HUT70977A

HUT70977A - Dna sequences waich lead to the formation of polyfructans (levans) plasmids containing these sequences as' wells as a process for preparing transgenic plants

Info

Publication number: HUT70977A
Application number: HU9500400A
Authority: HU
Inventors: Manuela Roeber; Gebhardt Geier; Klaus Geider; Lothar Willmitzer
Original assignee: Hoechst Schering Agrevo Gmbh
Priority date: 1992-08-12
Filing date: 1993-08-09
Publication date: 1995-11-28
Also published as: KR950703059A; DE69333833T2; CA2142308C; UA40598C2; US5792923A; AU682472B2; AU4946893A; EP0663956B1; DE4227061A1; ATE297998T1; DE69333833D1; US6028249A; IL106646A0; WO1994004692A1; CA2142308A1; JPH08500015A; EP0663956A1; US6501005B1; JP3643591B2

Description

A találmány tárgyát olyan DNS szekvenciák képezik, amelyek polifruktánok (levánok) képződéséhez vezetnek, valamint plazdok, amelyek ezeket a DNS szekvenciákat tartalmazzák, és azok az eljárások, amelyekben ezeket a plazmidokat polifruktán (leván) expresszióval rendelkező transzgenikus növények előállítására használják.

-Xi .

/' ·- _x ,

KÖZZÉTÉTELI

PÉLDÁNY

• · · .921/SZE

S.B.G. & K.

Nemzetközi Szabadalmi Iroda H-1062 Budapest, Andrássy út 113. Telefon: 34-24-950, Fax: 34-24-3Ϊ3

Polifruktánok képződéséhez vezető DNS szakaszok, az ezeket tartalmazó plazmidok és eljárás transzgén növények előállítására

H h y o-,. _z G b G · _c isóhe Forschung—Berlin GmbH., BERLIN

NÉMET SZÖVETSÉGI KÖZTÁRSASÁG

Feltalálók: RÖBER Manuéla,

GEIER Gebhardt,

GEIDER Klaus,

WILLMITZER Lothar,

BERLIN,

HEIDELBERG,

SANDHAUSEN,

BERLIN

NÉMET SZÖVETSÉGI KÖZTÁRSASÁG

A bejelentés napja: 1993. 08. 09.

Elsőbbsége:

1992. 08. 12. (P 42 27 061.8)

NÉMET SZÖVETSÉGI KÖZTÁRSASÁG

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/EP93/02110

A nemzetközi közzététel száma: WO 94/04692

-ΐΑ találmány tárgyát olyan DNS szekvenciák képezik, amelyek polifruktánok (levánok) képződését eredményezik, valamint eljájárás transzgenikus növények előállítására, olyan plazmidok alkalmazásával, amelyeken megtalálhatók ezek a DNS szekvenciák.

A nagy molekulasúlyú, vízben oldódó lineáris polimerek, például a poliakrilát vagy polimetakrilát alapúak ásványolaj termékek, és számos fontos alkalmazási területük van. Olyan tulajdonságaik például, hogy növelik a viszkozitást vizes rendszerekben, a szuszpendálás vagy ülepítés gyorsaságát növelő tulajdonságuk, komplexképző tulajdonságuk különösen értékes technikai szempontból. Ezeket a termékeket különösen nagy menynyiségben használják mint szuper elnyelőket víz megkötésénél, valamint vízzel hígítható lakkoknál. A kiváló pozitív tulajdonságaik ellenére, mivel ezektől a termékektől nehéz megszabadulni, felhasználásuk egyre inkább kritika tárgyát képezi, mivel nem bonthatók le biológiailag.

Az egyéb lehetőségek, amelyek újra feldolgozható anyagokon alapulnak, főleg a keményítők és a cellulózok, ezeknek a poliszacharidoknak a makromolekuláris szerkezete miatt, kolátozottan alkalmazhatónak bizonyultak. A biológiailag nem lebontható, kémiai eredetű polimerek helyettesítésére számos magas polimerizációs fokú poliszacharid származék alkalmazására gondoltak. Idáig ezeknek a poliszacharidoknak az előállítása csak biotechnológiai módszerekkel érhető el, fermentációval és transzglikozidációs eljárásokkal. Az ily módon kapott termékek, például a dextránok és polifruktánok (levánok) a tömeges előállítás szempontjából nem versenyképesek.

A polifruktánokat számos egyszikű és kétszikű, magasabb rendű növényben megtalálták eddig, emellett algákban és számos

Aj

Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumban [ Meier and Reid, Encyclopedia of Plánt Physiology, New Series, 13A, 418-471 (1982)] . A fruktánok szerepe a növények fejlődésében és a növények növekedésében még nem ismert teljesen. A fruktánok szerepére a következő javaslatokat tették eddig: az alacsony hőmérsékleten való megfagyás elleni védelem, alternatív szénhidrát tartalék, korlátozó keményítő bioszintézis esetében, alkalmazott köztes tartalék a fotoasszimilátumoknál, amely a füvek szárában található, mielőtt a magvakba szállítódnak.

Minden fruktán egy molekula szacharózt (glükóz-fruktóz) tartalmaz a polimerizációs reakció kiindulási molekulájaként, amelyhez a fruktóz polimerek hozzáadódnak.

A fruktóz molekula kapcsolódásától függően a növényi eredetű fruktánokat négy osztályba lehet sorolni [ Meier and

Reid Encyclopedia of Plánt Physiology, New Series, 13A, 418-471 (1982)] :

a)	(2-1)	kapcsolt	β-D-fruktánok	(inulin	típus),
b)	(2-6)	kapcsolt	β-D-fruktánok	(phlein	vagy leván
	típus)	f
c)	erősen	elágazó	fruktánok, 2-1	és 2-6	kapcsolódá-
	sok keverékével	r
d)	(2-1)	kapcsolt	fruktánok, amelyek az	a)—c)típusok-

kai ellentétben kizárólag fruktóz csoportokból adódnak hozzá mind glükóz, mind fruktóz csoportokkal való polimerizáció során (neokestose típus).

