CN1291898A - 用于角膜上皮疾病的药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含有尿抑素作为活性成分的药物,它可用于预防和治疗角膜上皮疾病、光角膜疾病、术后角膜上皮疾病、药物诱发的角膜上皮疾病和干眼病。

Description

用于角膜上皮疾病的药物

技术领域

本发明涉及一种包含尿抑素(urinastatin)作为活性成分的治疗组合物，更具体的是涉及供防治角膜上皮疾病、UV-诱发的角结膜上皮疾病、角膜切除术后角膜上皮并发症、药物诱发的角结膜上皮疾病和干眼病的治疗组合物。

背景技术

角膜是位于眼球前极处晶状体前房上的透明装置，具有依次排列的层状结构，该层状结构由上皮、Bowman膜、基质、Dexcemet膜和内皮构成。结膜是角膜的延续，覆盖了眼球的表面和眼睑的内表面。形态学上结膜可分类为眼睑结膜、穹窿结膜和球结膜，但在组织学上，它由上皮层和基质层构成。本说明书里，角膜和结膜有时共同称为“角结膜”。

据信，角结膜疾病的发生是其上皮受损的结果。从病因学上来说，角结膜疾病可归因于某些内源疾病，如疱疹性角膜炎、细菌性角膜溃疡、神经麻痹角膜炎、糖尿病性角膜病、Sjogren综合症，Stevens-Johnson综合症、干性角结膜炎(干眼病)等，或归因于外源疾病，如手术后、药物诱发、创伤和贴眼睛透镜佩戴者的疾病，或由物理或化学损伤引起的疾病。

在这类角结膜疾病中，角膜上皮损伤是角膜的事情，因为，根据病因学，这种损伤可能发展成难治的角膜疾病，其中上皮不可能再生，结果是视力丧失或致盲。

为了在这类疾病中恢复视力，必须迅速发生角膜上皮完整性的正常再生和修复。

角膜上皮损伤的治愈机理由1-3阶段构成。第一阶段由上皮细胞粘附、伸展和迁移构成，第二阶段的特征是上皮细胞的有丝分裂增殖，第三阶段是上皮细胞分化，上皮依次排列的层状结构通过第三阶段而恢复。

角膜上皮创伤愈合中已知的调节／控制因子有纤连蛋白、透明质酸、IL-6、表皮生长因子(EGF)等，它们可促进第一阶段的上述过程。此外，物质P与EGF或胰岛素样生长因子(IGF-1)联合，可以促进上皮细胞的伸展和迁移。

作为促进第二阶段上皮细胞增殖的物质，已知有EGF、FGF(成纤维细胞生长因子)、角化细胞生长因子(KGF)和肝细胞生长因子(HGF)等[Gospodarowicz，D．等，Exp．Eye Res．，25，631-649(1977)；Sotozono，C．等：Exp．EyeRes．，59，385-392(1994)；Wilson，S．E．等：Ophthalmol．Vis．Sci．，34，2544-2561(1993)]。

已知维生素A可促进第三阶段的上皮细胞分化。

在这类物质中，对于角膜上皮损伤临床上有作手术后治疗药物的是纤连蛋白和透明质酸的局部制剂。业已证实，纤连蛋白和透明质酸促进了角膜上皮细胞的粘附和伸展，特别是极低浓度的纤连蛋白显示出明显的效果。

但是，纤连蛋白和透明质酸的作用主要表现于涉及角膜上皮损伤愈合的第一阶段过程中，它们对于第二阶段上皮细胞有丝分裂增殖几乎没有作用。此外，诸如EGF、FGF、KGF和HGF等生长因子的风险是会引起新生血管形成，这极大地抑制了它们作为药物的应用[Youji Mitsui等：新生血管形成的机理；OphthalmologyNew Insight，第3卷，眼内血管疾病，8-20，Medical View Co．(1994)]。

事实上，对EGF和FGF引起的新生血管形成是有报道的[Schweigerer，L．：Z．Kardiol．，78，12-15(1989)；Taniguchi，E．等：Nippon Ganka GakkaiZasshi，95，52-58(1991)；Nezu，E．等：Jpn．J．Ophthalmol．，36，401-406(1992)]。此外，在制备这些生长因子中遇到的相当多困难也实质上阻碍了它们作为药物的发展。

因此，用作角膜上皮疾病治疗药物的活性成分，至今所有的已知化合物都不令人满意，人们确实需要更好的化合物。

同时，多年来人们怀疑包括胶原酶的蛋白酶与角膜溃疡的发病机理显著有关[Motokazu Itoi：临床眼科学杂志，24，879-882(1970)]。事实上，据报道，诸如半胱氨酸等胶原酶抑制剂抑制了实验性角膜溃疡，其临床应用已有报道[Brown，S．I．等：Arch．Opthalmol．，82，95-97(1969)；Brown，S．I．等：Arch．Ophthalmol．，83，355-353(1970)；Junzo Hirano等：临床眼科学杂志，29，49-54(1975)；Hajime Nunomura等：临床眼科学杂志，71，88-90(1975)]。但是，它们提供的治疗结果不如需要的那样显著。

同时，上皮细胞的迁移对于角膜上皮损伤愈合的第一阶段是如此的重要，以致于通常相信，蛋白酶局部化于伸展细胞顶末端对于所述细胞迁移是必须的。因此，角膜上皮细胞的扩展和迁移与蛋白酶的关系迄今已用蛋白酶抑制剂作了研究。

Morimoto等用各种蛋白酶抑制剂进行研究，发现亮肽素(硫醇蛋白酶抑制剂)、抑肽酶(丝氨酸蛋白酶抑制剂)和卵α₂-巨球蛋白(ovoα₂-macroglobulin，一般的蛋白酶抑制剂)恒定地抑制了角膜上皮细胞的伸展[Keisuke Morimoto等：胶原研究小组研究文摘，35，170-173(1987)]。

Zieske等的著作赞同了上述发现，它们使用抑胃肽(酸性蛋白酶抑制剂)、1，10-二氮菲(金属蛋白酶抑制剂)、抑肽酶(丝氨酸蛋白酶抑制剂)和苯甲基磺酰氟作为蛋白酶抑制剂[Zieske，J．D．＆ Bukusoglu，G．：眼科学和视力科学研究32，2073-2078(1991)]。无论如何都提出蛋白酶抑制剂对于角膜上皮损伤的愈合具有负效应。

但是，已知某些蛋白酶抑制剂，如蛋白水解性蛋白酶抑制剂抑肽酶、α₁-抗胰蛋白酶等，可能作为人成纤维细胞和人内皮细胞的生长因子起作用[Ogawa，M．等：Res Commun．CHem．Pathol．Pharmacol．50，155-158(1985)；Scott，G．K．等：Biol．Chem．Hoppe-Seyler，369，131-135(1988)；Mckeehan，W．L．等：J．Biol．Chem．，261，5378-5383(1986)]。

此外，已知血纤维蛋白溶酶原活化剂／血纤维蛋白溶酶系统对于涉及所述角膜溃疡发生的胶原酶的产生是必不可少的[Berman，M．等：Invest．Ophthalmol．Vis．Sci．，19，1204-1221(1980)]。因此，业已推测血纤维蛋白溶酶抑制剂对修复角膜上皮有愈合作用。

多年来人们已知抑肽酶是一种有效的血纤维蛋白溶酶抑制剂[Feeney，R．E．等：J．Biol．Chem．，25，1957-1960(1969)]。确实，抑肽酶已或多或少的成功地用于治疗人角膜上皮损伤[日本审定公告(Japanese Kokoku Publication)Hei-7-72139；USP 4，849，406；EP 0 223 254 B1；Salonen，E．M．等：Acta Ophthalmologia，65，3-12(1987)]。

但是，如上所述，抑肽酶更确切地是以抑制方式作用于角膜上皮细胞的迁移，这对于治疗角膜上皮损伤是极为重要的[Zieske，J．D．＆Bukusoglu，G．：Investigative Ophathalmology ＆ Visual Science，32，2073-2078(1991)]，另外，该物质具有引起新生血管形成的危险，因此它不能作为治疗药通常用于修复角膜上皮。

最近人们已明白，维持血纤维蛋白溶酶原活化剂的活性对于角膜创伤愈合是很重要的[Morimoto，K．等：血栓和止血69，387-391(1993)]。因此很需要不以抑制方式对血纤维蛋白溶酶和血纤维蛋白溶酶原活化剂起作用，或即使起作用也只有温和的抑制活性或基本上没有抑制作用的角膜上皮疾病治疗药物。抑肽酶是一种有效的血纤维蛋白溶酶抑制剂的事实，也是该物质未被开发作为药物的原因之一。

有报道使用卵巨球蛋白(ovomacroglobulin)治疗难治的角膜疾病，取得了有限的成功，卵巨球蛋白是一种蛋白水解性蛋白酶抑制剂，它强烈抑制包括胶原酶在内的其它蛋白酶[Ryuji kamata等：临床眼科学杂志，45，233-237(1991)；Ryuji Kamata等：Nippon-no-Ganka，64，955-960(1993)]，但就其它理由而言，它是衍生于鸡蛋白的外源性蛋白质，采用卵巨球蛋白具有抗原性和过敏反应之风险，所以该物质不能成功地临床用于角膜上皮疾病的治疗药物。

这些报告提出，蛋白水解性蛋白酶抑制剂可能促进人角膜上皮细胞的增殖，从而对创伤的痊愈有效，但由于它们抑制血纤维蛋白溶酶和血纤维蛋白溶酶原活化剂，另外具有诸如新生血管形成和抗原性的致命副作用，人们一直需要发现一种可开发成为药品给予人体的更令人满意的化合物。

