WO1999043347A1

WO1999043347A1 - Medicaments destines aux troubles de l'epithelium corneen

Info

Publication number: WO1999043347A1
Application number: PCT/JP1999/000853
Authority: WO
Inventors: Ryoki Takahashi; Takayasu Noguchi; Kiyoshi Akiba; Takeo Omura
Original assignee: Wakamoto Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1998-02-25
Filing date: 1999-02-25
Publication date: 1999-09-02
Also published as: KR20010041337A; CA2321704A1; CN1291898A; AU752950B2; AU2639799A; EP1060748A1; EP1060748A4; TW443931B

Description

明細書角膜上皮障害症治療剤技術分野

本発明は、ゥリナス夕チンを有効成分とする薬剤であって、角膜上皮障害症、紫外線角結膜上皮障害症、角膜切開術施行後角膜上皮障害症、薬剤性角結膜上皮障害症及びドライアイに対して、その予防及び治療のために用いる薬剤に関するものである。背景技術

角膜は、眼球の前極にあって水晶体前房を透明に覆っており、上皮細胞層、ポ一マン膜、実質層、デスメット層及び内皮細胞層からなる整然とした層構造を有する組織である。結膜は、角膜から連なるように眼球表面部及び瞼裏部に存在しており、形態学的には眼瞼結膜、円蓋結膜及び眼球結膜に分類できるが、組織学的には上皮層及び実質層からなるものである。本明細書においては、角膜及び結膜を総称して「角結膜」という。

角結膜の障害は、角結膜の表面から上皮に欠損が生じることによって引き起こされるものと考えられている。角結膜障害症は、角膜ヘルぺス、細菌性角膜潰瘍、神経麻痺性角膜炎、糖尿病性角膜症、シエーダレン症候群、ステイーブンス · ジョンソン症候群、眼球乾燥症候群（ドライアイ）等の内因性疾患に伴う角結膜上皮障害、術後、薬剤性、外傷、コンタクトレンズ装用等による外因性疾患又は物理的若しくは化学的障害によって生じる。

このような角結膜障害症のなかで、角膜上皮障害症は、病因によっては、角膜上皮障害症から上皮の再生が認められない難治性角膜障害に進行し、視力障害や失明に至ることもあることから、問題視されている。

そのような視力の回復には、角膜上皮の正常な再生被覆がすみやかに行われる必要がある。

角膜上皮創傷治癒の機序は、第 1相から第 3相まであり、第 1相は上皮細胞の接着，伸展 ·移動、第 2相は上皮細胞の増殖、第 3相は上皮細胞の分化からなり、第 3相を経て初めて整然とした層構造をもつ上皮に戻る。

角膜上皮創傷治癒の調節、制御因子として知られているものとして、第 1相の過程で促進的に作用するフイブロネクチン、ヒアルロン酸、 I L— 6、 Ep i d e rma l g r owt h f a c t o r (E G F) 等の成分がある。またサブスタンス Pは、 EGFや I n s u l i n l i k e g r owt h f a c t o r ( I GF- 1) と共存して上皮細胞の伸展 ·移動に促進的に働く。

第 2相の上皮細胞の増殖に促進的に作用する成分は、 EGF、 FGF (f i b r o b 1 a s t g r owt h f a c t o r) > k e r a t i n o c y t e g r owt h f a c t o r (KGF) > He p a t o c y t e g r owt h f a c t o r (HGF) 等が知られている（Go s p o d a r— ow i c z, D. , e t a 1. ： Exp. Ey e Re s. , 25, 631 - 649 (19 77) ； S o t o z on o, C. , e t a 1. ： E x p . Ey e Re s. , 59 , 385 - 392 ( 1994) ； Wi l s on, S. E. , e t a 1. ： Oph t h a lmo l . V i s. S c i . , 34, 2544- 2561 ( 199 3) ) 。

第 3相の上皮細胞の分化は、ビタミン Aによって促進されることが知られている。

このような成分のなかで、角膜上皮創傷の積極的な治療法として、臨床的に応用されているのがフイブロネクチンやヒアルロン酸の点眼である。フイブロネクチンやヒアルロン酸が角膜上皮細胞の接着 ·伸展を促進し、特に、フイブロネクチンは非常に低濃度で著効を示すこと等が確認されている。

しかし、フイブロネクチンやヒアルロン酸の作用は角膜上皮創傷治癒の第 1相の過程で主に働くもので、第 2相の上皮細胞の増殖作用は弱い。また、 EGF、 FGF, KGF及び HGF等の増殖因子は血管新生を誘発する危険性を持っていて、医薬品とするには致命的な副作用と考えられる（三井洋司、他：血管新生のメカニズム；眼科 N e w I n s i gh t Vo l . 3 眼内血管新生性疾患、 8— 20、メジカルビユー社（ 1994) ) 。

事実、 EGF、 FGFによる血管新生が報告されている（S c hwe i— g e r e r， L. , ： Z. Ka r d i o l . 78 , 12 - 15 ( 1989) ； Tan

1 g u c h i . E. ， e t a 1. ： N i p p on G a n k a G a k k a i Z a s s h i , 95, 52— 58 ( 1991) ； N e z u, E. , e t a 1

. ： J p n. J. Oph t h a l mo l . , 36, 401—406 ( 1992) ) 。更に、これらの増殖因子の製造が極めて困難であることも医薬品とすることへの障害になっている。

以上のように、角膜上皮障害症治療剤の有効成分とするには、これまで公知の化合物はいずれも満足できるものではなく、更に優れた化合物が強く望まれていた。

一方、角膜潰瘍の発生機序として、コラゲナーゼ等のプロテア一ゼの関与が重要であることは古くから推定されていた（糸井素一：臨眼、 879 - 88

2 ( 1 970) ) 。実際、システィン等のコラゲナーゼインヒビ夕一が実験的な角膜潰瘍を抑制すること及びその臨床応用も報告されている（B r own, S I

. ， e t a 1. ： Ar c h. O h t h a l mo l . , 82 , 95— 97 (1 969) ； B r own, S I . , e t a l . ： Ar c h. Oph t h a l mo

1 · , 8_3_, 352 - 353 ( 1970) ；平野順三、他：臨眼、 49-

54 ( 1975) ；布村元、他：臨眼、 L1_， 88 - 90 ( 1975) ) 。しかし、それらの治療効果は満足の行くものではなかった。

また、角膜上皮創傷治癒過程の第 1相において、上皮細胞の移動は非常に重要であり、一般的に細胞の移動には、伸展する細胞の先端にプロテア一ゼの局在することが必要であると考えられていることから、角膜上皮細胞の伸展 ·移動とプ口テア一ゼの関係がプロテア一ゼインヒビターを用いて研究されてきた。

森本らは、各種のプロテアーゼインヒビ夕一を用いて研究し、ロイぺプチン（ t h i o l p r o t e a s e i nh i b i t o r) 、ァフロチニン ( s e r i n e p r o t e a s e i nh i b i t o r) 、オボ a ₂—マクログロブリン（g e n e r a l p r o t e a s e i nh i b i t o r) は、いずれも角膜上皮細胞の伸長を抑制した（森本啓介、他：コラーゲン研究会抄録、 ϋ, 1

70 - 173 (1 987) ) 。

以上のことは、プロテア一ゼインヒビ夕一としてぺプス夕チン（p e p s t a t i n ; a c i d p r o t e a s e i nh i b i t o r) 、 1， 10—フエナンス口リン（1， 10— ph e n an t h r o l i n e ； me t a l 1 o p r o t e a s e i nh i b i t o r) 、ァプロチニン、ap r o t i n i n ; s e r i n e p r o t e a s e i nh i b i t o r) 、フエ二レメチリレス Jレフォニ Jレフルオリド（ph e ny l me t hy l s u l f ony l f l u o r i d e) を用いた Z i e s k eらの研究によっても示されている（Z i e s k e， J . D. & Bu ku s o g l u G. : I nv e s t i g a t i v e O p h t h a 1 mo 1 o g y & V i s u a l S c i e n c e, 32 , 2073 - 2078 (1 99 1) ) 。いずれにせよ、角膜上皮創傷治癒にとってプロテア一ゼインヒビ夕一はマイナスの作用を与える面があることが示唆されて来た。

しかしながら、ある種のプロテア一ゼインヒビ夕一、例えば、タンパク性プロテアーゼインヒビ夕一であるァプロチニン、 —アンチトリプシン等が、ヒト線維芽細胞ゃヒト内皮細胞の増殖因子になることが知られている（Og awa， M. ， e t a 1. ： Re s C ommu n . Ch em. P a t h o l . P h a r ma c o 1. 50 , 1 55— 158 ( 1985) ； S c o t t, G. K. ， e t a 1. ： B i o l . Ch em. Ho p p e— S e y l e r, 369, 131 — 1 35 ( 1 988) ； Mc k e e h an, W. L. , e t a 1. ： J . B i o 1. Ch em. 261, 5378— 5383 ( 1986) ) 。

また、前述したような角膜潰瘍発生に関与するコラゲナーゼ産生にはプラスミノーゲンァクチべ一夕一プラスミンシステムが必要であることが知られていた (B e rman, M. , e t a 1. ： I nv e s t. Oph t h a lmo l . V i s . S c i . 1 9, 1204 - 122 1 (1980) ) 。従って、プラスミンインヒビターが角膜上皮創傷治癒作用を有することが推定されていた。

ァプロチニンが強力なプラスミンインヒビタ一であることは、古くから知られていた（F e e n e y, R. E. ， e t a 1. ： J. B i o l . Ch em. , 25, 1 957 - 1 960 ( 1969) ) 。そして、ァプロチニンがヒトでの角膜上皮創傷治癒に応用され、有効性においてある程度の成果は得られていた（特公平 7— 72 139号公報； US P 4, 849, 406 ; ΕΡ 0 223 254 B l ; S a l on e n, E-M. , e t a 1. ： A c t a O p h t h a 1 mo 1 o g i a 65, 3 - 12 (1987) ) 。

しかし、前述したように、ァプロチニンは、角膜上皮障害症治療にとって非常に重要な角膜上皮細胞の移動に対して逆に阻害作用を有していること（Z i e s k e， J. D. &Buku s o g l u G. : I nv e s t i g a t i v e O ph t h a l mo 1 o gy & V i s u a l S c i e n c e 32 , 207 3 - 2078 (1991) ) 、また、血管新生の危険性が懸念されること等により、角膜上皮障害症治療剤として活用するには至らなかった。

また、近年、角膜損傷治癒にはプラスミノ一ゲンァクチべ一夕一の活性保持が重要であることが分かって来た（Mo r i mo t o， K. ， e t a 1. : T h r omb o s i s an d Ha emo s t a s i s 69， 387 - 39 1 ( 1993) ) 。そこで、角膜上皮障害症治療剤としては、プラスミン及びプラスミノーゲンァクチべ一夕に対して阻害作用を示さないか、阻害してもその阻害活性が非常に弱く実質的な阻害作用を有さない化合物が望まれて来た。ァプロチニンは強力なプラスミン阻害剤であることも医薬にできなかった理由の一つと考えられる。

また、コラゲナーゼを含めて、その他のプロテア一ゼをも強く阻害する特異性の広いタンパク性プロテアーゼインヒビターであるオボマクログロプリンを難治性角膜疾患の治療に応用している報告もあり、ある程度の成果が得られたが（鎌田龍二、他：臨眼， AA， 233 - 237 ( 1 991) ；鎌田龍二：日本の眼科， 64， 955— 960 ( 1993) ) 、応用されたオボマクログロブリンは二ヮトリ卵白由来の異種タンパクであり抗原性やアレルギー反応が生じる可能性が高いこと等より角膜上皮障害治療剤として活用させるには満足の行くものではなかった。

これらの報告から、タンパク性プロテアーゼインヒビターがヒト角膜上皮細胞の増殖を促進し、創傷治癒に効果を示す可能性が考えられたが、プラスミンゃプラスミノーゲンァクチべ一ターを阻害すること、更には血管新生や抗原性等の致命的欠陥が危惧され、ヒトに投与する医薬品とするためには更に優れた化合物の発見が望まれていた。ところで、角結膜障害症については、近年、紫外線に原因するものが注目されている。日光に目がさらされる状況、例えば、海水浴時等において、紫外線は角結膜上皮に照射され、種々の因子によって角結膜上皮の障害を起こす。

