KR20010041337A - 각막 상피 장애증 치료제 - Google Patents

Abstract

각막 상피 장애증, 자외선 각결막 상피 장애증, 각막절개술 시행후 각막 상피 장애증, 약제성 각결막 상피 장애증 및 드라이 아이 (dry eye) 를 예방 및 치료하는데 사용되는 우리나스타틴을 유효 성분으로서 함유하는 약제.

Description

각막 상피 장애증 치료제{REMEDIES FOR CORNEAL EPITHELIUM DISTURBANCE}

각막은, 안구의 전극에 있어서 수정체 전방을 투명하게 덮고 있고, 상피세포층, 보우만막 (Bowman's membrane), 실질층, 데스메막 (Descemet's membrane) 및 내피세포층으로 이루어진 정연한 층구조를 갖는 조직이다. 결막은, 각막과 이어지도록 안구표면부 및 검리(瞼裏)부에 존재하며, 형태학적으로는 안검(眼瞼)결막, 원개(圓蓋)결막 및 안구결막으로 분류할 수 있지만, 조직학적으로는 상피층 및 실질층으로 이루어진 것이다. 본 명세서에서는, 각막 및 결막을 총칭하여「각결막」이라 한다.

각결막의 장애는, 각결막의 표면 내지 상피에 결손이 발생함으로써 일어나는 것으로 생각되고 있다. 각결막 장애증은, 허피스성 (herpetic) 각막염, 세균성 각막 궤양, 신경마비성 각막염, 당뇨병성 각막증, 쇼그렌 증후군, 스티븐스 ·존슨 증후군, 안구건조 증후군 (드라이 아이) 등의 내인성 질환에 따른 각결막 상피 장애, 수술후, 약제성, 외상, 콘택트렌즈 착용 등에 의한 외인성 질환 또는 물리적 혹은 화학적 장애에 의해 발생한다.

이러한 각결막 장애증 중에서, 각막 상피 장애증은, 병인에 따라서는, 각막 상피 장애증으로부터, 상피가 재생되지 않는 난치성 각막 장애로 진행되어, 시력 장애나 실명에 이르는 경우도 있기 때문에, 문제시되고 있다.

상기 경우와 같은 시력의 회복을 위해서는, 각막 상피의 정상적인 재생피복이 빠르게 이루어질 필요가 있다.

각막 상피 창상치유의 기전은, 제 1 상 내지 제 3 상까지이며, 제 1 상은 상피세포의 접착 ·신전(伸展) ·이동, 제 2 상은 상피세포의 증식, 제 3 상은 상피세포의 분화로 이루어지며, 제 3 상을 거쳐 비로소 정연한 층구조를 갖는 상피로 되돌아간다.

각막 상피 창상치유의 조절, 제어인자로서 알려져 있는 것으로서, 제 1 상의 과정에서 촉진적으로 작용하는 피브로넥틴, 히알루론산, IL-6, 표피 성장 인자 (EGF) 등의 성분이 있다. 또, 물질 P 는, EGF 나 인슐린 유사 성장 인자 (IGF-1) 과 공존하여 상피세포의 신전 ·이동에 촉진적으로 작용한다.

제 2 상의 상피세포의 증식에 촉진적으로 작용하는 성분은, EGF, FGF (섬유아세포 성장 인자), 각질세포 성장 인자 (KGF), 간세포 성장 인자 (HGF) 등이 알려져 있다 (Gospodar-owicz, D., et al.: Exp. Eye Res., 25, 631-649 (1977); Sotozono, C., et al.: Exp. Eye Res., 59, 385-392 (1994); Wilson, S. E., et al.: Ophthalmol. Vis. Sci., 34, 2544-2561 (1993)).

제 3 상의 상피세포의 분화는, 비타민 A 에 의해 촉진되는 것으로 알려져 있다.

이러한 성분 중에서, 각막 상피 창상의 적극적인 치료법으로서, 임상적으로 응용되고 있는 것이 피브로넥틴이나 히알루론산의 점안이다. 피브로넥틴이나 히알루론산이 각막 상피세포의 접착 ·신전을 촉진하고, 특히 피브로넥틴은 매우 저농도에서 현저한 효과를 나타내는 것 등이 확인되고 있다.

그러나, 피브로넥틴이나 히알루론산의 작용은 각막 상피 창상치유의 제 1 상의 과정에서 주로 작용하는 것이며, 제 2 상의 상피세포의 증식작용은 약하다. 또, EGF, FGF, KGF 및 HGF 등의 증식인자는 혈관 신생을 유발할 위험성을 가지고 있어, 의약품으로 하기에는 치명적인 부작용이라 생각된다 (미쯔이 요시, 외 : 혈관 신생의 메카니즘; 안과 New Insight 3권 안내 혈관 신생성 질환, 8-20, 메디칼 뷰 사 (1994)).

사실, EGF, FGF 에 의한 혈관 신생이 보고되어 있다 (Schwei-gerer, L.,: Z. Kardiol. 78, 12-15 (1989); Taniguchi. E., et al.: Nippon Ganka Gakkai Zasshi, 95, 52-58 (1991); Nezu, E., et al.: Jpn. J. Ophthalmol., 36, 401-406 (1992)). 또한, 이들 증식인자의 제조가 매우 어렵다는 것도 의약품으로 하는데 있어 장애가 되고 있다.

이상과 같이, 각막 상피 장애증 치료제의 유효성분으로 하기에는, 지금까지 공지의 화합물은 모두 만족할 수 있는 것이 아니며, 더욱 우수한 화합물이 강하게 요망되고 있다.

한편, 각막궤양의 발생 기전으로서, 콜라게나제 등의 프로테아제의 관여가 중요하다는 것은 오래전부터 추정되어 왔다 (이또이 모또가즈: 임안 (臨眼), 24, 879-882 (1970)). 실제로, 시스테인 등의 콜라게나제 억제인자가 실험적인 각막궤양을 억제하는 것 및 그 임상응용도 보고되어 있다 (Brown, SI., et al.: Arch. Ophthalmol., 82, 95-97 (1969)); Brown, SI., et al.: Arch. Ophthalmol., 83, 352-353 (1970); 히라노 쥰조, 외: 임안 (臨眼), 29, 49-54 (1975); 누노무라 하지메, 외: 임안 (臨眼), 71, 88-90 (1975)). 그러나, 이들의 치료효과는 만족할 만한 것이 아니었다.

또, 각막 상피 창상치유 과정의 제 1 상에 있어서, 상피세포의 이동은 매우 중요하며, 일반적으로 세포의 이동에는, 신전하는 세포의 선단에 프로테아제가 국재하는 것이 필요하다고 생각되어, 각막 상피세포의 신전 ·이동과 프로테아제의 관계가 프로테아제 억제인자를 이용하여 연구되어 왔다.

모리모또 등은, 각종 프로테아제 억제인자를 이용하여 연구하여, 류펩틴 (타이올 프로테아제 억제인자), 아프로티닌 (세린 프로테아제 억제인자), 오보 α₂-마크로글로불린 (일반적인 프로테아제 억제인자) 은, 모두 각막 상피세포의 신장을 억제하였다 (모리모또 게이스께, 외: 콜라겐 연구회 초록, 35, 170-173 (1987)).

이상의 것은, 프로테아제 억제인자로서 펩스타틴 (산 프로테아제 억제인자), 1,10-페난트롤린 (메탈로프로테아제 억제인자), 아프로티닌 (세린 프로테아제 억제인자), 페닐메틸술포닐 불화물을 이용한 Zieske 등의 연구에 의해서도 나타나 있다 (Zieske, J. D. ＆ Bukusoglu G.: Investigative Ophthalmology ＆ Visual Science, 32, 2073-2078 (1991)). 모두 각막 상피 창상치유에 있어 프로테아제 억제인자는 마이너스 작용을 주는 면이 있음이 시사되어 왔다.

그러나, 어떤 종류의 프로테아제 억제인자, 예컨대 단백성 프로테아제 억제인자인 아프로티닌, α₁-안티트립신 등이, 인체 섬유아세포나 인체 내피세포의 증식인자가 되는 것이 알려져 있다 (Ogawa, M., et al.: Res Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 50, 155-158 (1985); Scott, G. K., et al.: Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 369, 131-135 (1988); Mckeehan, W. L., et al.: J. Biol. Chem. 261, 5378-5383 (1986)).

또, 상기 각막궤양 발생에 관여하는 콜라게나제 생산에는 플라스미노겐 활성화인자/플라스민 시스템이 필요하다는 것이 알려져 있다 (Berman, M., et al.: Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 19, 1204-1221 (1980)). 따라서, 플라스민 억제인자가 각막 상피 창상치유작용을 갖는 것이 추정되고 있다.

아프로티닌이 강력한 플라스민 억제인자인 것은, 오래전부터 알려져 있다 (Feeney, R. E., et al.: J. Biol. Chem., 25, 1957-1960 (1969)). 그리고, 아프로티닌이 인체에서의 각막 상피 창상치유에 응용되어, 유효성에서 어느 정도의 성과는 얻었다 (일본 특허공보 평 7-72139 호; USP 4,849,406; EP 0 223 254 Bl; Salonen, E-M., et al.: Acta Ophthalmologia 65, 3-12 (1987)).

그러나, 상술한 바와 같이, 아프로티닌은, 각막 상피 장애증 치료에 있어 매우 중요한 각막 상피세포의 이동에 대해 역으로 저해작용을 가지고 있는 것 (Zieske, J. D. ＆ Bukusoglu G.: Investigative Ophthalmology ＆ Visual Science 32, 2073-2078 (1991)), 또, 혈관 신생의 위험성이 염려되는 등에 의해, 각막 상피 장애증 치료제로서 활용할 수는 없었다.

또, 최근, 각막 손상 치유에는 플라스미노겐 활성화인자의 활성유지가 중요하다는 것이 알려졌다 (Morimoto, K., et al.: Thrombosis and Haemostasis 69, 387-391 (1993)). 그래서, 각막 상피 장애증 치료제로는, 플라스민 및 플라스미노겐 활성화인자에 대해 저해작용을 나타내거나, 저해하여도 그 저해활성이 매우 약하여 실질적인 저해작용을 갖지 않는 화합물이 요구되어 왔다. 아프로티닌은 강력한 플라스민 저해제라는 점도 의약으로 할 수 없었던 이유의 하나라고 생각된다.

또, 콜라게나제를 포함하여, 기타 프로테아제도 강하게 저해하는 특이성 넓은 단백성 프로테아제 억제인자인 오보마크로글로불린을 난치성 각막질환의 치료에 응용하고 있다는 보고도 있고, 어느 정도의 성과가 얻어졌지만 (가네다 류지, 외 : 임안 (臨按), 45, 233-237 (1991)); 가네다 류지 : 일본의 안과, 64, 955-960 (1993)), 응용된 오보마크로글로불린은 난백(卵白) 유래의 이종 단백질이며 항원성이나 알레르기 반응이 발생할 가능성이 높은 등, 각막 상피 장애 치료제로서 활용하기에는 만족할 수 없는 것이었다.

이들 보고에서, 단백성 프로테아제 억제인자가 인체 각막 상피세포의 증식을 촉진하고, 창상치유에 효과를 나타낼 가능성이 생각됐지만, 플라스민이나 플라스미노겐 활성화인자를 저해하는 것, 나아가서는 혈관 신생이나 항원성 등의 치명적 결함이 우려되어, 인체에 투여하는 의약품으로 하기에는 보다 우수한 화합물의 발견이 요구되고 있다.

그런데, 각결막 장애증에 대해서는, 최근, 자외선에 원인이 있다는 것이 주목되고 있다. 일광에 눈이 노출되는 상황, 예컨대 해수욕을 할 때 등에 있어서, 자외선은 각결막 상피에 조사되어, 여러 인자에 의해 각결막 상피의 장애를 일으킨다.

자외선에 의한 각결막 상피 장애증으로는, 이하와 같은 것이 알려져 있다.

괴사나 박리를 동반하는 광각막염 (Bergmanson JP: Corneal damage in photokeratitis-Why is it so painful?; Optom. Vis. Sci., 67, 407-413, 1990), 동통이나 수명 (羞明), 검 (瞼)경련을 특징으로 하는 "설맹 (설안염)", 자외선 야기의 복수병인에 의한 백내장의 유발 (Hightower KR: A review of the evidence that ultraviloet irradiation is a risk factor in cataractogenesis; Doc. Ophthalmol., 88, 205-220, 1994), 랑겔한스 세포의 장애에 따른 면역반응의 저하 (Kelley JG., et al: Langerhans cell alterations in the guinea pig cornea; Invest Ophthalmol Vis Sci., 26, 1293-1296, 1985. Ray-Keil L., et al: Reduction in the incidence of rejection of heterotopic murine corneal transplants by pretreatment with ultraviolet radiation; Transplantation, 42, 403-406, 1986).

염증성 사이토카인의 유도 (Kennedy M, et al: Ultraviloet irradiation induces the production of multiple cytokines by humal corneal cells; Invest Ophthalmol Vis Sci., 38, 2483-2491, 1997), DNA 장애 (Reddy VN, et al: The effect of aqueous humor ascorbate on ultraviolet-B-induced DNA damage in lens epithelum; Invest Ophthalmol Vis Sci., 39, 344-350, 1998), 그리고 신경장애 (Trabucchi G, et al: Corneal nerve damage and regeneration after excimer laser photokeratectomy in rabbit eyes; Invest Ophthalmol Vis Sci., 35, 229-235, 1994) 등.