A baktérium eredetű fruktánok vagy a leván vagy az inulin típusba sorolhatók [ Carlsson, Caries Research, 4, 97-113 (1970); Dedonder, Methods in Enzymology, 8, 500-505 (1966)] .

A növényi és baktérium fruktánok bioszintézisével kapcsolatban végzett kísérletek arra mutattak rá, hogy ez különböző utakon játszódhat le. A baktérium és növényi fruktánok még tovább osztályozhatók, nem az elsődleges szerkezetük, hanem főleg a molekulasúlyuk alapján. Tehát a növényekből izolált fruktánokról kimutatták, hogy molekulasúlyuk 5,000 és 50,000 dalton között változik [ Pollock and Chatterton, in: The Biochemistry of Plants, 14, 109-140 (1988)] , míg a baktériumokból izolált fruktánok molekulasúlyáról leírták hogy a 2,000,000 dalton értéket is elérheti [Clarké és munkatársai., in: Carbohydrates as Organic Raw Materials, VCH Weinheim, 169182 (1991)] .

A Bacillus fajból és a Streptococcus fajból származó különböző mikroorganizmusok olyan polifruktózokat termelnek, amelyekben mind a leván típusú fruktánokat, mind az inulin típusú fruktánokat leírták [ Carlsson, Caries Research, 4_, 97113 (1970); Dedonder, Methods in Enzymology, 8_, 500-505 (1966)] .

A bioszintézis úttal végzett kísérletek rávilágítottak arra, hogy a magasabb rendű növényekben érvényes bioszintézis úttal szemben itt sokkal egyszerűbb a mód, és csak egy enzim játszik szerepet. Ennek az enzimnek a triviális neve a levánszukráz, ez egy transzfruktoziláz (szacharóz: β-D-fruktozil-transzferáz, E.C.2.4 .1.10.), amely az alábbi reakciót katalizálja :

szacharóz + akceptor = glükóz + fruktozil akceptor

Jellemző akceptor lehet a víz, az alkohol, a cukor vagy a polifruktóz. Az a hipotézis, hogy csak egy enzim katalizálja ezt a reakciót, egyrészt a proteinkémiai módszerekkel megtisztított enzim vizsgálatán alapul, másrészt azon a tényen, hogy a levánszukráz gént különböző Bacillus fajokból, valamint egy Streptococcus fajból izolálták, és Escherichia coli-ba való transzfer után leván képződését eredményezi [ Gay és munkatársai., Journal of Bacteriology, 153, 1424-1431 (1983); Sato és munkatársai., Infection and Immunity, 52., 166-170 (1986)] .

Idáig a Bacillus amyloliquefaciens-ből származó [ Tang és munkatársai., Gene, 96, 89-93 (1990)] és a Bacillus subtilisből származó [ Steinmetz és munkatársai., Molecular and Generál Genetics, 200, 220-228 (1985)] levánszukráz géneket írták le, amelyek viszonylag erős homológiát mutatnak egymással, és mindkettő katalizálja a leván típusú fruktánok szintézisét. Emellett leírtak egy fruktozil-transzferázt Streptococcus mutans-ból [ Shiroza és munkatársai., Journal of Bacteriology, 170, 810-816 (1988)] . Ez kevés homológiát mutat a Bacillus fajból származó levánszukrázokkal. A Streptococcus mutans-ban keletkező fruktán inulin típusú.

A WO 89/12386 számú bejelentésben leírják annak lehetőségét, hogy szénhidrát polimereket, azaz például dextránt vagy levánt lehet termelni transzgenikus növényekben, különösen a transzgenikus növények gyümölcseiben. Ezeknek a növényeknek az előállításához az Aerobacter levanicuiri-ból, a Streptococcus sáli varius-ból és a Bacillus subtilis-ból származó levánszukrázok és a Leuconostoc mesenteroides-ből származó dextránszukázok alkalmazását írják le.

« • · · • · • · · • · * · ·

Emellett olyan kiméra gének konstrukcióját is leírják, amelyek alkalmasak lehetnek a Bacillus subtilis-ból származó levánszukrázok, valamint a Leuconostoc mesenteroides-ből származó dextránszukrázok transzgenikus növényekben való expresszálására. Emellett leírják az ezeket a konstrukciókat tartalmazó transzgenikus növények készítését is. Leírják továbbá az ezeket a konstrukciókat tartalmazó transzgenikus növények készítését is. Az nem ismert, hogy az ismertetett eljárással előállíthatók-e polifruktánok.

Leírnak emellett egy sorozat eljárást a szénhidrát koncentráció módosításra és/vagy a szénhidrát koncentrálására transzgenikus növényekben, biotechnológiai módszerek alkalmazásával. így annak a ténynek az ismeretében, hogy a keményítő koncentráció fokozása és a keményítő kémiai valamint fizikai szempontból való módosítása már ismert, feltehető, hogy a burgonya növények szénhidrát tartalmának módosítása az ADP-glükóz-pirofoszforiláz aktivitás növelésével vagy csökkentésével elérhető (EP 455 316).

Az EP 442 592 számú bejelentésből emellett az is ismert, hogy a fotoasszimilátumok eloszlásának módosítása a citoszól és apoplasztikus invertáz segítségével lehetséges, és a kitermelés, valamint a burgonya növények szárazsággal és faggyal szembeni ellenállása a heterológ pirofoszfatáz génnek burgonya növényekben való expresszálása révén módosítható.

Abból a célból, hogy az egyre nagyobb mennyiségben használt kiindulási anyagok, azaz a poliszacharidok fizikaikémia paramétereit adaptáljuk a vegyipar igényeinek megfelelően, valamint minimalizáljuk ezeknek a termékeknek az előállítási költségeit, transzgenikus növények előállítási eljárásait

• · · · * · · · · • · · · » ·«···· * · · · » Μ t t , , kell kifejleszteni, amelyek az ismert eljárásokkal összehasonlítva jobb, nagyobb termést adó növényeket eredményeznek.