紫外線による角結膜上皮障害症としては、以下のようなものが知られている。壊死や剥離を伴う光角膜炎（B e r gma n s o n J P : Co r n e a l d ama e i n ph o t o k e r a t i t i s— Why i s i t s o p a i n f u l ? ; Op t om. V i s. S c i . , 67， 407— 413 ， 1990) 、疼痛ゃ羞明、瞼痙攣を特徴とする "雪目" 、紫外線惹起の複数病因による白内障の誘発（H i g h t owe r KR : A r e v i ew o f t h e e v i d e n c e t h a t u l t r a v i o l e t i r r a d i a t i o n i s a r i s k f a c t o r i n c a t a r a c t o g e n e s i s ; Do c. Oph t h a l mo l . , 88， 205 - 220, 19 94) 、ランゲルハンス細胞の障害に伴う免疫反応の低下（Ke 1 1 e y J G . , e t a l ： L ang e r h an s c e l l a l t e r a t i o n s i n t h e gu i n e a p i g c o r n e a ; I nv e s t Oph t h a 1 mo 1 V i s S c i . , 26, 1293- 1296, 1985. Ra y— K e i 1 L . , e t a l : Re du c t i on i n t h e i n c i d e n c e o f r e j e c t i on o f h e t e r o t o p i c m u r i n e c o r n e a l t r an s p l an t s by p r e t r e a t m e n t w i t h u l t r av i o l e t r a d i a t i on ; T r a n s p l an t a t i o n, 42， 403 -406, 1986) 。

炎症性サイトカインの誘導（Ke nn e dy M, e t a 1 ： U 1 t r a v i o l e t i r r ad i a t i on i ndu c e s t h e p r o du c t i o n o f mu l t i p l e c y t o k i n e s by huma n c o r n e a l e e l I s ; I nv e s t Oph t h a lmo l V i s S c i . , 38, 2483— 2491， 1997) 、 DNA障害（R e d d y VN, e t a 1 ： T h e e f f e c t o f a qu e ou s humo r a s c o r b a t e on u l t r a v i o l e t— B— i ndu c e d DNA d ama g e i n l e n s e p i t h e l um ; I nv e s t Oph t h a lmo l V i s S c i . ， 39， 344— 350， 1998) 、そして神経障害（T r a b u c c h i G, e t a 1 ： C o r n e a 1 n e r v e d ama g e and r e g e n e r a t i o n a f t e r e x c i me r l a s e r p h o t o k e r a t e c t omy i n r a b b i t e y e s ； I nv e s t Oph t h a lmo l V i s S c i . ， 35， 229 - 235, 1 994) 等。

このような疾患のほとんど全てが角結膜上皮細胞に対する障害を伴うものであり、紫外線によりスーパーオキサイド、ハイド口ォキシラジカル、ハイド口パーォキシド等のフリーラジカルが生成し、これらのフリーラジカルによる障害が主要因と考えられている。

生体の恒常性維持作用を考慮すると、このようなフリーラジカルを消去又は抑制するに充分な量のラクトフエリン（約 2mg/m l涙）やダル夕チオンが涙液に備わっていると考えられる。

従って、紫外線による種々の角結膜上皮障害は、紫外線により発生したフリーラジカルが引き金ではあるが、それ以上に生体の恒常性維持機能に重要な病因があると考えるのが適切である。

このような考えから、フリーラジカルの消去又は抑制作用とともに、生体防御機能も促進する作用を兼ね備えた薬剤が、紫外線による角結膜上皮障害に対して適用することができ、その予防と治療に役立つものと考えられた。

紫外線障害に対する防御効果を有する生理的な点眼剤として、これまでに、グルタチオン、ビタミン C、ビタミン E等が知られている。また生理的には涙液にあるラクトフエリンゃグルタチオンが、種々の要因で生じるフリーラジカルを消去し、角結膜上皮障害を防御することが知られている（Me g aw JM： G 1 u t a t h i on e and o c u l a r pho t o b i o l o gy ; Cu r r . Ey e Re s. ， 3， 83— 87, 1984) 。

更に、紫外線遮断コンタクトレンズの応用も試みられている（B e r gman s on J P： T h e s i gn i f i c an c e o f u 1 t r a v i o 1 e t r a d i a t i on f o r e y e d i s e a s e s . A r e v i e w w i t h c o mm e n t o n t h e e f f i c a c y o f U V— b l o c k i n g c on t a c t l e n s e s ; Oph t h a l m i c Phy s i o l Op t. , 15, 83— 91， 1995) 。

しかし、このような公知の薬剤や成分、装具は、紫外線により発生したフリーラジカルを消去し防御することが主な作用であり、眼の恒常性維持の考え方からは、決して満足できるものではなかった。さて、近視の矯正方法として、近年、角膜切開術が注目されている。極めて古くから、近視の矯正はメガネの着用ゃコンタクトレンズの装着により行うことが一般的であつたが、メガネ着用には、美容上の問題や日常生活における煩わしさの問題があり、コンタクトレンズの装着には、事故による角膜損傷の問題等があり、近視の矯正を根本的に行う方法が望まれていた。

これに対して、角膜切開術は、一度の施術によって近視の矯正を行うことができるので、その後にメガネの着用やコンタクトレンズの装着等の煩わしさがなくなることから、革新的手段として注目されるようになったものである。

しかしながら、角膜切開術施行後にも角膜切開術の施行方法によっては角膜上皮障害症が発症することがあり、その予防及び治療方法の確立が、角膜切開術の普及に欠くべからざるものとして研究されるようになった。

角膜切開術とは、矯正の程度に応じて、角膜表面を所定の形状、所定の大きさに切開することにより、近視を矯正させようとする手術であり、 r e f r a c t i v e k e r a t e c t omy (RK) と呼ばれている。

RK施術にあたっては、角膜の切開のためにダイヤモンドナイフを用いる手法が行われていた。この手法は、手術顕微鏡に取り付けた固視灯を患者に注視させつつ、術者がフリーハンドで角膜を切開してゆくものである。

このような手法においては、感染予防と術後状態の良好化のために、術後にステロイドと抗生物質を点眼することが行われている。

一方、角膜切開術のいま一つの手法は、 ph o t o r e f r a c t i v e k e r a t e c t omy (PR K) であり、エキシマレーザ一器械により切開を行うものである。

PRKは、術者の技量により手術精度が変化しないから、切開形状や切開長さの微妙な差異によって極めて異なる術後経過をたどる角膜切開術においては好ましい手法として、近年極めて注目を集めており、また、その器械も日々着実に進歩している。角膜切開術は、 P R Kに集約されるものと期待されている。

P R Kは、ェキシマレーザーのレーザービームを角膜上皮に照射することにより、当該箇所を切開するものである。この方法によれば、近視矯正のほか、遠視矯正や乱視矯正も行うことができるので、極めて有効な視力矯正方法となる。これらは、近年は、屈折矯正手術と呼ばれるようになった。

エキシマレーザーを用いる P R Kは、その優れた矯正効果が確認される一方、種々の合併症が報告されている。例えば、角膜各層において上皮欠損が生じるが、これはエキシマレ一ザ一手術では不可避的に生じるものであって、激しい痛みを伴う場合もある。

また、術後の一定期間においては、上皮下混濁が必ず生じることが観察されている。術後 1 2力月で消失するものではあるが、その期間の視力障害を避けることができないことから問題視されることが多い。更に、角膜内皮において、細胞数が有意に減少することが観察されている。

従って、これらの合併症の克服が、エキシマレ一ザ一を用いる P R Kの一段の普及に欠かせないものとして注目されている。

エキシマレ一ザ一は波長 1 9 3 n mの紫外線を用いるものであるので、角膜上皮細胞の波長 1 9 3 n mの紫外線に対する抵抗性を増加させる物質を発見することができれば、このような問題が解決される可能性があった。ところで、眼科用剤として総称される眼の疾病に対する予防、診断及び又は治療のための薬剤は、眼科領域における疾病に適用するために内服薬剤や点眼薬剤の種々のものが開発され、適用されている。

これらが適用される眼の疾病としては、例えば、緑内障、白内障、角膜疾患、強膜疾患、網膜疾患、ぶどう膜疾患、硝子体疾患、視神経疾患、結膜疾患、涙器疾患、眼窩疾患、眼精疲労等を挙げることができ、更にこれらは、眼科における各種手術の術前、術中、術後にも適用されている。

これらの予防、診断及びノ又は治療のための薬剤としては、例えば、緑内障治療剤、白内障治療剤、抗菌剤（抗生物質、合成抗菌剤）、副腎皮質ホルモン剤、散瞳剤、縮瞳剤、サルファ剤、局所麻酔剤、血管収縮剤、血管拡張剤、収斂剤、酵素製剤、抗アレルギー剤、非ステロイド消炎剤、抗真菌剤、抗ウィルス剤、角膜保護 ·治癒促進剤等を挙げることができる。

これらの眼科用剤のなかには、眼の疾病には有効であっても、副作用として重篤な角結膜上皮障害症を引き起こす作用を有するものがある。このような副作用を有するものは、従って、有効な眼科用剤として用いることができない。そこで、これらの薬剤と同時に投与することにより、副作用を消失させることができる物質であって、有効な眼科用剤として用いることができるようにすることができる物質が望まれていた。さて、角結膜障害症のなかで、近年注目されているものにドライアイがある。ドライアイは、コンタクトレンズ装用者の増加、人工的空調環境中での生活時間の延長、テレビやコンピュータ等の V D T画面の凝視機会の増加等によって増加傾向にあり、問題視されているものである。

ドライアイは、涙液の低下又は質に異常をきたした状態をいい、角結膜障害の有無を問わないものとされている（山田ら。日本眼科紀要、 4 3， 1 2 8 9 - 1 2 9 3 ( 1 9 9 2 ) ) 。これによれば、涙液減少症、乏涙症、眼乾燥症、シェ一ダレン症候群、ステイーブンス ·ジョンソン症候群、眼類天疱胞、眼瞼縁症、閉眼不全、知覚神経麻痺等の疾患がドライアイの範疇に含まれることとなる。

ドライアイについては、角結膜上皮のムチンとの関係が指摘され、種々の研究が行われてきている。角膜上皮、杯細胞以外の結膜上皮が共通して産生するものとしてムチン 1が知られている（あたらしい眼科、 V o l . 1 4 . N o . 1 1 , 1 9 9 7 ) 。ドライアイの治療法の一つとして、このムチンの代用品としてのメチルセルロース、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の粘弾性物質を含有する人工涙液の点眼等が行われている。しかしながら、これらの物質はムチンとは物理学的性質や生理学的性質が異なるため、その治療効果には限界があった。国際公開公報 WO 9 7 / 3 9 7 6 9号公報には、アルブミンを有効成分とする用剤をドライアイに適用する試みが記載されている。これは、眼の表面上皮のムチン分泌を増大させ、表面の涙液層の安定化を図るものである。

特開平 9一 1 3 6 8 3 2号公報には、スルホデヒドロアビエチン酸を含有させてドライアイの予防剤及び治療剤を提供する技術が開示されている。このものは、ムチン産生細胞である結膜ゴブレツト細胞のムコ多糖産生機能促進作用を有し、その機能低下に基づく角化性角結膜障害を抑制するものである。

特開平 9一 3 0 1 8 6 6号公報には、カルボスチリル誘導体を含有するドライアイ治療剤が開示されている。このものは、ゴブレット細胞を増加させることによって、ムチンの産生量を増加させ、眼の粘液量を増加するものである。

特開平 1 0— 2 1 8 7 9 2号公報には、アンジォテンシン変換酵素阻害薬を有効成分とするドライアイ治療剤が開示されている。これは、アンジォテンシン変換酵素阻害薬が涙腺機能に対して直接的に働く神経作動薬として機能し、涙液分泌促進作用を有していることを利用するものである。

これらの技術は、ある程度の治療効果は得られても不充分である場合や副作用を伴うものである場合もあり、根本的治療に役立つものとはいえないという問題点があった。発明の要約

