HUT69790A - Tnf muteins - Google Patents

Description

/1990/]. A humán tumor nekrózis faktor-alfa /hTNF-a/ primer szerkezetét egy E. coli-ban klónozott és kifejezett cDNS nukleotid. szekvenciájából következtették le [Pennica és tsai: Natúré 312, 724-729 /1984/; Karmenout és tsai: Europ. J. Biochem. 152, 515-522 /1935/; Wand és tsai: Science 228, 149-154 /1985/; Shirai és tsai: Natúré 313» 803-8606 /1985/]. A hTNF-<x és a humán limfotoxin amiásav-szekvenciája között nagyfokú /30 %/ homológiát találtak; utóbbi anyag a gyakran tumor nekrózis faktor-bétának /hTNF-fi/ nevezett, főként limfociták által termelt citokin [Gray és tsai: Natúré 312, 721-724 /1984/; Fiers és tsai: Cold Spring Harbour Symp. 51, 587-595 /1986/].

A módosított aminosav-szek véne iákat tartalmazó hTNF-<x-t

- u.n. TNF-óe-muteinek - az irodalomban leírták [Yamagishi és tsai: Protein Engineering 3, 713-719 /1990/ vagy Piers: Tumor Necrosis Factors: Structure, Function and Mechanism of Action, Aggarwal és Vilcek /kiadók/, Karcéi Dekker, Inc., New York nyomdában, vagy Fiers és tsai: Bonavista és Granger, 77-81. o, /s.a./]. Ezenkívül a TNF-öc-muteinek számos szabadalmi bejelentés tárgyát képezik [pl. WO 86/02381, WO 86/04606, WO 88/06625 sz. nemzetközi szabadalmi bejelentések; 155 549, 158 286, 168 214, 251_O37 és 340 333 sz. európai közrebocsájtott európai szabadalmi bejelentések; és 3 843 534 sz. német közrebocsájtási irat].

Az irodalomban a limfotoxin muteinjeit is leírták /pl.

250 000, 314 094 és 336 383 sz. közrebocsájtott európai szabadalmi bejelentések/.

A TNF biológiai hatásait specifikus receptorok közvetítik, éspedig a nátrium-dodecilszulfát poliakrilamid gél elektroforézis /SDS-PAGl/ szerint 55 kD látszólagos molekulatömegü receptor • ·· ···· ·· • · · · · ·«· · ··· · • · · · • · · ······· · ·

/p55-TNF-^/ és az SDS-PACrE szerint 75 kD látszólagos molekulatömegű. receptor /p75-TNF-R/. A TNF—receptor mindkét formáját klónozták, éspedig a p55-TNF-R receptort Loetscher és tsai [Gell. 61, 351-359 /1990/] és a p75-TNF-R receptort pl. Dembic és tsai [Cytokine _2, 53-58 /1990/];/mindkét receptor klónozását, továbbá pl. a 90116707.2 sz. európai szabadalmi be jelentésben ismertették/· Az utóbbi időben azt találták, hogy mindkét receptor nem csupán a TNF-ac-t, hanem nagy affinitással a TNF-B-t is megköti [Schönfeld és tsaií J. Bioi. -Chem, 266, 3863-3869 /1991/].

Az irodalomból jólismert, hogy a TNF-cc biológiai aktivitásai alapján különböző rendellenességek kezelésére alkalmazható, így Pl· a TNF-ec önmagában vagy interferonnal kombinálva hatékony tumorellenes szer lehet [Brouckaert és tsai: Int. J. Cancer 38» 763-769 /1986/]. E vegyület szélesebbkörü gyógyászati alkalmazását azonban szisztémás toxicitása gátolja [Taguchi T. és Sohmura Y: Biotherapy 3.» 177-186 /L991/].

Azt találtuk, hogy egéren a humán TNF-ec /hTNF-<x/, amely csak a kisebb egér és patkány TNF receptorhoz /egér és patkány p55-TNF-l</ kötődik sokkal kevésbé toxikus, mint a mindkét egér TNF receptorhoz /p55-TNF-R és p75-TNF-R/ kötődő egér és patkány TNF-ec /mTNF-«/. így pl. C57B16 egéren a mTNF-ec és hTNF-ec LD_5Q értéke 10 ^ug/egér illetve 500 /ug/egér /lásd Brouckaert és tsai: Agents and Actions 26, 196-198 /1989/; Everaerdt B. és tsai: Biochem. Biophys, Rés. Gomm. 163» 378-385 /1989/; Lewis M, és tsai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2830 /1991/]. Ezért úgy tűnik, hogy a p75-TNF-R a szisztémás toxicitásban jelentős szerepet tölt be • · · ·· ···· ·· • · · · • · · · · · • · · · · · • · · ·· ······· ··

-ΛΑ hTNF-« és mTNF-ec csaknem azonos mértékben kötődik a humán P55-TNF-R és humán p75-TNF-R receptorhoz. Azonban azok a hTNF-« mutánsok, amelyek a hp55-TNF-R által közvetített biológiai aktivitást megtartják, a hp75-TNF-R receptoron mutatott aktivitást azonban csaknem teljes egészében elvesztették, az egér- és patkányrendszerben a hTNF-α funkcionális ekvivalensei és primátusokban várhatóan kisebb szisztémás toxicitást mutatnak.

A humán p75-tumor nekrózis faktor receptorhoz /hp75-TNF-R/ és a humán p55-tumor nekrózis faktor receptorhoz /hp55-TNF-R/ szignifikáns mértékben eltérő kötődési affinitást mutató humán nekrózis faktor muteineket a 486 908 sz. közrebocsájtott európai szabadalmi bejelentésben írtak le.

Azt találtuk, hogy olyan hTNF muteinek vagy gyógyászatilag alkalmas sóik, amelyek a humán tumor nekrózis faktor aminosav-szekvenciája legalább 86-helyzetében változást tartalmaznak /a szerin maradék helyett treonin van jeleiy' a hp55-TNF-R receptorhoz való kötődési aktivitásukat megtartják, ugyanakkor azonban a hp75-TNF-R receptorhoz való kötődésüket csaknem teljesen elvesztik. Ezenkívül azt találtuk, hogy az ilyen hTNF-muteinek a hp55-TNF-R által közvetett biológiai aktivitást megtartják, a hp75-TNF-R receptorhoz azonban nem kötődnek. A találmányunk szerinti hTNF muteineket azonban nem korlátozzuk az ilyen tipusu muteinekre. Találmányunk más tipusu muteinekre is kiterjed, amelyek kizárólag a hp55-TNF-R receptorhoz kötődnek, azonban a funkcionális sejtválaszt kiváltó kapacitásukat elvesztették.

Találmányunk humán p55-tumor nekrózis faktor receptorhoz /hp55- TNF-R/ szelektív kötődési affinitást mutató humán tumor nekrózis faktor muteinekre vonatkozik, amelyeket az jellemez, hogy

- 5 • · · · · · ··· ·· ······· ·· nakj a humán tumor nekrózis faktor aminosav-szek véne iájául egál ább a 86-helyzetében változást tartalmaznak, éspedig szer in-maradék helyett treonin van jelen,

A humán TNF-úc aminosav-szekvenciáját az /1/ képleten tüntetjük fel. A fenti aminosav-szekvenciát Pennica és tsai /s.a./ írták le vagy Marmenout és tsai /s.a./ vagy Wang és tsai /s.a./ vagy Shirai és tsai /s.a./ közölték vagy az érett TNF-oc-t kódoló pDS56/RBSII,SphI-TNPec plazmád /lásd la. és lb. ábra és I. példa/ inzertjének nukleotid szekvenciája kódolta.

A fentiekben meghatározott hTNF muteinek a hTNF aminosav-szekvenciája egy vagy több további helyzetében is változásokat hordozhatnak, előnyösen egy vagy két további helyzetben, különösen a 29, 31, 32, 29 és 32, vagy 31 és 32 helyzetben. Ezekben a további helyzetekben bármely aminosav - előnyösen a természetben előforduló aminosav - jelen lehet. A 29-helyzetben előnyösen szerin, glicin vagy tirozin, különösen előnyösen szerin lehet jelen. A 31-helyzetben levő helyettesítések szempontjából a glutaminsav vagy aszparagin előnyös. A 32-helyzetben levő helyettesítések tekintetében a tirozin, triptofán vagy treonin, különösen a triptofán és treonin előnyös.

A találmányunk szerinti hTNF muteinek további olyan aminosav-helyettesitéseket is tartalmazhatnak, amelyek a p55-TNF-R receptorhoz való szelektív kötődési affinitást nem változtatják meg. A fehérjék és polipeptidek olyan aminosav-helyettesitései, amelyek a biológiai aktivitást lényegében nem változtatják meg, az irodalomból jólismertek [lásd pl. Neurath H. és Hill R.L.: «The Proteins”, Academic Press, New York /1979/, különösen a 14. oldalon levő 6. ábra]. A leggyakoribb megfigyelt aminosav• · ··

- 6 -helyettesítések az alábbiak: Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Iys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly és fordítva, A találmányunk szerinti hTNF muteinek továbbá linker” szekvenciák által kódolt különböző aminosav-szekvenciákat tartalmazhatnak. Ezek a szekvenciák a hTNF muteinek kifejezésére felhasznált, a továbbiakban ismertetésre kerülő kifejező vektorok révén keletkezhetnek.

