SK41593A3

SK41593A3 - Using of inhibitors of plasminogene activators for the production of medicament for a therapy of ignitions and wounds

Info

Publication number: SK41593A3
Application number: SK415-93A
Authority: SK
Inventors: Eckhard Schuler; Jurgen Romisch; Eric-Paul Paques; Gerhard Dickneite
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1992-04-30
Filing date: 1993-04-28
Publication date: 1993-11-10
Also published as: HUT65755A; EP0567816A1; CZ76893A3; JPH069425A; CA2095207A1; UY23572A1; NO931561L; CN1080873A; PL298748A1; DE4214215A1; KR930021179A; ZA933023B; AU3822993A; MX9302519A; IL105521A0; HU9301272D0; NO931561D0

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka použitia inhibítorov plazminogénových aktivátorov na výrobu liekov pre terapiu alebo/a profylaxiu zápalovýchochorení.

Doterajší stav techniky

Pri rôznych ochoreniach je narušená regulácia plazm í novej aktivity. Plazmíny sa tvoria z p 1azminogénov pomocou plazminogénových aktivátorov (PA), ako je napríklad močový p 1azminogénový aktivátor (uPA) alebo tkanivový p 1 azminogénový aktivátor (tPA). Plazminogénové aktivátory (PA) sa inhibujú inhibitormi plazminových aktivátorov (PAI).

V súčasnej dobe sú známe dva rôzne fyziologicky relevantné typy PAI: Inhibítor plazminogénového aktivátora typu 1 (PAI-1) a inhibítor plazminogénového aktivátora typu 2 (P AI-2). Oba PAI sú i n h i b í t o r y šerp í nového typu.

Pri zápale očí, uší alebo kože, napr. pri poškodení rohovky, dochádza všeobecne ku zvýšeniu plazmínovej aktivity v slznej tekutine. Plazmi n zodpovedá za rozklad fibronektínu v mimobunkovej matrici,za stimuláciu anginogenézy a za aktiváciu prokolagenázy na aktívnejšiu kolagenázu, čo má za následok odbúravanie molekúl kolagénu (Barlati a spol., Exp.Eye Res.51,

1-9 (1990)). Na liečenie rôznych patologických stavov, pri ktorých dochádza k zvýšeniu plazmínovej aktivity, sa už skôr použili nízkomolekulárne látky ako a 1 fa-aminokaprónová kyselina,alebo trans-4-aminoetycyk 1ohexankarboxy 1ová kyselina (tranexamová kyselina). Tak sa napríklad preukázalo, že tranexamová kyselina je vhodná na liečenie osteoartri t ídv . Pomocou tranexamovej kyseliny sa mohla znížiť nadmerná f i br i no 1 y t ická aktivita pri vrede na rohovke a podobných ochoreniach. Nevýhodou vyššie menovaných nízkomolekulárnych plazminových inhibítorov sú však ich vedľajšie toxické účinky.

ο

Ďalším možným plazmi novým aprotinín, podmienečne vhodný (corneal u 1 c e r).

ihibítorom sa ukázal byť na liečenie vredu rohovky

Podstata vynálezu

Prekvapivým nálezom bolo, že zápaly, hlavne očí, uší a kože, ale tiež napr.osteoartri t i s, alebo colitis ulcerosa,sa môžu úspešne liečiť inhibítormi aktivátorov p 1 azminogénov.

Predmetom vynálezu je preto použitie inhibítorov p 1 azminogénových aktivátorov na výrobu liečiva pre terapiu a/alebo pre profylaxiu zápalu očí, uší, kože, pre osteoarthritis a/alebo colitis u 1 c e r o s a.

Inhibovala sa hlavne urokináza (uPA) a/alebo tPA, predovšetkým uPA a/alebo tPA. Vhodnými inhibítormi sú hlavne PAI-1 a/alebo PAI-2 a ich mutanty alebo var ianty,predovšetkým PAI-2, hlavne fragmenty PAI-2, napríklad delecia na N-konci predovšetkým N-terminá1nych aminokyselín 1-82, prípadne 1-84 pri PAI-2. Inhibitory sa môžu použiť buď samostatne alebo v kombinácii s inými liečivami, napríklad s anti b ioti kam i , pri čom sa môžu použiť ako lokálne tak i na systematickú liečbu. Pri osteoartri t i s sa účinné látky aplikovali predovšetkým intraarti ku 1 ár ne alebo intraoperatívne (často artroskopicky ) . Účinná dávka leží všeobecne pre topické použitie medzi 1-300 000 urokinázu inhibujúcimi jednotkami, s výhodou medzi 500 - 50 000 urokinázu inhibujúcimi jednotkami, pre i.v. aplikáciu, alebo pre i.m. aplikáciu za použitia rozpúšťadla medzi 50 - 750 000 urokinázu inhibujúcimi jednotkami na kg telesnej hmotnosť i .

Inhibitory, predovšetkým PAI-2, sa môžu stabilizovať pomocou prídavku fyziologicky prijateľných stabilizátorov ako je albumín, polygelín, hydrolyzát želatíny, glycín, cyste í n, glukóza, laktóza, maltóza a /alebo sacharóza.

Oblasťami použitia inhibítorov sú všeobecne lokálne terapie a/alebo profylaxie zápalových očných chorôb ako je corneal ulcer, uveitis, k o n j u k t i v i t i s, pri operačnom alebo postoperačnom ošetrení, na ochranu očných štruktúr, i

predovšetkým v prípade zápalových priebehov, pri zápalových ušných chorobách, ako napr. zápale stredného ucha, zápale ušného bubienka, pretrhnutí ušného bubienka so zápalovým priebehom, ale tiež pri kožných chorobách srevádzaných zápalmi ako je ruža, hlavne pri infiltrácii tkaniva zápalovými bunkami ako sú makrofágy, monocyty a granulocyty, acantolýza, pľuzgierovitých ochoreniach ako je napr. pemfigus, ekzémy a kontaktné ä atopické zápaly kože, spáleniny so zápalovým priebehom, vaskulitídy, na podporu liečenia rán, terapie otvorených rán a kožných vredov. Ďalšími oblasťami použitia sú ošetrenia epitelárnych poškodení, osteoartri t ídy, colitis ulcerosa, Cronovej choroby,IBD (zápalové črevné choroby), pankreati t i s, akné, ošetrenie poškodenia epitelu, poškodenie rohov k y,tvorba jaziev pri poranení očí, skleritis, neliečiace sa vredové erózie, xerózie a keratózie. Ďalej sú inhibítory vhodné buď samotné alebo v kombinácii s ďalšími účinnými látkami, predovšetkým ako vymývacie roztoky pri intra a postoperačnom ošetrení a/alebo pri ošetrení uvedeného zapálenia otvorených rán. Ďalším výhodným použitím je ošetrenie kontaktých šošoviek pred používaním roztokom menovaného inhibítoru, buď samotného, alebo v kombinácii s ďalšími účinnými látkami na inhibíciu neovasku 1 ari žacie, na terapiu poranenia a zápalu očí a /alebo na ošetrenie infiltrátu očnej rohovky či zápalu rohovky vyvolaného nosením kontaktých šošoviek.