上記の現状に鑑み、本発明は、角膜上皮創傷治癒の各相において作用し、かつ安全で副作用がなく、角膜上皮障害症に対して有効にその予防と治療を行うことができる薬剤を提供することを目的とするものである。

本発明はまた、紫外線による角結膜上皮障害に対して、予防作用と治療作用とを有する紫外線角結膜上皮障害症適用剤を提供することを目的とするものでもある。

本発明はまた、エキシマレーザーによる P R K施術後の合併症を防止するのに有効な薬剤を提供することを目的とするものである。

本発明は更に、副作用として存在する角結膜上皮障害作用を有する眼科用剤の当該副作用を消失させ、当該眼科用剤を有効に適用させる角結膜上皮障害症適用剤を提供することを目的とするものである。

本発明はそして、ドライアイを発症する原因を根絶することによりドライアイの予防と治療とを行うことができる薬剤を提供することを目的とするものである

第一の本発明は、角膜上皮障害症を予防及び又は治療するための角膜上皮障害症適用剤であって、ゥリナス夕チンを有効成分として含有することを特徴とする角膜上皮障害症適用剤である。

第二の本発明は、紫外線による角結膜上皮障害症を予防及び又は治療するための紫外線角結膜上皮障害症適用剤であって、ゥリナス夕チンを有効成分として含有することを特徴とする紫外線角結膜上皮障害症適用剤である。

第三の本発明は、角膜切開術施行後の角膜上皮障害症を予防及び又は治療するための角膜切開術施行後障害症適用剤であって、ゥリナス夕チンを有効成分として含有することを特徴とする角膜切開術施行後障害症適用剤である。

第四の本発明は、眼科用薬剤を投与したことに起因する角結膜上皮障害症を治療するための薬剤性角結膜上皮障害症治療剤であって、ゥリナス夕チンを有効成分として含有することを特徴とする薬剤性角結膜上皮障害症治療剤である。第五の本発明は、ドライアイを予防及び/又は治療するためのドライアイ適用剤であって、ゥリナス夕チンを有効成分として含有することを特徴とするドライアイ適用剤である。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 1における、ゥリナス夕チンのヒト角膜上皮細胞に対する接着，伸展（移動）作用を示す写真である。発明の詳細な開示

以下に本発明を詳述する。

第一の本発明は、角膜上皮障害症を予防及びノ又は治療するための角膜上皮障害症適用剤であって、ゥリナス夕チンを有効成分として含有することを特徴とする角膜上皮障害症適用剤である。

ここに、角膜上皮障害症適用剤とは、角膜上皮障害症に適用する薬剤であって、例えば、角膜上皮障害症予防剤、角膜上皮障害症治療剤等を挙げることができる。角膜上皮障害症予防剤は、角膜上皮障害症発症のおそれがある場合にその発症を予防するために用いる薬剤であり、角膜上皮障害症治療剤は、すでに発症した角膜上皮障害症に対して角膜上皮障害症を治療又は軽減するために用いる薬剤である。

本明細書中において、「適用」とは、治療、診断及び又は予防を目的としてヒトを含む動物に投与することを意味し、「適用剤」とは、治療剤、診断剤及び又は予防剤を含む広い意味を有するものとする。

本発明の角膜上皮障害症適用剤は、ゥリナス夕チンを有効成分として含有するものである。本明細書中において、「ゥリナス夕チン」とは、ヒト尿中トリプシンインヒビ夕一（UT I) を意味する。

上記ゥリナス夕チンは、分子量約 67000 (ゲル濾過クロマトグラフィー法による測定）又は分子量約 34000 (SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定）の糖蛋白質であり、その約 35%が糖部分より構成されている既に公知の物質である（「医学と薬学」 33巻、 5号、 1089— 1097、 19 95年）。ゥリナス夕チンは、商品名「ミラクリツド」として持田製薬社から巿販されている。

ゥリナス夕チンは、健康な男子新鮮尿から一般的な精製法、例えば、ゲイ藻土、シリカゲルに吸着後、イオン交換樹脂、ゲル濾過等を順次組み合わせ精製することにより得ることができる。

近年、分析法の進歩により、ゥリナス夕チンは数種のアイソマーより構成されることが知られて来た。これらのアイソマ一の相違点は、その構成糖部分のスルフォン化の程度によって特徴づけられる。それ以外の点（アンチトリプシン活性、分子量、アミノ酸組成、 N—末端アミノ酸シーケンス、 C—末端アミノ酸シ一ゲンス、シアル酸含有量、ゥロン酸含有量）では相違点は無いと考えられる（Y u k i , Y. , e t a 1. ： B i o c h i m i c a e t B i o phy s i c a Ac t a, 1203, 298— 303 (1 993) ) 。これらのゥリナス夕チンのアイソマ一のいずれであっても、本発明に含まれることは明白である。本発明に係るゥリナス夕チンについては、その細胞増殖作用がヒト線維芽細胞ゃゥシ角膜内皮細胞で認められているが（J o h a n n a. K. , e t a 1. ： B i och im. B i ophy s. Ac t a. 1221, 145 - 152 (1 994) ) , ヒト角結膜上皮細胞や実質細胞への報告は無く、細胞種や動物種によってタンパク性プロテアーゼインヒビ夕一の応答性が著しく異なることから（ Mc ke ehan, W. L. , e t a 1. ： J. B i o l. Chem. 261 ， 5378-5383 ( 1986) ) 、ヒト尿中トリプシンインヒビ夕一のヒト角結膜上皮細胞に対する薬理効果については予測のできないことであった。

特開昭 63 - 267730号公報には、ゥリナス夕チンを有効成分とするァレルギ一性鼻炎及びアレルギー性結膜炎治療用外用剤が開示されている。これには、アレルギー性結膜炎患者に対して 2 OmgZml投与した場合、眼の結膜充血及び搔痒感が消失したことが記載されている。

一方、後に詳述するように、本発明者らがゥリナス夕チンの角膜上皮細胞の接着，伸展（移動）に対する促進効果を動物実験で鋭意研究したところ、難治性である糖尿病性ラッ卜角膜上皮障害症及び家兎角膜上皮損傷を劇的に治癒することが確認でき、細胞培養で認められた生理活性を証明することができた。また、これが、プラスミノーゲンァクチべ一夕一活性を阻害することなく、角膜上皮損傷治癒に必要なプラスミノ一ゲンァクチべ一夕一を、過剰産生による組織破壊まで進展することがない程度に分泌促進させる作用によるものであることも確認できた。これらの事実は極めて革新的な角膜上皮障害症適用剤としての条件を満足するものであり、第一の本発明の要旨はここにある。

上記ゥリナス夕チンを薬理学的に許容される添加剤とともに混合し、本発明の角膜上皮障害症適用剤を製造することができる。

上記ゥリナス夕チンを本発明の角膜上皮障害症適用剤の有効成分として用いる場合、ゥリナス夕チンの濃度範囲は特に制限はないが、 0. 05〜 10000 gZm 1でヒ卜角膜上皮細胞の接着 ·伸展（移動）を促進することを顕微鏡又は肉眼で観察及び確認ができたことから、同濃度範囲で用いることが好ましい。更に濃度範囲を 0. 5〜5000 gZm 1とすることにより、ヒト角膜上皮細胞の著しい増殖が認められることから、同濃度範囲で用いることがより好ましい。本発明の角膜上皮障害症適用剤は、局所投与剤、特に点眼剤、眼軟膏剤又は凍乾剤等の剤型とすることが好ましいが、これらに限定されるものではない。点眼剤、眼軟膏剤とする場合、添加剤としてデヒドロ酢酸ナトリウム、パラォキシ安息香酸メチル等の保存剤、塩化ナトリウム、グリセリン等の等張化剤、カルポキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール等の増粘剤、ェデ卜酸ナトリウム、多糖類等の安定化剤等の一般的なものを使用することができるが、これらに限定されるものではなく眼生理的に許容される範囲であればよい。上記各種剤型に添加される緩衝液としては、等張で、 p H 4〜 9、特に p H 5 . 5〜 8 . 0の無刺激のものを使用することが好ましい。

また、本発明の角膜上皮障害症適用剤は、有効成分としてのゥリナス夕チンの働きが妨げられない範囲で、フイブロネクチン、ヒアルロン酸及び各種のグリコサミノダリカン（コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、へパラン硫酸、へパリン、ケラタン硫酸）等の眼生理活性物質との混合併用が可能であり、強力な角膜上皮障害症適用剤とすることができる。更に、抗生物質やダルココルチコイド等のステロイド性抗炎症剤や非ステロイド性抗炎症剤との混合併用も可能である。本発明の角膜上皮障害症適用剤の用法、用量は、患者の症状、年齢等により変動するが、点眼剤は、通常、 1日 1〜 5回、 1回当たり 1〜 5滴を点眼するのが良い。眼軟膏剤の場合は、通常、 1日 1〜 3回、各結膜嚢内に適量を塗布して使用する。

第一の本発明の角膜上皮障害症適用剤が対象とする角膜上皮障害症としては、角膜上皮に障害を生じる症状であれば特に限定されず、例えば、角膜ヘルぺス、細菌性角膜潰瘍、神経麻痺性角膜炎、糖尿病性角膜症、シエーダレン症候群、ステイーブンス ·ジョンソン症候群等の内因性疾患に伴う角結膜上皮障害、術後、薬剤性、外傷、コンタクトレンズ装用等による外因性疾患等を挙げることができる。第二の本発明は、紫外線による角結膜上皮障害症に適用するための紫外線角結膜上皮障害症適用剤であって、ゥリナス夕チンを有効成分として含有することを特徴とする紫外線角結膜上皮障害症適用剤である。

ここに、紫外線角結膜上皮障害症適用剤とは、紫外線による角結膜上皮障害症に適用する薬剤であって、例えば、角結膜上皮障害症予防剤、角結膜上皮障害症治療剤等を挙げることができる。角結膜上皮障害症予防剤は、紫外線による角結膜上皮障害症発症のおそれがある場合にその発症を予防するために用いる薬剤であり、角結膜上皮障害症治療剤は、紫外線によってすでに発症した角結膜上皮障害症に対して角結膜上皮障害症を治療又は軽減するために用いる薬剤である。本発明者らの検討によれば、ゥリナス夕チンは、ヒト角結膜上皮細胞の紫外線障害に対して、ダルタチオン、ビタミン (：、ビタミン E、ラクトフエリン等に比較して、極めて有効な防御効果を有していることが判明した。更に、この防御効果は、他のプロテアーゼ阻害剤に見られない独自の作用であることも確認できた。ゥリナス夕チンのこのような眼科領域に於ける適用は全く報告がなく、本発明者らが初めて見いだした事実である。

ゥリナス夕チンにフリーラジカル捕捉作用がないことは報告されており、ゥリナス夕チンのフリーラジカルの消去（抑制）作用についてはすでに幾つかの報告もある。

しかし、後述する実施例で明らかにするように、紫外線照射中のゥリナス夕チン含量が、これまでに報告された有効量（37〜74^8 1111 ； 1〜2 M、分子量 34000として計算、以下同じ）に比較して極めて少ない量であり（M . Nomu r a, e t a 1 ： E f f e c t o f Ur i n a s t a t i n and A p r o t i n i n o n t h e oxyg e n r a d i c a l p r o du c t i o n o f p o l ymo r ph onu c l e a r 1 e u k o c y t e s ；医学のあゆみ、 142， 895— 896， 1987) 、仮に、このようなゥリナス夕チンの効果が、フリーラジカルの消去（抑制）作用だけであるとすると、ダル夕チオン、ビタミン C、ビタミン E等の結果との間に大きな矛盾が生じる。

従って、ゥリナス夕チンの紫外線障害の防御効果は、フリーラジカルの消去（抑制）作用だけではなく、他の防御機能を促進する作用が働いたと考えられ、例えば、シャペロンの誘導ゃスカベンジャー受容体タンパクの発現等の可能性も考えられる。