A találmányunk szerinti hTNF muteinek továbbá olyan specifikus szekvenciákat tartalmazhatnak, amelyek előnyösen affinitás hordozóanyagokhoz kötődnek. Az ilyen szekvenciák példájaként a legalább két szomszédos hisztidin-maradékot tartalmazó szekvenciákat említjük meg /lásd 282 042 sz. közrebocsájtott európai szabadalmi bejelentés/. Az ilyen szekvenciák nitriloecetsav nikkel kelát gyantákhoz szelektíven kötődnek [Hochuli és Döbeli: Bioi. Chem. Hoppe-Seyler 368, 748 /1987/; 253 303 sz. közrebocsájtott európai szabadalmi bejelentés]. Az ilyen specifikus szekvenciát tartalmazó hTNF muteinek a hTNF műtein aminosav szekvenciájának C-terminálisához vagy N-terminálisához vagy mindkét terminálisához kapcsolódhatnak.

A találmányunk szerinti hTNF muteinek különböző immunoglobulin nehéz láncú vagy könnyű láncú polipeptidekkel is kombinálhatók. Ez kimér hTNF mutein immunoglobulin polipeptidekhez vezet, amelyek in vivő hosszabb felezési idővel rendelkezhetnek. Hosszabb felezési időket tapasztaltunk pl. olyan kimer polipeptidek esetében, amelyek az emlős immunoglobulin nehéz lánca vagy könnyű lánca részéből konstans tartományának első két állnak [lásd

Traunecker és tsai: Natúré 331* 84-86 /1988/ és 394 827 sz. közre··· ·· ···· ·· ♦ · · · • ··· · · • · · · · · ··· ·· ······· ··

- 7 bocsájtott európai szabadalmi bejelentés].

A hTKF muteinek továbbá polimerekhez is kapcsolhatók /pl. 500-20.000 dalton molekulatömegü polietilénglikol vagy polipropilénglikol/. Ez védett hTNF mutein kompozíciókhoz vezet, amelyek lényegében nem-immunogének lehetnek. A polimerek és polipeptidek kapcsolására számos módszer ismert és ezeket az irodalomban le is írták /lásd pl. 4 179 337 sz. amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírás/.

Különösen előnyös találmányunk szerinti hTNF muteinek az alábbiak: Thr⁸⁶-TNF-«, Ser²⁹-Thr⁸⁶-TNF-«, Glu³¹-Thr⁸⁶-TNF-«, Trp³²-Thr⁸⁶-TNF-«, Ser²⁹-Trp³²-Thr⁸⁶-TNF-« vagy Asn³¹-Thr³²-Thr⁸⁶-TNF-a.

A találmányunk szerinti hTNF muteineket az irodalomból jól ismert módszerekkel állíthatjuk elő [Sambrook és tsai: Molecular Cloning, A Laboratory Karmai, 2. kiadás, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour Laboratory Press, USA /1989/] vagy a következő bekezdések. A példákban leirt módon határozható meg, hogy az ilyen hTNF muteinek a p55-TNF-R receptorhoz szelektíven kötődnek-e vagy sem. A találmányunk szerinti hTNF muteinek alternatív módon az irodalomból ismert standard kémiai módszerekkel is szintetizálhatók; előnyösen szilárdfázisu módszereket alkalmazhatunk [lásd Merrifield módszerei: J. Am. Chem· Soc. 85> 2149-2154 /1963/]. Találmányunk továbbá e muteinek sóira is kiterjed. A sók előállítása önmagukban ismert módszerekkel történik.

Feltételezésünk szerint a TNF-el összefüggő más betegségek és állapotok kezelésében általánosan használható az a stratégia, amely szerint a hasznos és nemkívánatos TNF-oc aktivitásokat • · ·· ···· ·· • · · · · · · • ··· · ··· · · • · · · · · ··· ·· ·*·· ··· ··

- 8 az egyik vagy másik TNF-receptorhoz specifikusan kötődő vegyületek - pl· a találmányunk szerinti hTNF-muteinek - felhasználásával szétválasztjuk·

Találmányunk tárgya továbbá a fentiekben le irt hTNF-muteineket kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó DNS-szekvéneiák. Az ilyen DNS-szekvéneiák hTNF-t kódoló genom- vagy cDNS-szekvenc iákból kiindulva, az irodalomban leirt /s.a·/ módon, az in vitro mutagenézis ismert módszereivel alakíthatók ki [lásd pl. Sambrook és tsai /1989/]· Az ilyen mutagenézist a kívánt tulajdonságok megfelelő vizsgáló rendszerekben történő meghatározása végett tesztelhető nagyszámú mutáns termelése céljából véletlenszerű módszerrel, vagy egy adott DNS-szekvencia meghatározott helyén történő mutáció előidézése céljából u.n. hely-irányitott műt agenéz issei [lásd pl. Sambrook és tsai: /19θ9/, 15.51-15.113] vagy polimeráz lánc reakció felhasználásával [lásd pl. White és tsai: Trends in Genetics 5,, 185-189 /1989/] végrehajtott mutagenézissel végezhetjük el.

A véletlenszerűen végzett mutagenézisnél alkalmazott egyik kémiai mutagén ágens a nátrium-biszulfit, amely a citozinmaradékot uracilmaradékká alakítja és ezáltal a ”C > ”T^W átmenethez vezet /nukleotidok standard rövidítése? a módszer tekintetében lásd pl. Shortle és Nathans, Procd. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 75, 2170-2174 /1978/ vagy Pine és Huang, Meth. Enzym. 154, 415-430 /1987/]· Ez a mutagén ágens csak az egyszálu DNS-re hat, mig a mutált cél DNS szekvencia kifejezése kettősszálu plazmid vektorral történik. A mutagenézisnél és kifejező vektoroknál az ujraklónozás többek között u.n. phazmidok alkalmazásával kerülhető el. Ezek vektorok, amelyek a replikáció plazmid eredetén kívül valamely ···

szálszerü fágból leszármaztatott replikáció eredetet is hordoznak. Az ilyen phazmidok példáiként a Stanssen és tsai által leírt [Nucleic Acids. Rés. 17, 4441-4454 /1989/] pKa- és mPc-phazmidokat említjük meg. Ezen kifejező rendszer felhasználásával u.n. hézag-duplex szerkezetek alakíthatók ki [lásd továbbá Kramer és tsaií Muci. Acids. Rés, 12, 9441-9456 /1984/], amelyekben csak a TNF-t kódoló szekvencia /s.a./ van egyszálú konfigurációban és ezért a specifikus kémiai mutagén ágens számára hozzáférhető. A véletlenszerű mutagenézisben felhasznált hézag-duplexek a hely-specifikus műtagenézissei kapcsolatban Stanssen és tsai által /s.a·/ leirt módon építhetők fel azzal a különbséggel, hogy a /-/szál ugyanazt az aktív antibiotikum rezisztens gént tartalmazza mint a /+/szál. A hTNFíe-t kódoló DNS-szekvenciában különböző restrikciós helyek felhasználásával a hézag szélessége változtatható. Az ilyen restrikciós helyek példáiként a Clal-Sall helyeket /470 nukleotid/, BstH-BstXl helyeket /237 nukleotid/ vagy Styl-Styl helyeket /68 nukleotid/ említjük meg. Az ilyen hézag-duplex összetételed ezután növekvő koncentrációjú /4 M-ig/ biszulf ittál kezelhetjük, majd számos dialízis lépésnek vethetjük alá [Shortle és Nathans /s.a·/ által leirt módon]. Egy megfelelő prokarióta gazdasejtet ezután az irodalomból ismert és pl. Sambrook és tsai /s.a./ által leirt ekkelj módszer/ ilyen phazmidokkal transzformálhatunk. Ebben az összefüggésben megfelelő prokarióta gazdasejten olyan gazdasejtet értünk, amely egy specifikus regeneráló funkciójában hiányos és ezért a replikáció alatt az uracil-maradék a DNS-ben megmarad; ez a gazdasejt továbbá a megfelelő mutált TNF kifejezésére képes. Az ilyen specifikus gazdasejtek az irodalomból ismertek, pl. E. coli törzsek, mint pl. E. Coli BW 313 [Kunkel T.A.: Procd. Natl. Acad.

• 4 * ♦ · ·« 44 · • · * · · 9· • ··· · · · · · · • · · · ·4 • •4 ·· ·44· ···· <4

- 10 Sci. USA 82, 488-492 /1985/]. A keletkező kiónokból screeneléssel megfelelő vizsgáló rendszerek segítségével kiválasztjuk azokat, amelyek a kívánt hTNF kifejezésére képesek. így pl. el járhatunk oly módon, hogy minden telepet mikrotiter-lemezen a releváns antibiotikumot tartalmazó megfelelő táptalajban inokulálunk. A sejteket lizozim hozzáadásával lizálhatjuk, majd szekvenciális fagyasztásos-felengedéses ciklusokat hajtunk végre. A nukleinsavak kicsapása és centrifugálás után minden telep felüluszó ját közvetlenül a megfelelő vizsgálatoknak vethetjük alá, pl. a Ila, és Ilb. vagy VIII. példában leirt módon, amelynek során élősejtek felületén vagy tisztított formában mérjük a p75-TNP-H és p55-TNF-R receptorhoz történő kötődést.