Meglepő módon azt találtuk, hogy az Erwinia amylovora Gram-negatív baktériumból származó levánszukráz DNS szekvencia, amelynek nukleotid szekvenciája a SEQ ID NO.1-ben található, lehetővé teszi, hogy nagy mennyiségben állítsunk elő polifruktánokat (levánokat) transzgenikus növényekben, amelyek teljesen megfelelnek a vegyipar igényeinek újra feldolgozható nyersanyagokként .

Egy DNS szekvenciának egy növényi genomba való integrálásával, amelyen az előzőkben említett DNS szekvencia megtalálható, a polifruktán (leván) növényben való expressziója, főleg a levelekben és a gümőkben lehetséges. A találmány szerinti levánszukráz DNS szinten nem mutat jelentős homológiát az ismert levánszukrázokkal.

A találmány tárgya eljárás olyan transzgenikus növények előállítására, amelyek polifruktánt (levánt) expresszálnak a levelekben és a gümőkben, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket almazzuk:

(a) DNS szekvenciát készítünk, amely az alábbi rész-szekvenciákat tartalmazza:

(i) egy promoter,a mely a növényekben aktív, és biztosítja RNS keletkezését a megcélzott célszövetekben vagy célsejtekben;

(ii) egy levánszukráz DNS szekvencia; és ¹ <

(iii) egy 3' nem-transzlálódó szekvencia, amely a növényi sejtekben a transzkripció leállását eredményezi, valamint poli A csoportoknak az RNS 3' végéhez való adását eredmén eredményezi;

(b) a DNS szekvencia transzferé és integrálása a növényi genomba, egy növényi sejtekből származó rekombináns kétszálú molekula formájában, plazmid alkalmazásával, és (c) teljes növények regenerálása a transzformált növényi sejtekből.

Az (a) ii) lépésben kapott levánszukráz nukleotid szekvenciája előnyösen a SEQ ID NO. 1 alatt bemutatott nukleotid szekvencia.

A levánszukráz az alábbi reakciót katalizálja: szacharóz-(fruktóz)_n+szacharóz => szacharóz-(fruktóz) _{n +} ]_ + +glükóz.

Ennek az eljárásnak az alkalmazásával elvileg az összes növény módosítható a polifruktán (leván) expressziója szempontjából, előnyösen olyan terményeknél mint a kukorica, rizs, búza, árpa, cukorrépa, dohány és burgonya.

Az eljárás (b) lépésében elvileg minden olyan plazmid használható, amelyben megtalálható a SEQ ID NO. 1-ben levő DNS szekvencia. Az előnyösen használható plazmidok; a p35s-CW-LEV (DSM 7186), a p35s-CY-LEV (DSM 7187) vagy a p33-CW-LEV (DSM 7188) .

Mivel a levánszukráz szubsztrátja a szacharóz, a poli fruktánok előállítása különösen előnyös azokban a szervekben amelyek nagy mennyiségű szacharózt tárolnak. Ilyen szerv például a cukorrépa gyökere, vagy a cukornád szára. Különösen előnyös a genetikailag módosított burgonyáknál, amelyek a szacharózt a gümőikben tárolják, a keményítő bioszintézis blokkolása révén.

A szacharóz bioszintézise a citoszólban játszódik le, míg ezzel szemben a tárolás a vakuólumokban történik. A cukorrépa vagy a burgonya tároló szöveteibe való transzport, vagy a magvak endospermiumaiba való transzport során a szacharóznak át kell lépnie az intercelluláris térbe. A polifruktánok előállítása során mindhárom sejt-kompartment megfelelő, azaz a citoszól, a vakuólum és az intercelluláris tér is.

A SEQ ID NO. 1 nukleotid szekvencia levánszukrázt kódoló szekvenciájához egy olyan promotert kapcsolhatunk, amely biztosítja a transzkripciót a megfelelő sorrendben, amelyek az értelmes orientációban kapcsolódnak egymáshoz (a promoter 3'-vége a kódoló szekvencia 5'-végéhez kapcsolva) az előállítandó enzimet kódoló szekvencián. A terminációs szignál, amely meghatározza az mRNS szintézis leállítását, a kódoló szekvencia 3'-végéhez kapcsolódik. Ahhoz, hogy az expresszált enzimet a specifikált szubcelluláris kompartmentekbe irányítsuk, azaz például a kloroplasztokba, amiloplasztokba, mitokondriumokba, vakuólumokba, a citoszólba vagy az intercelluláris térbe, egy úgynevezett szignál szekvenciát vagy tranzit pepiidet kódoló szekvenciát lehet helyezni a promoter és a kódoló szekvencia közé. Ennek a szekvenciának ugyanabban a leolvasási fázisban kell lennie mint az enzimet kódoló szekvenciának.

Ahhoz hogy a találmány szerinti DNS szekvenciát magasabb rendű növényekbe juttassuk be, nagyszámú klónozó vektor áll rendelkezésre, amelyek Escherichia coli replikációs szekvenciát

tartalmaznak, ami lehetővé teszi, hogy a transzformált sejteket szelektáljuk. Ilyen vektor például a pBR322, a pUC-sorozat, az M13 mp-sorozat, a pACYC 184, az EMBL 3, stb. A kívánt gént a növénybe bejuttató módszertől függően más DNS szekvenciák is alkalmasak lehetnek. Ha a Ti- vagy Ri-plazmidokat kell használni, például a növényi sejt transzformálására, akkor a Ti- és Ri-plazmidnak legalább a jobb karja, gyakran azonban mindkét karja csatolva kell hogy legyen, határoló régióként, a bejuttatandó génhez. A T-DNS alkalmazását növények transzformálásában intenzíven kutatták, és megfelelően leírták az alábbi publikációkban [ EP 120 516 bejelentés; Hoekema, in: The Binary Vector System, Offset-drukkerij Kanters B.V. Alblasserdam, V. fejezet (1985); Fraley és munkatársai., Crit. Rév. Plánt Sci., 4_, 1-46; An és munkatársai., EMBO J., 4_, 277-287 (1985)] . Ha a bejuttatott DNS már integrálódott a genomba, akkor már rendszerint stabilan megmarad, és megmarad az eredeti transzformált sejtek utódaiban is. Normális esetben tartalmaz egy szelekciós markért, amely a transzformált növényi sejtekben egy biocid vagy antibiotikum elleni rezisztenciát indukál, például G418, bleomicin, higromicin vagy foszfinotricin elleni rezisztenciát. Az egyes alkalmazott markereknek lehetővé kell tenniük a transzformált sejtek elválasztását azoktól a sejtektől, amelyek nem tartalmazzák a bejuttatott DNS-t.

