HUT65755A

HUT65755A - Process for production of preparations containing plasminogen-activators for treatment of inflammation and wound

Info

Publication number: HUT65755A
Application number: HU9301272A
Authority: HU
Inventors: Eckhard Schueler; Juergen Roemisch; Gerhard Dickneite; Eric-Paul Paques
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1992-04-30
Filing date: 1993-04-30
Publication date: 1994-07-28
Also published as: HU9301272D0; NO931561L; ZA933023B; IL105521A0; PL298748A1; DE4214215A1; KR930021179A; AU3822993A; NO931561D0; EP0567816A1; CA2095207A1; CZ76893A3; SK41593A3; CN1080873A; UY23572A1; JPH069425A; MX9302519A

Description

PLAZMINOGÉNAKTIVÁTOR-INHIBITOROK^FEtHASZNÁLÁSA GYULLADÁSOK ÉS

SEBEK KEZELÉSÉRE ALkALMAQ. ^LOaJlL/TASA^A

BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg, NSZK

A bejelentés napja: 1993. 04. 30.

Elsőbbsége: 1992. 04. 30. (P 42 14 215.6) NSZK

Feltalálók:

dr. Eckhard SCHÜLER,

Marburg, dr. Jürgen RÖMISCH, dr. Eric-Paul PAQUES,

Marburg,

Marburg/dr. Gerhard DICKNEITE,

MarburgNémet Szövetségi Köztársaság

77068-1023 BÉ/Pk ··«· • *! · · · ·· a ···· ·« ·· .:. .:. ·..· ·..·

- 2 A találmány tárgya plazminogénaktivátor-inhibitorok felhasználása gyulladások és sebek kezelésére. Találmányunk vonatkozik egy eljárásra is hatóanyagként plazminogénaktivátor-inhibitorokat tartalmazó, gyulladások és sebek kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására is.

Különféle betegségek szenved zavart a plazminaktivitás szabályozása. A plazmin plazminogénből képződik plazminogénaktivátorok (PA), például uPa (húgyúti PA) vagy szöveti plazminogénaktivátor (tPA) segítségével. A plazminogénaktivátorokat a plazminogénaktivátor-inhibitorok (PAI) gátolják. A fiziológiailag releváns PAI-k közül jelenleg két fő típust különböztetünk meg: az 1-es típusú plazminogénaktivátor-inhibitort (PAI-1) és a 2-es típusú plazminogénaktivátor-inhibitort (PAI-2). Mindkét PAI szerpin típusú inhibitor.

A szem, a fül vagy a bőr gyulladásánál, például a cornea károsodásakor általában megnövekszik a plazmin aktivitás a könnyfolyadékban. Ez a plazmin felelős az extracelluláris mátrixban lévő fibronektin lebontásáért, az angiogenezis elősegítéséért és a prokollagenáz aktív kollagenázzá történő aktiválódásáért, amelynek következménye a kollagénmolekulák lebomlása (lásd Barlati és munkatársai, Exp. Eye Rés. 51, 1-9 (1990)). Az olyan különféle patologikus állapotok kezelésére, amely állapotok kialakulásában a megnövekedett plazminaktivitás szerepet játszik, már korábban is alkalmaztak kis molekulájú anyagokat, például a 2-amino-kapronsavat vagy a tranexánsavat (transz-4-amino-etil-ciklohexán-karbonsav). Például a tranexánsav alkalmasnak bizonyult Osteoarthritis kezelésére. A tranexánsav segítségével ugyancsak csökkenthető volt a túl ····

- 3 nagy fibrinolitikus aktivitás Colitis ulcerosa és hasonló betegségek esetében. Az említett kis molekulájú plazmin inhibitorok azonban toxikus mellékhatásaik miatt károsak.

Az aprótinin ugyancsak plazmin-inhibitor. Ez az anyag feltételesen bizonyult alkalmasnak Corneal ulcer kezelésére.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy gyulladások, különösen a szem, a fül és/vagy a bőr gyulladásai, valamint például Osteoarthritis vagy Colitis ulcerosa előnyösen kezelhető plazminogénaktivátor-inhibitorokkal.

Találmányunk tárgya tehát plazminogénaktivátor-inhibitorok felhasználása szem-, fül- vagy bőrgyulladás, Osteoarthritis és/vagy Colitis ulcerosa kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyszerkészítmények előállítására.

Találmányunk vonatkozik egy eljárásra hatóanyagként plazminogénaktivátor-inhibitorokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, amelynek során az ismert módon előállított plazminogénaktivátor-inhibitorokat szokásos gyógyszerészeti vivő- és/vagy segédanyagokkal összekeverünk és a keveréket szem-, orr- vagy bőrgyulladás, Osteoarthritis és/vagy Colitis ulcerosa kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyszerkészítménnyé kiszereljük.

Az ismert módon kifejezésen az elsőbbség napjáig megismerhető eljárásokat értjük.

Elsősorban az urokinázt (uPA) és/vagy a tPA-t, mindenekelőtt az uPA-t és/vagy a tPA-t gátoljuk. Az alkalmas inhibitorok elsősorban a PAI-1 és/vagy PAI-2, valamint mutánsaik vagy variánsaik, mindenekelőtt a PAI-2, különösen PAI-2 fragmensek, például deléciók az N-terminális végen, mindenekelőtt az érett

- 4 PAI-2 N-terminális 1-82, illetve 1-84 aminosavak deléciói. Az inhibitorokat alkalmazhatjuk önmagukban vagy egyéb gyógyszerhatóanyagokkal, például antibiotikumokkal kombinálva, az alkalmazásuk lehet helyi vagy szisztemikus. Osteoarthritis esetén a hatóanyagokat előnyösen intraartikulárisan vagy intraoperatív (nyitott úton vagy artroszkópiásan) alkalmazzuk. A hatékony dózis általában helyi alkalmazás esetén 1-300000 urokináz-gátló egység, előnyösen 500-50000 urokináz-gátló egység, intravénás vagy oldószerrel közvetített intramuszkuláris adagolás esetén 50-750000 urokináz-gátló egység 1 kg testtömegre.

Az inhibitorok mindenekelőtt a PAI-2 fiziológiásán alkalmazható stabilizátorok, például albumin, poligenin, zselatinhidrolizátum, glicin, cisztein, glükóz, laktóz, maltóz és/vagy szacharóz hozzáadásával stabilizálhatok.

