JP3135122B2 - ｈＰＴＨフラグメント（１―３７）とその誘導体 - Google Patents
ｈＰＴＨフラグメント（１―３７）とその誘導体Info
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- JP3135122B2 JP3135122B2 JP03500084A JP50008491A JP3135122B2 JP 3135122 B2 JP3135122 B2 JP 3135122B2 JP 03500084 A JP03500084 A JP 03500084A JP 50008491 A JP50008491 A JP 50008491A JP 3135122 B2 JP3135122 B2 JP 3135122B2
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/635—Parathyroid hormone (parathormone); Parathyroid hormone-related peptides
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- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
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- A61P5/12—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the posterior pituitary hormones
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、hPTHフラグメント（１−37）とその製造
法、および、これを含有する医薬品とその使用に関する
ものである。
法、および、これを含有する医薬品とその使用に関する
ものである。
ヒト・パラトルモン（hPTH）、すなわち副甲状腺ホル
モンは、骨粗鬆症や上皮小体機能不全症などの治療に、
重要な役割を果すことができるものである。
モンは、骨粗鬆症や上皮小体機能不全症などの治療に、
重要な役割を果すことができるものである。
骨粗鬆症（骨の量の減少）（Riggs and Melton,N.Eng
l.J.Med.314,1676−1686,1986）は、主として閉経後の
女性や高齢者に、よく起こる病気である。患者は病気の
程度によって、背骨部、前腕部あるいは大腿部を頻繁に
骨折したり、痛みのために動かすことができなくなった
り、また、適正な運動や社会生活ができなくなったり、
さらには、生命の危険に脅かされたりする。現在のとこ
ろ、この病気の治療は、ほとんど不可能と考えられてい
る（Consensus Development Conference:Prophylaxis a
nd Treatment of Osteoporosis.1987）。動物実験の結
果（Selye,Endocrinology 16,547−558,1932;Kalu et a
l.,Lancet 1363−1366,1970;Hefti et al.,Clin.Scienc
e 62,389−396,1982;Tam et al.,Endocrinology 110,50
6−512,1982;Podbeske et al.,Endocrinology 112,1000
−1006,1983;Gunness−Hey and Hock,Metab.Bone Dis.
＆ Rel.Res.５,177−181,1964）や、原発性上皮小体機
能亢進症についてのより最近の組織学的な発現から、PT
Hを用いることによって骨の量を増加できることが示唆
されている。実際、リーヴェ（Reeve）たちは、毎日、
少量のPTHを投与することによって、副作用として僅か
に皮質性骨の量が減少したものの、骨粗鬆症患者の小柱
骨組織を改善することができた（Br.Med.J.1340−1344,
1980），このリーヴェ（Reeve）らの発見は、PTHを1,25
−ビタミンD3（Slovik et al.,J.Bone Miner.Res.１,37
7−381,1986）、カルシトニン（Hesch et al.,Calcif.T
issue Int.44,176−180,1989）あるいはエストロゲン
（Reeve et al.,Proceedings of the 5th Internationa
l Congress on Bone Morphometry,Niigata,July 24−2
9,1988）などの骨組織活性物質とともに投与すれば、骨
の皮質を失うことなく海綿質の量を増加させることがで
きることを支持するものである。
l.J.Med.314,1676−1686,1986）は、主として閉経後の
女性や高齢者に、よく起こる病気である。患者は病気の
程度によって、背骨部、前腕部あるいは大腿部を頻繁に
骨折したり、痛みのために動かすことができなくなった
り、また、適正な運動や社会生活ができなくなったり、
さらには、生命の危険に脅かされたりする。現在のとこ
ろ、この病気の治療は、ほとんど不可能と考えられてい
る（Consensus Development Conference:Prophylaxis a
nd Treatment of Osteoporosis.1987）。動物実験の結
果（Selye,Endocrinology 16,547−558,1932;Kalu et a
l.,Lancet 1363−1366,1970;Hefti et al.,Clin.Scienc
e 62,389−396,1982;Tam et al.,Endocrinology 110,50
6−512,1982;Podbeske et al.,Endocrinology 112,1000
−1006,1983;Gunness−Hey and Hock,Metab.Bone Dis.
＆ Rel.Res.５,177−181,1964）や、原発性上皮小体機
能亢進症についてのより最近の組織学的な発現から、PT
Hを用いることによって骨の量を増加できることが示唆
されている。実際、リーヴェ（Reeve）たちは、毎日、
少量のPTHを投与することによって、副作用として僅か
に皮質性骨の量が減少したものの、骨粗鬆症患者の小柱
骨組織を改善することができた（Br.Med.J.1340−1344,
1980），このリーヴェ（Reeve）らの発見は、PTHを1,25
−ビタミンD3（Slovik et al.,J.Bone Miner.Res.１,37
7−381,1986）、カルシトニン（Hesch et al.,Calcif.T
issue Int.44,176−180,1989）あるいはエストロゲン
（Reeve et al.,Proceedings of the 5th Internationa
l Congress on Bone Morphometry,Niigata,July 24−2
9,1988）などの骨組織活性物質とともに投与すれば、骨
の皮質を失うことなく海綿質の量を増加させることがで
きることを支持するものである。
上皮小体機能不全症（PTH欠乏症）（Kruse,Monatssch
r.Kinderheilkunde 136,652−666）は、先天的な原因や
手術の結果、あるいは頚部への放射線被曝などによって
起こり、血液中のカルシウム濃度が減少するものであ
る。また、この病気の患者は痙攣性の発作を起しやす
い。もし、PTHが幼児期あるいは小児期に既に欠乏して
いると、知能の発育不全、歯および骨の欠陥といった危
険に長い間さらされることになる。ほとんどの患者は、
カルシウムおよび／またはビタミンＤ製剤を用いた治療
によって血清中のカルシウム濃度を一定にすることが可
能であるが、この治療は腎臓障害を起す危険を伴うもの
である。この投薬に伴う危険は、PTHによるホルモン治
療に変えることで避けることができる。
r.Kinderheilkunde 136,652−666）は、先天的な原因や
手術の結果、あるいは頚部への放射線被曝などによって
起こり、血液中のカルシウム濃度が減少するものであ
る。また、この病気の患者は痙攣性の発作を起しやす
い。もし、PTHが幼児期あるいは小児期に既に欠乏して
いると、知能の発育不全、歯および骨の欠陥といった危
険に長い間さらされることになる。ほとんどの患者は、
カルシウムおよび／またはビタミンＤ製剤を用いた治療
によって血清中のカルシウム濃度を一定にすることが可
能であるが、この治療は腎臓障害を起す危険を伴うもの
である。この投薬に伴う危険は、PTHによるホルモン治
療に変えることで避けることができる。
さらに、最近、副甲状腺ホルモンは抗高血圧活性を示
すことが明らかにされてきた（Nickols,Blood Vessels,
24,120−124,1987）。
すことが明らかにされてきた（Nickols,Blood Vessels,
24,120−124,1987）。
上皮小体機能不全症のホルモン治療だけでなく、骨粗
鬆症や緊張亢進症の治療でも、PTHは長期間、必要であ
れば一生、規則的に投与しなければならない。従って、
投与されるPTHは不純物がなく、また、抗体を形成しな
いものでなければならない。このような条件を最も効率
的に満たすものは、遺伝子工学もしくは化学的な経路を
経て合成された、ヒトPTHのアミノ酸配列を有するペプ
チドである。分泌されるPTH分子は、84個のアミノ酸か
ら成っている［hPTH−（１−84）］。しかしながら、こ
の規模のペプチドは化学的に合成することは困難であ
り、遺伝子工学によってより容易に作ることができる。
鬆症や緊張亢進症の治療でも、PTHは長期間、必要であ
れば一生、規則的に投与しなければならない。従って、
投与されるPTHは不純物がなく、また、抗体を形成しな
いものでなければならない。このような条件を最も効率
的に満たすものは、遺伝子工学もしくは化学的な経路を
経て合成された、ヒトPTHのアミノ酸配列を有するペプ
チドである。分泌されるPTH分子は、84個のアミノ酸か
ら成っている［hPTH−（１−84）］。しかしながら、こ
の規模のペプチドは化学的に合成することは困難であ
り、遺伝子工学によってより容易に作ることができる。
今までに、ヒトPTHのアミノ末端部分の配列を持つ、
異なる２種類のペプチド−すなわち、hPTH−（１−34）
とhPTH−（１−38）−が合成されてきた。hPTH−（１−
34）（Mallette et al.,J.Clin.Endocrin.Metab.67,964
−972,1988）でも、hPTH−（１−38）（Kruse and Krac
ht,Eur.J.Pediatr.146,373−377,1987）でも、注射によ
る単独投与を行なった臨床実験では、ウシから抽出され
たウシPTH（bPTH）による実験から経験的に予想されて
いたような短期的な結果、すなわち、尿中のリン酸塩と
環状アデノシン１リン酸（cAMP）の排泄が一時的に促進
されること、および血漿中のcAMP濃度が一時的に増加す
ることなどが観察された。
異なる２種類のペプチド−すなわち、hPTH−（１−34）
とhPTH−（１−38）−が合成されてきた。hPTH−（１−
34）（Mallette et al.,J.Clin.Endocrin.Metab.67,964
−972,1988）でも、hPTH−（１−38）（Kruse and Krac
ht,Eur.J.Pediatr.146,373−377,1987）でも、注射によ
る単独投与を行なった臨床実験では、ウシから抽出され
たウシPTH（bPTH）による実験から経験的に予想されて
いたような短期的な結果、すなわち、尿中のリン酸塩と
環状アデノシン１リン酸（cAMP）の排泄が一時的に促進
されること、および血漿中のcAMP濃度が一時的に増加す
ることなどが観察された。
少人数の骨粗鬆症患者を対象とした治療学的試験で
は、hPTH−（１−34）（Reeve et al.,Proceedings of
the 5th International congress on Bone Morphometr
y,Niigata,July 24−29,1988）もhPTH−（１−38）（he
sch et al.,Calcif.Tissue Int.44,176−180,1989）
も、ある程度の成果をあげることができた。
は、hPTH−（１−34）（Reeve et al.,Proceedings of
the 5th International congress on Bone Morphometr
y,Niigata,July 24−29,1988）もhPTH−（１−38）（he
sch et al.,Calcif.Tissue Int.44,176−180,1989）
も、ある程度の成果をあげることができた。
しかしながら、これほど有用なPTHフラグメントで
も、患者によっては、たとえ内因性PTHであっても外部
より投与されたフラグメントによる効果を反対にしてし
まうような抗体を生成してしまうという欠点がある［例
えば、hPTH−（１−34）ではオードランらの報文（Audr
an et al.,J.Clin.Endocrin.Metab.64,937−943,198
7）、hPTH−（１−38）ではステーグマンらの報文（Sto
gmann et al.,Monatsschr.Kinderheilk 136,107,1988）
を参照］。
も、患者によっては、たとえ内因性PTHであっても外部
より投与されたフラグメントによる効果を反対にしてし
まうような抗体を生成してしまうという欠点がある［例
えば、hPTH−（１−34）ではオードランらの報文（Audr
an et al.,J.Clin.Endocrin.Metab.64,937−943,198
7）、hPTH−（１−38）ではステーグマンらの報文（Sto
gmann et al.,Monatsschr.Kinderheilk 136,107,1988）
を参照］。
約20年ほど以前に、バーソンとヤーロー（Berson and
Yalow,J.Clin.Endocrinol.Metab,28,1037−1047,196
8）は、ヒトの血漿中には、分泌によって生じたり、あ
るいは元の分子の辺縁部が急激に分解されることで生じ
た種々のPTHフラグメントが存在することを明らかにし
た。また、この辺縁部PTH代謝の結果生じ、血液循環に
