HUT69708A

HUT69708A - Process for producing parathormon fragments and pharmaceutical compositions containing them

Info

Publication number: HUT69708A
Application number: HU9402272A
Authority: HU
Inventors: Klaus Strein; Christian Duvos; Hubert Mayer; Bernd Mueller-Beckmann; Edgar Wingender
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1992-02-04
Filing date: 1993-02-04
Publication date: 1995-09-28
Also published as: US5783558A; ZA93727B; WO1993015109A2; MX9300586A; KR950700326A; CA2126974A1; AU3628093A; IL104580A0; HU9402272D0; EP0625163B1; IL104580A; DE4203040A1; ATE171952T1; JPH07507051A; DE59309044D1; WO1993015109A3; EP0625163A1; TW286320B

Description

A találmány tárgyát új paratiroidhormon (PTH)-fragmentumok, azok farmakológiailag elviselhető származékai, ezeknek a fragmentumoknak és azok származékainak kémiai úton történő előállítása, és azokat tartalmazó gyógyszerkészítmények képezik.

A paratiroidhormon (PTH), a mellékpajzsmirigy egyik hormonja, fontos szabályozó szerepet játszik egyebek mellett a szervezet kalciumszintjének fenntartásában. A PTH stimulálja a csontképződést vagy a csontfelszívódást. Emellett egy sor enzimre szabályozó hormonként hat, egyebek között az ornitin-dekarboxilázra és az adenilát-ciklázra (cAMP-szintézis). A PTH kalciumhiány esetén kalciumot mobilizál a csontokból, csökkenti a vese kalciumkiválasztását és egyidejűleg megnövelt 1,25- (OH) ₂D3-szintézissel javítja a kalcium bélből való felszívódását. Ezekre a célszervekre gyakorolt hatással éri el a kalciumszint mormalizálását. Fordítva, túl magas kalciumszint esetén a kalciumnak a csontokba való beépülését stimulálja. Továbbá, mutat még mitogén hatást is a PTH, különösen az oszteoblasztok és kondrociták stimulációját.

Ismeretes továbbá a DE-OS 37 35 319 számú német szövetségi köztársaságbeli nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentésből, hogy a fent említett hatásokért a PTH-nak egy speciális tartománya felelős, és, hogy az ennek a tartománynak megfelelő PTH-fragmentumok adásával lehetséges ugyanezet a hatást elérni [lásd még Sömjen és munkatársai, Biochem. J., 272, 781-785 (1990); Shurtz-Swirski és munkatársai, Acta Endocrinol., 122, 217-226 (1990); Potts és munkatársai Advences in Protein ·· ·· « ···· · • · · « · · • ····«·· · • * · ···· · · •·· ·· · ···

Chemistry, 35, 3232-396 (1982)]. Ezekből a tanulmányokból azt is megtudhatjuk, hogy hogyan lehet ezeket a PTH-fragmentumokat előállítani és variálni, aholis lehetséges a természetesen előforduló PTH hasítása, valamint a kémiai szintézis vagy géntechnológiai eljárások alkalmazása. A hPTH(l-37) előállításának egy kémiai szintézisen alapuló eljárását leírják a WO 91/06564 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben. Ennek az ismert szilárd- és folyadékfázisú szintézisnek azonban az a hátránya, hogy az előállításnál a kitermelések viszonylag alacsonyak.

A PTH-fragmentumok különösen a csontritkulás kezelése szempontjából érdekesek. Kétségtelenül bebizonyosodd, hogy a fragmentumok különféleképpen hatásosak és, hogy egyes esetekben például a hPTH(-134) alkalmazásánál a hatás egyes betegeknél pozitív, másoknál azonban a kalciumkoncentráció rosszabbodása lép fel és az össz-csonttömeg a kezelés folyamán csökken.

A találmány célkitűzése ezért az volt, hogy olyan új PTHfragmentumokat szolgáltasson, amelyek jobb terápiás hatással rendelkeznek, különösen a szervezet kalciumszintjének szabályozásában és a kalciumnak a csontokba való beépülésében. Azonkívül ezeket a fragmentumokat viszonylag csekély ráfordítással, jó kitermeléssel kell tudni előállítani.

Ez a feladat megoldható az olyan PH-fragmentumokkal, amelyek a bPTH(3-35), pPTH(3-35) vagy hPTH(3-35) aminosavszekvenciákat tartalmazzák, ahol ezeknek a szekvenciáknak a C-terminális vége egy aminosavval vagy az N-terminális vége egy vagy két •ι ·· « ·«···

9 9 9 9 99

99 9 9 9999

9 9 ·«·· ·· «··· ·« · 9 9 9« aminosawal meghosszabbítható. A találmány értelmében különösen az (1-35) és (1-36) PTH-fragmentumok jönnek számításba. A szekvenciavázlat a következő fragmentumok aminosavszekvenciáit tartalmazza:

1.	számú	szekvenciavázlat:	hPTH(3-35) magfragmentum
2.	számú	szekvenciavázlat:	hPTH(3-36)
3 .	számú	szekvenciavázlat:	hPTH(l-35)
4 .	számú	szekvenciavázlat:	hPTH(l-36).