Az inhibitorok felhasználási területe általában gyulladásos szembetegségek helyi terápiája és/vagy megelőzése. A kezelendő betegségek közül példaként a következőket említjük: Corneal ulcer, Uveitis, Konjunktivitis, intra- vagy posztoperatív kezelésnél, a szemstruktúra védelme mindenekelőtt gyulladásos fülmegbetegedések lefolyásakor, ilyen megbetegedések például a középfülgyulladás, a dobhártyagyulladás és a gyulladásos lefolyású dobhártyaszakadás. Megemlítjük továbbá a gyulladásos jelenségekkel, például vörösödéssel járó bőrbetegségeket is, különösen gyulladásos sejtek, például makrofágok, monociták vagy granulociták általi szövetbeszűrődés esetén, megemlítjük továbbá az akantolízist, hólyagképződést, például a következő betegségeknél: Pemphigus, ekcéma, Kontaktdermati5 tis és atópiás dermatitis, gyulladásos lefolyású égések, érgyulladás. Alkalmazhatók az inhibitorok továbbá a sebgyógyulás elősegítésére nyílt sebek és bőrfekélyek kezelésére. További alkalmazási területek a felhámsérülések, Osteoarthritis, Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, IBD (Inflammatory bowel disease), Pankreatitis, Akne, felhámsérülések kezelése, szaruhártyasérülések kezelése, szemsérüléseknél a hegképződés elősegítése, Skleritis, nem gyógyuló Cornea-eróziók, xerózis, hiperkeratózis.

Az inhibitorok alkalmasak továbbá önmagukban vagy további hatóanyagokkal kombinálva öblítőfolyadékként intra- és posztoperatív kezeléseknél és/vagy nyílt sebek vagy az említett gyulladások kezelésénél. Egy további előnyös felhasználási mód a kontaktlencsék kezelése viselés előtt egy az említett inhibitorokat önmagukban vagy további hatóanyagokkal kombinálva tartalmazó oldattal. Ilyen további hatóanyag lehet például a neovaszkularizációt gátló hatóanyag, szemsérülés és szemgyulladás gyógyítására szolgáló hatóanyag és/vagy a szem szaruhártya infiltrátum és szaruhártya gyulladás kezelésére szolgáló hatóanyag.

A következőkben megemlítünk néhány előnyös alkalmazási területet, ahol a plazminogénaktivátor-inhibitorok, például a PAI-2 alkalmazható.

1. A szem szaruhártya sérülés kezelése lézeres szaruhártyakimetszés vagy szaruhártyametszés után. Az ilyen lézeres szaruhártya kimetszési eljárást rövid- és távollátóknál a törésmutató javítására alkalmazzák például, vagy asztigmia javítására, szaruhártya hibák javítására, hegek eltávolítá- ·ο· sára, szaruhártya átültetéshez, a szaruhártya nedvesítésére kiszáradási jelenségek esetén, továbbá a szaruhártya friss sérüléseikor, szemfertőzésekkor, például vírusfertőzésnél (például herpesz), baktériumos, gombás vagy paraziták által okozott fertőzéskor, a felhámrétegen belüli mészlerakódásnál (öregedési jelenség), valamint a kötőhártya és a szaruhártya összenövésekor (pterigiumok).

2. A következő állapotoknál: szemgyulladások és szemhomályosodások, például lézeres kezelés vagy normál szemsebészeti beavatkozás (például vitrektómia, szürkehályog-műtét, extrakapszuláris szürkehályog extrakció, lencseműtétek, lencsecsere, lencseimplantáció, keratoplasztika (szaruhártyaátültetés) után, továbbá a következő állapotoknál: Konjunktivitis, Keratokonjunktivitis, Keratokonjunktivitis sicca, Iritis, Iridocyclitis, Keratitis, Graves ophthalmopathie, Mooren's ulcer, Vaskulitis, Uveitis, szemben fellépő allergiás jelenségek, fertőzések, anyagcserezavarok, gyulladásos megbetegedések és autoimmunbetegségek (például szisztemikus Lupos erythematodes, Wegen-szindróma, reumás Arthritis, szarkoidózis, Polyarthritis, Pemphigus, Pemphigoid, Erythema multiforme, Sjögren-féle szindróma, gyulladásos bélbetegségek (Inflammatory Bowel Disease), szklerózis multiplex, izomgyengeség, szaruhártyagyulladás, Skleritis.

3. Hegképződés megakadályozására történő alkalmazás sebészeti beavatkozás illetve sérülés után.

4. Sebgyógyulás meggyorsítására és az optimális regeneráció elérésére (például sima határfelület kialakulására az öreg sztróma és az újonnan képződött felhám között), sérülés vagy ·«*«

sebészeti beavatkozás után az epitélium és a sztróma anyagcsere funkciói normalizálására és stabilizálására.

5. Neovaszkularizáció megakadályozására retinabetegség esetén, különösen cukorbetegeknél; retinaoldódás, a retina érsérülése, a retina és az uvea gyulladása és szaruhártyaátültetés esetén.

6. A szemben végzett transzplantációknál, különösen szaruhártyaátültetésnél. A PAI-2 ebben az esetben a plazminogén kötődés csökkentése révén csökkenti a szenzibilizálódást, megakadályozza a neovaszkularizációt, anélkül, hogy a seb gyógyulását ugyanakkor negatív irányban befolyásolná. Ez csökkenti a kilökődés veszélyét.

7. A szem területén található ödémáknál, például makulaödéma, szubmakula-ödéma, fotokoaguláció utáni ödéma, cornea ödéma, konjunktiva-ödéma, retina-ödéma és a szem környezetében lévő ödéma.

8. A szem területén lévő infiltrációk, például a szaruhártya, a szemcsarnok, a kötőhártya vagy ínhártya területén.

9. Cornea ulcer gyógyítására.

A ΡΑΙ-2-t előállíthatjuk például a következőképpen:

A 0 238 275. számú európai szabadalmi leírás szerint a PAI-2cDNS-t szakember számára ismert módon izoláljuk, klónozzuk, vektorokra ligáljuk és megfelelő gazdasejtekbe transzformáljuk illetve transzfektáljuk. A sejteket ismert eljárással fermentáljuk és feltárjuk. Az rPAI-2 tisztítására például az E. coli lizátumból különféle kromatográfiás eljárások kombinációja a legalkalmasabb (például ioncserélő kromatográfiás eljárás, Q8 szefarózón, hidrofób kromatográfiás eljárás fenil-szefarózon, gélszűrés, szefakril vagy fraktogel anyagon). Az rPAI-2 tisztítását élesztő lizátumból végezhetjük például úgy, hogy elvégzünk egy alaptisztítást (sejtelválasztás, sejtfeltárás golyósmalommal, cross-flow szűrés, cross-flow koncentrálás), majd egy végső tisztítást (kromatográfiás eljárással, például a 91/02057. számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírtak szerint, vagy ioncserélő kromatográfiás és immunaffinitás kromatográfiás eljárás segítségével). A fajlagos aktivitás általában 150000 U/mg vagy ennél nagyobb humán urokináz gátlásra vonatkoztatva.

A PAI-1 előállítása analóg módon történhet, például a 90/13648. számú nemzetközi szabadalmi leírásban ismertetett eljárással.