A DNS-nek a növénybe való juttatására az Agrobacteri im-mal végzett transzformáció mellett számos egyéb technika is alkalmas. Ilyen technika például a protoplasztok fúziója, a DNS mikroinjektálása és elektroporációja, a ballisztikus módszerek és a vírusfertőzés. A transzformált növényi anyagból teljes növények regenerálhatok egy megfelelő, a szelekcióhoz antibiotikumokat vagy biocidokat tartalmazó táptalajon. A kapott növényeket azután megvizsgálhatjuk, hogy tartalmazzák-e a bejuttatni kívánt DNS-t. Az elektroporációban és az injekciózásban nincs különösebb követelmény a használt plazmáddal szemben. Egyszerű plazmidok, mint például pUC-származékok is használhatók. Ha azonban teljes növényeket kell regenerálni az ilyen transzformált sejtekből, akkor a szelektálható marker jelenléte szükséges. A transzformált sejtek a növényben növekszenek a szokásos módon [ McCormick és munkatársai., Plánt Cell Reports, 5, 81-84 (1986)] . Ezek a növények normális körülmények között növekedhetnek, más, ugyanilyen transzformált géneket tartalmazó vagy eltérő növényekkel keresztezhetők. A keletkező hibrid egyedek a megfelelő fenotípusos tulajdonságokkal rendelkeznek.

Letétbe helyezések

Az alábbi plazmidokat a Deutsche Sammlung von

Mikroorganismen-nél (DSM) helyeztük letétbe (Braunschweig,

Németország) 1992.

július 16-án (letéti szám):

p35s-CW-LEV (DSM 7186) p35s-Cy-LEV (DSM 7187) p33-CW-LEV (DSM 7188)

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékletben megadott ábrákat.

1. ábra: a p35s-CW-LEV plazmid szerkezetét mutatja.

A, B és C fragmenteket tartalmaz. Az A fragment tartalmazza a karfiol mozaikvirus(CaMV)35s promoterét,a 6906-7437 nukleotidokat.

- 12Α Β fragment tartalmazza az Erwinia amylovoraból származó levánszukráz 689-2122 nukleotidokat tartalmazó szekvenciáját (SEQ ID N0.1).

A C fragment tartalmazza a Ti-plazmid T-DNS-e

3-as génjének poliadenilezési szignálját, pTiACH 5, 11749-11939-es nukleotidok.

2. ábra: a p35s-CY-LEV plazmád szerkezetét mutatja.

A, B és C fragmenteket tartalmaz. Az A fragment tartalmazza a karfiol mozaikvírus(CaMV)35s promoterét, a 6906-7437 nukleotidokat.

A B fragment tartalmazza az Erwinia amylovoraból származó levánszukráz 864-2122 nukleotidokat tartalmazó szekvenciáját (SEQ ID NO.1).

A C fragment tartalmazza a Ti-plazmid T-DNS-e

3-as génjének poliadenilezési szignálját,pTiACH.

3. ábra: a p33-CW-LEV plazmád szerkezetét mutatja.

A, B és C fragmenteket tartalmaz. Az A fragment tartalmazza a B33 patatin gén promoter régiójának Dral-Drai fragmentjét(a -1512-es pozíciótól a +14-es pozícióig).

A B fragment tartalmazza az Erwinia amylovoraból származó levánszukráz 864-2122 nukleotidokat tartalmazó szekvenciáját (SEQ ID NO.l).

A C fragment tartalmazza a Ti-plazmid T-DNS-e 3-as génjének poliadenilezési szignálját, pTiACH 5, 11749-11939-es nukleotidok.

4. ábra: a polifruktán detektálását mutatja transzformált dohánynövényekben (2., 3. és 13.)

Ebben :

Fru = fruktóz, Suc = szacharóz, Kés = kestose cl = 1-es kontroll c2 = 2-es kontroll

M = marker

Ahhoz, hogy a találmány alapját képező példákat megismerjük, először az ezekhez szükséges összes, önmagában ismert eljárást felsoroljuk.

1. klónozási eljárás

A klónozáshoz a pUC18 vektort [ Yanisch-Perron és munkatársai., Gene, 33, 103-109 (1985)] használjuk.

A növények transzformálásához a génkonstrukciókat a BIN 19 bináris vektorba klónozzuk [ Bevan, Nucleic Acids Research, 12, 8711-8720 (1984)] .

2. Baktérium törzsek

A pUC vektorokhoz az Escherichia coli BMH71-18 törzset [Messing és munkatársai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 24, 6342-6346 (1977(] használjuk. A TB1 egy rekombináció-negativ, tetraciklin rezisztens származéka a JM101 törzsnek [Yanisch-Perron és munkatársai., Gene, 33, 103-109 (1985)] . A TB1 törzs genotípusa [Bárt Barrel, személyes közlés] : F'(traD36, proAB, lacl, lacZAM15), A(lac, pro), SupE, this, recA, Sri::TnlO(TcR).

A plazmidok burgonya növényekbe való transzformálását Agrobacterium tumefaciens LBA440 törzzsel végezzük [Bevan, Nucleic Acids Research, 12, 8711-8720 (1984)] .