A találmány tárgyát képezi továbbá ezeknek a fragmentumoknak az előállítására szolgáló eljárás, amelynek során az említett fragmentumokat vagy azok, részfragmentumait folyadékfázisú szintézissel védett aminosavakból előállítjuk, amely aminosavakat megfelelő sorrendben egymáshoz kapcsolunk úgy, hogy a mindenkori fragmentum kívánt aminosavszekvenciája keletkezzen. A találmány tárgyát képezik még az olyan gyógyszerkészítmények, amelyek a szokásos segéd- és adalékanyagok mellett hatóanyagként egy találmány szerinti PTH-fragmentumot tartalmaznak.

A hPTH, bPTH és pPTH (h = humán, b = szarvasmarha, p = sertés) aminosavszekvenciák ismeretesek Potts és munkatársai tanulmányából [Adv. in Protein Chem. 323-396 (1982)], így a hPTH(l-34) aminosavszekvenciája Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-MetHis-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-LeuArg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe.

A találmány szerinti PTH(3-35) aminosavtartományt tartalmazó PTH-fragmentumok, amelyek a +3 aminosavhelyzetből kiindulva az N-terminálison egy vagy két aminosawal meghosszabbíthatók, külö4 · * · · • <· · · « • ·· · · • · · ···· nősen olyan fragmentumok, amelyek a +2 helyzetben D- vagy L-Val aminosavat tartalmaznak. Azok a fragmentumok, amelyek az N-terminálisnál két aminosawal vannak meghosszabbítva, a +2 helyzetben D- vagy L-Val-t és a +1 helyzetben D- vagy L-Ser-t tartalmaznak.

Azok a fragmentumok, amelyek a C-terminálison a +35 (Val) aminosav-helyzetből kiindulva egy aminosawal vannak meghosszabbítva, különösen olyan fragmentumokat jelenítenek meg, amelyek a +36 helyzetben D- vagy L-Ala aminosavat tartalmaznak.

Előnyösek a Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-GlyLys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-LeuGln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Val aminosavszekvenciát tartalmazó PTH(l-35) és a Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-GlyLys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-LeuGln-Asp-Val-His-Asn-Phe-Val-Ala aminosavfrekvenciáát tartalmazó PTH(l-36) fragmentumok.

A C-terminális végen lévő aminosavak karboxilcsoportja lehet szabad állapotban vagy valamilyen fiziológiailag elviselhető alkálifém- vagy alkáliföldfém, így nátrium-, kálium- vagy kalciumsó formájában. A karboxicsoport amidálva is lehet primer vagy szekunder aminokkal, így például ammóniával, 1-6 szénatomos alkil-aminokkal vagy di(l-6 szénatomos)-alkil-aminokkal, különösen metil-aminnal vagy dimetil-aminnal, azaz a -CONR-^R²

-1 általános képlet ábrázolhatja, amelyben R¹ jelentese hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport; R² jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport, ahol az alkilcsoportok például metil-, etil-, propil-, izopropil-, butilcsoportot, stb.

44 4 *«·· » • 4 9 · 4 9 9

9 9 9 9 9 99 9

9 9 9999 * · w 4 4 · ·· · 4··

- 6 “ jelenthetnek.

Ilyen értelemben előnyösek a PTH(2-35), PTH(2-35)-Z, PTH(l-35), PTH(l-35)-Z, PTH(2-36), PTH(2-36)-Z, PTH(l-36) vagya PTH(l-36)-Z fragmentumok, különösen a megfelelő hPTH-fragmentumok, ahol Z a fent megadott -CONR⁴R² általános képletű amidéit karboxicsoportot jelenti. R¹ jelentése különösen hidrogénatom és R² jelentése különösen metil-, etil- vagy izopropilcsoport.

A találmány szerinti PTH-fragmentumok előnyös terápiás tulajdonságokkal rendelkeznek. Segítségükkel különösen nemcsak a szervezet kalciumszintje szabályozható, hanem a kalciumnak a csontokba való beépülése is célzottan elősegíthető, így kedvezően befolyásolhatják a csontritkulás folyamatát, illetve azt megállíthatják. Ez a hatás meglepő, mert ezek a fragmentumok az ismert hPTH(1-37) vagy hPTH(l-34) fragmentumoktól eltérően nem tartoznak azok közé a biológiailag aktív hPTH-fragmentumok közé, amelyek a hPTH(1-84) primer hasításával az emberi szervezetben keletkeznek. A találmány szerinti PTH-fragmentumok további előnyének számít, hogy ezek jobb kitermeléssel állíthatók elő, mint a hosszabb aminosavszekvenciájó fragmentumok.

Az ismert hPTH(1-n) fragmentumokkal ellentétben, amelyeknél n jelentése 34, 37 vagy 38, a találmány szerinti PTH-fragmentumok meglepően nagyobb hatékonyságot mutatnak a különböző vizsgálati rendszerekben úgy, hogy terápiás felhasználsára jobban alkalmazhatók, mint az eddig ismert fragmentumok. Az új fragmentumok előnyei különösen a következők: nagyobb mitogenitás és DNS-szintézis teljesítmény; csekélyebb katabolisztikus, kalcium*··· · 4 4 · 44 • ·· · · 4 4 4» « · · · · · · ·4 •444 ·· 4 444·

- 7 -mobilizáló hatás; kisebb cAMP-aktiválás; a kalcium-reteció növelése és nagyobb fokú kalciumbeépülés a csontokba. Ezek a hatások együttesen az új fragmentumoknak az eddig ismert ΡΊΉ- fragmentumokéhoz viszonyított jelentősen nagyobb fokú anabolisztikus hatását eredményezik.