よって体内に供給される量の生成物は、生物活性を持た
ない巨大なカルボキシル末端のフラグメントであり、こ
のフラグメントは肝臓で形成されることが示された（D'
Amour and Huet,Am.J.Physiol.246,E249−255,1984）。
また、実験の結果から、完全な腎機能に依ったhPTH−
（１−84）は、圧倒的な生物活性を持つタイプのPTHで
あると考えられた。これに対して、不完全な腎機能で
は、個々の患者の血漿のクロマトグラフィーで、hPTH−
（１−34）の溶出ピークが明確に観測された（Grunbaum
et al.,Am.J.Physiol.247,E442−448,1984）。
Yalow,J.Clin.Endocrinol.Metab,28,1037−1047,196
8）は、ヒトの血漿中には、分泌によって生じたり、あ
るいは元の分子の辺縁部が急激に分解されることで生じ
た種々のPTHフラグメントが存在することを明らかにし
た。また、この辺縁部PTH代謝の結果生じ、血液循環に
よって体内に供給される量の生成物は、生物活性を持た
ない巨大なカルボキシル末端のフラグメントであり、こ
のフラグメントは肝臓で形成されることが示された（D'
Amour and Huet,Am.J.Physiol.246,E249−255,1984）。
また、実験の結果から、完全な腎機能に依ったhPTH−
（１−84）は、圧倒的な生物活性を持つタイプのPTHで
あると考えられた。これに対して、不完全な腎機能で
は、個々の患者の血漿のクロマトグラフィーで、hPTH−
（１−34）の溶出ピークが明確に観測された（Grunbaum
et al.,Am.J.Physiol.247,E442−448,1984）。
現在までのところ、健康人の血漿中にあって体内を循
環している、生物活性をもつPTHフラグメントは検出で
きていない。
環している、生物活性をもつPTHフラグメントは検出で
きていない。
そのため、体内でのPTHの分解を容器内でシュミレー
ションしてみて、それによって、PTH分子全体での主な
開裂位置を明らかにしようとする、種々の試みがなされ
てきた。このような研究では、鎖のアミノ末端から５番
目のアミノ酸から43番目のアミノ酸までの間の、ほとん
ど全部の位置が考慮されてきた（例えば、Barling et a
l.,Int.J.Biochem.16,815−821,1984）。ズルとシャン
グ（Zull and Chuang,J.Bio.Chem.260,1608−1613,198
5）は、bPTHとカテプシンＤとを用いた研究を行なっ
た。その結果、彼らは、ウシひ臓から分泌される酵素に
よってウシPTH（bPTH）が酵素分解されて、Ｃ末端のフ
ラグメント（35−84）と（38−84）、および、これらと
相補的なＮ末端フラグメント（１−34）と（１−37）が
形成されることを明らかにした。なお、彼らの論文に記
載されているbPTHは、我々が発見したhPTH（１−37）と
は、位置１（bPTHではアラニン［以下、Ala］、hPTHで
はセリン［以下、ser］）、７（bPTHではフェニルアラ
ニン［以下、Phe］、hPTHではロイシン［以下、Le
u］）、および16（bPTHではSer、hPTHではアスパラギン
［以下、Asn］）が異なっている。上記の最後に述べた
ウシPTH（１−37）フラグメントは、ラットとウシから
採取した腎臓膜を用いた研究によって、容器中で生物活
性を示すことが明らかになったが、この（１−37）フラ
グメントは、極めて少量しか検出されず、また、急速に
加水分解されて（１−34）フラグメントになってしま
う。このことから、著者らは、ウシの体内で、PTHはカ
テプシンＤによる酵素分解をうけて、最終的に（１−3
4）フラグメントを生成すると結論した。これに対し
て、他の研究者からは、生体の、どの血漿中からも、い
かなるＮ末端フラグメントも検出されないことに疑いが
出された（Goltzmann et al.,J.Clin.Invest.65,1309−
1317,1980）。今までのところ、分解によって生成し
た、生物活性のあるＮ末端PTHフラグメントを、正常な
ラットから検出することはできていない（Bringhurst e
t al.,Am.J.Physiol.255,E886−893,1982）。また、マ
クレガーら（MacGregor et al.,J.Biol.Chem.261,1929
−1934,1986）は、ウシの生体内の副甲状腺は、いかな
る生物活性Ｎ末端PTHフラグメントをも分泌していない
ことを発見した。要するに、上記のような報告から明ら
かなことは、本発明の時点においては、いかなる生物活
性Ｎ末端PTHフラグメントも、人間や動物の血漿中にあ
って体内を循環しているということはないということで
ある。
ションしてみて、それによって、PTH分子全体での主な
開裂位置を明らかにしようとする、種々の試みがなされ
てきた。このような研究では、鎖のアミノ末端から５番
目のアミノ酸から43番目のアミノ酸までの間の、ほとん
ど全部の位置が考慮されてきた（例えば、Barling et a
l.,Int.J.Biochem.16,815−821,1984）。ズルとシャン
グ（Zull and Chuang,J.Bio.Chem.260,1608−1613,198
5）は、bPTHとカテプシンＤとを用いた研究を行なっ
た。その結果、彼らは、ウシひ臓から分泌される酵素に
よってウシPTH（bPTH）が酵素分解されて、Ｃ末端のフ
ラグメント（35−84）と（38−84）、および、これらと
相補的なＮ末端フラグメント（１−34）と（１−37）が
形成されることを明らかにした。なお、彼らの論文に記
載されているbPTHは、我々が発見したhPTH（１−37）と
は、位置１（bPTHではアラニン［以下、Ala］、hPTHで
はセリン［以下、ser］）、７（bPTHではフェニルアラ
ニン［以下、Phe］、hPTHではロイシン［以下、Le
u］）、および16（bPTHではSer、hPTHではアスパラギン
［以下、Asn］）が異なっている。上記の最後に述べた
ウシPTH（１−37）フラグメントは、ラットとウシから
採取した腎臓膜を用いた研究によって、容器中で生物活
性を示すことが明らかになったが、この（１−37）フラ
グメントは、極めて少量しか検出されず、また、急速に
加水分解されて（１−34）フラグメントになってしま
う。このことから、著者らは、ウシの体内で、PTHはカ
テプシンＤによる酵素分解をうけて、最終的に（１−3
4）フラグメントを生成すると結論した。これに対し
て、他の研究者からは、生体の、どの血漿中からも、い
かなるＮ末端フラグメントも検出されないことに疑いが
出された（Goltzmann et al.,J.Clin.Invest.65,1309−
1317,1980）。今までのところ、分解によって生成し
た、生物活性のあるＮ末端PTHフラグメントを、正常な
ラットから検出することはできていない（Bringhurst e
t al.,Am.J.Physiol.255,E886−893,1982）。また、マ
クレガーら（MacGregor et al.,J.Biol.Chem.261,1929
−1934,1986）は、ウシの生体内の副甲状腺は、いかな
る生物活性Ｎ末端PTHフラグメントをも分泌していない
ことを発見した。要するに、上記のような報告から明ら
かなことは、本発明の時点においては、いかなる生物活
性Ｎ末端PTHフラグメントも、人間や動物の血漿中にあ
って体内を循環しているということはないということで
ある。
本発明の目的は、天然パラトルモン（PTH）の生物学
的および治療学的活性を有している摂取し易い医薬品の
hPTHフラグメントであって、少なくとも公知のPTHフラ
グメント−（１−34）および（１−38）の効果を有し、
しかも、これらに固有の欠点を持たない−特に、抗体の
形成を引き起こすことのない、新しいhPTHフラグメント
−（１−37）を提供することにある。
的および治療学的活性を有している摂取し易い医薬品の
hPTHフラグメントであって、少なくとも公知のPTHフラ
グメント−（１−34）および（１−38）の効果を有し、
しかも、これらに固有の欠点を持たない−特に、抗体の
形成を引き起こすことのない、新しいhPTHフラグメント
−（１−37）を提供することにある。
また、本発明は、前記hPTHフラグメント−（１−37）
の製造法、およびこれを様々な治療用、診断用医薬品と
して用いる使用を提供することにもある。
の製造法、およびこれを様々な治療用、診断用医薬品と
して用いる使用を提供することにもある。
上記の目的は、新しいアミノ酸配列からなるhPTHフラ
グメントによって達成することができる。
グメントによって達成することができる。
すなわち、本発明は、以下のアミノ酸配列を有するhP
THフラグメント−（１−37）と、その天然および薬学的
に同等な誘導体、特に、アミド化、アセチル化、ホスホ
リル化およびグリコシル化されたhPTHフラグメント−
（１−37）誘導体に関する。
THフラグメント−（１−37）と、その天然および薬学的
に同等な誘導体、特に、アミド化、アセチル化、ホスホ
リル化およびグリコシル化されたhPTHフラグメント−
（１−37）誘導体に関する。
さらに、本発明は、原核もしくは真核生物の発現によ
り調製し、クロマトグラフィーによって精製することを
特徴とする上記hPTHフラグメント−（１−37）またはそ
の誘導体の製造法に関する。またさらに、本発明は、ヒ
トの血液からクロマトグラフィーを用いた公知の方法に
よって、上記フラグメントを単離するhPTHフラグメント
−（１−37）または、その誘導体の製造法に関する。ま
た、本発明は、保護された上記の配列を含むアミノ酸群
から、従来の方法によってhPTHフラグメントを固相もし
くは液相で形成し、保護基をはずし、クロマトグラフィ
ーを用いた、確立された精製法で精製する上記hPTHフラ
グメント−（１−37）またはその誘導体の製造法にも関
する。
り調製し、クロマトグラフィーによって精製することを
特徴とする上記hPTHフラグメント−（１−37）またはそ
の誘導体の製造法に関する。またさらに、本発明は、ヒ
トの血液からクロマトグラフィーを用いた公知の方法に
よって、上記フラグメントを単離するhPTHフラグメント
−（１−37）または、その誘導体の製造法に関する。ま
た、本発明は、保護された上記の配列を含むアミノ酸群
から、従来の方法によってhPTHフラグメントを固相もし
くは液相で形成し、保護基をはずし、クロマトグラフィ
ーを用いた、確立された精製法で精製する上記hPTHフラ
グメント−（１−37）またはその誘導体の製造法にも関
する。
驚くべきことには、完全な生物活性を有する最小のhP
THフラグメントはhPTH−（１−37）であり、これはhPTH
−（１−84）が人体中で開裂して最初に形成されること
が、本発明によって明らかになった（実施例１参照）。
さらにまた驚くべきことには、hPTH−（１−37）の空間
的な構造は、従来知られているフラグメントの構造と明
らかに異なっており（実施例５参照）、構造と効果およ
び抗体の性質との間に特定の関連があることが分った。
THフラグメントはhPTH−（１−37）であり、これはhPTH
−（１−84）が人体中で開裂して最初に形成されること
が、本発明によって明らかになった（実施例１参照）。
さらにまた驚くべきことには、hPTH−（１−37）の空間
的な構造は、従来知られているフラグメントの構造と明
らかに異なっており（実施例５参照）、構造と効果およ
び抗体の性質との間に特定の関連があることが分った。
hPTHフラグメント−（１−37）は、化学的に合成（実
施例２参照）し、医薬品として製剤した。また、従来の
ベクターを用いた遺伝子工学的な方法によっても製造し
た。すなわち、hPTH−（１−37）ペプチドを、（１）原
核生物および（２）真核生物を用いて、遺伝子工学的な
経路を経て製造した。原核生物を用いる場合、大腸菌を
利用することが好ましい。この目的のために利用できる
ものとしては、分泌発現用の発現ベクター（例えば、pS
P6、pRit誘導体、ファーマシア社製）、直接細胞質発現
用ベクター（例えば、pKK誘導体、ファーマシア社
製）、あるいは融合タンパク質としての発現用ベクター
（例えば、pMC1871、ファーマシア社製）などを挙げる
ことができる（マーストンらの文献を参照［Marston et
al.,Biochem.J.240,1−12,1986］）。真核生物を用い
る場合、種々の有機体やベクターを利用することができ
る。例えば、昆虫細胞（Summers and Smith.Tex.Agri.E
xp.Stn.（bull）1555,1987）、酵母（Hitzemann et a
l.,Nature 293,717−722,1981）、糸状菌類（Yelton et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,1470−1474,1984）お
よび哺乳類の細胞（Zettlmeissl et al.,Biotechnology
５,720−725,1987）などである。これらのなかで、昆
虫細胞が好ましい。得られたペプチドはクロマトグラフ
ィー、好ましくは、実施例１に示したクロマトグラフィ
ーによって精製する。
施例２参照）し、医薬品として製剤した。また、従来の
ベクターを用いた遺伝子工学的な方法によっても製造し
た。すなわち、hPTH−（１−37）ペプチドを、（１）原
核生物および（２）真核生物を用いて、遺伝子工学的な
経路を経て製造した。原核生物を用いる場合、大腸菌を
利用することが好ましい。この目的のために利用できる
ものとしては、分泌発現用の発現ベクター（例えば、pS
P6、pRit誘導体、ファーマシア社製）、直接細胞質発現
用ベクター（例えば、pKK誘導体、ファーマシア社
製）、あるいは融合タンパク質としての発現用ベクター
（例えば、pMC1871、ファーマシア社製）などを挙げる
ことができる（マーストンらの文献を参照［Marston et
al.,Biochem.J.240,1−12,1986］）。真核生物を用い
る場合、種々の有機体やベクターを利用することができ
る。例えば、昆虫細胞（Summers and Smith.Tex.Agri.E
xp.Stn.（bull）1555,1987）、酵母（Hitzemann et a