3. Az Agrobacterium tumefaciens transzformálása

A BIN19 származékok esetében a DNS-nek az Agrobacterium-ba való bejuttatását közvetlen transzformációval végezzük, Holsters és munkatársai módszerével [ Holsters és munkatársai., Molecular and Generál Genetics, 163, 181-187 (1978)] . A transzformált Agrobacterium plazmid DNS-ét Bimbóim és Doly módszerével izoláljuk [ Birnboim and Doly, Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523 (1979)], majd gélelektroforézissel vizsgáljuk megfelelő restrikciós enzimekkel végzett emésztés után.

4. Növényi transzformáció

A) Dohány: Agrobacterium tumefaciens éjszakán át, szelekciós nyomás alatt növesztett tenyészetéből 10 ml-t lecentrifugálunk, a felülúszót elöntjük, majd a baktériumokat azonos térfogatú antibiotikum-mentes táptalajban szuszpendáljuk. Egy steril Petri-csészében steril növények levélkorongjait (körülbelül 1 cm^), amelyeknek a központi erét kivágtuk, ebbe a baktérium szuszpenzióba merítjük. A levélkorongokat ezután szorosan egymás mellé helyezve 2% szacharózt és 0,8% Bacto agart tartalmazó MS táptalajt [ Murashige és munkatársai., Physiologia Plantarum, 15, 473-497 (1962)] tartalmazó Petri-csészékbe tesszük. Két napig sötétben 25°C-on inkubáljuk, majd 100 mg/1 kanamicint, 500 mg/1 claforant, 1 mg/1 benzilamino-purint (BAP), 0,2 mg/1 naftilecetsavat (NAA) és 0,8% Bacto agart tartalmazó MS táptalajra visszük. A növekvő gyökereket hormonmentes MS táptalajra visszük,amely 250 mg/1 claforant tartalmaz .

- 15B) Burgonya: Steril burgonya tenyészetből származó tíz kis levelet, amelyeket egy szikével felsértettünk, 10 ml, 2%-os szacharózt tartalmazó MS táptalajba teszünk, amelyben 30-50 μΐ, éjszakán át szelekciós nyomás alatt növesztett Agrobacterium tumefaciens van. 3-5 perces enyhe rázatás után a leveleket MS táptalajra tesszük ki (1,6% glükóz, 2 mg/ml zeatin ribóz, 0,02 mg/1 naftilecetsav, 0,02 mg/1 gibberellinsav, 500 mg/1 claforan, 50 mg/1 kanamicin és 0,8% Bacto agar). Egy hétig 3000 lux megvilágítás mellett 25°C-on inkubáljuk, majd a táptalajban levő claforan koncentrációt felére csökkentjük. A további növesztést Rocha-Sosa és munkatársai módszerével végezzük [ RochaSosa és munkatársai., EMBO Journal, _8, 29 (1989)] .

5. Transzgenikus növényekből származó genomiális DNS elemzése

A genomiális növényi DNS izolálását Rogers és munkatársai leírása szerint végeztük [Rogers és munkatársai., Plánt Mól. Bioi., 5, 69-76 (1985)] .

A DNS elemzéshez a megfelelő restrikciós enzimmel való emésztés után 10-20 pg DNS-t használunk. Az elemzést Southern blottal végezzük, a vizsgálat a vizsgálandó DNS szekvenciák integrációjára vonatkozik.

6. Transzgenikus növényekből származó össz-RNS elemzése

A növényi össz-RNS izolálását Logemann és munkatársai leírása szerint végezzük [Logemann és munkatársai., Analytical

Biochem., 163, 16-20 (1987)] .

Az elemzésben 50 pg össz-RNS-t használunk, az elemzésre a Northern biot módszerét használjuk, az elemzés célja a keresett transzkriptumok jelenlétének igazolása.

7. Polifruktóz extrakciója és meghatározása növényekben

Az extrakciót és a meghatározást Portis H.G. módszerével végezzük [Portis, H.G., Meth. Plánt Biochem., 2, 353-369 (1990)] .

1. Példa

A p35s-CW-LEV plazmid készítése és a plazmád beépítése dohány és burgonya növényekbe

A p35s-CW-LEV plazmid tartalmazza az A, B és C fragmenteket, amelyeket a pUC18 polilinkerébe klónoztunk (1. ábra).

Az A fragment tartalmazza a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S promoterét. Egy olyan fragmentet tartalmaz, amelyben a CaMV 6909-7437-es nukleotidjai találhatók [ Franck és munkatársai., Cell, 21, 285-294 (1980)] , és amelyet egy EcoRI-KpnI fragment formájában izoláltunk a pDHl plazmádból [ Pietrzak és munkatársai., Nucleic Acids Research, 14, 5857-5868] , és a pUC18 plazmid polilinkerének EcoRI-KpnI hasítási helye közé klónoztunk .

A B fragment az Erwinia amylovora-ból származó levánszukráz 689-2122-es nukleotidjaiból álló szekvenciákat tartalmazza (SEQ ID NO. 1), ezt a pUC18 polilinker BamHI/Sall hasítási helyére klónozzuk.

A C fragment a Ti-plazmid, a pTi ACH 5 T-DNS-e 3-as génjének poliadenilezési szignálját tartalmazza [ Gielen te al., EMBO J., 3, 835-846 (1984)] , a 11749-11939-es nukleotidokat,

- 17amelyeket egy PvuII-HindlII fragment formájában izoláltunk a pAGV40 plazmidból [ Herrera-Estrella és munkatársai., Natúré, 303, 209-213 (1983)], majd, az Sphl linkereknek a PvuII hasítási helyhez való kapcsolása után a pUC18 polilinker SphlHindlII hasítási helye közé klónoztuk. A p35s-CW-LEV mérete 2151 bp.

A p35s-CW-LEV plazmidnak azt a részét, amely az A, B és C fragmenteket tartalmazza, bináris vektorokba építjük, majd az Agrobacteriurri rendszer felhasználásával dohány és burgonya növényekbe juttatjuk be. A transzformált sejtekből teljes növényeket regenerálunk. Egy ilyen génnel transzformált dohánynövény sorozat leveleinek elemzése világosan mutatja, hogy polifruktán (leván) van jelen, amit a 35s-Cw-LEV gén expressziójára vezethetünk vissza (4. ábra).