A szilárdfázisú és folyadékfázisú szintézis szokásos, már a hPTH-fragmentumok szintézisénél is alkalmazott eljárás (lásd a WO 91/06564 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentést). Hátrányos azonban ennél az eljárásnál, hogy sok szennyeződés is keletkezik, amelyek, nemcsak a termék tiszta állapotban történő előállítását nehezítik meg, hanem a kitermelést is csökkentik.

Hogy az eljárást egy adott termék előállításánál a nyerstermék tisztasága és a kitermelés tekintetében optimalizálni tudjuk, szükséges az eljárási paramétereket és az alkalmazott anyagokat, igy a nem ragálandó csoportoknak a blokkolására szolgáló anyagokat vagy a blokkoló anyagok lehasitására használt reagenseket, az előállítandó termékhez, az előállítandó intermedierekhez, illetve kiindulási anyagokhoz hozzáigazítani. Ez a hozzáigazítás, a sok eljárási paraméter összefüggéseit tekintve, nem könnyű feladat. A találmány szerinti PTH-módosulatok előállításánál előnyösen hat, ha a szintetizált pepiidnek a szilárd fázisról való leválasztásához és az oldalcsoportok blokkolásához használt K reagens alkatrészként etánditiol helyett ditiotreitolt (DTT-t = Cleland-reagenst) tartalmaz.

Bebizonyosodott, hogy az R. Frank által a Tetrahedron Letters-ben [44, No.19. 603-604 (1988)] közölt Simultaneous • 4 44 · ··»« · • 99*9 i· « 4 · ·· 4 * · 4 · 4 ···· «· • «Μ < · Λ 444*

Multiple Peptide Synthesis under Continuous Flow Conditions on Cellulose Paper Discs as Segmental Solid Supports című tanulmányból ismert szűrési eljárás elvileg alkalmas például a hPTH(l-35)~ és hPTH(1-36)-fragmentumok előállítására, azonban a 36 feletti számú aminosavszekvenciát tartalmazó pTH-fragmentumok ezzel az eljárással - nyilván a szennyező anyagok nagy mennyiségének képződése miatt - tiszta állapotban csak jóval kisebb kitermeléssel állíthatók elő.

A találmány szerinti fragmentumokat, önmagukban vagy hatóanyagként a szokásos segéd- és adalékanyagokkal együtt tartalmazó gyógyszereket előnyösen parenterálisan adagolják. A gyógyszernek kalciumszabályozó hatása van és amellett előnyös módon elősegíti a kalciumnak a csontokba való beépülését. A gyógyszer alkalmazásánál előnyös, ha a hatóanyagot adagolási egységenként 300 μg és 30 mg közötti mennyiségben tartalmazza. Jó hatást különösen akkor érünk el, ha az adagolási egység a találmány szerinti fragmentum 100 és 1000 közötti számú egységének, illetve 10^-8 és 10^-7 közötti M/liter testnedv hatékony koncentrációinak felel meg.

A találmány szerinti PTH-fragmentumokat előnyösen steril liofilizátumokként tároljuk és az alkalmazás előtt valamilyen alkalmas izotóniás oldattal elegyítjük. Ebben a formában azután a fragmentumok injektálhatok, infundálhatók vagy, adott esetben, a nyálkahártyákon keresztül abszorbeáltathatók. Oldószerként a szokásos, injekciós vagy infúziós célokra alkalmas izotóniás vizes rendszerek alkalmazhatók. Ebben az esetben előnyösek a fiziológiás nátrium-klorid oldatok, vagy, adott esetben, valamilyen pufferrel izotóniásra állított oldatok.

Az alkalmazandó napi adag az indikációtól függ. A csontritkulás intravénás/intramuszkuláris injekcióval végzett terápiájánál a 100 és 1200 egység (Mg)/nap között, a napi szubkután injekciók esetében előnyösen a 300 és 2400 egysgé (Mg/nap) között van. A biológiai aktivitás meghatározása a hPTH-fragmentumok használatos biológiai vizsgálati módszerével, a hPTH-fragmentumok mérésénél alkalmazott nemzetközi referens-készítményekkel szemben végzett méréseken alapszik.

A találmány szerint PTH-fragmentumokat előállíthatjuk a szintézis szűrő eljárásával vagy a szokásos előírások szerint egy kereskedelmi peptidszintetizátor segítségével.

1. példa

A hPTH(l-35) és hPTH(l-36) kémiai szintézise

A találmány szerinti eljárással (kémiai szintézis) történő előállításnál előnyösen Milligen 9050 peptidszintetizátort használunk. Az aminosavak pentafluor-fenil-észtereit használjuk, a kapcsolási reakció során a racemizálás megakadályozása céljából hidroxi-benzotriazollal (HOBt) kombinálva. Az N-a-aminofunkciókat fluorenil-metoxi-karbonil-csoporttal (Fmoc) védjük. Az aminosavoldalláncokat a hisztidin és lizin esetében N-terc-butoxi-karbonil-csoporttal (t-Boc), az aszparaginsav, glutaminsav és szerin esetében terc-butil-csoporttal (t-Bu), és az arginin esetében