A mutáció specifikus helyeit pl. restrikciós fragmens analízissel határozhatjuk meg [lásd pl. Sambrook és tsai /s.a./]. Az ilyen fragmensek DNS-szék véneiájának me^iatározásával a mutáció pontos helyzete meghatározható és ha az ilyen mutáció aminosav-cseréhez vezet, úgy az uj aminosav a meghatározott DNS-szekvenciából leszármaztatható. A DNS szekvenciálást az irodalomból ismert módszerekkel végezhetjük el, pl. T7 polimeráz felhasználásával szuperspirális DNS-en a kereskedelemben beszerezhető szekvenciáié kit segítségével /Pharmacia, Uppsala, Svédország/.

Mint már említettük, egy adott DNS-szekvencia mutálására rendelkezésre álló másik lehetőség a hely irányított mutagenézis”. Az ilyen tipusu nnitagenézis széleskörűen használt stratégiáját Hutchinson és Adgell [J. Virol. 8, 181 /1971/] írták le; ennek lényege, hogy a kívánt nukleotid helyettesítést hordozó szintetikus oligonukleotidet valamely egyszálu DNS-szekvencia azon cél-tartományába építjük be, ahol a mutációt el kívánjuk

- 11 • · · · · » · • ··· · ··· · · • · · · · · ··· *· ······· · · végezni [lásd pl. Smith. Annual Rév. Génét. 19, 423 /1985/J javított módszerek vonatkozásában lásd Stanssen és tsai: 2-6. hivatkozás /1989/].

Egy ilyen előnyös módszert Stanssen és tsai /1989/ írtak le, amelynek során hézagos duplex DNS'*-t alkalmaznak a Kramer és tsai /1984/ által leirt módon [lásd fent és Kramer és Fritz: Methods in Enzimology,/1987/, Academic Press Inc. /USA/], azonban a mutációt tartalmazó szál kiválasztásához M13 funkcionális gének helyett antibiotikum rezisztens géneket alkalmazunk, a phasmid-technológián kívül [lásd továbbá Stanssen és tsai /1989/ /s.a./]. E rendszer előnye, hogy egymásután több mutagenézis ciklus elvégzésére képes anélkül, hogy a gént egy uj mutagenézis vektorra át kellene vinni; a második mutagenézis ciklus csupán abban különbözik, hogy egy másik antibiotikum markert kell kiválasztani /Stranssen és tsai s.a./. Kontrollként a mutánsnak a vadtipusu TNF-é történő hely-specifikus visszamutagenézise alkalmazható. Ezenkívül a TNF génben egy restrikciós helyet létrehozó vagy megszüntető oligonukleotid alkalmazása esetén a mutáns nem csupán a hely-irányitott mutagenézishez felhasznált oligonukleotiddé történő hibridizáció utján ellenőrizhető, hanem a restrikciós hely jelenléte vagy hiánya által is. Az aminosav-szekvenciában a vadtipusu aminosavak helyén bármely természetben előforduló aminosavat tartalmazó hTNP rautein készlet előállítása céljából egy oligonukleotid készletet alkalmazunk, amely a meghatározott helyzetekben minden lehetséges kodont tartalmaz.

Mint már említettük, egy adott DNS-szekvencia mutálásának további lehetősége a polimeráz lánc reakciót /PCR/ alkalmazó mutagenézis. A módszer elveit pl. White és tsai /1989/ ismertették, ·· · · · · · • ··· · ··· · · • · · · · · *·· ·· ······· · ·

- 12 mig javított módszereket pl. Innia és tsai írtak le [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press lile. /1990/].

A PCR nagymennyiségű, meghatározott hosszúságú és szekvenciáju specifikus DNS fragmens kis mennyiségű templát DNS-ből történő termelésére szolgáló in vitro módszer. A PCR a cél szekvencia ellentétes szálaihoz hibridizáló két oligonukleotid primer által szegélyezett DNS fragmens enzimes amplifikációján alapul. A primerek orientációja olyan, hogy 3* végeik egymásfelé mutatnak. A templát hővel több ciklusban végzett denaturálása, a primereknek komplementer szekvenciáikhoz történő illesztése és az igy átalakított primerek DNS polimerázzál végrehajtott kiterjesztése a PCR primerek 5* végei között levő szegmens amplifikációját eredményezi. Minthogy minden primer kiterjesztett terméke egy másik primer templátjaként szolgálhat, minden ciklus lényegében megkétszerezi az előző ciklusban termelt DNS fragmens mennyiségét. Minthogy a primerek a megsokszorozott termékbe fizikailag beépülnek s a primer 5* végei és a templát közötti hibás összeillesztések az amplifikáció hatékonyságát jelentős mértékben nem befolyásolják, a megsokszorozott szekvencia megváltoztatható és ezáltal a kívánt mutáció a megsokszorozott DNS-be beépíthető. A termofii Thermus aquaticus baktériumból izolált termostabil Taq DNS polimeráz felhasználásával a polimeráz denaturálódása elkerülhető; ez a denaturálódás mindez ideig minden egyes denaturálási lépés után enzim hozzáadását tette szükségessé. E fejlesztés segítségével a PCR számos egyszerű, hőmérséklet-cikluson alapuló berendezés felhasználásával automatizálható. Ezenkívül az amplifikációs reakció specifikussága oly módon növelhető, hogy a primer ··· • I» ·« <) · ·· • · · · • * ·« · · • · · · · · ··· ·· ···· ··· ··

- 13 beillesztésnél és kiterjesztésnél magasabb hőmérsékleteket alkalmazunk. A megnövelt specifikusság a megsokszorozott termékek összkitermelését azáltal javítja, hogy a nem célzott fragmensek között az enzimekért és primerekért folyó versengést minimumra csökkenti.

Az oligonukleotidok megtervezését és szintézisét az irodalomban ismert és pl. Sambrook és tsai /1989/ által leirt módon vagy a hely-irányitott mutagenézissei kapcsolatban idézett irodalmi helyek valamelyikében leírtak szerint végezhetjük el.

A találmányunk szerinti hTNF műteint kódoló DNS-szekvencia létrehozása után a kifejezést a fentiekben leirt phasmid technológiával vagy az irodalomból jól ismert bármely megfelelő prokarióta vagy eukarióta kifejező rendszer felhasználásával /lásd pl. Sambrook és tsai s.a./ végezhetjük el.

A kifejezést előnyösen prokarióta sejtekben végezhetjük el, igy pl. az alábbi sejteket alkalmazhatjuk: E. coli, Bacillus subtilis stb., előnyösen E. coli, különösen E. coli KL2 törzsek, pl. Ml5 [DZ 291, Villarejo és tsai: J. Bacteriol. 120, 466-474 /1974/], HB 101 [ATCC No. 33694], WK6 /Stranssens és tsai s.a./ vagy E. coli SG13OO9 [Gottesmann és tsai: J. Bacteriol, 148, 265-273 /1981/]. A találmányunk szerinti hTNF muteineket továbbá alacsonyabb vagy magasabb rendű eukarióta sejtekben is kifejezhetjük, igy pl, élesztősejtekben /pl. Saccharomyces, Pichia stb./, szál szerű gombákban /pl, Aspergillus stb./ vagy sejt vonalakban /pl. kínai hörcsög petefészeksejtvonalakban stb./? a kifejezést előnyösen élesztősejtekben végezhetjük el [lásd: Sreekrishna és tsai: Biochem. 28, 4117-4125 /1989/? Hitzeman és tsai: Natúré 29£, 717-722 /1981/? 263 311 sz. európai közrebocsájtási irat].

- 14 A találmányunk szerinti hTNF muteinek az ilyen rendszerekben intracellulárisan vagy - a gén megfelelő adaptálása után - extracellulárisan fejeződnek ki [lásd Lermans és tsai: Gene 85, 99-108 /1989/].

Az E. coli-ban történő kifejezésre alkalmas vektorokat többek között az alábbi irodalmi helyeken Írták le: [Sambrook és tsai /s.a./ vagy Fiers és tsai: Procd. 8th Int. Biotechnology Symposium [Soc. Franc, de Microbiol., Paris, (Durand és tsai kiadó), 680-697. oldal /1988/] vagy a pDS családhoz tartozó egy vagy több specifikus vektor [Bujard és tsai: Methods in Enzymology, kiadó: Wu és Grossmann, Academic Press, Inc., 155. kötet, 416-433 /1987/; Stüber és tsai: Immunological Methods, kiadó: Lefkovits és Pernis, Academic Press, Inc., IV. kötet, 121-152 /1990/], mint pl. pDS56/RBSII,SphI-THF«(Thr86) Aásd I. példa/ vagy pDS56/RBSII,SphI-TNF«(Trp32Thr86) /lásd III. példa/ vagy pDS56/RBSII,SphI-TNFíc(Ser29Thr86) vagy pDS56/RBSII,SphI-TNFoc(Ser29Trp32Thr86) vagy pDS56/HBSII ,SphI-TNF«( Asn31Thr32Thr86) vagy pDS56/RBSII,SphI-TNF«(Glu31Thr86) /lásd IV. példa/]. Minthogy ezekkel a specifikus pDS56/RBSII plazmidokkal specifikus szabályozható promotor/operátor elemeik és riboszómás megkötő helyeik révén magas szintű kifejezés érhető el, a plazmidok az E. coli sejtekben csak akkor tarthatók fenn, ha a promotor/operátor elem aktivitását a lac represszornak az operátorhoz történő kötődése represszálja. A promotor aktivitása a kívánt sejtsürüségre IPTG hozzáadásával állítható vissza, amely a represszort inaktiválja és a promotort megtisztítja. Minthogy a legtöbb E. coli törzs nem rendelkezik az ilyen nagy kópiaszámu plazmidokban jelenlevő promotor szekvenciák funkciójának teljes represszálásához elegendő • ·« ·· ··»·