Nasleduje popis niekoľkých výhodných použití inhibítorov plazminogénových aktivátorov, ako je napríklad P AI- 2:

Použitie pri ošetrení po poranení očnej rohovky pomocou 1aserkeratek tómi e, ale tiež pomocou keratotómie. Tieto postupy 1 aserkeratektómi e sa môžu použiť pri korektúrach indexu lomu pri krátkozrakosti a ďalekozrakosti, pri korektúrach ast igmati zrnu, pri korektúrach chýb rohovky, pri odstraňovaní jaziev, pri keratop 1 asti i, na vyhladenie rohovky pri vysychávaní,pri čerstvom poranení rohov k y,pri infekciách oka, napríklad vírusmi (ako napr. vírusom herpes), baktériami, hubami alebo parazitmi, pri vápenných usadeninách pod vrstvou epitelu (jav spojený so

I starnutím), pri zrastoch spojovky s rohovkou (pterýgia).

Použitie pri zápale očí a zákale očí, napríklad po operácii laserom, normálnej očnej chirurgii (napríklad vitrektómii, kataraktchi rurgi i, extrakapsulárnej kataraktextrakcii, operáciách šošovky, výmene šošovky, implantácii šošovky, keratop 1 asti i , transplantáciách rohovky) pri konjukti v i t i s , keratokonjukti v i t i s , keratokonjukti v i t i s sicca, i r i t i s , i r idocyc 1 i t i s, keratitis, šedom zákale, Moorenovom vrede, vaskulitis uveitis, pri očných alergiách, pri infekciách, pri poruchách látkovej výmeny, zápalových ochoreniach a ochoreniach auto imunity (napríklad systemický Lupus erythematodes, Wegenerov syndróm, reumatický artritis, sarcoidóza, po 1yarthri t i s, pemphigus, pemphigoid, erythema multiforme, Sjoegrenov syndróm, črevné zápalové ochorenia, skleróza mu 11 i p 1 ex, Myasthenia gravis, keratitis, skleritis.

Použitie na zamedzenie tvorby jaziev v očiach po chirurgickom zásahu, prípadne po zranení.

Použitie na urýchlené hojenie rán a optimálnu regeneráciu (napríklad hladké styčné plochy medzi starým tkanivom a novo tvoreným epitelom), na normalizáciu a stabilizáciu funkcie epitelu pri látkovej výmene a tkaniva po poranení, alebo po chirurgickom zákroku.

Použitie na inhibíciu neovasku1arizáci e pri retinopatii, hlavne u diabetikov, pri omývaní sietnice, porušení ciev sietnice, zápale sietnice a uvey, pri transplantáciách rohovky.

Použitie pri transplantáciách v oku,hlavne pri transplantácii rohovky. PAI-2 tu môže znížením afinity PMN redukovať citlivosť, zabrániť neovasku 1 arizáci i, bez toho, aby došlo k súčasne negatívnemu ovplyvneniu hojenia rán. To znižuje odmietavé reakcie organizmu.

Použitie pri opuchoch v oblasti oka, napríklad opuchu makula a submakula, opuchu po fotokoagu1áci i, opuchu rohovky, opuchu spojoviek, opuchu sietnice a opuchu okolia oka.

Použitie pri infiltrácii v oblasti oka, ako rohovky, očnej komory, spojovky a skléra.

Použitie pri terapii Corneal ulcer.

PAI-2 sa môže napr. pripraviť nasledovným spôsobom: podľa spôsobu uvedenom v EP-O-238-275 sa PAI-2--cDNA izolovala bežne známym spôsobom, klonovala, preniesla do vektorov a transformovala vo vhodných hostiteľských bunkách. Bunky sa známym spôsobom ŕermentovali a dezintegrova1 i. Na čistenie rPAI-2 z lyzátov Escherichia coli sú napr. vhodné kombinácie rôznych chromatografi okých metód (napr.iontomeničová chromatografia na Q-Sepharóze, hyzdrofóbna chromatografi a na Phenylsepharóze, gelová filtrácia cez Sephacryl alebo Fractogel. Na čistenie rPAI-2 z kvasnicových lyzátov je vhodný postup skladajúci sa z hrubého čistenia (separácia buniek, dezintegácia buniek v guľovom mlyne, protiprúdová filtrácia a protiprúdová koncentrácia). Následné čistenie do vyššieho stupňa (chrómatografickými postupmi, ako je napríklad uvedené v WO-91/02057, alebo pomocou iontomeničovej chromatografie a imunoafinitnej chromatografi e). Špecifická aktivita je všeobecne 1 50 000 jednotiek/mg alebo viac, vztiahnutá na inhibiciu humánnej úrok i názy.

PAI-1 možno pripraviť analogickým spôsobom, napríklad podľa WO 90/13648.

Výhody predovšetkým zápalov bez inhibítorov aktivátorov p 1 azminogénov vo všeobecne netoxickej monoterapii vedľajších účinkov, pri súčasnej spočívajú uvedených i n h i b í c i i neovasku1arizáci e . Pretože používané koncentrácie ínhibítorov plazm í nových aktivátorov sú podstatne nižšie ako koncentrácie plazmi nových ínhibítorov, možná je súčasná aplikácia s inými účinnými látkami, z čoho kombinácia s antibiotikami je zvlášť výhodná. Ďalej, pretože je použiteľné množstvo ínhibítorov plazmi nových aktivátorov zreteľne nižšie ako u plazmi nových ínhibítorov, znižuje sa preto všeobecne nebezpečenstvo alergických reakcií. Výhodou je i d 1 hodobý úôinok v porovnaní s plazmi novými i n h i b i t o r m i.