4· «· ··**· <**•44 4· • ·· » · 4··· • · · 4»·· 4· »··» 44 · ···t

2,2,5,7,8-pentametil-kromán-6-szulfonil-csoporttal (Pmc) védjük. Előnyösen a következő gyantákat használjuk: Fmoc-Val-Fmoc-ValNovaSyn-Pa 500 (Novabiochem), a szubsztitúció foka 0,37 mmól/g hPTH(1-35)-re, és Fmoc-Ala-NovaSyn-Pa 500 (Novabiochem), a szubsztitúció foka 0,35 mmól/g hPTH(-136)-ra. A peptidnek a gyantáról való lehasitását és a védőcsoportok lehasitását trifluor-ecetsav (TFA), fenol, víz, tioanizol és ditiotreitol (DTT) elegyével végezzük. Ennél előnyösen mintegy 2 órán át 82,5 % TFA-ból, 5 % fenolból, 5 % vízből, 5 % tioanizolból és 2,5 % DTT-ből és módosított K-reagensbol [lásd King és munkatársai, Int. J. Peptide Protein Rés., 36, 255-266 (1990)] álló elegyet alkalmazunk. Az Fmoc-csoportot piridin Ν,Ν-dimetil-formamidos (DMF) oldatával hasítjuk le. Az oldat előnyösen 20 %-os. A nyerspeptideket terc-butil-metil-éterrel csapjuk ki, előnyösen víz:acetonitril (9:1) elegyben oldjuk, majd előnyösen a J. T.

Baker Chemical Co. C-18 töltetű hüvelyein (cartridge) át előtisztítva liofilizáljuk.

A kitermelés az előnyös körülmények között 71 % a hPTH(1-35)-re és 67 % a hPTH(1-36)-ra. A nyerspeptideket preparatív nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC) segítségével, előnyösen fordított fázisú C4 (RP-4) töltettel ellátott oszlopon, víz:acetonitril grandienssel tisztítjuk. A kitermelés a nyerspeptidekre vonatkoztatott 10-15 %.

2. példa hPTH(l-35) és hPTH(l-36) előállítása szűrési eljárással ·« ·· · <ν·«·9 • V * · · ·9 • ·· · W ···· • · · «··· « · ···· ·· · ···

A szűrési eljárás (Fiitermethode) alkalmazásával végzett szintézist a Fmoc/terc-butil (t-Bu) módszerrel, 1-hidroxi-benzotriazol (HOBt):diizopropil-karbodiimid (DICD) kapcsolással végezzük. Speciális oldalláncvédő-csoportokként az Arg esetében Pmc, Asn és Glu esetében trimetoxi-benzil-csoportot (Tmob-t) és His esetében butoxi-karbonil-csoportot (BOC-t) használunk.

A találmány szerinti PTH-fragmentumok szűrési eljárással történő előállításánál szekvenciánként két szűrőt használunk, amelyekre 5-5 Mmól C-terminális aminosavszármazékot viszünk fel. Minden egyes szekvenciát így 10 μιηόΐ-os mennyiségben állítunk elő.

A szintézis megkezdése előtt először előkészítjük a cellulózszűrőket az aminosavak felvételére. Ehhez a szűrőpapírt kíméletes savas kezeléssel, például 10 %-os metilén-dikloridos TFA-oldattal forrásig melegítjük, majd valamilyen kapcsoló-vegyülettel reagáltatjuk. Az első aminosavnak a hordozón való megkötéséhez előnyösen benzil-észter-típusú kapcsolást alkalmazunk. Kapcsoló vegyületként különösen előnyös - a későbbi elválasztásokra is tekintettel - egy (I) általános képletű p-alkoxi-benzil-származékot alkalmazni, amely védőcsoportként 4-metoxi-tritil-éter-csoportot tartalmaz, amelyet metilén-dikloridos diklór-ecetsav oldattal könnyen lehasithatunk. Ezt a vegyületet 4-hidroxi-fenolnak 4-metoxi-tritil-kloriddal végzett szelektív tritilezésével állítjuk elő. A metoxi-tritil-csoport a cellulóz hidroxicsoportjainak az alkoxi-benzil-származékkal végzett észterezésénél szükséges védőcsoport.

ν· · • · · · * · · • ·· · 9 ff9 · • * · ···« · 4 ···· 9· · ···

- 12 Az első Fmoc-aminosav felvitelét, miként a többit is, benzil-alkohollal szubsztituált hordozókkal hajtjuk végre, miközben a szűrőtöltetre vonatkoztatott háromszoros feleslegben lévő mennyiségű előaktívált aminosavszármazékot reagáltatunk dimetil-amino-piridin (DMAP) katalizátorként való alkalmazásával az átalakított aljzattal. Az előaktíválást úgy érjük el, hogy az Fmoc-csoporttal védett aminosavszármazékokat 1-hidroxi-benzotriazollal (HOBt) és diizopropil-karobidiimiddel (DICD) HOBtészter-származékokká átalakítjuk. Az aminosavakat előnyösen DMFben 1,5 ekvivalens HOBt-vel és 1,2 ekvivalens DICD-vel 45 percig reagáltatjuk. Az előaktívált aminosavszármazékokat in situ a szűrőpapírra visszük, ahol az aminosav a savas végével kapcsolódik. A második és további aminosavak kapcsolásának előkészítéséhez az utoljára kapcsolt aminosav Fmoc-csoportját előnyösen 20 %-os DMF-es piperidinoldattal lehasítjuk. Ezután következik a következő Fmoc-csoporttal védett aminosav kapcsolása; az amidképződést brómfenolkék indikátorral ellenőrizzük [lásd V. Krchnak: Collect. Czech. Chem. Commun., 53, 2542 (1988)]; ez 0,5-2 óra alatt teljessé válik.