Λ · 9 4 • · ·· · · • · · ·*·· · '* » · ·

- 15 represszor molekulával, az ilyen E. coli törzseket /pl. E. coli M15 vagy SG13OO9/ a specifikus pDS56/RBSII plazmidokkal történő transzformálás plőtt a lac represszort kódoló valamely plazmiddal /pl. pREP 4 - lásd 2a. és b. ábra/ transzformálni kell? ezután a plazmidok az E. coli sejtekben stabilan fenntarthat ók. A pREP4 a lac represszor kódolásán kívül a pACYC184 plazmid [Chang és Gohen: J. Bacteriol. 134, 1141-1156 /1978/] egy tartományát is tartalmazza, amely a replikációhoz és a leánysejtekhez történő stabil transzmisszióhoz szükséges összes információt tartalmazza [további információk tekintetében lásd továbbá System fór high level production in E. coli and rapid purification of recombinant proteins: application to epitope mapping, preparation of antibodies and structure function analysis - Stüber és tsai: Immunological Methods, IV. kötet, 121-152. oldal, Lefkovits és Pernis /kiadók/, Academic Press, New York /1990/]·

A gazdasejteknek vektorok által végzett, a fentiekben leirt transzformációját bármely szokásos módszerrel végrehajthatjuk [lásd pl. Sambrook és tsai /s.a./]. Prokarióta gazdasejtek /pl. E. coli/ esetében DNS felvételére alkalmas kompetens sejtek az exponenciális növekedési fázis után összegyűjtött, majd az ismert kalcium-kloridos módszerrel kezelt sejtekből állíthatók elő. A transzformáció a gazdasejtből történő protoplaszt képzés után vagy az irodalomból ismert és leirt más módszerekkel is elvégezhető [Sambrook és tsai /s.a./]. Ennek megfelelően valamely vektor - különösen a fentiekben leirt hTNF muteint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazó, prokarióta vagy alacsonyrendü eukarióta gazdasejtekben történő kifejezésre képes vektorok - és az ilyen vektorok által transzformált gazdasejtek - különösen prokarióta • · • · ·

• · · · · · • · · · · · • · · · • ·· ······· · · gazdasejtek, pl, E. coli vagy alacsonyrendü eukari ót a gazdasejtek - szintén találmányunk tárgyát képezik·

A kívánt kifejező vektort tartalmazó gazdaszervezeteket általában a növekedés szempontjából optimális körülmények között tenyésztjük, Prokarióta gazdasejtek esetében az exponenciális növekedés végén - amikor az időegységre vonatkoztatott sejtszámnövekedés lassul - a kívánt hTNP műtein kifejezését indukáljuk, azaz a kívánt hTNF muteint kódoló DNS-t átírjuk és az átirt mRNS-t lefordítjuk. Az indukciót oly módon végezhetjük el, hogy a táptalajhoz valamely induktort vagy derepresszort adunk vagy a fizikai paramétereket módosítjuk /pl, hőmérséklet változtatás/. A találmányunk előnyös kiviteli alakjait képező kifejező vektorokban a kifejezést a lac represszor ellenőrzi. A kifejező kontroll szekvenciát izopropil-B-D-tiogalaktopiranozid /IPTG/ hozzáadásával derepresszál juk és ezátal a kívánt hTNF rautein szintézisét indukáljuk,

A transzformált gazdasejtek által fentiek szerint termelt találmányunk szerinti hTNP muteineket a fermentációs közegből nyerhetjük ki vagy a sejtek felnyitása után és/vagy a fehérje és peptid kémiában ismert bármely megfelelő extrakciós módszerrel izolálhatjuk, így pl, az alábbi kinyerési módszerek alkalmazhatók: ammónium-szulfátos kicsapás, dialízis, ultraszürés, gélszürés vagy ioncserélő kromatografálás, gél elektroforézis, izoelektromos fókuszálás, affinitás kromatográfia, mint pl. immunoaffinitás kromatográfia, HPLC stb. Különösen előnyösnek bizonyultak az alábbi eljárások: ammónium-szulfátos káesapdo és/vagy polietilénkicsapás, imines fdializis, affinitás kromatográfia, pl. fenil-agarózon, különösen fenil-sepharozon vagy ioncserélő kromato gráf álás, kü• · • · · · · · • · · · · · · ·· ··· · ·

- 17 Ionosén MONO-Q- és/vagy MONO-S-matrixon /Pharmacia, Uppsala, Svédország/ vagy különösen a Tavemier és tsai által leirt [J. Mól. Bioi. 211, 493-501 /1901/] és az V. példában leirt módszer.

Találmányunk tárgya ennek megfelelően eljárás a fentiek ben meghatározott hTNF muteinek előállítására oly módon, hogy valamely, a fentiekben leirt transzformált gazdasejtet megfelelő táptalajban tenyésztünk, a műteint a feliiluszó tenyészetből vagy magából a gazdasejtből izoláljuk és a műteint kívánt esetben sóvá alakítjuk. A fenti eljárással előállított vegyületek ugyancsak találmányunk tárgyát képezik.

A találmányunk szerinti hTNF muteineket az jellemzi, hogy a humán p55-TNF-R receptorhoz szelektíven kötődnek. Ezt a tulajdonságot az irodalomból a kötődési affinitások mérésére ismert bármely módszerrel meghatározhatjuk. így pl. a TNF és a találmányunk szerinti muteinek kötődését sejttenyészetekben olyan sejtek alkalmazásával határozzuk meg, amelyek a TNF receptorok két típusát különböző mértékben fejezik ki; ilyen sejtek pl. a Hep-2 sejtek, amelyek kizárólag a humán p55-TNF-R receptort fejezik ki vagy az U937 vagy HL60 sejtek, amelyek ezenkívül a humán P75-TNP-R receptort is kifejezik /Brockhaus és tsai: Procd. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 87, 3127-3131 /1990/; Hohmann és tsai: J. Bioi. Chem. 264, 14927-14934 /1989/; Loetscher és tsai: /1990/; Dembic és tsai /1990/]. A kötődési affinitások természetesen közvetlenül, tisztított natív vagy rekombináns p55-TNF-R és P75-TNF-R felhasználásával, a példákban le irt módon vagy az ilyen receptorok megfelelő oldható analógjai alkalmazásával is me ghat ározhat ók.

• · • · · ·

- 18 A jelen szabadalmi leírásban használt humán p55-tumor nekrózis faktor receptorhoz történő szelektív kötődési affinitás kifejezés azt jelenti, hogy a két TNP-receptorhoz irányuló kötődési affinitás közötti különbség a meghatározáshoz felhasznált vizsgálatok szerint olyan jelentős mértékű, hogy a találmányunk szerinti muteinek a vadtipusu TNP-hez hasonlóan a p55TNP-receptorokhoz szelektíven kötődnek, ugyanakkor azonban a hp75-TNF-R-hez történő kötődést funkcionálisan lényegében elvesztették. Pontosabb meghatározás szerint a példákban bemutatott vizsgálati rendszer vonatkozásában a fenti kifejezés azt jelenti, hogy a találmányunk szerinti specifikus hTNP műtein Kp értéke a rekombináns oldható hp75-TNP-R receptorral végzett in vitro kötődési teszt szerint legalább 10-szer és előnyösen legalább 10 -szer nagyobb mint a vadtipusu TNP-« megfelelő értéke, mig ugyanezen hTNP inutein Kp értéke a rekombináns oldható hp55-TNP-R receptorral végzett in vitro kötődési teszt szerint legfeljebb kétszerese a vadtipusu TNP-íc megfelelő értékének. Megjegyezzük azonban, hogy a fenti specifikus Kp értékek csupán tájékoztató jellegűek és szabadalmunk oltalmi köre szempontjából semmilyen korlátozást nem jelentenek.

A találmányunk szerinti hTNP muteinek tumorellenes hatását az irodalomból ismert módszerekkel határozhatjuk meg.

A találmányunk szerinti hTNP muteineket orálisan, injekció vagy helyi utón felhasználásra kerülő készítmények formájában alkalmazhatjuk. A hatóanyag dózisát oly módon választjuk meg, hogy a hTNF mutein funkcióval kapcsolatos biológiai funkciót hatékonyan módosítsa.

Találmányunk tárgya továbbá gyógyászati készítmény, amely találmányunk szerinti hTNP muteineket és megfelelő inért • · ··

- 19 gyógyászati hordozóanyagokat tartalmaz. Bármely szokásos gyógyászati hordozóanyag felhasználható. E célra enterális, perkutáns vagy parenterális adagolásra alkalmas, szerves vagy szervetlen hordozóanyagok alkalmazhatók, pl. víz, zselatin, gumiarábikum, laktóz, keményítő, magnézium-sztearát, talkum, növényi olajok, polialkilénglikolok, vazelin stb. A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények további hatóanyagokat is tartalmazhatnak. A készítmények ezenkívül más adalékanyagokat is tartalmazhatnak, pl. ízesítő-, tartósító-, stabilizáló-, emulgeálószereket, puffereket stb. A készítmények a gyógyszergyártásnál használatos adalékanyagokat tartalmazhatnak.