K. T s u b o t aらは、ヒト角膜上皮細胞（HCEC) に高濃度 H₂〇₂を接触させることにより、 UV— B照射と同等の細胞内 OH · ラジカルの生成とそれによる細胞内 ATP含量の減少を確認している。更に、 ΟΗ · ラジカルだけでは生じないミトコンドリア内膜の損傷が UV— Β照射で発生していることを認めている（S. Sh i mmu r a, e t a l ： S ub t h r e s h o l d UV Ra d i a t i on— i ndu c e d p e r ox i d e f o rma t i o n i n Cu l t u r e d c o r n e a l e p i t h e l i a l e e l 1 : T h e p r o t e c t i v e e f f e c t s o f L a c t o f e r r i n ; E x p. Ey e Re s. ， 63， 5 19 - 526, 1996. , K. T s ub o t a. , e t a l : U l t r av i o l e t B— i ndu c e d m i t o c h ond r i a l dy s f un c t i on i s a s s o c i a t e d w i t h d e c r e a s e d c e l l d e t a c hme n t o f c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l i n v i t r o ; I nv e s t Oph t h a l mo l V i s S c i . , 38, 620-62 6， 1 997) o

即ち、ヒト角結膜上皮細胞の増殖は UV— B照射で受けるミトコンドリア内膜の損傷を防御しなければ有り得ない。このことから、ゥリナス夕チンは紫外線照射で生じたミトコンドリア内膜の損傷も防御していると考えられる。

紫外線照射によるヒト角結膜上皮細胞の障害をゥリナス夕チンは著しく防御する。そして、その防御効果は、ラクトフエリン、ダル夕チオン、ビタミン E、ビ夕ミン C等の抗酸化剤、及び、 —トリプシン ·インヒビ夕一、 α₂—プラスミン 'インヒビ夕一、ァプロチニン、べス夕チン等のプロテア一ゼ阻害剤よりもはるかに優れている。

そして、ゥリナス夕チンの防御機序は、紫外線照射によって発生したフリーラジカルの消去（抑制）作用、プロテアーゼ阻害活性による作用、細胞膜保護作用等による要因とは考えにくく、これら既知作用以外の機序が大きく働いていると考えられる。

紫外線照射による眼科障害に対して、ゥリナス夕チンを適用しょうとすることは、これまでに知られておらず、第二の本発明の要旨は、ここにある。

上記ゥリナス夕チンを薬理学的に許容される添加剤とともに混合し、本発明の紫外線角結膜上皮障害症適用剤を製造することができる。

第二の本発明の紫外線角結膜上皮障害症適用剤の剤型としては、上記した第一の本発明の角結膜上皮障害症適用剤と同じものを挙げることができ、更に、混合併用することができるもの、用法、用量等についても、上記した第一の本発明の角結膜上皮障害症適用剤についてのものを同様に挙げることができる。

第二の本発明の紫外線角結膜上皮障害症適用剤が対象とする角結膜上皮障害症としては、紫外線照射による結膜充血、びまん性表層角膜炎、角膜浮腫、虹彩炎等の他、壊死や剥離を伴う光角膜炎、疼痛ゃ羞明、瞼痙攣を特徴とする "雪目" 、紫外線惹起の複数病因による白内障、ランゲルハンス細胞の障害に伴う免疫反応の低下、炎症性サイ卜力インの誘導、 DNA障害、神経障害等を挙げることができる。第三の本発明は、角膜切開術施行後の角膜上皮障害症に適用するための角膜切開術施行後角膜上皮障害症適用剤であって、ゥリナス夕チンを有効成分として含有することを特徴とする角膜切開術施行後角膜上皮障害症適用剤である。

本明細書において「角膜切開術施行後角膜上皮障害症適用剤」とは、上記角膜切開術施行後に生じる角膜上皮障害症に適用する薬剤であって、例えば、角膜切開術施行後角膜上皮障害予防剤、角膜切開術施行後角膜上皮障害治療剤等を挙げることができる。角膜切開術施行後角膜上皮障害症予防剤は、角膜切開術施行後、角膜上皮障害症発症のおそれがある場合にその発症を予防するために用いる薬剤であり、角膜切開術施行後角膜上皮障害症治療剤は、角膜切開術施行後に生じた角膜上皮障害症に対して角膜上皮障害症を治療又は軽減するために用いる薬剤である。

上記角膜切開術としては特に限定されず、例えば、エキシマレーザー器械により切開を行う ph o t o r e f r a c t i v e k e r a t e c t omy (P RK) 等を挙げることができる。

上記角膜切開術施行後角膜上皮障害症は、例えば、 PRK施術時のエキシマレ一ザ一の角膜上皮への照射に起因するものであると推察することができる。ェキシマレーザーは、波長 193 nmの紫外線であり、従って、波長 193 nmの紫外線に起因する角膜上皮障害症を予防及び Z又は治療することができるものが、上記目的にかなうものである。

本発明者らは、鋭意研究の結果、上記目的のためにゥリナス夕チンが極めて効果的であることをつきとめ、本発明を完成したものである。

角膜切開術施行後の角膜上皮障害症に対して、ゥリナス夕チンを適用しようとすることは、これまでに知られておらず、第三の本発明の要旨は、ここにある。上記ゥリナス夕チンを薬理学的に許容される添加剤とともに混合し、本発明の角膜切開術施行後角膜上皮障害症適用剤を製造することができる。

第三の本発明の角膜切開術施行後角膜上皮障害症適用剤の剤型としては、上記した第一の本発明の角膜上皮障害症適用剤と同じものを挙げることができ、更に、混合併用することができるもの、用法、用量等についても、上記した第一の本発明の角膜上皮障害症適用剤についてのものを同様に挙げることができる。第三の本発明の角膜切開術施行後角膜上皮障害症適用剤が対象とする角膜上皮障害症としては、例えば、角膜各層に生じるものとして、上皮欠損、上皮下混濁、角膜内皮細胞数減少等の角膜内皮に対する障害等を挙げることができ、角膜全層に及ぶものとして、角膜穿孔、角膜感染症等を挙げることができ、視機能に対する障害として、ハロー、グレア、低矯正、過矯正、戻り等を挙げることができる。第四の本発明は、眼科用剤による角結膜上皮障害症に適用するための薬剤性角結膜上皮障害症治療剤であって、ゥリナス夕チンを有効成分として含有することを特徴とする薬剤性角結膜上皮障害症治療剤である。

薬剤性角結膜上皮障害症治療剤は、種々の眼科用剤によって生じた角結膜上皮障害症に対して治療又は軽減するために用いる薬剤である。

本発明者らは、鋭意研究の結果、種々の眼科用剤による角結膜上皮障害症に対してゥリナス夕チンが極めて効果的であることをつきとめ、本発明を完成したものである。

上記眼科用剤としては、投与することによって角結膜上皮障害症を発症する危険性があるものであれば特に限定されず、例えば、以下のもの等を挙げることができる。

内服眼科用剤：ジクロフエナミド、へレニエン、ジョードステアリン酸カルシゥム、メタゾラミド、濃グリセリン。

縮瞳剤：塩酸ピロカルピン、サリチル酸フィゾスチグミン、ェチルホスホン酸パラニトロフエニルェチル、ヨウ化工コチォパート、臭化ジスチグミン、カルバコール。

緑内障治療剤：マレイン酸チモロ一ル、塩酸べフノロ一ル、塩酸カルテオロール、イソプロピルウノプロストン、ラ夕ノプロスト。

散瞳剤：塩酸シクロベントレート、臭化水素酸ホマト口ピン、硫酸アト口ピン、塩酸フエ二レフリン、トロピカミド、ェピネフリン、酒石酸水素ェピネフリン、塩酸ジピべフリン。

白内障治療剤：ピレノキシン、フアコリジン（商品名。ゼリア新薬社製）、ダル夕チオン。

角膜保護 ·治療剤：コンドロイチン硫酸ナトリウム、フラビタン（商品名。山之内製薬社製）、シァノコバラミン、グリチルリチン酸ジカリウム、ヒアルロン酸ナトリウム。

酵素製剤： αキモトリブシン。

血管収縮剤：硝酸ナファゾリン。

防腐収斂剤：硝酸銀、ホウ酸、ホウ砂。

抗生物質。抗真菌剤。合成抗菌剤。サルファ剤。抗ウィルス剤。

副腎皮質ホルモン剤：酢酸ヒドロコルチゾン、酢酸ブレドニゾロン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、デキサメタゾン、リン酸べタメ夕ゾンナトリウム、フルォロメトロン。

その他：硫酸亜鉛、ァズレンスルホン酸ナトリウム、塩化リゾチーム、テゴー 5 1、ポリビニルアルコール。

非ステロイド消炎剤：ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、プラノプロフェン。

抗アレルギー剤：マレイン酸クロルフエ二ラミン、クロモグリク酸ナトリウム、アンレキサノクス、フマル酸ケトチフェン、トラニラスト。局所麻酔剤：塩酸ォキシテトラカイン、テ一力イン。

第四の本発明は、上記のような眼科用剤が副作用として有する角結膜上皮障害作用を発症した場合、その副作用を消失させ、当該眼科用剤を有効に適用させるものである。

眼科用剤による角結膜上皮障害症に適用するための薬剤性角結膜上皮障害症治療剤に対して、ゥリナス夕チンを適用しょうとすることは、これまでに知られておらず、第四の本発明の要旨は、ここにある。

上記ゥリナス夕チンを薬理学的に許容される添加剤とともに混合し、本発明の薬剤性角結膜上皮障害症適用剤を製造することができる。

第四の本発明の薬剤性角結膜上皮障害症治療剤の剤型としては、上記した第一の本発明の角膜上皮障害症適用剤と同じものを挙げることができ、更に、混合併用することができるもの、用法、用量等についても、上記した第一の本発明の角膜上皮障害症適用剤についてのものを同様に挙げることができる。

第四の本発明の薬剤性角結膜上皮障害症治療剤が対象とする角結膜上皮障害症としては、上記した第一の本発明の角膜上皮障害症適用剤と同じもののほか、眼科用剤を投与したことによって生じる結膜上皮障害症をも挙げることができる。第五の本発明は、ドライアイを予防及び又は治療するためのドライアイ適用剤であって、ゥリナス夕チンを有効成分として含有することを特徴とするドライアイ適用剤である。

ここに、ドライアイ適用剤とは、ドライアイ（眼球乾燥症候群）に適用する薬剤であって、例えば、ドライアイ予防剤、ドライアイ治療剤等を挙げることができる。ドライアイ予防剤は、ドライアイ発症のおそれがある場合にその発症を予防するために用いる薬剤であり、ドライアイ治療剤は、発症したドライアイに対してドライアイを治療又は軽減するために用いる薬剤である。

後に詳述するように、ゥリナス夕チンが動物モデルを使つたドライアイを確実に予防することができることが確認でき、この事実が、ゥリナス夕チンが角結膜上皮細胞に対するムチン 1産生促進効果を有していることによるものであることも確認できた。これらの事実は極めて革新的なドライアイ適用剤としての条件を満足するものであり、本発明の要旨はここにある。

上記ゥリナス夕チンを薬理学的に許容される添加剤とともに混合し、本発明のドライアイ適用剤を製造することができる。

上記ゥリナス夕チンを本発明のドライアイ適用剤の有効成分として用いる場合、ゥリナス夕チンの濃度範囲は特に制限はないが、 0. 05〜1 0000 gZ m lでヒト角結膜上皮細胞のムチン 1の産生を促進すること、及び、同濃度でラットモデルを使ったドライアイを予防することができたことが確認できたことから、同濃度範囲で用いることが好ましい。更に濃度範囲を 0. 5〜5000 g / 1とすることにより、ヒト角結膜上皮細胞の著しいムチン産生が認められることから、同濃度範囲で用いることがより好ましい。

第五の本発明のドライアイ適用剤の剤型としては、上記した第一の本発明の角膜上皮障害症適用剤と同じものを挙げることができ、更に、混合併用することができるもの、用法、用量等についても、上記した第一の本発明の角膜上皮障害症適用剤についてのものを同様に挙げることができる。