2. Példa

A p35s-CY-LEV plazmid készítése és a plazmid beépítése dohány és burgonya növényekbe

Az ebben a példában szereplő eljárást az 1. példában leírtak alapján végezzük, azzal a módosítással, hogy a B fragmentet (amely a levánszukrázt kódolja), az 5' végén megrövidítettük. Ennek az az eredménye, hogy a fehérje a transzgenikus növények citoszóljában expresszálódik.

Az A fragment tartalmazza a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S promoterét. Egy olyan fragmentet tartalmaz, amelyben a CaMV 6909-7437-es nukleotidjai találhatók [ Franck és munkatársai., Cell, 21, 285-294 (1980)] , és amelyet egy EcoRI-KpnI fragment formájában izoláltunk a pDHl plazmidból [ Pietrzak és munkatársai., Nucleic Acids Research, 14, 5857-5868] , és a pUC18 plazmid polilinkerének EcoRI-KpnI hasítási helye közé klónoztunk.

A B fragment az Erwinia amylovora-ból származó levánszukráz 864-2122-es nukleotidjaiból álló szekvenciákat tartalmazza (SEQ ID NO. 1), ezt a pUC18 polilinker Smal/Sall hasítási helyére klónozzuk.

A C fragment a Ti-plazmid, a pTi ACH 5 T-DNS-e 3-as génjének poliadenilezési szignálját tartalmazza [ Gielen te al. , EMBO J., 3, 835-846 (1984)], a 11749-11939-es nukleotidokat, amelyeket egy PvuII-HindlII fragment formájában izoláltunk a pAGV40 plazmidból [ Herrera-Estrella és munkatársai., Natúré, 303, 209-213 (1983)], majd, az Sphl linkereknek a PvuII hasítási helyhez való kapcsolása után a pUC18 polilinker SphlHindlII hasítási helye közé klónoztuk. A p35s-CY-LEV mérete 1976 bp.

A p35s-CW-LEV plazmádnak azt a részét, amely az A, B és C fragmenteket tartalmazza, bináris vektorokba építjük, majd az Agrobacterium rendszer felhasználásával dohány és burgonya növényekbe juttatjuk be. A transzformált sejtekből teljes növényeket regenerálunk.

3. Példa

Az ebben a példában szereplő eljárást az 1. példában leírtak alapján végezzük, azzal a módosítással, hogy a 35s promotert az I. osztályba tartozó patatin B33 gén [ Rocha-Sosa és munkatársai., EMBO J., 6>, 23-29 (1989)] promoterével helyettesítjük. A p33-CW-LEV plazmid tartalmazza az A, B és C fragmenteket, amelyeket a pUC18 polilinkerbe klónoztunk (lásd 3. ábra).

- 19Az A fragment tartalmazza a Dral-Dral fragmentet (a -1512es pozíciótól a +14-es pozícióig), a patatin B33 génje promoter régiójából [ Rocha-Sosa és munkatársai., EMBO J., 8_, 23-29 (1989)], amelyet a pUC18 polilinker Smal pozíciójába klónozunk.

A C fragment a Ti-plazmid, a pTi ACH 5 T-DNS-e 3-as génjének poliadenilezési szignálját tartalmazza [ Gielen és munkatársai., EMBO J., 3_, 835-846 (1984)] , a 11749-11939-es n nukleotidokat,amelyeket egy PvuII-HindlII fragment formájában izoláltunk a pAGV40 plazmádból [ Herrera-Estrella és munkatársai. , Natúré, 303, 209-213 (1983)], majd, az Sphl linkereknek a

PvuII hasítási helyhez való kapcsolása után a pUC18 polilinker SphI-HindlII hasítási helye közé klónoztuk. A p33-CW-LEV mérete 3149 bp.

A p33-CW-LEV plazmidnak azt a részét, amely az A, B és C fragmenteket tartalmazza, bináris vektorokba építjük, majd az Agrobacterium rendszer felhasználásával dohány és burgonya növényekbe juttatjuk be. A transzformált sejtekből teljes növényeket regenerálunk. Egy ilyen génnel transzformált dohánynövény sorozat leveleinek elemzése világosan mutatja, hogy polifruktán (leván) van jelen, amit a 33-Cw-LEV gén expressziójára vezethetünk vissza (4. ábra) .

4. Példa

A transzgenikus növényekben szintetizált β2,6-Ρfruktofurán (leván) elemzése ^C-NMR spektroszkópiával A p35s-CW-LEV konstrukcióval transzformált transzgenikus növények elemzését mutatjuk be példaként. Ezt az elemzést ugyanúgy lehés munkatársaikalmazni a p35s-CW-LEV és a p35s-CYLEV konstrukciókkal transzformált növényekre is.

Ahhoz, hogy a transzgenikus növények által szintetizált levánból elegendő mennyiséget kapjunk NMR spektroszkópiával való elemzéshez, körülbelül 10 g levélszövetet dörzsölünk el 10 ml vízben. A homogenizátumot azután 4000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk Beckman Minicentrifugában, majd a felülúszót egy PD10 oszlopra visszük (LKB-Pharmacia), hogy az alacsony molekulasúlyú vegyületeket eltávolítsuk. Az oszlopot vízzel hozzuk egyensúlyba, mielőtt 2,5 ml felülúszót viszünk fel rá, majd a magasabb molekulasúlyú vegyületeket 3,5 ml vízzel eluáljuk. Az eluátumot tovább tisztítjuk ioncserélő gyöngyök hozzáadásával (AG 501 X8, Biorad), majd 30 percig rázatjuk. A gyöngyök eltávolítására 4000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk az oldatot, majd a felülúszót Sepharose 4B oszlopra visszük (átmérője 16 mm, elválasztási térfogat 24 ml), hogy a rövid cukorláncokat eltávolítsuk. Az eluátumot egy vákuum-centrifuga alkalmazásával vákuumban szárítjuk (univapo 150 H, Uniquip, Martinsried, Németország), majd az alábbi körülmények között vizsgáljuk 1_:

PULPROG	zgdc30	F2-processzálási paraméterek
Oldószer	D2 0	Sí	32768
AQ	1,3762726 sec	SF	100.5485322 MHz
FIDRES	0,363305 Hz	WDW	EM
DW	21,0 pisec	SSB	0
RG	32768	L3	0,50 Hz
NUCLEUS	13C	GB	0
Dll	0,0300000 sec	PC	1, 40
P31	100,0 pisec
S2	20 dB	10 NMR	plot paraméter
HL1	1 dB	CX	33,00 cm
Dl	1,000000 sec	F1P	123,000 ppm
Pl	6, 5 μεεο	FI	12367,47 Hz
DE	26,3 psec	F2P	-6,000 ppm
SF01	100.5597430MHz	F2	-603,29 Hz
SWH	23809.58 Hz	PPMCM	3,90909 ppm/cm
TD	65536	HZCM	393.05334 Hz/cm
NS	8000
DS	2
Az	elemzés eredményei az	5. ábrán láthatók. A kapott
csúcsok	képe ugyanaz, mint amit Gross	és munkatársai [ Gros

munkatársai., Physiol. Mól. Plánt Pathol . , 4 0, 371 (1992)] publikáltak a levánra.

Ez azt igazolja, hogy a transzformált növények levánt szintetizálnak az 1-3. példákban ismertetett konstrukciók egyikével való transzformáció után.

-22SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás módosított polifruktán képződéssel rendelkező e, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk:

egy DNS szekvenciát állítunk elő, amely a szabályok szerint az alábbi rész-szekvenciákat tartalmazza: (i) egy, a növényekben aktív promotert, amely célsejtekben, (ii) Erwinia amylovora, Bacillus amyloliquefaciens vagy Streptococcus mutáns mikroorganizmusokból származó polifruktán (levan)-szukrázt kódoló DNS szekvencia, és (iii) egy 3'-nem-transzlálódó szekvencia, amely a növényi sejtekben a transzkripció leállását, valamint poliA végláncoknak az RNS 3' végéhez való hozzáadását eredményezi, (b) ezt a DNS szekvenciát a növeényi sejtekbe transzfenál j uk és a szekvenciát a növény genomjába integrálrál j uk, és teljes, ép növényt transz formált növényi sejtekből r regeneráljuk.

Az 1. igénypont szerinti eljárás módosított polifruktán képződéssel rendelkező transzgenikus növények előállítására, azzal jellemezve, hogy a polifruktán-szukrázt kódoló DNSszekvencia az alábbi 1438 bp (Seq-ID No. 1) szekvencia:

GGATCCCCCG GGCTGCA.GCG ATCATGGTTA TTTATAAGGG ATTGTTATGT CCTGAA.AA.CC

ACACAACAGA ACCAGAC-TGA TTTCAAA.AAA TAAAAAGCTA TTAATATACA C-ACCTTCAGC

120

AAGA^aGG⁷¹ ^CG.AAA.T.AA.C CTGTG.AGGAT ΆΤΤΤ ATG TCA GAT

Met Ser Asp

TAT AAT TAT AAA CCA ACG CTG TGG ACT CC-T GCC GAT GCA mr-ir¹ 1 1 <7 AAA 208 Tyr Asn Tyr Lvs Pro Thr Leu Trp Thr Asrg Alá Asp Alá Leu Lys 10 15 GTT CAT GAG C-AT GAC CCA ACC ACA ACT CAA. CCG GTT ATT GAC ATT 253 Val Eis Glu Asp Asp Pro Thr Thr Gin Pro Val 7 Ί o Aso Ile 20 25 30. GCA TTC CCG C-TA ATG AGT GAA GAA GTC mrprp ATT TGG GAT > f-r· ATG 298 Alá Phe Pro Val Met Ser C-lu Glu Val Phe He Trn Aso Thr Met 35 40 45 CCA TTG CGA GAC TTC C-AC GGA GAG ATT ATC rpQíTi GTA AA.T C-C-T TGG 343 Pro Len Arg Asp Phe Aso Gly Glu 7 Ί_ο 7 1 a Ser Val Asn Gly Trp 50 55 60 TGT A.TT ATT TTT ACG CTA ACA GCA GAT CGC AA.C ACT GAT CCG 388 Cys 11 e 7 1 θ Phe Thr LcU Thr Alá Asp Arg Asn Thr Asp Asn Pro 65 70 75 CAA. TTC CAG GAT GAA AAT C-GC A MTI -rx 1 T.AT GAT ATT ACT CC-T GAC TGG 2 7 Gin Phe C-ln Asp Glu Asn Gly Asn Tyr Asp T Ί o Thr Arg Asp Trp 80 85 90 GAA GAC AGA CAT GGT CC-T 'Ό CGT ATT T’QT¹ TAT TGG TAC TCA CGC 478 Glu Asp Arg His Gly Arg -' a Arg 7 Ί o Cys rru- — 1 V x. Trp' Tyr Ser 95 100 105