A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények bármely szokásos formában előállíthatók, pl.

a/ orális adagolásra szolgáló szilárd formák, pl. tabletták, kapszulák, pilulák, porok, granulák stb.;

b/ orális adagolásra szolgáló folyékony formák, pl. oldatok, szirupok, szuszpenziók, elixirek stb.;

c/ parenterális adagolásra szolgáló készítmények, pl. steril oldatok, szuszpenziők vagy emulziók; és d/ helyi alkalmazásra szolgáló formák, pl. oldatok, szuszpenziók, kenőcsök, krémek, gélek, mikronizált porok, aeroszolok stb.

A gyógyászati készítmények sterilezhetők és adjuvánsokat /pl. tartósító-, stabilizáló-, nedvesítő-, emulgeálószerek, az ozmózisnyomás változását előidéző sók és/vagy pufferek/ tartalmazhatnak.

A parenterális adagolásra szolgáló készítmények intravénásán vagy intramuszkulárisan befecskendezhető infúziós vágyinjekciós oldatok lehetnek. Ezek a készítmények további gyógyászati • · ·

- 20 hatóanyagokat is tartalmazhatnak. A készítményekhez adalékanyagokat /pl. tartósító-, stabilizáló-, emulgeálószerek, puff erek stb./ is adhatunk, a gyógyszergyártás szokásos módszereinek megfelelően.

Találmányunk tárgya továbbá eljárás gyógyászati készítmények előállítására oly módon, hogy valamely találmányunk szerinti vegyületet és kívánt esetben további gyógyászati hatóanyagokat nem-toxikus inért gyógyászatilag kompatibilis hordozóanyagokkal összekeverünk és a keveréket galenikus formára hozzuk.

Találmányunk tárgya továbbá a találmányunk szerinti eljárással előállított vegyületek felhasználása gyógyászati készítmények előállítására.

Találmányunk tárgya továbbá a találmányunk szerinti hTNF muteinek ellen termelt antitestek. Az ilyen antitestek jólismert módon diagnosztikai vagy gyógyászati célokra és tisztítási módszereknél alkalmazhatók. Az antitesteket oly módon termeljük, hogy egy emlősbe vagy madárba a találmányunk szerinti hTNF műtein elleni antitest termelésének megindításához eigendő mennyiségű találmányunk szerinti hTKF muteint és gyógyászatilag kompatibilis hordozóanyagot tartalmazó vakcinát fecskendezünk. Az e célra szükséges hTNF mutein mennyiség a szakember által jólismert vagy rutin kísérletekkel határozható meg. A jelen szabadalmi leírásban használt gyógyászati hordozóanyag kifejezés a humán gyógyászatban alkalmazható standard készítményekben vagy állati vakcinákban használatos tipikus adjutánsokra vonatkozik.

A TNF potens pleiotrop citokin. Számos különböző aktivitása /pl. immun sejtek növekedési faktorának aktiválása, gyulladásoknál betöltött közvetítő szerep vagy az endotéliumban levő • ·· · • · · · · · · • ·*4 · ··· · · • · · · · * ··· ·· ···· ··· ··

- 21 specifikus gének induktora/ a gazdaszervezetnek fertőzésekkel vagy sérülésekkel szemben kifejtett védekezésében játszik szerepet. A TNF erős szisztémás toxicitást is mutat; a bakteriaemia káros hatásait és a bakteriális meningitis okozta szeptikus sokkot nagy mértékben endogén citokinek közvetítik és ezek között a TNF korai és fontos szerepet tölt be. Ezenkívül a TNF közvetlen citotoxikus aktivitásával szemben sok sejt és sejtvonal érzékeny. Állatkísérletek tanúsága szerint a TNF tumorellenes hatásában különböző szisztémás hatások és celluláris toxicitás feltehetően komb inál ódnak .

A fenti tények reális alapot szolgáltatnak a találmányunk szerinti hTNF niuteineket felhasználó uj gyógyászati stratégiák kidolgozására; ezek során a sok különböző hTNF aktivitás szétválasztásával a nemkívánatos toxikus hatásokat a kívánt aktivitásoktól különválasztjuk, így pl. a találmányunk szerinti hTNF muteineket magas dózisokban tumorellenes szerként alkalmazzuk; ezt a feltehetően alacsony szisztémás toxicitás teszi lehetővé és ily módon a vadtipusu hTNF rákos betegekben történő felhasználhatóságát feltehetően igen nagy mértékben leszűkítő dóziskorlátozó toxicitás kiküszöbölhető. A találmányunk szerinti hTNF muteinek potenciális felhasználását azonban nem korlátozzuk a rák gyógyítására. Az 55kDa TNF receptor tipusu specifikus gyógyszerek - pl. a találmányunk szerinti hTNF muteinek - minden olyan betegség kezelésében kedvezően alkalmazhatók, amelyben a TNF gazdaszervezet védekező faktorként bakteriális fertőzésekben [lásd pl. Kindler V. és tsaií CELL 56, 731-740 /1989/; Nakano Y. és tsai: J. Immunoi. 144, 1935 /1990/] vagy gyulladásokban közvetítőként jótékony szerepet játszik. A TNF a cachexiában /leromlás/ is szerepet játszik [pl.

• a ··· ···· ·· • · · a • a a a a · • · · aaa aa a··· ··« »a

- 22 Beutler B. és Cerami /a.a./] és az alacsony szisztémás toxicitást mutató találmányunk szerinti TNF műtőinek elhízás ellenes kezelésnél is alkalmazhatók. Még a túlzott mértékű TNF felszabadulás által kifejtett toxikus hatások /pl* szeptikus sokk vagy bakteriális meningitis/ is kedvezően kezelhetők 55kDA TNF receptor specifikus agonistákkal /pl. a találmányunk szerinti muteinekkel/ vagy TNF antagonistákkal képezett kombinációkkal.

A TNF uj gyógyászati kezelésekben fokozott szerepet játszik. E kezelések során az alacsony szisztémás toxicitással rendelkező és a számos különböző TNF aktivitás közül csupán néhányat kiváltó, p55-TNF-receptor tipusu specifikus agonisták várhatóan jelentős előnyöket mutatnak a vadtipusu TNF-el szemben; rövid összefoglalás az alábbi irodalmi helyen található: Tumor Necrosis Factors, The Kolecules and their Bnerging Role in Medicine, B. Beutler, kiadós Raven Press /1992/, ISBN 0-88167-852-X. Ide tartoznak a TNF aktivitásai az alábbi területeken: endothelialis sejt homosztatikus tulajdonságok és neutrofil adhézió modulálása, szövet iskémia és reperfuziós sérülés, osteoblasztok és osteoclatok csont reszorpcióban, növekedési faktorként sok sejten általában és hematopoiesisben, valamint metabolikus és tápláló hatások. A celluláris védekező rendszert biztosító specifikus gének indukciója /pl. a p55-TNFR ellenőrzés alatt levő Mn-superoxid dismutáz indukciója/ [Lewis és tsai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2830 /1991/; Tartaglia és tsai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9292 /1991/] vagy a TNF számos sejtben kifejtett közvetlen citotoxicitása egyaránt racionális alapot szolgáltat a receptor tipusu specifikus TNF agonisták felhasználásával végzett uj gyógyászati stratégiákhoz. A TNF a limfokin által aktivált killer ··♦

sejtek /LAK/ kialakításában növekedés/differenciáló faktorként vesz részt és úgy tűnik, hogy ez a TNF tumorellenes aktivitásában szerepet játszik·

Fontos tényező, hogy valamennyi fentemlitett aktivitás más rekombináns citokinekkel /pl· gamma-interferonnal/ kombinálva fokozható vagy módosíthat6.

Találmányunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy az oltalmi kört e példákra korlátoznánk· Az alábbi rövidítéseket és szimbólumokat alkalmazzuk: Β, E, H, S, Xb és X a BglI, EcoRI, HindlII, Sáli, Xbal illetve Xhol restrikciós enzimek hasítási helyeit jelölik.

| jelentése a N25OPSN25OP29 szabályozható promotor/operátor elem;

jelentése a RBSII,SphI szintetikus riboszómás kötődési hely; aÉawíKielentése a TNF« /TNFe/, beta-laktamáz /bla/, kloramfenikol acetil transzferáz /cat/, lac represszor /lacl/ és neomicin foszfotranszferáz /neo/ génjei;

lllllíjill jelentése a fág lambda t_Q transzkripciós terminátora /ΐθ/ és az E. coli rroB operon TI /TI/;

jelentése a pBR322 és pREP4 /repl/ plazmid replikáéiós tartományai;

--> jelentése a N25OPSN25OP29 és RBSII,SphI által ellenőrzött kódoló tartomány.

Az la. ábrán a pDS56/RBSII ,SphI-TNFa plazmid sematikus rajzát tüntetjük fel.