l.,Nature 293,717−722,1981）、糸状菌類（Yelton et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,1470−1474,1984）お
よび哺乳類の細胞（Zettlmeissl et al.,Biotechnology
５,720−725,1987）などである。これらのなかで、昆
虫細胞が好ましい。得られたペプチドはクロマトグラフ
ィー、好ましくは、実施例１に示したクロマトグラフィ
ーによって精製する。
本発明の医薬品は、hPTH−（１−37）もしくは、これ
と生理学的に同等なhPTH−（１−37）の塩を含有する。
hPTH−（１−37）を含有する医薬品の形態および組成
は、投与の方法に依っている。ヒトhPTH−（１−37）の
投与は、非経口的に、あるいは鼻からや口から、また
は、吸入によって行なってもよい。好ましくは、使用直
前に溶液もしくは凍結乾燥されたhPTH−（１−37）から
注射液を調製する。さらに、この医薬品には、調剤のた
め、もしくは、溶解性、安定性または消毒のため、ある
いは体内への吸収効率を高めるためなどに必要な補助成
分が含まれていてもよい。毎日の投与量は症状に依って
いる。骨粗鬆症の治療では、毎日の投与量は、静脈／筋
肉注射の場合で１日当り100から1200単位（mg）であ
り、皮下注射の場合で１日当り300から2400単位（mg）
が好ましい。生物活性の決定は、国際基準試薬と私たち
の実験室でヒトhPTHフラグメントのために調製した基準
試薬とを用いて、hPTHフラグメントに共通なバイオ・ア
ッセイの測定を基礎にして行なった。
と生理学的に同等なhPTH−（１−37）の塩を含有する。
hPTH−（１−37）を含有する医薬品の形態および組成
は、投与の方法に依っている。ヒトhPTH−（１−37）の
投与は、非経口的に、あるいは鼻からや口から、また
は、吸入によって行なってもよい。好ましくは、使用直
前に溶液もしくは凍結乾燥されたhPTH−（１−37）から
注射液を調製する。さらに、この医薬品には、調剤のた
め、もしくは、溶解性、安定性または消毒のため、ある
いは体内への吸収効率を高めるためなどに必要な補助成
分が含まれていてもよい。毎日の投与量は症状に依って
いる。骨粗鬆症の治療では、毎日の投与量は、静脈／筋
肉注射の場合で１日当り100から1200単位（mg）であ
り、皮下注射の場合で１日当り300から2400単位（mg）
が好ましい。生物活性の決定は、国際基準試薬と私たち
の実験室でヒトhPTHフラグメントのために調製した基準
試薬とを用いて、hPTHフラグメントに共通なバイオ・ア
ッセイの測定を基礎にして行なった。
本発明のhPTHフラグメント−（１−37）は、上皮小体
機能不全症および骨粗鬆症の長期にわたる治療に、特に
適している。なぜならば、このhPTHフラグメント−（１
−37）は優れた生物活性を示す一方で、たとえ長期間使
用しても、いかなる免疫反応も引き起こさないからであ
る。
機能不全症および骨粗鬆症の長期にわたる治療に、特に
適している。なぜならば、このhPTHフラグメント−（１
−37）は優れた生物活性を示す一方で、たとえ長期間使
用しても、いかなる免疫反応も引き起こさないからであ
る。
また、本発明の医薬品は、本態性緊張亢進症に対して
長期間もしくは一生涯用いる血圧安定剤として優れたも
のである。
長期間もしくは一生涯用いる血圧安定剤として優れたも
のである。
さらに、本発明の医薬品は、腎臓病および肺疾患の集
中治療用の試薬として応用できる（実施例６参照）。
中治療用の試薬として応用できる（実施例６参照）。
またさらに本発明の医薬品は、男性のインポテンツの
治療薬としても利用できる（実施例６参照）。
治療薬としても利用できる（実施例６参照）。
以下に、実施例および実施例で参照する図を用いて、
本発明をさらに詳細に説明する。
本発明をさらに詳細に説明する。
第１図：セファデックス（Sephadex）G25−分子量に
よって粗分離するとともに、粗製ペプチド抽出物の脱塩
を行なう、アルギ酸溶出液の調製用大規模クロマトグラ
フィー。RIA（放射能免疫分析）によって、斜線部分か
らhPTHフラグメントが検出される。
よって粗分離するとともに、粗製ペプチド抽出物の脱塩
を行なう、アルギ酸溶出液の調製用大規模クロマトグラ
フィー。RIA（放射能免疫分析）によって、斜線部分か
らhPTHフラグメントが検出される。
カラム :ファーマシア（Pharmacia）Ｋ 100/100;ID
10cm×10cm 材質 :セファデックス（Sephadex）G25 媒体 溶離液 :1M 酢酸 展開速度:5ml/分 光吸収 :280nm 第２図：第１図のペプチド物質を、さらに分離するた
めの調製用HPLC陽イオン交換クロマトグラフィー。各々
16mlずつ採取されたNo.2−５のフラクションは、それぞ
れ640pmol以上のhPTHフラグメント−（44−68）−IR物
質を含有している（斜線部）。
10cm×10cm 材質 :セファデックス（Sephadex）G25 媒体 溶離液 :1M 酢酸 展開速度:5ml/分 光吸収 :280nm 第２図：第１図のペプチド物質を、さらに分離するた
めの調製用HPLC陽イオン交換クロマトグラフィー。各々
16mlずつ採取されたNo.2−５のフラクションは、それぞ
れ640pmol以上のhPTHフラグメント−（44−68）−IR物
質を含有している（斜線部）。
カラム :HPLC鋼製カラム 2cm×10cm 材質 :パーコシル・ペプケート（Parcosil Pepkat） 溶離液 :A:5mM K2HPO4 pH3.0 B:1M HCl中でＡと同様 展開速度:8ml/分 光吸収 :280nm 溶離傾斜:0−60％Ｂ、60分間 第３図：第２図のフラクションNo.2−５を、さらに分
離するための半調製用RPクロマトグラフィー。フラクシ
ョンNo.17および20には、3ml中に、hPTHフラグメント−
（44−68）が180pmol以上存在していることがRIAによっ
て検出できる。
離するための半調製用RPクロマトグラフィー。フラクシ
ョンNo.17および20には、3ml中に、hPTHフラグメント−
（44−68）が180pmol以上存在していることがRIAによっ
て検出できる。
カラム :HPLC鋼製カラム 1cm×10cm 材質 :オーペゲン（Orpegen）RP HD−ゲル7/300 溶離液 :A:0.01M HCl B:80％アセトニトリル中でＡと同様 展開速度:3ml/分 光吸収 :280nm 溶離傾斜:0−60％Ｂ、60分間 温度 :45℃ 第４図：第３図のフラクションNo.20を、さらに分離
するための半調製用陽イオン交換クロマトグラフィー。
フラクションNo.32および33には、10ml中に、hPTHフラ
グメント−（44−68）が、それぞれ750pmolおよび600pm
ol存在していることがRIAによって検出できる。
するための半調製用陽イオン交換クロマトグラフィー。
フラクションNo.32および33には、10ml中に、hPTHフラ
グメント−（44−68）が、それぞれ750pmolおよび600pm
ol存在していることがRIAによって検出できる。
カラム :HPC鋼製カラム 1cm×5cm 材質 :パーコシル・ペプケート（Parcosil Pepkat） 溶離液 :A:5mM K2HPO4 pH3.0 B:1M NaCl中でＡと同様 展開速度:3ml/分 光吸収 :230nm 溶離傾斜:0−50％Ｂ、50分間 第５図：中間段階1:第４図のフラクションNo.32およ
び33の分析用RPクロマトグラフィー。２種類の形態のhP
THフラグメント−（44−68）−IRが検出された。すなわ
ち、フラクションNo.3には、3ml中に150pmol以上、フラ
クションNo.15および16には、3ml中に、各々300pmol以
上存在している。
び33の分析用RPクロマトグラフィー。２種類の形態のhP
THフラグメント−（44−68）−IRが検出された。すなわ
ち、フラクションNo.3には、3ml中に150pmol以上、フラ
クションNo.15および16には、3ml中に、各々300pmol以
上存在している。
カラム :HPLC鋼製カラム 1cm×10cm 材質 :オーペゲン（Orpegen）RP HD−ゲル7/300 溶離液 :A:0.1％ TFA B:80％アセトニトリル中でＡと同様 展開速度:3ml/分 光吸収 :280nm 溶離傾斜:0−40％Ｂ、60分間 温度 :45℃ 第６図：中間段階2:第５図のフラクションNo.15およ
び16の分析用陽イオン交換クロマトグラフィー。2mlの
フラクションNo.9にhPTHフラグメント−（44−68）−IR
物質が、特に、濃縮されていた（200pmol以上）。
び16の分析用陽イオン交換クロマトグラフィー。2mlの
フラクションNo.9にhPTHフラグメント−（44−68）−IR
物質が、特に、濃縮されていた（200pmol以上）。
カラム :HPLC鋼製カラム 0.5cm×5cm 材質 :パーコシル・ペプケート（Parcosil Pepkat） 溶離液 :A:5mM K2HPO4 pH3.0 B:1M NaCl中でＡと同様 展開速度:0.7ml/分 光吸収 :230nm 溶離傾斜:0−50％Ｂ、50分間 第７図：第６図のフラクション８および９の疎水性ク
ロマトグラフィー。0.87mlのフラクションNo.5−10の各
々には、170pmol以上のhPTHフラグメント−（44−68）
−IR物質が含まれていた。
ロマトグラフィー。0.87mlのフラクションNo.5−10の各
々には、170pmol以上のhPTHフラグメント−（44−68）
−IR物質が含まれていた。
カラム :HPLC鋼製カラム 0.5cm×5cm 材質 :パーコシル・プロ（Parcosil Pro）HIC 溶離液 :A:100mM Na2HPO4 pH6.5 B:3M （NH4）2SO4中でＡと同様 展開速度:0.7ml/分 光吸収 :230nm 溶離傾斜:100−０％Ｂ、45分間 第８図：第７図のフラクションNo.5から10の分析用RP
クロマトグラフィー。hPTHフラグメント−（44−68）−
IRのピークが観測された。
クロマトグラフィー。hPTHフラグメント−（44−68）−
IRのピークが観測された。
カラム :HPLC鋼製カラム 0.5cm×5cm 材質 :オーペゲン（Orpegen）RP HD−ゲル7/300 溶離液 :A:0.1％ TFA B:80％アセトニトリル中でＡと同様 展開速度:0.7ml/分 光吸収 :230nm 溶離傾斜:0−40％Ｂ、60分間 温度 :45℃ 第９図:hPTHフラグメントの最終精製に用いた分析用R
Pクロマトグラフィー。第８図のフラクション25を再度
クロマトグラフにかけて、ピーク位置に極めて純粋なhP
THフラグメントを集めた。配列を調べたところ、これが
hPTH−（38−84）であることが分った。
Pクロマトグラフィー。第８図のフラクション25を再度
クロマトグラフにかけて、ピーク位置に極めて純粋なhP
THフラグメントを集めた。配列を調べたところ、これが
hPTH−（38−84）であることが分った。
カラム :HPLC鋼製カラム 0.5cm×5cm 材質 :オーペゲン（Orpegen）RP HD−ゲル7/300 溶離液 :A:0.1％ TFA B:80％アセトニトリル中でＡと同様 展開速度:0.7ml/分 光吸収 :230nm 溶離傾斜:0−40％Ｂ、60分間 温度 :45℃ 第10図:N末端hPTHフラグメントを合成するための反転
相HPLCクロマトグラフィー。すなわち、hPTH−（１−3
3）、hPTH−（１−34）、hPTH−（１−37）、hPTH−
（１−38）を合成した。もしこれらのフラグメントが、
血液によって人体内を循環している天然のＮ末端hPTHフ
ラグメントの参照として用いられるならば、hPTH−（１
−37）がヒトの血液中にある正確な分子形態であること
を示すことができる。
相HPLCクロマトグラフィー。すなわち、hPTH−（１−3
3）、hPTH−（１−34）、hPTH−（１−37）、hPTH−
（１−38）を合成した。もしこれらのフラグメントが、
血液によって人体内を循環している天然のＮ末端hPTHフ
ラグメントの参照として用いられるならば、hPTH−（１
−37）がヒトの血液中にある正確な分子形態であること
を示すことができる。
カラム :パーコシル・プロ（Parcosil Pro）300−７
C4、125×4mm 温度 :55℃ 溶離液 :A:0.1％ トリフロロ酢酸 B:80％アセトニトリル中＋Ａと同様 溶離傾斜:最初: 25％ Ｂ :55分: 50％ Ｂ 60分:100％ Ｂ 光吸収 :230nm 展開速度:0.7ml/分 第11図:hPTHフラグメントによる刺激を受けてから
の、PC−12細胞内のcAMP濃度の時間変化である。1.5×1
05の細胞を、10-4MのIBMXの存在下で10-7MのhPTH−（１
−33）、hPTH−（１−37）あるいはhPTH−（１−38）と
ともに、０、2.5、10および20分間培養した。比較のた
めに、IBMXだけで20分間培養した細胞も測定した。値
は、３回の実験の平均値±標準偏差である。
C4、125×4mm 温度 :55℃ 溶離液 :A:0.1％ トリフロロ酢酸 B:80％アセトニトリル中＋Ａと同様 溶離傾斜:最初: 25％ Ｂ :55分: 50％ Ｂ 60分:100％ Ｂ 光吸収 :230nm 展開速度:0.7ml/分 第11図:hPTHフラグメントによる刺激を受けてから
の、PC−12細胞内のcAMP濃度の時間変化である。1.5×1
05の細胞を、10-4MのIBMXの存在下で10-7MのhPTH−（１
−33）、hPTH−（１−37）あるいはhPTH−（１−38）と
ともに、０、2.5、10および20分間培養した。比較のた
めに、IBMXだけで20分間培養した細胞も測定した。値
は、３回の実験の平均値±標準偏差である。
第12図:hPTHフラグメントによる刺激を受けてから５
分後の、PC−12細胞内のcAMP濃度と、hPTH−（１−3
3）、hPTH−（１−37）およびhPTH−（１−38）濃度と
の関係を示した。2.2×105の細胞を、10-4MのIBMXの存
在下で、hPTH−（１−33）、hPTH−（１−37）およびhP
TH−（１−38）の、それぞれ10-11（二つ実験した）
Ｍ、10-10M、10-9M、10-8Mおよび10-7M溶液とともに５
分間培養し、細胞内のcAMP濃度を測定する実験を３回行
なった。PTHを含まないIBMX参照試料の値は、18.0、26.