本発明のドライアイ適用剤が対象とする適用症としては、涙液の低下又は質に異常をきたした状態であれば角結膜障害の有無は問わず、例えば、涙液減少症、乏涙症、眼乾燥症、シエーダレン症候群、ステイーブンス ·ジョンソン症候群、眼類天疱胞、眼瞼縁症、閉眼不全、知覚神経麻痺等の疾患等に起因するドライアィを挙げることができる。本発明の角膜上皮障害症適用剤、紫外線角結膜上皮障害症適用剤、角膜切開術施行後障害症適用剤、薬剤性角結膜上皮障害症治療剤、及び、ドライアイ適用剤は、いずれも眼科用剤としてヒトを含む動物に適用することができ、例えば、点眼等の方法により適用することができる。上記点眼等の方法により、上記本発明の眼科用剤を、治療及び又は予防の目的のためにヒトを含む動物に適用し、処理（T r e a t i n g) する方法もまた、本発明の一つである。

上記本発明の眼科用剤を工業的生産（Manu f a c t u r i n g) するために本発明に係るゥリナス夕チンを使用することもまた、本発明の一つである。本発明の角膜上皮障害症適用剤、紫外線角結膜上皮障害症適用剤、角膜切開術施行後障害症適用剤、薬剤性角結膜上皮障害症治療剤、及び、ドライアイ適用剤は、いずれもゥリナス夕チンを有効成分として含有する眼科用剤であるが、上に詳述したように、ゥリナス夕チンを有効成分として含有している限り、その他の成分を含有するとしないとにかかわらず、本発明の範囲に入るものである。本発明の角膜上皮障害症適用剤、紫外線角結膜上皮障害症適用剤、角膜切開術施行後障害症適用剤、薬剤性角結膜上皮障害症治療剤、及び、ドライアイ適用剤は、医薬組成物としてヒトを含む動物に投与することができるものであるので、それぞれ、角膜上皮障害症適用医薬組成物、紫外線角結膜上皮障害症適用医薬組成物、角膜切開術施行後障害症適用医薬組成物、薬剤性角結膜上皮障害症治療医薬組成物、及び、ドライアイ適用医薬組成物ということができるものである。発明を実施するための最良の形態

以下に参考例及び実施例を掲げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。参考例 1

ゥリナス夕チンの製造

健康成人尿約 1000 Lを 6N NaOHでpH10. 0に調整し約 30分放置後、生じた不溶物をテトロン綿カラムで除去し、通液尿を 6N H₂S〇₄で pH7. 0に補正した。この液 990 Lに空気を吹き込み泡立たせ泡画分を 14 0 L採集した。

採集した泡画分尿を 6N HC 1で pH5. 0に調整し、シリカゲル 5D (富士デビソン社製） 10 Om 1に約 10 で 4時間バッチ法により吸着を行った。シリカゲル 5 Dをカラムに充填し、 0. 05 Nリン酸一ナトリウム一 0. 5M N a C 1 (pH 5. 0 ) 水溶液で洗浄後、 0. 3 M塩化アンモニゥム—アンモニァ水（pH9. 5) でゥリナス夕チンを溶出した。溶出液を室温下で 70%硫安分画を行い、一昼夜静置後、生じた沈殿物を回収した。この沈殿物をリン酸一ナトリウム水溶液（PH4. 0) に溶解し、 0. 1M NaC l含有リン酸ーナトリウム水溶液（PH4. 0) で平衡化した DEAE—セル口ファイン A200 カラム（樹脂量 300m l ) に通液し、同緩衝液で洗浄後、 0. 3M NaC 1 を含有するリン酸一ナトリウム水溶液（PH4. 0) でゥリナス夕チンを溶出し、この液をさらに純水で希釈し同様の操作で再クロマトグラフィーを行った。得られた溶出液を 0. 3N NaOH で pH7. 0に戻し、ァプロチニン ·セファロース CL一 4 Bカラムを通液させ、微量の混入カリクレインを除去した。この通過液を PM— 100 (アミコン社製）限外濾過膜を通過させ、さらに通過液を PM— 10 (アミコン社製）限外濾過膜による濃縮を行い、最後に 0. 22 a mの除菌膜を通し、比活性 2700単位 Zmgタンパク質の精製ゥリナス夕チン (ロット A) を 60万単位得た。

同様の精製操作により、精製ゥリナス夕チンをさらに 3ロット（ロット B :比活性 2800単位 Zmgタンパク質、収量 59万単位、ロット PW— 2 :比活性 2800単位 Zmgタンパク質、収量 56. 5万単位、ロット PW— 3 :比活性 2600単位 Zmgタンパク質、収量 65万単位）得た。

同様の精製操作により、精製ゥリナス夕チン（ロット 67 B 8 ：比活性 274 0単位/ mgタンパク質、収量 60万単位）を得た。

本精製ゥリナス夕チンは、 SDS電気泳動（12%ゲル）で分子量 34000 に単一バンドを呈し、ゥリナス夕チン標準品を抗原として調製したゥサギ抗体とゲル内二重拡散沈降法で沈降線を形成し、発熱性試験、卜ロンポプラスチン試験等の生物規格試験に合格した。実施例 1

ヒト角膜上皮細胞の接着 ·伸展（移動）

ヒト角膜上皮細胞株（h uma n c o rne a l ep i t he l i a l c e l l 1 i n e : HCEC) を無血清培地（0. 1 mgZm 1硫酸カナマイシンを含む D—MEMZF— 12培地；日研生物医学研究所製）で細胞数 2. 0 X 10⁵/m 1に調製した液 300 1を浮遊細胞用フラスコ（住友べ一クライト社製）に播種し、同時に、種々の濃度のゥリナス夕チン（ロット PW— 2) を添加した。 37で、 5%C〇₂インキュベータ一内で 5時間培養した後、培地を完全に除去し、更に新しい同無血清培地 300 1を各穴に添加した後、直ちに顕微鏡観察下で写真を撮り、ヒト角膜上皮細胞の接着 '伸展（移動）の程度を観察した。対照はゥリナス夕チンの代わりに生理食塩水を添加した細胞群とした。結果を図 1に示した。図 1において、上段の 2枚の写真は、対照群（c o n t r 0 1 ) を表し、中段の 2枚の写真は、ゥリナス夕チン（濃度 0. 5 zgZm l ) を添加した群を表し、下段の 2枚の写真は、ゥリナス夕チン（濃度 5 // g/m 1 ) を添加した群を表す。図 1より明らかなように、対照（c o n t r o 1 ) に比較して、ヒト角膜上皮細胞の接着 ·伸展（移動）している細胞群（矢じり印）がゥリナス夕チンを添加したマルチウエルにおいて著しく多く認められた。実施例 2

ヒト角膜上皮細胞の増殖

ヒト角膜上皮細胞株（h uma n c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l l i n e : HCEC) を 1 %胎牛血清を含む S HEM (s u p p l e m e n t a r y h o rmo n e e p i t h e l i a l me d i um) 改変培地（A r a k i K. e t a 1. : I n v e s t. Op h t h a l mo l . V i s . S c i . , 1 8， 266 5, 1 993に記載の SHE M培養液から e p i d e rma l g r owt h f a c t o rを省いた培地）に細胞数 3 X 1 0⁴/m 1に調整し、この細胞懸濁液 1 00 1を 96穴マルチウエルプレート (コ一二ング社）に播種し、ほぼ同時にゥリナス夕チン 1 0 1を各穴に添加し、 37で、 5%C〇₂インキュベーター内で 48時間培養した。ゥリナス夕チンは 2ロット（ l o t A ; l. 6， 0. 1 6mg /m 1， 1 o t B ； 2. 2mgZ m l ) を用いた。 48時間培養後、 MTT (3— (4， 5— d i me t hy l— 2 - t h i a z o l y l — 2， 5 -d i p h e ny l ~ 2H- t e t r a z o 1 i um b r om i d e) 5 mg/m 1液 1 0 ^ 1を各穴に添加し、再び 37 、 5 %C0₂インキュベーター内で 1 6時間培養した。培養後、 20%SDS (s o d i um d o d e c y l s u l f a t e) — 0. 0 1規定塩酸液 1 0 0 β 1を各穴に添加し、細胞培養を止め更に 37 t:で 6時間インキュベートした。生成した青色フオルマザン量はマイクロプレートリーダ一による 570 nm- 660 nmの吸光値から算出し、ヒト角膜上皮細胞の増殖を測定した。ゥリナス夕チンによる細胞増殖活性は、ゥリナスタチンの代わりに生理食塩水 1 0 1を添加した細胞群を対照とし、（ゥリナスタチン添加細胞群の吸光値 ÷生理食塩水添加細胞群の吸光値） X I 00 (%) として表した。なお、用いたゥリナスタチンのロットはァイソマー含量が異なり、各ァイソマーの含量比を表 1に示した。結果を表 2に示した。表 2から明らかなように、ヒト角膜上皮細胞の増殖作用はアイゾマーの種類の含量比の違いにより変化するが、対照に比較して遙かに優れ、約 2倍以上の増殖が認められた。表 1 ゥリナス夕チンアイソマーの存在比ァ f ソ r- (%)

u- - 1 u- - 2 u- 3 u- - 4

L o t . A 2. 4 32. 1 5 1. 3 1 4. 2

L o t . B 1 6. 4 37. 6 5 1. 7 1 4. 3 表 2 ゥリナス夕チンのヒト角膜上皮細胞増殖作用

実施例 3

ヒト角膜上皮細胞の増殖

ヒト角膜上皮細胞株 H C E Cを 1 %胎牛血清を含む SHE M改変培地に細胞数 5 X 1 0⁴/m 1に調整し、この細胞調整液 300 1を 48穴マルチウエルプレート（コ一二ング社）に播種し、種々の濃度のゥリナス夕チン（ロット PW— 2, PW- 3) 30 1を同時に各穴に添加し、終濃度 0. 0 5〜l gZm l に調製して、 37°C、 5 %C0₂インキュベータ一内で 64時間培養した。

培養後、各穴の培養上清を除去し、剥離液（0. 25 % t r y p s i n (wZ v) ， 0. 02 %EDTAを含むリン酸緩衝生理食塩水） 1 00 1を添加して、更に 6分間、 37 ：、 5%C0₂インキュベーター内で保温した。保温後、更にピペッティングを行い上皮細胞を十分剥離 ·分散し、ここに 0.

1 % (w/v) トリパンブルー染色液 100 t 1を添加して細胞を染色した後、直ちに血球計算盤にて細胞数を計測した。ゥリナス夕チンの代わりに生理食塩水

30 1を添加した細胞群をコントロールとした。

結果を表 3に示した。表 3から、ゥリナス夕チンの濃度依存性のある明確なヒト角膜上皮細胞の増殖作用が示された。表 3 ゥリナス夕チンのヒト角膜上皮細胞増殖作用ゥリナス夕チン濃度（ tg/ml) 細胞数（X10⁵ eel ls/ml) コントロール 2. 4 0

PW- 2 0. 05 2. 2 3

0. 1 2. 5 0

0. 2 2. 5 3

0. 5 2. 9 0

1 3. 4 3

PW- 3 0. 05 2. 4 3

0. 1 2. 7 5

0. 2 2. 7 5

0. 5 2. 9 3

1 3. 0 0 実施例 4

角膜上皮障害症の治療

角膜上皮剥離糖尿病ラットにおける角膜上皮被覆 ·再生促進作用について検討した。 8週令の S p r a gu e— Daw l e y系雄性ラットを一夜絶食後、 3 mMクェン酸バッファー（PH4. 5) に溶解したストレブトゾトシン（シグマ社）を 6 OmgZk g体重の用量で尾静脈より投与し、その後 2週間飼育して糖尿病ラットを作製した。

上記作製の糖尿病ラットを 4群に分け、ネンブタール注射液（大日本製薬社製 ) を体重 1 k gあたり 4 Omg腹腔内投与し全身麻酔後、更にべノキシール 0. 4%液（参天製薬社製）を片眼あたり一滴点眼して局部麻酔し、眼科用メスで角膜輪郭から中心部にかけて角膜上皮全域を剥離した。角膜全上皮層を剥離した直後からゥリナス夕チン（ロット PW— 2) 5 a g/m 1 , S O O gZm lの 2 液、ヒアレインミニ 0. 3 (参天製薬社製）及び生理食塩液（光製薬社製）を各群のラッ卜に各々 1日 6回、 2時間間隔で 5 1ずつ点眼した。