同时，在角结膜炎疾病中，紫外辐射所致的疾病是当今注目的焦点。在眼睛暴露于太阳光辐射的场合，如海水浴，紫外射线撞击角膜上皮，并通过各种因子引起角结膜上皮疾病。

作为UV-引起的角膜上皮疾病，下列是已知的。

伴有坏死和腐蚀的光角膜炎[Bergmanson J．P．：光角膜炎中的角膜损伤-为什么这样痛?Optom．Vis．Sci．，67，407-413，1990]；“雪盲”，特征是疼痛、畏光和睑痉挛；UV-引起的白内障，其中涉及许多病因因素[Hightower K．R．：紫外辐射在白内障形成中是危险因素的证据综述；Doc．Ophthalmol．，88，205-220，1994]；与朗格汉斯(Langerhans)细胞损伤有关的免疫抑制[Kelley J．G．等：在豚鼠角膜里朗格汉斯细胞的改变；Invest．Ophthalmol．Vis．Sci．，26，1293-1296，1985；Ray-Kell L．等：用紫外辐射预处理减少了异种小鼠角膜移植物排斥的发生率；移植，42，403-406，1986]；引起炎性细胞因子的产生[KennedyM．等：紫外辐照引起人角膜细胞产生多种细胞因子；Invest．Ophthalmol．Vis．Sci．，38，2483-2491，1997]；DNA损伤[Reddy，V．N．等：水性体液抗坏血酸对紫外线B-引起的晶状体上皮DNA损伤的作用；Invest．Ophthalmol．Vis．Sci．，39，344-350，1998]；和神经病[Trabucchi，G．等：家兔眼睛激光角膜切除术后角膜神经的损伤和再生；Invest．Ophthalmol．Vis．Sci．，35，229-235，1994]。

几乎所有的这些疾病都伴有对角结膜上皮细胞的损伤，由诸如超氧化物、羟基游离基、羟基过氧化物等通过UV辐射影响产生的游离基造成的损伤被认为是主要的病因。

当注意到活体的自身稳态机制时，可以推知泪液天生含有足量的乳铁蛋白(约2毫克／ml泪液)和谷胱甘肽以淬灭或抑制这类游离基。

因此，虽然UV形成的游离基会引起角结膜上皮的各种UV-诱发的疾病，但逻辑上认为活体的自身稳定机制中存在着更为至关重要的病因。

从以上阐述来看，具有游离基淬灭或抑制作用和促进机体防御机制功能的药物，应能预防和治疗UV-引起的角结膜上皮损伤。

作为对UV-引起的疾病具有防御潜力的生理学局部给药的眼药，已知有谷胱甘肽、维生素C、维生素E等。此外，已知乳铁蛋白和谷胱甘肽都是眼泪的生理成分，它们可淬灭游离基，保护角结膜上皮防止损伤[Megaw J．M．：谷胱甘肽和眼部光生物学；Curr．Eye Res．，3，83-87，1984]。

此外，也可使用阻挡UV的眼镜贴片[Bergmanson，J．P．：紫外辐照对眼睛疾病的意义，阻挡UV的眼镜贴片的效力综述；Ophthalmic．Physiol．Opt．，15，83-91，1995]。

但是，这些已知药物、成分和装置的主要的功能是通过淬灭紫外辐照产生的游离基来保护眼睛，没有一个足以令人满意地维持眼睛的自身稳定。

同时，作为校正近视眼的一个方法，近年来屈光性角膜切除术受到很大关注。由来已久的是通过佩戴眼睛或眼镜贴片来校正近视眼，但使用眼镜伴有美容问题并在日常生活中很麻烦，而使用眼镜贴片会引起意外的角膜损伤。因此，需要校正近视眼的根治方法。

相反的是，屈光性角膜切除术能通过单次手术校正近视眼，并免除佩戴眼睛或眼镜贴片的麻烦，所以该手术是划时代的进展。

但是，取决于熟练人员和专家意见，屈光性角膜切除术可能遗留角膜上皮疾病，因此，建立预防和治疗这类疾病的治疗方案成为一个研究的目标，它是建立屈光性角膜切除术作为常规技术的一个必须的先决条件。

屈光性角膜切除术是校正近视眼的一个手术，包括根据校正需要切开角膜表层成预定的式样和大小，通常简称为Pk。

在Pk过程中，用钻石刀切开角膜。根据该技术，指导病人凝视装有解剖显微镜的固定的灯，操作者徒手切开角膜。

在这样的病例中，手术后向眼睛滴入类固醇和抗生素，以防止感染并改善预后。

屈光性角膜切除术的另一个技术称为光屈光性角膜切除术(PRK)，其中用准分子激光器激光束进行角膜切开。

PRK不依赖于操作者对手术的准确操作，因此是作为屈光性角膜切除术的优选技术，其中术后的进程根据切口式样和长度的细微不同和而明显地不同，而引起极大关注。此外，必要的设备使用也已老练。预期目前的屈光性角膜切除术将会最终集中于PRK。

PRK是将准分子激光器激光束聚焦于角膜上皮，在辐照部位作切口的手术。由于该技术不仅能够校正近视眼，也可校正远视和散光，被认为是视力校正的极有帮助的技术。该类方法近来被称为屈光外科。

虽然已证实准分子激光层PRK显示出优秀的校正效力，但也报道有各种并发症。例如，会引起各层角膜上皮缺损，这是准分子激光层手术或多或少不可避免的，有时还伴有严重的疼痛。

此外，在某些术后阶段里总是能观察到上皮下的浑浊。虽然该浑浊能在手术后12个月里消失，但在许多病例中也是个值得关注的事情，因为在干预期间不可避免地会损伤视力。此外，在角膜内皮中观察到细胞群明显减少。

因此，为了使应用准分子激光器激光的PRK使用范围更广，必须克服这些手术后的并发症。

由于准分子激光器使用了波长为193纳米的紫外发射波，可以预见，若发现一种能增加角膜上皮对193纳米紫外辐照耐受性的物质，上述问题可引刃而解。

同时，作为预防、诊断和／或治疗眼睛疾病的药物(它们被综合地称为眼药)，业已开发和临床应用了各种口服药物和局部滴注的药物。

使用这类药物的眼睛疾病包括青光眼、白内障、角膜病、巩膜疾病、视网膜病、眼色素层疾病、玻璃体疾病、光神经疾病、结膜疾病、泪液器官疾病、眼窝疾病和弱视或眼紧张。这些药物在手术前、手术中或手术后使用。

作为预防、诊断和／或治疗这类疾病的药物，可以提及的是抗青光眼药、抗白内障药、抗微生物药(抗生素、合成的抗菌药)、肾上腺皮质激素、瞳孔放大剂、瞳孔缩小剂、磺胺类药物、局部麻醉剂、血管收缩剂、血管扩张剂、收敛剂、酶制剂、抗过敏剂、非类固醇类抗炎药、抗真菌剂、抗病毒剂和角膜保护剂／愈合促进剂和其它的药物。

这些眼药的某一些尽管在眼睛疾病中是有效的，但具有诱发严重角结膜上皮疾病的副作用。有这类副作用的药物不可用作有效的眼药。因此，需要在与所述药物同时给药时能掩盖这类副作用，并可用作有用眼药的物质。

同时，近年来最令人关注的角膜结膜疾病之一是干眼。干眼的发生率随着佩戴眼镜贴片的人群增加、在人工空调环境里生活的时间增加和注视电视、计算机VDT屏幕的场合增加而倾向同步地增加，已成为极其令人关注的事宜。

干眼指泪液的体积减少或泪液量的异常，不论有或没有角结膜损伤[Yamada等：Folia Ophthalmologica Japonica，43，1289-1293(1992)]。根据该定义，缺乏泪液、泪液过少、眼球干燥症、Sjogren综合症、Stevens-Johnson综合症、天疱疮、眼睑边缘疾病、眼睑闭合不足、感觉神经麻痹等都包容在干眼病范畴内。

业已指出了干眼病与角结膜上皮粘蛋白(mucin)的关系，且对其也作了许多研究。粘蛋白1已知是除了杯状细胞(goblet)外的角膜上皮和结膜上皮产生的物质[眼睛杂志，第14卷，第11号(1997)]。作为对干眼病的治疗用药程式，采用了滴入含有粘弹性物质，如甲基纤维素、硫酸软骨素、透明质酸等的人工泪液作为粘蛋白的替代物。但是，由于这些物质的物理和生理性质与粘蛋白不同，它们提供的治疗效果是有限的。

国际专利WO97／39769描述了偿试在干眼病中采用含有白蛋白作为活性物质的一种系统。该方法意在增加表面上皮的粘蛋白分泌，从而稳定眼睛表面的泪液膜。

日本Kokai专利申请公开Hei-9-136832揭示了一种通过硫代脱氢松香酸配制预防和／或治疗干眼病药物的技术。该药物增加了产生粘蛋白的结膜杯状细胞产生粘多糖的功能，并抑制了角结膜由于所述杯状细胞的功能破坏而引起的角质改变。

日本特许公开公报Hei-9-301866揭示了一种干眼病的治疗药物，它含有喹诺酮衍生物。该药物增加了杯状细胞的数目，从而增加了粘蛋白的产生和眼睛里粘液的体积。

日本特许公开公报Hei-10-218792揭示了一种干眼病的治疗药物，它含有血管紧张素转换酶抑制剂。该药物发现了这样的事实，即血管紧张素转换酶抑制剂可作为拟神经(neurergic)药物，直接作用于泪腺，以促进泪液的分泌。

这些技术或治疗上不完全有效或有副作用，它们的缺点是它们不可用于根治。

发明概述

本发明在上述现有技术状况下进行了发展，其目的是提供一种药物，它安全并没有副作用风险地作用于角膜上皮创伤愈合的各个阶段，因此能有效地预防或治疗角膜上皮疾病。

本发明的再一个目的是提供用于UV-引起的角结膜上皮疾病的治疗组合物，它能有效地防治由UV辐照引起的角结膜上皮损伤。

本发明的另一个目的是提供能有效地预防准分子激光PRK病例中手术后并发症的药物。

本发明的另一个目的是提供用于角结膜上皮疾病的治疗组合物，该组合物能消除其它眼药对角结膜上皮的副作用，从而能在所述病征中安全地使用所述眼科药物。

本发明的进一步目的是提供能摆脱干眼病的病因因素，从而预防和治疗干眼病的药物。

本发明的第一方面内容涉及角膜上皮疾病的治疗组合物，它可用于预防和／或治疗角膜上皮疾病，该组合物包括尿抑素作为活性成分。

本发明的第二方面内容涉及一种用于UV-诱发的角结膜上皮疾病的治疗组合物，它可用于预防和／或治疗UV-引起的角结膜上皮疾病，该组合物包括尿抑素作为活性成分。

本发明的第三方面内容涉及一种用于角膜切除术手术后的角膜上皮并发症的治疗组合物，它可用于预防和／或治疗角膜切除术手术后的角膜上皮并发症，该组合物包括尿抑素作为活性成分。