1、20.9であった。示した数値は、平均値±標準偏差で
ある。
分後の、PC−12細胞内のcAMP濃度と、hPTH−（１−3
3）、hPTH−（１−37）およびhPTH−（１−38）濃度と
の関係を示した。2.2×105の細胞を、10-4MのIBMXの存
在下で、hPTH−（１−33）、hPTH−（１−37）およびhP
TH−（１−38）の、それぞれ10-11（二つ実験した）
Ｍ、10-10M、10-9M、10-8Mおよび10-7M溶液とともに５
分間培養し、細胞内のcAMP濃度を測定する実験を３回行
なった。PTHを含まないIBMX参照試料の値は、18.0、26.
1、20.9であった。示した数値は、平均値±標準偏差で
ある。
第13図:hPTHフラグメントhPTH−（１−33）、hPTH−
（１−37）およびhPTH−（１−38）の紫外光円二色性ス
ペクトルである。他のhPTHフラグメントに比べると、hP
TH−（１−37）は、目立った特徴を有している。
（１−37）およびhPTH−（１−38）の紫外光円二色性ス
ペクトルである。他のhPTHフラグメントに比べると、hP
TH−（１−37）は、目立った特徴を有している。
第14図：化学的に合成したhPTH−（１−37）の第１段
階の精製。ここでは、粗製物に対して陽イオン交換クロ
マトグラフィーを用いた。参照試料によると、担持時間
29分の高いピークは、合成したhPTH−（１−37）である
（矢印の位置）。
階の精製。ここでは、粗製物に対して陽イオン交換クロ
マトグラフィーを用いた。参照試料によると、担持時間
29分の高いピークは、合成したhPTH−（１−37）である
（矢印の位置）。
カラム :パーコシル・プロ（Parcosil Pro）300−７
125×4mm 温度 :25℃ 溶離液 :A:5mM Na2HPO4 B:5mM Na2HPO4、1M NaCl、pH＝3.0 溶離傾斜:最初: 5％ Ｂ 57分:100％ Ｂ 光吸収 :230nm 展開速度:1ml/分 第15図：合成のときに準じたスケールでの、まだ精製
していない第14図の物質の反転相HPLCクロマトグラフィ
ー。溶出液の22.5分のピークは、hPTH−（１−37）参照
試料のものと一致した。
125×4mm 温度 :25℃ 溶離液 :A:5mM Na2HPO4 B:5mM Na2HPO4、1M NaCl、pH＝3.0 溶離傾斜:最初: 5％ Ｂ 57分:100％ Ｂ 光吸収 :230nm 展開速度:1ml/分 第15図：合成のときに準じたスケールでの、まだ精製
していない第14図の物質の反転相HPLCクロマトグラフィ
ー。溶出液の22.5分のピークは、hPTH−（１−37）参照
試料のものと一致した。
カラム :パーコシル・プロ（Parcosil Pro）RP300−７
C4、100×20mm 温度 :25℃ 光吸収 :230nm 溶離液 :A:0.1％ トリフロロ酢酸 B:80％アセトニトリル中＋Ａと同様 溶離傾斜:0−100％ Ｂ、60分間 展開速度:7ml/分 第16図：第15図の物質の最終精製に用いる反転相HPLC
クロマトグラフィー。ピークは、hPTH−（１−37）の参
照試料のものと一致した。
C4、100×20mm 温度 :25℃ 光吸収 :230nm 溶離液 :A:0.1％ トリフロロ酢酸 B:80％アセトニトリル中＋Ａと同様 溶離傾斜:0−100％ Ｂ、60分間 展開速度:7ml/分 第16図：第15図の物質の最終精製に用いる反転相HPLC
クロマトグラフィー。ピークは、hPTH−（１−37）の参
照試料のものと一致した。
カラム :パーコシル・プロ（Parcosil Pro）RP300−18
C4、125×4mm 温度 :25℃ 光吸収 :230nm 溶離液 :A:0.1％ トリフロロ酢酸 B:80％アセトニトリル中＋Ａと同様 溶離傾斜:0−100％ Ｂ、60分間 展開速度:0.7ml/分 第17図：第16図で得られた合成hPTH−（１−37）の質
量スペクトル。分子量4398.1のところのピークは、計算
によって求めた分子量4401.0と、0.1％の誤差の範囲内
で一致している。側鎖の配列は観測されていない。分子
量2201.5のピークも、二重イオン化されたものに誤差の
範囲内で一致している。この質量の測定は、相補配列に
よって確認した。
C4、125×4mm 温度 :25℃ 光吸収 :230nm 溶離液 :A:0.1％ トリフロロ酢酸 B:80％アセトニトリル中＋Ａと同様 溶離傾斜:0−100％ Ｂ、60分間 展開速度:0.7ml/分 第17図：第16図で得られた合成hPTH−（１−37）の質
量スペクトル。分子量4398.1のところのピークは、計算
によって求めた分子量4401.0と、0.1％の誤差の範囲内
で一致している。側鎖の配列は観測されていない。分子
量2201.5のピークも、二重イオン化されたものに誤差の
範囲内で一致している。この質量の測定は、相補配列に
よって確認した。
実施例１ 体内を循環している生物活性PTHフラグメントの配列の
間接的決定 用いた出発物質は、腎臓機能不全症の患者から採取し
た大量の血液ロ液で、約20000ダルトンまでの分子サイ
ズの、すべての血漿構成成分を含有している。
間接的決定 用いた出発物質は、腎臓機能不全症の患者から採取し
た大量の血液ロ液で、約20000ダルトンまでの分子サイ
ズの、すべての血漿構成成分を含有している。
I.粗製ペプチド物質の回収 血液ロ液は、排除サイズ20000ダルトンのトリアセテ
ート・フィルターを用いたサートリウス（sartorius）
社製血液ロ過装置（SM 40042型、サートリウス社、ゲ
ッチンゲン、ドイツ［Type SM 40042,Sartorius,Gottin
gen,Germany］）によって回収した。ロ液は、長期間に
わたるロ過によって安定な代謝を維持している腎臓機能
不全症の患者から採取した。1000リットルの血液ロ液を
採取して、すぐに、フロー加熱、酸性化および阻害酵素
の添加を行ない、タンパク分解が起こらないようにし
た。その後、ホースマン（Forssmann）がDE3633797A1で
開示している方法によって、粗製ペプチド・フラクショ
ン（約100g）をアルギン酸で抽出し、単離した。
ート・フィルターを用いたサートリウス（sartorius）
社製血液ロ過装置（SM 40042型、サートリウス社、ゲ
ッチンゲン、ドイツ［Type SM 40042,Sartorius,Gottin
gen,Germany］）によって回収した。ロ液は、長期間に
わたるロ過によって安定な代謝を維持している腎臓機能
不全症の患者から採取した。1000リットルの血液ロ液を
採取して、すぐに、フロー加熱、酸性化および阻害酵素
の添加を行ない、タンパク分解が起こらないようにし
た。その後、ホースマン（Forssmann）がDE3633797A1で
開示している方法によって、粗製ペプチド・フラクショ
ン（約100g）をアルギン酸で抽出し、単離した。
II.パラトルモン（PTH）の中間領域およびＣ末端で特異
的な放射能免疫分析に対して免疫反応性を示すフラクシ
ョン（コード51.5）の単離 1.セファデックス（Sephadex）G25による粗製ペプチド
物質の脱塩 アルギン酸抽出によって得られた粗製ペプチド・フラ
クションを、セファデックスG25（ファーマシア社製、
ウブサラ、スエーデン［Pharmacia,Uppsala,Sweden］）
を充填したカラムにかけて、1M酢酸を展開液にして８℃
でゲル・クロマトグラフィーによる分離を行なった（第
１図）。プールＩからIVの免疫反応性を、中間領域で特
異的なヒトPTH（hPTH−（44−68）−RIA、イムノンディ
アグノスティク社製、ダルムシュタット、ドイツ［Immu
ndiagnostik,Darmstadt,Germany］）を用いた放射能免
疫分析によって測定した。前記製造者のデータによれ
ば、検出限界は、使用した基準（hPTH−（44−68））の
6fmol/試験（１試験当り６フェムト・モル）である。イ
ントラ・アッセイおよびインター・アッセイの変動係数
は、それぞれ10から13％および12から21％である。ペプ
チドhPTH−（53−84）およびhPTH−（１−84）がhPTH−
（44−68）−RIAと100％交叉反応するのに対して、合成
hPTHペプチドhPTH−（１−34）、hPTH−（28−48）およ
びhPTH−（64−84）は、いかなる交叉反応も起こさな
い。
的な放射能免疫分析に対して免疫反応性を示すフラクシ
ョン（コード51.5）の単離 1.セファデックス（Sephadex）G25による粗製ペプチド
物質の脱塩 アルギン酸抽出によって得られた粗製ペプチド・フラ
クションを、セファデックスG25（ファーマシア社製、
ウブサラ、スエーデン［Pharmacia,Uppsala,Sweden］）
を充填したカラムにかけて、1M酢酸を展開液にして８℃
でゲル・クロマトグラフィーによる分離を行なった（第
１図）。プールＩからIVの免疫反応性を、中間領域で特
異的なヒトPTH（hPTH−（44−68）−RIA、イムノンディ
アグノスティク社製、ダルムシュタット、ドイツ［Immu
ndiagnostik,Darmstadt,Germany］）を用いた放射能免
疫分析によって測定した。前記製造者のデータによれ
ば、検出限界は、使用した基準（hPTH−（44−68））の
6fmol/試験（１試験当り６フェムト・モル）である。イ
ントラ・アッセイおよびインター・アッセイの変動係数
は、それぞれ10から13％および12から21％である。ペプ
チドhPTH−（53−84）およびhPTH−（１−84）がhPTH−
（44−68）−RIAと100％交叉反応するのに対して、合成
hPTHペプチドhPTH−（１−34）、hPTH−（28−48）およ
びhPTH−（64−84）は、いかなる交叉反応も起こさな
い。
他のフラクションが免疫反応性を全く示さなかったの
に対して、プールＩでは、完全な免疫反応性がhPTH−
（44−68）−RIAで測定された。
に対して、プールＩでは、完全な免疫反応性がhPTH−
（44−68）−RIAで測定された。
また、プールＩでは、極めて高いＣ末端免疫反応性が
hPTH−（53−84）−RIA（イムノンディアグノスティク
社製、ダルムシュタット、ドイツ［immundiagnostik,Da
rmstadt,Germany］）で測定された。製造者のデータに
よれば、hPTH−（53−84）−RIAによる検出限界は、使
用した基準（hPTH−（53−84））の4fmol/試験である。
イントラ・アッセイおよびインター・アッセイの変動係