이러한 질환의 거의 모두가 각결막 상피세포에 대한 장애를 동반하는 것이며, 자외선에 의해 슈퍼옥시드, 히드록시라디칼, 히드로퍼옥시드 등의 유리 라디칼이 생성되고, 이들 유리 라디칼에 의한 장애가 주요인으로 생각되고 있다.

생체의 항상성 유지작용을 고려하면, 이러한 유리 라디칼을 소거 또는 억제하기에 충분한 양의 락토페린 (약 2 ㎎/㎖ 눈물) 이나 글루타티온이 눈물에 구비되어 있다고 생각된다.

따라서, 자외선에 의한 여러 각결막 상피 장애는, 자외선에 의해 발생한 유리 라디칼이 원인이기는 하지만, 그 이상으로 생체의 항상성 유지기능에 중요한 병인이 있다고 생각하는 것이 적절하다.

이러한 생각에서, 유리 라디칼의 소거 또는 억제작용과 함께, 생체방어기능도 촉진하는 작용을 겸비한 약제를, 자외선에 의한 각결막 상피 장애에 대해 적용할 수 있고, 그 예방과 치료에 도움이 된다고 생각되었다.

자외선 장애에 대한 방어효과를 갖는 생리적인 점안제로서, 지금까지 글루타티온, 비타민 C, 비타민 E 등이 알려져 있다. 또, 생리적으로는 눈물에 있는 락토페린이나 글루타티온이, 여러 가지 원인으로 발생하는 유리 라디칼을 소거하고, 각결막 상피 장애를 방어하는 것으로 알려져 있다 (Megaw JM: Glutathione and ocular photobiology; Curr. Eye Res., 3, 83-87, 1984).

또한, 자외선 차단 콘택트렌즈의 응용도 시도되고 있다 (Bergmanson JP: The significance of ultraviloet radiation for eye diseases. A review with comment on the efficacy of UV-blocking contact lenses; Ophthalmic Physiol Opt., 15, 83-91, 1995).

그러나, 이러한 공지의 약제나 성분, 장구는, 자외선에 의해 발생한 유리 라디칼을 소거하여 방어하는 것이 주요 작용이며, 눈의 항상성 유지의 관점에서는, 결코 만족할 수 있는 것은 아니었다.

한편, 근시의 교정방법으로서, 최근 각막절개술이 주목되고 있다. 아주 오래전부터, 근시의 교정은 안경의 착용이나 콘택트렌즈의 장착으로 실시하는 것이 일반적이었지만, 안경 착용에는, 미용상의 문제나 일상생활에서의 번거로움의 문제가 있고, 콘택트렌즈의 장착에는, 사고에 의한 각막 손상의 문제 등이 있어, 근시의 교정을 근본적으로 실시하는 방법이 요구되고 있다.

이에 비해, 각막절개술은, 한번의 시술로 근시의 교정을 실시할 수 있기 때문에, 그 후에 안경의 착용이나 콘택트렌즈의 장착 등의 번거로움이 없어지므로, 혁신적 수단으로서 주목받게 된 것이다.

그러나, 각막절개술 시행후에도 각막절개술의 시행방법에 따라서는 각막 상피 장애증이 발증하는 경우가 있어, 그 예방 및 치료방법의 확립이, 각막절개술의 보급에 꼭 필요한 것으로서 연구되게 되었다.

각막절개술이란, 교정의 정도에 따라서, 각막 표면을 소정 형상, 소정 크기로 절개함으로써, 근시를 교정시키고자 하는 수술이며, 굴절성 각막절개술 (RK) 이라 불리고 있다.

RK 시술에 있어서는, 각막의 절개를 위해 다이아몬드 나이프를 사용하는 수법이 실시되어 왔다. 이 수법은, 수술 현미경에 부착한 고시(固視)등을 환자에게 주시시키면서, 수술자가 프리핸드 (free-hand) 로 각막을 절개하는 것이다.

이러한 수법에 있어서는, 감염예방과 수술후 상태의 양호화를 위해, 수술후에 스테로이드와 항생물질을 점안하는 것이 실시되고 있다.

한편, 각막절개술의 또 하나의 수법은, 광 굴절성 각막절개술 (PRK) 이며, 엑시머 레이저 기계에 의해 절개를 실시하는 것이다.

PRK 는, 수술자의 기량에 따라 수술 정밀도가 변화하지 않으므로, 절개형상이나 절개길이의 미묘한 차이에 의해 크게 달라지는 수술후 경과를 밟게 되는 각막절개술에 있어서는 바람직한 수법으로서, 최근 크게 주목받고 있으며, 또 그 기계도 착실하게 진보하고 있다. 각막절개술은, PRK 에 집약되는 것으로 기대되고 있다.

PRK 는, 엑시머 레이저의 레이저 빔을 각막 상피에 조사함으로써, 해당 부분을 절개하는 것이다. 이 방법에 의하면, 근시교정 외에, 원시교정이나 난시교정도 실시할 수 있기 때문에, 매우 유효한 시력교정방법이다. 이들은, 최근 굴절교정수술로 불리게 되었다.

엑시머 레이저를 이용하는 PRK 는, 그 우수한 교정효과가 확인되는 반면, 여러가지 합병증이 보고되고 있다. 예컨대, 각막 각층에서 상피결손이 발생하는데, 이는 엑시머 레이저 수술에서는 불가피하게 발생하는 것으로써, 심한 통증을 동반하는 경우도 있다.

또, 수술후의 일정기간에는, 상피하 혼탁이 발생하는 것이 반드시 관찰되고 있다. 수술후 12 개월이면 소실하는 것이기는 하지만, 그 기간의 시력 장애를 피할 수 없기 때문에 문제시되는 경우가 많다. 또한, 각막 내피에서, 세포수가 급격히 감소하는 것이 관찰되고 있다.

따라서, 이들 합병증의 극복이, 엑시머 레이저를 이용하는 PRK 의 보급 확산에 불가피한 것으로서 주목되고 있다.

엑시머 레이저는 파장 193 nm 의 자외선을 이용하는 것이기 때문에, 각막 상피세포의 파장 193 nm 의 자외선에 대한 저항성을 증가시키는 물질을 발견하는 것이 가능하다면, 이러한 문제가 해결될 가능성이 있다.

안과용제로서 총칭되는 눈의 질병에 대한 예방, 진단 및/또는 치료를 위한 약제는, 안과영역에서의 질병에 적용하기 위한 여러 가지 내복약제나 점안약제가 개발되어 적용되고 있다.

이들이 적용되는 눈의 질병으로는, 예컨대 녹내장, 백내장, 각막질환, 강막질환, 망막질환, 포도막질환, 유리체질환, 신경계질환, 결막질환, 루기 (淚器) 질환, 안와 (眼窩) 질환, 안정 (眼精) 피로 등을 들 수 있고, 이들은 안과에서의 각종 수술의 수술전, 수술중, 수술후에도 적용되고 있다.

이들의 예방, 진단 및/또는 치료를 위한 약제로는, 예컨대 녹내장 치료제, 백내장 치료제, 항균제 (항생물질, 합성항균제), 부신피질 호르몬제, 산동(散瞳)제, 축동(縮瞳)제, 술파제, 국소마취제, 혈관수축제, 혈관확장제, 수렴제, 효소제제, 항알레르기제, 비스테로이드 소염제, 항진균제, 항바이러스제, 각막 보호 ·치유 촉진제 등을 들 수 있다.

이들 안과용제 중에는, 눈의 질병에는 유효하지만, 부작용으로서 심한 각결막 상피 장애증을 일으키는 작용을 갖는 것이 있다. 이러한 부작용을 갖는 것은, 따라서 유효한 안과용제로서 사용할 수 없다. 그래서, 이들 약제와 동시에 투여함으로써, 부작용을 소실시킬 수 있고, 유효한 안과용제로서 사용할 수 있도록 할 수 있는 물질이 요구되고 있다.

한편, 각결막 장애증 중에서, 최근 주목되고 있는 것에 드라이 아이가 있다. 드라이 아이는, 콘택트렌즈 착용자의 증가, 인공적 공조환경 중에서의 생활시간의 연장, TV 나 컴퓨터 등의 VDT 화면의 응시기회 증가 등에 따라 증가경향에 있으며, 문제시되고 있는 것이다.

드라이 아이는, 눈물의 저하 또는 질에 이상을 초래한 상태를 말하며, 각결막장애의 유무에 관계없는 것으로 알려져 있다 (야마다 등. 일본안과기요, 43, 1289-1293 (1992)). 이에 의하면, 눈물감소증, 눈물부족증, 안건조증, 쇼그렌 증후군, 스티븐스 ·존슨 증후군, 안류천포포 (眼類天疱胞), 안검녹증 (眼瞼綠症), 폐안부전 (閉眼不全), 지각신경마비 등의 질환이 드라이 아이의 범주에 포함된다.

드라이 아이에 대해서는, 각결막 상피의 뮤신 (mucin) 과의 관계가 지적되어, 여러가지 연구가 이루어져 왔다. 각막 상피, 배(杯)세포 이외의 결막 상피가 공통으로 생산하는 것으로서 뮤신 1 이 알려져 있다 (새로운 안과, 14권, No. 11, 1997). 드라이 아이의 치료법의 하나로서, 이 뮤신의 대용품으로서의 메틸셀룰로오스, 콘드로이틴 황산, 히알루론산 등의 점탄성 물질을 함유하는 인공눈물의 점안 등이 행해지고 있다. 그러나, 이들 물질은 뮤신과는 물리학적 성질이나 생리학적 성질이 다르기 때문에, 그 치료효과에는 한계가 있었다.

국제공개공보 WO97/39769 호에는, 알부민을 유효성분으로 하는 용제를 드라이 아이에 적용하는 시도가 기재되어 있다. 이는, 눈의 표면상피의 뮤신 분비를 증대시켜, 표면의 눈물층의 안정화를 꾀하는 것이다.

일본 공개특허공보 평 9-136832 호에는, 술포데히드로아비에틴산을 함유시켜 드라이 아이의 예방제 및 치료제를 제공하는 기술이 개시되어 있다. 이것은, 뮤신 생산세포인 결막 고블렛 (Goblet) 세포의 뮤코다당 생산기능 촉진작용을 가지며, 그 기능저하에 의거하는 각화성 각결막장애를 억제하는 것이다.

일본 공개특허공보 평 9-301866 호에는, 카르보스티릴 유도체를 함유하는 드라이 아이 치료제가 개시되어 있다. 이것은, 고블렛 세포를 증가시킴으로써, 뮤신의 생산량을 증가시켜, 눈의 점액량을 증가시키는 것이다.

일본 공개특허공보 평 10-218792 호에는, 안지오텐신 변환효소 저해약을 유효성분으로 하는 드라이 아이 치료제가 개시되어 있다. 이것은, 안지오텐신 변환 효소 저해약이 눈물선 기능에 대해 직접적으로 작용하는 신경작동약으로서 기능하고, 눈물분비 촉진작용을 가지고 있는 것을 이용하는 것이다.

이들 기술은, 어느 정도의 치료효과는 얻을 수 있지만 불충분한 경우나 부작용을 수반하는 경우도 있어, 근본적 치료에 도움이 된다고는 할 수 없는 문제점이 있었다.

[발명의 요약]

상기 현상에 감안하여, 본 발명은, 각막 상피 창상치유의 각상에서 작용하고, 안전하며 부작용이 없어, 각막 상피 장애증에 대해 유효하게 그 예방과 치료를 실시할 수 있는 약제를 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.

본 발명은 또, 자외선에 의한 각결막 상피 장애에 대해, 예방작용과 치료작용을 갖는 자외선 각결막 상피 장애증 적용제를 제공하는 것을 목적으로 하는 것이기도 하다.

본 발명은 또, 엑시머 레이저에 의한 PRK 시술후의 합병증을 방지하는 데 유효한 약제를 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.

본 발명은 또한, 부작용으로서 존재하는 각결막 상피 장애작용을 갖는 안과용제의 해당 부작용을 소실시키고, 해당 안과용제를 유효하게 적용시키는 각결막 상피 장애증 적용제를 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.

본 발명은 그리고, 드라이 아이를 발증하는 원인을 근절함으로써 드라이 아이의 예방과 치료를 실시할 수 있는 약제를 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.

제 1 본 발명은, 각막 상피 장애증을 예방 및/또는 치료하기 위한 각막 상피 장애증 적용제로서, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 각막 상피 장애증 적용제이다.

제 2 본 발명은, 자외선에 의한 각결막 상피 장애증을 예방 및/또는 치료하기 위한 자외선 각결막 상피 장애증 적용제로서, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 자외선 각결막 상피 장애증 적용제이다.

제 3 본 발명은, 각막절개술 시행후의 각막 상피 장애증을 예방 및/또는 치료하기 위한 각막절개술 시행후 장애증 적용제로서, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 각막절개술 시행후 장애증 적용제이다.