Príklad 1

Použitie PAI-2 na terapiu Corneal ulcer

V králičom modele popísanom Cejkovou a spol. (H i stochemistry 45:71-75) pre Corneal ulcer sa PAI-2 aplikoval Ιοί 5 až 100 /ug/m 1) ká 1 ne do (25/Ug/ml oka rôznych koncentráciách

3x denne, 100 /ug/ml dvakrát denne). Kontrolná skupina obdržala rovnaké objemy (1 ml) rozpúšťadla (fyziologický roztok chloridu sodného, pH 7,2), aplikované dvakrát denne. Referenčnou látkou bol aprotinín (5000 medzinárodných jednotiek/ml v prvých dvoch týždňoch, dvakrát denne; v nasledujúcich dvoch týždňoch sa dávka znížila na 2500 medzinárodných jednotiek/ml).

Pôsobením 0,75 M hydroxidu sodného pomocou plastovej trubičky s vnútorným priemerom 11 mm, sa vyvolal masívny nárast zápalových buniek. ľieto vykazovali proteo 1 ytickú aktivitu a súčasne indukovali keratinocyty syntetizujúce odlišné spektrum proteog1ykánov na epiteli rohovky. Následkom toho je porušenie riadnej štruktúry rohovky, čo ďalej vedie ku strate transparencie.

Merali sa nasledovné parametre: perforácia tvorba vredu, neovaskularizácia, plazmi nová aktivita tekutine, znaky zápalu ako transparencia očí, viditeľnosť s kontrolnou skupinou sa u PAI-2 skupiny pozorovali nasledovné výhody: plazmínová aktivita sa mohla zredukovať na minimum.

prúd zápalových rohovky, v slznej buniek, dúhovky (Tab1). V porovnaní

Pre rovnakú redukciu plazm í novej aktivity pomocou aprotinínu je potrebná častejšia aplikácia. Pri PAI-2 sa úplne zabránilo perforácii a tvorbe vredu. Tieto účinky možno dosiahnuť tiež aprotinínom. Pri PAI-2 došlo k prekvapivo vysokému a trvalému zníženiu výskytu zápalových buniek, ktoré vznikli po experimentálnom zásahu až na úroveň zdravého tkaniva.

Následné pozitívne účinky, prekvapivo vzniknuté pôsobením PAI-2, ktorý zabránil neovaskularizácii, viedli k uplnemu uzdraveniu. Tak sa mohla obnoviť transparencia oka a viditeľnosť dúhovky. Pri ošetrení aprotinínom síce nedochádza k ulcerácii a perforácii rohovky, nedochádza však ani k obnoveniu transparencie. Pozitívne výsledky dosiahnuté už pri relatívne nízkej dávke PAI-2 sa nedosiahli ani pri vyšších dávkach aprotinínu.

Inhibovanie plazminogénových aktivátorov pomocou PAI-2 má, na rozdiel od inhibície plazmínu, napr. aprotinínom, ešte ďalšie výhody. Výlučné ošetrenie inhibítormi plazminogénových aktivátorov stačia pre úspešnú liečbu, čo je výhoda oproti skôr používanej terapii. Extrémne vysoký účinok používanej účinnej látky dovoľuje aplikáciu inhibítoru vo veľmi nízkych koncentráciách, čo umožňuje ešte tiež kombinovanú terapiu, napríklad s antibiotikami, ako je ch 1oramfen iko1.

V ďalšom pokuse sa ošetrenie vredu rohovky nevykonalo priamo po indukcii, napríklad účinkom lúhu, ale začalo až po 10 dňoch. V tomto neskoršom okamihu už plazmi nová aktivita v slznej kvapaline vzrástla na hodnotu 2 - 2,5 zum/ml. Pokiaľ sa v'tejto dobe (10 dní po indukcii) zaháji liečba aprotinínom (5000 medzinárodných jednotiek/ml, lokálna aplikácia dvakrát denne), klesá preukázateľná koncentrácia aktívneho plazminu na normálnu hodnotu. Tento účinok však vydrží asi len dve hodiny potom hodnota plazmínu opäť stúpa.

Pokiaľ sa v tomto časovom bode začne liečba pomocou PAI-2 (napríklad 100 zúg/ml, lokálna aplikácia), klesá koncentrácia aktívneho plazmínu na normálne hodnoty (0,4 - 0,6 zug/ml). Účinok jednorazovej aplikácie PAI-2 trvá prekvapivo veľmi dlho. Hodnota koncentrácie plazmínu v slznej kvapaline je napríklad po 48 hod. po jednorázovej aplikácii

PAI-2 ešte len 1 zug/ml. Pri všetkých troch testovaných koncentráciách PAI-2 (5,25,100 zug/ml) bolo možné potlačiť ulceratívny proces. Najlepšie terapeutické výsledky sa dosiahli pri použití koncentrácie PAI-2 25zug/ml.

Tento prekvapivo dlhodobý účinok sa pozoroval len pri i nhibítoroch aktivátorov plazmínogénu PAI-2, nie však pri i n h i bícii plazmi novaprotininom.

.Zatiaľ čo lokálna aplikácia steroidov, napríklad dexametazonnátriumfosfátu, je spojená pri ošetrení oka s vedľajšími účinkami,ako napríklad so zmenou objemu očnej gule a očného tlaku, nemá ošetrenie oka PAI-2 pri normálnom oku žiadne vedľajšie účinky. Histológia, napr. vzorka lame I ár nej štruktúry anteriórneho tkaniva, ale i biochemické nálezy, ako napr. hydratácia rohovky , enzymatické aktivity (laktátdehydrogenáza, kyslá fosfatáza, kyslá glykozidáza, alkalická fosfatása, sukcinátdehydrogenáza) zostávajú nezmenené. Okrem toho sa dokázalo, že popri úspešnej i nh i b í c i i zápalu, sa nebrzdila reepite1 i z á c i a .

Meranie aktivity plazmínu v slznej kvapaline:

Malé kolieska filtračného papiera (filtračný papier W h a t man s priemerom 5 mm) sa namočili do substrátového roztoku D-va 1 - 1 eu-1 y s-1 r i f 1 uor'omety 1 am i nok umar í nu (FCA, Enzýme System Products, Livermore, CA, USA) a usušili sa. Roztok substrátu sa pripravil nasledovným spôsobom: 1 mg substrátu sa rozpustil v 4 kvapkách Ν,Ν-dimetylformamidu a pridal sa 1, ml 0, 1M ľris -HCI pH 7,2. Roztoky plazmínu s koncentráciou 0,2 0,5zug/ml sa pripravili rozpustením plazmínu (Sigma) v 0,1M ľris-HCl pufrového roztoku s pH 7,2. 20 _zu 1 každej koncentrácie sa nakvapkalo na papierové kolieska, ktoré sa vopred impregnovali roztokom substrátu a. potom inkubovali vo vlhkej komôrke pri 37’C (v termostate), spoločne s kolieskami papiera napustenými slznou kvapalinou. Na určenie koncentrácie plazmínu v slznej kvapaline sa papierové koliesko položilo na rohovku a slzná kvapalina vsakovala 5 sekúnd. Počas inkubácie papierových koliesok pri 37’C sa papierové kolieska prehliadali v 2 hodino9 vých intervaloch v UV svetle. Intenzita žltej fluorescencie slznej kvapaliny vyvolaná UV žiarením sa porovnávala s fluorescenciou známej koncentrácie plazmínu (kalibračná krivka získaná z papierových koliesok v známej koncentrácii plazmínu) a tak sa určila plazmínová aktivita vzoriek.