また、角膜全上皮層の剥離直後及びその 24時間後、 32時間後にリチャードソン染色液（1 %ホウ酸ナトリウム水溶液に溶解した 1 %メチレンブルーと 1 % ァズール I Iの 1 ： 1混合液）を一滴点眼した後、生理食塩液（光製薬社製）で十分洗浄し、損傷部を染色後、ビデオカメラを取り付けた実体顕微鏡下で両前眼部を撮影した。角膜上皮創傷部面積は得られたモニター画面上の染色部を画像解析処理システムソフトウェア（N I Hイメージ 1. 61) を用いて測定した。角膜上皮の再生 ·修復は、剥離直後の創傷部面積を 100 %とし、創傷部面積の縮小として表 4に示した。本実施例で用いた動物モデルは、角膜上皮創傷治癒速度を低下させるリチャードソン染色液（Ub e 1 s J . e t a 1. ; I n v e s t. Oph t h a lmo l . V i s. S c i . ， 23, 127 (1982 ) ) であったため、後述する実施例 6の動物モデルより難治性であり、剥離 32 時間後もコントロールは、ほとんど治癒が認められなかった。また、角結膜上皮障害治療用点眼剤であるヒアレインミニ 0. 3 (主薬ヒアルロン酸ナトリウム 0 . 3%) 点眼群もほとんど治癒が認められなかった。しかし、ゥリナス夕チン点眼群は、角膜創傷部位の面積が有意に縮小した。従って、ゥリナス夕チンが難治性の角膜上皮創傷の治癒を有意に促進することが明らかとなった。表 4 糖尿病ラット角膜上皮障害に対するゥリナス夕チンの効果

角膜上皮剥離直後（0時間）の角膜損傷部位の面積を 100%とする, * pく 0.05 * * pく 0.01 実施例 5

ヒ卜角膜上皮細胞性プラスミノーゲン活性化因子（PA) に及ぼすゥリナス夕チンとァプロチニンの影響

種々の原因で障害を受けた角膜上皮細胞が、その修復過程において、角膜上皮細胞が分泌する P Aが重要な役割を成していることは、 1983年に、すでに T h o f t RAらによって提唱されていた（Th o f t RA. e t a 1. ； Hyp o t h e s i s o f c o r n e a l e p i t h e l i a l m a i n t e n an c e. , I nv e s t. Oph t h a l mo l . V i s. S c i . , 24, 1442— 1443 (1983) ) 。

一方、損傷治癒にプラスミン活性を阻害するァプロチニンが有益であること、即ち、間接的に PA活性を抑制することが重要であると、 S a l on e n E Mらが、 1987年に報告している（S a l on e n E M. , e t a 1. ； P 1 a s m i n i n t e a r f l u i d o f p a t i e n t s w i t h c o r n e a l u l c e r s r b a s i s f o r n ew t h e r a p y . Ac t a Oph t h a lmo l . , 65 3 - 12 ( 1987) , C e j k o v a J . , e t a l . ； H i s t o c h em i c a l s t u d y o f a l k a l i— bu r n e d r abb i t an t e r i o r e y e s e gme n t i n wh i c h s e v e r e l e s i on s we r e p r e v e n t e d by a p r o t i n i n t r e a tme n t. ， H i s t o c h em i s t r y, 92， 441 -448 (1989) ) 。しかし、 1991年に、 J ame s Dらは、角膜上皮損傷治癒過程に必要な角膜上皮の移動をァプロチェンが濃度依存的に阻害することを報告している（J ame s D. ， e t a 1. ； E f f e c t o f p r o t e a s e i n h i b i t o r s on c o r n e a l e p i t h e l i a l m i g r a t i on. , I nv e s t. Oph t h a lmo l . V i s. S c i . ， 32， 2073-2078 (1991) ) 。

そして、更に、 1 998年、 Wi n s t on W Y K. らが決定的な事実を報告した。彼等は、プラスミノ—ゲン欠損マウスを用いて、機械的角膜上皮障害を作成し、損傷治癒を観察した結果、重篤で持続的な炎症反応、角膜上皮後方へのフイブリン沈着、潰瘍生成、実質性血管新生等複雑な悪化症状を認めた。そして、角膜上皮の損傷治癒においてプラスミンの生成が必須であると結論つけた (Wi n s t on W Y Κ. , e t a 1. ； He a l i n g o f c o r n e a 1 e p i t h e l i a l d e f e c t s i n p 1 a s m i n o g e n an d f i b r i n o g e n d e f i c i e n t m i c e. , I n v e s t . Op h t h a lmo l . V i s. S c i . ， 39， 502 - 508 ( 1998) ) „

この事は、プラスミンの生成を担う PAが必須であることを裏付けるものである。更に、近年、 Th oma s Dらにより、 P Aを角膜上皮細胞毒性試験の指標とする試みがなされている。即ち、 P A分泌を抑制する薬剤は細胞毒性を有し、損傷防御に不適であり、反対に、 P A分泌を促進する薬剤は手術中の角膜上皮損傷防御に有益であることを示唆している（Th oma s D. , e t a 1. ； Cy t o t ox i c i t y o f V i s c o e l a s t i c s on c u 1 t u r e d c o r n e a l e p i t h e l i a l c e l l s me a s u r e d by p l a sm i n o g e n a c t i v a t o r r e 1 e a s e . , J. Re f r a c t. Co r n e a l Su r g. , 10， 95- 102 (1994) ) 。

PAの分泌とその活性保持が、角膜上皮損傷治癒に必須であることは多くの研究者により報告されている（And r a s B. , e t a 1. ； T e a r p 1 a sm i n o g e n a c t i v a t o r s— i n d i c a t o r s o f e p i t h e l i a l c e l l d e s t r u c t i on. Th e e f f e c t o f s c r a p i ng, n-h e p t an o l d e b r i d eme n t , and a l k a l i bu r n o f t h e c o r n e a o n t h e p l a sm i n o g e n a c t i v a t o r a c t i v i t y o f r a b b i t t e a r s. , I n t e r. Oph t h a l mo l . , 15 ， 363— 369 (199 1) 、 Ch r i s P L. ； P 1 a s m i n an d p l a sm i n o g e n a c t i v a t o r i nh i b i t o r s a f t e r e x c i me r l a s e r ph o t o r e f r a c t i v e k e r a t e c t omy : New c o n c e p t i n p r e v e n t i on o f p o s t o p e r a t i v e myo p i c r e g r e s s i on and h a z e. , Re f r a c t. & c o r n e a l S u r g. ， 9, 300 - 302 ( 1993) ) 。

また、 J o z s e f Tらにより、種々の角結膜疾患ゃシュ一ダレン症候群の涙液中において P A阻害因子（PA I) が高く認められ、 P Aの活性が低下していることも報告されている（J o z s e f T. , e t a 1. ； P l a sm i n o g e n a c t i v a t o r i nh i b i t o r s i n human t e a r s . ， Ac t a Oph t h a l mo l . , 69， 426 -43 1 (1 99 1) ) 。

この様に多数の研究者の報告から角膜上皮損傷治癒における、プラスミノ一ゲン活性化因子ノプラスミン系の是非の論争は、 P Aの分泌とその活性保持が、必須条件となることが結論づけられた。

そこで、ゥリナス夕チンがァプロチニンと同様な欠陥を有するか否か以下の実施例において検討した。実施例 5— 1

ゥリナス夕チンによるヒト角膜上皮細胞性 P A分泌促進作用

ヒト角膜上皮細胞 HC ECを 10%胎牛血清を含む S HEM改変倍地に細胞数 1 X 1 0⁴/m 1に調整し、この細胞調整液 500 1を 24穴マルチウエルプレート（コ一二ング社）の各穴に播種し、 37 ：、 5%C〇₂インキュベータ内で 3時間前培養した。その後、ゥリナス夕チン（ロット PW— 2、 50 /m 1 ) 10 // 1を各穴に添加し、同様の条件で、更に、 3日間と 6日間それぞれ培養し、その培養上清を採集した。採集した上清液を遠心分離膜（ウルトラセント；東ソ一社）で約 5倍に濃縮した後、 P 1 oug Jらの方法（P l oug J . ， e t a 1. ； B i och im. B i ophys. Ac t a. ， 24, 27 8 ( 1957) ) を一部改変したフイブリン平板法、及び、合成基質 3145- V (ぺプチド研究所）の方法（Kawaba t a S. , e t a 1. ； Eu r • J. B i ochem, ， 172, 17 ( 1988) ) で PA活性を測定した。また、 P Aの同定はゥロキナーゼ抗体（T e c h n o C 1 o n e G. m. b. H. ；オーストリア）と組織性プラスミノ一ゲン活性化因子抗体（Ac cu r a t e Chemi c a l & S c i en t i f i c Co r po r a t i on ； USA) との交差反応をオクタローニ一法（ゲル内二重拡散沈降法）で確認できた。結果を表 5に示した。

3日間の培養では、ゥリナス夕チン添加、無添加の両群において差が認められなかった。しかし、 6日間の培養では、ゥリナスタチン添加群において無添加群に比較して明らかな PA分泌促進傾向が認められた。この事から、ゥリナスタチンは角膜上皮損傷治癒に必須な P Aを、過剰産生による組織破壊まで進展することのない程度の僅かな分泌促進を行い、損傷治癒を効果的に進める事が確認できた。表 5 ゥリナス夕チンによるヒト角膜上皮細胞性プラスミノ一ゲンァクチべ一夕一分泌促進作用培養日数プラスミノーゲンァクチべ —夕一活性 OnU/ml) ゥリナス夕チン無添加ゥリナス夕チン添加

3曰後 1500±44 1700±49

6日後 1500±29 1900±Π0 実施例 5 - 2

ゥリナス夕チンとァプロチニンによるヒト角膜上皮細胞性 PA活性阻害の比較ヒト角膜上皮細胞 H C E Cを 10 %胎牛血清を含む SHE M改変倍地で 6日間、 37Τλ 5%C0₂インキュベータ内で培養した後、その培養上清 49 Om l を 60 %飽和硫安分画を行い、生じた沈殿を遠心分離機で回収し、 50mMリン酸緩衝液（pH7. 0) 25m lに溶解した。この溶解液を、 50mMリン酸緩衝液（pH7. 0) で平衡化した亜鉛キレ一トセファロース CL— 6 Bカラム（アマシャム 'フアルマシアバイオテック社製） 23m lに負荷し、同緩衝液で十分洗浄後、同緩衝液に 0. 3モル食塩と 0. 1モルイミダゾールを含む溶離液で P Aを溶出した。溶出液 17m 1を PM— 10 (アミコン社製）で濃縮し、更に濃縮液 3m 1をセファクリール S 200カラム（アマシャム ·フアルマシアバイォテック社製） 30m lでゲル濾過クロマトグラフィーを行ない、比活性 350 00単位 Z蛋白の部分精製 P Aを得た。この部分精製 P A (10単位/ m l ) 5 O Iを、 501111^食塩含有0. 1モル · トリス塩酸緩衝液（pH8. 0) 0. 5m lに添加し、次に、ゥリナス夕チン（1700単位 1111 ) とァプロチニン (1700単位 1111 ：バイエル社）を各々の試験管に添加し、 3分間、 35でで加温した。続いて両試験管に 25マイクロ ·モルの合成基質 3 145 -V0. 5m lを加え 30分間、 35t:で加温した。加温後、 20%酢酸水溶液 2m lを添加して反応を止めた。 PAによる合成基質 3145—Vのペプチド加水分解を蛍光光度計（励起波長 380 nm, 蛍光波長 460 nm) で測定し、次式に従つて、ゥリナス夕チンとァプロチニンによる P A活性の阻害率を求めた。

P A活性の阻害率 = (1一阻害剤添加群の残存 P A活性阻害剤非添加群の P A 活性） X 100

結果を表 6に示した。表 6のごとく、ゥリナス夕チンによる P A活性の阻害率は 3%以下で、ほとんど無いと解釈できた。またプラスミンに対する阻害も弱いと報告されている（50 %阻害率 =830単位 Zm 1、大西治夫ら、日薬理誌、 81、 235 - 244, 1983) 。一方、ァプロチニンは 30 %以上の阻害を有し、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換を阻害すると言えた。更に、ァプロチニンは、上記文献にプラスミンも強力に阻害すると報告されている（50 %阻害率 =6. 4単位 Zml) ことからプラスミノ—ゲン活性化因子 Zプラスミン系による角膜上皮損傷治癒の第一相の機序を完全に阻止する可能性が非常に高い。従って、角膜上皮損傷の治療剤としての有効性はァプロチニンよりゥリナス夕チンの方が遥かに優れていることが明白である。表 6 ゥリナス夕チンとァプロチニンによるヒト角膜上皮細胞性プラスミノーゲンァクチべ一夕一活性阻害の比較