제 4 본 발명은, 안과용 약제를 투여한 것에 기인하는 각결막 상피 장애증을 치료하기 위한 약제성 각결막 상피 장애증 적용제로서, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 약제성 각결막 상피 장애증 치료제이다.

제 5 본 발명은, 드라이 아이를 예방 및/또는 치료하기 위한 드라이 아이 적용제로서, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 드라이 아이 적용제이다.

본 발명은, 우리나스타틴을 유효성분으로 하는 약제로서, 각막 상피 장애증, 자외선 각결막 상피 장애증, 각막절개술 시행후 각막 상피 장애증, 약제성 각결막 상피 장애증 및 드라이 아이 (dry eye) 에 대해, 그 예방 및 치료를 위해 사용하는 약제에 관한 것이다.

도 1 은, 실시예 1 에서의 우리나스타틴의 인체 각막 상피세포에 대한 접착 ·신전 (이동) 작용을 나타내는 사진이다.

이하에 본 발명을 상술한다.

제 1 본 발명은, 각막 상피 장애증을 예방 및/또는 치료하기 위한 각막 상피 장애증 적용제로서, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 각막 상피 장애증 적용제이다.

여기서, 각막 상피 장애증 적용제란, 각막 상피 장애증에 적용하는 약제로서, 예컨대 각막 상피 장애증 예방제, 각막 상피 장애증 치료제 등을 들 수 있다. 각막 상피 장애증 예방제는, 각막 상피 장애증 발증의 우려가 있는 경우에 그 발증을 예방하기 위해 사용하는 약제이며, 각막 상피 장애증 치료제는, 이미 발증한 각막 상피 장애증에 대해 각막 상피 장애증을 치료 또는 경감하기 위해 사용하는 약제이다.

본 명세서 중에서,「적용」이란, 치료, 진단 및/또는 예방을 목적으로 인체를 포함하는 동물에 투여하는 것을 의미하고, 「적용제」란, 치료제, 진단제 및/또는 예방제를 포함하는 넓은 의미를 갖는 것으로 한다.

본 발명의 각막 상피 장애증 적용제는, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 것이다. 본 명세서중에서, 「우리나스타틴」이란, 인체 뇨중 트립신 억제인자 (UTI) 를 의미한다.

상기 우리나스타틴은, 분자량 약 67000 (겔 여과 크로마토그래피법에 의한 측정) 또는 분자량 약 34000 (SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의한 측정) 의 당단백질이며, 그 약 35 % 가 당부분으로 구성되어 있는 이미 공지된 물질이다 (「의학과 약학」33권, 5호, 1089-1097, 1995년). 우리나스타틴은, 상품명「미라클리드」로서 모찌다세이야꾸샤에서 시판되고 있다.

우리나스타틴은, 건강한 남자 신선뇨로부터 일반적인 정제법, 예컨대 규조토, 실리카겔에 흡착한 후, 이온교환수지, 겔여과 등을 차례로 조합하여 정제함으로써 얻을 수 있다.

최근, 분석법의 진보에 따라, 우리나스타틴은 여러 종류의 이성질체로 구성됨이 알려져 왔다. 이들 이성질체의 상이점은, 그 구성 당부분의 술폰화의 정도에 따라 특징지워진다. 그 이외의 점 (안티트립신 활성, 분자량, 아미노산 조성, N-말단 아미노산 시퀀스, C-말단 아미노산 시퀀스, 시알산 함유량, 우론산 함유량) 에서는 상이점은 없다고 생각된다 (Yuki, Y., et al.: Biochimica et Biophysica Acta, 1203, 298-303 (1993)). 이들 우리나스타틴의 이성질체는 모두 본 발명에 포함되는 것은 명백하다.

본 발명에 관한 우리나스타틴에 대해서는, 그 세포증식작용이 인체 선유아세포나 소각막 내피세포에서 확인되고 있지만 (Johanna. K., et al.: Biochim. Biophys. Acta. 1221, 145-152 (1994)), 인체 각결막 상피세포나 실질세포에 대한 보고는 없고, 세포종류나 동물종류에 따라 단백성 프로테아제 억제인자의 응답성이 현저하게 달라지기 때문에 (Mckeehan, W. L., et al.: J. Biol. Chem. 261, 5378-5383 (1986)), 인체 뇨중 트립신 억제인자의 인체 각결막 상피세포에 대한 약리효과는 예측이 불가능한 것이었다.

일본 공개특허공보 소 63-267730 호에는, 우리나스타틴을 유효성분으로 하는 알레르기성 비염 및 알레르기성 결막염 치료용 외용제가 개시되어 있다. 여기에는, 알레르기성 결막염 환자에 대해 20 ㎎/㎖ 투여한 경우, 눈의 결막충혈 및 가려움이 소실된 것이 기재되어 있다.

한편, 후술하는 바와 같이, 본 발명자들이 우리나스타틴의 각막 상피세포의 접착 ·신전 (이동) 에 대한 촉진효과를 동물실험에서 예의 연구한 결과, 난치성인 당뇨병성 랫트 각막 상피 장애증 및 집토끼 각막 상피 손상을 극적으로 치유하는 것을 확인하여, 세포배양에서 확인된 생리활성을 증명할 수 있었다. 또, 이것이, 플라스미노겐 활성화인자 활성을 저해하지 않고, 각막 상피 손상치유에 필요한 플라스미노겐 활성화인자를, 과잉생산에 의한 조직파괴까지 진전하지 않을 정도로 분비촉진시키는 작용에 의한 것이라는 것도 확인할 수 있었다. 이들 사실은 매우 혁신적인 각막 상피 장애증 적용제로서의 조건을 만족하는 것이며, 제 1 본 발명의 요지는 여기에 있다.

상기 우리나스타틴을 약리학적으로 허용되는 첨가제와 함께 혼합하여, 본 발명의 각막 상피 장애증 적용제를 제조할 수 있다.

상기 우리나스타틴을 본 발명의 각막 상피 장애증 적용제의 유효성분으로서 사용할 경우, 우리나스타틴의 농도범위는 특별히 제한되지 않지만, 0.05 ∼ 10000 ㎍/㎖ 로 인체 각막 상피세포의 접착 ·신전 (이동) 을 촉진하는 것을 현미경 또는 육안으로 관찰 및 확인할 수 있다는 점에서, 이 농도범위에서 사용하는 것이 바람직하다. 또한 농도범위를 0.5 ∼ 5000 ㎍/㎖ 로 함으로써, 인체 각막 상피세포의 현저한 증식이 확인되는 점에서, 이 농도범위에서 사용하는 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 각막 상피 장애증 적용제는, 국소투여제, 특히 점안제, 안(眼)연고제 또는 동건(凍乾)제 등의 제형으로 하는 것이 바람직하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 점안제, 안연고제로 할 경우, 첨가제로서 데히드로아세트산나트륨, 파라옥시벤조산메틸 등의 보존제, 염화나트륨, 글리세린 등의 등장화제, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐알콜 등의 증점제, 에데트산나트륨, 다당류 등의 안정화제 등의 일반적인 것을 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것이 아니라, 안(眼)생리적으로 허용되는 범위이면 된다. 상기 각종 제형에 첨가되는 완충액으로는, 등장이며, pH 4 ∼ 9, 특히 pH 5.5 ∼ 8.0 의 무자극인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

또, 본 발명의 각막 상피 장애증 적용제는, 유효성분으로서의 우리나스타틴의 작용이 방해되지 않는 범위에서, 피브로넥틴, 히알루론산 및 각종 글리코사미노글리칸 (콘드로이틴 황산, 데르마탄 황산, 헤파란 황산, 헤파린, 케라탄 황산) 등의 안생리활성물질과의 혼합병용이 가능하며, 강력한 각막 상피 장애증 적용제로 할 수 있다. 또한, 항생물질이나 글루코코르티코이드 등의 스테로이드성 항염증제나 비스테로이드성 항염증제와의 혼합병용도 가능하다.

본 발명의 각막 상피 장애증 적용제의 용법, 용량은, 환자의 증상, 연령 등에 따라 변동하는데, 점안제는, 통상 1 일 1 ∼ 5 회, 1 회당 1 ∼ 5 방울 점안하는 것이 좋다. 안연고제의 경우는, 통상 1 일 1 ∼ 3 회, 각 결막낭내에 적당량 도포하여 사용한다.

제 1 본 발명의 각막 상피 장애증 적용제가 대상으로 하는 각막 상피 장애증으로는, 각막 상피에 장애를 발생시키는 증상이라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 허피스성 각막염, 세균성 각막궤양, 신경마비성 각막염, 당뇨병성 각막증, 쇼그렌 증후군, 스티븐스 ·존슨 증후군 등의 내인성 질환에 따른 각결막 상피장애, 수술후, 약제성, 외상, 콘택트렌즈 착용 등에 따른 외인성 질환 등을 들 수 있다.

제 2 본 발명은, 자외선에 의한 각결막 상피 장애증에 적용하기 위한 자외선 각결막 상피 장애증 적용제로서, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 자외선 각결막 상피 장애증 적용제이다.

여기서, 자외선 각결막 상피 장애증 적용제란, 자외선에 의한 각결막 상피 장애증에 적용하는 약제로서, 예컨대 각결막 상피 장애증 예방제, 각결막 상피 장애증 치료제 등을 들 수 있다. 각결막 상피 장애증 예방제는, 자외선에 의한 각결막 상피 장애증 발증의 우려가 있는 경우에 그 발증을 예방하기 위해 사용하는 약제이며, 각결막 상피 장애증 치료제는, 자외선에 의해 이미 발증한 각결막 상피 장애증에 대해 각결막 상피 장애증을 치료 또는 경감하기 위해 사용하는 약제이다.

본 발명자들의 검토에 의하면, 우리나스타틴은, 인체 각결막 상피세포의 자외선 장애에 대해, 글루타티온, 비타민 C, 비타민 E, 락토페린 등에 비교하여, 매우 유효한 방어효과를 가지고 있음이 판명되었다. 또한, 이 방어효과는, 다른 프로테아제 저해제에서 볼 수 없는 독자의 작용이라는 것도 확인할 수 있었다. 우리나스타틴의 이러한 안과영역에서의 적용은 전혀 보고가 없고, 본 발명자들이 처음으로 발견한 사실이다.

우리나스타틴에 유리 라디칼 보족작용이 없다는 것은 보고되어 있고, 우리나스타틴의 유리 라디칼의 소거 (억제) 작용에 대해서는 이미 몇가지 보고도 있다.

그러나, 후술하는 실시예에서 명확한 바와 같이, 자외선 조사중의 우리나스타틴 함량이, 지금까지 보고된 유효량 (37 ∼ 74 ㎍/㎖ ; 1 ∼ 2 ㎛, 분자량 34000 로서 계산, 이하 동일) 에 비교하여 매우 적은 양이며 (M. Nomura, et al: Effect of Urinastatin and Aprotinin on the oxygen radical production of polymorphonuclear leukocytes; 이가꾸노아유미, 142, 895-896, 1987), 만약 이러한 우리나스타틴의 효과가, 유리 라디칼의 소거 (억제) 작용뿐이라면, 글루타티온, 비타민 C, 비타민 E 등의 결과와의 사이에 큰 모순이 생긴다.

따라서, 우리나스타틴의 자외선 장애의 방어효과는, 유리 라디칼의 소거 (억제) 작용뿐 아니라, 다른 방어기능을 촉진하는 작용이 작용했다고 생각되며, 예를 들어, 샤페론의 유도나 스캐빈져 수용체 단백의 발현 등의 가능성도 생각된다.

K.Tsubota 등은, 인체 각막 상피세포 (HCEC) 에 고농도 H₂O₂를 접촉시킴으로써, UV-B 조사와 동등한 세포내 OH ·라디칼의 생성과 그에 따른 세포내 ATP 함량의 감소를 확인하였다. 또한, OH ·라디칼만으로는 발생하지 않는 미토콘드리아 내막의 손상이 UV-B 조사에서 발생하고 있음을 확인하였다 (S. Shimmura, et al: Subthreshold UV Radiation-induced peroxide formation in Cultured corneal epithelial cell: The protective effects of Lactoferrin; Exp. Eye Res., 63, 519-526, 1996., K. Tsubota., et al: Ultraviloet B-induced mitochondrial dysfunction is associated with decreased cell detachment of corneal epithelial cell in vitro; Invest Ophthalmol Vis Sci., 38, 620-626, 1997).

즉, 인체 각결막 상피세포의 증식은 UV-B 조사에서 받는 미토콘드리아 내막의 손상을 방어해야만 있을 수 있다. 이 점에서, 우리나스타틴은 자외선 조사에서 발생한 미토콘드리아 내막의 손상도 방어하고 있다고 생각된다.

자외선 조사에 의한 인체 각결막 상피세포의 장애를 우리나스타틴은 현저하게 방어한다. 그리고, 그 방어효과는, 락토페린, 글루타티온, 비타민 E, 비타민 C 등의 항산화제, 및 α₁-트립신 ·억제인자, α₂-플라스민 ·억제인자, 아프로티닌, 베스타틴 등의 프로테아제 저해제보다도 훨씬 우수하다.