数は、それぞれ8.3から9.8％および11から14％である。
ペプチドhPTH−（64−84）およびhPTH−（１−84）がhP
TH−（53−84）−RIAと100％交叉反応するのに対して、
合成hPTHペプチドhPTH−（１−34）、hPTH−（28−48）
およびhPTH−（44−68）は、いかなる交叉反応も起こさ
ない。
hPTH−（53−84）−RIA（イムノンディアグノスティク
社製、ダルムシュタット、ドイツ［immundiagnostik,Da
rmstadt,Germany］）で測定された。製造者のデータに
よれば、hPTH−（53−84）−RIAによる検出限界は、使
用した基準（hPTH−（53−84））の4fmol/試験である。
イントラ・アッセイおよびインター・アッセイの変動係
数は、それぞれ8.3から9.8％および11から14％である。
ペプチドhPTH−（64−84）およびhPTH−（１−84）がhP
TH−（53−84）−RIAと100％交叉反応するのに対して、
合成hPTHペプチドhPTH−（１−34）、hPTH−（28−48）
およびhPTH−（44−68）は、いかなる交叉反応も起こさ
ない。
ここでは、２種類のPTH−RIAによる測定を行なったた
めに、高濃度のＣ末端PTHフラグメントが生じたので、
プールＩ（斜線部）をさらに精製した。
めに、高濃度のＣ末端PTHフラグメントが生じたので、
プールＩ（斜線部）をさらに精製した。
2.プールＩの調製用陽イオン交換クロマトグラフィー 陽イオン交換カラム・クロマトグラフを用いて、室温
で、さらに分離・調製を行なった（第２図）。12本のク
ロマトグラフを用いて、総計約6gのプールＩ成分を分離
し、hPTH−（44−68）−RIAによって免疫反応性を測定
した（第２図）。表には示されていないフラクションN
o.2−５（斜線部）は、hPTH−（44−68）−RIAで、極め
て高い免疫反応性を示した。これらのフラクションを一
緒に集めてプールにして、さらに分離を続けた。なお、
これらのフラクションは、hPTH−（53−84）−RIAで
も、極めて高い免疫反応性を示した。
で、さらに分離・調製を行なった（第２図）。12本のク
ロマトグラフを用いて、総計約6gのプールＩ成分を分離
し、hPTH−（44−68）−RIAによって免疫反応性を測定
した（第２図）。表には示されていないフラクションN
o.2−５（斜線部）は、hPTH−（44−68）−RIAで、極め
て高い免疫反応性を示した。これらのフラクションを一
緒に集めてプールにして、さらに分離を続けた。なお、
これらのフラクションは、hPTH−（53−84）−RIAで
も、極めて高い免疫反応性を示した。
3.調製用陽イオン交換クロマトグラフィーによって得ら
れた免疫反応性プールの半調製用反転相クロマトグラフ
ィー（第２工程） 得られた免疫反応性プール（約200g）を、半調製用反
転相（RP）クロマトグラフを用いて、45℃で、さらに精
製した（第３図）。hPTH−（53−84）−RIAで免疫反応
性を示すピーク（第３図）と、hPTH−（44−68）−RIA
で免疫反応性を示すピーク（第３図）とが、互いに充分
には分離しないで表われた。
れた免疫反応性プールの半調製用反転相クロマトグラフ
ィー（第２工程） 得られた免疫反応性プール（約200g）を、半調製用反
転相（RP）クロマトグラフを用いて、45℃で、さらに精
製した（第３図）。hPTH−（53−84）−RIAで免疫反応
性を示すピーク（第３図）と、hPTH−（44−68）−RIA
で免疫反応性を示すピーク（第３図）とが、互いに充分
には分離しないで表われた。
RIAに対して極めて高い反応性を示す、後ろのプール
についての操作を以下により詳しく記載する（第４図か
ら第６図）。この第４工程から第６工程までを行なって
得られたフラクションNo.51.5の配列を分析した。
についての操作を以下により詳しく記載する（第４図か
ら第６図）。この第４工程から第６工程までを行なって
得られたフラクションNo.51.5の配列を分析した。
なお、ここで特に言及しなかったフラクションから
は、いかなる免疫反応性も測定されなかった。
は、いかなる免疫反応性も測定されなかった。
4. ａ）半調製用RPクロマトグラフィーによって得られた免
疫反応性プールの半調製用陽イオン交換クロマトグラフ
ィー（第３工程） 上記のRPクロマトグラフィーによって得られた免疫反
応性プールを、半調製用陽イオン交換カラム・クロマト
グラフィーを用いて、室温で、さらに精製した（第４
図）。フラクションNo.32−33は、中間領域およびＣ末
端PTH（図示せず）に免疫反応性を示した。これらのフ
ラクションを集めてプールにして（斜線部）、さらに操
作を進めた。なお、ここで特に言及しなかったフラクシ
ョンからは、いかなる免疫反応性も測定されなかった。
疫反応性プールの半調製用陽イオン交換クロマトグラフ
ィー（第３工程） 上記のRPクロマトグラフィーによって得られた免疫反
応性プールを、半調製用陽イオン交換カラム・クロマト
グラフィーを用いて、室温で、さらに精製した（第４
図）。フラクションNo.32−33は、中間領域およびＣ末
端PTH（図示せず）に免疫反応性を示した。これらのフ
ラクションを集めてプールにして（斜線部）、さらに操
作を進めた。なお、ここで特に言及しなかったフラクシ
ョンからは、いかなる免疫反応性も測定されなかった。
ｂ）4a）で得られた免疫反応性プールの分析用RPクロマ
トグラフィー 上記の半調製用陽イオン交換クロマトグラフィーによ
って得られた免疫反応性プールを、分析用RPクロマトグ
ラフィーを用いて、45℃で、さらに精製した（第５
図）。極めて高い免疫反応性を示す免疫反応性プール
（斜線部）を、さらに精製した。なお、ここで特に言及
しなかったフラクションからは、いかなる免疫反応性も
測定されなかった。
トグラフィー 上記の半調製用陽イオン交換クロマトグラフィーによ
って得られた免疫反応性プールを、分析用RPクロマトグ
ラフィーを用いて、45℃で、さらに精製した（第５
図）。極めて高い免疫反応性を示す免疫反応性プール
（斜線部）を、さらに精製した。なお、ここで特に言及
しなかったフラクションからは、いかなる免疫反応性も
測定されなかった。
ｃ）4b）で得られた免疫反応性プールの分析用陽イオン
交換クロマトグラフィー 上記で得られた免疫反応性プールを、分析用陽イオン
交換クロマトグラフィーを用いて、室温で、さらに精製
した（第６図）。第６図に示したように、hPTH−（44−
68）−RIAで免疫反応性が観測された（斜線部）。hPTH
−（53−84）−RIAでの測定結果も同様に示した。ここ
で特に言及しなかったフラクションからは、いかなる免
疫反応性も測定されなかった。また、極めて高い免疫反
応性を示したフラクションを集めてプールにし（斜線
部）、さらに操作を進めた。
交換クロマトグラフィー 上記で得られた免疫反応性プールを、分析用陽イオン
交換クロマトグラフィーを用いて、室温で、さらに精製
した（第６図）。第６図に示したように、hPTH−（44−
68）−RIAで免疫反応性が観測された（斜線部）。hPTH
−（53−84）−RIAでの測定結果も同様に示した。ここ
で特に言及しなかったフラクションからは、いかなる免
疫反応性も測定されなかった。また、極めて高い免疫反
応性を示したフラクションを集めてプールにし（斜線
部）、さらに操作を進めた。
5.4c）で得られた免疫反応性プールの疎水性クロマトグ
ラフィー 4c）で得られた免疫反応性プールを、疎水性クロマト
グラフィーを用いて、室温で、さらに精製し（第７
図）、hPTH−（44−68）−RIAで免疫反応性を測定した
（第７図）。ここで特に言及しなかったフラクションか
らは、いかなる免疫反応性も測定されなかった。また、
極めて高い免疫反応性を示したフラクションを集めてプ
ールにし（斜線部）、最後の精製を行なった。
ラフィー 4c）で得られた免疫反応性プールを、疎水性クロマト
グラフィーを用いて、室温で、さらに精製し（第７
図）、hPTH−（44−68）−RIAで免疫反応性を測定した
（第７図）。ここで特に言及しなかったフラクションか
らは、いかなる免疫反応性も測定されなかった。また、
極めて高い免疫反応性を示したフラクションを集めてプ
ールにし（斜線部）、最後の精製を行なった。
6. ａ）第一分析用RPクロマトグラフィー ５）で得られた免疫反応性プールを、RPカラム・クロ
マトグラフィーを用いて、25℃で分離し、hPTH−（44−
68）−RIAで免疫反応性を測定した（第８図）。斜線部
のフラクションについては、再度、クロマトグラフィー
で分離した。
マトグラフィーを用いて、25℃で分離し、hPTH−（44−
68）−RIAで免疫反応性を測定した（第８図）。斜線部
のフラクションについては、再度、クロマトグラフィー
で分離した。
ｂ）第二分析用RPクロマトグラフィー 6a）で得られた免疫反応性プールを、再びRPカラム・
クロマトグラフに通した（第９図）。温度を45℃にした
以外は、6a）と同様にして行なった。高いピーク部分を
コードNo.51.5とし、配列を調べた。
クロマトグラフに通した（第９図）。温度を45℃にした
以外は、6a）と同様にして行なった。高いピーク部分を
コードNo.51.5とし、配列を調べた。
III.パラトルモン（PTH）の中間領域およびＣ末端で特
異的な放射能免疫分析に対して免疫反応性を示す第二フ
ラクション（コード54.5）の単離 フラクション51.5の単離を行なう過程で、半調製用RP
クロマトグラフィーによって、二つの免疫反応性を示す
プールが得られた（第３工程）。この第３工程のプール
の前の方を、IIの４から６で述べた後ろのプールの場合
と同様にして精製した。4b）では、再び、免疫反応性を
示すピークが二つ現われた。この場合、前のピークが支
配的であったので、これをさらに精製した。4c）から6
c）を行なったのち、得られたフラクションをコードNo.
54.5として、配列を調べた。
異的な放射能免疫分析に対して免疫反応性を示す第二フ
ラクション（コード54.5）の単離 フラクション51.5の単離を行なう過程で、半調製用RP
クロマトグラフィーによって、二つの免疫反応性を示す
プールが得られた（第３工程）。この第３工程のプール
の前の方を、IIの４から６で述べた後ろのプールの場合
と同様にして精製した。4b）では、再び、免疫反応性を
示すピークが二つ現われた。この場合、前のピークが支
配的であったので、これをさらに精製した。4c）から6
c）を行なったのち、得られたフラクションをコードNo.