Tabuľka 1

Ošetrenie corneal ulcer vyvolané pôsobením lúhu

Testované skupiny

Skupina 1

Skupina 2

Skupina 3

Skupina 4

Parameter kontrolná skupina (fyziologický roztok chloridu sodného; aplikovaný dvakrát denne) skupina aprotininu (5000 medzinárodných jednotiek/ml; aplikácia dvakrát denne) rPAI-2 (100 zug/ml, aplikácia dvakrát denne) rPAI-2 (25 zug/ml, aplikácia trikrát denne)

Výsledok ošetrenia 4 testovaných skupín po 4 týždňoch

3 4

Transparencia	-	-	-	+
Viditeľnosť dúhovky	-	-	-	+
Zápal	+	slabý	-	-
Zvýšená aktivita plazmi nov	+	-	-	-
Neovasku 1 ar i zác i a	+	+	slabá	-
Tvorba vredu	+	+	-	-

Perforácia

1

Príklad 2

Použitie PAI-2 na regeneráciu epitelu rohovky

Účinok PAI-2 na regeneráciu epitelu rohovky sa sledoval na králičom modele

Popis móde 1 u

Pokusy sa vykonávali na dospelých králikoch činčila (2,5— 3,0 kg telesnej hmotnosti. Anestézia sa uskutočňovala i.v. aplikáciou tiopentalu (25 mg/kg telesnej hmotnosti). Oči sa potom fixovali a rohovka sa mechanicky poškodila: celá rohovka sa opatrne dvakrát deepite1 izova1 a (v rozmedzí jedného týždňa) pomocou Graefovho noža. Potom sa PAI-2 (v PBS pufrového roztoku, pH 7,2) trikrát denne v rôznych koncentráciách (5-50 zug/ml) lokálne aplikoval do oka. Kontrolná skupina dostala rovnaký objem (0,5 m 1) P B S pufrového roztoku (pH 7,2) alebo aprotinínu (60 /ug/ml) alebo flurbiprofénu (0,1% roztok) v PBS pufrového roztoku, pH 7,2.

Zvieratá boli v rôznom čase od poranenia (po 1, 4, 7, 14, 21, 28 dňoch) zabité. Štruktúra rohovky sa skúmala histologickyabiochemicky.

V slznej kvapaline sa určila aktivita plazmínu a korelovala sa s histologickými údajmi. Dvakrát týždenne sa fotograficky dokumentoval optický obraz stavu očí.

Aktivita plazmínu sa stanovovala spôsobom popísaným v príklade 1. Po usmrtení zvierat sa oči ihneď vybrali a vyrezala sa rohovka alebo celý predný očný Segment.

Niekoľko rohoviek sa podrobilo impregnácii striebrom podľa McGovérna (1955). Po stiahnutí epitelu sa preparáty vložili do želatíny. Všetky ostatné metódy sa uskutočňovali s celými prednýmiočnými segmentmi. Časť sa ponorila do ľahkého benzínu, ktorý sa vychladil zmesou acetónu a pevného oxidu uhličitého. Rezy (12 zum silné) sa vykonali v kryostate rovnobežne, alebo kolmo na povrch oka. Rezy sa potom preniesli na vopred

2 neochladený nosič preparátu alebo na semipermeabilnú membránu a uskutočnila sa skúška na g 1 ukozaming1 ykán, am inopeptidázu M(APM), d ipeptidy1peptidázu IV (DPP IV), gama-g1utamy1transferázu (GGT), alkalickú fosfatázu (A1P), adenositri fosfatázu závislú na Na*-K *' (ATPáza) a dehydrogenázy (sukcinátdehydrogenáza SDH, 1 aktátdehydrogenáza LDH).

Pred dôkazom APM, DPP IV, GGT a A1P sa rezy fixovali dve 'minúty v chladnej zmesi chloroformu a acetónu (1:1). Dôkaz AlP sa vykonal azokopu1ačnou metódou použitím naftol-AS-MX-fosfátu (Calbiochem, La Jolla: Ca, USA) a soli Fast Blue-B (Michrome, Gurr, Polle, UK). AMP sa dokázal pomocou A1a-4-metoxy-betanafty 1-amin-a1a-MNA (Bachem, Bubendorf, CH) a soli Fast Blue-B (FBB, Michrome Gurr, UK), DPP IV pomocou gly-pro-MNA (Bachem, CH) a soli Fast Blue-B (Michrome Gurr, UK), GGT pomocou gama-glu-MNA (Bachem, CH), gly (Lachema , Brno, ČSFR) a Fast Blue-B, podľa Lojdu a spol. (1979). Rezy na sem ipermeabi 1ných membránach sa použili na dôkaz kyslej fosfatázy (AcP) pomocou azokopu lačne j reakcie s naftol-AS-BI -fosfátom (Calbiochem) a hexazonium p-rosani 1 ínom, ktorý sa pripravil z rosalínu čistého akridínu. (Merck, Darmstadt, SRN) a z beta-g 1 ukuronidázy (beta-glu) a z N-acety1-beta-D-g1ukozaminidázy (Ac-Glu), Substráty: Naftol-AS-BI-beta-glucuronid a nafto 1-AS-BI-acety Γ-beta-D-g1 ukoz am i n i d (oba od Ca1 b iochem ) .Na oba substráty sa využili kopulačné reakcie s hexzonium-p-rosanilínom. Kyslá beta-galaktozidáza sa dokázala pomocou Lojdovej indigometódy (Čejková, Lojda, 1 9 75, Lojda a spol., 1 9 79 ) za použit'ia 4-C 1 -5-Br-3-i ndo 1 y 1 beta-D-ga 1 aktoz i du (Cyc 1oChemica 1 , LosAngeles, C A, U S A).

ATPáza sa dokázala podľa Čejkovej a Lojdu (1978) použitím ATP-Tris a bárnatej soli.

Dehydrogenázy sa detekovali pomocou nitro BT (Lachema, Brno, ČSFR) ako akceptora elektrónov v nefixovaných kryostatových rezoch podľa Lojdu a spol. (1979).

Na dôkaz g 1 ukozaminog1ykánov sa rezy fixovali 5 min. v chladnom etanole a zafarbili sa 1% roztokom alciánovej modrej, obsahujúcom rôzne koncentrácie chloridu horečnatého (Čejková a spol.., 1 973 ), ale tiež s 1% roztokom alciánovej modrej

3 v 3% kyseline octovej, pH 2,5.

Zostávajúca časť anteri orných očných segmentov sa fixovala v 4% paraforma1dehyde v 0,1M fosfátovom pufrovom roztoku pH

7,2 a potom sa narezala v kryostate. 12/um silné rezy sa preniesli na nosič pokrytý anbumínom, rozmrazili sa a vysušili. Fixované rezy sa použili na dôkaz DPP IV (s Gly-arg-MNA, Bachem, CH, a s aldehydom kyseliny n itrosa 1 icy 1 ovej , NSA, Merčk) a DPP II (s lys-pro-MNA a Fast Blue-B (Lojda, 1985, Čejková a Lojda, 1986). Pri niektorých fixovaných rohovkách sa vyšetrovali morfologické zmeny farbením hematoxa1 ineozínom.

Kontrolný pokus - pufrový roztok

V neošetrovanom oku stúpa aktivita plazmínu na 0,2 - 0,4 zug/ml počas dvoch hodín po zranení. Po jednom dni dosahuje plazmínová aktivita hodnoty 1,0 - 2,0 zug/ml a zostáva na tejto hodnote až do siedmeho dňa a potom klesá do 14. dňa na 0,2 - 0,4 xug/ml a po 21 dňoch dosahuje hodnoty menšie ako 0,2 zug/m 1 (Tab . 2).

Epitel sa regeneruje a obahuje rôzne enzýmové aktivity (DPP IV, kyslé glykozidázy a lysozomálne proteázy (tabuľka 3). Počas 4 dní po deepitelizácii dochádza k masívnemu nárastu zápalových buniek (predovšetkým polymorfných neutrofí 1nych granu1ocytov, PMN), ktoré sa pozorovali v podpornom väzivovom tkanive. Na okraji prebieha neovaskularizácia rohovky. Niektoré keratinocyty nekrotizujú a bývajú nahradené keratinocytrni z okolia. Po 14 až 21 dňoch sa reepi ta 1 izáci a skončí. K negatívnym dôsledkom patrí angiogenéza a strata transparenci e (transparenci a sa znovu úplne neobnoví).

Vzniknutý zákal rohovky bol i rreverz i b i 1 ný.

Ošetrenie flurbiprofénom:

Plazmínová aktivita v s 1 znej kvapa1 i ne vzrastá podobne ako pri kontrolnej skupine pufrového roztoku (tabuľka 2).

Na rozdiel od kontroly s pufrovým roztokom do podporného väzivového tkaniva prúdilo menej zápalových buniek, neovaskularizácia sa zoslabila, avšak nezastavila sa. V niekoľkých prípadoch nedošlo k reepite 1 izáci i , často sa dokonca inhibovala. Epitel rohovky vykazoval len veľmi nízku aktivitu APľázy a GGT. Výsledky sú uvedené v tabuľke 3.

Ošetrenie aprotinínom alebo P AI-2 :

Počas celého priebehu pokusu sa aktivity p lazminu výrazne znižovali. Maximálne hodnoty v aproti n í nove j skupine dosahujú hodnoty ľ,0 zug/ml, v skupine PAI-2 len 0,4 /ug/ml (tabuľka 2). Aktivity DPP IV, kyslých glykozidáz a 1 yzozomá1nych hydroláz sú u oboch sledovaných skupinách relatívne nízke a aktivity ATPázy a GGT sú normálne.

Pri ošetrení aprotinínom sa dostáva do podporného väzivového tkaniva len relatívne malé množstvo zápalových buniek, v skupine PAI-2 sa nenašli takmer žiadne.

V oboch skupinách sa transparencia opäť obnovila.

V aprotinínove j skupine sa rana uzdravila len po 14 dňoch, zatiaľ čo v skupine PAI-2 bola už 10. deň po d e e p i t e 1 i zácii opäť uzatvorená. Pri použití aprotinínu sa nemôže zabrániť neovaskularizácii rohovky, zatiaľ čo pri použití PAI-2 (vo všetkých použitých koncentráciách) sa an'giogenéza úplne blokovala.

Výhody liečenia PAI-2 pripadne inhibítormi aktivátorov p 1azmľnogénov spočívajú teda v urýchlení reepitelializácie, v úplnom zastavení neovaskularizácie, v úplnej a rýchlej (rýchlejšej než pri aprotiníne alebo iných látkach) obnove transparencie. PAI-2 veľmi dobre potláča zápal rohovky a podporného väzivového tkaniva. V oblasti zápalu sa napríklad nenašli takmer žiadne PMN.Enzymatické aktivity epitelu rohovky sa pri použití PAI-2 veľmi rýchle normalizovali. Ako ďalšiu výhodu je možné oceniť i to, že použité koncentrácie PAI-2 sú omnoho menšie než u aprotinínu.

PAI-2 je ešte úplne aktívny dokonca i v koncentráci i 10/ug/ml. S tým je spojená výhoda PAI, spočívajúca v tom, že

5 sa môže aplikovať ešte súčasne s ďalšími účinnými látkami.

Tabuľka 2

Aktivita plazmínu v slznej kvapaline (zug/ml)

Opakovaná deepitelizácia

Čas (h,d)	Pufrový roztok	r-PAI-2	A p r o t i ní n	Flurbiprofén
2 h	0,2-0,4	0,2-0,4	< 0,2	0,2-0,4
1 d	1 , 0-2,0	0,2-0,4	0 , 2-0-4	1 ,0-2,0
4 d	1,0-2,0	0,2-0,4	0,2-0,4	1 ,0-2,0
7 d	1,0-2,0	0,2-0,4	0,2-0,4	1,0-2,0
14 d	0,2-0,4	<0,2	<0,2	0,2-0,4
21 d	< 0,2			<0,2