그리고, 우리나스타틴의 방어 기전은, 자외선 조사에 의해 발생한 유리 라디칼의 소거 (억제) 작용, 프로테아제 저해활성에 의한 작용, 세포막 보호작용 등에 의한 요인이라고는 생각하기 어렵고, 이들 기지의 작용 이외의 기전이 크게 작용하고 있다고 생각된다.

자외선 조사에 의한 안과 장애에 대해, 우리나스타틴을 적용하려 하는 것은, 지금까지 알려져 있지 않고, 제 2 본 발명의 요지는, 여기에 있다.

상기 우리나스타틴을 약리학적으로 허용되는 첨가제와 함께 혼합하여, 본 발명의 자외선 각결막 상피 장애증 적용제를 제조할 수 있다.

제 2 본 발명의 자외선 각결막 상피 장애증 적용제의 제형으로는, 상기한 제 1 본 발명의 각결막 상피 장애증 적용제와 동일한 것을 들 수 있고, 나아가 혼합병용할 수 있는 것, 용법, 용량 등에 대해서도, 상기 제 1 본 발명의 각결막 상피 장애증 적용제에 대한 것을 동일하게 들 수 있다.

제 2 본 발명의 자외선 각결막 상피 장애증 적용제가 대상으로 하는 각결막 상피 장애증으로는, 자외선 조사에 의한 결막충혈, 비만성 표층 각막염, 각막 부종, 홍채염 등 외에, 괴사나 박리를 동반하는 광각막염, 동통이나 수명, 검경련을 특징으로 하는 "설맹(설안염)" , 자외선 야기의 복수병인에 의한 백내장, 랑게르한스 세포의 장애에 따른 면역반응의 저하, 염증성 사이토카인의 유도, DNA 장애, 신경장애 등을 들 수 있다.

제 3 본 발명은, 각막절개술 시행후의 각막 상피 장애증에 적용하기 위한 각막절개술 시행후 각막 상피 장애증 적용제로써, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 각막절개술 시행후 각막 상피 장애증 적용제이다.

본 명세서에서 「각막절개술 시행후 각막 상피 장애증 적용제」란, 상기 각막절개술 시행후에 발생하는 각막 상피 장애증에 적용하는 약제로써, 예컨대 각막절개술 시행후 각막 상피 장애 예방제, 각막절개술 시행후 각막 상피 장애 치료제 등을 들 수 있다. 각막절개술 시행후 각막 상피 장애증 예방제는, 각막절개술 시행후, 각막 상피 장애증 발증의 우려가 있는 경우에 그 발증을 예방하기 위해 사용하는 약제이며, 각막절개술 시행후 각막 상피 장애증 치료제는, 각막절개술 시행후에 발생한 각막 상피 장애증에 대해 각막 상피 장애증을 치료 또는 경감하기 위해 사용하는 약제이다.

상기 각막절개술로는 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 엑시머 레이저 기계에 의해 절개를 실시하는 광 굴절성 각막절개술 (PRK) 등을 들 수 있다.

상기 각막절개술 시행후 각막 상피 장애증은, 예컨대 PRK 시술시의 엑시머 레이저의 각막 상피에 대한 조사에 기인하는 것으로 추찰할 수 있다. 엑시머 레이저는, 파장 193 nm 의 자외선이며, 따라서 파장 193 nm 의 자외선에 기인하는 각막 상피 장애증을 예방 및/또는 치료할 수 있는 것이, 상기 목적에 맞는 것이다.

본 발명자들은, 예의 연구의 결과, 상기 목적을 위해 우리나스타틴이 매우 효과적이라는 것을 밝혀내어, 본 발명을 완성한 것이다.

각막절개술 시행후의 각막 상피 장애증에 대해, 우리나스타틴을 적용하려 하는 것은, 지금까지 알려져 있지 않고, 제 3 본 발명의 요지는 여기에 있다.

상기 우리나스타틴을 약리학적으로 허용되는 첨가제와 함께 혼합하여, 본 발명의 각막절개술 시행후 각막 상피 장애증 적용제를 제조할 수 있다.

제 3 본 발명의 각막절개술 시행후 각막 상피 장애증 적용제의 제형으로는, 상기 제 1 본 발명의 각막 상피 장애증 적용제와 동일한 것을 들 수 있고, 나아가, 혼합병용할 수 있는 것, 용법, 용량 등에 대해서도, 상기 제 1 본 발명의 각막 상피 장애증 적용제에 대한 것을 동일하게 들 수 있다.

제 3 본 발명의 각막절개술 시행후 각막 상피 장애증 적용제가 대상으로 하는 각막 상피 장애증으로는, 예컨대 각막 각층에 발생하는 것으로서, 상피결손, 상피하 혼탁, 각막 내피세포수 감소 등의 각막 내피에 대한 장애 등을 들 수 있고, 각막 전층에 미치는 것으로서, 각막 착공, 각막 감염증 등을 들 수 있고, 시(視)기능에 대한 장애로서, 유두륜, 눈부심, 저교정, 과교정, 되돌아옴 등을 들 수 있다.

제 4 본 발명은, 안과용제에 의한 각결막 상피 장애증에 적용하기 위한 약제성 각결막 상피 장애증 치료제로써, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 약제성 각결막 상피 장애증 치료제이다.

약제성 각결막 상피 장애증 치료제는, 여러 안과용제에 의해 발생한 각결막 상피 장애증에 대해 치료 또는 경감하기 위해 사용하는 약제이다.

본 발명자들은, 예의 연구한 결과, 여러가지 안과용제에 의한 각결막 상피 장애증에 대해 우리나스타틴이 매우 효과적인 것을 밝혀내어, 본 발명을 완성한 것이다.

상기 안과용제로는, 투여함으로써 각결막 상피 장애증을 발증할 위험성이 있는 것이라면 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 이하의 것을 들 수 있다.

내복 안과용제 : 디클로르페나미드, 헬레니엔, 디요오도스테아르산칼슘, 메타졸라미드, 농(濃)글리세린.

축동제 : 염산필로카르핀, 살리실산피소스티그민, 에틸포스폰산파라니트로페닐에틸, 요오드화에코티오페이트, 브롬화디스티그민, 카르바콜.

녹내장 치료제 : 말레산티모롤, 염산베프노롤, 염산카르테오롤, 이소프로필우노프로스톤, 라타노프로스트.

산동제 : 염산시클로펜토레이트, 브롬화 수소산 호마트로핀, 황산아트로핀, 염산페닐레프린, 트로피카미드, 에피네프린, 타르타르산수소에피네프린, 염산디피베프린.

백내장 치료제 : 피레녹신, 파콜리신 (상품명. 제리아 신야꾸샤 제조), 글루타티온.

각막 보호 ·치료제 : 콘드로이틴 황산나트륨, 플라비탄 (상품명. 야마노우찌 세이야꾸샤 제조), 시아노코발라민, 디칼륨 글리시르리지네이트, 히알루론산나트륨.

효소제제 : α키모트립신.

혈관수축제 : 질산 나파졸린.

방부수렴제 : 질산은, 붕산, 붕사.

항생물질. 항진균제. 합성항균제. 술파제. 항바이러스제.

부신피질 호르몬제 : 아세트산히드로코르티존, 아세트산프레드니졸론, 인산덱사메타존나트륨, 덱사메타존, 인산베타메타존나트륨, 플루오로메토론.

기타 : 황산아연, 아줄렌술폰산나트륨, 염산리소자임, 테고-51, 폴리비닐알콜.

비스테로이드 소염제 : 디클로페나크나트륨, 인도메타신, 프라노프로펜.

항알레르기제 : 말레산클로르페니르아민, 크로모글리크산나트륨, 암렉사녹스, 푸말산케토티펜, 트라닐라스트.

국소마취제 : 염산옥시테트라카인, T-카인.

제 4 본 발명은, 상기와 같은 안과용제가 부작용으로서 갖는 각결막 상피 장애작용을 발증한 경우, 그 부작용을 소실시켜, 해당 안과용제를 유효하게 적용시키는 것이다.

안과용제에 의한 각결막 상피 장애증에 적용하기 위한 약제성 각결막 상피 장애증 치료제에 대해, 우리나스타틴을 적용하려 하는 것은, 지금까지 알려져 있지 않고, 제 4 본 발명의 요지는, 여기에 있다.

상기 우리나스타틴을 약리학적으로 허용되는 첨가제와 함께 혼합하여, 본 발명의 약제성 각결막 상피 장애증 적용제를 제조할 수 있다.

제 4 본 발명의 약제성 각결막 상피 장애증 치료제의 제형으로는, 상기 제 1 본 발명의 각막 상피 장애증 적용제와 동일한 것을 들 수 있고, 나아가, 혼합병용할 수 있는 것, 용법, 용량 등에 대해서도, 상기 제 1 본 발명의 각막 상피 장애증 적용제에 대한 것을 동일하게 들 수 있다.

제 4 본 발명의 약제성 각결막 상피 장애증 치료제가 대상으로 하는 각결막 상피 장애증으로는, 상기 제 1 본 발명의 각막 상피 장애증 적용제와 동일한 것 외에, 안과용제를 투여하여 발생하는 결막 상피 장애증을 들 수 있다.

제 5 본 발명은, 드라이 아이를 예방 및/또는 치료하기 위한 드라이 아이 적용제로써, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 드라이 아이 적용제이다.

여기에, 드라이 아이 적용제란, 드라이 아이 (안구건조 증후군) 에 적용하는 약제로써, 예컨대 드라이 아이 예방제, 드라이 아이 치료제 등을 들 수 있다. 드라이 아이 예방제는, 드라이 아이 발증의 우려가 있는 경우에 그 발증을 예방하기 위해 사용하는 약제이며, 드라이 아이 치료제는, 발증한 드라이 아이에 대해 드라이 아이를 치료 또는 경감하기 위해 사용하는 약제이다.

후술하는 바와 같이, 우리나스타틴이 동물 모델을 사용한 드라이 아이를 확실하게 예방할 수 있음을 확인할 수 있고, 이 사실이, 우리나스타틴이 각결막 상피세포에 대한 뮤신 1 생산촉진효과를 가지고 있음에 기인하는 것도 확인할 수 있었다. 이러한 사실은 매우 혁신적인 드라이 아이 적용제로서의 조건을 만족하는 것이며, 본 발명의 요지는 여기에 있다.

상기 우리나스타틴을 약리학적으로 허용되는 첨가제와 함께 혼합하여, 본 발명의 드라이 아이 적용제를 제조할 수 있다.

상기 우리나스타틴을 본 발명의 드라이 아이 적용제의 유효성분으로 사용할 경우, 우리나스타틴의 농도범위는 특별히 제한되지 않지만, 0.05 ∼ 10000 ㎍/㎖ 로 인체 각결막 상피세포의 뮤신 1 의 생산을 촉진하는 것, 및 동일 농도에서 랫트 모델을 사용한 드라이 아이를 예방할 수 있음을 확인할 수 있었던 점에서, 이 농도범위에서 사용하는 것이 바람직하다. 또한 농도범위를 0.5 ∼ 5000 ㎍/㎖ 로 함으로써, 인체 각결막 상피세포의 현저한 뮤신 생산이 확인된다는 점에서, 이 농도범위에서 사용하는 것이 보다 바람직하다.

제 5 본 발명의 드라이 아이 적용제의 제형으로는, 상기 제 1 본 발명의 각막 상피 장애증 적용제와 동일한 것을 들 수 있고, 나아가, 혼합병용할 수 있는 것, 용법, 용량 등에 대해서도, 상기 제 1 본 발명의 각막 상피 장애증 적용제에 대한 것을 동일하게 들 수 있다.

본 발명의 드라이 아이 적용제가 대상으로 하는 적용증으로는, 눈물의 저하 또는 질에 이상을 초래한 상태라면 각결막 장애의 유무에 관계없이, 예컨대 눈물감소증, 눈물부족증, 안건조증, 쇼그렌 증후군, 스티븐스 ·존슨 증후군, 안류천포포, 안검녹증, 폐안부전, 지각신경마비 등의 질환 등에 기인하는 드라이 아이를 들 수 있다.

본 발명의 각막 상피 장애증 적용제, 자외선 각결막 상피 장애증 적용제, 각막절개술 시행후 장애증 적용제, 약제성 각결막 상피 장애증 치료제, 및 드라이 아이 적용제는, 모두 안과용제로서 인체를 포함하는 동물에 적용할 수 있고, 예컨대 점안 등의 방법으로 적용할 수 있다. 상기 점안 등의 방법으로, 상기 본 발명의 안과용제를, 치료 및/또는 예방의 목적으로 인체를 포함하는 동물에 적용하여, 처리 (Treating) 하는 방법도 또한, 본 발명의 하나이다.

상기 본 발명의 안과용제를 공업적 생산 (Manufacturing) 하기 위해 본 발명에 관한 우리나스타틴을 사용하는 것도 또한, 본 발명의 하나이다.

본 발명의 각막 상피 장애증 적용제, 자외선 각결막 상피 장애증 적용제, 각막절개술 시행후 장애증 적용제, 약제성 각결막 상피 장애증 치료제, 및 드라이 아이 적용제는, 모두 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 안과용제이지만, 상술한 바와 같이, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하고 있는 한, 기타 성분의 함유 여부에 관계없이, 본 발명의 범위에 들어가는 것이다.