A plazminogénaktivátor-inhibitorok előnye elsősorban az, hogy az említett gyulladások nem toxikus és mellékhatás nélküli módon kezelhetők és ugyanakkor gátoljuk a neovaszkularizációt is. Mivel a plazminogénaktivátorok gátlása lehetővé teszi, hogy sokkal alacsonyabb koncentrációkban alkalmazzuk ezeket az anyagokat, mint a plazmin-inhibitorokat, különösen előnyös, ha egyidejűleg vagy kombinációban egyéb hatóanyagokat, például antibiotikumokat is alkalmazunk. A plazminogénaktivátor-inhibitorokból az alkalmazandó mennyiség lényegesen kisebb, mint a plazmin-inhibitorok esetén, ezért az allergiás reakciók fellépésének veszélye általában kisebb. A plazmininhibitorokhoz képest a hatás időtartama is előnyösen megnövekszik.

1. példa

PAI-2 alkalmazása Cornea ulcer gyógyítására

A Cornea ulcer kezelésének vizsgálatára Csejkova és munkatársai által ismertetett (Histochemistry 45: 71-75, 1975) nyúlmodellt alkalmazzuk. A ΡΑΙ-2-t különböző koncentrációkban (5-100 μg/ml) alkalmazzuk lokálisan a szembe (25 μg/ml naponta háromszor; 100 μg/ml-t naponta kétszer). Az összehasonlító egyedek azonos térfogatú (1 ml oldószert) fiziológiás sóoldat (pH=7,2) kapnak naponta kétszer. Összehasonlító hatóanyagként aprotinint alkalmaztunk (az első két hétben 5000 IU/ml-t naponta kétszer; a következő két hétben a dózist 2500 IU/ml-re csökkentettük).

Egy 11 ml belső átmérőjű műanyag tubus segítségével végzett 0,75 mólos nátrium-hidroxidos kezelés után a gyulladásos sejtek jelentős beáramlása figyelhető meg: ezek proteolitikus aktivitást váltanak ki és egyidejűleg arra indukálják a keratinocitákat, hogy a cornea felhámon egy más proteoglikán spektrumot szintetizáljanak. Ennek az a következménye, hogy a cornea szerkezetében zavarok keletkeznek, és ez az átlátszóság elvesztését okozza.

A következő paramétereket mértük: cornea-perforáció, Ulcusképződés, neovaszkularizálódás, plazmin-aktivitás a könnyfolyadékban, gyulladásos jellemzők, például gyulladásos sejtek beáramlása, a szem átlátszósága, az iris láthatósága (lásd 1. táblázat). A placebo csoporttal végzett összehasonlításból a következő előnyök adódtak a PAI-2 csoportoknál: A plazmin aktivitás minimálisra csökkenthető. Ahhoz, hogy aprotininnel

ugyanezt a plazminaktivitás-csökkenési mértéket elérjük, azt gyakrabban és többször kell alkalmazni. A ΡΑΙ-2-vel a perforáció és az ulcus-képződés teljesen megszűnik. Ezek a hatások aprotininnel is elérhetők. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy ΡΑΙ-2-vel a kísérleti inger következményeképpen beáramló gyulladássejtek száma drasztikusan és tartósan csökken, mégpedig az egészséges szövetnél meglévő normális mértékig.

Ezen kívül a következő pozitív hatásokat értük el meglepő módon: a neovaszkularizáció gátlását, amely a teljes gyógyuláshoz elkerülhetetlenül szükséges, elértük a ΡΑΙ-2-vel, oly módon, hogy a szem átlátszósága visszaállítható, és az Írisz ismét látható lett. Az aprótinines kezeléssel ugyan a cornea fekélyesedése és perforációja elkerülhető, az átlátszóság azonban elvész. A már viszonylag alacsony PAI adagolással elért pozitív hatásokat nagyobb aprotinin dózissal sem sikerült elérni.

A plazminogénaktivátorok ΡΑΙ-2-vel történő gátlása a plazmin például aprotininnel történő gátlásához képest még a további következő előnyökkel rendelkezik: a kezelés sikere érdekében elegendő, ha kizárólag plazminogénaktivátor-inhibitorokkal végezzük a kezelést, és ez előny a szokásos terápiákkal szemben. Az alkalmazott hatóanyag rendkívül nagy potenciája lehetővé teszi, hogy nagyon alacsony inhibitor koncentrációkat alkalmazzunk, és így még egy kombinációs terápia, például antibiotikumokkal, például klór-ampfenikollal együtt nagyon is lehetséges.

Egy további kisérleben a cornea fekélyt nem közvetlenül annak például alkálilúg behatással történő indukálása után, hanem csak tíz nappal később kezdtük kezelni. Ebben a későbbi időpontban a könnyfolyadékban mérhető plazmin aktivitás már jelentős értékre 2-2,5 μ9/ιη1-Γβ növekedett.

Ha abban az időpontban (10 nappal az indukció után) aprotinin kezelést kezdünk (5000 IU/ml; helyi alkalmazás naponta kétszer), akkor a könnyfolyadékban kimutatható aktív plazmin koncentráció a normál értékre visszaáll. Ez a hatás azonban csak mintegy két órán keresztül tart, azután a plazmin értékek ismét növekednek.

Ha ebben a későbbi időpontban PAI-2 kezelést kezdünk (például 100 μ9/πι1; helyi alkalmazás), akkor az aktív plazmin koncentráció a normál értékre (0,4-0,6 μg/ml) visszaáll. Egyetlen PAI-2 alkalmazás hatása is meglepő módon igen hosszú, így például a plazmin koncentráció a könnyfolyadékban 48 órával az egyetlen PAI-2 alkalmazás után még 1 μg/ml. Ennél a kísérletnél mindhárom vizsgált PAI-2 koncentráció (5, 25 és 100 μg/ml) megfelel a fekélyesedési folyamat csökkentésére.

A legjobb terápiás eredményeket 25 μg/ml PAI-2 koncentrációnál kaptuk.

Ezt a meglepő módon hosszú ideig tartó hatást csak akkor figyelhetjük meg, ha a plazminogénaktivátorokat ΡΑΙ-2-vel gátoljuk. Amennyiben a plazmin gátlása aprotininnel történik, ez a hatás nem figyelhető meg.

Míg a szteroidokkal, például dexametazon-nátrium-foszfáttal történő helyi alkalmazás esetén a szem kezelése során mellékhatások, például az üvegtestek duzzadásának és a szemnyomásnak a változása figyelhetők meg, ha a szemet ΡΑΙ-2-vel kezeljük, akkor normál szem esetén nem tapasztalunk mellékha tást. Változatlan marad a szövettan, például az anterior stróma lamelláris szerkezetének a mintázata, de a biokémiai jellemzők, például a cornea hidratálása, az enzimes aktivitások (a laktát-dehidrogenáz, a savanyú foszfatáz, a savanyú glikozidáz, a lúgos foszfatáz, a szukcinát-dehidrogenáz). Ezen kívül kimutatható, hogy a sikeres gyulladás gátlás mellett a felhám újraképződését nem gátoljuk így.