ACC GGT AAA. GAC TGG ATT ,-p rprp C-GC GGT CGG GTA ATG GCC C-AA C-C-T 4 2 0 Thr C-lv Lvs Aso Trp Ile 7? Η o Gly Gly Arg Val Me t AJ, 3 Glu C-lv 110 115 120 GTC GCA CCG ACC- ACG CGT GAG TGG GCC ACC CCG ATC CTT TTA. 5ő3 Val Alá Pro Thr Thr Arg C-lu Trp C-ly Thr Pro . He Leu Leu 125 130 135 AA.C GAT CGG C-GC GAT ATT C-AC CTG TiT TAT ACC TGT GTC ACT CCG 613 Asn Aso Arg C-lv Asp He .Asp Leu Tvr Tyr Thr Cys Val Thr Pro 14Ö 14 5 150 GGT GCA ACC ATT GCC AAA. C-TC- CGC GGT AAA. ATC GTC ACT TCC C-AT 658 Gly Al s Thr Ile Alá Lys Val Arg C-ly Lys 7 Ί q Val Tnx* Ser Aso 155 160 165 CAA AGT GTA AGG CTG GAA. GGT TTT CAG CAG GTT ACA TCA CTT TTC 703 Gin Ser Val Ser Leu Glu C-ly Phe Gin C-ln Val Thr Ser Leu Phe 170 175 180 TC.T GCT GAC GGG ACT A.TT TAC CAG ACG C-AA GAG CAG AAC GCT TTC 748 Ser Alá ÁSD Gly Thr He Tvr Gin Thr C-lu Glu Gin Asn A2_ 3 Phe 185 190 195 TGG AA.C TTC CGT GAC CCA AGC CCA TTC ATT GAC AGG AAT C-AT GGC 793 Trp Asn Phe Arg Asp Pro Ser Pro Phe He Asp Ara Asn Aso c-lv 200 205 210 AAA. TTA Τ' ATG CTG TTT GAA. GGA AA.C GTG C-CC- GGG CCG CGC GGT 838 Lvs Leu Tvr Met Leu Phe C-lu C-ly Asn Val Alá C-lv Pro Arg C-lv 215 220 225

• ·

TCG CAC GAA ATT ACC CAG C-CT GAG ATG C-GT AAT GTG CCG CCG GC-T S83 Ser His Glu Σ Σ g Τ1Γ2Γ Gin Alá Glu Met Gly .Asn Val Pro Pro Glv 230 235 240 TAT GAA GAT GTG GGT GGC GC.A AAA TAT CAG GCA GGC TC-T GTT GGT cos Tvr Glu Asn Val Gly Glv Alá Lvs Tyr Gin Alá Gly Cvs Val C-lv 245 250 255 CTG GCT GTG C-CC Ά > > GAC CTG TCA GGC AC-T GAG TGG C.A.A .ATC CTC- 973 Léü Alá Val Alá Lvs Aso Leu Ser Gly Ser Glu Tro Gin Ile Leu 260 255 270 CCT CCG CTG ATC ACC GCT GTT GC-C GTA AAC GAT CAG ACT GAA CC-C 1018 Pro Pro Leu T 1 3 7'nr Alá Val Glv Val Asn Aso Gin Thr Glu Arc 275 2S0 285 CCT CAT TTT GTC TTC CAC- C-A.T C-C-T AAA TAC TAT CTG TTC ACC ATT 1063 Pro his Phe Val Phe Gin Asp Gly Lys Tyr .Tyr Leu Phe Thr Ile 290 295 300 AGC CAT AAC- TAC ACT TTT GCC GAT AAC CTG ACC GGC CCT GAT GGA 1108 Ser ' His Lvs Tyr Thr Phe Alá Aso .Asn Leu Thj? Gly Pro Aso C-lv 305 310 315 GTG rp T^rp rprpm C-TA AGC GAT AAA CTT ACC GGC CCT TAC ACG CCG 1153 Val Tyr C-lv Phe Val Ser Asp Lys Leu •Thr C-ly Pro Tvr Thr Pro 320 3 2 b 330 ATG ΆΑΤ AGC TCC GGG CTG GTG CTG C-GC AAC CCG TCT TC.A CAA CCT 1198 Met Asn Ser Ser Gly Leu Val Leu Gly Asn Pro Ser Ser Gin Pro 335 340 345 rprpr' CAG ACA rp rp TCA CAC TAT GTT ATG CCT AA.T GGG CTG GTC ACT 1243 Phe Gin Tyr Ser r. i S Tvr V a 1 Met Pro Asn Glv Leu Val Thr 350 3 b 3 360 TCC ‘T¹ T Π¹ λ m rp C-AC AC-T GTT CCG TGG AAA GC-T AAC- GAC TAT CGC ATT ¹ ✓ 2 7 Ser Phe 7 Ί 3 Aso Ser Val Pro Tro Lvs C-ly Lys A.so Tvr Arc Ile 3 6 5 370 375 c-c-c Λ¹ U'C 1 ACT C-.AA C-CT CCG ACC GTA AAA. > rp rp CTC- TTG AAA C-C-C C-A.T 1333 C-lv Glv T 32Γ C-lu Alá Pro Thr Val Lys Ile Leu Leu Lvs Glv Aso 380 335 390 CGC TCA rp rp rp ATT GTT C-AT AGC TTC GAT TAT GGA rp > *p > rp rp CCG GCA 13 7 S Arg Ser Pne 7 JL 3 Var Aso Ser Phe Asp rp- .— 1 y r Gly Tyr Ile Pro Ara 395 400 405 ATG AAA GAC ATT ACT TTA. AAA TAAGTCTG TT G'T’CG^ TATC.A AG CTTATCGA 1429 Met Lys Asp 7 a s Thr Leu Lys

410 415

TACCGTCGA 1438 .

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polifruktán (leván) szukráz expressziója polifruktán (leván) szukráz aktivitást eredményez a kloroplasztokban, amiloplasztokban, mitokondriumokban, citoszólban, intercelluláris térben és/vagy a vakuólumokban.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított növény.
5. A 4. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy termény haszon növény.
6. A 4. vagy 5. igénypont szerinti növény, azzal jellemezve, hogy a növény kukorica, rizs, búza, árpa, cukorrépa, cukornád, dohány vagy burgonya növény.
7. Egy Erwinia amylovora polifruktán-szukráz DNS szekvencia (Seq-ID No. 1) alkalmazása módosított polifruktán képződéssel rendelkező növények előállítására.
8. A p35s-CW-LEV (DSM 7186), p35s-CY-LEV (DSM 7187) vagy a p33-CW-LEV (DSM 7188) plazmidok alkalmazása a levelekben és a gümőkben polifruktán expresszióval rendelkező növények előállítására .