本发明的第四方面内容涉及一种用于药物诱发的角结膜上皮疾病的治疗组合物，它可用于治疗由于给予眼科药物引起的角结膜上皮疾病，该组合物包括尿抑素作为活性成分。

本发明的第五方面内容涉及一种用于干眼病的治疗组合物，它可用于预防和／或治疗干眼病，该组合物包括尿抑素作为活性成分。

附图简述

图1是一套图显示尿抑素对人角膜上皮细胞的粘附／伸展(迁移)-促进作用。

发明详述

本发明现详述如下。

本发明的第一方面内容涉及角膜上皮疾病的治疗组合物，它可用于预防和／或治疗角膜上皮疾病，该组合物包括尿抑素作为活性成分。

本文中“角膜上皮疾病的治疗组合物”指在角膜上皮疾病中使用的药物，包括用于预防角膜上皮疾病的药物和角膜上皮疾病的治疗药物。用于预防角膜上皮疾病的药物是预期会有角膜上皮疾病发作情况下，意在预防这类发作的药物，角膜上皮疾病的治疗药物是用于治愈或缓解已经发生的角膜上皮疾病的药物。

本文使用的术语“治疗的”指对包括人的动物，以治疗、诊断和／或预防疾病为目的而给予药物，本文使用的“治疗组合物”广义上指治疗药物、诊断试剂和／或预防制剂。

用于角膜上皮疾病的本发明治疗组合物包括尿抑素作为活性成分。本文使用的术语“尿抑素”指人尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)。

上述的尿抑素是一种糖蛋白，其分子量约为67000(通过凝胶渗透层析测量)或约34000(通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测量)，是一种已知其糖部分约占35％[医学和药学科学杂志(Journal of Medicine and Pharmaceutical Science)，33，5，1089-1097(1995)]的物质。市场上，尿抑素由Mochida Pharmaceutical Co．购得，商品名为“Miraclid”。

尿抑素可从新鲜健康男性尿通过标准的纯化方法纯化得到，如通过在硅藻土、硅胶等吸附，然后用离子交换树脂、凝胶过滤等处理，以系列组合运用。

随着近来分析技术的发展，已阐明尿抑素由几种异构体组成。这些异构体之间的不同特征在于糖部分磺化的程度。在其它方面(抗胰蛋白酶活性、分子量、氨基酸组成、N-末端氨基酸序列、C-末端氨基酸序列、唾液酸含量、糖醛酸含量)似乎没有不同[Yuki等：Biochimica dt Biophysica Acta，1203，298-303(1993)]。因此，很显然尿抑素任何异构体和所有异构体都在本发明的范围里。

对于用于本发明的尿抑素，已经注意到它对人成纤维细胞和牛角膜内皮细胞的细胞生长刺激活性[Johanna，K．等：Biochim．Biophys．Acta，1221，145-152(1994)]，但对人角结膜上皮细胞和基质细胞的作用没有相关的报道。此外，对蛋白水解性蛋白酶抑制剂的反应随着细胞的种类和动物的种类改变而明显地不同[Mckeehan，W．L．等：J．Biol．Chem．261，5378-5383(1986)]，因此该人尿胰蛋白酶抑制剂对人角结膜上皮细胞的药理作用是不可预见的。

日本特许公开公报Sho-63-267730揭示了一种用于治疗过敏性鼻炎和过敏性结膜炎的外用药，它包括作为活性成分的尿抑素。述说，对患有过敏性结膜炎的病人给予20毫克／毫升时，结膜周围充血和痒的感觉消失。

另一方面，本发明者在动物里就尿抑素对角膜上皮细胞的吸附／伸展(迁移)的促进作用进行了广泛的研究，显示(详细的结果如下所示)可显著地治愈糖尿病大鼠和家兔的角膜上皮损伤，在细胞培养中也证实了所观察到的该生理活性。此外，据发现，上述结果归因于对血纤维蛋白溶酶原活化剂分泌的促进，这是愈合角膜上皮创伤所必须的，其促进程度远不足以导致由于没有抑制血纤维蛋白溶酶活化剂活性的过度产生而破坏组织。这些因素符合用于角膜上皮疾病的划时代新颖治疗组合物的要求，本发明的第一方面内容就是基于上述发现。

本发明用于角膜上皮疾病的治疗组合物可通过所述尿抑素与添加剂的配制来制备。

在使用所述尿抑素作为本发明角膜上皮疾病治疗组合物的活性成分中，对尿抑素的浓度没有特别的限制，而根据所证实人角膜上皮细胞粘附／伸展(迁移)的显微镜的和总的观察结果，浓度范围为0．05-10000微克／毫升，尿抑素的配制量宜选自上述范围。此外，由于人角膜上皮细胞明显增殖所见浓度为0．5-5000微克／毫升，故尿抑素优选的浓度范围是上述刚提到的。

本发明用于角膜上皮疾病的治疗组合物，优选局部外用剂型，特别是眼科溶液，眼科软膏或冻干的眼科粉末剂型，但对其没有限定。例如，可这样制备眼科溶液或软膏：使用各种标准配制的添加剂，如诸如脱氢乙酸钠、对一氧基苯甲酸甲酯等防腐剂、诸如氯化钠、甘油等等渗剂、诸如羧甲基纤维素、聚乙烯醇等增稠剂和诸如乙二胺四乙酸钠、多糖等稳定剂等等。但是，添加剂不限于上述的物质，可为其它眼睛生理学角度可接受的物质。向所述各种剂型加入的缓冲溶液优选的是等渗的和无刺激的，pH为4-9，特别是pH5．5-8．0。

在不干扰活性组分尿抑素的活性范围里，用于角膜上皮疾病的本发明治疗组合物可含有眼科学上的生物活性物质，如纤连蛋白、透明质酸和各种粘多糖(硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸类肝素、肝素、硫酸角质素)等，以提供用于角膜上皮疾病的更有效制剂。此外，也可配制抗生素、诸如糖皮质激素的甾族抗炎药和非甾族抗炎药。

用于角膜上皮疾病的本发明治疗组合物的给药方式和剂量视病人的病情、年龄和其它因素而定，例如，对于眼科溶液，可每天滴眼1-5次，每剂1-5滴。对于眼科软膏，将合适量的软膏用于结膜小囊，一般每天1-3次。

对可用本发明治疗组合物治疗的角膜上皮疾病没有特别的限制，只要涉及到角膜上皮的损伤即可，因此包括与诸如疱疹性角膜炎、细菌性角膜溃疡、神经性瘫痪角膜炎、糖尿病角膜病、Sjogren综合症、Stevens-Johnson综合症等的内在疾病有关的角结膜上皮疾病，和与诸如手术后、药物诱发的、创伤性的和眼镜贴片佩戴者疾病的外在疾病有关的角结膜上皮疾病。

本发明的第二方面内容涉及用于UV-引起的角结膜上皮疾病的治疗组合物，它可用于治疗UV-引起的角结膜上皮疾病，包括尿抑素作为活性成分。

术语“用于UV-引起的角结膜上皮疾病的治疗组合物”指用于紫外辐射引起的角结膜上皮疾病的药物，包括用于预防角结膜上皮疾病的药物和用于角结膜上皮疾病的治疗药物。用于角结膜上皮疾病的预防药物是用于预防UV-引起的角结膜上皮疾病急性发作的药物，用于角结膜上皮疾病的治疗药物是用于治愈或缓解已经形成的UV-引起的角结膜上皮疾病的药物。

本发明者研究发现，与谷胱甘肽、维生素C、维生素E、乳铁蛋白等相比，尿抑素能极有效地保护人角结膜上皮免受紫外辐射的损伤。此外，已证实，该保护效应是独特的，其它蛋白酶抑制剂没有这样的效应。事实上，眼科学领域里根本没有报道过尿抑素以该方式的应用，前述事实是本发明者第一次发现的。

已有报道，尿抑素没有游离基清除活性，同时一些报道提到了尿抑素的游离基淬灭(抑制)作用。

但是，如下列实施例所显示的，UV辐射期间的尿抑素含量与至今报道的有效量(37-74微克／毫升；根据分子量34000计算，为1-2μM；以下用法相同)相比是极低的[M．Nomura等：尿抑素和抑肽酶对多形核白细胞产生氧游离基的作用；Advances in Medicine，142，895-896(1987)]，若尿抑素的该作用仅归属于它的游离基淬灭(抑制)作用，这将与谷胱甘肽、维生素C、维生素E等的结果有不可避免的大抵触。

因此，尿抑素抵抗UV损伤的保护效应不仅归因于它的游离基淬灭(抑制)作用，而且看来还涉及对防御功能有贡献的一些其它因素。这样，可以假定会诱发伴侣分子或清除剂受体蛋白的表达。

K．Tsubota等使人角膜上皮细胞(HCEC)与高浓度的H₂O₂接触，证明产生的胞内OH游离基，比得上对UV-B辐照的反应，结果降低了胞内ATP含量。此外，已发现，UV-B辐照引起了线粒体衬里膜的损伤，这不是由OH游离基单独引起的[S．Shimmura等：低于阈值的UV辐照诱发培养的角膜上皮细胞形成过氧化物：乳铁蛋白的保护作用；Exp．Eye Res．，63，519-526，1996，K．Tsubota等：UV B-诱发的线粒体失调与体外角膜上皮细胞去附着细胞的减少有关；Invest．Ophthalmol．Vis．Sci．38，620-626，1997]。

因此，除非预防UV-B辐照对线粒体内膜的损伤，不可能发生人角结膜上皮细胞的增殖。因此，尿抑素被认为也能保护线粒体内膜抵抗由于紫外辐照产生的损伤。

因此，尿抑素可明显抑制UV-引起的人角结膜上皮细胞损伤。该保护作用迄今比抗氧剂，如乳铁蛋白、谷胱甘肽、维生素E、维生素C等，或比诸如α₁-胰蛋白酶抑制剂、α₂-血纤维蛋白溶酶抑制剂、抑肽酶、苯丁抑制素(Bestatin)等蛋白酶抑制剂的作用更强。