A plazminaktivitás mérése a könnyfolyadékban

Kis papírlemezeket (Whatman szűrőpapír; 5 mm átmérő) átitatunk egy D-Val-Leu-Lys-trifluor-metil-amino-kumarin szubsztrát oldattal (FCA, az Enzymes Systems Products, Livermore, CA, USA), majd megszárítunk. A szubsztrát oldatot a következőképpen készítjük el: 1 mg szubsztrátumot 4 csepp N,N-dimetilformamidban feloldunk és hozzáadunk 1 ml 0,1 mólos trisz-HCl pH=7,2-es puffért. Plazmin oldatokat úgy készítünk, hogy 0,20,5 μg/ml koncentrációban a Sigma cég plazminját feloldjuk 7,2 pH-jú 0,1 mólos trisz-HCl pufferban. Minden koncentrációból 20 μΐ-t a szubsztrát oldattal előkezelt papírlemezre cseppentünk, majd azt nedves kamrában 37 °C-on (termosztátban), a könnyfolyadékkal átitatott papírlemezekkel együtt inkubáljuk. A plazmin koncentráció könnyfolyadékban való meghatározásához a papírlemezkéket a corneá-ra helyezzük és a könnyfolyadékot 5 másodpercen keresztül felitatjuk. A papírlemezkék 37 °C-on történő inkubálása közben a papírlemezeket 2 órás időközökben megvizsgáljuk ultraibolya fényben. Összehasonlítjuk a könnyfolyadék minták által az ultraibolya fényben kibocsátott sárga

• ·

fluoreszcencia intenzitását ismert plazmin koncentrációjú mintákéval (kalibrációs görbét készítünk ismert plazmin koncentrációjú papírlemezkékkel), és így határozzuk meg a minták plazmin aktivitását.

1. táblázat

Alkálivegyületek által indukált cornea fekély kezelése

A vizsgálati csoportok:

1. csoport: placebo-csoport (fiziológiás konyhasóoldat, amelyet naponta kétszer alkalmazunk);

2. csoport: aprotinin-csoport (5000 IU/ml naponta kétszer alkalmazva);

3. csoport; rPAI-2 (100 pg/ml naponta kétszer alkalmazva);

4. csoport: rPAI-2 (25 Mg/ml naponta háromszor alkalmazva).

A négy vizsgálati csoporttal végzett

Paraméter	kezelés 1	eredménye 2	négy hét 3	után 4
Átlátszóság	-	-	-	+
írisz láthatóság	-	-	-	+
Gyulladás	+	gyenge	-	-
Megnövekedett plazmin
aktivitás	+	-	-	-
Neovaszkularizáció	+	+	gyenge	-
Fekélyképződés	+	+	-	-
Perforáció	+	—	—	-

2. példa

PAI-2 felhasználása szaruhártya felhám regenerálására

Nyulak segítségével vizsgáltuk PAI-2 hatását a szaruhártya felhám regenerálódására.

A vizsgálat leírása:

A vizsgálatokat 2,5-3,0 kg testtömegű felnőtt csincsilla nyulakkal végeztük. Az állatokat 25 mg/kg testtömeg dózisban intravénásán tiopentállal altattuk el. A szemeket ezután rögzítettük és a szaruhártyát mechanikusan megsértettük: a teljes szaruhártyáról eltávolítjuk óvatosan kétszer (egyhetes időközökben) a felhámot Gaefe-féle késsel. Végül naponta háromszor ΡΑΙ-2-t (PBS pufferban, pH=7,2) adagolunk lokálisan a szemben különböző koncentrációkban (5-50 gg/ml). A kontroll állatok ugyanolyan térfogatú (0,5 ml) 7,2 pH-jú PBS puffért vagy 60 /xg/ml aprotinint vagy flurbiprofent (0,1 %-os pH=7,2-es PBS pufferős oldatban) kaptak.

Az állatokat a sérülés okozása után különböző időpontokban (1, 4, 7, 14, 21 és 28 nap múlva) leöltük. A szaruhártya szerkezetét megvizsgáltuk hisztológiai és hisztokémiai szempontból.

A könnyfolyadékban meghatároztuk a plazminaktivitást és egybevetettük a hisztológiai adatokkal. Hetenként kétszer dokumentáltuk a szem optikai megjelenését fénykép segítségével.

A plazminogénaktivitást az 1. példában leírtak szerint határoztuk meg.

Az állatok leölése után azonnal szemenukleációt végeztünk és kivágtuk a szaruhártyát vagy a teljes első szem szegmenst.

Néhány corneá-t megvizsgálunk a McGovern (1955) féle ezüst impregnációs eljárással. Az epitélium lehúzása után a preparátumokat zselatinba helyezzük. Valamennyi egyéb eljárást a teljes elülső szem szegmenssel végeztük. Egy részt könnyű benzinben, amelyet aceton és szárazjég keverékével előzetesen lehűtöttünk, hirtelen lehűtünk. Egy kriosztátban elhelyezünk 12 Mm vastag metszeteket a szemfelülettel párhuzamosan vagy arra merőlegesen. Ezután a metszeteket elő nem hűtött tárgylemezre vagy szemipermeábilis membránra visszük át és meghatározzuk a gkükóz-amino-glikánt, az amino-peptidáz-M-et (APM), a dipeptidil-peptidáz IV-et (DPP IV), a gamma-glutamil-transzferázt (GGT), az alkálikus foszfatázt (A1P), a nátrium-, káliumion-függő adenozin-trifoszfatázt (ATPase) és a dehidrogenázokat (szukcinát, dehidrogenáz, SDH, laktát dehidrogenáz LDH).

Az PM, DPP IV, GGT és A1P meghatározása előtt a metszeteket két percig egy hideg kloroform/aceton 1:1 térfogatarányú elegyben fixáljuk. Az AlP-t azo-kapcsolási eljárással mutatjuk ki nafton-AS-MX-foszfát (Calbiochem, La Jolla; CA, USA) és Fást Blue B só (Michrome, Gurr, Poole, UK) felhasználásával. Az APM-et Ala-4-metoxi-B-naftil-amin-Ala-MNA (Bachem, Svájc) és Fást Blue B só (Michrome, Gurr, UK) segítségével mutatjuk ki. Az DPP IV-et Gly-Pro-MNA (Bachem, Svájc) és Fást Blue B só (Michrome, Gurr, UK) , GGT-t Gamma-Glu-MNA (Bachem, Svájc), Gly (Lachema, Brno, CSFR) és Fást Blue B só (Lojda és társai (1979)) segítségével mutatjuk ki. A szemipermeábilis membránokon lévő metszeteket használjuk a savanyú foszfatáz (AcP) kimutatására naftol-AS-BI-foszfát (Calbiochem) és hexazónium-prozanilin - amely akridin-mentes rozanilinből készült és a