阻害率

ゥリナスタチン（nOOU/ml) 3%

ァプロチニン（ΠΟθυ/ml) 32% 実施例 6

糖尿病ラット角膜上皮創傷に対するゥリナス夕チンの治療効果

SD系雄性ラット（7週令、日本チャールズリバ一社より購入）を入荷後、 1 週間の予備飼育を行った。 8週令時に、 3mMクェン酸緩衝液（pH4. 5) に溶解したストレブトゾトシン（STZ ;シグマ社）をラット尾静脈から投与（6 Omg/k g) し、更に、 2週間飼育して糖尿病に罹患させた。 STZ投与 11 日後にプレテスト 3 a (和光純薬社製）を用いてラット尿中のブドウ糖量を測定することにより糖尿病モデル作成の確認を行った。 STZ投与 2週間後、ネンブタール注射液（ダイナポット）を腹腔内投与（40mgZkg) して全身麻酔し、更に、眼科用表面麻酔剤ぺノキシール 0. 4%液（参天製薬社製）を 1滴点眼した後、輪部より中央までの角膜上皮全層剥離を行った。角膜上皮全層剥離直後、 1% (w/v) フルォレセインナトリウム水溶液を 1滴点眼し、生理食塩水で洗浄後、実体顕微鏡下で創傷部位の染色を確認し、ビデオ記録を行った。ゥリナス夕チン（ロット PW— 2 ： 50〜500 gZml) 、ラット血清及びヒアレインミニ 0. 3 (参天製薬社製）の各被検物質は、角膜上皮全層剥離直後から、 1日 6回、約 2時間間隔で 1眼あたり 5 し眼し、 1群 4匹として両眼を用いた。また、生理食塩水を対照とした。フルォレセインナトリウム染色による創傷部位面積のビデオ記録を角膜上皮剥離直後、 8時間後、 24時間後、 32時間後、 48時間後、 72時間後の 6回実施し、ォリンパスビデオマイクロメータ一 V M— 50 (N I Hイメージ 1. 61) で創傷部位面積の計測を行った。

角膜上皮創傷治癒効果は、角膜上皮全層剥離直後の創傷部位面積値（100% ) に対する経時的測定値を比率で算出し、表 7に示した。表 7の結果からゥリナスタチンが他剤に比較して角膜上皮創傷治癒効果が極めて優れていることが判明した。

表 7

実施例 7

紫外線照射によるヒト角膜上皮細胞障害に対するゥリナス夕チンの効果

ヒト角膜上皮細胞 H C E Cを 10 %胎牛血清を含む SHE M改変倍地で細胞数 1 X 10⁵/m 1に調整し、この細胞調整液 500 ^ 1を 24穴マルチプレート (コ一二ング社製）の各穴に播種し、 37 ：、 5%C0₂インキュベータ内で 1 6〜1 7時間培養した。その後、培養上清を全て除去し、試料を含む 10%胎牛血清一 SHEM改変倍地 50 0 fji \を各穴に添加し、再び同条件で 2時間培養した。試料と接触培養後、この培養上清液を全て除去し、試料がマルチプレート内にほとんど残らない状態にした。

この状態のマルチプレート内に殺傷力最大の紫外線 UV— C照射を 20〜30 cmの距離で 5秒間行った。 UV— C照射後、先と同様の試料を含む 10%胎牛血清一 S HEM改変倍地 500 1を各穴に再添加し、同条件で 16〜17時間培養した。その後、各穴の培養上清を除去し、剥離液（0. 25%T r yp s i n (w/v) ， 0. 02% EDTAを含む PBS) 100 1を添加して、 3 7で、 5 %C0₂インキュベータ内で 6分間保温した。保温後、更に、ピぺッテイングをして生存している上皮細胞を充分剥離 '分散し、ここに 0. 1 % (w/ V) トリパンブルー染色液 100 1を加え細胞染色した後、直ちに、血球計算盤にて生細胞数を計測した。ヒ卜角膜上皮細胞の紫外線障害に対する試料の防御効果は、以下のように算出した。

防御効果（％) = (試料添加群の生細胞数 ÷試料無添加群の生細胞数） X 10

0

結果を表 8— 1、 8— 2に示した。表 8— 1 紫外線照射によるヒト角膜上皮細胞障害に対するゥリナス夕チンの効

**p<0. 0 1 表 8— 2 紫外線照射によるヒト角膜上皮細胞障害に対するゥリナス夕チンの効

表 8— 1から明らかなように、ゥリナス夕チン（ロット 6 7 B 8 ) 0 . 3 M 及びを 1 0 %胎牛血清— S H E M改変培地に添加して接触培養した細胞は、紫外線照射前に培養上清液を除去したので、紫外線照射時にはゥリナス夕チンがほとんどない状態にもかかわらず、無添加ゃァプロチニン添加群に比べて明らかに生細胞数が多かった。その生細胞数はゥリナス夕チン 0 . 3 M添加群では紫外線非照射の細胞増殖とほぼ同等であり、紫外線によって生じるすべての障害から細胞をほぼ完全に防御したと理解できた。

ゥリナスチタン 3 M添加群では、非照射の細胞より生細胞数が増加していた。これは、紫外線に対する防御効果に加えて、実施例 2で示したのと同様の細胞増殖作用が発現したものと考えられた。

一方、ァプロチニンによる防御効果は認められず、むしろ紫外線の殺傷力を増加する傾向がみられた。従って、ゥリナス夕チンの防御機序は、アブロチニンによって阻害される既知のプロテア一ゼに対する阻害活性によるものではないことが明白となった。

更に、その効果を既存のフリーラジカル消去（抑制）剤と比較した結果、表 8 一 2に示すように、ゥリナス夕チンが極めて有効な効果を示すことが明らかとなつた。

イン · ビトロにおけるゥリナス夕チンのフリーラジカル消去（抑制）作用の 5 0 %有効濃度は約 1 Mと報告されている（医学のあゆみ、 1 4 2， 8 9 5 - 8 9 6、 1 9 8 7 ) 。しかし、本実施例で効果を示したゥリナス夕チンの濃度は、接触培養時で 0 . であり、フリーラジカルが多量に発生する紫外線照射時には、照射前にゥリナス夕チンの入った培養上清液を除去しているので、その数 %以下の濃度に低下していると推定される。仮に照射時にゥリナスチタンが 5 % 残存していたとしても 0 . 0 1 5 / Mであり、このような極微量でもゥリナス夕チンは紫外線障害に対する防御効果を示すことがわかった。

即ち、ゥリナス夕チンの紫外線照射障害に対する防御効果の作用機序は、既知のフリーラジカル消去（抑制）作用以外の、未知の働きによる要因が極めて大きいことがわかった。

また、ゥリナス夕チンは、ライソゾーム膜の安定化作用を有することが報告されている。ヒト角膜上皮細胞の紫外線照射障害の防御作用は、ゥリナス夕チンによる上皮細胞膜の保護効果とも考えられた。

実施例 7の各細胞群の膜破壊を調べるため、紫外線照射前後の各細胞群の培養上清液中の乳酸脱水素酵素（L D H) 量を測定した。その結果、対照群、ゥリナス夕チン添加群、ァプロチニン添加群のいずれにも L D H活性を認めることができなかった。

D N A障害による L D H欠損が考えられるので、確認のため、各細胞群を各々 Tw e e n 8 0界面活性剤で膜溶解をし、そのライセートについて L D H活性を調べた。その結果、全ての細胞群において L D H活性の正常値が認められた。このことから、実施例 7における紫外線照射量は細胞膜破壊まで至っていないことが判った。ゥリナス夕チンによる上皮細胞の紫外線照射障害の防御効果は、ゥリナス夕チンの既知の作用機序であるライソゾーム膜の安定化作用と類似した細胞膜保護効果によるものではないことが判つた。

以上のことから、ゥリナス夕チンによるヒト角膜上皮細胞の紫外線照射障害の主要な防御作用機序は、（1 ) フリーラジカル消去（抑制）作用、（2 ) プロテァーゼ阻害活性、（3) ライソゾーム膜の安定化作用、の 3つのいずれの既知の作用機序も該当しない未知のものであると考えられた。実施例 8

波長 193 nmの紫外線照射によるヒト角膜上皮細胞障害に対するゥリナス夕チンの効果

ヒト角膜上皮細胞 HC ECを 10%胎牛血清— S HEM改変培地で細胞数 1 X 10⁵ m lに調整し、この細胞調整液 500 1を 24穴マルチプレート（コ一二ング社製）の各穴に播種し、 37で、 5%C0₂インキュベータ内で 16〜 17時間培養した。培養後、培養上清を全て除去し、試料を含む 10%胎牛血清一 SHEM改変培地 500 t 1を各穴に添加し、再び同条件で 2時間接触培養した。試料と接触培養後、培養上清を全て除去し、試料がマルチプレート内にほとんど残らない状態にした。

この状態のマルチプレート内に 193 nmの紫外線照射を 10〜30 cmの距離で 5秒間行った。照射後、先と同様の試料を含む 10%胎牛血清— SHEM改変培地 500 1を各穴に再添加し、同条件で 16〜17時間培養した。その後、実施例 7と同様の方法で、生細胞数を計測し、ゥリナス夕チン（ロット 67 B 8) 、ァプロチニンによるヒト角膜上皮細胞の紫外線障害の防御効果を算出した。結果を表 9に示した。ゥリナス夕チンが濃度に依存した防御効果を示すことが確認できた。一方、ァプロチニンは防御効果を示さなかった。表 9 波長 193 nmの紫外線照射によるヒト角膜上皮細胞障害に対するゥリナス夕チンの効果

試料（添加濃度 M) 防御効果（％) ゥリナス夕チン（0. 3) 134

ゥリナス夕チン（3. 0) 145

ァプロチェン（0. 3) 94

ァプロチニン（3. 0) 83 実施例 9

薬剤性ヒト角膜上皮細胞障害に対するゥリナス夕チンの効果

ヒト角膜上皮細胞 H C E Cを 1 0 %胎牛血清一 SHE M改変培地で細胞数 1 X 1 0⁵/m lに調整し、この細胞調整液 500 1を 24穴マルチプレート（コ一二ング社）の各穴に播種し、 37で、 5 %C〇₂インキュベータ内で 24時間培養した。その後、培養上清を除去し、 PBS (—）（日水製薬社製） 500 1で細胞を 2回洗浄後、培地を無血清培地 500 ^ 1に交換して、 37 、 5% C〇₂インキュベータ内で 1 2時間培養した。培養後、培養上清を除去し、 PB S (-) で細胞を 2回洗浄後、ゥリナス夕チン（ロット 67 B 8) を含む無血清培地 5 00 1を加えて 3 7で、 5 %C〇₂インキュベータ内で 1 2時間培養した。培養後、培養上清を除去し、 PB S (—）で 2回洗浄後、緑内障治療用点眼薬レスキユラ（主薬イソプロピルウノプロストン 0. 12mgZml含有、上野製薬社製）を無血清培地でイソプロピルウノプロストンを 0. O SmgZm lとなるように希釈した液 500 ^ 1を加えて室温で 10分間放置した。放置後、培養上清を回収して、細胞障害度の指標である LDH活性を測定した。結果を表 1 0に示した。ゥリナス夕チンの添加濃度に依存した細胞障害防御効果が確認できた。表 10 薬剤性ヒト角膜上皮細胞障害に対するゥリナス夕チンの効果