尿抑素保护作用的机理可能几乎不涉及它对UV辐照产生的游离基的淬灭(抑制)作用、衍生自其蛋白酶抑制活性的作用和由于其细胞膜-保护活性的作用，但可能的是除了这些已知的起重要作用之外的一个机理。

目前医疗界尚未提到尿抑素能治疗UV-引起的眼睛疾病，本发明的第二方面内容基于上述发现。

用于UV-引起的角结膜上皮疾病的本发明治疗组合物，可通过用药学上可接受的添加剂配制所述的尿抑素来制备。

用于UV-引起的角结膜上皮疾病的本发明第二方面内容的治疗组合物的剂型，可包括与上述第一方面中用于角膜上皮疾病的治疗组合物所述的相同剂型，可同时给药的药物和给药方式和剂量也与本发明第一方面里用于角膜上皮疾病所述的治疗组合物相同。

本发明的第二方面的治疗组合物可治疗的角膜结膜上皮疾病包括UV-引起的结膜充血、扩散性浅表角膜炎、角膜水肿、虹膜炎等，伴有坏死和腐蚀的光角膜炎，特征是疼痛、畏光和睑痉挛麻痹，其中UV-引起的白内障涉及许多病因因素：由朗格汉斯细胞损伤导致的免疫抑制，引起炎性细胞因子的产生DNA损伤和神经病理。

本发明的第三方面内容涉及用于角膜切除术后角膜上皮并发症的治疗组合物，它可用于治疗角膜切除术后的角膜上皮并发症，包括尿抑素作为活性成分。

本说明书所用术语“用于角膜切除术后角膜上皮并发症的治疗组合物”，指用于角膜切除病例手术后发生的角膜上皮疾病、包括用于角膜切除术后角膜上皮并发症的预防和用于角膜切除术后角膜上皮并发症治疗的药物。用于角膜切除术后角膜上皮并发症的预防药是预防屈光性角膜切除术后角膜上皮疾病急性发作的药物，用于角膜切除术后角膜上皮并发症的治疗药是治疗或缓解屈光性角膜切除术后发生的角膜上皮疾病的药物。

对用于所述角膜切除术的手术方法没有特别的限制，但特别包括使用准分子激光进行手术的光屈光角膜切除术(PRK)。

上述的角膜切除术后角膜上皮并发症怀疑是在PRK期间由于角膜上皮暴露于准分子激光而引起的。准分子激光束是一种波长为193纳米的紫外辐射，因此，一种能预防或治愈由波长为193纳米的紫外射线引起的角膜上皮疾病的治疗组合物适合于上述的目的。

本发明者在许多研究后发现，尿抑素对于上述目的和本发明的优选方案是极为有效的。

目前医疗界尚未想到尿抑素在用于上述目的的角膜切除术后的角膜上皮疾病中的应用，本发明的第三方面内容是基于这种新知识。

用于角膜切除术后角膜上皮综合症的本发明治疗组合物，可通过用药学上可接受的添加剂配制所述的尿抑素来制备。

用于角膜切除术后角膜上皮并发症的本发明第三方面的治疗组合物的剂型，包括与上述第一方面中用于角膜上皮疾病的治疗组合物所述相同剂型，可同时给药的药物和给药方法和剂量，也与本发明第一方面中用于角膜上皮疾病的治疗组合物相同。

本发明第三方面的治疗组合物可治疗的角结膜上皮并发症，特别包括侵袭角膜不同层的上皮缺损，上皮下浑浊，和内皮细胞数减少之内膜损伤；和例如侵袭角膜全层的角膜穿孔和角膜感染；以及例如影响视功能的光晕，眩目，校正不足，过度校正和衰退，及其它。

本发明的第四方面内容涉及用于药物引起的角结膜上皮疾病的治疗组合物，它用于治疗眼科药物引起的角结膜上皮疾病，包括尿抑素作为活性成分。

用于药物引起的角结膜上皮疾病的治疗组合物，是用于治疗或减轻各种由眼科药引起的角结膜上皮疾病的治疗组合物。

本发明者经广泛的研究发现，尿抑素能极有效地抵抗由眼科药引起的各种角结膜上皮疾病，并能使本发明优化。

对上述的眼科药物没有特别限定，只要它们给药时具有引起角结膜上皮疾病发作的危险，包括下列药物和其它药物。

口服眼科药物：二氯苯胺、土木香内酯、二碘代硬脂酸钙、甲醋唑胺、浓甘油；

缩瞳剂：盐酸毛果芸香碱、水杨酸毒扁豆碱、乙基磷酸对-硝基苯乙基酯、碘化二乙氧膦酰硫胆碱、溴化双吡己胺、氯化氨甲酰胆碱；

抗青光眼药：马来酸噻吗心安、盐酸苯呋心安、盐酸喹酮心安、unoprostone异丙酯、latanoprost；

扩瞳药：盐酸cyclopentorate、后马托品、氢溴化物、硫酸阿托品、盐酸苯福林、托品酰胺、肾上腺素、酸式酒石酸肾上腺素、盐酸双特戊酰肾上腺素；

抗白内障药：吡诺克辛、Phacolysin(商标，Zeria Pharmaceutical)、谷胱甘肽；

角膜保护剂／治疗药：软骨素硫酸钠、Flavitan(商标，山之内制药株式会社)、维生素B₁₂、甘草酸二钾、透明质酸钠；

酶：α-糜蛋白酶；

血管收缩药：硝酸萘甲唑啉；

抗腐败药／收敛剂：硝酸银、硼酸、硼砂；

抗生素、抗真菌剂、合成的抗菌素、磺胺类药物、抗病毒药；

肾上腺皮质激素：乙酸氢化可的松、乙酸泼尼松龙、地塞米松磷酸钠、地塞米松、倍他米松磷酸钠、氟米龙；

其它：硫酸锌、甘菊环烃硫酸钠、氯化溶菌酶、Tego-51、聚乙二醇；

非甾族抗炎药：双氯芬酸钠、吲哚美辛、普拉洛芬；

抗过敏药：马来酸噻马心安、色甘酸钠、氨来占诺、富马酸酮替芬、曲尼司特；

局部麻醉药：盐酸土霉素、T-卡因。

本发明第四方面内容能有效地停止所述眼科药物引起的角结膜上皮疾病的副作用。

目前尚不知尿抑素可用作治疗组合物治疗由眼科药物引起的角结膜上皮疾病，本发明的第四方面内容即基于上述发现得到。

用于药物引起的角结膜上皮疾病的本发明治疗组合物，可通过用药学上可接受的添加剂配制所述的尿抑素来制备。

用于药物引起的角结膜上皮疾病的本发明第四方面的治疗组合物的剂型，可包括与上述第一方面中用于角膜上皮疾病的治疗组合物所述的相同剂型，可同时给药的药物以及给药方法和剂量也与本发明第一方面所述用于角膜上皮疾病的治疗组合物相同。

可用本发明第四方面用于药物引起的角结膜上皮疾病的治疗组合物治疗的角膜结膜上皮疾病，不仅包括前述的用本发明第一方面提到的角膜上皮疾病治疗组合物治疗的疾病，而且包括给予眼科药物引起的角结膜上皮疾病。

本发明的第五方面内容涉及用于干眼病的治疗组合物，它可用于预防和／或治疗干眼病，包括尿抑素作为活性成分。

术语“用于干眼病的治疗组合物”指用于干眼病的药物，包括干眼病的预防药物和干眼病的治疗药物。干眼病的预防药物是用于预防干眼病预期发作的药物，和用于治愈或缓解干眼病的治疗药物。

如以下将详述的那样，已证实尿抑素在动物模型中确定防止了干眼病，这一结果的因于尿抑素促进了角结膜上皮细胞产生粘蛋白1。这些事实满足了用于干眼病的治疗组合物的划时代新要求，本发明的该方面即基于上述发现。

根据本发明，用于干眼病的治疗组合物可用药学上可接受的添加剂配制尿抑素来制备。

在尿抑素作为所述干眼病治疗组合物活性组分的应用中，对所使用的尿抑素浓度范围没有特别的限制。但是，根据发现，在0．05-10000微克／毫升它能促进人角结膜上皮细胞产生粘蛋白1，在相同的浓度下尿抑素能确实防止大鼠模型的干眼病，尿抑素浓度优选地在上述范围里。此外，由于当尿抑素浓度为0．5-5000微克／毫升时人角结膜上皮细胞产生的粘蛋白特别高，因此更优选的是在刚刚述及的范围里配制尿抑素。

根据本发明第五方面内容，用于干眼病的治疗组合物的剂型，包括与上述第一方面中用于角膜上皮疾病治疗组合物所述的相同剂型，可同时给药的药物以及给药方法和剂量也与本发明第一方面用于角膜上皮疾病所述的治疗组合物相同。

本发明干眼病治疗组合物所治的病症包括干眼病的各种形式，其中不论是否有角结膜损伤存在，泪液量都会减少或质量异常，如泪液过少、眼球干燥症、Sjogren综合症、Stevens-Johnson综合症、天疱疮、眼睑边缘疾病、眼睑闭合不足、感觉神经瘫痪等。

本发明提供了上述用于角膜上皮疾病的治疗组合物、用于UV-引起的角结膜上皮疾病的治疗组合物、用于角膜切除术后角膜并发症的治疗组合物、用于药物引起的角结膜上皮疾病的治疗组合物和用于干眼病的治疗组合物，它们可作为眼科药物给予包括人的动物，例如通过滴入眼睛给予。治疗方法包括将本发明所述的眼科药物的任一种施用于包括人的动物，以达到治疗和／或预防目的，这也包含于本发明的范畴。

使用本发明的尿抑素来制备本发明所述眼科药物也在本发明的范围里。

本发明提供的用于角膜上皮疾病的治疗组合物、用于UV-引起的角结膜上皮疾病的治疗组合物、用于角膜切除术后角膜并发症的治疗组合物、用于药物引起的角结膜上皮疾病的治疗组合物和用于干眼病的治疗组合物，都是眼科组合物，包括尿抑素作为活性成分，这类组合物的任何一种只要它含有尿抑素作为活性成分，不论是否另外含有如上所述的其它成分，都在本发明的范围里。