Merek, Darmstadt, Németország gyártmánya - segítségével, és ugyancsak ezen metszetek segítségével mutatjuk ki a β-glukoronidázt (β-glu) és az N-acetil-B-D-glukózaminidázt (Ac-Glu). Szubsztrátum: naftol-AS-BI-B-glukoronid és naftol-AS-BI-Nacetil-B-D-glukózamid (mindkettő a Calbiochem cég terméke); mindkettőhöz a hexazónium-p-rozanilin kapcsoló reagenst használtuk. A savas β-galaktozidázt (β-Gal) Lojda indigogén eljárásával (lásd Cejkova és Lojda, 1975; Lojda et al; 1979) 4-C1-

5-Br-3-indolil-B-D-galaktozid felhasználásával (Cyclo Chemicals, Los Angeles, CA, USA cég gyártmánya) mutatjuk ki. Az ATPázt Cejkova és Lojda (1978) eljárása szerint ATP-trisz és Ba²⁺-só felhasználásával mutatjuk ki.

A dehidrogenázokat Lojda és munkatársai (1979) eljárása szerint rögzítetlen kriosztát metszetekben detektáljuk Nitro BT-vel (Lachema, Brno, CSFR gyártmány) mint elektron akceptor segítségével.

A glukóz-amino-glikánok kimutatására a metszeteket hideg etanolban 5 percig fixáljuk, majd 1 %-os Alcian kék oldattal, amely különböző koncentrációjú MgC12~t tartalmaz, színezzük (Cejkova és munkatársai, 1973) . Ugyancsak színezzük 1 %-os Alcian blue 3 %-os ecetsavat, pH= 2,5-ös oldatával.

Az elülső szem szegmensek megmaradó részét 4 %-os 0,1 mólos foszfát pufferral (pH=7,2) készített paraformaldehidben fixáljuk, majd kriosztátban felvágjuk. 12 μτη vastag metszeteket albuminnal bevont tárgylemezre viszünk, felengedtetjük és megszárítjuk. A fixált metszeteket a DPP IV kimutatására (GlyArg-MNA, Bachem Svájc és nitroszalicil-aldehid NSA, Merek), valamint DPP II kimutatására (Lys-Pro-MNA és Fást Blue B) használjuk (Lojda, 1985 és Cejkova és Lojda 1986). Néhány fixált szaruhártyát megvizsgálunk a morfológiai változások szempontjából is (hematoxilin-eozin-szinezékkel).

Pufferos összehasonlító vizsgálat

A kezeletlen szemben a plazmin aktivitás a sérülés után 2 órán belül 0,2-0,4 pg/ral-re növekszik. Egy nap múlva a plazmin aktivitás 1,0-2,0 Mg/ml, ezen az értéken marad a hetedik napig, majd a 14. napig 0,2-0,4 gg/ml-re csökken, és 21 nap múlva éri el a 0,2 Mg/ml alatti értéket (lásd 2. táblázat).

A felhám a peremtől kezdve regenerálódik és különböző plazmin aktivitásokat (DPP IV savas glikozidázok és lizozoma proteázok (lásd 3. táblázat). Négy nappal a deepitelializáció után jelentős gyulladásos sejtáramlás figyelhető meg a sztrómába (mindenekelőtt polimorf magú neutrofil granulociták PMN). A periférián a szaruhártya neovaszkularizációja figyelhető meg. Néhány keratinozita elhal. Ezeket a szomszédos keratinociták helyettesítik. 14-21 nap múlva a felhám újraképződése lezárul. Negatív következményként az angiogenezist és az átlátszóság elvesztését kell megemlítenünk (az átlátszóság nem áll teljesen helyre).

A fellépett szaruhártya zavarosodás irreverzibilis.

Flurbiprofénnel végzett kezelés:

Hasonlóan az előzőekben ismertetett csak pufferoldattal kezelt csoporthoz a plazminaktivitás a könnyfolyadékban növekszik (lásd 2. táblázat).

A pufferes összhasonlító vizsgálattal ellentétben itt • « «

kevesebb gyulladásos sejt áramlik a sztrómába, a neovaszkularizáció akadályozott, azonban teljesen gátolt. Néhány szemnél nem tapasztalunk újrafelhámosodást, néhányszor kifejezetten gátolt ez a folyamat. A szaruhártya felhám csak nagyon kis ATPáz és GGT aktivitást mutat. Az adatokat a 3. táblázatban foglaljuk össze.

Aprotininnel vagy ΡΑΙ-2-vel végzett kezelés:

A teljes kísérleti időtartam alatt a plazmin aktivitás jelentősen csökken. Az aprotinin csoportnál a maximális értékek 1,0 μg/ml körül, a ΡΑΙ-2-vel kezelt csoportoknál csak 0,4 Mg/ml körül találhatók (lásd 2. táblázat).

A DPP IV, a savas glikozidázok, a lizoszóma hidrolázok aktivitása mindkét kezelt csoportnál relatíve gyenge, az ATPáz és a GGT aktivitás normális.

Aprotinin kezeléskor csak viszonylag kevés gyulladásos sejt áramlik a sztrómába, a ΡΑΙ-2-vel kezelt csoportban alig mutathatók ki ilyen sejtek.

Az átlátszóság mindkét kezelt csoportnál visszaáll.

Az aprotinin csoportban a seb gyógyulása csak 14 nap alatt fejeződik be, még a ΡΑΙ-2-vel kezelt csoportban már a

10. napon a felhám eltávolítása után ez befejeződik.

Aprotinin-kezeléssel a szaruhártya neovaszkularizációját nem lehetett megakadályozni, míg a ΡΑΙ-2-vel végzett kezelés (valamennyi alkalmazott koncentrációban) az angiogenezist teljesen megakadályozta.

A ΡΑΙ-2-vel illetve a plazminogénaktivátor-inhibitorokkal végzett kezelés előnyei tehát a következők: a felhám újrakép19 ződés meggyorsul, a neovaszkularizáció teljesen megakadályozható, az átlátszóság tökéletesen és gyorsan (gyorsabban, mint aprotininnel vagy bármely más anyaggal) visszaállítható. A PAI-2 nagyon eredményesen nyomja el a szaruhártya és a sztróma gyulladását. így például alig mutatható ki a gyulladásos területre bevándorolt PMN. A szaruhártya felhám enzimaktivitása ΡΑΙ-2-vel végzett kezelés során nagyon gyorsan normalizálódik. További előnyként értékelhető, hogy az alkalmazott PAI-2 koncentrációk lényegesen alacsonyabbak voltak kísérleteink során, mint az aprotinin koncentrációk.

A PAI-2 még 10 Mg/ml koncentrációban is tökéletesen hatékony. Ezzel kapcsolatos a PAI-2 azon előnye, hogy a ΡΑΙ-2-t adott esetben egyidejűleg más hatóanyagokkal együtt is lehet alkalmazni.

2. táblázat

Plazminaktivitás a könnyfolyadékban (Mg/ml)

Ismételt felhám-eltávolítás

Időtartam (óra, nap)	Puffer	rPAI-2	Aprotinin	Flurbiprofen
2 óra	0,2-0,4	0,2-0,4	<0,2	0,2-0,4
1 nap	1,0-2,0	0,2-0,4	0,2-0,4	1,0-2,0
4 nap	1,0-2,0	0,2-0,4	0,4-1,0	1,0-2,0
7 nap	1,0-2,0	0,2-0,4	0,2-0,4	1,0-2,0
14 nap	0,2-0,4	<0,2	<0,2	0,2-0,4
21 nap	<0,2			<0,2

• · · «

3. táblázat

Nyúl szem ismételt szaruhártya felhám eltávolítása

Paraméter	Vizsgált csoportok	rPAI-2 (10 pg/ml)
Puffér kontroll	Flurbiprofén (10 pg/ml)	Aprótinin (60 pg/ml)
1. Plazminaktivitás a könnyfolyadékban	növekszik	növekszik	enyhén növekszik	nem növekszik
2. Enzimaktivitás a szaruhártya felhámban
- DPP IV	+	alacsony	gyenge	gyenge
- savas gliko-
zidázok	+	alacsony	gyenge	gyenge
- lizoszóma
hidrolázok	+	alacsony	gyenge	gyenge
- Na⁺-K⁺-ATPáz	-	alacsony	+	+
- GGT	-	alacsony	+	+
3. PMN a strómában	számos	kevés	kevés	csaknem hiányzik
4. Felhám újraképződés a seb gyógyulása után	normál (14 nap)	elhúzódó	elősegített (<14 nap)	gyorsított (10 nap
5. Vaszkularizáció	kifejezett	gátolt (de nem teljesen)	kifejezett	teljesen gátolt
6. A cornea átlátszósága	irreverzibilisen homályos	részlegesen homályos	helyreállított (majdnem)	helyreállított (hamarabb)

• ·

3. példa

ΡΆΙ-2 szemsérülések kezelésére illetve intra- és posztoperatív kezeléshez

A kísérleteket a 2. példa szerint végezzük és értékeljük ki. Itt azonban az epitéliumot nem húzzuk le, hanem a szaruhártyát egy szikével végzett vágással, amelye a sztrómába a sztróma vastagságának 60-80 %-áig behatol, és a teljes szaruhártya felületet átfogja (5 mm-re a peremtől) megsértjük. A szaruhártyába behatoló egy vágás után a könnyfolyadékban a plazminaktivitás viszonylag gyorsan (2 órán belül) megnő, és több napon át viszonylag magas értéken marad (lásd 4. táblázat) .

Már egy nap után gyulladásos sejtek vándorolnak a sérült területre. Itt azután a közvetlen környezetben is megnövekedett lizoszóma proteáz és glikozidáz aktivitás mutatható ki.

Az első és hetedik nap között epitéliumsejtek vándorolnak a vágási sebbe. Tíz nap múlva a seb epitéliumsejtekkel ismét feltöltődik. A bevándorolt sejtek az alul fekvő sztrómához azonban nagyon rosszul tapadnak. Ezért a tényleges sebzáródás inkább lassú és elhúzódó. A sebgyógyulásnál a kollagén fibrilumok szabálytalanul helyezkednek el. Glükóz-amino-glikánokat a seb helyén nem lehet kimutatni. A glikozidázok aktivitása mindenekelőtt a β-galaktozidáz aktivitása a területen megnő. A makroszkopikus jelenségképből az látszik, hogy a szaruhártya átlátszósága a vágott seb területén átmenetileg - a maximum a gyógyulás alatt a negyedik és a hetedik nap között található eltűnik.

·· • · * · · · ·· *· · ····· • · ··· ··· ·· ··

- 22 A szaruhártya nem átlátszó hegszövettel gyógyul. A szaruhártya átlátszóság változásai irreverzibilisek. Az adatokat az

5. táblázatban foglaljuk össze.

ΡΑΙ-2-vel végzett kezelés:

A ΡΑΙ-2-vel kezelt állatoknál a könnyfolyadékban a teljes kezelési időtartam alatt csak minimális plazminaktivitás mutatható ki. A maximálisan elért aktivitás 0,4 ^g/ml. Ellentétben a pufferral kezelt összehasonlító csoporttal, a PAI-2vel kezelt állatoknál a gyulladás teljesen leállt. így például az első napon a ΡΑΙ-2-vel ellátott szemekben a sztróma seb közvetlen közelében nem mutathatók ki gyulladásos sejtek.

A keratinociták viszonylag korán aktiválódnak. A bevándorló epitéliumsejtek csak viszonylag alacsony lizoszóma hidroláz aktivitással rendelkeznek, ezzel szemben a GGT, ATPáz és SDH aktivitás nagyon hamar normalizálódik.

Már a negyedik napon a vágott seb ismét feltöltődik epitéliumsejtekkel. Ezek nagyon jól tapadnak az alul elhelyezkedő sztrómához. Már a 10. napon az eredetileg tátongó vágott seb ismét teljesen kisimul. A mélyebben fekvő sztrómarétegek a szomszédos keratinociták részvételével (anyagcsere és sejtosztódás aktivitás) gyógyulnak. 14 nap elteltével a sebgyőgyulás befejeződik. Az újonnan képződött keratinociták normális anyagcsere aktivitást mutatnak (például GGT szempontjából) és gyulladásra utaló jel nem tapasztalható.

Összességében elmondhatjuk, hogy a PAI kezelés lényegesen gyorsabb és minőségi szempontból lényegesen jobb sebgyógyulást tesz lehetővé. A szaruhártya sebgyógyulása eredményeképpen ·♦· · · • · · · teljesen átlátszó szövet képződik, a hegképződés teljesen elmarad. A betegek számára fontos leletek mindkét PAI koncentrációval (10 μg/ml és 20 ^g/ml) elérhetők.

A ΡΑΙ-2-vel kapott eredményeket az 5. táblázatban foglaljuk össze.

Aprotininnel végzett kezelés

A pufferral kezelt kontrollcsoporthoz képest a plazmin koncentráció csökken a könnyfolyadékban (lásd 3. táblázat).

A metszett seb normál sebességgel gyógyul (lassabb, mint ΡΑΙ-2-vel).

A PAI-2 hatásához hasonló módon a bevándorolt epitéliumsejteknél a lizoszóma hidroláz és glikozidás aktivitás csökkent.

Az újonnan képződött epitélium sztrómához való tapadása nem olyan erős, mint a ΡΑΙ-2-vel kezelt állatoknál.

A metszett seb lassabban gyógyul, de átlátszó szövet keletkezik. Hisztokémiai szempontból a seb nagyon hasonló ahhoz, amit a ΡΑΙ-2-vel kezelt állatoknál kapunk.

Pufferral kezelt kontrolcsoportok

A pufferral kezelt kontrollcsoport állatainál a plazmin aktivitás a könnyfolyadékban hosszabb időn keresztül megnő (lásd 4. táblázat). Egyidejűleg a gyulladásos sejtek (főként PMN) erős beáramlása figyelhető meg a szaruhártyába. Az epitélium litikus potenciája, amely például lizoszóma hidrolázból áll, megnövekszik, míg a GGT és ATPáz aktivitás csökken.

A sebzáródás maga nagyon lassú (kb. 10 nap), az újonnan ··<*>· • « • · · • ·· «« • · · · képződött epitélium az alul elhelyezkedő sztrómához nagyon rosszul tapad, fehér heg képződik, az átlátszóság részben elvész, mégpedig irreverzibilisen.

A ΡΑΙ-2-vel illetve plazmin/plazminogénaktivátor rendszer inhibitoraival való kezelés előnyei tehát a következők: csak ilyen módon érhető el a szaruhártya hisztológiai szempontból is gyors és teljesen kielégítő (teljesen átlátszó heg nélküli jó tapadás, neovaszkularizáció hiánya, a szaruhártya normális anyagcsere aktivitása) gyógyulása.

4. táblázat

Plazminaktivitás a könnyfolyadékban (Mg/ml)

Mély szaruhártya metszési seb

Időtartam	Puffer (óra, nap)	rPAI-2	Aprotinin
2 óra	0,2-0,4	0,2-0,4	<0,2
1 nap	0,4-1,0	0,2-0,4	0,2-0,4
4 nap	1,0-2,0	0,2-0,4	0,4-1,0
7 nap	1,0-2,0	0,2-0,4	0,4-1,0
14 nap	0,4-1,0	0,2-0,4	0,2-0,4
21 nap	0,2-0,42	<0,2	<0,2
2 8 nap	<0,2

5. táblázat

Nyúl szemén mély szaruhártya bemetszési seb

Paraméter	Vizsgálati csoportok
	Pufferral	Apro-	rPAI-2
	kezelt	tinin	(10 vagy
	koltroll-	(60gg/ml)	20 gg/ml)
	csoport

Könnyfolyadék - plazminaktivitás	erős növekedés	csökkent	gyakorlatilag nincs növekedés
PMN beáramlás	számos	ritka	hiányzik
Epitélium - lizoszóma
hidrolázok	nőtt	alacsony	alacsony
- GGT	csökkent	normál	normál (hamarabb)
- ATPáz	csökkent	normál	normál (hamarabb)
Sebgyógyulás - sebzáródás	lassú	normál	gyors
	(10 nap)		(4 nap
- az epitélium	rossz	elfogad-	nagyon jó
tapadása a sztrómához		ható
- hegképződés	+	-	-
- átlátszóság	részlegesen	átlátszó	átlátszó

elvész irreverzibilis

4. példa

PAI-2 felhasználása lézeres műtétek utáni kezeléshez

A Lohmann és munkatársai által 1991-ben ismertetett eljárásban nyulak fotorefraktív lézeres keratektómiáját végezték el (193 nm excimer laser) . Végül 20 /xg/ml koncentrációban lokálisan ΡΑΙ-2-t adunk a szembe (naponta kétszer-háromszor).

Az összehasonlító csoport azonos térfogatú oldószert kap (20 mmól glicin, pH=7,2, 150 mmól NaCl, 0,3 %-os zselatin hidrolizátum). A referenciacsoport vagy aprotinint kap (5000 IU/ml naponta kétszer két hétig) vagy 0,1 %-os prednizolon-acetátot (naponta kétszer egy hétig vagy naponta egyszer 11 hétig), vagy 0,1 %-os flurbiprofent (ugyanolyanolyan dózisban, mint a prednizolon-acetátot).

Mérési paraméterek a következők: zavarosodás kialakulása, plazminkoncentráció a könnyfolyadékban és a hisztológiai lelet.

A kontrolcsoportban a plazminkoncentráció rövid időn belül mintegy 1 μg/ml-ről egészen 50 Mg/ml értékre növekedett, egy hét után azonban normalizálódott. Az újonnan képződött epitélium és a megmaradt sztróma közötti kapcsolódási felület nem volt sima. Ezen kívül újonnan képződött mátrix anyagot, például kollagént lehetett kimutatni.

A sztrómában különálló vakuolák figyelhetők meg. Kezelés nélkül fennál a tendencia a rövidlátóság regressziójára.

Hibás struktúrák és képződmények kialakulása következtében a szem zavarosodása figyelhető meg.

Prednizolon-acetáttal való kezelésnél elvileg hasonló eredmény figyelhető meg, csupán a kollagén új szintézise valamivel kisebb, ezzel szemben a flurbiprofénnel való kezelés során a zavarosodáson kívül jelentős kollagén szintetizálódás figyelhető meg.

Aprotininnel végzett kezelésnél a régi sztróma és az újonnan képződött epitélium közötti határfelület sima. Mégis megfigyelhető egy fényreflexióhoz kötött szaruhártya zavaró27 *♦·· · · ··«· • ·· ·« 9 ·· • · · »···« sodás. Vakuolák nem figyelhetők meg, a bazális sejtek is normál méretűek. Mindazonáltal új kollagén szintetizálódik.

A ΡΑΙ-2-vel végzett kezelés eredménye tökéletesen tiszta, átlátszó szem (lásd 6. táblázat). Még 3 hónap múlva sem állapítható meg zavarosodás - ez normál esetben legfeljebb 3-5 hét elteltével fellép. Az epitélium tökéletesen regenerálódik: a régi sztróma és az újonnan képződött epitélium közötti határfelület sima. Nincs lerakódás, nincs vakuola, nem szintetizálódik kollagén és nem tapasztalható az epitélium hiperplázia sem.

A rövidlátásra való regresszió ugyancsak nem figyelhető meg.

Ha valamennyi referenciaanyagot kombináljuk, a kezelés eredménye akkor sem jobb, mint a ΡΑΙ-2-vel kezelt csoportnál.

Ennek a kombinációs terápiának, illetve valamely referenciaanyggal végzett terápiának a ΡΑΙ-2-vel végzett kezeléssel szembeni hátrányai a következők:

- Szteroidok három hónapig vagy annál hosszabb ideig történő helyi alkalmazása nemkívánatos és magas veszélyt jelent (az abláció erőssége függvényében) szekunder glaukómák kialakulására .

- Az aprotinin nem fér össze a prednizolonnal.

- Ismertek az aprotininnel szembeni túlérzékenységi reakciók.

- BSE problematika, tisztasági fok, idegen fehérje karakter szól az aprotinin alkalmazása ellen.

*·♦<

·« 9 · ·

6. táblázat

Lézeres szaruhártya kimetszés utáni terápia

	Kezelés időtartama (hónap)	Zavarosodás	Epitélium felszín	Kollagénszintézis (^fényreflexió)
Prednizolon	3	+	szabálytalan	+
Flurbiprofen	1-3	+	szabálytalan	++
Aprotinin	0,5-1	+	szabályos	++
Aprótinin/prednizolon Flurbiprofen	3	+	szabályos	- 1)
PAI-2	1	-	szabályos	-

^x) Azonban újonnan szintetizálódik egy még ismeretlen anyag.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Plazminogénaktivátor-inhibitorok felhasználása szem, fül, bőr, csont, ízületek vagy bél vagy egyéb belső szervek gyulladásai kezelésére és/vagy megelőzésére, és/vagy intraés/vagy posztoperatív kezelésre, és/vagy nyitott sebe kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására.
2. Az 1. igénypont szerinti felhasználás, azzal jellemezve, hogy a plazminogénaktivátor urokináz és/vagy tPA.
3. Az 1. igénypont szerinti felhasználás, azzal jellemezve, hogy az inhibitor PAI-1 és/vagy PAI-2, előnyösen előnyösen PAI-2 fragmensekből áll.
4. Az 1. igénypont szerinti felhasználás, azzal jellemezve, hogy Corneal ulcer, Uveitis, Konjunktivitis, a középfülgyulladás, a dobhártyagyulladás és a gyulladásos lefolyású dobhártyaszakadás, bőrpirosságok, akantolízis, Pemphigus, ekcéma, Kontaktdermatitis és atópiás dermatitis, gyulladásos lefolyású égések, érgyulladás, bőrfekélyek, osteoarthritis, IBD (Inflammatory bowel disease), Pankreatitis, Akne, felhámsérülések kezelése, szaruhártyasérülések kezelése, szemsérüléseknél a hegképződés elősegítése, Skleritis, nem gyógyuló Cornea-eróziók, xerózis, hiperkeratózis kezelésére.
5. Az 1. igénypont szerinti felhasználás intra- és/vagy posztoperatív kezelésre és/vagy nyitott sebek vagy az említett gyulladások kezelésére.
6. Az 1. igénypont szerinti felhasználás neovaszkularizáció gátlására, szem szaruhártya infiltrátumok kezelésére vagy kontaktlencse viselők szemének szaruhártya gyulladásai kezelésére.
7. Az 1. igénypont szerinti felhasználás, azzal jellemezve, hogy a műtéti kezelés lézeres szaruhártya kimetszés és/vagy a nyitott sebek vagy gyulladások lézeres szaruhártya kimetszés következményei.
8. Az 1. igénypont szerinti felhasználás szemgyulladások és szemhomályosodások, például lézeres kezelés vagy normál szemsebészeti beavatkozás (például vitrektómia, szürkehályogműtét, extrakapszuláris szürkehályog extrakció, lencseműtétek, lencsecsere, lencseimplantáció, keratoplasztika (szaruhártyaátültetés) után, valamint a következő megbetegedések konzekvenciái kezelésére: Konjunktivitis, Keratokonjunktivitis, Keratokonjunktivitis sicca, Iritis, Iridocyclitis, Keratitis, Graves ophthalmopathie, Mooren's ulcer, Vaskulitis, Uveitis, szemben fellépő allergiás jelenségek, fertőzések, anyagcserezavarok, gyulladásos megbetegedések és autoimmunbetegségek (például szisztemikus Lupos erythematodes, Wegen-szindróma, reumás Arthritis, szarkoidózis, Polyarthritis, Pemphigus, Pemphigoid, Erythema multiforme, Sjögren-féle szindróma, gyulladásos bélbetegségek (Inflammatory Bowel Disease), szklerózis multiplex, izomgyengeség, szaruhártyagyulladás, Skleritis.
9. Az 1. igénypont szerinti felhasználás hegképződés megakadályozására szemben sebészeti beavatkozás vagy sérülés után.
10. Az 1. igénypont szerinti felhasználás neovaszkularizáció megakadályozására retinabetegség esetén, különösen cukorbetegeknél; retinaoldódás, a retina érsérülése, a retina és az uvea gyulladása és szaruhártyaátültetés esetén.

• •44 • · ·· • · ·· • « • ··· ·· • V

4» • 4 > - 31 V
11. Az 1. igénypont szerinti felhasználás szemmel kapcsolatos transzplantációknál, különösen szaruhártya átültetésnél való alkalmazásra.
12. Az 1. igénypont szerinti felhasználás a szem területén található ödémáknál, például makulaödéma, szubmakulaödéma, fotokoaguláció utáni ödéma, cornea ödéma, konjunktivaödéma, retina-ödéma és a szem környezetében lévő ödéma kezelésére.
13. Az 1. igénypont szerinti felhasználás a szem területén lévő infiltrációk, például a szaruhártya, a szemcsarnok, a kötőhártya vagy ínhártya területén kezelésére.
14. Az 1. igénypont szerinti felhasználás a sebgyógyulás gyorsítására, különösen szemészeti területen.
15. Az 1. igénypont szerinti felhasználás lokális injekciókhoz, például a szubkonjunktívába, az üvegtestbe, a szemkamrába vagy a szlerába adott injekcióhoz.
16. Az 1. igénypont szerinti felhasználás mikroinjekcióval történő alkalmazáshoz.
17. Az 1. igénypont szerinti felhasználás öblítő oldatként történő alkalmazáshoz.
18. Az 1. igénypont szerinti inhibitorok felhasználása biológiailag lebontható hordozórendszerrel kombinálva.
19. Az 1. igénypont szerinti inhibitorok felhasználása gyógyászatilag alkalmazható vivőanyag-rendszerrel, például cellulózszármazékokkal, polimer mátrixokkal vagy kontaktlencsékkel kombinálva.
20. Az 1. igénypont szerinti inhibitorok felhasználása stabilizátorokkal kombinálva.
21. Az 1. igénypont szerinti inhibitorok felhasználása további hatóanyagokkal kombinálva.
22. Az 1. igénypont szerinti inhibitorok felhasználása, azzal jellemezve, hogy további hatóanyagként egy vagy több antibiotikumot alkalmazunk.
23. Eljárás hatóanyagként plazminogénaktivátor-inhibitorokat tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított plazminogénaktivátor-inhibitorokat szokásos gyógyszerészeti vivőanyagokkal és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverjük és a keveréket szem, fül, bőr, csont, Ízület, bél vagy egyéb belső szerv gyulladása kezelésére és/vagy megelőzésére, és/vagy intraés/vagy posztoperatív kezelésre, és/vagy nyitott sebek kezelésére alkalmas gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.