A peptidszintézis befejezése után következik a pepiidnek az alkoxi-benzilalkohol-származékról való leválasztása TFA segítségével. Ennél az oldalláncokat védő terc-butil-csoportok is lehasadnak. Ehhez előnyösen egy TFA:anizol:metilén-diklorid elegyet használunk, amelynek optimális összetétele: 55 térfogat% TFA, 5 térfogat% anizol és 40 térfogat% metilén-diklorid.

A lehasított nyerspeptideket dietil-éterrel extraháljuk és utána liofilizáljuk. A kitermelés 43 mg hPTH(l-35) és 34 mg hPTH(l-36). Az így előállított nyerspeptidet preparatív fordított fázisú kromatográfiával, előnyösen C4 szilikagélen tisztítjuk.

3. példa

Különböző PTH-fragmentumok patkányok kalcium-retenciójára gyakorolt hatásának meghatározása

Növekedésben lévő patkányok kalcium-mérlegének mérése alkalmas modell egy szisztémásán adott anyag csontanyagcserére gyakorolt hatásosságának in vivő vizsgálatára. A kalcium-mérleg megállapításánál mérjük a kalcium ki- és beáramlását a szervezetből és a szervezetbe és ebből számítjuk a kalcim-retenciót (mérleget). Ennél figyelembe vesszük, hogy a csontozat a szervezet kalciumtartalmának körülbelül 99 %-át tárolja, miközben a plazma kalciumszintje állandó marad. A táplálékból a szervezetben visszatartott kalciummennyiséget ezért a csonttömeg növekedésével arányosnak tekintjük.

A vizsgálatok kísérleti állataiként a vizsgálatok megkezdésekor 10 hetes, és 250 g és 300 g közötti tömegű hím CD-patkányok szolgálnak. A vizsgálati állatokat a kereskedelemben szokásos anyagcserevizsgálati ketrecekben külön-külön tartjuk. Az anyagcserevizsgálati ketrecekben a széklet és vizelet automatikus elválasztása biztosítva van. Mindkét frakciót kvantitatíve gyűjtjük felfogó tartályokban, így egymástól elválasztva analizálhatok .

Eledelként lisztszerű állagú, desztillált vízzel 1:1 (tömeg/tömeg) arányban pépesített patkány standard-táplálék szolgál. A naponta adagolt táplálékmennyiséget úgynevezett csoportos táplálás (group feedings) értelmében az állatok táplálékigényéhez úgy igazítjuk, hogy azt minden állat teljes egészében elfogyassza. A napi táplálékadag 20 g nedves táplálék. Desztillált víz az állatoknak tetszés szerinti mennyiségben rendelkezésre áll.

Valamennyi vizsgálati anyagot naponta 40 g hPTH(l-34) x kg^-1 x nap^_1-nek megfelelő ekvimolekuláris adagokban 10 napig szubkután injektáljuk. Ebből az első 7 nap az állatok adaptációjára szolgál, míg a kalcium-mérleg mérése az utolsó 3 napon történik.

A kalciumbevitelt (Ca-intake) az elfogyasztott táplálék mennyiségéből és a táplálék kísérletileg meghatározott kalciumtartalmából számítjuk. Ehhez a táplálék-szállítmányból naponta alikvot mennyiséget tömegállandóságig szárítunk és a nedves és száraz tömeg összehasonlításából a víztartalmat meghatározzuk. Ezután a megszárított táplálékból 2x500 mg-ot laboratóriumi mikrohullámú készülék segítségével koncentrált savakkal az alábbiak szerint feltárunk: 500 mg megszárított táplálékhoz egymás után 3 ml koncentrált salétromsavat, 1 ml koncentrált sósavat és 1 ml 30 %-os hidrogén-peroxid oldatot pipettázunk. A spontán oxidációs reakció lezajlása (felhabzás) után következik a nyomással vezérelt feltárás lezárt Teflon PFA feltáróedényben. Ennél egymás után a következő nyomás-/időfokozatokat kell megjárni: 5 percig 276 kPa (40 psi); 5 percig 552 kPa (80 psi);

• · · percig 1,035 kPa (150 psi). A lehűtött feltárt anyaghoz még egyszer 2 ml 30 %-os hidrogén-peroxid oldatot adunk a feltárási reakció sebességének ellenőrzése céljából (már nincs felhabzás). A feltárt anyagot 0,3 %-os sósavoldattal készített 1 térfogat/ /térfogat %-os lantán-nitrát oldattal 100 ml-re feltöltjük. A kalciumtartalom láng-atomabszorpciós spektrométeren (AAS) történő méréséhez a próbákat még egyszer hígítjuk 1:100 arányban 1 %-os lantán-nitrát oldattal. A felvett táplálékmennyiségből és a mért víz- és kalciumtartalomból azután kiszámítjuk a kalciumbevitelt.

A széklet útján történő kalciumveszteséget a kalciumbevitelhez hasonló módon állapítjuk meg: a víztartalom meghatározása, azonos körülmények között végzett savas feltárás a mikrohullámú készülékben és azt követően a kalciumtartalom mérése az atomabszorpciós spektrométeren,.

A vizelet gyujtőtartályába 2 ml 10 %-os sósavoldatot mérünk a húgysavas só kicsapódásának megkadályozása céljából. A vizsgálat végeztével megmérjük a vizelet tömegét, majd annak egy alikvotját 0,3 %-os sósavoldattal készített 1 térfogat%-os lantán-nitrát oldattal 1:100 arányban meghígítjuk. A próba kalciumtartalmának meghatározását az atomabszorpciós spektrométer segítségével végezzük.