本发明提供的用于角膜上皮疾病的治疗组合物、用于UV-引起的角结膜上皮疾病的治疗组合物、用于角膜切除术后角膜并发症的治疗组合物、用于药物引起的角膜结膜上皮疾病的治疗组合物和用于干眼病的治疗组合物，都是药物组合物，它可对包括人在内的动物给药，因此可称为用于角膜上皮疾病的药物组合物、用于UV-引起的角结膜上皮疾病的药物组合物、用于角膜切除术后角膜并发症的药物组合物、用于药物引起的角结膜上皮疾病的药物组合物和用于干眼病的药物组合物。

实施本发明的最佳模式

下列参考实施例和工作实施例进一步详细地阐述了本发明，它们不以任何方式对本发明作限制。

参考实施例1

尿抑素的生产

用6N NaOH将约1000升健康成人的尿调节到pH10．0，静置约30分钟。形成的不溶物质用Tetron棉花柱除去，用6N H₂SO₄将柱的流出物调节到pH7．0。将空气吹入990升液体形成泡沫，收集140升的泡沫组分。

用6N HCl将收集的泡沫组分调节到pH5．0，在约10℃下分批吸附在100毫升硅胶5D(Fuji-Davison)上4小时。

将硅胶5D装柱，用水性0．05N磷酸二氢钠-0．5MNaCl溶液(pH5．0)洗涤，用0．3M氯化铵-氨水(pH9．5)洗脱尿抑素。室温使洗脱物经70％硫酸铵沉淀，静置24小时，回收沉淀物。该沉淀物溶于磷酸二氢钠水溶液(pH4．0)中，上DEAE-Cellulofine A200柱(树脂含量300毫升)，此柱用含0．1M NaCl的磷酸二氢钠水溶液(pH4．0)平衡。该柱用上述相同缓冲液洗涤后，用含0．3M NaCl的磷酸二氢钠水溶液(pH4．0)洗脱尿抑素。洗脱液用纯净水进一步稀释，在上述相同条件下再进行层析。用0．3N NaOH使洗脱液再恢复至pH7．0，通过抑肽酶-SepharoseCL-4B柱，除去痕量污染的血管舒缓肽。流出物经PM-100(Amicon)超滤膜过滤，琥液用PM-10(Amicon)超滤膜进一步浓缩：最后通过0．22微米膜过滤器，回收6×10⁵单位纯化的尿抑素，其比活性为2700U／mg蛋白(批A)。

用相同的纯化过程，另外制备了3批纯化的尿抑素(批B：比活性2800U／mg蛋白质，得率5．9×10⁵U；批PW-2：比活性2800 U／mg蛋白质，得率5．65×10⁵单位；批PW-3：比活性2600U／mg蛋白质，得率6．5×10⁵U)。

用上述相同的纯化方法得到进一步纯化的尿抑素(批67B8：比活性2740U／mg蛋白质，得率6×10⁵U)。

该纯化的尿抑素在SDS电泳(12％凝胶)上有单一条带，分子量为34000，在凝胶双扩散试验中，它与兔抗体形成一条沉淀线，(此兔抗体用尿抑素标准品作为抗原制备而得)。并通过了生物规范试验，如热原试验和促凝血酶原激酶试验。

实施例1

人角膜上皮细胞的粘附和伸展(迁移)

将人角膜上皮细胞系HCEC悬于无血清培养基(含有0．1毫克／毫升硫酸卡那霉素的D-MEM／F-12培养基；Nikken Biomedical Research Institute)获得的培养液300微升接种到细胞悬浮瓶(Sumitomo Bakelite)中，并调节至每毫升细胞数为2．0×10⁵，同时加入不同浓度的尿抑素(Lot PW-2)。在5％CO₂培养箱中37℃培育5小时后，彻底除去培养基，在每个孔中加入上述相同的新鲜无血清培养基300微升，然后立即在显微镜下观察拍照，以评价人角膜上皮细胞的粘附和伸展(迁移)程度。在对照细胞组中，加入盐水代替尿抑素。

结果显示在图1中。在图1中，顶排的两张照片代表对照组，中间排的两张照片代表加入尿抑素(浓度为0．5微克／毫升)的组，底排的两张照片代表加入尿抑素(浓度为5微克／毫升)的组。从图1明显看出，与对照相比，在已加入尿抑素的多孔板中观察到有相当多的细胞丛(用箭头示出)表现出人角膜上皮细胞的粘附和伸展(迁移)。

实施例2

人角膜上皮细胞的增殖

用100微升细胞悬液接种96孔多孔板(Corning)，该细胞悬液通过将人角膜上皮细胞系HCEC悬浮在1％胎牛血清-SHEM(添加激素上皮培养基)的改进培养基(SHEM培养基在Araki，K．等人：Invest．Ophthalmol．Vis．Sci．，18，2665，1993，中有描述，其中删去了表皮生长因子)中制得，调节细胞浓度为3×10⁴细胞／毫升，每个孔内立即加入10微升尿抑素。在5％CO₂培养箱中37℃培育细胞48小时。采用两批尿抑素(A批：1．6和0．16毫克／毫升，B批：2．2毫克／毫升)。培养48小时后，在每个孔内加入10微升5毫克／毫升MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴鎓)溶液，在5％CO₂培养箱中37℃继续培养16小时。然后，将100微升20％SDS(十二烷基硫酸钠)-0．01 N-HCl加入每个孔内，中止细胞培养，使该系统于37℃再培育6小时。从用微板读数仪测得的570纳米至660纳米的吸光度计算蓝色甲_的产生量，对人上皮细胞的增殖进行定量测定。用10微升盐水代替尿抑素处理的细胞组作为对照，估计尿抑素的促细胞增殖活性，表示成(尿抑素处理细胞组中的吸光度÷盐水处理细胞组中的吸光度)×100(％)。所用尿抑素的异构体比例不同，如表1所示。结果显示在表2中。从表2可以明显看出，尽管尿抑素对人上皮细胞的促进作用随异构体的比例不同而变变化，但是所得增殖比对照多大约两倍。

表1尿抑素异构体的比例

表2尿抑素对人角膜上皮细胞增殖的效果

尿抑素(最终浓度)	增殖速率(％)
A批(160微克／毫升)	194±20
B批(220微克／毫升)	245±5．1

实施例3

人角膜上皮细胞的增殖

将人角膜上皮细胞系HCEC悬浮在1％胎牛血清-SHEM改进培养基中至浓度为5×10⁴细胞／毫升制得细胞悬液，用300微克该细胞悬液接种48孔多孔板(Corning)，同时在每个孔内加入30微升不同浓度的尿抑素(PW-2，PW-3批)至最终浓度为0．05至1微克／毫升。在5％CO₂培养箱中37℃培育细胞64小时。

培养结束后，除去每个孔中的培养上清液，在加入100微升脱附着溶液(含有0．25％(w／v)胰蛋白酶和0．02％EDTA的磷酸盐缓冲液)后，在5％CO₂培养箱中再37℃培育该系统6小时。

培育后，通过移液进一步脱附着和分散上皮细胞。加入100微升0．1％(w／v)台盼蓝溶液对细胞染色，立即用血细胞计数器计数。建立加入30微升盐水代替尿抑素的细胞组作为对照。

结果显示在表3中。表3中的数据表明尿抑素对人角膜上皮细胞的增殖有明显的浓度依赖性促进作用。

表3尿抑素对人角膜上皮细胞增殖的促进效果

实施例4

角膜上皮疾病的治疗

在失去上皮角膜的糖尿病大鼠中评价促进角膜重新形成上皮的活性。

使8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠禁食过夜，从尾静脉给予3毫摩尔柠檬酸缓冲液(pH4．5)配的链脲菌素溶液(Sigma)，剂量为每千克体重60毫克。再喂养该动物两周，以建立患糖尿病的大鼠。

然后将这样获得的糖尿病大鼠分成4组，每只动物腹膜内注射40毫克／千克体重的Nembutal注射剂(Dainippon Pharmaceutical)进行全身麻醉，每只眼睛滴一滴0．4％Benoxil溶液(Santen Pharmaceutical)作局部麻醉。然后，用眼科用刀，将整个角膜上皮从角膜缘到角膜中央刮下。在切除全部角膜上皮后，立即开始尿抑素(PW-2批)5微克／毫升或500微克／毫升、Hyalei-Mini 0．3(Santen Pharmaceutical)或盐水(Hikari Pharmaceutical)各5微升局部给予对应组中的大鼠，每日给药6次，间隔2小时。

另外，在所述切除全部角膜上皮之后立即以及切除后24小时和32小时，将一滴Richardson染色液(1％亚甲基蓝和1％硼酸钠水溶液配的1％天青II的1∶1混合物)滴入眼中。在用盐水(Hikari Pharmaceutical)充分清洗后，损伤部位被染色，用携带视频相机的立体显微镜对眼睛两侧的前端拍照。用图象分析系统软件(NIHImage 1．61)从监视屏上染色区域的图象测定角膜上皮伤口的面积。取切除上皮后立即测得的伤口面积为100％，将角膜上皮重新形成的程度表示成伤口面积的减少，并显示在图4中。本实施例所用的动物模型比下文给出的实施例6所用的动物模型更耐受处理，因为所用的染色溶液是Richardson染色液，已知该染色液延迟了角膜上皮伤口的愈合[Ubels，J．等人：Invest．Ophthalmol．Vis．Sci．，23，127(1982)]，而且在对照组中即使切除上皮后32小时基本上也没有发生愈合。在经Hyalein-Mini 0．3(活性组分是透明质酸钠0．3％，该溶液是用来治疗角膜上皮疾病的局部眼用溶液)处理的组中基本上也没有发现愈合。相反，在尿抑素滴注组中发现角膜伤口面积明显减少。因此很显然，尿抑素明显促进了难治的角膜上皮伤口的愈合。

表4尿抑素在糖尿病大鼠角膜上皮损伤中的效果

	对照	尿抑素(500微克／毫升)	尿抑素(5微克 ／毫升)	Hyalein_-Mini 0．3
0小时	100	100	100	100
24小时	97．9±11．7	87．9±8．8	89．2±9．2	107．3±3．7
32小时	102．1±15．0	66．4±8．4**	72．8±22．5*	96．6±11．6