Az 1b. ábra a pDS56/RBSII,SphI-TNFec plazmid teljes nukleotid szekvenciáját tartalmazza. Ebben a szekvenciában a restrikciós enzimeknek az la. ábrán feltüntetett felismerő szék-

··« ·· venciáit megjelöltük. A bemutatott aminosav-szekvencia az érett TNFa /157 aminósav/ hárombetűs kódban feltüntetett aminosav-szekvenciája.

A 2a. ábrán a pREP4 plazmid sematikus rajzát tüntetjük fel.

A 2b. ábra a pREP4 plazmid teljes nukleotid szekvenciáját tartalmazza. Ebben a szekvenciában a restrikciós enzimeknek a 2a. ábrán feltüntetett felismerő szekvenciáit bejelöltük.

A 3. ábrán a Thr^-TNFee képletű TNF« műteint kódoló EcoRI-HindlII fragmens készítését tüntetjük fel.

A 4. ábra a pDS56/RBSII,SphI-INFcí/Trp32/ plazmid 1 fragmensének nukleotid szekvenciáját tartalmazza.

Az 5. ábrán a pDS56/RBSII,SphI-TNPo/Ser29/ plazmid fragmensének nukleotid szekvenciáját tüntetjük fel.

A 6. ábra pDS56/RBSII,SphI-TNF<s/Ser29Trp32/ plazmid fragmensének nukleotid szekvenciáját tartalmazza.

A 7. ábrán a vadtipusu humán TNFa és Thr^, Trp^-Thr^ PQ 7>p gr és Ser -Trp^J -Thr muteinek rekombináns humán p-75 és p-55 TNF-R receptorokon mutatott korapetitiv kötődését mutatjuk be.

Rekombináns humán p-75TNF-R-I^|3 fúziós fehérjével /A lemez/ és rekombináns humán p-55TN?-R-IgG^3 fúziós fehérjével /B lemez/ bevont mikrotiter lemezeket különböző koncentrációjú

Q /* vadtipusu TNFoc /töltött körök/, Thr° mutein/üres körök/, jp oc ρη ·}ρ gr

Trp^J -Thr mutein /üres négyzetek/ és Ser ’Trp*⁵ -Thr mutein /üres háromszögek/ jelenlétében, radioaktív jelzett humán TNFec-al inkubálunk. A szobahőmérsékleten megkötött radioaktivitást 3 óra múlva gamma-számlálóban megszámláljuk.

86

A 8. ábrán a vadtipusu humán TNFa és Ser -Thr , ·· «···

- 25 ·♦« ·· • · · · · ·· · · • · · · · · ··· ·· ···· ««· ··

Glu^-Thr^ és Asn^-Thr^-Thr^ nruteinek rekombináns humán p-75 és p-55TNF-R receptorokon mutatott kompetitiv kötődését mutatjuk be.

Rekombináns humán p-75TNF-R-IgG^3 fúziós fehérjével /A ábra/ és rekombináns humán p-55TNF-R-IgG^3 fúziós fehérjével /B ábra/ bevont mikrotiter lemezeket különböző koncentrációjú vadtipusu TNF« /töltött körök/, Ser -Thr műtein /nyitott körök/,

Asn^-Thr^-Thr^ mutein /üres négyzetek/ és Glu^-Thr^ mutein /üres háromszögek/ jelenlétében, radioaktív jelzett TNFoc-al inkubálunk. A szobahőmérsékleten megkötött radioaktivitást 3 óra múlva gamma-számlálóval megszámláljuk.

Az alábbiakban a szilárd anyagokra szilárd anyagok keverékeiben, folyékony anyagokra folyadékokban és szilárd anyagokra folyadékokban megadott százalékos értékek tömeg/tömeg, térfogat/térfogat illetve tömeg/térfogat százalékban értendők.

I, példa pDS56/RBSII,SphI-TNF« plazmid

A találmányunk szerinti különböző TNF« műtőinek előállításánál TNFet gén forrásként a pDS56/RBSII,SphI-TNP« humán TNFoc kifejező plazmid /lásd 1. ábra/ szolgál. A transzformált E, coli 1515 /pREP4;pDS56/RBSII,SphI-TNFo/ törzset a Budapesti Szerződés értelmében szbadalmi célokra a Deutsche Sammlung von Mikroorganismer und Zellkulturen GmbH /DNM/ intézetben /Braunschweig, Németország/ 1991· szeptember 8-án 6713 számon deponál tűk.

TNFec gén mutagenézise PCR felhaszná^lásával

Két PCR reakciót végzünk a pDS56RBSII ,SphI-TNFec /1· ábra/ plazmiddal, mint templát DNS-el, Perkin-Elmer Cetus GeneAmp^ DNS ··· • · ·· ···· ··· ampl ifikáló reagens kit felhasználásával, az AmpliTaq^R rekombináns Taq DNS polimerázzal /lásd 3. ábra/.

Az I. reakciót a 17/F S’-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG^’;

[a 17/F primer a pDS56/RBSII,SphI-TNF« plazmid 3949-3970 nukleotid jeit tartalmazza] és a 29/M22 5-GTAGGTGACGGCGATGCGGCTGATGGT-3’;

[a 29/M22 primer olyan nukleotidokat tartalmaz, amelyek a pDS56/RBSII,SphI-TNFoc plazmid 378-352 nukleotidjaival komplementerek] primerekkel végezzük el.

A II. reakciót a 29/MH1 5*-CAGACCAAGGTCAACCTCCTC-3’;

(a 29/MK1 primer a pDS56/RBSII,SphI-TNFec plazmid 379-399 nukleotidáeit tartalmazza] és a 17/0 5’-CATTACTGGATCTATCÁACAGG-3* ;

[a 17/0 primer olyan nukleotideket tartalmaz, amelyek a pDS56/RBSII,SphI-TNFa plazmid 748-727 nukleotidjeivel komplementerek] primerekkel végezzük el.

/1,25 mM dATP, dGTP, dCTP és dTTP/, 10 /ul lOx reakció puffért /100 mM trisz-HCl, pH 8,3, 500 mM KC1, 15 mM MgClg és 0,1 % zse-

Eppendorp csőben összekeverünk és 80 ml ásványolajat /Perkin-ELmer Cetus/ rétegezőnk föléje. A csöveket DNS termikus ciklizálóba /TRIO-Thermoblock, Biometra/ visszük át és egy percen át 94 °C-on tartjuk; 35 ciklus előtt a DNS megolvasztását /1 perc 94 °c/, a primerek anneálását /1 perc 50 °C/ és a primerek kiterjesztését /3 perc 72 °C/ végezzük el. Ezután további 2 percen át 72 °C-on tartjuk, a reakcióelegyeket szobahőmérsékletre hütjük és kloroformmal extraháljuk. A vizes fázisban levő DNS-t etanollal kicsapjuk és 6 %-os poliakrilamid gélben elektroforézisnek ·«· • · · · · · • · · · · · ··· ·· «····«· · ·

- 27 vetjük alá [Sambrook és tsai, /1989/]. A DNS-t etidium-bromiddal megfestjük, majd az I. és II, fragmenst /lásd 3. ábra/ a gélről izoláljuk és tisztítjuk /Sambrook és tsai, 1989/.

A Thr -TNFa muteint kódoló DNS fragmens készítése

Az I. és II. fragmenst enzimesen foszforilezzük, majd egymással ligáijuk /Sambrook és tsai, 1989/. A ligáz hővel történő inaktiválása és EcoRI és Hindin restrikciós enzimekkel végzett emésztés után DNS—t 6 %-os poliakrilamid gélben elektroforézisnek vetjük alá. Ezután a DNS-t etidium-bromiddal megfestjük, majd az EcoRI-HindlII A fragmenst /lásd 3. ábra/ a gélről izoláljuk és tisztítjuk /s.a./.

A Thr -TNFoe muteint kódoló plazmád készítése

A EcoRI-HindlII A fragmenst standard módszerekkel /Sambrook és tsai, 1989/ az EcoRI-HindlII által felnyitott pDS56/RBSII,SphI-TNFec plazmádba beillesztjük és ily módon a pDS56/RBSII,SphI-TNF«/Thr⁸⁶/ plazmidot alakítjuk ki. A DNS plazmidot elkészítjük /Bimbóim és tsai, 1979/ és a TNFoc muteint kódoló tartomány identitását a két szálú DNS szekvenciálásával igazoljuk /Sambrook és tsai, 1989/·

Thr -TNF« termelése

A pDS56/RBSII,SphI-TNFe/Thr86/ plazmidot Btandard módszerekkel /s.a./ olyan E. coli M15 sejtekbe transzformáljuk, amelyek a pREP4 plazmidot már tartalmazzák. A transzformált sejteket 37 °C-on iS-táptala-jbaH 100 mg/1 ampicillint és 25 mg/liter kanamicint tartalmazó LB táptalajban /Sambrook és tsai, 1989/ tenyésztjük.

600 nm optikai sűrűség mellett kb. 0,7-1,0 IPTG-t adunk hozzá, végső koncentráció 2 mM. Az elegyet további 2,5-5 órán át 37 °C-on tartjuk, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtjük.