본 발명의 각막 상피 장애증 적용제, 자외선 각결막 상피 장애증 적용제, 각막절개술 시행후 장애증 적용제, 약제성 각결막 상피 자애증 치료제, 및 드라이 아이 적용제는, 의약조성물로서 인체를 포함하는 동물에 투여할 수 있는 것이므로, 각각, 각막 상피 장애증 적용 의약조성물, 자외선 각결막 상피 장애증 적용 의약조성물, 각막절개술 시행후 장애증 적용 의약조성물, 약제성 각결막 상피 장애증 치료 의약조성물, 및 드라이 아이 적용 의약조성물이라 할 수 있는 것이다.

[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]

이하에 참고예 및 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

참고예 1

우리나스타틴의 제조

건강한 성인뇨 약 1000 L 를 6 N NaOH 로 pH 10.0 으로 조정하여 약 30 분 방치한 후, 발생한 불용물을 테트론 면칼럼으로 제거하고, 통액뇨를 6 N H₂SO₄로 pH 7.0 으로 보정하였다. 이 액 990 L 에 공기를 주입하여 거품을 일으켜 거품 획분을 140 L 채집하였다.

채집한 거품 획분뇨를 6 N HCl 로 pH 5.0 으로 조정하고, 실리카겔 5 D (후지 다비슨 사 제조) 100 ml 에 약 10 ℃ 에서 4 시간 배치법으로 흡착을 실시하였다. 실리카겔 5 D 를 칼럼에 충전하여, 0.05 N 인산-나트륨-0.5 M NaCl (pH 5.0) 수용액으로 세정한 후, 0.3 M 염화암모늄-암모니아수 (pH 5.0) 로 우리나스타틴을 용출하였다. 용출액을 실온하에서 70 % 황산 암모늄으로 침전시키고, 24 시간 정치한 후, 발생한 침전물을 회수하였다. 이 침전물을 인산-나트륨 수용액 (pH 4.0) 에 용해하고, 0.1 M NaCl 함유 인산-나트륨 수용액 (pH 4.0) 으로 평형화한 DEAE-셀룰로파인 A200 칼럼 (수지량 300 ml) 을 통과시키고, 동일 완충액으로 세정한 후, 0.3 M NaCl 을 함유하는 인산-나트륨 수용액 (pH 4.0) 으로 우리나스타틴을 용출하고, 이 액을 순수한 물로 다시 희석하여 동일한 조작으로 재 크로마토그래피를 실시하였다. 얻어진 용출액을 0.3 N NaOH 로 pH 7.0 으로 되돌려, 아프로티닌 ·세파로스 CL-4B 칼럼을 통액시키고, 미량의 혼입 칼리크레인을 제거하였다. 이 통과액을 PM-100 (아미콘 사 제조) 한외 여과막을 통과시키고, 통과액을 PM-10 (아미콘 사 제조) 한외여과막에 의한 농축을 실시하고, 마지막으로 0.22 ㎛ 의 제균막을 통과시켜, 비활성 2700 단위/㎎ 단백질의 정제 우리나스타틴 (로트 A) 을 60 만 단위 얻었다.

동일한 정제조작에 의해, 정제 우리나스타틴을 3 로트 더 (로트 B : 비활성 2800 단위/㎎ 단백질, 회수량 59 만 단위, 로트 PW -2 : 비활성 2800 단위/㎎ 단백질, 회수량 56.5 만 단위, 로트 PW-3 : 비활성 2600 단위/㎎ 단백질, 회수량 65 만 단위) 얻었다.

동일한 정제조작에 의해, 정제 우리나스타틴 (로트 67B8 : 비활성 2740 단위/㎎ 단백질, 회수량 60 만 단위) 을 얻었다.

본 정제 우리나스타틴은, SDS 전기영동 (12 % 겔) 로 분자량 34000 에 단일 밴드를 나타내며, 우리나스타틴 표준품을 항원으로서 조제한 토끼항체와 겔내 이중확산침전법으로 침전선을 형성하고, 발열성 시험, 트롬보 플라스틴 시험 등의 생물규격시험에 합격하였다.

실시예 1

인체 각막 상피세포의 접착 ·신전 (이동)

인체 각막 상피세포주 (human corneal epithelial cell line : HCEC) 를 무혈청 배지 (0.1 ㎎/㎖ 황산 카나마이신을 포함하는 D-MEM/F-12 배지 : 일연 생물의학 연구소 제조) 에서 세포수 2.0 ×10⁵/㎖ 로 조제한 액 300 ㎕ 을 부유세포용 플라스크 (스미또모 베켈라이트 사 제조) 에 파종하고, 동시에, 여러 농도의 우리나스타틴 (로트 PW-2) 을 첨가하였다. 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터 내에서 5 시간 배양한 후, 배지를 완전하게 제거하고, 새로운 동일 무혈청 배지 300 ㎕ 을 각 혈에 첨가한 후, 즉시 현미경 관찰하에서 사진을 찍어, 인체 각막 상피세포의 접착 ·신전 (이동) 의 정도를 관찰하였다. 대조는 우리나스타틴 대신 생리식염수를 첨가한 세포군으로 하였다. 결과를 도 1 에 나타낸다. 도 1 에서, 상단의 2 장의 사진은, 대조구 (control) 을 나타내고, 중단의 2 장의 사진은, 우리나스타틴 (농도 0.5 ㎍/㎖) 을 첨가한 군을 나타내고, 하단의 2 장의 사진은, 우리나스타틴 (농도 5 ㎍/㎖) 을 첨가한 군을 나타낸다. 도 1 에서 명확한 바와 같이, 대조 (control) 에 비교하여, 인체 각막 상피세포의 접착 ·신전 (이동) 하고 있는 세포군 (화살촉 표시) 이 우리나스타틴을 첨가한 멀티 웰에 있어서 현저하게 많이 확인되었다.

실시예 2

인체 각막 상피세포의 증식

인체 각막 상피세포주 (human corneal epithelial cell line : HCEC) 를 1 % 소태아 혈청을 포함하는 SHEM (supplementary hormone epithelial medium) 개변 (modified) 배지 (Araki K. et al.: Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 18, 2665, 1993 에 기재된 SHEM 배양액으로부터 epidermal growth factor 를 생략한 배지) 에 세포수 3 ×10⁴/㎖ 로 조정하고, 이 세포현탁액 100 ㎕ 을 96 웰 멀티웰 플레이트 (코닝 사 제조) 에 파종하고, 거의 동시에 우리나스타틴 10 ㎕ 을 각 웰에 첨가하여, 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터내에서 48 시간 배양하였다. 우리나스타틴은 2 로트 (로트A ; 1.6, 0.16 ㎎/㎖, 로트B ; 2.2 ㎎/㎖) 를 이용하였다. 48 시간 배양한 후, MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 5 ㎎/㎖ 액 10 ㎕ 을 각 혈에 첨가하고, 다시 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터내에서 16 시간 배양하였다. 배양후, 20 % SDS (sodium dodecyl sulfate)-0.01 규정염산액 10 ㎕ 를 각 웰에 첨가하고, 세포배양을 중지하고 다시 37 ℃ 에서 6 시간 인큐베이트하였다. 생성된 청색 포르마잔량은 마이크로 플레이트 리더에 의한 570 nm - 660 nm 의 흡광치로부터 산출하여, 인체 각막 상피세포의 증식을 측정하였다. 우리나스타틴에 의한 세포증식활성은, 우리나스타틴 대신 생리식염수 10 ㎕ 를 첨가한 세포군을 대조로 하여, (우리나스타틴 첨가 세포군의 흡광치 ÷생리식염수 첨가 세포군의 흡광치) ×100 (%) 로 나타내었다. 사용한 우리나스타틴의 로트는 이성질체 함량이 다르고, 각 이성질체의 함량비를 표 1 에 나타낸다. 결과를 표 2 에 나타낸다. 표 2 에서 명확한 바와 같이, 인체 각막 상피세포의 증식작용은 이성질체의 종류의 함량비의 차이에 따라 변화하지만, 대조에 비교하여 훨씬 우수하며, 약 2 배 이상의 증식이 확인되었다.

우리나스타틴의 인체 각막 상피세포 증식작용

우리나스타틴 (종농도)	증식률(%)
로트A(160 ㎍/㎖)	194 ±20
로트B(220 ㎍/㎖)	245 ±5.1

실시예 3

인체 각막 상피세포의 증식

인체 각막 상피세포주 HCEC 를 1 % 소태아 혈청을 포함하는 SHEM 개변 배지에 세포수 5 ×10⁴/㎖ 로 조정하고, 이 세포조정액 300 ㎕ 을 48 웰 멀티웰 플레이트 (코닝 사 제조) 에 파종하고, 여러 농도의 우리나스타틴 (로트 PW-2, PW-3) 30 ㎕ 를 동시에 각 웰에 첨가하여, 최종 농도 0.05 ∼ 1 ㎍/㎖ 로 조제하여, 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터 내에서 64 시간 배양하였다. 배양후, 각 웰의 배양상청을 제거하고, 박리액 (0.25 % 트립신 (w/v), 0.02 % EDTA 를 포함하는 인산 완충 생리식염수) 100 ㎕ 를 첨가하여, 다시 6 분간, 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터 내에서 보온하였다.

보온후, 다시 피페팅을 실시하여 상피세포를 충분히 박리 ·분산하고, 여기에 0.1 % (w/v) 트리판 블루 염색액 100 ㎕ 를 첨가하여 세포를 염색한 후, 즉시 혈구계산판으로 세포수를 계측하였다. 우리나스타틴 대신 생리식염수 30 ㎕ 를 첨가한 세포군을 대조구로 하였다.

결과를 표 3 에 나타낸다. 표 3 에서, 우리나스타틴의 농도의존성이 있는 명확한 인체 각막 상피세포의 증식작용이 나타났다.

우리나스타틴의 인체 각막 상피세포 증식작용

우리나스타틴 농도 (㎍/㎖) 세포수 (×105cells/㎖)

대조구 2.40PW-2 0.05 2.230.1 2.500.2 2.530.5 2.901 3.43

PW-3 0.05 2.430.1 2.750.2 2.750.5 2.931 3.00

실시예 4

각막 상피 장애증의 치료

각막 상피 박리 당뇨병 랫트의 각막 상피 피복 ·재생촉진작용에 대해 검토하였다.

8 주 된 Sprague-Dawley 계 수컷 랫트를 하룻밤 단식시킨 후, 3 mM 시트르산 버퍼 (pH 4.5) 에 용해한 스트렙토조토신 (시그마 사) 을 60 ㎎/kg 체중의 용량으로 미정맥에서 투여하여, 그 후 2 주간 사육하여 당뇨병 랫트를 제작하였다.

상기 제작한 당뇨병 랫트를 4 군으로 나누어, 넴부탈 주사액 (다이니뽄세이야꾸샤 제조) 을 1 kg 당 40 ㎎ 복강내 투여하여 전신 마취한 후, 베녹실 0.4 % 액 (산뗀세이야꾸샤) 을 양쪽 눈에 한방울씩 점안하여 국부마취하고, 안과용 메스로 각막윤곽으로부터 중심부에 걸쳐 각막 상피 전역을 박리하였다. 각막 전상피층을 박리한 직후 우리나스타틴 (로트 PW-2) 5 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖ 의 2 액, 히알레인미니 0.3 (산뗀세이야꾸샤 제조) 및 생리식염액 (히까리세이야꾸샤 제조) 를 각군의 랫트에게 각각 1 일 6 회, 2 시간 간격으로 5 ㎕ 씩 점안하였다.

또, 각막 전상피층의 박리직후 및 그 24 시간후, 32 시간후에 리차드슨 염색액 (1 % 붕산나트륨 수용액에 용해한 1 % 메틸렌블루와 1 % 아주르 Ⅱ 의 1 : 1 혼합액) 을 한방울 점안한 후, 생리식염액 (히까리세이야꾸샤 제조) 로 충분히 세정하여, 손상부를 염색한 후, 비디오 카메라를 장착한 실체 현미경하에서 양전안부를 촬영하였다. 각막 상피 창상부 면적은 얻어진 모니터 화면상의 염색부를 화상해석처리 시스템 소프트웨어 (NIH 이미지 1.61) 를 이용하여 측정하였다. 각막 상피의 재생 ·수복은, 박리 직후의 창상부 면적을 100 % 로 하고, 창상부 면적의 축소로 하여 표 4 에 나타낸다. 본 실시예에서 사용한 동물모델은, 각막 상피 창상치유속도를 저하시키는 리차드슨 염색약 (Ubels J. et al.; Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 23, 127 (1982)) 이었기 때문에, 후술하는 실시예 6 의 동물모델보다 난치성이며, 박리 32 시간후도 대조구은, 거의 치유가 보이지 않았다. 또, 각결막 상피 장애치료용 점안제인 히알레인미니 0.3 (주약 히알루론산나트륨 0.3 %) 점안군도 거의 치유가 보이지 않았다. 그러나, 우리나스타틴 점안군은, 각막 창상부위의 면적이 축소되었다. 따라서, 우리나스타틴이 난치성의 각막 상피 창상의 치유를 촉진하는 것이 밝혀졌다.