角膜上皮切除后即刻(0小时)的角膜损伤面积取为100％。^*p＜0．05，^**p＜0．01实施例5

尿抑素和抑肽酶对人角膜上皮细胞纤溶酶原激活剂(PA)的影响

Thoft R．A．等人早在1983年[Thoft，R．A．等人：“维持角膜上皮的假设”，Invest．Ophthalmol．Vis．Sci．，24，1442-1443(1983)]就已指出，角膜上皮细胞分泌的PA在受各种原因损伤的角膜上皮细胞的恢复过程中起重要作用。

另一方面，据Salonen E．M．等人在1987年报道说，抑制纤溶酶活性的抑肽酶对伤口愈合有帮助，这就是说间接抑制PA活性是重要的[Salonen，E．M．等人：＂角膜溃疡患者泪液中的纤溶酶：新治疗的基础＂，Acta Ophthalmol．，65，3-12(1987)；Cejkova，J．等人：＂碱灼伤的家兔前眼节的组织化学研究，其中抑肽酶的处理预防了严重的损伤＂，Histochemistry，92，441-448(1989)]。

然而，James，D．等人在1991年报道说，角膜上皮伤口愈合所必需的过程，即角膜上皮的移动，受抑肽酶的浓度依赖型抑制[James，D．等人：＂蛋白酶抑制剂对角膜上皮迁移的作用＂Invest．Ophthalmol．Vis．Sci．，32，2073-2078(1991)]。

另外，Winston，W．Y．K．等人在1998年报道了一个决定性的发现。他们用纤溶酶原缺陷型小鼠构建了一个角膜上皮机械性损伤的动物模型，并观察伤口愈合的过程。结果发现有严重的持续的炎性反应，纤维蛋白沉积在角膜上皮的后侧，有溃疡以及复杂的恶性病(如基质性新生血管形成)。因此他们得出结论：纤溶酶的产生是角膜上皮伤口愈合所必需的[Winston，W．Y．K．等人：＂纤溶酶原和纤维蛋白原缺陷型小鼠中角膜上皮缺陷的愈合＂，Invest．Ophthalmol．Vis．Sci．，39，502-508(1998)]。

该发现赞同了负责产生纤溶酶的PA的绝对必要性。最近，Thomas，D．等人用PA作为标记进行了角膜上皮细胞毒性试验。因此，他们提出，抑制PA分泌的药物有细胞毒性，不适合创伤预防，而促进PA分泌的药物可用来在手术时保护角膜上皮防止受伤[Thomas，D．等人：＂通过纤溶酶原激活剂释放测定粘弹物对培养的角膜上皮细胞的细胞毒性＂，J．Refract．Corneal Surg．，10，95-102(1994)]。

许多工作人员已经报道说，PA的分泌及其活性的维持是角膜上皮伤口愈合所必需的[Andras，B．等人：＂泪水的纤溶酶原激活剂-上皮细胞破坏的指示物。角膜的切除、正庚醇清创术以及碱灼伤对家兔泪水纤溶酶原激活剂活性的影响，Inter．Ophthalmol．，15，363-369(1991)；Chris，P．L．：＂准分子激光器光屈光角膜切除术后纤溶酶和纤溶酶原激活剂的抑制剂：预防手术后近视性视力衰退和视力模糊的新概念＂，Refract．& Corneal Surg．，9，300-302(1993)]。

另外，Jozsef，T．等人发现在各种角结膜疾病和Sh_gren疾病的泪水中有高水平的PA抑制剂(PAI)，并报道说PA活性减少[Jozsef，T．等人：＂人泪水中的纤溶酶原激活剂抑制剂＂，Acta Ophthalmol．，69，426-431(1991)]。

从许多研究人员的那些报道可以得出结论，在上述讨论的纤溶酶原激活剂-纤溶酶原系统在角膜上皮伤口愈合的优点和缺点中，PA的分泌以及其活性的维持是必需的条件。

因此，在下列实施例中研究了尿抑素是否具有类似于抑肽酶的缺点。

实施例5-1

尿抑素对人角膜上皮细胞PA分泌的促进作用

将人角膜上皮细胞系HCEC分散在10％胎牛血清-SHEM改进培养基中至细胞数为1×10⁴／毫升，制得细胞悬液，将该悬液以500微升／孔接种到24孔多孔板(Corning)上，在5％CO₂培养箱中37℃预培育3小时。然后，在每个孔中加入10微升尿抑素(PW-2批，50微克／毫升)，在上述相同条件下培养细胞3天或6天，然后分别收获培养上清液。用离心分离膜(Ultracent；Tosoh Corporation)将每份收获的上清液浓缩至约1／5，用纤维蛋白平板试验(该方法是Ploug，J．等人[Ploug，J．等人：Biochim．Biophys．Acta．，24，278(1957)]的方法的部分改进)和合成底物3145-V方法(Peptide Research Institute)[Kawabata，S．等人：Eur．J．Biochem．，172，17(1988)]测定PA活性。通过用Ouchterlony方法(凝胶双扩散法)确认尿激酶抗体(TechnoClone G．m．b．H．，Austria)以及组织纤溶酶原激活剂抗体(Accurate Chemical& Scientific Corporation，U．S．A．)的交叉反应，鉴定出PA。结果显示在表5中。

在3天培养期间，没有发现尿抑素组和无尿抑素组之间有差别。然而，在培养6天期间，在尿抑素组中发现，与无尿抑素组相比，PA分泌有明显增加的趋势。这一发现表明尿抑素稍稍促进了PA分泌(这是角膜上皮伤口愈合所必需的)，其程度不会因过度产生而引起组织破坏，从而有效地实现了伤口愈合。

表5尿抑素对人角膜上皮细胞纤溶酶原激活剂的促分泌作用实施例5-2

尿抑素与抑肽酶对人角膜上皮细胞PA活性抑制作用的比较

将人角膜上皮细胞系HCEC培养在含有10％胎牛血清的SHEM的改进培养基中，在5％CO₂培养箱中37℃培养6天，对490毫升培养上清液进行60％饱和的硫酸铵沉淀。离心回收所得沉淀，溶于25毫升50毫摩尔磷酸盐缓冲液(pH 7．0)中。将该溶液上样于经50毫摩尔磷酸盐缓冲液(pH 7．0)平衡的锌螯合物SepharoseCL-6B柱(Amersham Pharmacia Biotech)，用相同缓冲液充分洗柱后，用含有0．3M氯化钠和0．1M咪唑的相同缓冲液洗脱PA。用PM-10(Amicon)浓缩17毫升洗脱液，用Sephacryl S200(30毫升)柱(Amersham Pharmaceutical Biotech)对3毫升浓缩液进行凝胶渗透层析，获得比活为35000单位／蛋白的部分纯化的PA样品。将该部分纯化的PA样品(10单位／毫升)50微升加入0．5毫升含50毫摩尔氯化钠的0．1M Tris-HCl缓冲液(pH 8．0)中，然后分别在试管中加入尿抑素(1700单位／毫升)和抑肽酶(1700单位／毫升；Bayer)。35℃培育试管3分钟。然后，在两个试管中加入0．5毫升25微摩尔合成底物3145-V，35℃培育试管30分钟。该培育后，用2毫升20％乙酸／水中止反应。用荧光分光光度计(激发波长380纳米，荧光发射波长460纳米)定量测定PA对合成底物3145-V的肽分解，用以下公式分别计算尿抑素和抑肽酶抑制PA活性的百分数。

PA活性抑制百分数=(1-加入抑制剂组中残余的PA活性／无抑制剂组中PA活性)×100

结果显示于表6中。从表6可以看出，尿抑素对PA活性的抑制最多为3％，基本上可以忽略。据报道，纤溶酶的抑制也是弱的[50％抑制=830单位／毫升；HaruoOhnishi等人：Folia Pharmacologic Japonica，81，235-244，1983]。另一方面，抑肽酶显示出抑制不低于30％，因此可以视为纤溶酶原转变成纤溶酶的抑制剂。另外，上述文献报道说抑肽酶非常强地抑制了纤溶酶(50％抑制=6．4单位／毫升)。因此，抑肽酶非常可能完全抑制了角膜上皮伤口愈合第一阶段中与纤溶酶原激活剂-纤溶酶系统有关的过程。因此很明显，作为角膜上皮疾病的治疗药物，尿抑素无疑比抑肽酶更有效。

表6尿抑素和抑肽酶对人角膜上皮细胞纤溶酶原激活剂活性的相对抑制作用

实施例6

尿抑素对糖尿病大鼠角膜上皮损伤的治疗作用

使雄性SD大鼠(7周龄；购自Charles River，Japan)在运抵到后习服一周。在8周龄时，从尾静脉(60毫克／千克)给予溶于3毫摩尔柠檬酸盐缓冲液(pH 4．5)中的链脲菌素(STZ；Sigma)，再饲养大鼠两周，以诱导糖尿病发作。在给予STZ后的第11天，用Pretest 3a(Wako Pure Chemical)测定大鼠尿中的葡萄糖，以确认糖尿病模型的建立。给予STZ两周后，腹膜内给予Nembutal注射剂(Dainabot)全身麻醉，进而将一滴眼用的局部用麻醉药Benoxil 0．4％(Santen Pharmaceutical)滴注到眼内。然后，从角膜缘到角膜中央剥下角膜的上皮层。在切除全部上皮后，立即滴注入一滴1％(w／v)荧光素钠／水。在用盐水洗眼后，在立体显微镜确认染色的损伤部位，用视频相机记录。在完全切除角膜上皮后，立即开始分别滴入测试物质，即尿抑素(PW-2批；50-500微克／毫升)、大鼠血清和Hyalein-Mini(SantenPharmaceutical)，每个眼睛每剂5微升，每日以大约2小时的间隔滴6次，每组用4只动物的两只眼睛。用盐水作为对照。在切除角膜上皮后立即用OlympusVideo Micrometer VM-50(NIH Image 1．61)对荧光素钠染色的伤口面积进行视频记录，然后在8小时、24小时、32小时、48小时和72小时进行记录，总共记录6次，测定每一时刻的伤口面积。