54.5として、配列を調べた。
IV.血液ロ液より単離し、パラトルモン（PTH）の中間領
域およびＣ末端で特異的な放射能免疫分析に対して免疫
反応性を示すPTHペプチドの配列 血液より採取し、上記IIおよびIIIによって得られた
フラクション51.5と54.5のアミノ酸配列を、気相アミノ
酸配列分析装置470A型（アプライド・バイオシステム社
製［Applied Biosystem］）によって決定した。標準プ
ログラムPTHRUNを用いてエドマン分解（Edman and Beg
g,Eur.J.Biochem.１,80−91,1967）を行なった。遊離し
たアミノ酸の分析は、標準プロトコールABIを使用したA
BI120Aクロマトグラフを用いて、オンラインで行なっ
た。
域およびＣ末端で特異的な放射能免疫分析に対して免疫
反応性を示すPTHペプチドの配列 血液より採取し、上記IIおよびIIIによって得られた
フラクション51.5と54.5のアミノ酸配列を、気相アミノ
酸配列分析装置470A型（アプライド・バイオシステム社
製［Applied Biosystem］）によって決定した。標準プ
ログラムPTHRUNを用いてエドマン分解（Edman and Beg
g,Eur.J.Biochem.１,80−91,1967）を行なった。遊離し
たアミノ酸の分析は、標準プロトコールABIを使用したA
BI120Aクロマトグラフを用いて、オンラインで行なっ
た。
この結果、フラクション51.5の39のアミノ酸配列を決
定することができた。また、条件によっては、さらに５
つのアミノ酸配列を決定できた。決定された配列は、ヒ
トPTHの（38−76）部分に対応している（Kuetmann et a
l.,Biochem.17,5723−5729,1978）。
定することができた。また、条件によっては、さらに５
つのアミノ酸配列を決定できた。決定された配列は、ヒ
トPTHの（38−76）部分に対応している（Kuetmann et a
l.,Biochem.17,5723−5729,1978）。
フラクション54.5では、16のアミノ酸配列を決定する
ことができた。この配列は、ヒトPTHの（38−53）部分
に対応している。
ことができた。この配列は、ヒトPTHの（38−53）部分
に対応している。
すなわち、二つのフラクションをヒトの血液ロ液より
単離することができ、その両者ともに、Ｃ末端だけでな
く中間領域のPTH−RIAでも検出された。このどちらのペ
プチドもアミノ末端からGln−Ala−Pro−Leu−Ala−Pro
−Arg−etc.と始まっている。すなわち、どちらのペプ
チドもhPTH分子の38番目のアミノ酸から始まっている。
一方、得られたペプチドのどちらでも、Ｃ−末端のアミ
ノ酸を明確に決定することはできなかった。フラクショ
ン51.5の場合、配列は、だいたい位置84まで続いてい
る。もう一方のペプチドは、少量しか得られなかったの
で、位置16までしか配列を決定できなかった。このペプ
チドは、Ｃ末端RIAで検出できたので、少なくとも30の
アミノ酸配列を有している。また、異なるＮ末端配列か
ら始まっているＣ末端PTHペプチドを単離することはで
きなかった。これらの結果から、hPTH−（１−84）は37
番目と38番目のアミノ酸の間で開裂し、生物活性なフラ
グメントhPTH−（１−37）を形成すると考えられる。
単離することができ、その両者ともに、Ｃ末端だけでな
く中間領域のPTH−RIAでも検出された。このどちらのペ
プチドもアミノ末端からGln−Ala−Pro−Leu−Ala−Pro
−Arg−etc.と始まっている。すなわち、どちらのペプ
チドもhPTH分子の38番目のアミノ酸から始まっている。
一方、得られたペプチドのどちらでも、Ｃ−末端のアミ
ノ酸を明確に決定することはできなかった。フラクショ
ン51.5の場合、配列は、だいたい位置84まで続いてい
る。もう一方のペプチドは、少量しか得られなかったの
で、位置16までしか配列を決定できなかった。このペプ
チドは、Ｃ末端RIAで検出できたので、少なくとも30の
アミノ酸配列を有している。また、異なるＮ末端配列か
ら始まっているＣ末端PTHペプチドを単離することはで
きなかった。これらの結果から、hPTH−（１−84）は37
番目と38番目のアミノ酸の間で開裂し、生物活性なフラ
グメントhPTH−（１−37）を形成すると考えられる。
実施例２ ヒト・パラトルモン・ペプチドhPTH−（１−37）の合成 1.ケイソウ土で補強したFmoc−Leu−樹脂の合成 無水Fmoc−アミノ酸（５当量）を最小限のN,N−ジメ
チルホルムアミド（DMF）に溶かし、丸底フラスコ中の
ヒドロキシメチルフェノキシアセチルノルロイシン樹脂
に加えた。さらに、４−ジメチルアミノピリジン（１当
量）も最小限のDMFに溶かして、この丸底フラスコ中に
加えた。１時間後、過剰の反応液をロ過によって除き、
樹脂をよく洗浄した。
チルホルムアミド（DMF）に溶かし、丸底フラスコ中の
ヒドロキシメチルフェノキシアセチルノルロイシン樹脂
に加えた。さらに、４−ジメチルアミノピリジン（１当
量）も最小限のDMFに溶かして、この丸底フラスコ中に
加えた。１時間後、過剰の反応液をロ過によって除き、
樹脂をよく洗浄した。
2.ヒト・パラトルモン・ペプチドhPTH−（１−37）の合
成 以下のアミノ酸配列を有するペプチドを合成するため
に、フロー法（Atherton and Sheppard,Solid phase pe
ptide synthesis.IRL Press,Oxford 1989）を用いた。
成 以下のアミノ酸配列を有するペプチドを合成するため
に、フロー法（Atherton and Sheppard,Solid phase pe
ptide synthesis.IRL Press,Oxford 1989）を用いた。
上記したペプチド配列を、Fmoc−ペンタフロロフェニ
ル・エステル（OPfp）を用いた自動ペプチド合成装置
（ミリガン［Milligen］9050）によって合成した。以下
に示したOPfp−アミノ酸（４当量）を用いた。（いずれ
の場合も、Ｌ−アミノ酸誘導体を用いた。） Fmoc−Ala−OPfp Fmoc−Ala Fmoc−Asp（OBut）−OPfp Fmoc−Asp（OBut） Fmoc−Met−OPfp Fmoc−Met Fmoc−Glu（OBut）−OPfp Fmoc−Glu（OBut） Fmoc−His（Trt）−OPfp Fmoc− His（Trt） Fmoc−Leu−OPfp Fmoc−Leu Fmoc−Arg（Mtr）−OPfp Fmoc−Arg（Mtr） Fmoc−Tri−OPfp Fmoc−Tri Fmoc−Lys（BOC）−OPfp Fmoc−Lys（BOC） Fmoc−Ile−OPfp Fmoc−Ile Fmoc−Phe−OPfp Fmoc−Phe Fmoc−Gly−OPfp Fmoc−Gly Fmoc−Asn−OPfp Fmoc−Asn（Trt） Fmoc−Gln−OPfp Fmoc−Gln（Trt） Fmoc−Val−OPfp Fmoc−Val Fmoc−Ser（But）−ODhbt Fmoc−Ser（But） この合成は、TBTP［テトラフロロホウ酸ｏ−（1H−ベ
ンゾトリアゾール−１−イル）−N,N,N′,N′−テトラ
メチルウロニウム］を加え、この添加で生じたヒドロキ
シベンゾニトリル・エステルによって行なうこともでき
る。
ル・エステル（OPfp）を用いた自動ペプチド合成装置
（ミリガン［Milligen］9050）によって合成した。以下
に示したOPfp−アミノ酸（４当量）を用いた。（いずれ
の場合も、Ｌ−アミノ酸誘導体を用いた。） Fmoc−Ala−OPfp Fmoc−Ala Fmoc−Asp（OBut）−OPfp Fmoc−Asp（OBut） Fmoc−Met−OPfp Fmoc−Met Fmoc−Glu（OBut）−OPfp Fmoc−Glu（OBut） Fmoc−His（Trt）−OPfp Fmoc− His（Trt） Fmoc−Leu−OPfp Fmoc−Leu Fmoc−Arg（Mtr）−OPfp Fmoc−Arg（Mtr） Fmoc−Tri−OPfp Fmoc−Tri Fmoc−Lys（BOC）−OPfp Fmoc−Lys（BOC） Fmoc−Ile−OPfp Fmoc−Ile Fmoc−Phe−OPfp Fmoc−Phe Fmoc−Gly−OPfp Fmoc−Gly Fmoc−Asn−OPfp Fmoc−Asn（Trt） Fmoc−Gln−OPfp Fmoc−Gln（Trt） Fmoc−Val−OPfp Fmoc−Val Fmoc−Ser（But）−ODhbt Fmoc−Ser（But） この合成は、TBTP［テトラフロロホウ酸ｏ−（1H−ベ
ンゾトリアゾール−１−イル）−N,N,N′,N′−テトラ
メチルウロニウム］を加え、この添加で生じたヒドロキ
シベンゾニトリル・エステルによって行なうこともでき
る。
酢酸−アニソール−エタンジチオール−フェノールの
94:2:2:2（v/v/v/w）混合溶媒によって、担体樹脂から
ペプチドを溶出させ、エーテルで沈殿させた。HPLCによ
って精製したのち、アミノ酸分析、分析用HPLCおよびア
ミノ酸配列分析によって確認した。
94:2:2:2（v/v/v/w）混合溶媒によって、担体樹脂から
ペプチドを溶出させ、エーテルで沈殿させた。HPLCによ
って精製したのち、アミノ酸分析、分析用HPLCおよびア
ミノ酸配列分析によって確認した。
3.ヒト・パラトルモン・ペプチドhPTH−（１−37）の実
用的合成 をミリゲン／バイオサーチ［MilliGen/Biosearch］社製
自動合成装置9050（9050 PepSynthesizer）（プログラ
ム・バージョン1.3）を用いた連続フロー法によって合
成した。Ｌ体のFmoc−アミノ酸ペンタフロロフェニル・
エステルを、それぞれ0.8mmolづつ用いた。合成に必要
な試薬は、すべてミリゲン／バイオサーチ［MilliGen/B
iosearch］社より入手した。この合成に必要な試薬は、
すなわち、N,N−ジメチルホルムアミド、ピペリジンの2
0％N,N−ジメチルホルムアミド溶液、および１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾールである。Ｌ−アミノ酸誘導体は
４倍過剰に用い、また、末端のアミノ基はFmocで保護し
た。アスパラギン酸とグルタミン酸は、NW−tert−ブチ
ル・エステルの形で；チロシンとセリンは、tert−ブチ
ル・エステルの形で；ヒスチジンとリジンは、NW−tert
−ブトキシカルボニル化合物の形で；また、アルギニン
は、NG−2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−６−スル
ホニル（Pmc）誘導体の形で、それぞれ用いた。合成
は、ケイソウ土樹脂Fmoc−Leu−Pepsyn K A（ミリゲン
／バイオサーチ［MilliGen/Biosearch］社製）を出発物
質として行なった。この樹脂では、担体とＣ末端のアミ
ノ酸（1g当り0.091ミリ当量のロイシン、1.60g）とが結
合する。Fmoc−Arg（Pmc）−OHは、［テトラフロロホウ
酸ｏ−（1H−ベンゾトリアゾール−１−イル）−N,N,
N′,N′−テトラメチルウロニウム］（TBTU）、１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾールおよびジイソプロピルエチ
ルアミンの存在化でアシル化した。以下のような操作を
繰り返した。すなわち、ピペリヂンの20％DMF溶液でFmo
cを除き（７分間）、DMFで洗い（12分間）、アシル化
（30分間;Fmoc−Val−OPfpでは45分間）し、DMFで洗っ
た（８分間）。合成反応の進行具合は、紫外光によって
連続的に監視した。合成は、Ｎ末端のFmoc基を除去して
完了した。樹脂に結合したペプチドを、それぞれ50mlの
イソプロパノール、氷酢酸、イソプロパノールとジエチ
ルエーテルで、３回洗浄し、乾燥した。
用的合成 をミリゲン／バイオサーチ［MilliGen/Biosearch］社製
自動合成装置9050（9050 PepSynthesizer）（プログラ
ム・バージョン1.3）を用いた連続フロー法によって合
成した。Ｌ体のFmoc−アミノ酸ペンタフロロフェニル・
エステルを、それぞれ0.8mmolづつ用いた。合成に必要
な試薬は、すべてミリゲン／バイオサーチ［MilliGen/B
iosearch］社より入手した。この合成に必要な試薬は、
すなわち、N,N−ジメチルホルムアミド、ピペリジンの2
0％N,N−ジメチルホルムアミド溶液、および１−ヒドロ
キシベンゾトリアゾールである。Ｌ−アミノ酸誘導体は
４倍過剰に用い、また、末端のアミノ基はFmocで保護し
た。アスパラギン酸とグルタミン酸は、NW−tert−ブチ
ル・エステルの形で；チロシンとセリンは、tert−ブチ
ル・エステルの形で；ヒスチジンとリジンは、NW−tert
−ブトキシカルボニル化合物の形で；また、アルギニン
は、NG−2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−６−スル