실시예 5

인체 각막 상피세포성 플라스미노겐 활성화 인자 (PA) 에 미치는 우리나스타틴과 아프로티닌의 영향

여러 원인으로 장애를 받은 각막 상피세포가, 그 수복과정에 있어서, 각막 상피세포가 분비하는 PA 가 중요한 역할을 이루는 것은, 1983 년에, 이미 Thoft RA 들에 의해 제창되었다 (Thoft RA., et al.; Hypothesis of corneal epithelial maintenance., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 24, 1442-1443 (1983)).

한편, 손상치유에 플라스민 활성을 저해하는 아프로티닌이 유익한 것, 즉, 간접적으로 PA 활성을 억제하는 것이 중요하다고, Salonen E M 들이 1987 년에 보고하고 있다 (Salonen E M., et al.; Plasmin in tear fluid of patients with corneal ulcers : basis for new therapy., Acta Ophthalmol.,65,3-12 (1987), Cejkova J., et al.; Histochemical study of alkali-burned rabbit anterior eye segment in which severe lesions were prevented by aprotinin teratment., Histochemistry, 92, 441-448 (1989)).

그러나, 1991 년에, James D 들은, 각막 상피 손상치유 과정에 필요한 각막 상피의 이동을 아프로티닌이 농도의존적으로 저해하는 것을 보고하고 있다 (James D., et al.; Effect of protease inhibitors on corneal epithelial migration., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 32, 2073-2078 (1991)).

그리고, 1998 년, Winston W Y K. 들이 결정적인 사실을 보고하였다. 그들은, 플라스미노겐 결손 마우스를 이용하여, 기계적 각막 상피 장애를 작성하고, 손상치유를 관찰한 결과, 심각하고 지속적인 염증반응, 각막 상피 후방에의 피브린 침착, 궤양생성, 실질성 혈관 신생 등 복잡한 악화증상이 보였다. 그리고, 각막 상피의 손상치유에서 플라스민의 생성이 필수라고 결론지었다 (Winston W Y K., et al.; Healing of corneal epithelial defects in plasminogen and fibrinogen deficient mice., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 39, 502-508 (1998)).

이것은, 플라스민의 생성을 담당하는 PA 가 필수라는 것을 증명하는 것이다. 또한, 최근 Thomas D 들에 의해, PA 를 각막 상피세포 독성시험의 지표로 하는 시도가 이루어지고 있다. 즉, PA 분비를 억제하는 약제는 세포독성을 가지고, 손상방어에 부적합하며, 반대로, PA 분비를 촉진하는 약제는 수술중의 각막 상피 손상방어에 유익하다는 것을 시사하고 있다 (Thomas D., et al.; Cytotoxicity of Viscoelastics on cultured corneal epithelial cells measured by plasminogen activator release., J. Refract. Corneal Surg., 10, 95-102 (1994)).

PA 의 분비와 그 활성담지가, 각막 상피 손상치유에 필수인 것은 많은 연구자에 의해 보고되어 있다 (Andras B., et al.; Tear plasminogen activators-indicators of epithelial cell destruction. The effect of scraping, n-heptanol debridement, and alkali burn of the cornea on the plasminogen activator activity of rabbit tears., Inter. Ophthalmol., 15, 363-369 (1991), Chris P L.; Plasmin and plasminogen activator inhibitors after excimer laser photorefractive keratectomy: New concept in prevention of postoperative myopic regression and haze., Refract. ＆ corneal Surg., 9, 300-302 (1993)).

또, Jozsef T 들에 의해, 여러 가지 각결막 질환이나 슈그렌 증후군의 눈물중에서 PA 저해인자 (PAI) 가 높게 확인되고, PA 의 활성이 저하되어 있는 것도 보고되고 있다 (Jozsef T., et al.; Plasminogen activator inhibitors in human tears., Acta Ophthalmol., 69, 426-431 (1991)).

이와 같이 다수의 연구자의 보고로부터 각막 상피 손상치유에서의, 플라스미노겐 활성화 인자/플라스민계의 시비의 논쟁은, PA 의 분비와 그 활성유지가, 필수조건이 되는 것으로 결론지어졌다.

그래서, 우리나스타틴이 아프로티닌과 동일한 결함을 갖는지의 여부는 이하의 실시예에서 검토하였다.

실시예 5-1

우리나스타틴에 의한 인체 각막 상피세포성 PA 분비 촉진작용

인체 각막 상피세포 HCEC 를 10 % 소태아 혈청을 포함하는 SHEM 개변배지에 세포수 1 ×10⁴/㎖ 로 조정하여, 이 세포조정액 500 ㎕ 을 24 웰 멀티웰 플레이트 (코닝 사 제조) 의 각 웰에 파종하여, 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터내에서 3 시간 배양하였다. 그 후, 우리나스타틴 (로트 PW-2, 50 ㎍/㎖) 10 ㎕ 를 각 웰에 첨가하여, 동일한 조건에서, 다시 3 일간과 6 일간 각각 배양하고, 그 배양상청을 채집하였다. 채집한 상청액을 원심분리막 (울트라센트; 토소 사) 으로 약 5 배로 농축한 후, Ploug J 들의 방법 (Ploug J., et al.; Biochim. Biophys. Acta., 24, 278 (1957)) 을 일부 개변한 피브린 평판법, 및 합성기질 3145-V (펩티드 연구소) 의 방법 (Kawabata S., et al.;Eur. J. Biochem., 172, 17 (1988)) 으로 PA 활성을 측정하였다. 또, PA 의 동정은 우로키나제 항체 (TechnoColne G. m. b. H.; 오스트리아) 와 조직성 플라스미노겐 활성화 인자 항체 (Accurate Chemical ＆ Scientific Corporation; USA) 와의 교차반응을 오우크터로니법 (겔내 이중확산 침강법) 으로 확인할 수 있었다. 결과를 표 5 에 나타낸다.

3 일간의 배양에서는, 우리나스타틴 첨가, 무첨가 두 군에서 차가 보이지 않았다. 그러나, 6 일간의 배양에서는, 우리나스타틴 첨가군에서 무첨가군에 비해 명확한 PA 분비 촉진경향이 보였다. 이것에서, 우리나스타틴은 각막 상피 손상치유에 필수인 PA 를, 과잉생산에 의한 조직파괴까지 진전되지 않을 정도의 약간의 분비촉진을 실시하여, 손상치유를 효과적으로 진행함을 확인할 수 있었다.

실시예 5-2

우리나스타틴과 아프로티닌에 의한 인체 각막 상피세포성 PA 활성 저해의 비교

인체 각막 상피세포 HCEC 를 10 % 소태아 혈청을 포함하는 SHEM 개변배지에서 6 일간, 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터 내에서 배양한 후, 그 배양상청 490 ㎖ 를 60 % 포화 황산 암모늄으로 침전시키고, 발생한 침전을 원심분리기로 회수하고, 50 mM 인산완충액 (pH 7.0) 25 ㎖ 에 용해하였다. 이 용해액을, 50 mM 인산완충액 (pH 7.0) 으로 평형화한 아연 킬레이트 세파로스 CL-6B 칼럼 (아마샴 ·팔마시아 바이오테크사 제조) 23 ㎖ 에 부하하여, 그 완충액으로 충분히 세정한 후, 그 완충액에 0.3 몰 식염과 0.1 몰 이미다졸을 포함하는 용리액으로 PA 를 용출하였다. 용출액 17 ㎖ 를 PM-10 (아미콘 사 제조) 로 농축하고, 다시 농축액 3 ㎖ 를 세파크릴 S200 칼럼 (아마샴 ·팔마시아 바이오테크사 제조) 30 ㎖ 로 겔여과 크로마토그래피를 실시하여, 비활성 35000 단위/단백의 부분정제 PA 를 얻었다. 이 부분정제 PA (10 단위/㎖) 50 ㎕ 를, 50 mM 식염함유 0.1 몰 ·트리스염산 완충액 (pH 8.0) 0.5 ㎖ 에 첨가한 다음, 우리나스타틴 (1700 단위/㎖) 과 아프로티닌 (1700 단위/㎖ : 바이엘 사) 을 각각의 시험관에 첨가하여, 3 분간, 35 ℃ 에서 가온하였다. 이어서 두 시험관에 25 마이크로 ·몰의 합성기질 3145-V 0.5 ㎖ 를 첨가하여 30 분간, 35 ℃ 에서 가온하였다. 가온한 후, 20 % 아세트산 수용액 2 ㎖ 를 첨가하여 반응을 중지하였다. PA 에 의한 합성기질 3145-V 의 펩티드 가수분해를 형광광도계 (여기파장 380 nm, 형광파장 460 nm) 로 측정하고, 다음식에 따라 우리나스타틴과 아프로티닌에 의한 PA 활성의 저해율을 구했다.

PA 활성의 저해율 = (1 - 저해제 첨가군의 잔존 PA 활성/저해제 비첨가군의 PA 활성) ×100

결과를 표 6 에 나타낸다. 표 6 과 같이, 우리나스타틴에 의한 PA 활성의 저해율은 3 % 이하이며, 거의 없는 것으로 해석할 수 있다. 또, 플라스민에 대한 저해도 약하다고 보고되어 있다 (50 % 저해율 = 830 단위/㎖, 오오니시 하루오 외, 니찌야꾸리시, 81, 235-244, 1983). 한편, 아프로티닌은 30 % 이상의 저해를 가지며, 플라스미노겐에서 플라스민으로의 변환을 저해한다고 할 수 있다. 또한, 아프로티닌은, 상기 문헌에 플라스민도 강력하게 저해한다고 보고되어 있는 (50 % 저해율 = 6.4 단위/㎖) 점에서 플라스미노겐 활성화 인자/플라스민계에 의한 각막 상피 손상치유의 제 1 상의 기전을 완전하게 저지할 가능성이 매우 높다. 따라서, 각막 상피 손상의 치료제로서의 유효성은 아프로티닌보다 우리나스타틴이 훨씬 우수하다는 것이 명백하다.

우리나스타틴과 아프로티닌에 의한 인체 각막 상피세포성 플라스미노겐 활성화인자 활성 저해의 비교

저해율

우리나스타틴 (1700 U/㎖) 3 %아프로티닌 (1700 U/㎖) 32 %

실시예 6

당뇨병 랫트 각막 상피 창상에 대한 우리나스타틴의 치료효과

SD 계 수컷 랫트 (생후 7 주, 일본 찰즈리버 사로부터 구입) 를 입하한 후, 1 주간의 예비사육을 실시하였다. 생후 8 주에, 3 mM 시트르산 완충액 (pH 4.5) 에 용해한 스트렙토조토신 (STZ ; 시그마 사) 을 랫트 미정맥에서 투여 (60 ㎎/㎏) 하고, 다시 2 주간 사육하여 당뇨병에 나환시켰다. STZ 투여 11 일후에 프리테스트 3a (와꼬쥰야꾸샤 제조) 를 이용하여 랫트의 뇨중의 포도당량을 측정하여 당뇨병 모델작성을 확인하였다. STZ 투여 2 주후, 넴부탈 주사액 (다이나보트) 을 복강내 투여 (40 ㎎/㎏) 하여 전신마취하고, 안과용 표면마취제 페녹실 0.4 % 액 (산뗀세이야꾸샤 제조) 을 1 방울 점안한 후, 윤곽에서 중앙까지의 각막 상피 전층 박리를 실시하였다. 각막 상피 전층 박리 직후, 1 % (w/v) 플루오레세인나트륨 수용액을 1 방울 점안하고, 생리식염수로 세정한 후, 실체현미경하에서 창상부위의 염색을 확인하여, 비디오 기록을 실시하였다. 우리나스타틴 (로트 PW-2 : 50 ∼ 500 ㎍/㎖), 랫트 혈청 및 히알레인미니 0.3 (산뗀세이야꾸샤 제조) 의 각 피험물질은, 각막 상피 전층 박리 직후로부터, 1 일 6 회, 약 2 시간 간격으로 양쪽 눈에 5 ㎕ 씩 점안하고, 1 군 4 마리로 하여 두눈을 이용하였다. 또, 생리식염수를 대조로 하였다. 플루오레세인나트륨 염색에 의한 창상부위 면적의 비디오 기록을 각막 상피 박리 직후, 8 시간후, 24 시간후, 32 시간후, 48 시간후, 72 시간후의 6 회 실시하고, 올림푸스 비디오 마이크로 미터 VM-50 (NIH 이미지 1.61) 로 창상부위면적의 계측을 실시하였다.

각막 상피 창상 치유효과는, 각막 상피 전층 박리 직후의 창상부위 면적치 (100 %) 에 대한 시간의 경과에 따른 측정치를 비율로 산출하여, 표 7 에 나타낸다. 표 7 의 결과에서 우리나스타틴이 다른 제에 비교하여 각막 상피 손상 치유효과가 매우 우수하다는 것이 판명되었다.

당뇨병 랫트 각막 손상 모델에 대한 우리나스타틴의 치유효과

	대조구	우리나스타틴(500 ㎍/㎖)	우리나스타틴(50 ㎍/㎖)	랫트 혈청(3 배 희석)	히알레인미니 0.3
0 시간	100 %	100 %	100 %	100 %	100 %
8 시간	100 ±20.7	91.5 ±19.2*	103.2 ±7.0	100 ±8.0	89.9 ±3.7
24 시간	78.9 ±12.4	55.0 ±13.5**	63.6 ±13.3	65.7 ±6.2	64.1 ±10.5
32 시간	51.5 ±6.6	31.1 ±13.0**	43.3 ±12.2	51.4 ±12.5	48.8 ±12.1
48 시간	13.7 ±4.4	5.2 ±5.9*	14.3 ±10.8	17.3 ±12.3	15.6 ± 6.8
72 시간	0	0.1 ±0.2	2.0 ±3.9	3.8 ±6.2	0.4 ±0.6

각막 상피 박리직후 (0 시간) 의 각막 손상부위의 면적을 100 % 로 한다.

* p ＜ 0.05, ** p ＜ 0.01

실시예 7

자외선 조사에 의한 인체 각막 상피세포 장애에 대한 우리나스타틴의 효과

인체 각막 상피세포 HCEC 를 1 % 소태아 혈청을 포함하는 SHEM 개변배지에서 세포수 1 ×10⁵/㎖ 로 조정하고, 이 세포조정액 500 ㎕ 을 24 웰 멀티 플레이트 (코닝 사 제조) 의 각 웰에 파종하여, 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터 내에서 16 ∼ 17 시간 배양하였다. 그 후, 배양상청을 모두 제거하고, 시료를 포함하는 10 % 소태아 혈청-SHEM 개변배지 500 ㎕ 를 각 웰에 첨가하여, 다시 동일 조건에서 2 시간 배양하였다. 시료와 접촉배양한 후, 이 배양상청액을 모두 제거하여, 시료가 멀티 플레이트내에 거의 남지 않는 상태로 하였다.

이 상태의 멀티 플레이트내에 살상력 최대의 자외선 UV-C 조사를 20 ∼ 30 ㎝ 의 거리에서 5 초간 실시하였다. UV-C 조사후, 앞에서와 동일한 시료를 포함하는 10 % 소태아 혈청-SHEM 개변배지 500 ㎕ 를 각 웰에 재첨가하여, 동일 조건에서 16 ∼ 17 시간 배양하였다. 그 후, 각 웰의 배양상청을 제거하고, 박리액 (0.25 % 트립신 (w/v), 0.02 % EDTA 를 포함하는 PBS) 100 ㎕ 를 첨가하여, 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터 내에서 6 분간 보온하였다. 보온후, 다시, 피페팅을 하여 생존하고 있는 상피세포를 충분히 박리 ·분산하고, 여기에 0.1 % (w/v) 트리판블루 염색액 100 ㎕ 를 첨가하여 세포염색한 후, 즉시, 혈구계산판으로 생세포수를 계측하였다. 인체 각막 상피세포의 자외선 장애에 대한 시료의 방어효과는, 이하와 같이 산출하였다.

방어효과 (%) = (시료 첨가군의 생세포수 ÷시료 무첨가군의 생세포수) ×100

결과를 8-1, 8-2 에 나타낸다.

자외선 조사에 의한 인체 각막 상피세포 장애에 대한 우리나스타틴의 효과

시료 (농도)	방어효과 (%)
우리나스타틴 (0.3 ㎛)	155 ±7.0**
우리나스타틴 (3 ㎛)	211 ±8.3**
아프로티닌 (0.3 ㎛)	86.6 ±13
아프로티닌 (3 ㎛)	77.2 ±5.1

** p ＜ 0.01

자외선 조사에 의한 인체 각막 상피세포 장애에 대한 우리나스타틴의 효과

시료 (농도)	방어효과 (%)
우리나스타틴 (0.3 ㎛)	140
인체 락토페린 (2 mM) 시그마 사	101
메실산데페록사민 (2 mM) 니뽄찌바가이기샤	94
비타민 E (아세트산 DL-α-토코페롤, 20 ㎛)간또카가꾸샤	107
글루타티온 (2 mM) 시그마 사	95
시스테인 (2 mM) 와꼬쥰야꾸샤	46
비타민 C (아스코르브산, 2 mM) 니뽄로슈샤	104

표 8-1 에서 명확한 바와 같이, 우리나스타틴 (로트 67B8) 0.3 ㎛ 및 3 ㎛ 을 10 % 소태아 혈청-SHEM 개변배지에 첨가하여 접촉배양한 세포는, 자외선 조사전에 배양상청액을 제거했기 때문에, 자외선 조사시에는 우리나스타틴이 거의 없는 상태임에도 불구하고, 무첨가나 아프로티닌 첨가군에 비해 명확하게 생세포수가 많았다. 그 생세포수는 우리나스타틴 0.3 ㎛ 첨가군에서는 자외선 비조사의 세포증식과 거의 동등하며, 자외선에 의해 발생하는 모든 장애로부터 세포를 거의 완전하게 방어했다고 이해할 수 있다.

우리나스타틴 3 ㎛ 첨가군에서는, 비조사의 세포보다 생세포수가 증가되었다. 이것은, 자외선에 대한 방어효과에 더하여, 실시예 2 에서 나타낸 것과 동일한 세포증식작용이 발현한 것으로 생각되었다.

한편, 아프로티닌에 의한 방어효과는 보이지 않고, 오히려 자외선의 살상력을 증가하는 경향이 보였다. 따라서, 우리나스타틴의 방어 기전은, 아프로티닌에 의해 저해되는 기지의 프로테아제에 대한 저해활성에 의한 것은 아님이 명백해졌다.

또한, 그 효과를 기존의 유리 라디칼 소거 (억제) 제와 비교한 결과, 표 8-2 에 나타낸 바와 같이, 우리나스타틴이 매우 유효산 효과를 나타냄이 명백해졌다.

시험관 속에서의 우리나스타틴의 유리 라디칼 소거 (억제) 작용의 50 % 유효농도는 약 1 ㎛ 로 보고되어 있다 (이가꾸노 아유미, 142, 895-896, 1987). 그러나, 본 실시예에서 효과를 나타낸 우리나스타틴의 농도는, 접촉배양시에 0.3 ㎛ 이며, 유리 라디칼이 다량으로 발생하는 자외선 조사시에는, 조사전에 우리나스타틴이 함유된 배양상청액을 제거했기 때문에, 그 수 % 이하의 농도로 저하되어 있다고 추정된다. 만약 조사시에 우리나스타틴이 5 % 잔존했다 하더라도 0.015 ㎛ 이며, 이러한 극미량이라도 우리나스타틴은 자외선 장애에 대한 방어효과를 나타냄을 알 수 있다.

즉, 우리나스타틴의 자외선 조사장애에 대한 방어효과의 작용 기전은, 기지의 유리 라디칼 소거 (억제) 작용 이외의, 미지의 작용에 의한 요인이 극히 크다는 것을 알 수 있었다.

또, 우리나스타틴은, 리소좀막의 안정화 작용을 갖는 것이 보고되어 있다. 인체 각막 상피세포의 자외선 조사장애의 방어작용은, 우리나스타틴에 의한 상피세포막의 보호효과라고도 생각되었다.

실시예 7 의 각 세포군의 막파괴를 조사하기 위해, 자외선 조사전후의 각 세포군의 배양상청액중의 젖산 탈수소효소 (LDH) 량을 측정하였다. 그 결과, 대조구, 우리나스타틴 첨가군, 아프로티닌 첨가군 모두 LDH 활성을 확인할 수 없었다.

DNA 장애에 의한 LDH 결손이 고려되므로, 확인을 위해, 각 세포군을 각각 Tween 80 계면활성제로 막용해하여, 그 라이세트에 대해 LDH 활성을 조사하였다. 그 결과, 모든 세포군에서 LDH 활성의 정상치가 확인되었다. 이 점에서, 실시예 7 의 자외선 조사량은 세포막 파괴까지 이르지 않았음을 알 수 있었다. 우리나스타틴에 의한 상피세포의 자외선 조사장애의 방어효과는, 우리나스타틴의 기지의 작용 기전인 라이소좀막의 안정화 작용과 유사한 세포막 보호효과에 의한 것이 아님을 알 수 있었다.

이상에서, 우리나스타틴에 의한 인체 각막 상피세포의 자외선 조사장애의 주요한 방어작용 기전은, (1) 유리 라디칼 소거 (억제) 작용, (2) 프로테아제 저해활성, (3) 라이소좀막의 안정화 작용, 의 3 가지 기지의 작용 기전 모두 해당하지 않는 미지의 것으로 생각되었다.

실시예 8

파장 193 nm 의 자외선 조사에 의한 인체 각막 상피세포 장애에 대한 우리나스타틴의 효과

인체 각막 상피세포 HCEC 를 10 % 소태아 혈청-SHEM 개변배지에서 세포수 1 ×10⁵/㎖ 로 조정하고, 이 세포조정액 500 ㎕ 을 24 웰 멀티 플레이트 (코닝 사 제조) 의 각 웰에 파종하여, 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터 내에서 16 ∼ 17 시간 배양하였다. 배양 후, 배양상청을 모두 제거하고, 시료를 포함하는 10 % 소태아 혈청-SHEM 개변배지 500 ㎕ 를 각 웰에 첨가하여, 다시 동일 조건에서 2 시간 접촉배양하였다. 시료와 접촉배양후, 배양상청을 모두 제거하고, 시료가 멀티 플레이트내에 거의 남지 않는 상태로 하였다.

이 상태의 멀티 플레이트내에 193 nm 의 자외선 조사를 10 ∼ 30 ㎝ 의 거리에서 5 초간 실시하였다. 조사후, 앞에서와 동일한 시료를 포함하는 10 % 소태아 혈청-SHEM 개변배지 500 ㎕ 를 각 웰에 재첨가하고, 동일 조건에서 16 ∼ 17 시간 배양하였다. 그 후, 실시예 7 과 동일한 방법으로, 생세포수를 계측하고, 우리나스타틴 (로트 67B8), 아프로티닌에 의한 인체 각막 상피세포의 자외선 장애의 방어효과를 산출하였다. 결과를 표 9 에 나타낸다. 우리나스타틴이 농도에 의존한 방어효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 한편, 아프로티닌은 방어효과를 나타내지 않았다.

파장 193 nm 의 자외선 조사에 의한 인체 각막 상피세포 장애에 대한 우리나스타틴의 효과

시료 (첨가농도 ㎛)	방어효과 (%)
우리나스타틴 (0.3)	134
우리나스타틴 (3.0)	145
아프로티닌 (0.3)	94
아프로티닌 (3.0)	83

실시예 9

약제성 인체 각막 상피세포 장애에 대한 우리나스타틴의 효과

인체 각막 상피세포 HCEC 를 10 % 소태아 혈청-SHEM 개변배지에서 세포수 1 ×10⁵/㎖ 로 조정하고, 이 세포조정액 500 ㎕ 을 24 웰 멀티 플레이트 (코닝 사 제조) 의 각 웰에 파종하여, 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터 내에서 24 시간 배양하였다. 그 후, 배양상청을 제거하고, PBS(-) (닛쓰이세이야꾸샤 제조) 500 ㎕ 로 세포를 2 회 세정한 후, 배지를 무혈청 배지 500 ㎕ 로 교환하여, 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터내에서 12 시간 배양하였다. 배양후, 배양상청을 제거하고, PBS(-) 로 세포를 2 회 세정한 후, 우리나스타틴 (로트 67B8) 을 포함하는 무혈청 배지 500 ㎕ 를 첨가하여 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터 내에서 12 시간 배양하였다. 배양후, 배양상청을 제거하고, PBS(-) 로 2 회 세정한 후, 녹내장 치료용 점안약 레스큐라 (주약 이소프로필우노프로스톤 0.12 ㎎/㎖ 함유, 우에노세이야꾸 제조) 를 무혈청 배지에서 이소프로필우노프로스톤을 0.05 ㎎/㎖ 가 되도록 희석한 액 500 ㎕ 를 첨가하여 실온에서 10 분간 방치하였다. 방치한 후, 배양상청을 회수하여, 세포장애도의 지표인 LDH 활성을 측정하였다. 결과를 표 10 에 나타낸다. 우리나스타틴의 첨가농도에 의존한 세포장애 방어효과를 확인할 수 있었다.

실시예 10

n-헵탄올 유발 집토끼 각막 상피 손상에 대한 우리나스타틴의 치유효과

동물은 체중 2.5 ∼ 3.0 ㎏ 의 일본 백색 집토끼 (기따야마 라베스) 를, 1 주간 이상 예비사육한 후, 각막 등에 이상이 없는 것을 확인하여 사용하였다. 실온 : 23 ±3 ℃, 온도 : 50 ±20 % 로 설정한 사육환경하에서 실험을 실시하였다. 집토끼에게 염산케타민을 근육내 투여하여 전신마취를 실시한 후에, 오른쪽 눈에 0.4 % 염산옥시부프로카인을 점안하여 국소마취한 후, n-헵탄올을 적신 직경 6 mm 의 여과지를 각막 중앙부에 60 초간 접촉시켜, 각막 상피를 박리하여 손상을 유발하였다. 시료액의 점안은 박리직후로부터 2 시간 간격으로 6 회 (50 ㎕/1 회), 2 일째는 박리 24 시간후로부터 2 시간 간격으로 6 회 점안하였다. 또, 생리식염액를 대조액으로 하였다. 각막 상피 손상부분의 면적은, 박리직후, 박리후 12, 24, 30, 36 및 48 시간에 0.5 % 플루오레세인나트륨액 점안에 의해 손상부분을 염색하여, 사진촬영한 후, 측정하였다.

각막 상피 치유효과를 표 11 에 나타낸다. 박리 12 ∼ 48 시간후까지 우리나스타틴 1500 U/㎖ 및 6000 U/㎖ 의 점안은 생리식염액 점안군과 비교하여, 각막 손상치유를 촉진하는 것이 명확해졌다.

각막 상피 박리직후 (0 시간) 의 손상부위의 면적을 100 % 로 한다.

각 값은 평균치 ±표준편차를 나타낸다 (n=7).

* p ＜ 0.05, ** p ＜ 0.01, *** p ＜ 0.001 vs 대조구

실시예 11

자외선 조사에 의한 인체 결막 상피세포 장애에 대한 우리나스타틴의 효과

인체 결막 상피세포 ATCC CCL 20.2 를 10 % 소태아 혈청이 함유된 DMEM/F 12 배지에서 1 ×10⁵/㎖ 로 조정하고, 이 세포조제액 500 ㎕ 을 24 웰 멀티 플레이트 (스미또모 베크라이트샤 제조) 의 각 웰에 파종하고, 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터 내에서 16 ∼ 17 시간 배양하였다. 그 후, 배양상청을 모두 제거하고, 시료 (우리나스타틴, 로트 67B8, 종농도 100 ㎍/㎖) 를 첨가한 10 % 소태아 혈청이 들어 있는 DMEM/F12 배지 500 ㎕ 를 각 웰에 첨가하고, 다시 동일 조건에서 배양하였다. 시료와 접촉배양후, 이 배양상청을 모두 제거하였다. 이 상태의 멀티 플레이트에 자외선 UV-B (312 nm, 100 mJ/㎠) 를 조사하였다. UV-B 조사후, 10 % 소태아 혈청이 함유된 DMEM/F12 배지 500 ㎕ 를 각 웰에 첨가하고, 동일 조건에서 16 ∼ 17 시간 배양하였다. 그 후, WST-8 용액 (Cell Counting Kit-8, 도닌가가꾸샤 제조) 을 배지에 대해 1/10 량 첨가하여, 37 ℃ 에서 4 시간 반응시킨 후, 세포내 탈수소산소에 의해 생성된 수용성 포르마잔 450 nm 에서의 흡광도의 측정을 실시하여 생세포수를 측정하여, 실시예 7 과 동일한 방법으로 방어효과를 산출하였다. 결과를 표 12 에 나타낸다. 우리나스타틴이 자외선 장애에 대한 방어효과를 나타냄이 밝혀졌다.

자외선 조사에 의한 인체 결막 상피세포 장애에 대한 우리나스타틴의 효과

	세포증식(A450nm 평균 ±SD)	방어효과(%)
우리나스타틴(0.3 ㎛)	0.556 ±0.015	173
우리나스타틴(3 ㎛)	0.765 ±0.009	238

실시예 12

약제성 인체 결막 상피세포 장애에 대한 우리나스타틴의 효과

48 웰 플레이트에 10 % 소태아 혈청이 함유된 DMEM/F12 배지에서 현탁한 인체 결막 상피세포 ATCC CCL 20.2 (1 ×10⁵/㎖) 를 300 ㎕ 분주하여, 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터 내에서 배양하였다.

48 시간 후, 세포가 완전히 융합된 것을 확인하여, 상청을 제거, PBS(-) 에서 2 회 세정한 후, 혈청 무첨가의 DMEM/F12 배지에 현탁하였다. 37 ℃, 5 % CO₂에서 12 시간 인큐베이트한 후, 다시 상청을 제거, PBS(-) 에서 2 회 세정하여, PBS(-) 에서 각 농도로 희석한 우리나스타틴 (로트 67B8) 을 300 ㎕ 첨가하였다. 37 ℃, 5 % CO₂에서 12 시간 인큐베이트한 후, 다시 상청을 제거, PBS(-) 에서 2 회 세정하여, 녹내장 치료용 점안약 티모프톨 (주약 말레산 티모롤 50 ㎎/㎖ 함유, 반유세이야꾸샤 제조) 을 말레산티모롤 농도 1.25 ㎎/㎖ 가 되도록 PBS(-) 로 희석한 액 300 ㎕ 를 첨가하였다. 20 분후, 다시 플레이트를 PBS(-) 로 2 회 세정하고, DMEM/F12 를 300 ㎕ 첨가하였다. 12 시간후, WST-8 를 첨가하여, 37 ℃ 에서 2 시간 반응시키고, 450 nm 에서의 흡광도를 측정하여 생세포수를 측정하였다. 결과를 표 13 에 나타낸다. 우리나스타틴이 농도에 의존한 방어효과를 나타내는 것이 명확해졌다.

약제성 인체 결막 상피세포 장애에 대한 우리나스타틴의 효과

우리나스타틴 첨가농도 (㎍/㎖)	세포증식 (A450nm 평균 ±SD)
control (약제 무첨가)	0.738 ±0.025
0	0.277 ±0.090
1	0.577 ±0.120
10	0.686 ±0.065
100	0.747 ±0.096

n=6

실시예 13

인체 결막 상피세포의 뮤신 1 생산에 미치는 우리나스타틴의 효과

인체 결막 상피세포 (ATCC CCL 20.2) 를 10 % 소태아 혈청이 함유된 DMEM/F12 배지 (기브코샤 제조) 에 현탁하고, 96 웰 플레이트에 5000 세포/웰로 파종하여, 하룻밤동안 37 ℃, 5 % CO₂인큐베이터 내에서 배양하고, 세포를 플레이트에 접착시킨 후, 시료를 첨가한 배지로 교환하여 다시 2 일간 배양하였다. 그 후, 뮤신 1 생산량을 이하의 효소면역법으로 측정하였다. 70 % 에탄올로 세포를 고정한 후, 1 웰 당 250 ㎕ 의 1 % 소혈청 알부민이 함유된 PBS 를 첨가하여, 실온에서 2 시간 방치하였다. PBS 로 희석한 항 뮤신 1 마우스 항체 (파민겐사 제조) 를 첨가하여, 실온에서 2 시간 반응시킨 후, PBS 로 3 회 세정하였다. PBS 로 희석한 페르옥시다아제 표식 항마우스 IgG 항체 (산타크루즈 바이오테크놀로지 사 제조) 를 첨가하여, 실온에서 2 시간 반응시킨 후, PBS 로 4 회 세정하였다. 페르옥시다아제의 기질액 (0.012 % 과산화수소, 1.6 ㎎/㎖ 올트페닐렌디아민이 함유된 0.1 M 인산완충액, pH 6.2) 200 ㎕ 를 첨가하여, 실온에서 20 분간 반응시켜, 4.5 N 황산 50 ㎕ 를 첨가하여 반응을 정지하였다. 마이크로 플레이트 리더 (reader) 로 흡광도 (490 nm - 660 nm) 를 측정함으로써 뮤신 1 생산량을 측정하였다. 결과를 표 14 에 나타낸다. 우리나스타틴을 포함하지 않는 배지에서 배양한 대조의 흡광도의 평균치를 100 % 로 하여 나타냈다. 우리나스타틴은 농도에 의존한 뮤신 1 생산촉진효과를 나타내는 것이 명확해졌다.

인체 결막 상피세포의 뮤신 1 생산에 미치는 우리나스타틴의 효과

시료 (첨가농도 ㎍/㎖)	뮤신 1 생산량 (% ±SE)
무첨가 (0)	100
우리나스타틴 (50)	111 ±6.0
우리나스타틴 (200)	123 ±6.8*

n=5 * p ＜ 0.05

실시예 14

랫트 강제개검(强制開瞼) 송풍 드라이 아이 모델에서의 각결막 상피 장애에 대한 우리나스타틴의 효과

생후 6 주된 Sprague-Dawley 계 수컷 랫트를 이용하였다. 그리고, 미리 전안부, 안검에 이상이 없음을 확인하였다. 랫트 10 마리의 왼쪽 눈에 우리나스타틴 용액 (로트 67B8 를 500 ㎍/㎖ 이 되도록 생리식염액으로 희석한 액) 을 1 회 5 ㎕, 1 일 6 회, 1 주간 점안하였다. 오른쪽 눈에는 대조로서 생리식염액을 동일하게 점안하였다. 최종점안후 2 시간후에 이하의 방법으로, 각결막을 건조하여, 각결막 상피 장애를 유발하여, 장애에 대한 우리나스타틴의 효과를 평가하였다.

상기 점안처치한 랫트 (10 마리) 를 펜트바루비탈 40 ㎎/㎏ (복강내 투여) 마취하에서, 눈을 강제적으로 충분히 개검시켜, 눈의 정면 6 ㎝ 의 거리에서 드라이어에 의한 송풍을 15 분간 실시하여, 바람을 전안부 전체에 닿도록 함으로써, 눈물을 증발시키고, 각결막을 건조하여, 각결막 상피 장애를 유발하였다. 장애유발후, 1 % 로즈벵갈 용액 5 ㎕ 를 점안하고, 생리식염액으로 충분히 세정하여, 각결막의 뮤신 결손부를 염색한 후, 과잉량의 펜트바루비탈 주사액의 정맥 주입에 의해 안락사시킨 후, 구결막부를 포함하여 안구를 상처나지 않게 주의깊게 적출하여, 즉시 로즈벵갈로 염색된 뮤신으로 덮이지 않은 장애부위를 관찰하였다. 이 때, 로즈벵갈 양성의 양은, 드라이 아이 진단기준 (드라이 아이 연구회, 1995) 에 따라, 구결막의 비(鼻)측, 이(耳)측 및 결막에 대해 염색의 정도를 각각 0 ∼ 3 점, 합계 9 점으로 스코어화하였다. 수치가 높을수록 각결막 상피 장애가 심각하다. 이 스코어화는 동일 검자가 모두 실시하고, 또 좌우 두눈의 구별이 되지 않도록 마스크하여 평가하였다.

결과를 표 15 에 나타낸다. 500 ㎍/㎖ 우리나스타틴 점안군은, 생리식염액 점안군과 비교하여, 건조에 의한 각결막 상피 장애가 매우 억제되어 있다 (P ＜ 0.05). 따라서, 우리나스타틴은 드라이 아이에서의 각결막의 뮤신 피복장애를 억제함이 밝혀졌다.

제제예 1

우리나스타틴 (비활성 4000 ∼ 2000 unit/㎎ 단백) 50 ㎎ 단백

클로로부탄올 10 ㎎

염화나트륨 240 ㎎

인산수소 2 나트륨 240 ㎎

인산 2 수소나트륨 200 ㎎

상기 각 성분을 멸균증류수 100 ㎖ 에 용해한 후, 멸균여과하여, 멸균한 안과용 용기에 10 ㎖ 씩 충전하여, 점안제로 하였다.

본 발명의 각막 상피 장애증 적용제는, 인체를 포함하는 포유동물의 각막 상피 장애증, 즉 허피스성 각막염, 세균성 각막궤양, 신경마비성 각막염, 당뇨병성 각막증, 물리적, 화학적 장애에 기인하는 각막 상피 장애증의 예방제 및 치료제로서 유용하다.

또, 본 발명의 자외선 각결막 상피 장애증 적용제는, 자외선에 의한 각결막 상피 장애증의 예방제 및 치료제로서 유용하다.

또, 본 발명의 각막절개술 시행후 각막 상피 장애증 적용제는, 각막절개술 시행후의 각막 상피 장애증에 적용하기 위한 각막절개술 시행후 각막 상피 장애증의 예방제 및 치료제로서 유용하다.

또한, 본 발명의 약제성 각결막 상피 장애증 치료제는, 부작용으로서 존재하는 각결막 상피 장애작용을 가는 안과용제의 해당 부작용을 소실시키고, 해당 안료용제를 유효하게 적용시키는 약제성 각결막 상피 장애증의 치료제로서 유용하다.

그리고, 본 발명의 드라이 아이 적용제는, 드라이 아이의 예방제 및 치료제로서 유용하다.

Claims (5)

1. 각막 상피 장애증을 예방 및/또는 치료하기 위한 각막 상피 장애증 적용제로서, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 각막 상피 장애증 적용제.
2. 자외선에 의한 각결막 상피 장애증을 예방 및/또는 치료하기 위한 자외선 각결막 상피 장애증 적용제로서, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 자외선 각결막 상피 장애증 적용제.
3. 각막절개술 시행후의 각막 상피 장애증을 예방 및/또는 치료하기 위한 각막절개술 시행후 장애증 적용제로서, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 각막절개술 시행후 장애증 적용제.
4. 안과용 약제의 투여로부터 기인하는 각결막 상피 장애증을 치료하기 위한 약제성 각결막 상피 장애증 치료제로서, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 약제성 각결막 상피 장애증 치료제.
5. 드라이 아이 (dry eye) 를 예방 및/또는 치료하기 위한 드라이 아이 적용제로써, 우리나스타틴을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 드라이 아이 적용제.