Eredmények:

Az eredményeket az alábbi táblázatban mutatjuk be.

• «

• · ·

I. TÁBLÁZAT

Kalcium-retenció (mg/nap)

anyag	középérték	+/- SD	% növekmény
kontroll	49,5	5,32	0
hPTH(l-34)	91,8	10,25	85
hPTH(l-35)	108,6	9,21	119
hPTH(1-36)	110,5	11,44	123
hPTH(l-37)	96,0	7,69	94
hPTH(l-38)	91,8	9,68	85

Kiértékelés:

Meglepő módon azt találjuk, hogy a PTH(l-35) és PTH(l-36) peptidszekvenciáknak megfelelő 35 vagy 36 aminosavból álló lánchosszúságú parathormon-fragmentumok nagyobb kalcium-retenciót és kifejezettebb mértékű csontokba való beépülést eredményeznek, mint a tudomány jelenlegi állása szerint eddig ismert hPTH(l-n) peptidek, ahol n = 34, 37, 38. Akkor is megnövelt kalcium-retenciót találtunk, ha a peptideket az N-terminálisnál egy aminosavval megrövidítjük.

4. példa

Mitogenitás szegycsonti szervtenyészetekben

Megvizsgáljuk az új fragmentumok mitogenitását szegycsoatból származó szervtenyészetekben; megállapítható, hogy ez az aktivitás kifejezettebb, mint az ismert hPTH(l-34) és hPTh(l-38)

fragmentumok, esetében (lásd a II. táblázatot).

II, TÁBLÁZAT

Mitogenitás szegycsonti szervtenyészetekben

N E/C +/- SEM

kontroll	4	1,00 +/-	0,13
hPTH(1-34)	4	2,94 +/-	0,38
hPTH(l-35)	4	3,13 +/-	0,57
hPTH(l-36)	4	3,37 +/-	0,58
hPTH(l-38)	4	2,96 +/-	0,30

5. példa

DNS-szintézis teljesítmény ROS 17/2.8 sejteken

Megmérjük a DNS-szintézis teljesítményt ROS 17/2.8 sejteken.

A PTH(1-35) fragmentum meglepő módon erősebben növeli a szintézis teljesítményt, mint más fragmentumok (lásd a III. táblázatot).

»♦ * · • · · · · • · · · • · · ·

III. TÁBLÁZAT

DNS-szintézis hPTH(l-X) fratmentumokkal, 100 nmól,

ROS 17/2.8 sejtek n [³H]timidin-beépülés

E/C (cpm)

(alapérték)	4	663	+	49	1,0	± 0,07
34	5	2148	+	289	3,2	±0,44
35	6	2686	+	282	4,1	± 0,43
36	6	2136	+	246	3,2	±0,37
37	6	2021	+	251	3,1	±0,38

a HPTH(l-35), hPTH(l-36) és hPTH(l-37) fragmentumok általi indukció az alapértékkel szemben p < 0,001-gyel nő, a hPTH(l-34) általi p < 0,01-gyel nő.

6. példa

Ciklusos adenozin-monofoszfát (cAMP/-stimulálás

Mérjük a cAMP-képződés különböző PTH-peptidek általi kiváltását szegycsontból származó szervtenyészetekben, valamint sertésvese-membránfrakciókban. Ez az aktivitás a PTH (-135) és pTH(l-36) fragmentumok esetében a PTH(1-34) fragmentuméhoz képest meglepő módon csökken (lásd a IV. és V. táblázatot). Ez jelentős, minthogy a PTH katabolisztikus, azaz kalcium-mobilizáló tulajdonságai ismeretes módon együtt járnak a cAMP növekedésével [lásd Schlüter és munkatársai, J. Bioi. Chem., 264, 19, 11087-11092 • ·

(1989); Lövik és munkatársai, Calcif Tissue Int., 43, 7-18 (1988)]. Ezek a megállapítások valószínűek, így alátámasztják a fenti megállapításokat, amelyek a peptid anabolitikus tulajdonságainak növekedését mutatják a 35 és 36 aminosavból álló lánchosszak között.

IV. TÁBLÁZAT cAMP-stimulálás szegycsontból származó szervtenyészetekben,

100 nM induktor n pmól cAMP

kontroll	4	4,7
1-34	4	25,8
1-35	4	18,2
1-36	4	17,6

V. T cAMP-stimulálás pmól	Á B L Á Z A T
sertésvese-membránokban
cAMP/mg	fehérje ± SEM
alapszintézis	20,6 ±	1,2
hPTH(l-34)	86,6 ±	1,0
hPTH(-135)	82,4 ±	0,4
hPTH(l-36)	44,6 ±	1,8

minden esetben n = 3 és p < 0,001

7. példa

DNS-szintézis teljesítmény PHT(3-X)-fragmentumokkal

Megnövelt DNS-szintézis teljesítményt észlelünk UMR 106 sejteken az olyan fragmentumokkal is, amelyeknek N-terminálisa két aminosavval rövidebb. Hatásmaximum itt is akkor észlelhető, ha a lánchossz 34 és 36 aminosav között van (lásd a VI. táblázatot). Ez a megállapítás meglepő, mivel tudott, hogy a +1 vagy +1 és +2 aminosavak törlése a cAMP-indukció elvesztéséhez vezet, ami együtt jár a PTH kalcium-mobilizáló tulajdonságainak elvesztésével. Az N-terminálisban megrövidített PTH-fragmentumok anabolitikus (mitogén) aktivitását eddig nem írták le.