6

Tabuľka 3

Opakovaná deepite1 izáci a králičích očí

Testované skupiny

Parameter

Pufrový roztok

F 1 urb i profén

A p r o t i n í n rPAI-2

	\| (k o n t r o 1 ä) 1	[10 m g/m 1]	[60 zug/ml]	[10 zug/ml]
1 .	r 1 Aktivita \|
	p 1 a z m í n u \|			slabé	žiadne
	v s 1 znej \| kvapaline \| I	zvýšenie	zvýšenie	zvýšenie	zvýšenie
2 .	1 Enzýmatické \| aktivity \| v epiteli [ rohovky \| - DPP IV \| - kys.gly- \|	+	nízka	slabá	slabá
	k o z i d á z a \|	+	nízka	slabá	s 1 abá
	- lyzozom. \|
	hydrolázy \|	+	nízka	slabá	slabá
	- Na-K- \|	-	nízka	+	+
	ATPáza \|
	- GGT \| \|	-	nízka	+	+
3 .	1 PMN v tka- \|
	nive \|	početná	nízka	nízka	takmer
					žiadna
4 .	1 Reep i te1 i zá-	normálna	p r e d íí -	nemožná	zrých1 e-
	cia po zaho-	(14 dní)	žená	(< 1 4 dní)	ná
	jen í rán v \|				(10 dní)
	tkanive \|

7

Tabuľka 3, pokračovanie

5. Vasku 1 a- \| r i zác i a \| 1 \|	zreteľná	i nh i bo- v a n á (nie blokovaná	zreteľná	b 1 okovaná
1 6. Transparen-\|	i nver z.	čiastočne	obnovená	obnovená
cia rohovky \| 1	zakalená	zakalená	(takmer)	(ľahko)

Príklad 3

Použitie PAI-2 na ošetrenie poranenia oka a na pooperačné ošetrenie

Experimenty sa uskutočnili a vyhodnotili podobne ako je popísané v príklade 2. Tu sa však epitel nevybral, ale rohovka sa porušila rezom s k 1 a p e 1 u do podporného väzivového tkaniva do hĺbky 60-80% hrúbky podporného väzivového tkaniva a zasahujúceho celú hornú plochu rohovky (5 mm od okraja). Po porezaní rohovky stúpa v slznej tekutine plazmínová aktivita (počas 2 hod) a zostáva niekoľko dní na relatívne vysokých hodnotách (tabuľka 4).

Zápalové bunky migrujú do miesta zranenia už po 1 dni. V bezprostrednej blízkosti je možné tiež preukázať zvýšenú aktivitu 1 yzozomá1nych proteáz a glykozidáz.

Od prvého do siedmeho dňa migrujú bunky epitelu do reznej rany. Po 10 dňoch sa rezná rana opäť naplní epi telovými bunkami. Priľnavosť pribúdajúcich buniek k pod nimi ležiacemu podpornému väzivovému tkanivu je však veľmi zlá. Tým sa rana hojí pomaly a namáhavo. Usporiadanie ko 1 agénových fibrýl je pri tomto hojení nepravidelné.

G 1 y kozám inog1 yko1 y sa v mieste zranenia nedokázali. Aktivity glykozidáz, predovšetkým beta-ga1aktozidáz, boli v rovná18 kej oblasti zvýšené.

Z makroskopického pohľadu sa transparencia rohovky v oblasti reznej rany dočasne stráca; maximálna strata je medzi 4, a 7. dňom fázy hojenia.

Rohovka sa vyliečila za vzniku netransparentného jazvového tkaniva. Zmeny transparencie rohovky boli irreverzibilné. Údaje sú zhrnuté v tabuľke 5.

Ošetrenie pomocou PAI-2;

Počas celej doby ošetrenia sa u zvierat ošetrených PAI-2 dokázala v slznej kvapaline len minimálna plazmínová aktivita. Maximálna dosiahnutá aktivita sa pohybovala okolo 0,4 /ug/ml.

V protiklade ku kontrolnej skupine (s pufrovým roztokom) sa zápal u zvierat ošetrených PAI-2 úplne zastavil. Tak sa napríklad prvý deň nepreukázali žiadne zápalové bunky u očí ošetrených pomocou PAI-2 v bezprostrednej blízkosti zranenia podporného väzivového tkaniva.

Keratinocyty sa relatívne rýchle aktivovali. Bunky epitelu, ktoré doputovali migráciou mali len relatívne nízke aktivity 1 yzozomá1nych hydroláz, kým aktivity GGT, ATPázy a SDH sa opäť rýchle normalizovali.

U ž po 4 dňoch sa rezná rana úplne vyplnila bunkami epitelu. Tieto bunky veľmi dobre p r i T n u 1 i k podpornému väzivovému taknivu, ležiacom pod nimi. Už po 10 dňoch bola pôvodne sa rozostupujúca rana celkom plochá. Na vyliečenie hlbšie ležiacich vrstiev podporného väzivového tkaniva sa podieľali (aktivita látkovej výmeny a aktivita bunkového delenia) susedné keratinocyty. Po 14 dňoch Sa hojenie rany skončilo. Novo^: vzniknuté keratinocyty vykazovali normálnu aktivitu látkovej výmeny (napríklad aktivitu GGT). V žiadnom prípade nedošlo tiež k zápalu.

Ošetrenie pomocou PAI-2 umožňuje súhrnne povedané podstatné zrýchlenie hojenia rany a podstatné zlepšenie jej kvality. Pri hojení rany na rohovke vzniká úplne transparentné tkanivo a nedochádza k tvorbe jazvy. Tieto pre pácientov dôležité

9 účinky možno dosiahnuť pri oboch koncentráciách (10/ug/ml a 20 /ug/ml). Výsledky dosiahnuté pomocou PAI-2 sú zhrnuté v tabuľke 5.

Ošetrenieaprotinínom:

V porovnaní s kontrolnou skupinou (s pufrovým roztokom) sa v slznej kvapaline koncentrácia plazmínu znížila (porovnaj tabuľku 3).

Rezná rana sa hojí normálnou rýchlosťou (pomalšie ako v prípade P AI-2).

V porovnaní s účinkom PAI-2 sa u doputovavší ch epitelových bunkách aktivita 1 yzozomá1nych hydroláz znížila.

Adhézia novo utvoreného epitelu na podporné väzivové tkanivo nebola taká silná ako u zvierat ošetrených PAI-2. Rezné rany sa hojili pomalšie, vzniklo však transparentné tkanivo. Histochemicky bolo miesto poranenia veľmi podobné ako pri ošetrení zvierat PAI-2.

Kontrolná skupina (s pufrovým roztokom):

Plazmínová aktivita v slznej kvapaline sa u zvierat kont·- rolnej skupiny (s pufrovým roztokom) zvýšila na dlhší čas (tabuľka 4). Súčasne sa pozoroval v rohovke silný výskyt zápalových buniek (prevažne PMN).

Lytický potenciál epitelu pozostávajúci z napríklad lysozomálnych hydroláz, sa zvýšil, zatiaľ čo aktivita GGT a ATPázy sa redukovali. Samotné uzatvorenie rany bolo veľmi pomalé (približne 10 dní) a adhézia novo vytvoreného epitelu na podporené väzivové tkanivo, ležiace pod ním, bola veľmi zlá. Vytvorila sa biela jazva a transparenci a sa čiastočne- stratila a to irreverzibilne.

Výhody ošetrenia PAI-2, prípadne inhibítormi systému p 1 azm í n/ak t i vátor plazminogénu spočívajú v tom, že touto ces-tou dochádza k rýchlejšej a uspokojivejšej obnove rohovky ú p 1 i ne transparentnej, bez jaziev, s dobrou adhéziou, bez neovaskularizácie a s normálnou aktivitou látkovej výmeny na rohovke, a to i na histologickom základe.

Tabuľka 4

Aktivita plazminu v slznej kvapaline (/ug/ml)

Hlboká rezná rana v rohovke

Čas	Pufrový	rPAI-2	a p r o t i n í n
(h , d)	roztok

2 h	0,2-0,4	0,2-0,4	< 0,2
1 d	0,4-1,0	0,2-0,4	0,2-0,4
4 d	1,0-2,0	0,2-0,4	0,4-1,0
7 d	1,0-2,0	0,2-0,4	0,4-1,0
14 d	0,4-1,0	0 , 2-0,4	0,2-0,4
21 d	0,2-0,4	< 0,2	< 0,2
28 d	< 0,2

Tabuľka 5

Hlboká rezná rana do králičieho oka

	Testované skupiny
Parameter	pufr ová	aprotinín	rPAI/2
	kontrola	[60 /Ug/ml]	[10 alebo 20 zug/m 1]
Slzná
kvapa1 i na
- aktivita	vysoké	redukovaná	takmer nezvýšená
plazmínu	zvýšenie
Infiltrácia
-PMN	početná	vzácna	chýba
Epitel i um
- 1 yzozomá1.	zvýšené	nízke	nízke
hydro 1 ázy
-GGT	znížená	normálna	normálna
			(čoskoro)
-ATPáza	z n í ž e n á	normálna	normálna
			(čoskoro)
Hojenie rán
-uzatvore-	porna 1 é	norma 1 ne	zrýchlené
nie rán	(10 dní)		( 4 d n i )
- a d h é z i a
epitel i a	z 1 á	akcepto-	veľm i
		v a t e ľ n á	dobrá
-tvorba
jaziev	+	-	-
-transpa-

Tabuľka 5. pokračovanie rencia | čiastočne jaziev do | irreves. tkaniva | stratená transparentná transpar e n t a n á

Príklad 4

Použitie PAI-2 na liečenie po chirurgickom zákroku laserom

Fotoreaktívna laserová keratektómia (193 nm excimer laser) sa vykonala na králikoch, ktorú popísal Lohman a spol. (1991). Potom sa lokálne do očí aplikoval (2- krát až 3-krát denne) PAI-2 v koncentrácii 20/Ug/ml. Kontrolná skupina obdržala rovnaký objem rozpúšťadla (20 mM glycínu pH 7,2, 150 mM N a C 1 , 0,3% hydrolyzátu želatíny). Referenčná skupina obsahovala buď aprotinín (5000 medzinárodných jednotiek/ml, 2-krát denne, 2 týždne), alebo 0,1% pred n i so 1onacetátu (2-krát denne 1 týždeň; 1-krát denne, 11 týždňov), alebo 0,1% flurbiprofén (predni so 1 onacetát) .

Ako merné parametre slúžili tvorba zákalu, koncentrácia plazmínu v slznej kvapaline a histologický nález.

V kontrolnej skupine stúpla koncentrácia plazmínu v krátkom čase z cca 1/ug/ml na hodnoty až 50 zug/ml. Po týždni sa však normalizovala. Novo utvorená plocha medzi epitelom a pozostalým podporným väzivovým tkanivom nebola hladká. Okrem toho sa dal dokázať novo vytvorený materiál matrice, napríklad ko 1 agén.

V podpornom väzivovom tkanive sa pozorovali ojedinele vakuoly. Bez ošetrenia vzniká tendencia k regresii ku krátkozrakosti .

Očný zákal sa pozoroval ako dôsledok tvorby chybných štruktúr a neosyntéz. Pri ošetrení prední solonacetátom sa v princípe pozoroval rovnaký výsledok, len nová syntéza kola23 génu bola trochu redukovaná, zatiaľ čo pri ošetrení flurbiprofénom sa pozoruje popri zákale významná nová syntéza kolagénu.

Pri ošetrení aprotinínom je hraničná plocha medzi starým podporným väzivovým tkanivom a novo vytvoreným epitelom hladká. Jednako sa len pozorovalo zakalenie rohovky spôsobené reflexiou svetla. Žiadne vakuoly sa nepozorovali a tiež veľkosť podkladových buniek bola normálna. Syntetizoval sa však nový ko 1ágén.

Výsledkom ošetrenia pomocou PAI-2 bolo absolútne čisté, transparentné oko (viď tabuľka 6). Ani po troch mesiacoch sa nepozoroval žiadny zákal, hoci pri normálnom priebehu sa vyvíja po troch až p iati ch týždňoch. Epitel sa perfektne regeneroval:

Hraničná plocha medzi starým podporným väzivovým tkanivom a novo vytvoreným epitelom je hladká. Nepozorovalo sa žiadne zjazvení e, žiadne vakuoly, žiadna nová syntéza kolagénu a žiadna hyperplázia epitelu.

Žiadna regresia ku krátkozrakosti sa nepozorovala.

I v prípade spoločnej aplikácie kombinácie všetkých referenčných látok, nie sú výsledky ošetrenia lepšie než. výsledky ošetrení skupiny liečenej PAI-2.

Nevýhody tejto kombinovanej terapie, prípadne terapie referenčnými látkami oproti ošetreniu pomocou PAI-2 sú nasledovné:

- trojmesačná a dlhšia povrchová aplikácia steroidov prináša nežiaduce a vysoké riziko (závislé na stupni poškodenia) tvorby sekundárneho glaukómu

- aprotinín nemožno kombinovať s prednisolonom

- sú známe alergické reakcie na aprotinín

- proti použitiu aprotinínu hovorí i problematika BSE, stupeň čistotya charakter cudzorodého proteínu.

4

Tabuľka 6

Terapia po keratektómii laserom

	Doba Zákal ošetrenia (mes i ace)	Povrch epitelu	Nová syntéza ko 1 agénu = > r e f 1 e x i a na svet 1 o)
Prednisolon	3 +	nepravi- delný	+
F 1urb i profén	1-3 +	nepravi- delný	+ +
Aprotinín	0,5-1 +	pravidelný	+ +
Aprot./Pred. Flurbiprofén	3 +	pravidelný	- 1 >
PAI-2	1	pravidelný	-

) Syntéza novej ešte neznámej látky

Claims

PATENTOVÉ NÁROK Y

1. Použitie inhibítorov plazminogénových aktivátorov na výrobu /ôZczt/tV na terapiu a/alebo profylaxiu zápalov očí, uší, •kože, kostí, kĺbov, čriev alebo iných vnútorných orgánov, a/alebo na operačné a/alebo postoperačné ošetrenie , a/alebo na

*. ošetrenie otvorených rán.
2. Použitie podľa nároku 1, vyznačené, tým, že p 1azminogénovými aktivátormi sú urokináza a/alebo tPA.
3. Použitie podľa nároku 1, v y z n a č e n é t ý m, že inľiibítormi sú PAI-1 a/alebo PAI-2, výhodne fragmenty PAI-2.
4. Použitie inhibítorov plazminogénových aktivátorov podľa nároku 1 na liečenie zápalu rohovky, uveitídy, k o n j u k. t 'i v i tidy, zápalu stredného ucha, zápalu ušného bubienka, pretrhnú!

t i a ušného bubienka so zápalovým priebehom, červenania kože, acanthilózy pemfigus, ekzémov, dotykových a atopických zápalov kože, spálenín so zápalovým priebehom, vaskulitidy, kožných vredov, zápalov kostných kĺbov, zápalov čriev, t.j. IBD, pank4 reatídy, akné, ako i na liečenie epitelu, na liečenie poranenia rohovky, na liečenie jaziev pri očných poraneniach,na 1 i e — ’ čeni..e, skleritídy, nehojacich sa erózií rohovky, xerózy a/alebo keratózy.
5. Použitie inhibítorov plazminogénových aktivátorov podľa nároku 1, na operatívnu a/alebo postoperativnu liečbu a/alebo na liečbu otvorených rán alebo na liečbu vyššie menovaných zápa 1 ov .
6. Použitie inhibítorov plazminogénových aktivátorov podľa nároku 1, na i n h i b í c i u neovaskularizácie, na liečbu očných rohovkových infiltrátov a/alebo zápalov rohovky u osôb použiv26 júcich kontaktné šošovky.
7. Použitie podľa nárokov 1, v y z n a č e n é t ý m, že operatívnou liečbou je laserokeratektómia a/alebo otvorené rany alebo zápaly sú dôsledkom laserkeratektómie.
8. Použitie Ínhibítorov plazminogénových aktivátorov podľa nároku 1 na liečenie očných zápalov a očných zákalov, napríklad po laserovom ošetrení, po normálnom očnom chirurgickom . zákroku, napríklad vitrektómii, k at a r a k t ch i rurg i i, extrakapsu* .. lárnej kataraktchirurgii, operácii očnej šošovky, výmene očnej šošovky,implantácii očnej šošovky, keratoplastii, transplantá° cii rohovky, ako i následkov ďalších chorôb, ako zápalu spojoviek, keratokonjuktivitídy, keratokonjuktivitídy sicca, i r i t í dy, iridocyclitidy, keratitídy,šedého zákalu,More n_:ovho vredu, vaskulitídy, uveitidy, očných alergických javov,infekcií, porúch výmeny látkovej, zápalových ochorení a ochorení súvisiacich s autoimunitou, ako je napríklad systemický lupus erythemátodes, Wegenerov syndróm, reumatická artritída, sarcoidóza, polyartritída, pemphigus, pemphigoid, erythma multiforme, S j o egrenov syndróm, zápalové kožné ochorenia, zápalové ochorenia čriev, skleróza mu 11 i p 1 ex, myasthenia gravis, keratitída, s k 1 e r i t í d a .

C
9. Použitie ínhibítorov plazminogénových aktivátorov podľa nároku 1 na zamedzenie tvorby jaziev na oku po chirurgickom «

¹ zákrokualebopoporanení.
10. Použitie ínhibítorov plazminogénových aktivátorov podľa nároku 1 na inhibíciu neovaskularizácie pri retinopatii, najmä u diabetikov, pri odchlopení sietnice, poranení ciev sietnice alebo zápale sietnice , a uvey alebo pri transplantác i i rohovky.
11. Použitie ínhibítorov plazminogénových aktivátorov podľa nároky 1 pri očnej transplantácii, najmä pri transplantácii rohovky.
12. Použitie inhibítorov plazminogénových aktivátorov podľa nároku 1 na liečenie opuchov v okolí oka, napríklad opuchu makuly, submakuly, opuchu po fotokoagu1áci i , opuchu rohovky, opuchu spojoviek , opuchu sietnice, opuchu okolia oka.
13. Použitie inhibítorov plazminogénových aktivátorov na liečenie infiltrátov v oblasti oka, najmä rohovky, očnej komory, spojoviek a očného bielka.

·'
14. Použitie inhibítorov plazminogénových aktivátorov pod' ľa nároku 1 na urýchlenie liečenia rán, najmä v oftalmologickej oblasti.

c
15. Použitie inhibítorov plazminogénových aktivátorov podľa nároku 1 na lokálnu injekciu ako napríklad injekciu aplikovanú do subkonjuktíva, sklovca, očnej komory alebo očného bielka.
16. Použitie inhibítorov plazminogénových aktivátorov podľa nároku 1 na mikroinjekcíe.
17. Použitie inhibítorov plazminogénových aktivátorov podľa nároku 1 ako roztoku na výplach.

.
18. Použitie inhibítorov plazminogénových aktivátorov podľa nároku 1 v kombinácii s biologicky odbúrate ľným nosným syst témom;

i !

ί
19. Použitie inhibítorov plazminogénových aktivátorov podľa nároku 1 v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosným systémom, ako napríklad s derivátmi celulózy, polymérnymi matricami alebo kontaktnými šošovkami.
20. Použitie inhibítorov plazminogénových aktivátorov podί ľa nároku 1 v kombinácii so stabilizátormi.

i í

í
21. Použitie inhibítorov plazminogénových aktivátorov pod•i

I

Ta nároku 1 v kombinácii s ďalšími účinnými látkami.
22. Použitie inhibítorov podľa nároku Γ, v y z n a č e n é t ý m , že sa z ďalších účinných látok používa aspoň jedno antibiotikum.