ホニル（Pmc）誘導体の形で、それぞれ用いた。合成
は、ケイソウ土樹脂Fmoc−Leu−Pepsyn K A（ミリゲン
／バイオサーチ［MilliGen/Biosearch］社製）を出発物
質として行なった。この樹脂では、担体とＣ末端のアミ
ノ酸（1g当り0.091ミリ当量のロイシン、1.60g）とが結
合する。Fmoc−Arg（Pmc）−OHは、［テトラフロロホウ
酸ｏ−（1H−ベンゾトリアゾール−１−イル）−N,N,
N′,N′−テトラメチルウロニウム］（TBTU）、１−ヒ
ドロキシベンゾトリアゾールおよびジイソプロピルエチ
ルアミンの存在化でアシル化した。以下のような操作を
繰り返した。すなわち、ピペリヂンの20％DMF溶液でFmo
cを除き（７分間）、DMFで洗い（12分間）、アシル化
（30分間;Fmoc−Val−OPfpでは45分間）し、DMFで洗っ
た（８分間）。合成反応の進行具合は、紫外光によって
連続的に監視した。合成は、Ｎ末端のFmoc基を除去して
完了した。樹脂に結合したペプチドを、それぞれ50mlの
イソプロパノール、氷酢酸、イソプロパノールとジエチ
ルエーテルで、３回洗浄し、乾燥した。
担体樹脂からの溶出は、トリフロロ酢酸／フェノール
／エタンジチオール／チオアニソール1:0.75:0.25:0.5:
0.5（v/w/v/v/v;5ml）混合溶媒で行った。溶液を容器内
で濃縮し、ジエチルエーテルを加えて沈殿させた。得ら
れた粗製ペプチドをジエチルエーテルで数回洗い、乾燥
させた。以上のようにして、240mgのペプチド樹脂から6
5mgの粗製ペプチドを得た。
／エタンジチオール／チオアニソール1:0.75:0.25:0.5:
0.5（v/w/v/v/v;5ml）混合溶媒で行った。溶液を容器内
で濃縮し、ジエチルエーテルを加えて沈殿させた。得ら
れた粗製ペプチドをジエチルエーテルで数回洗い、乾燥
させた。以上のようにして、240mgのペプチド樹脂から6
5mgの粗製ペプチドを得た。
別に合成し、正確なアミノ酸配列を質量スペクトルや
配列分析によって明らかにしてあるhPTH−（１−37）を
用いて、精製を行なった。第１段階として、保護基をは
ずした粗製ペプチドを陽イオン交換HPLCで精製した（パ
ーコシル・ペプケート［Parcosil Pepkat］、2cm×10c
m、330Å、７μ、展開速度:9ml/分、230nm、溶離液:A＝
5mM Na2HPO4;B＝5mM Na2HPO4＋1M NaCl、溶離傾斜:5
％から100％60分）。28.17分のピーク（第14図）は、基
準物質のものと一致した。第２段階の精製として、脱塩
のときと同様のRP−HPLCを行なった（パーコシル・プロ
（Parcosil Pro］、2cm×10cm、300Å、７μ、展開速
度:7ml/分、230nm、溶離液:A＝0.1％トリフロロ酢酸水
溶液、Ｂ＝トリフロロ酢酸の0.1％アセトニトリル／水
4:1溶液、溶離傾斜:0％から100％Ｂで60分）。収量は6.
6mg（1.5mmol;14％）だった。30.80分にピークが表われ
た（第15図）。C18物質を用いた分析用RP−HPLCでは、
鋭い単一のピークが表われた（第16図）。
配列分析によって明らかにしてあるhPTH−（１−37）を
用いて、精製を行なった。第１段階として、保護基をは
ずした粗製ペプチドを陽イオン交換HPLCで精製した（パ
ーコシル・ペプケート［Parcosil Pepkat］、2cm×10c
m、330Å、７μ、展開速度:9ml/分、230nm、溶離液:A＝
5mM Na2HPO4;B＝5mM Na2HPO4＋1M NaCl、溶離傾斜:5
％から100％60分）。28.17分のピーク（第14図）は、基
準物質のものと一致した。第２段階の精製として、脱塩
のときと同様のRP−HPLCを行なった（パーコシル・プロ
（Parcosil Pro］、2cm×10cm、300Å、７μ、展開速
度:7ml/分、230nm、溶離液:A＝0.1％トリフロロ酢酸水
溶液、Ｂ＝トリフロロ酢酸の0.1％アセトニトリル／水
4:1溶液、溶離傾斜:0％から100％Ｂで60分）。収量は6.
6mg（1.5mmol;14％）だった。30.80分にピークが表われ
た（第15図）。C18物質を用いた分析用RP−HPLCでは、
鋭い単一のピークが表われた（第16図）。
合成物が、hPTH−（１−37）の一次構造を有している
ことは、質量スペクトル（プラズマ脱着法、バイオ−イ
オン、アプライド・バイオシステム［Bio−Ion,Applied
Biosystem］）および気相アミノ酸配列分析装置470A型
（アプライド・バイオシステム社製［Applied Biosyste
m］）による相補配列分析で確認した。合成したhPTH−
（１−37）の生物活性は、腎臓動脈と肺動脈とでの筋収
縮の差を測定する機能テストで確認した。このテストの
結果、合成物は確かに生物活性を有していることが分っ
た。
ことは、質量スペクトル（プラズマ脱着法、バイオ−イ
オン、アプライド・バイオシステム［Bio−Ion,Applied
Biosystem］）および気相アミノ酸配列分析装置470A型
（アプライド・バイオシステム社製［Applied Biosyste
m］）による相補配列分析で確認した。合成したhPTH−
（１−37）の生物活性は、腎臓動脈と肺動脈とでの筋収
縮の差を測定する機能テストで確認した。このテストの
結果、合成物は確かに生物活性を有していることが分っ
た。
実施例３ 体内を循環している生物活性ヒトPTHがhPTH−（１−3
7）であることの証明 実施例１に記載したように、血液ロ液をクロマトグラ
フィーによって処理し、実施例２で合成したhPTH−（１
−37）を参照物質として利用した（第10図）。こうし
て、hPTHの放射能免疫分析に対してアミノ領域で特異的
な免疫反応性を示す、血液ロ液から得たフラクションを
決定することができた。このフラクションを実施例１と
同様にして精製し、hPTH−（１−37）であることを確認
した。パーコシルRPカラム・クロマトグラフを用いるこ
とで、hPTH−（１−37）を、他のhPTHフラグメント（第
10図）、すなわちhPTH−（１−33）、hPTH−（１−34）
およびhPTH−（１−38）から明確に分離することができ
ることで証明できた。
7）であることの証明 実施例１に記載したように、血液ロ液をクロマトグラ
フィーによって処理し、実施例２で合成したhPTH−（１
−37）を参照物質として利用した（第10図）。こうし
て、hPTHの放射能免疫分析に対してアミノ領域で特異的
な免疫反応性を示す、血液ロ液から得たフラクションを
決定することができた。このフラクションを実施例１と
同様にして精製し、hPTH−（１−37）であることを確認
した。パーコシルRPカラム・クロマトグラフを用いるこ
とで、hPTH−（１−37）を、他のhPTHフラグメント（第
10図）、すなわちhPTH−（１−33）、hPTH−（１−34）
およびhPTH−（１−38）から明確に分離することができ
ることで証明できた。
実施例４ hPTH−（１−37）の生物活性を証明するためのフラクシ
ョン分析 ラットにヒト・パラトルモンのペプチドhPTH−（１−
33）、hPTH−（１−37）およびhPTH−（１−38）を投与
して、その後のファエオクロモシトマ（phaeochromocyt
oma）細胞（PC−12）内での環状３′,5′−アデノシン
１リン酸（cAMP）レベルの変化を調べた。
ョン分析 ラットにヒト・パラトルモンのペプチドhPTH−（１−
33）、hPTH−（１−37）およびhPTH−（１−38）を投与
して、その後のファエオクロモシトマ（phaeochromocyt
oma）細胞（PC−12）内での環状３′,5′−アデノシン
１リン酸（cAMP）レベルの変化を調べた。
予備実験では、PTHを加えるとラットのファエオクロ
モシトマ細胞内のcAMPレベルは増加した。このことに基
づいて、合成したhPTH−（１−37）の活性と他のＮ末端
PTHフラグメント［hPTH−（１−33）とhPTH−（１−3
8）］の活性とを、この細胞系で比較した。
モシトマ細胞内のcAMPレベルは増加した。このことに基
づいて、合成したhPTH−（１−37）の活性と他のＮ末端
PTHフラグメント［hPTH−（１−33）とhPTH−（１−3
8）］の活性とを、この細胞系で比較した。
実験には、PC−12細胞を用いた。細胞は、10mlのＬ−
グルタミン酸200M（ギブコ［Gibco］社製）、10％のウ
マ血清、５％FCSおよび１％のペニシリン／ストレプト
マイシンによってRPMI培地（ギブコ［Gibco］社製）で
培養した。ホスホジエステラーゼ阻害剤として、シグマ
［Sigma］社製４−イソブチル−１−メチルキサンチン
（IBMX）を用いた。培養容器は、ポリ−Ｌ−ロイシンで
表面処理をした24個のへこみ（直径16mm）が設けられて
いるものを用いた。表面処理は、殺菌ロ過したポリ−Ｌ
−ロイシン溶液（100mg/l）を37℃で１時間かけて塗布
することで行なった。
グルタミン酸200M（ギブコ［Gibco］社製）、10％のウ
マ血清、５％FCSおよび１％のペニシリン／ストレプト
マイシンによってRPMI培地（ギブコ［Gibco］社製）で
培養した。ホスホジエステラーゼ阻害剤として、シグマ
［Sigma］社製４−イソブチル−１−メチルキサンチン
（IBMX）を用いた。培養容器は、ポリ−Ｌ−ロイシンで
表面処理をした24個のへこみ（直径16mm）が設けられて
いるものを用いた。表面処理は、殺菌ロ過したポリ−Ｌ
−ロイシン溶液（100mg/l）を37℃で１時間かけて塗布
することで行なった。
以下のhPTHペプチドについて実験をした。
hPTH−（１−33）（分子量:3972.2;ペプチド含量:76.9
％） hPTH−（１−37）（分子量:4401.0;ペプチド含量:74.5
％） hPTH−（１−38）（分子量:4458.0;ペプチド含量:81.8
％） 濃い細胞シートを形成した細胞（約４−８日後）を実
験に使用した。実験培養は室温で1mlの細胞培地で行な
った。実験の直前にPTHペプチドを細胞培地で希釈して
から、1.5×105の細胞を、10-4MのIBMXの存在下で10-7M
のhPTH−（１−33）、hPTH−（１−37）およびhPTH−
（１−38）とともに、０、2.5、５、10および20分間培
養した。比較のため、IBMXだけで20分間培養する実験も
行なった。数値は、３回行なった結果から得た平均値±
標準偏差である（第11図参照）。
％） hPTH−（１−37）（分子量:4401.0;ペプチド含量:74.5
％） hPTH−（１−38）（分子量:4458.0;ペプチド含量:81.8
％） 濃い細胞シートを形成した細胞（約４−８日後）を実
験に使用した。実験培養は室温で1mlの細胞培地で行な
った。実験の直前にPTHペプチドを細胞培地で希釈して
から、1.5×105の細胞を、10-4MのIBMXの存在下で10-7M
のhPTH−（１−33）、hPTH−（１−37）およびhPTH−
（１−38）とともに、０、2.5、５、10および20分間培
養した。比較のため、IBMXだけで20分間培養する実験も
行なった。数値は、３回行なった結果から得た平均値±
標準偏差である（第11図参照）。
もう一つ別の実験として、2.2×105のPC−12細胞を10
-4MのIBMXの存在下で、それぞれ、10-11（２回行なっ
た）、10-10、10-9、10-8および10-7MのhPTH−（１−3
3）、hPTH−（１−37）およびhPTH−（１−38）ととも
に５分間培養した試料を、各々３試料づつ調製し、細胞
内のcAMP濃度を測定した。PTHを含まないIBMXだけの参
照試料の値は、18,0、26.1、20.9であった。示した数値
は、平均値±標準偏差である（第12図参照）。
-4MのIBMXの存在下で、それぞれ、10-11（２回行なっ
た）、10-10、10-9、10-8および10-7MのhPTH−（１−3
3）、hPTH−（１−37）およびhPTH−（１−38）ととも
に５分間培養した試料を、各々３試料づつ調製し、細胞
内のcAMP濃度を測定した。PTHを含まないIBMXだけの参
照試料の値は、18,0、26.1、20.9であった。示した数値
は、平均値±標準偏差である（第12図参照）。
PTHとIBMXとは、同時に添加した。培地を吸引除去し
たのち、1mlの99％エタノールを加えて反応を終らせ
た。細胞を削り取り、エタノールでプラスチック製チュ
ーブ（グライナー［Greiner］社製）に移した。培養容
器を66％エタノールで洗い、上記のチューブ内のエタノ
ール溶液と合わせて、遠心分離した。得られた上澄み
を、窒素ガスをパージした状態で、水浴上で蒸発させた
（50℃）。cAMPの濃度は、放射能免疫分析キット（NEN
社製）を用いて測定した。この測定は製造者の指示通り
に行なった。測定に使用したcAMP標準物質、cAMP抗血清
錯体、cAMP125I−トレサー、cAMP担体血清およびcAMP沈
殿剤の使用量は、製造者が指示した量の50％であった。
たのち、1mlの99％エタノールを加えて反応を終らせ
た。細胞を削り取り、エタノールでプラスチック製チュ
ーブ（グライナー［Greiner］社製）に移した。培養容
器を66％エタノールで洗い、上記のチューブ内のエタノ
ール溶液と合わせて、遠心分離した。得られた上澄み
を、窒素ガスをパージした状態で、水浴上で蒸発させた
（50℃）。cAMPの濃度は、放射能免疫分析キット（NEN
社製）を用いて測定した。この測定は製造者の指示通り
に行なった。測定に使用したcAMP標準物質、cAMP抗血清
錯体、cAMP125I−トレサー、cAMP担体血清およびcAMP沈
殿剤の使用量は、製造者が指示した量の50％であった。
結果から、実験を行なった細胞内系で、hPTH−（１−
37）の活性は、他の非内因的なPTHペプチドの活性と大
きく異なっていることが分った。このことから、上記に
示したような、これらのペプチドの製造の違いが、PTH
受容体−アデニレートシクラーゼ系の活性化に影響を及
ぼすだけでなく、抗原性にも影響すると考えられる。
37）の活性は、他の非内因的なPTHペプチドの活性と大
きく異なっていることが分った。このことから、上記に
示したような、これらのペプチドの製造の違いが、PTH
受容体−アデニレートシクラーゼ系の活性化に影響を及
ぼすだけでなく、抗原性にも影響すると考えられる。
実施例５ 円二色性によるパラトルモン・フラグメントhPTH−（１
−33）、hPTH−（１−37）およびhPTH−（１−38）の二
次構造に関する研究 ジャスコDP−500データ・プロセッサーと組合せたジ
ャスコＪ−500自記偏光分光計を用いて、円二色性を測
定した。二次構造を決定するために、測定は、光路長1m
mの厳選された石英製セルを使用して、室温で190nmから
240nmの範囲で行なった。パラトルモンの濃度は、hPTH
−（１−33）は50μg/ml、hPTH−（１−37）が50μg/m
l、そしてhPTH−（１−38）も50μg/mlであった。溶媒
は、10mMのトリスHCl緩衝液pH7.5を用いた。（他の測定
条件：感度２ミリ度/cm、時定数２秒、記録計速度4nm/
分、波長記録エクスパンション5nm/cm）。第13図に示し
た曲線は、hPTH−（１−33）、hPTH−（１−37）および
hPTH−（１−38）の各々についての４回の測定結果から
ベースラインを差し引いて得られた信号の平均である。
−33）、hPTH−（１−37）およびhPTH−（１−38）の二
次構造に関する研究 ジャスコDP−500データ・プロセッサーと組合せたジ
ャスコＪ−500自記偏光分光計を用いて、円二色性を測
定した。二次構造を決定するために、測定は、光路長1m
mの厳選された石英製セルを使用して、室温で190nmから
240nmの範囲で行なった。パラトルモンの濃度は、hPTH
−（１−33）は50μg/ml、hPTH−（１−37）が50μg/m
l、そしてhPTH−（１−38）も50μg/mlであった。溶媒
は、10mMのトリスHCl緩衝液pH7.5を用いた。（他の測定
条件：感度２ミリ度/cm、時定数２秒、記録計速度4nm/
分、波長記録エクスパンション5nm/cm）。第13図に示し
た曲線は、hPTH−（１−33）、hPTH−（１−37）および
hPTH−（１−38）の各々についての４回の測定結果から
ベースラインを差し引いて得られた信号の平均である。
二次構造の決定は、リードとキンゼルによって述べら
れている方法（Reed and Kinzel,Biochemistry 23,1357
−1362,1984）によって行った。得られたデータからの
計算で、hPTH−（１−38）の二次構造は、α−ヘリック
スの比率が約27％であることが分った。これに対して、
アミノ酸一つ分だけ短いhPTH−（１−37）フラグメント
では、はるかに多く、約40−45％であった。また、hPTH
−（１−33）のα−ヘリックスは、hPTH−（１−38）と
同様に少なかった。
れている方法（Reed and Kinzel,Biochemistry 23,1357
−1362,1984）によって行った。得られたデータからの
計算で、hPTH−（１−38）の二次構造は、α−ヘリック
スの比率が約27％であることが分った。これに対して、
アミノ酸一つ分だけ短いhPTH−（１−37）フラグメント
では、はるかに多く、約40−45％であった。また、hPTH
−（１−33）のα−ヘリックスは、hPTH−（１−38）と
同様に少なかった。
二次構造が大きく異っているのために、PTHフラグメ
ントhPTH−（１−37）のペプチド−受容体相互作用や免
疫エピトープの性質は、他のフラグメントの場合と明ら
かに違うことが、この研究から分った。
ントhPTH−（１−37）のペプチド−受容体相互作用や免
疫エピトープの性質は、他のフラグメントの場合と明ら
かに違うことが、この研究から分った。
実施例６ 肺血管と海綿体（男性生殖器）の無線条筋に対するhPTH
−（１−37）の生物活性に関する研究 肺血管と海綿体の無線条筋をヒトとウサギから外科的
に採取し、筋力の向上を測定するために、適当な器官浴
システムに固定した。これらの筋肉に、種々の収縮活性
物質を作用させて予め収縮させておき、その後、10-9モ
ルのhPTH−（１−37）を作用させると、ヒトの器官の他
の平滑筋に比べて顕著な弛緩が起こった。このことは、
hPTH−（１−37）は、肺血管を弛緩させたり、雄性器官
の血液循環を活性化させるのに、特に適したペプチドで
あることを示している。
−（１−37）の生物活性に関する研究 肺血管と海綿体の無線条筋をヒトとウサギから外科的
に採取し、筋力の向上を測定するために、適当な器官浴
システムに固定した。これらの筋肉に、種々の収縮活性
物質を作用させて予め収縮させておき、その後、10-9モ
ルのhPTH−（１−37）を作用させると、ヒトの器官の他
の平滑筋に比べて顕著な弛緩が起こった。このことは、
hPTH−（１−37）は、肺血管を弛緩させたり、雄性器官
の血液循環を活性化させるのに、特に適したペプチドで
あることを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 1/14 Ａ６１Ｋ 37/24 (72)発明者 シュルツ―クナーパ、ペーター ドイツ連邦共和国、ノーイスタット ア ー．デー．ヴェー．デー―6730、アム クリーガーガーテン ２ (72)発明者 アダーマン、クヌート ドイツ連邦共和国、ハノーファー 61、 デー―3000、ローベルトシュトラーセ ４ (72)発明者 ガーゲルマン、ミハエル ドイツ連邦共和国、シュリールシャイ ム、デー―6905、ヴォルムザー―シュト ラーセ ９ (56)参考文献 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ ｌ．Ｍｅｔａｂ．，Ｖｏｌ．67，Ｎｏ. ５（1988）ｐ．964−972 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/635 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列で表わされるhPTHフラ
グメント−（１−37）または、そのアミド化、アセチル
化、ホスホリル化、もしくはグリコシル化されたhPTHフ
ラグメント−（１−37）誘導体。 - 【請求項２】hPTHフラグメント−（１−37）が、下記の
方法のいずれかで得たものである請求項１に記載のhPTH
フラグメント−（１−37）またはそのhPTHフラグメント
−（１−37）誘導体： （１）原核もしくは真核生物の発現により調製し、次い
でクロマトグラフィーにより精製する方法； （２）ヒトの血液からクロマトグラフィーによって単離
する方法。 - 【請求項３】hPTHフラグメント−（１−37）が、該フラ
グメントを構成するアミノ酸を保護基によって保護して
なる複数の保護基含有アミノ酸を用いて、固相もしくは
液相で合成したのち、保護基を除去し、次いでクロマト
グラフィーにより精製して得たものである請求項１に記
載のhPTHフラグメント−（１−37）またはそのhPTHフラ
グメント−（１−37）誘導体。 - 【請求項４】請求項１に記載のhPTHフラグメント−（１
−37）またはそのhPTHフラグメント−（１−37）誘導体
を含有する肺血管弛緩用もしくは雄性器官の血液循環活
性化用薬剤。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3935738.4 | 1989-10-27 | ||
| DE3935738A DE3935738A1 (de) | 1989-10-27 | 1989-10-27 | Arzneimittel, enthaltend das humane parathormon-fragment (1-37) als aktiven wirkstoff |
| PCT/EP1990/001807 WO1991006564A1 (de) | 1989-10-27 | 1990-10-25 | hPTH-FRAGMENT-(1-37), SEINE HERSTELLUNG, DIESES ENTHALTENDE ARZNEIMITTEL UND SEINE VERWENDUNG |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05505594A JPH05505594A (ja) | 1993-08-19 |
| JP3135122B2 true JP3135122B2 (ja) | 2001-02-13 |
Family
ID=6392300
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03500084A Expired - Fee Related JP3135122B2 (ja) | 1989-10-27 | 1990-10-25 | ｈＰＴＨフラグメント（１―３７）とその誘導体 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0497915B1 (ja) |
| JP (1) | JP3135122B2 (ja) |
| AT (1) | ATE121424T1 (ja) |
| AU (1) | AU643725B2 (ja) |
| CA (1) | CA2071538C (ja) |
| DE (2) | DE3935738A1 (ja) |
| DK (1) | DK0497915T3 (ja) |
| ES (1) | ES2071837T3 (ja) |
| GR (1) | GR3015909T3 (ja) |
| WO (1) | WO1991006564A1 (ja) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4039656A1 (de) * | 1990-12-12 | 1992-06-17 | Bissendorf Peptide Gmbh | Arzneimittel, enthaltend das humane parathormon-fragment (1-37) in der form des amids oder ethylamids als aktiven wirkstoff |
| HUT68010A (en) * | 1991-12-17 | 1995-05-29 | Procter & Gamble Pharma | The use of bisphonates and parathyroid hormone for the treatment of osteoporosis |
| DE4203040A1 (de) * | 1992-02-04 | 1993-08-05 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neue parathormonfragmente, deren herstellung und diese enthaltende arzneimittel |
| US5496801A (en) * | 1993-12-23 | 1996-03-05 | Allelix Biopharmaceuticals Inc. | Parathyroid hormone formulation |
| DE4434551A1 (de) * | 1994-09-28 | 1996-04-04 | Forssmann Wolf Georg Prof Dr D | Peptide aus der Sequenz des hPTH (1-37) |
| DE19517430A1 (de) * | 1995-05-12 | 1996-11-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Pharmazeutische Darreichungsform von Parathormon mit einer zwei- bis sechsstündigen Wirkstoff-Freisetzungsperiode |
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