• · · · « · · • ··· ······ • · · · · · ··· ·· ·«·· ··· ··

- 28 II. példa

Glu³¹—TNFoc és Asn³¹,Thr³²-TNF« előállítása

Elvi megfontolások

A Glu³^·-TNFec és Asn³^Thr³²-TNFoc muteineket az I. példágr bán a Thr° -TNFíc készítése kapcsán részletesen leirt eljárással állítjuk elő. Ezért a fenti TNFa muteinek előállításával kapcsolatban csak az I. és II. PCR reakciókban felhasznált primereket írjuk részletesen le. Ezenkívül a különböző TNFa muteineket kódoló kifejező plazmidok nevét tüntetjük fel.

Crlu^-TNFa előállítása

A PCR I. reakciót a 17/F [5’-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG-3»;

a 17/F primer a pDS56/llBSII,PshI-TNFíc plazmid 3949-3970 nukleotidjeit tartalmazza] és a 21/M5 [5-ATTGGCCCGCTCGTTCAGCCACTGGAGCTGCCCCTC-3*; a 21/M5 primer olyan nukleotidokat tartalmaz, amelyek a pDS56/RBSII,SphI-TNFec plazmid 219-184 nukleotidjaival komplementerek; a mutált bázisokat aláhúztuk] primerekkel végezzük el.

A PCR II. reakciót a 21/MR [5’-GCCCTCCTGGCCAATGGCGTGG-3^,;

a 21/MR primer a pDS56/RBSII,SphI-TNF« plazmid 220-241 nukleotidjeit tartalmazza] és 17/0 [5’-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3’; a 17/0 primer olyan nukleotidokat tartalmaz, amelyek a pDS56/RBSII,SphI-TNFűt plazmid 748-727 nukleotidjeivel komplementerek/ primerekkel végezzük el.

A kapott pDS56/RBSII,SphI-TNFe/Glu31/ kifejező plazmidot a Glu³¹-TNF« előállításánál és a pDS56/RBSII,SphI-TNFe/Glu31Thr86/ plazmid felépítésénél használjuk fel /lásd IV. példa/.

Asn³¹Thr³²-TNFoc előállítása

A PCR I. reakciót a 17/F [5’-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG-3’;

a 17/F primer a pDS56/RBSII,SphI-TNF« plazmid 3949-3970 nukleotidjeit tartalmazza] és a 21/M6 [ 5-ATTGGCAGTGTTGTTCAGCCACTGGAGCTGCCCCTC- 29 • · · · · · « • ·*· · ··· · « • · · · · · ··· ·· ·«·· ··· · ·

-3*; a 21/M6 primer olyan nukleotideket tartalmaz, amelyek a pDS56/RBSII,SphI-TNF<e plazmid 219-184 nukleotidjeivel komplementerek; a mutált bázisokat aláhúztuk] primerekkel végezzük el.

A PCR II. reakciót a 21/MR [ 5^,-ΟΟΟΟΤΟΟΤΟΟΟΟΑΑ.ΉΟΟΟΤΟΟ-3’; a 21/MR primer a pIS56/RBSII,SphI-TNPdc plazmid 220-241 nukleotidjeit tartalmazza] és a 17/0 [ S’-CATTACTOGATCTATCAACAOO-B*; a 17/0 primer olyan nukleotideket tartalmaz, amelyek a pDS56/RBSII,SphI-TNF« plazmid 748-727 nukleotidjeivel komplementerek] primerekkel végezzük el.

A kapott pDS56/RBSII,SphI-TNF«/Asn311hr32/ kifejező plazmidot az Asn³^Thr³²TNFa előállításánál és a pDS56/RBSII,SphI-TNF<x/Asn31Thr32Thr86/ plazmid felépítésénél használjuk fel /lásd IV. példa/.

III. példa

Trp³²Thr⁸⁸-TNFa: előállítása

Elvi megfontolások

A Trp³²Thr⁸⁶-TNF<!c előállításánál a pDS56/RBSII,SphI-Tin?ö$/Trp32Thr86/ plazmidot építjük fel és ezután ezt használjuk fel E. coli-ban a Trp^Thr^-TNFa műtein előállítására.

A pDS56/RBSII,SphI-TNT‘ö/l?rp32Thr86/ plazmid felépítése

Az I. és II. példában leírt valamennyi plazmid a BglI enzim restrikciós enzim számára ugyanazt a két helyet tartalmazza mint a pDS56/RBSII,SpI-TNF« plazmid /lásd 1. ábra/. E két hely közül az egyik a beta-laktamáz génben, mig a másik a TNFec génben helyezkedik el. Az utóbbi a TNF« kódoló tartományát két részre választja szét; az egyik rész a ΤΝΕβε 1-36 aminosavát, mig a másik a TNFa 37-157 aminosavát kódolja /lásd lb. ábra/.

*·· ·· ·♦·· ·· • · · · * ··· « · • · ♦ · » · ··· ·· ···· ··· ··

- 30 Az pDS56/RBSII,SphI-TNFú/Trp32Thr86/ plazmid felépítése céljából DNS 1 és 2 fragmenst standard módszerekkel állítunk elő /Sambrook és tsai, 1989/· Az 1 fragmens /szekvenciákat lásd 4· ábra/ a pDS56/RBSII,SphI-TNFű/Trp32/ plazmid kis BglI fragmense, amely szabályozható promotort és a Trp³²-TNP« 36-ig terjedő aminosavainak kódoló tartományát tartalmazza. A 2 fragmens a pDS56/RBSII,SphI-TNFa/Thr86/ plazmid nagy BglI fragmense, amely a Thr -TNPoc 37-nél kezdődő aminosavainak kódoló tartományát és a plazmid replikációs tartományát tartalmazza. Az 1 fragmenst és az enzimatikusan defoszforilezett 2 fragmenst egymással ligáijuk /Sambrook és tsai, 1989/ és ily módon a pDS56/RBSII,SphI-TNP«/Trp32Thr86/ plazmidot alakítjuk ki.

Az M15/pREP4;pDS56/RBSII,SphI-TNP_ei/Trp32/ sejteket a Budapesti Megállapodásnak megfelelően szabadalmi célokra a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH /DSM/ intézetben /Braunschweig, Németország/ 1990. november 19-én DSM 6241 számon deponáltuk.

Trp³²Thr⁸⁸-TNF« termelése

A pDS56/RBSII,SphI-TNF<s/Trp32Thr86/ plazmidot standard mód· szerekkel /s.a./ olyan E, coli M15 sejtekbe transzformáljuk, amelyek a pHEP4 plazmidot már tartalmazzák. A transzformált sejteket 37 °C-on 100 mg/liter ampicillint és 25 mg/liter kanamicint tartalmazó LB táptalajban tenyésztjük. 600 nm optikai sűrűség mellett kb. 0,7-1,0 IPTG-t adunk hozzá 2 mM végső koncentrációban. Az elegyet további 2,5-5 órán át 37 °C-on tartjuk, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtjük.

IV. példa

Ser²⁹Thr⁸⁶-TNFec, Ser²⁹Trp³²Thr⁸⁶-TNPq, Glu³¹Thr⁸⁶-TNPcc ·· ·«·· ·· • · · ·♦· 4 · • ·

és Asn³¹Thr³²Thr^8G-TNF«c előállítása

Elvi megfontolások

A Ser²⁹Thr⁸⁶-TNF<ie, Ser²⁹Trp³²Thr⁸⁶-TNF«, Glu³¹Thr⁸⁶-TNFec és Asn³^Thr³²Thr⁸⁸-TNFíc TNFa muteineket a III. példában a pp 8£

Trp^J Thr -TNFöc előállításával kapcsolatban részletesen leirt eljárással állítjuk elő. Ezéirt a fenti TNFa muteinek előállításánál csak a III. példa 1 fragmensének megfelelő DNS fragmenseket ismertetjük részletesen. Ezenkívül a különböző TNFa muteineket kódoló kifejező plazmidok nevét adjuk meg.

Ser²⁹Thr⁸⁶-TNF« előállítása

Az 1 fragmens /a szekvenciákat az 5. ábrán tüntetjük fel/ a pDS56/RBSII,SphI-TNF'e/'Ser29/ plazmid kis BglI fragmense, amely a pq szabályozható promotort és a Ser TNFa 36-ig terjedő aminosavainak kódoló tartományát tartalmazza. Az 1 fragmenst és az enzimatikus defoszforilezett 2 fragmenst /lásd III. példa/ egymással ligái juk /Sambrook és tsai, 1989/ és a keletkező pDS56/RBSII,SphI-TNFa/Ser29Thr86/ plazmidot használjuk fel E. coli-ban a Ser²⁹Thr⁸⁸-TNFa termelésére.

Az Ml 5 [pREP4;pDS56/RBSII,SphI-TNFe/Ser29/J sejteket a Budapesti Megállapodásnak megfelelően szabadalmi célokra a Deutsche Sammlung von Mikro organismen und Zellkulturen GmbH /DSM/ intézetnél /Braunschweig, Németország/ 1990. november 19-én DSM 6240 számon helyeztük letétbe.