用角膜上皮切除后即刻的伤口面积值作为100％，从连续测得的面积值评价药物对角膜上皮伤口愈合的作用。结果显示在表7中。从表7中可以明显看出，对角膜上皮伤口愈合的治疗效果，尿抑素明显比参照药物优越。

表7尿抑素在糖尿病大鼠角膜损伤模型中的治疗效果

角膜上皮切除后即刻(0小时)的角膜损伤面积取为100％。^*p＜0．05，^**p＞0．01

实施例7

尿抑素对UV诱导的人角膜上皮细胞损伤的作用

将人角膜上皮细胞系HCEC悬于10％胎牛血清-SHEM改进培养基至浓度为1×10⁵细胞／毫升，取500微升的该细胞悬液接种到24多孔板(Corning)的每个孔中。细胞在5％CO₂培养箱中37℃培育16至17小时。然后，彻底除去培养上清液，在每个孔内加入500微升含有测试样品的10％胎牛血清-SHEM改进培养基。使细胞在上述相同条件下再培养2小时。在与样品接触的培养结束后，彻底除去培养上清液，从而使多孔板中基本上没有样品残余物。

用UV-C，具有最大致死功率的紫外光，在距离20-30厘米处辐照该条件下的多孔板5秒。在UV-C辐照后，每个孔中再次加入500微升含有上述相同样品的10％胎牛血清-SHEM改进培养基，使细胞在上述相同条件下培育16-17小时。然后，弃去每个孔中的上清液，加入100微升切除溶液(含有0．25％胰蛋白酶(w／v)和0．02％EDTA的PBS)。然后在5％CO₂培养箱中37℃培育该测试板6小时。在此培育后，通过移液彻底脱下和分散活的上皮细胞，用100微升0．1％(w／v)台盼蓝染色液染色，立即用血细胞计数器计数活细胞。用以下计算式评价样品保护UV-诱导的人角膜上皮细胞防止损伤的作用。

保护作用(％)=(加样品组中的活细胞数÷无样品组中活细胞数)×100

结果显示在表8-1和8-2中。

表8-1尿抑素在UV诱导的人角膜上皮细胞损伤中的效果

样品(浓度)	保护作用(％)
尿抑素(0．3微摩尔)	155±7．0　**
尿抑素(3微摩尔)	211±8．3**
肽酶(0．3微摩尔)	86．6±13
肽酶(3微摩尔)	77．2±5．1

表8-2尿抑素在UV诱导的人角膜上皮细胞损伤中的效果

样品(浓度)	保护作用(％)
尿抑素(0．3微摩尔)	140
人乳铁蛋白(2毫摩尔)，Sigma	101
去铁敏甲磺酸盐(2毫摩尔)，Ciba-Geigy Japan	94
维生素E(DL-α-生育酚乙酸，20微摩尔)，Kanto Chemical	107
谷胱苷肽(2毫摩尔)，Sigma	95
半胱氨酸(2毫摩尔)，Wako Pure Chemical	46
维生素C(抗坏血酸，2毫摩尔)，Roche Japan	104

从表8-1中可以看出，尽管在UV辐照前除去了培养上清液，使得UV辐照时几乎无尿抑素残留，培养在10％胎牛血清-SHEM改进培养基中与0．3微摩尔或3微摩尔尿抑素(67B8批)接触的细胞明显比无尿抑素组和加入抑肽酶组的多。0．3微摩尔尿抑素组中的活细胞数几乎等于未经辐照的对照细胞数，因此得出结论，尿抑素几乎完全保护了细胞防止了由紫外辐照可能引起的所有损伤。在3微摩尔尿抑素组中，活细胞数增加超过了未接触UV辐照的对照细胞数。该结果提示，除了保护细胞抵抗UV辐照的作用外，尿抑素它还表现出对细胞的增殖有促进作用(如实施例2所证实的作用)。

另一方面，抑肽酶没有观察到有细胞保护作用，而是发现它有增强紫外光致死作用的趋势。因此，尿抑素的保护机制与抑肽酶所观察到的已知蛋白酶抑制活性明显不同。

另外，当与迄今已知的自由基淬灭剂(抑制剂)比较来评价上述作用时，尿抑素显然是非常有效的，这可从表8-2看出。

据报道[Advances in Medicine，142，895-896，1987]，尿抑素在体外淬灭(抑制)自由基的50％有效浓度约为1微摩尔。在本实施例中，在接触培养阶段，证实有效的尿抑素浓度为0．3微摩尔，由于含有尿抑素的培养上清液在UV辐照前被弃去，因此在产生大量自由基的UV辐照阶段，尿抑素的浓度看来降低至小于一个分数的数量级。即使假设在辐照阶段保留了5％的尿抑素，其浓度应减少到低至0．015微摩尔。因此，如此极少量的尿抑素显然仍然能够保护细胞抵抗紫外辐射损伤。

因此，在尿抑素抵抗UV诱导的损伤的细胞保护机制中，已知的自由基淬灭(抑制)作用以外的未知因素显然起着非常重要的作用。

另据报道，尿抑素具有使溶酶体膜稳定的特性。它对人角膜上皮细胞抵抗紫外辐射损伤的保护作用也暗示，尿抑素对上皮细胞膜也有保护作用。

为了研究实施例7中所用的各细胞组中的膜裂解，在UV辐照前后测定了每个细胞组中培养上清液的乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果，在对照组、加尿抑素组和加抑肽酶组中均未能检测到LDH活性。

鉴于LDH缺失可能由DNA损伤引起，用表面活性剂吐温80裂解每个细胞组中的细胞膜，测定裂解液中的LDH活性加以确认。结果，在所有细胞组中均发现了正常水平的LDH活性。该发现表明，实施例7中所用UV照射水平不足以诱导细胞膜裂解。因此，发现尿抑素对上皮细胞抵抗UV诱导损伤的保护作用并非归因于细胞膜的保护作用(这可能与尿抑素使溶酶体膜稳定的已知作用相似)。

前述内容提示，尿抑素保护人角膜上皮细胞抵抗UV诱导的损伤的主要机制是一种未知的机制，它与已知的3种作用，即(1)自由基淬灭(抑制)作用、(2)蛋白酶抑制作用，和(3)溶酶体膜稳定化作用的任一种无关。

实施例8

尿抑素在193纳米UV诱导的人角膜上皮细胞损伤中的效果

将人角膜上皮细胞系HCEC悬于10％胎牛血清-SHEM改进培养基至浓度为1×10⁵细胞／毫升，取500微升的该细胞悬液接种到24孔多孔板(Corning)的每个孔中。在5％CO2培养箱中37℃培育细胞16至17小时。培养结束后，彻底弃去上清液，在每个孔内加入500微升含有样品的10％胎牛血清-SHEM改进培养基。使细胞在样品存在下在上述相同条件下再培养2小时。在与样品接触的培养结束后，彻底除去培养上清液，从而使多孔板中基本上不留下样品残余物。

用193纳米UV光在10-30厘米距离处辐照该条件下的多孔板5秒。辐照后，在每个孔中加入500微升含有上述相同样品的10％胎牛血清-SHEM改进培养基，使细胞在上述相同条件下再培育16-17小时。然后，用实施例7所述的相同方式，计数活细胞，评价各尿抑素(67B8批)和抑肽酶保护人角膜上皮细胞抵抗UV诱导损伤的作用。结果显示在表9中。显然尿抑素有依赖于浓度的细胞保护作用。另一方面，抑肽酶显示出没有保护作用。

表9尿抑素在193纳米UV诱导的人角膜上皮细胞损伤中的效果

样品(浓度，微摩尔)	保护作用(％)
尿抑素(0．3)	134
尿抑素(0．3)	145
抑蛋白酶肽(0．3)	94
抑蛋白酶肽(0．3)	83

实施例9

尿抑素在药物诱导的人角膜上皮细胞损伤中的效果

将人角膜上皮细胞(HCEC)悬于10％胎牛血清-SHEM改进培养基至浓度为1×10⁵细胞／毫升，取500微升的该细胞悬液接种到24孔多孔板(Corning)的每个孔中。在5％CO₂培养箱中37℃培育细胞24小时。然后弃去上清液，用500微升PBS(-)(Nissui Pharmaceutical)清洗每个孔中的细胞两次后，用500微升不含血清的培养基来代替该培养基。使细胞在5％CO₂培养箱中再37℃培育12小时。培养结束后，弃去培养上清液，用PBS(-)洗涤细胞两次，加入500微升含有尿抑素(67B8批)、不含血清的培养基。在5％CO2培养箱中37℃培育细胞12小时。培养结束后，弃去上清液，用PBS(-)洗涤细胞两次，加入500微升抗绿内障药物Rescura(活性组分：非普洛酮(unoprostone)异丙酯0．12毫克／毫升；UenoPharmaceutical)，该药物预先用无血清培养基稀释至非普洛酮异丙酯浓度为0．05毫克／毫升。然后使测试板室温静置10分钟。随后，回收培养上清液，测定作为细胞毒性指示剂的LDH活性。结果显示在表10中。显然，尿抑素表现出依赖于浓度的抗细胞毒性作用。

表10尿抑素在药物诱导的人角膜上皮细胞损伤中的效果

尿抑素浓度(微克／毫升)	LDH 活性(570纳米吸光度，平均值±SD)
0	0．336±0．06
1	0．304±0．06
10	0．065±0．05
100	0．018±0．07
对照(不加入Rescura)	0．014±0．005

实施例10

尿抑素在正庚醇诱导的家兔角膜上皮损伤中的治疗效果

使体重2．5-3．0千克的日本白色家兔(Kitayama-Labes)习服至少一周，在确认角膜等没有任何异常后进行实验。实验在室温为23±3℃、相对湿度为50±20％的控制环境下进行。肌内给予每只家兔氯胺酮盐酸盐进行全身麻醉，然后将0．4％奥布卡因盐酸盐滴入右眼进行局部麻醉。然后，将直径为6毫米的正庚醇浸透的滤纸接触角膜中央表面60秒，以腐蚀待脱下的上皮，随后即引起损伤。在切除该上皮后，立即开始滴入测试溶液，2小时间隔总共滴6次(每剂50微升)。第二天，在切除后24小时，每隔2小时滴一次，总共滴6次。用盐水作为对照。用0．5％荧光素钠溶液对损伤区域染色，在切除上皮后立即、以及其后12、24、30、36和48小时对染色区域照相测定角膜上皮损伤面积。