実施例 10 n—ヘプタノ一ル誘発家兎角膜上皮損傷に対するゥリナス夕チンの治癒効果動物は体重 2 . 5〜3 . O k gの日本白色家兎（北山ラベス）を、 1週間以上予備飼育した後、角膜などに異常のないことを確認し使用した。室温： 2 3土 3 で、湿度： 5 0 ± 2 0 %に設定した飼育環境下で実験を実施した。家兎に塩酸ケ夕ミンを筋肉内投与し全身麻酔を施した後に、右眼に 0 . 4 %塩酸ォキシブプロカインを点眼し局所麻酔した後、 n—ヘプ夕ノールを浸した直径 6 mmの濾紙を角膜中央部に 6 0秒間接触させ、角膜上皮を剥離し損傷を誘発した。試料液の点眼は剥離直後から 2時間間隔で 6回（ 5 0 μ 1 1回）、 2日目は剥離 2 4時間後から 2時間間隔で 6回点眼した。また、生理食塩液を対照液とした。角膜上皮損傷部分の面積は、剥離直後、剥離後 1 2、 2 4、 3 0、 3 6および 4 8時間に 0 . 5 %フルォレセインナトリウム液点眼によって損傷部分を染色して、写真撮影後、測定した。

角膜上皮治癒効果を表 1 1に示した。剥離 1 2〜4 8時間後までゥリナス夕チン 1 5 0 0 U/m 1及び 6 0 0 0 U/m 1の点眼は生理食塩液点眼群と比較して、角膜損傷治癒を促進することが明らかとなった。

表 1 1 n—ヘプ夕ノール誘発家兎角膜上皮損傷に対するゥリナス夕チンの治癒効果

角膜上皮剥離直後（0時間）の損傷部位の面積を 100%とする。

各値は 7例の平均値土標準偏差を示す。

*p< 0. 05、 **p<0. 0 1、 ***p<0. 00 1 v s コントロール

実施例 1 1

紫外線照射によるヒト結膜上皮細胞障害に対するゥリナス夕チンの効果

ヒト結膜上皮細胞 ATCC CCL 20. 2を 1 0%胎牛血清入り DMEM /¥ 1 2培地で 1 X 1 0 Vm 1に調製し、この細胞調製液 50 Ομ 1を 24穴マルチプレート（住友ベークライト社製）の各穴に播種し、 37で、 5%C0₂ インキュベーター内で 16〜17時間培養した。その後、培養上清を全て除去し、試料（ゥリナス夕チン、ロット 67 B 8、終濃度 100 gZm 1 ) を添加した 1 0 %胎牛血清入り DMEMZF 12培地 50 Ομ 1を各穴に添加し、再び同条件で培養した。試料と接触培養後、この培養上清を全て除去した。この状態のマルチプレートに紫外線 UV— B (3 12 nm, 10 Om J/cm²) を照射した。 UV— B照射後、 10 %胎牛血清入り DMEMZF 1 2培地 50 Ομ 1を各穴に添加し、同条件で 16〜17時間培養した。その後、 WST— 8溶液（C e 1 1 Coun t i n g K i t— 8，同仁化学社製）を培地に対して 1/10 量加え、 37 で 4時間反応させた後、細胞内脱水素酵素により生成された水溶性ホルマザンの 45 O nmにおける吸光度の測定を行うことにより生細胞数の測定を行い、実施例 7と同様の方法で防御効果を算出した。結果を表 12に示した。ゥリナス夕チンが紫外線障害に対する防御効果を示すことが明らかとなった。表 12 紫外線照射によるヒ卜結膜上皮細胞障害に対するゥリナス夕チンの効果

実施例 12

薬剤性ヒト結膜上皮細胞障害に対するゥリナス夕チンの効果

48穴プレートに 10 %胎牛血清入り DMEMZF 12培地で懸濁したヒト結膜上皮細胞 ATCC CCL 20. 2 ( 1 X 1 0⁵/m 1 ) を 300μ 1分注し、 37°C、 5 %C〇₂のインキュベータ一内で培養した。

48時間後、細胞が完全な c on f 1 u e n tになったことを確認し、上清を除去、 PBS (—）で 2回洗浄した後、血清無添加の DMEM/F 12培地に懸濁した。 37で、 5%C0₂で 1 2時間インキュベートした後、再び上清を除去、 PBS (一）で 2回洗浄し、 PBS (―) で各濃度に希釈したゥリナス夕チン（ロット 67 B 8) を 300μ 1加えた。 37 、 5 % C Ο ₂で 1 2時間インキュベー卜した後、再び上清を除去、 PBS (—）で 2回洗浄し、緑内障治療用点眼薬チモプトール（主薬マレイン酸チモロール 5 OmgZm l含有、万有製薬社製 ) をマレイン酸チモロ一ル濃度 1. 2 SmgZm 1となるように PB S (-) で希釈した液 30 Ομ 1を加えた。 20分後、再びプレートを PB S (—）で 2回洗浄し、 DMEMZF 1 2を 300μ 1を加えた。 12時間後、 WST— 8を添加し、 37でで 2時間反応させ、 450 nmにおける吸光度を測定することによつて生細胞数を測定した。結果を表 1 3に示した。ゥリナス夕チンが濃度に依存した防御効果を示すことが明らかとなつた。表 1 3 薬剤性ヒト結膜上皮細胞障害に対するゥリナス夕チンの効果

n = 6

実施例 13

ヒ卜結膜上皮細胞のムチン 1産生に及ぼすゥリナス夕チンの効果ヒト結膜上皮細胞（ATCC CCL 20. 2) を 10%胎牛血清入り DME MZF 12培地（ギブコ社製）に懸濁し、 96穴プレートに 5000細胞穴で播種し、一晩 37 、 5%C〇₂インキュベーター内で培養し、細胞をプレートに接着させた後、試料を加えた培地に交換して更に 2日間培養した。その後、ムチン 1産生量を以下の酵素免疫法で測定した。 70%エタノールで細胞を固定後、 1穴当り 250μ 1の 1 %ゥシ血清アルブミン入り P B Sを加えて、室温で 2 時間放置した。 PBSで希釈した抗ムチン 1マウス抗体（ファーミンゲン社製）を加えて、室温、 2時間反応させた後、 PBSで 3回洗浄した。 PBSで希釈したペルォキシダーゼ標識抗マウス I gG抗体（サン夕クルズバイオテクノロジ一社製）を加え、室温、 2時間反応させた後、 PBSで 4回洗浄した。ペルォキシダーゼの基質液（0. 012%過酸化水素、 1. 6mgZm 1オルトフエ二レンジァミン入りの 0. 1Mリン酸緩衝液、 pH 6. 2) 200μ1を加えて、室温、 20分間反応させ、 4. 5Ν硫酸 50μ 1を加えて反応を停止した。マイクロプレートリーダーで吸光度（490n m— 660n m) を測定することによりムチン 1産生量を測定した。結果を表 14に示した。ゥリナス夕チンを含まない培地で培養した対照の吸光度の平均値を 100%として表した。ゥリナス夕チンは濃度に依存したムチン 1産生促進効果を示すことが明らかとなつた。

表 14 ヒト結膜上皮細胞のムチン 1産生に及ぼすゥリナス夕チンの効果

n= 5 * p< 0. 05 実施例 14 ラット強制開瞼送風ドライアイモデルにおける角結膜上皮障害に対するゥリナス夕チンの効果

6週令の S p r ague— Dawl e y系雄性ラットを用いた。なお、あらかじめ前眼部、眼瞼に異常がないことを確認した。ラット 10匹の左眼にゥリナス夕チン溶液（ロット 67B8を 500/ g/m 1になるよう生理食塩液で希釈した液）を 1回 5// 1、 1日 6回、 1週間点眼した。右眼には対照として生理食塩液を同様に点眼した。最終点眼後 2時間後に以下の方法で、角結膜を乾燥して、角結膜上皮障害を誘発し、障害に対するゥリナス夕チンの効果を評価した。上記点眼処置したラット（10匹）をペントバルビタール 4 OmgZk g (腹腔内投与）麻酔下で、眼を強制的に充分に開瞼させ、眼の正面 6 cmの距離よりドライヤーによる送風を 15分間行い、風を前眼部全体に当てることにより、涙液を蒸発させて、角結膜を乾燥し、角結膜上皮障害を誘発した。障害誘発後、 1 %ローズベンガル溶液 5 1を点眼し、生理食塩液で十分に洗浄して、角結膜のムチン欠損部を染色後、過剰量のペントバルビタール注射液の静注により安楽死させたのち、球結膜部を含め眼球を傷つけないよう注意深く摘出し、直ちに、口 —ズベンガルで染色されたムチンで覆われていない障害部位を観察した。この際、ローズベンガル陽性の量は、ドライアイ診断基準（ドライアイ研究会、 1 9 9 5 ) に従い、球結膜の鼻側、耳側および角膜について染色の程度をそれぞれ 0〜 3点、合計 9点でスコア化した。数値が高いほど角結膜上皮障害が重篤である。このスコア化は同一検者がすべてを行い、また左右両眼の区別がわからないようにマスクして評価した。

結果を表 1 5に示した。 5 0 0 g Zm 1ゥリナス夕チン点眼群は、生理食塩液点眼群と比較して、乾燥による角結膜上皮障害が有意に抑制されていた（Pぐ 0. 0 5) 。従って、ゥリナス夕チンはドライアイにおける角結膜のムチン被覆障害を抑制することが明らかとなつた。表 1 5 ドライアイによる角結膜上皮障害に対するゥリナス夕チンの効果

眼球角結膜における判定スコア（匹数）スコアゥリナス夕チン対照

9 0 0

8 0 1

7 0 0

6 0 2

5 1 0

4 0 2

3 2 1

2 1 3

1 5 1

0 1 0

平均スコア 1 . 8 ± 1 . 5 3 . 8士 2 . 3 製剤例 1

ゥリナス夕チン（比活性 4000〜2000un i tZmg蛋白） 5 Omg蛋白クロロブ夕ノール 1 Omg 塩化ナトリウム 24 Omg リン酸水素 2ナトリウム 24 Omg リン酸 2水素ナトリウム 20 Omg 上記各成分を滅菌蒸留水 10 Om 1に溶解した後、滅菌濾過し、滅菌した眼科用容器に 1 Om 1ずつ充填し、点眼剤とした。産業上の利用可能性

本発明の角膜上皮障害症適用剤は、ヒトを含む哺乳動物の角膜上皮障害症、すなわち角膜ヘルぺス、細菌性角膜潰瘍、神経麻痺性角膜炎、糖尿病性角膜症、物理的、化学的障害に起因する角膜上皮障害症の予防剤及び治療剤として有用である。

また、本発明の紫外線角結膜上皮障害症適用剤は、紫外線による角結膜上皮障害症の予防剤及び治療剤として有用である。

また、本発明の角膜切開術施行後角膜上皮障害症適用剤は、角膜切開術施行後の角膜上皮障害症に適用するための角膜切開術施行後角膜上皮障害症の予防剤及び治療剤として有用である。

更に、本発明の薬剤性角結膜上皮障害症治療剤は、副作用として存在する角結膜上皮障害作用を有する眼科用剤の当該副作用を消失させ、当該眼科用剤を有効に適用させる薬剤性角結膜上皮障害症の治療剤として有用である。

そして、本発明のドライアイ適用剤は、ドライアイの予防剤及び治療剤として有用である。

Claims

誠の毒 l . 角膜上皮障害症を予防及び z又は治療するための角膜上皮障害症適用剤であって、ゥリナス夕チンを有効成分として含有することを特徴とする角膜上皮障害症適用剤。

2 . 紫外線による角結膜上皮障害症を予防及び又は治療するための紫外線角結膜上皮障害症適用剤であって、ゥリナス夕チンを有効成分として含有することを特徴とする紫外線角結膜上皮障害症適用剤。

3 . 角膜切開術施行後の角膜上皮障害症を予防及び又は治療するための角膜切開術施行後障害症適用剤であつて、ゥリナス夕チンを有効成分として含有することを特徴とする角膜切開術施行後障害症適用剤。

4 . 眼科用薬剤を投与したことに起因する角結膜上皮障害症を治療するための薬剤性角結膜上皮障害症治療剤であつて、ゥリナス夕チンを有効成分として含有することを特徴とする薬剤性角結膜上皮障害症治療剤。

5 . ドライアイを予防及び/又は治療するためのドライアイ適用剤であって、ゥリナス夕チンを有効成分として含有することを特徴とするドライアイ適用剤。