Ser²⁹Trp³²Thr⁸⁶-TNFa előállítása

Az 1 fragmens /a szekvenciákat a 6. ábrán tüntetjük fel/ a pDS56/RBSII,SphI-TNFe/Ser29Trp32/ plazmid kis BgLI fragmense, amely a szabályozható promotort és a Ser²⁹Trp-TNFa 36-ig terjedő aminosavainak kódoló tartományát tartalmazza. Az 1 fragmenst és az • 4 ·· Η«· ·· ·· · ♦ · · « • ··· · ·«· · · • · · · · · ··· ·· ·····«· ·· enzimatikusan defoszforilezett 2 fragmenst /lásd III. ábra/ egymással ligái juk /Sambrook és tsai, 1989/ és a képződő pDS56/RBSII,SphI-TNFe/Ser29Trp32Thr86/ plazmidot használjuk fel E. coli-ban a Ser²^Trp^²Thr⁸⁶-TNF« termelésére.

Glu³¹Thr⁸⁶-TNF<x előállítása

Az 1 fragmens a pDS56/RBSII,SphI-TNFöo/Glu31/ plazmid kis BglI fragmense, amely a szabályozható promotort és a Glu^-TNFee 36-ig terjedő aminosavainak kódoló tartományát tartalmazza. Az fragmenst és az enzimatikusan defoszforilezett 2 fragmenst /lásd III. példa/ egymással ligáljuk /Sambrook és tsai, 1989/ és a képződő pDS56/fíBSII,SphI-TNFe/Glu31Thr86/ plazmidot használjuk fel E. coli-ban a Glu^Thr^-TNEcc termelésére.

Asn³¹Thr³²Thr⁸⁶-TNFec előállítása

Az 1 fragmens a pDS56/RBSII,SphI-TirFe/Asn31Thr32/ plazmid kis BglI fragmense, amely a szabályozható promotort és az

32

Asn Thr^J -TNFöc 36-ig terjedő aminosavainak kódoló tartományát tartalmazza. Az 1 fragmenst és az enzimatikusan defoszforilezett fragmenst /lásd III. ábra/ egymással ligáljuk /Sambrook és tsai, 1989/ és a képződő pDS56/RBSII,SphI-TNFa/Asn31Thr32Thr86/ plazmidot has znál juk fel E. coli-ban az Asn^Thr^²Thr⁸⁸-TNPa termelésére.

V, példa

Humán TNFac muteinek tisztítása

A fentiekben leirt módon transzformált és indukált E. coli sejtek egyéjszakás tenyészetéből 1 litert centrifugálássál összegyűjtünk és 20 ml 50 mM trisz-ben /pH 7,2; 200 mM KD1; 50 mM MgClg, 5 % glicerin/ ujraszuszpendálunk. A sejteket présen 20 000 psi nyomáson feltörjük. Ezután centrifugálással /70 000 x g, 30 perc, 4 °C/ derítjük, majd 30 %-os végső koncentráióig szilárd ammóniám-

- 33 γ

-szulfátot adunk hozzá. Az oldatot szobahőmérsékleten egyjórán át —\ keverjük, majd 10 000 x g mellett /20 perc, 4°C/ centrifugáljuk.

A felüluszót 0,45 /um-os szűrőn átszűrjük és ammónium-szulfátban %-ra állítjuk be. A kiváló fehérjéket centrifugálással összegyűjtjük, 20 ml 20 mM trisz-ben /pH 9,0/ oldjuk és ugyanezzel a pufferrel szemben egy éjjelen át 4 °C-on dializáljuk. A dializált minták 1 ml-es aliquot részeit 20 mM trisz-el /pH 9,0/ kiegyensúlyozott MonoQ oszlopra /HR 5/5, LKB-Pharmacia/ visszük fel és lineáris nátrium-klorid gradiens szerint /0-400 mM^20 mM trisz-ben, pH 9,0/ 0,5 ml/perc csepegési sebesség mellett eluáljuk. 0,5 ml-es frakciókat gyűjtünk össze és TNFoe muteinek jelenlétére nátrium-lauril-szulfát’poliakrilamid gél elektroforézissei /SDS-PAGEJ/ megelemezzük. A pozitív frakciókat összegyűjtjük, 20 mM 2-morfolino-etánszulfonsawal/MES; pH 6,0/ szemben dializáljuk és 20 mM MES-el /pH 6,0/ kiegyensúlyozott MonoS oszlopra /HR 5/5, LKB Pharmacia/ visszük fel. A fehérjéket lineáris nátrium-klorid gradiens szerint /0-400 mM, 20 mM MES-ben, pH 6/ 0,5 ml/perc csepegési sebesség mellett eluáljuk. Az elektrofórétikusan tiszta fehérjeként értékelt különböző TNFec muteineket 250 mM és 350 mM nátrium-klorid között eluáljuk. Foszfáttal puff erőit nátrium-klorid-oldattal /PBS/ szemben végzett dialízis után a fehérje koncentrációt BOA fehérje meghatározással /Pierce Chemical Company/ meghatározzuk; standardként vadtipusu humán TNFoc-t alkalmazunk.

VI. példa

Humán TNFec és muteinek kompetitiv kötődése rekombináns humán p75-TNF-R és P55-TNF-R receptorokhoz

A kompetitiv kötődés meghatározása céljából mikrotiter lemezeket rekombináns humán p75-TNF-R-humán IgG^jG és p55-TNF-R- 34 - • · 44 4·«*·· • ··· 4 »44 <· • · · 4 4· ♦·· ·· ···« ·»· »»

-humán IgGp fúziós fehérjék PBS-el készült, oldataival 0,3 /Ug/ml illetve 0,1 /Ug/ml oldataival bevonunk /100 /^mélyedés, egy éjjelen át 4 °C-on/ [Loetscher H. és tsai: J. Bioi. Chem. 266, 18324-18329 /1991/; Lesslauer W. és tsai: Eur. J. Immunoi. 21, 2883-2886 /1991/]· Ezután blokkoló pufferrel /50 mM trisz pH 7,4,

140 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,02 $ NaNp 1 % zsirmentesitett tejpor/ blokkoljuk, majd a mikrotiter lemezeket PBS-el mossuk és 10 ng/ml humán ¹²^I-TNP-óc-al /jodogén módszerrel kb. 30 /uCi/ug fajlagos aktivitásig jelzett; Pierce Chemical Company/ különböző mutein

-koncentráció mellett inkubáljuk. A térfogat mélyedésenként 100 /ul és minden koncentrációból három meghatározást végzünk. Szobahőmér sékleten 3 órán át állni hagyjuk, majd a mélyedéseket PBS-el ala posan mossuk és g-számlálóban számláljuk.

Claims (13)

1. Eljárás a humán p55-tumor nekrózis faktor receptorhoz szelektív kötődési affinitást mutató humán tumor nekrózis faktor mutein vagy gyógyászatilag alkalmas sói előállítására, amely műteint az jellemez, hogy a humán tumor nekrózis faktor aminosav szekvenciájában legalább azt a változtatást tartalmazza, hogy a 86~helyzetben szerin maradék helyett treonin van jelen, azzal jellemezve, hogy a fenti muteint kódoló DNS szekvenciát tartalmazó kifejező vektorral transzformált gazdasejtet megfelelő táptalajban tenyésztünk, a muteint a tenyészet felüluszóból vagy magából a gazdasejtből izoláljuk és kívánt esetben a muteint gyógyászatilag alkalmas sóvá alakítjuk·

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy olyan muteint állítunk elő, amelynek aminosav szekvenciája egy vagy több további helyzetben, előnyösen egy vagy két további helyzetben változtatást tartalmaz.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy olyan muteint állítunk elő, amelyben a humán nak.

tumor nekrózis faktor aminosav szekvenciájába 29 és 86; 31 és 86; 32 és 86; 29, 32 és 86 vagy 31> 32 és 86 helyzetben változtatást tartalmaz.

4. Az 1-3· igénypontok bármelyike szerinti eljárás,

Q/ς PQ RfZ azzal jellemezve, hogy Thr -TNFa, Ser^’-Thr -TNF«, Glu³¹-Thr⁸⁶-TNF«, Trp³²-Thr⁸⁶-TNFa, Ser²⁹-Trp³²-Thr⁸⁶-TNFa vagy Asn³¹-Thr³²-Thr⁸^-TNF« muteint állítunk elő.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy gazdasejtként valamely pro- 36 9 « ·ν «··· ·· • · · · · · « • ··· · ··· · · • · « · * · ·*· ·· ···· ·ί· ·» karióta vagy alacsonyrendü eukarióta gazdasejtet alkalmazunk.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként valamely E. coli törzset alkalmazunk.

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy kifejező vektorként valamely, a pDS családba tartozó vektort alkalmazunk.

8. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve , hogy valamely, az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított vegyületet és kívánt esetben további gyógyászati hatóanyagot nem-toxikus, inért, kompatibilis gyógyászati hordozóanyagokkal összekeverünk és a keveréket galenikus formára hozzuk.

9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított vegyületek felhasználása a 8. igénypont szerinti gyógyászati készítmények előállítására.

10. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított valamely vegyületet kódoló DNS szekvenciát tartalmazó DNS szekvencia.

11. Vektor, különösen prokarióta vagy alacsonyrendü eukarióta gazdasejtben történő kifejezésre szolgáló vektor, azzal jellemezve , hogy a 10. igénypont szerinti DNS szekvenciát tartalmaz.

12. Gazdasejt, különösen prokarióta vagy alacsonyrendü eukarióta gazdasejt, azzal jellemezve , hogy valamely, a 11. igénypont szerinti vektorral transzformálva van.

13. A 12. igénypont szerinti gazdasejt, azzal jellemezve , hogy valamely E. coli törzs.