Vla TÁBLÁZAT

DNS-szintézis PTH(3-X)-fragmentumok 100 nmól mennyiségével UMR 106 sejteken

X n [³H]timidin-beépülés E/C (cpm)

alapérték	5	925	+	48	1,0	+	0,04
34	5	1748	+	150	1,9	+	0 , 12
35	4	2591	+	115	2,8	+	0,1
36	5	2230	+	172	2,4	+	0 , 14
37	5	2161	±	74	2,3	+	0,06
38	5	1905	±	159	2,1	±	0, 13

Minden indukció az alapértékkel szemben p < 0,001-gyel nő.

• «

VIb TÁBLÁZAT

DNS-szintézis PTH(3-X)-fragmentumok 300 nmól mennyiségével UMR 106 sejteken

X n [³H]timidin-beépülés E/C

alapérték	4	972	+	32	1,0	±	0,03
34	4	3516	+	297	3,6	+	0,31
35	5	4158	+	213	4,3	±	0,22
36	5	4950	±	401	5,1	+	0,41
37	5	3962	±	268	4,1	+	0,28
38	5	3701	+	414	3,8	+	0,43

Minden indukció az alapértékkel szemben p < 0,001-gyel nő.

8. példa

PTH(l-35), PTH(l-35)-Z szintézise, ahol Z jelentése aminocsoport, detil-amino-csoport

A peptidek szintézisét a szilárdfázisú eljárással végezzük, éspedig a következő védőcsoportokkal:

Védőcsoportok:

	-aminocsoportok:	Fmoc
His	(lm) :	tritil
Asp	(karboxi):	OtBu
Glu	(karboxi):	OtBu
Lys	( -amino):	BOC
Ser	(hidroxi):	t-Bu

Arg (Gua): Pmc

Az Asn és Glu amidfunkcióit nem védjük.

Gyantához való kötés:

g p-Benzil-oxi-benzil-alkohol-gyantára (Alkoxi-gyanta, Novabiochem) 13,5 g Fmoc-ValOH és 8,5 g DCC (41 mmól)

N,N-dimetil-formamid:metilén-diklorid (3:7) elegyével készített oldatát visszük fel 0,5 g (3,9 mmól) 4-(dimetil-amino)-piridin hozzáadásával.

A gyanta felesleges szabad hidroxicsoportjainak benzoil-klorid és piridin elegyével végrehajtott blokkolása és N,N-dimetil-formamiddal, izopropil-alkohollal és diizopropil-éterrel (2-ciklusban) végzett mosása, valamint szárítása után 32 g Fmoc-Val-gyantát kapunk.

A védőcsoportnak 20 %-os DMF-es piperidinoldattal végzett lehasítása után 0,66 mmól/g-os gyantáravitel adódik a lehasítási termékeknek a mosófolyadékban 300 nm-nél végzett ultraibolya mérésével történő indirekt meghatározással [lásd J. Maienhorfer, C. D. Chang, Int. J. Pept. Prot. Rés., 11, 246 (1978)].

Mosó- és szintézisciklusok:

1.	DMF	2x5	perc
2.	Fmoc-lehasítás 20 %-os DMF-es piperidinnel	10	perc
3 .	Fmoc-lehasítás 20 %-os DMF-es piperidinnel	20	perc
4 .	mosás DMF-fel	4x5	perc
5 .	mosás izopropil-alkohollal	2x5	perc
6.	mosás DMF-fel	2x5	perc
7 .	kapcsolás (aminosav és HOBt, 2 ekvivalens)	5	perc

8. kapcsolás (DCC, 2 ekvivalens) perc.

• «

Az 5. lépés után az összegyűjtött mosótolvadékot a mindenkori gyantára vitt mennyiség meghatározására használjuk.

A kapcsolás eredményességét kvalitative kis gyantamennyiségen végzett ninhidrinpróbával (Kaiser-próba) vizsgáljuk [lásd E. Kaiser és munkatársai, Anal. Biochem., 34, 595 (1970)]. A kapcsolási megismétlése az elvégzett szintéziseknél általában nem szükséges.

A védőcsoportok lehasitása és lehasitás a gyantáról:

A szintézis végeztével az egészet három részre osztjuk és azokat külön-külön feldolgozzuk:

a) hPTH(1-35) [sav-formában: PTH(l-35)-Z, ahol Z jelentése karboxi-védőcsoport].

A védőcsoportok lehasitása és a gyantáról való lehasitás egy lépésben trifluor-ecetsav:fenol:víz:tioanizol:etánditiol (16,5:1:1:1:0,5) eleggyel.

b) hPTH(1-35)-amid [PTH(1-35)-Z, ahol Z jelentése karbamoilcso- port .

Ezt a fragmentumot a peptid-gyanta komplexumnak ammónia és DMF (1:1) eleggyel való kezelésével és azt követően a védőcsoportnak a fentiek szerinti lehasításával kapjuk.

c) hPTH(1-35)-etil-amid [PTH(l-35)-Z, ahol Z jelentése etil-

-amino-karbonil-csoport].

Ezt a fragmentumot a peptid-gyanta komplexumnak 70 %-os vizes etil-aminnal való kezelésével és azt követően a védőcsoportnak a fentiek szerinti lehasításával kapjuk.