表11中显示了对角膜上皮伤口愈合的效果。显然，在切除后12-48小时内，与滴入盐水组相比，滴入1500单位／毫升以及6000单位／毫升尿抑素促进了角膜伤口愈合。

表11尿抑素在正庚醇诱导的家兔角膜上皮损伤中的治疗效果

角膜上皮切除即刻(0小时)的角膜损伤面积取为100％。每个值表示平均值±SD(n=7)。^*p＜0．05，^**p＞0．01，^***p＜0．001对于对照实施例11

尿抑素在UV诱导的人结膜上皮细胞损伤中的效果

将人结膜细胞ATCC CCL20．2悬于10％胎牛血清-DMEM／F12培养基中至浓度为1×50⁵细胞／毫升，取500微升该细胞悬液接种到24孔多孔板(SumitomoBakelite)的每个孔内，在5％CO₂培养箱中37℃培育16-17小时。彻底弃去培养上清液，每个孔内加入500微升含有测试样品(尿抑素67B8批；最终浓度为100微克／毫升)的10％胎牛血清-DMEM／F12培养基。使细胞在上述相同条件下进一步培育。在接触样品的培养结束后，充分除去培养上清液。用UV-B(312纳米，100mJ／cm2)辐照处于该条件下的多孔板。UV-B辐照后，在每个孔内加入500微升10％胎牛血清-DMEM／F12培养基，使细胞在上述相同条件下培育16-17小时。然后，在培养基中加入1／10体积的WST-8溶液(细胞计数试剂盒-8，DojinChemical)，37℃反应4小时。然后，测定胞内脱氢酶活性所产生的水溶性甲_在450纳米下吸光度，以估计活细胞数。然后，如实施例7那样进行同样的计算，评价细胞保护效果。结果显示在表12中。显然，尿抑素具有抵抗UV-诱导损伤的保护作用。

表12尿抑素在UV-诱导的人结膜上皮细胞损伤中的效果

	细胞增殖(A450nm,平均值±SD)	保护作用(％)
尿抑素(0．3微摩尔)	0．556±0．015	173
尿抑素(3微摩尔)	0．765±0．009	238

实施例12

尿抑素在药物诱导的人结膜上皮细胞损伤中的效果

用10％胎牛血清-DMEM／F12培养基(1×10⁵／毫升)配的人结膜上皮细胞ATCCCCL20．2悬液以300微升／孔接种48孔测试板，在5％CO₂培养箱中37℃培育细胞。

48小时后，确认细胞已经完全铺满，弃去上清液，用PBS(-)洗涤细胞两次，并悬于无血清的DMEM／F12培养基中。在5％CO₂下37℃培育细胞12小时，随后再次弃去上清液。用PBS(-)洗涤细胞两次，加入预先用PBS(-)稀释至不同浓度的尿抑素(67B8批)300微升。在5％CO₂下37℃培育细胞12小时，再次弃去上清液。然后用PBS(-)洗涤细胞两次，加入300微升抗绿内障药物Timoptol(活性组分为马来酸噻吗洛尔50毫克／毫升；Banyu Pharmaceutical)，该药物预先用PBS(-)稀释至马来酸噻吗洛尔浓度为1．25毫克／毫升。20分钟后，再次用PBS(-)洗涤测试板两次，加入300微升DMEM／F12。12小时后，加入WST-8，37℃反应2小时。然后测定450纳米吸光度，以估计活细胞数。结果显示在表13中。显然，尿抑素显示出依赖于浓度的细胞保护作用。

表13尿抑素在药物诱导的人结膜上皮细胞损伤中的效果

尿抑素浓度(微克／毫升)	细胞增殖(A450nm，平均值±SD)
对照(没有加入药物)	0．738±0．025
0	0．277±0．090
1	0．577±0．120
10	0．686±0．065
100	0．747±0．096

n=6

实施例13

尿抑素对于人结膜上皮细胞产生粘蛋白1的作用

将人结膜上皮细胞(ATCC CCL20．2)悬于10％胎牛血清-DMEM／F12培养基(Gibco)中，接种在96孔板上，每个孔5000个细胞。在5％CO₂培养箱37℃培养细胞过夜，使细胞粘附在测试板上。然后用含有样品的相同培养基代替该培养基，再培养细胞2天。此后，用下列酶免疫试验测定粘蛋白1的产量。因此，在用70％乙醇固定细胞后，每个孔内加入250微升1％牛血清白蛋白-PBS，使板在在室温下静置2小时。然后加入经PBS稀释的抗粘蛋白1小鼠抗体(Pharmingen)，在室温下反应2小时。用PBS洗涤平板3次。然后加入PBS预先稀释的过氧化物酶-标记的抗小鼠IgG抗体(Santa Cruz Biotechnology)，室温下反应2小时后，用PBS洗板4次。随后，加入200微升过氧化物酶底物(含有0．012％过氧化氢和1．6毫克／毫升邻苯二胺的0．1M磷酸盐缓冲液，pH 6．2)，在室温下反应20分钟，最后加入50微升4．5N硫酸中止反应。用微板读数仪测定吸光度(490纳米-660纳米)，以估计粘蛋白1的产量。结果显示在表14中。取采用不含尿抑素培养基的对照培养的吸光度平均值作为100％。尿抑素明显显示出对于粘蛋白1的产生有依赖于浓度的促进作用。

表14尿抑素对于人结膜上皮细胞产生粘蛋白1的影响

样品(加入量 微克／毫升)	粘蛋白1的产生(％±SE)
未加入(0)	100
尿抑素(50)	111±6．0
尿抑素(200)	123±6．8*

n=5，^*p＜0．05实施例14

尿抑素在大鼠强制抽风(forced-open air-draft)干眼模型中对角结膜上皮损伤的作用

采用6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠。预先确认动物的前眼节(anterior eyesegment)和眼睑没有异常。在10只大鼠的左眼，滴入尿抑素溶液(67B8批，用盐水稀释至500微克／毫升)，每剂5微升，每日6次，持续1周。在对照右眼中，以相似方式滴入盐水。最后一次滴入后2小时，用以下方法使角结膜脱水，以诱导角结膜上皮损伤，评价尿抑素对该损伤的作用。

在用戊巴比妥40毫克／千克(腹膜内)麻醉下，使上述处理的10只大鼠的眼睑足够回缩开放，在距离眼前方6厘米处持一烘干机，使眼的整个前眼节暴露于抽风机下15分钟，以使泪水蒸发，角结膜脱水，从而诱导产生角结膜上皮损伤。在诱导了上皮损伤后，滴入5微升Rose Bengal溶液，然后用盐水彻底洗涤，从而对缺失粘蛋白的角结膜部分染色。然后，静脉内给予过量的戊巴比妥，处死动物，小心地取出包含球结膜的眼球，立即观察没有被Rose Bengal染色的粘蛋白覆盖的损伤部位。根据诊断干眼的标准(干眼研究组，1995)，在0至3点或总共9点的评分范围上对球结膜和角膜的每一鼻侧和耳侧的染色程度评分，以定量测定阳性的Rose Bengal染色。评分越高，角结膜上皮损伤的严重程度就越高。这种评分由一位检查者进行，通过掩藏右眼和左眼之间的差别来进行评价。

结果显示在表15中。在500微克／毫升尿抑素滴入组中，与滴盐水组相比，脱水导致的角结膜损伤明显被抑制(P＜0．05)。因此，尿抑素显然抑制了干眼中角结膜的粘蛋白覆盖缺损。

表15尿抑素在与干眼有关的角结膜上皮损伤中的效果眼球角结膜中的评价评分(大鼠)

评分	尿抑素	对照
9876543210	0000102151	0102021310
平均评分	1．8±1．5	3．8±2．3

生产实施例1

尿抑素(比活为4000至2000单位／毫克蛋白)    50毫克蛋白

氯丁醇        10毫克

氯化钠        240毫克

磷酸二氢钠    240毫克

磷酸一氢钠    200毫克

将上述组分溶于100毫升无菌蒸馏水中，通过膜过滤灭菌，将滤液分送到灭过菌的眼药瓶(每瓶10毫升)中，以提供眼用溶液。

实用性

本发明的用于结膜上皮疾病的治疗组合物可用作预防和治疗哺乳动物(包括人)角膜上皮疾病(即疱疹性角膜炎、细菌性角膜溃疡、麻痹性角膜炎、糖尿病性角膜病和物理或化学损伤引起的角膜上皮疾病)的药物。

本发明的用于UV诱导的角结膜上皮疾病的治疗组合物可用作预防和治疗紫外辐射诱导的角结膜上皮疾病的药物。

本发明的用于角膜切除手术后角膜上皮并发症的治疗组合物可用作治疗和预防角膜切除手术后角膜上皮并发症的药物。

另外，本发明的用于药物诱导的角结膜上皮疾病的治疗组合物可用作药物诱导的角结膜上皮疾病的治疗性药物，它能除去具有伤害角结膜上皮可能性的眼药的副作用，并能恰当地表明了眼药的适应症。

最后，本发明的用于干眼的治疗组合物可用作预防和／或治疗干眼的药物。

Claims (5)

1．一种用于角膜上皮疾病的治疗组合物，它可用于预防和／或治疗角膜上皮疾病，该组合物包括尿抑素作为活性成分。

2．一种用于UV-引起的角结膜上皮疾病的治疗组合物，它可用于预防和／或治疗UV-引起的角结膜上皮疾病，该组合物包括尿抑素作为活性成分。

3．一种用于手术后角膜上皮并发症的治疗组合物，它可用于预防和／或治疗手术后角膜上皮并发症，该组合物包括尿抑素作为活性成分。

4．一种用于药物诱导的角结膜上皮疾病的治疗组合物，它可用于治疗因给予眼科药物引起的角结膜上皮疾病，该组合物包括尿抑素作为活性成分。

5．一种用于干眼病的治疗组合物，它可用于预防和／或治疗干眼病，该组合物包括尿抑素作为活性成分。

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