Vákuumban végzett betöményítés után a kicsapást minden esetben vízmentes dietil-éterrel hajtjuk végre. A nyerspeptidek nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) analízissel 35 % (a szabad sav és az etil-amid-származék esetében) és 30 % (az amidszármazék esetében) végterméket mutatnak (a csúcsterület alapján) .

Az a) - c) fragmentumok vizsgálata:

A HPLC-rendszer: a-ból (víz, 0,1 % trifluor-ecetsav) és bből [víz:acetonitril (35:65) elegy, 0,1 % trifluor-ecetsav] álló grádiens. Indulás 100 % a-val, majd 40 perc alatt lineárisan 100 %-ig emelkedő b. 250x4,6 mm-es, ODS Hypersil 5 oszlop.

A preparatív tisztítás hasonló körülmények között, preparativ HPLC-vel (Nova-Prep, Merek) történik.

így 2,7 g hPTH(l-35) savat, 2,6 g hPTH(1-35)-etil-amidot és

2,1 g hPTH(1-35)-amidot kapunk. A HPLC-vizsgálattal megállapított tisztaság nagyobb 95 %-nál.

1. számú szekvenciavázlat:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) a szekvencia hossza: 33 aminosavmaradék (B) a szekvencia jellege: aminosav (C) a szekvencia száltípusa: egyszálas (D) topológia: lineáris (ii) a molekula jellege: peptid (xi) a szekvencia vázlatos leírása:

Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Phe

Val

2. számú szekvenciavázlat:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) a szekvencia hossza: 34 aminosavmaradék (B) a szekvencia jellege: aminosav (C) a szekvencia száltípusa: egyszálas (D) topológia: lineáris (ii) a molekula jellege: peptid (xi) a szekvencia vázlatos leírása:

Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn Ser Met

Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His Asn Phe

Val Alá

3. számú szekvenciavázlat:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) a szekvencia hossza: 35 aminosavmaradék (B) a szekvencia jellege: aminosav (C) a szekvencia száltípusa: egyszálas (D) topológia: lineáris (ii) a molekula jellege: peptid (xi) a szekvencia vázlatos leírása:

Ser

Asn

Val

Ser

Glu

Ile

Gin

Leu

Met

His

Asn

Leu

Gly

Lys

His

Leu

Asn

Met

Glu

Arg

Val

Glu

Trp

Leu

Arg

Lys

Leu

Gin

Asp

Val

His

Phe

Val

4. számú szekvenciavázlat:

(i) a szekvencia jellemzői:

(A) a szekvencia hossza: 36 aminosavmaradék (B) a szekvencia jellege: aminosav • 4« · (C) a szekvencia száltípusa: egyszálas (D) topológia: lineáris (ii) a molekula jellege: peptid (xi) a szekvencia vázlatos leírása:

Ser Val Ser Glu Ile Gin Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn

Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gin Asp Val His

Asn Phe Val Alá

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. APTH(l-35), PTH(l-36), PTH(2~35), PTH(2-36) PTH(3-35),

PTH(3-36), PTH(3-37) és PTH(3-38) hPTH-módosulatok bármelyike.

2. Az 1. igénypont szerinti hPTH-módosulatok, azzal j ellemezve, hogy a PTH-módosulat a PTH(1-35). 3. Az 1. igénypont szerinti hPTH-módosulatok, azzal j ellemezve, hogy a PTH-módosulat a PTH(1-36) . 4. Az 1. igénypont szerinti hPTH-módosulatok, azzal j elleme zve, hogy a PTH-módosulat a PTH(2-35) vagy a PTH(2 5. Az 1. igénypont szerinti hPTH-módosulatok, azzal j ellemezve, hogy a PTH-módosulat a PTH(3-35), PTH( 3-36),

PTH(3-37) vagy a PTH(3-38).
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti hPTH-módosulatok, azzal jellemezve, hogy a C-terminális karboxicsoport egy Z-csoporttal van amidálva, ahol Z jelentése -CONrAr^ általános képletű csoport, amelyben R¹ és R² jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1-6 szénatomos alkilcsoport.
7. A 6. igénypont hogy a PTH-módosulat a
8. A 6. igénypont hogy a PTH-módosulat a szerinti hPTH-módosulat, azzal jellemezve,

PTH(1-35)-Z vagy PTH(1-36)-Z.

szerinti hPTH-módosulat, azzal jellemezve,

PTH(2-35)-Z, PTH(2-36)-Z, PTH(3-35)-Z vagy

PTH(3-36)-z.
9. Eljárás az 1-8.

igénypontok bármelyike szerinti hPTH-módosulatok előállítására, azzal jellemezve, hogy a fragmentumo kat szilárdfázisú vagy folyadékfázisú szintézis szerint a frag» · meritumokat alkotó, részlegesen blokkolt aminosavakból állítjuk elő, amelyeket egymáshoz a fragmentumoknak megfelelő aminosavszekvencia sorrendjében kapcsolunk.
10. A szokásos segéd- és adalékanyagok mellett hatóanyagként az 1-8. igénypontok bármelyike szerint hPTH-módosulatot t

tartalmazó gyógyszerkészítmények.
11. A 10. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény kalciumszabályozó hatással.
12. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti hPTH-módosulatok alkalmazása a szervezet kalciumszintjének szabályozását vagy a kalcium csontokba történő beépülését szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására.