TW443931B - A therapeutic agent for the treatment of disorders of corneal and conjuntival epithelia - Google Patents

Description

A7 B7 443931 五、發明説明（I ) 【技術領域】 本發明係關於以Urinastatin做_爲有效成份之藥劑’針 對角膜上皮障礙症、紫外線角結膜上皮障礙症、角膜切開 術施行後角膜上皮障礙症、藥劑性角結膜上皮障礙症及乾 眼症，用於預防及治療之藥劑。 【習知技術】 角膜在眼球的前端透明地覆蓋著水晶體前房’具有由 上皮細胞層、波曼氏膜、實質層、台斯梅氏膜及內皮細胞 層等井然有序之層構造的組織。結膜以連接於角膜的方式 存在於眼球表面部及眼瞼裏部，在形態學上雖分類爲眼瞼 結膜、圓蓋結膜及眼球結膜，但組織學上則分爲上皮層及 實質層。於本說明書，總稱角膜及結膜爲「角結膜」。 角結膜之障礙，被認爲係因來自角結膜表面而產生於 上皮之毛病而引起。角結膜障礙症，係因伴隨角膜疱疹、 細菌性角膜潰瘍、神經麻痺性角膜炎、糖尿病性角膜症、 謝格連氏症候群、史迪文斯·強森症候群、眼球乾燥症候 群（乾眼症）等內因性疾病之角結膜上皮障礙、手術後、 藥劑性、外傷、隱形眼鏡裝戴等之外因性疾病或物理的、 化學的障礙而產生。 在如此的角結膜障礙症中，角膜上皮障礙症依病因， 因有的會從角膜上皮障礙症進化到無法再生上皮之難治性 角膜障礙’導致視力障礙及失明，被視爲問題。 在那樣的視力恢復上，必須快速地進行角膜上皮之正 常的再生被覆。 _^_____3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) '11 經濟部智慧財產局8工消費合作社印製 4439 3 1 A7 A7 B7 五、發明説明（> ) 角膜上皮創傷治癒之機構爲第1相到第3相，第1相 爲上皮細胞之接著、伸展 '移動，第2相爲上皮細胞之增 殖，第3相爲從上皮細胞之分化，經第3相始恢復具有井 然有序之層構造的上皮。 做爲角膜上皮創傷治癒之調節、控制因子被知曉的有 ，在第1相之過程有促進作用的纖維結合素、透明質酸、 I L 一 6、表皮增殖因子（E G F )等成分。又物質P與 E G F及類胰島素增殖因子（I G F - 1 )共存，能促進 上皮細胞之伸展、移動。 促進第2相之上皮細胞之增殖的成分被知曉的有，E G F、F GF (纖維組織母細胞增殖因子）、角質細胞增 殖因子（K G F )、肝細胞增殖因子（H G F )等（G 〇 spodar — 〇wicz，D.，et a 1 . ： E x p · Eye Res·，2 5 , 631—649 (197 7) ；Sotozono, C , , et a 1 . :Exp • Eye Res., 5 9 , 385-392 (1994 )；Wilson, S.E., et a 1 .:〇pht ha l m o 1 . V i s . S c i . , 3 4 , 2 5 4 4 — 2 5 6 1 ( 1 9 9 3 ) )° 第3相之上皮細胞之分化，被知曉是依維生素A來促 進。 在如此的成分中，做爲角膜上皮創傷之積極的治療法 ，在臨床上被應用的爲纖維結合素及透明質酸之點眼。已 確認出，纖維結合素及透明質酸會促進角膜上皮細胞之接 ____4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —訂------良—— 經濟部智慧財產局員工消费合作社印轂 4439 3 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（5 ) 著、伸展，特別是纖維結合素在很低濃度也顯示非常有效 〇 但，由於纖維結合素及透明質酸最主要作用於角膜上 皮創傷治癒之第1相之過程，對於第2相之上皮細胞之增 殖作用是微弱的。又，EGF、FGF、KGF及HGF 等增殖因子具有誘發血管新生之危險性，被認爲做爲醫藥 品有致命的副作用（三井洋司等：血管新生之機構；眼科 New Insight Vo 1_3眼內血管新生性疾 病，8-20，Med i ca lvi ew公司（1994 ))° 事實上，已有因E G F、F G F之血管新生之報告（ Schwei-gerer, L., :Z.Kardio 1 . 7 8 , 1 2 - 1 5 ( 1 9 8 9 ) ； T a n i g u c h i . E . , e t a 1 . ： N i p p ο n G a n k a G a k k a i Z a s s h i , 9 5，52-58 (1991 )；Nezu, E., et a 1 . :Jpn.J.Op h t h a 1 m o 1 . , 3 6 , 401 — 406 (1992 ))。又，這些增殖因子之製造是非常困難之事也成爲做 爲醫藥品之障礙。 如上，在做爲角膜上皮障礙症治療劑之有效成分，至 今公知的化合物都無法滿足，更優良的化合物很強烈地被 期待著。 另一方，做爲角膜潰瘍之發生機構，很久前就推定膠 原酶等之蛋白酶的參與是重要的（糸井素一：臨眼， ___5_ 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) Α4规格（210Χ 297公釐） . 装 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 443931 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消资合作社印製 五、發明説明（4 ) ，879 — 882 (1970))。實際上，已有報告提 出半胱氨酸等之膠原酶抑制劑之實驗性的抑制角膜潰瘍及 其臨床應用（Brown，SI.，et a 1 . : A r ch. Ophthalmol ., 8 2，9 5 - 9 7 ( 1 9 6 9 ) ;Brown，SI .，et a 1 . :Arc h.Ophthalmol . , 8 3，352 — 353 ( 1 9 7 0 );平野順三，其他：臨眼，2_9_，4 9-54 ( 1 9 7 5 );布村元，其他：臨眼，U，88-90 (1 9 7 5 ))。但，那些治療效果尙無法達到滿足的程 度。 又，於角膜上皮創傷治癒過程之第1相，上皮細胞之 移動是非常重要，一般在細胞之移動上，認爲在伸展細胞 前端蛋白酶的存在是必要的，因此角膜上皮細胞之伸展、 移動和蛋白酶之關係係使用蛋白酶抑制劑來作硏究。 森本等使用各種的蛋白酶抑制劑作硏究，亮肽素（硫 醇蛋白酶抑制劑），抑肽酶（絲氨酸蛋白酿抑制劑），卵 α2 —大球蛋白（一般蛋白酶抑制劑）都能抑制角膜上皮細 胞之伸展（森本啓介等：膠原硏究會抄錄，1 7〇 -173(1987))。 以上之事，做爲蛋白酶抑制劑係使用P e p s t a t i n (酸性蛋白酶抑制劑），1 , 1 0 —菲繞啉（類金屬 蛋白酶抑制劑），抑肽酶（絲氨酸蛋白酶抑制劑），氟化 苯基甲基磺醯之Z_i eske等的硏究也表示著（Zie s k e , J .D.&Bukusoglu G . : Inve _______6___ 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X29?公釐） n I 裝 II 訂 I 線 (請t閱讀背面之注意事項.填寫本頁) 4439 3 1 A7 B7 經濟部智慧財產局負工消費合作社印製 五、發明説明（s ) stigative Ophthalmology & V isuai Sc“nce，_2_2_，2073-2078 (1 9 9 1 ))。不管如何，對於角膜上皮創傷治癒，蛋 白酶抑制劑被指出會有負面作用。 但，某種蛋白酶抑制劑，例如’爲蛋白性蛋白酶抑制 劑之抑肽酶、α -抗胰蛋白酶等，被知曉能成爲人纖維織 母細胞及人內皮細胞之增殖因子（〇 g a w a，Μ .，e t al· .Res Commun. C h e m . Pa thol· Pharmacol . 5 0 . 1 5 5 - 1 5 8 (1985);Scott，G.K.，et a 1 .: Biol. Chem. Hoppe — Sevier，3 .6 9，131-135 (1988) ；Mckeehan ,W . L . , e t a 1 . :J.Biol. Chem. 261, 5378-5383(1986))。 又，在與如前述之角膜潰瘍發生有關之膠原酶產生上 ，血纖維蛋白溶酶原活化物/血纖維蛋白溶酶系是必要的 事被知曉著（Berman，M.，et a 1 . · I η vest. Ophthalmol. Vis. S c i . 19 , 1 2 ◦ 4 — 1 2 2 1 ( 1 9 8 〇））。因此，推定 血纖維蛋白溶酶抑制劑擁有角膜上皮創傷治癒作用。 很久前就知曉抑肽酶爲強力的血纖維蛋白溶酶抑制劑 (Feeney, R.E., et a 1 . '· J . B i ο 1 . Chem., 2 5 , 1957-1960 (1969 ))。又，抑肽酶被應用於人之角膜上皮創傷治癒，在有 ___7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） I 扯衣 訂— I 線 (請先閱讀背面之注意事16蜞寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 4439 3 1 A7 __B7 五、發明説明（L ) 效性上得到某程度之成果（日本特公平7-72139號 公報；USP 4, 849，406; EP 〇 223 2 5 4 Bl；Salonen, E - M . , e t a 1 . :A c t a Ophthalmologia 6 5 , 3 — 1 2 ( 1 9 8 7 ))。 但，如前所述’抑肽酶對角膜上皮障礙症治療來說， 針對非常重要的角膜上皮細胞之移動相反地具有阻害作用 (Zieske，J .D.&Bukusoglu G .: Investigative Ophthalmolog y & V i s u a 1 Science, 3 2，2 0 7 3 -2078(1991))，又，因擔心血管新生之危險性 等，無法做爲角膜上皮障礙症治療劑。 又，近年，已了解到在角膜損傷治癒上血纖維蛋白溶 .酶原活化物之活性保持是相當重要（Μ 〇 r i m 〇 t 〇， K.，et a 1 . :Thrombosis and H aemostasis 6 9 , 387 — 391 (1993 ))。於是，做爲角膜上皮障礙症治療劑，或是對血纖維 蛋白溶酶及血纖維蛋白溶酶原活化物未顯示阻害作用，或 即使有阻害其阻害活性非常弱而無實質的阻害作用之化合 物被期待著。抑肽酶爲強力血纖維蛋白溶酶阻害劑這事， 也是無法成爲醫藥品理由之一。 又，已有將能強烈地阻害包括膠原酶等蛋白酶之特異 性很廣的蛋白性蛋白酶抑制劑之卵大球蛋白應用於難治性 角膜疾病治療之報告，雖得到某程度之成果（鎌田龍二等 ------R_________ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ规格（210X297公釐） ---------^------11—-----S. (請先閱讀背面之注意事項J填寫本頁) 4439 3 1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（Ί ) •臨眼，233 — 237 (1991):鎌田龍二 :日本的眼科，止i, 955 — 960 (1993))， 但被應用之卵大球蛋白因係來自基卵白之異種蛋白，產生 抗原性及過敏反應之可能性高等，在活用於做爲角膜上皮 障礙治療劑在也無法滿足。 從這些報告，可認爲蛋白性蛋白酶抑制劑能促進人角 膜上皮細胞之增殖，有在創傷治癒上顯示效果的可能性， 但擔心到其會阻害血纖維蛋白溶酶及血纖維蛋白溶酶原活 化物，又有血管新生及抗原性等致命的缺陷，故在做爲使 用於人體之醫藥品上更優良化合物之發現被期待著。 關於角結膜障礙症，近年，因紫外線所造成者受到注 目。眼睛被日光照射之狀況，例如，在海水浴時等，紫外 線照射於角結膜上皮，因種種的因子而引起角結膜上皮之 障礙。 起因於紫外線之角結膜上皮障礙症，如下述被知曉著 〇 伴隨壞死及剝離之光角膜炎（Bergmanson JP： Corneal damage in photo keratitis-Why is it so pain ful?；Optom. Vis. S c i ., 6 7 , 4 07 — 413，1990)，特徵爲疼痛及畏光、瞼痙攣 之“雪目“，因紫外線引起之複數病因之白內障誘發（Η i g h t 〇 w e r K R ： A review o f the evidence that ultraviolet _^_2_____ 本紙伕尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I:--------^------ίτ------>$. (請先閱讀背面之注意事項ί填寫本頁) 443931 A7 B7

五、發明説明（f) irradiation is a risk facto r in cataractogenesis ；Doc . Ophthalmol ., 88，205 — 220，19 94)，伴隨藍蓋罕士氏細胞障礙之免疫反應的降低（K e 1 1 e y J G * e t a i • L a n g e r h a n s C e 1 1 a 1 t e r a t i 0 π s i n t h e g u i η e a P i g c 〇 r n e a 1 I n V e s t 〇 P h t h a 1 m 0 1 V l s S c 1 • ， 2 6 > 1 2 9 3 — 1 2 9 6 ί 1 9 8 5 - R a y — K e i 1 L • > e t a 1 ； R e d u c t i 〇 n i n t h e i n c i d e n c e 0 f r e j e c t i 〇π 〇 f h e t e r 0 t 〇 P i c m u r i n e c 0 r n e a 1 t r a n s P 1 a n t s b y F 丨r e t r e a t m e n t w i t h u 1 t r a y i 〇 1 e t r a d i a t i 〇 n T r a n s P 1 a n t a t i c )n 4 2 4 〇 3 一 4 〇 6 9 1 9 8 6 ) 發炎性細胞活素之引起（Kennedy Μ， et al ：Ultraviolet irradiation induces the production of m ultiple cytokines by human cornea 1 cells； Invest Ο p h t h a 1 m o 1 Vis Sci.，38, 2483 — 249 1，1997)，DNA障礙（Reddy V N , e t al:The effect of aqueous h u —^1 - 1JT - - - - - -- In I 一eJ {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 _U}___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4439 3 1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（q ) mor ascorbate on u 1 t r a v i ο 1 et — B— induced D N A damage in lens epithelum； Invest 〇pht h a 1 m ο I Vis Sci·，39，344 — 350 ，1 9 9 8 )，然後是神經障礙（T i· a b u c c h i G ，e t al 'Corneal nerve d a m a g e and regeneration after ex c i m e r laser photokeratecto my in rabbit eyes'. Invest Op h t h a 1 m o 1 Vis Sci ., 35, 229-2 3 5，1 9 9 4 )等。 這些疾病幾乎全部伴隨對角結膜上皮細胞之障礙，可 考慮成，因紫外線生成過氧化氫、氫氧基、氫過氧化物等 之自由基，而因這些自由基之障礙爲主要因素。 考慮到生體之恆常性維持作用，係認爲在淚液中具備 爲消除或抑制這些自由基之足夠量的乳吩嚀（約2 m g/ m1淚）及谷胱甘肽。 因此，因紫外線之種種的角結膜上皮障礙，因紫外線 產生之自由基爲只是其導火線，將其後之生體的恆常性維 持機能當成重要的病因乃是適當的。 依此想法，具自由基之消除或抑制作用，同時兼備促 進身體防禦機能之作用的藥劑’可想成能適用於因紫外線 之角結膜上皮障礙，且在其預防及治療上有用。 做爲對紫外線障礙具有防禦效果的生理性點眼劑，目 __Jj___ 本紙張尺度適用中國图家標準{ CNS ) Α4^ΰΜ 21〇><297公釐） " ^ ' I - ^^^^1 n —^n Hi 1^^^ 一^ (靖先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4439 3 1 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明（，0 ) 前爲止，知曉的有谷胱甘肽、維生素c、維生素E等。又 已知，在生理上存在於淚液中之乳吩嚀及谷胱甘肽，能消 除因種種要因產生之自由基，而防禦角結膜上皮障礙（M egaw JM：Glutathione and o c u 1 a r photobiology； Curr . E y e Res.，3，83 - 87 ,1984)。 又，紫外線遮蔽隱形眼鏡之應用也被試用著（B e r g m a n s ο n J P ： T h e signi f icanc e of ultraviolet radiation for eye diseases. A review w i t h comment on the efficacy of UV-bloking contact lens es ; Ophtha lmi c Phys i o I Opt . ，15, 83-91， 1995)。 但，如此般眾所周知的藥劑及成份、用具，係以消除 因紫外線產生之自由基來防禦爲主要作用，從眼之恆常性 維持之想法，絕不是能滿足的。 又，做爲近視之矯正方法，近年角膜切開術被注目著 。從非常久前，近視矯正一般藉戴眼鏡及隱形眼鏡來進行 ，但戴眼鏡有美容上之問題及在日常生活上麻煩之問題， 帶隱形眼鏡，有因車禍之角膜損傷之問題等，將近視之矯 正從根本上進行之方法被期待著。 針對此，角膜切開術因只要一次的手術即能進行近視 矯正，其後無戴眼鏡及隱形眼鏡等的麻煩，爲一革新的方 _____12_ 本紙張尺度逋用中國國家標隼（CNS } A4规格（210X297公嫠) nf' ln^ ί - - -- i - f ^h·, . ^^^^1 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 443931 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（、、） 法而被注目著。 但，在角膜切開術施行後因角膜切開術之施行方法， 也會發生角膜上皮障礙症，其預防及治療方法之確立，做 爲在角膜切開術之普及上不可或缺之事成爲被硏究之對象 0 所請角膜切開術，係因應矯正之程度將角膜表面按既 定形狀、既定大小切開，來矯正近視之手術，而被稱爲屈 光角膜整形術（R κ)。 在RK手術時，爲切開角膜係進行使用鑽石刀之手法 。此手法係邊讓患者注視裝在手術顯微鏡上之注固視燈， 邊由開刀者徒手將角膜切開。 在如此手法上，爲預防感染及手術後狀態之良好化， 於手術後進行類固醇及抗生物質之點眼。 另一方，角膜切開術之另一手法係光學屈光角膜整形 術（PRK)，其使用準分子雷射器械進行切開。 P R K因不會依開刀者之技術而影響手術精度，在因 切開形狀及切開長度之微妙差異導致十分不同之術後經過 的角膜切開術上係做爲較佳之手法，而在近年極被注目著 ，又，其器械也日日著實進步著。角膜切開術係期待於將 彙集在P R K上。 P R K係藉將準分子雷射之雷射光束照射於角膜上皮 ，以將該位置切開。依此方法，除近視之矯正’因也能進 行遠視矯正及亂視矯正，以致成爲十分有效之視力矯正方 法。這些，近年來被稱爲折射矯正手術。 13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） n Ji I — I I I I. ! _ _ _ _ T € \ 言 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 43 9 3 1 A7 B7 五、發明説明（A ) 使用準分子雷射之PRK ’除其優良之矯正效果被確 認外，種種的倂發症也被報告著。例如，在角膜各層發生 上皮毛病，但這在準分子雷射手術是無法避免的，有時也 會伴隨激烈的疼痛。 又，於手術後之一定期間，上皮下混濁一定會發生。 在手術後1 2個月會消失，但因無法避開在那期間之視力 障礙以致常被視爲問題點。又，在角膜內皮，也觀察到細 胞數之有意的減少。 因此，這些併發症之克服，爲了使用準分子雷射之P R K的更加普及，係做爲不可缺少之事而被注目著。 準分子雷射因使用波長1 9 3 n m之紫外線，只要發 現出能增加角膜上皮細胞對波長1 9 3 nm紫外線之抵抗 性的物質，就有可能解決如此問題。 可是，總稱眼科用劑之針對眼疾病之預防、診斷及/ 或治療之藥劑，各種能適用於眼科領域中之疾病的內服藥 劑及點眼藥劑已被開發、應用著。 做爲這些藥劑能適用之眼的疾病，能列舉如青光眼、 白內障、角膜疾病、鞏膜疾病、網膜疾病、葡萄膜疾病、 玻璃體疾病、視神經疾病、結膜疾病、淚器疾病、眼窩疾 病、眼睛疲勞等，又這些藥劑也適用於於眼科之各種手術 之術前、術中、術後。 做爲這些疾病預防、診斷及/或治療之藥劑，能列舉 如青光眼治療劑、白內障治療劑、抗菌劑（抗生物質、合 成抗菌劑）、副腎皮質荷爾蒙劑、散瞳劑、縮瞳劑、磺胺 14 _ 本紙張尺度適用中國國家榡隼（CNS ) A4規格（210X 297公嫠> (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4439 3 五、 Α7 Β7 發明説明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Μ'局所麻醉劑、血管收縮劑、血管擴張劑、收斂劑、酵 素製劑、抗過敏劑、非類固醇消炎劑、抗真菌劑、抗病毒 劑、角膜保護、治癒促進劑等。 在這些眼科用劑之中，也有對眼疾病有效，但具有引 起爲副作用之嚴重角膜上皮障礙症的作用者。有如此副作 物’因而無法用於做爲有效之眼科用劑。因此，藉由 堅藥劑同時投藥τ能讓副作用消失之物質，做爲有效 ®科用劑而能加以使用之物質被期待著。 角結膜障礙症中，近年被注目的有乾眼症。乾眼症因 戴隱形眼鏡者之增加、於人工空調環境中生活時間之延長 '電視及電腦等V D Τ畫面凝視機會之增加等有增加傾向 ’被視爲問題所在。 乾眼症係引起淚液降低或性質異常之狀態，不問是否 有角結膜障礙（山田等。日本眼科紀要，4 3，1 2 8 9 一 1293 (1992))。依此，淚液減少症、乏淚症 、眼乾燥症、謝格連氏症候群、史迪文斯·強森症候群、 眼類天疱瘡、眼瞼緣症、閉眼不全、知覺神經麻痺等疾病 也包括在乾眼症之範圍。 關於乾眼症，其和角結膜上皮之粘蛋白的關係，有種 種硏究在進行著。已知粘蛋白1係角膜上皮'杯細胞以外 之結膜上皮共通產生物（新眼科，V 〇 1 . 1 4 : Ν ο-ΐ 1 ， 1 9 9 7 ) 。 做爲乾眼症治療法之一 ，係進行含有 做爲此粘蛋白代用品之纖維素甲醚、硫酸軟骨素、透明質 酸等粘彈性物質的人工淚液之點眼等。但’因這些物質和 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X 297公釐} til. *.· I- —— 1 --- I I I ^^^1 —* (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 44393 A7 B7 五、發明説明（0) 粘蛋白在物理學的性質及生理學的性質上不同’其治療效 果有其限度。 於國際公開公報W0 97/39769號公報中，將 以白蛋白做爲有效成分之.用劑應用於乾眼症之嘗試被記載 著。此乃增大眼表面上皮之粘蛋白分泌，謀求表面之淚液 層的安定化。 於日本特開平9 _ 1 3 6 8 3 2號公報’提供含有磺 基脫氫松香酸的乾眼症之預防劑及治療劑之技術被揭示出 。此物係具有粘蛋白產生細胞之結膜杯細胞的粘多糖產生 機能促進作用，以抑制因其機能降低之角化性角結膜障礙 0 於日本特開平9 — 3 0 1 8 6 6號公報’含有喹諾酮 衍生物之乾眼症治療劑被揭示出。此物係藉增加杯細胞， 增加粘蛋白之產生量，增加眼之粘液量。 於曰本特開平10 — 218792號公報，以高血壓 蛋白寧轉化酶阻害藥做爲有效成分之乾眼症治療劑被揭示 出。其係利用高血壓蛋白寧轉化酶阻害藥之針對淚腺機能 可做爲直接作用之神經作用藥來發揮機能，而具有淚液分 泌促進作用。 這些技術，即使能得到某程度之治療效果，但也有不 充分之場合及伴隨副作用之場合，有無法在根本治療上稱 爲有用之物之問題點。 【發明之摘述】 鑑於上述之現狀，本發明之目的係提供一藥劑’能在 本紙張尺度適用中國國家標芈（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

,1T 經濟部智慧財產局員工消资合作社印製 443931 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 87 五、發明説明（θ) 角膜上皮創傷治癒之各相作用，且安全無副作用，針對角 膜上皮障礙症能有效地進行其預防及治療。 本發明之又一目的，係提供針對因紫外線之角結膜上 皮障礙，具有預防作用及治療作用之紫外線角結膜上皮障 礙症適用劑爲目的。 本發明之又一目的，係提供能防止因準分子雷射之P RK手術後倂發症之有效藥劑。 本發明之更一目的，係提供讓做爲副作用而存在之具 有角結膜上皮障礙作用之眼科用劑之該副作用消失，讓該 眼科用劑能有效應用之角結膜上皮障礙症適用劑。 本發明又一目的，係提供藉根絕乾眼症發病原因而能 進行乾眼症之預防及治療之藥劑。 第一之本發明，係一爲預防及/或治療角膜上皮障礙 症之角膜上皮障礙症適用劑，其特徵在於含有做爲有效成 份之 Urinastatin 〇 第二之本發明，係一爲預防及/或治療因紫外線的角 結膜上皮障礙症之紫外線角結膜上皮障礙症適用劑，其特 徵在於含有做爲有效成份之Urinastatin。 第三之本發明，係一爲預防及/或治療角膜切開術施 行後之角膜上皮障礙症之角膜切開術施行後障礙症適用劑 ，其特徵在於含有做爲有效成份之Urinastatin。 第四之本發明，係一爲治療因使用眼科用藥劑引起的 角結膜上皮障礙症之藥劑性角結膜上皮障礙症治療劑，其 特徵在於含有做爲有效成份之Urinastatin。 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） t 种衣 It ~~ 訂 I n _ —i ^ (請先閱讀背面之注意事項 ,.¾寫本頁) 4439 3 1 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（) 第五之本發明，係一爲預防及/或治療乾眼症之乾眼 症適用劑’其特徵在於含有做爲有效成份之Urinastatin。 【圖式之簡單說明】 圖1係表不於實施例1中1 Urinastatin之針對人角膜 上皮細胞之接著、伸展（移動）作用之照片。 【發明之詳細開示】 以下詳述本發明。 第一之本發明，係一爲預防及/或治療角膜上皮障礙 症之角膜上皮障礙症適用劑，其特徵在於含有做爲有效成 份之 Urinastatin ° 在此，所謂角膜上皮障礙症適用劑係適用於角膜上皮 障礙症之藥劑，能列舉如角膜上皮障礙症預防劑、角膜上 皮障礙症治療劑等。角膜上皮障礙症預防劑，係在有可能 發生角膜上皮障礙症之場合時爲預防其發生而使用之藥劑 ，角膜上皮障礙症治療劑，係針對已經發病之角膜上皮障 礙症爲治療或減輕角膜上皮障礙症而使用之藥劑。 於本說明書中，所謂「適用」係以治療' 診斷及/或 預防爲目而投藥於包括人之動物上之意思，所謂「適用劑 」係具有包含治療劑、診斷劑及/或預防劑之廣泛意思。 本發明之角膜上皮障礙症適用劑，係含有做爲有效成 份之Urinastatin。於本說明書中，「Urinastatin」係指人尿 中胰蛋白酶抑制劑（U T I )。 上述Urinastatin，係分子量約6 7 0 0 0 (以凝膠過 濾色譜法測定）或分子量約34000 (以SDS—聚丙 IJ---^------装------訂 (請先閱請背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4439 3 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（β) 烯醯胺凝膠電泳測定）之糖蛋白質’其約3 5 %由糖部份 構成，而爲已經公知之物質（「醫學及藥學」3 3卷，5 號，1 0 8 9 — 1〇9 7，1 9 9 5年）。持田製藥公司 將Urinastatin以商品名「Mi r a c 1 i d」販售著。 從健康男子新鮮尿以一般精製法，例如，藉由在矽藻 土、矽膠吸附後，將離子交換樹脂、凝膠過濾等依序組合 精製，即可得到Urinastatin。 近年，因分析方法之進步，知曉Urinastatin係由數種 異構物構成。這些異構物之不同點，係因其構成糖部份之 磺化程度而有其特徵。認爲在其他以外點（抗胰蛋白酶活 性、分子量、氨基酸組成、N -末端氨基酸鏈區、C -末 端氨基酸鏈區、唾液酸含有量、糖醛酸含有量）沒有不同 (Y u k i , Y . , e t al . ：Biochimica e t Biophysica Acta, 1203, 29 8 — 303 (1993))。不管這些 Urinastatin 異構物 之哪一個，都包含在本發明中。 關於與本發明有關Urinastatin，其細胞增殖作用在人 纖維芽細胞及牛角膜內皮細胞被承認著（〗〇 h a η n a .Κ . , e t al . ：Biochim.Biophy s .Acta .1221, 145 — 152 (1994) )，但無針對人角結膜上皮細胞及實質細胞之報告，由於 因細胞種及動物種的不同蛋白性蛋白酶抑制劑之應答性顯 著不同（Mckeehan，W.L.，et a 1 . ： J .Biol .Chem.261, 5378 — 5383 ( 19 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） ^^^1 ^^^^1 ^^^^1 ^^^^1 —^^1 ^^^^1 ^1· ^^^^1 ^^^^1 n· 1-^i «^1^1 tl«^i \OJ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 443931 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 1 9 8 6 )).’對於人尿中胰蛋白酶抑制劑對人角結膜上 皮細胞之藥理效果並無法預測。 於曰本特開昭6 3 — 2 6 7 7 3 0號公報，以 Urinastatin做爲有效成份之過敏性鼻炎及過敏性結膜炎治 療用外用劑被揭示出。在這公報中記載著針對過敏性結膜 炎患者投藥2 0 m g/m ί之場合，眼結膜充血及搔癢感 消失。 另一方面，如後詳述，本發明者等針對Urinastatin的 角膜上皮細胞之接著、伸展（移動）的促進效果用動物實 驗深入硏究後，確認能戲劇性地治癒爲難治性之糖尿病性 老鼠角膜上皮障礙症及家兔角膜上皮損傷，能證明細胞培 養所認識的生理活性。又，也確認出，其並不會阻害血纖 維蛋白溶酶原活化物，是藉讓在角膜上皮損傷治癒上必要 之血纖維蛋白溶酶原活化物於不會進展到因過剩產生而到 破壞組織之程度下分泌促進之作用。這些事實，十分滿足 做爲革新的角膜上皮障礙症適用劑之條件，第一之本發明 的要旨即在此。 將上述Urinastatin與藥理學上容許之添加劑混合，能 製造本發明之角膜上皮障礙症適用劑。 將上述Urinastatin做爲本發明之角膜上皮障礙症適用 劑之有效成份使用之場合，Urinastatin之濃度範圍無限制 ，但因於0.05〜10000#g/ml在顯微鏡或肉 眼下能觀察及確認促進人角膜上皮細胞之接著、伸展（移 動），以在該濃度範圍使用爲佳。又再將濃度範圍訂於0 ___20_ 本紙Γ張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格YilOX297公釐） " I.--;------Μ------ΐτ------A (請先閱讀背面之注意事項f填寫本頁) it 4439 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（κ) .5〜5000/zg/ml，因能察覺到人角膜上皮細胞 之顯著增殖，以在該濃度範圍使用爲更佳。 本發明之角膜上皮障礙症適用劑，雖以做爲局部投藥 劑、特別是點眼劑、眼軟膏劑或凍乾劑等之劑型使用爲佳 ，但並不限定於這些。做爲點眼劑、眼軟膏劑之場合，能 使用做爲添加劑之脫氫乙酸鈉、對羥基苯酸甲酯等之保存 劑，氯化鈉、甘油等之等張化劑，羧甲基纖維素、聚乙嫌 醇等之增粘劑，乙二胺四乙酸鈉、多糖類等之安定化劑等 的一般的物品，但不限定於這些，只要在眼生理上容許範 圍即可。做爲添加於上述各種劑型之緩衝液，較佳使用等 張' p Η 4〜9、特別是p Η 5 . 5〜8 . 0之無刺激之 -物。 又’本發明之角膜上皮障礙症適用劑，在不妨礙做爲 有效成分之Urinastatin之作用範圍下，與纖維結合素、透 明質酸及各種氨基多糖（硫酸軟骨素、硫酸軟骨素B、乙 酸肝素硫酸鹽、肝素、角質硫酸）等之眼生理活性物質混 合倂用是可能的’能做爲強力的角膜上皮障礙症適用劑。 又’與抗生物質及糖皮質激素等之類固醇性抗炎症劑及非 類固醇性抗炎症劑混合倂用也是可能的。 本發明之角膜上皮障礙症適用劑之用法、用量，因患 者之症狀、年齢等變動，但點眼劑通常1日1〜5回，1 回點眼1〜5滴。眼軟膏劑之場合，通常1日1〜3回於 各結膜囊內適量塗抹使用。 第一之本發明的角膜上皮障礙症適用劑，做爲其對象 21 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） IJ----------- 褒 ----訂·! — II--線 <請先閲讀背面之注咅？事項再填寫本頁) 4439 3 1 A7 B7 五、發明説明（w) : - 11>--- n·^ In u—^ 1 t (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 之角膜上皮障礙症只要於角膜上皮產生障礙症狀，並不限 定什麼，能例舉如，角膜泡疹、細菌性角膜潰瘍、神經麻 痺性角膜炎、糖尿病性角膜症、謝格連氏症候群、史迪文 斯·強森症候群等伴隨內因性疾病之角結膜上皮障礙，因 術後、藥劑性、外傷、帶隱形眼鏡等之外因性疾病等。 '第二之本發明，係一能適用於因紫外線之角結膜上皮 障礙症之紫外線角結膜上皮障礙症適用劑，其特徵在於含 有做爲有效成份之Urinastatin。 在此，紫外線角結膜上皮障礙症適用劑係適用於因紫 外線之角結膜上皮障礙症之藥劑，能列舉如，角結膜上皮 障礙症預防劑、角結膜上皮障礙症治療劑等。角結膜上皮 障礙症預防劑係在有因紫外線之角結膜上皮障礙症可能發 病之場合，爲預防其發病使用之藥劑，角結膜上皮障礙症 治療劑係針對因紫外線已發病之角結膜上皮障礙症，爲治 療或減輕角結膜上皮障礙症使用之藥劑。 經濟部智慧財產局員工消骨合作社印製 依本發明者等之檢討，Urinastatin針對人角結膜上皮 細胞之紫外線障礙，與谷晄甘肽、維生素C、維生素E、 乳吩嚀等比較，已判明具有非常有效之防禦效果。又，此 防禦效果，已確認爲於其他蛋白酶阻害劑無法見到之獨自 的作用。之前沒有Urinastatin之像這樣地適用於眼科之報 告’係本發明者等首次發現之事實。

Urinastatin無自由基捕捉作用之事被報告著，關於 Urinastatin之自由基之消除（抑制）作用已經有一些報告

Q _______22___ 本紙張尺度適用中國國家^ ( CNS ) A4規格（2丨0X297公釐) 一 443931 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7 五、發明説明（/ ) 但，如後述之實施例中可明顯的看出，紫外線照射中 之Urinastatin含量，與自今爲止被報告之有效量（3 7〜 74#g/ml ; 1〜2μΜ，以分子量3 4 0 0 0計算 ，以下同）比較，是非常少之量（M. Nomura, e t a 1 ： E f f e c t o f Urinastatin and A p r o t i n i n on the oxygen radical production of poly morphonuclear leukocytes;醫 學之步履，142，895 — 896，1987)，假如 ，像這樣的Urinastatin之效果，若只是自由基之消除（抑 制）作用，則會在與谷胱甘肽、維生素C、維生素E等之 結果間產生大矛盾。 因此，Urinastatin之紫外線障礙之防禦效果，不只是 自由基之消除（抑制）作用，而認爲促進其他防禦機能之 作用在進行，例如，保護劑之誘導及淸除劑受器蛋白之發 現等的可能性也被考慮著。 K . T s u b 〇 t a等，藉將高濃度1^2〇2接觸到人 角膜上皮細胞（H C E C )，確認著和U V - B照射同等 的細胞內0Η·自由基之生成及因此之細胞內ATΡ含量 之減少。又，認知到僅因0 Η，自由基無法產生之線粒體 內膜之損傷會因UV-B照射而發生。（S.Shimm u r a , e t al ：Subthreshold U V Radiation— induced peroxide format ion in Cultured corn -------23_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公慶） I I i ! : --Γ - ·ι I - - -- I n^i - - II 1^—^— ^^^1 1·-ϋ ί請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 443931 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（p) e a 1 epithelial c e 1 1 : T h e p r otective effects of Lactof errin；Exp.Eye Res., 63，519 — 5 2 6, 1996 ·, K.Tsubota ., e t a 1 (Ultraviolet B— induced m i t ochondrial dysfunction is associated with decreased cell detachment o f corneal epithelial cell in vitro； I n v e s t Ophthalmol Vis Sci.,3 8,620-626,1997)。 即，人角結膜上皮細胞之增殖必須防禦接受U V - B 照射之線粒體內膜之損傷才有可能。因此，認爲 Urinastatin也防禦著因紫外線照射產生之線粒體內膜之損 傷。 Urinastatin顯著地防禦著因紫外線照射之人角結膜上 皮細胞之障礙。又，其防禦效果比乳吩嚀、谷胱甘肽、維 生素E、維生素C等之抗氧化劑，及α 1 -胰蛋白酶抑制 劑、α 2 -血纖維蛋白溶酶抑制劑、抑肽酶、抑氨肽酶Β 素等之蛋白酶阻害劑更優秀。 又考慮成，Urinastatin之防禦方法，非依因紫外線照 射發生之自由基的消除（抑制）作用、蛋白酶阻害活性之 作用、細胞膜保護作用等，而是這些既知作用以外之機構 大大作用著。 ______24_ 本紙張I度適用中國國家標华·（CNsTT^l格（210X 297公釐） il'—I j~11 ~]-'-*农 I I I (請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) 4439 3 1 A7 B7 五、發明説明（A ) 針對因紫外線照射之眼科障礙’將Urinastatin加以適 用乃是至今未被知曉的第二之本發明的要旨所在。 將上述Urinastatin與藥理學容許之添加劑混合，能製 造本發明之紫外線角結膜上皮障礙症適用劑。 做爲第一之本發明的紫外線角結膜上皮障礙症適用劑 之劑型，能舉出與上述第一之本發明的角結膜上皮障礙症 適用劑相同之物，又，關於能混合併用之物，用法 '用量 等，能同樣舉出與關於上述第一之本發明的角結膜上皮障 礙症適用劑之物。 做爲第二之本發明的紫外線角結膜上皮障礙症適用劑 之對象的角結膜上皮障礙症，能列舉，因紫外線照射之結 膜充血、瀰漫性表層角膜炎、角膜浮腫、虹膜炎等、伴隨 壞死及剝離之光角膜炎、疼痛及羞明、瞼痙攣爲特徵之“ 雪目“'因紫外線引起之複數病因之白內障、伴隨藍蓋罕 士氏細胞障礙之免疫反應低下、炎症性細胞活素之誘導、 D N A障礙、神經障礙等。 第三之本發明，係一能適用於角膜切開術施行後之角 膜上皮障礙症之角膜切開術施行後角膜上皮障礙症適用劑 ，其特徵在於含有做爲有效成份之Urinastatin。 於本說明書所請「角膜切開術施行後角膜上皮障礙症 適用劑」，係適用於上述角膜切開術施行後產生之角膜上 皮障礙症的藥劑，能列舉，角膜切開術施行後角膜上皮障 礙預防劑、角膜切開術施行後角膜上皮障礙治療劑等。角 膜切開術施行後角膜上皮障礙症預防劑係角膜切開術施行 __________25^_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐〉 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印奴 4439 3 A7 B7 五、發明説明（4) 後，在有可能發生角膜上皮障礙症之場合時爲預防其發生 而使用之藥劑，角膜切開術施行後角膜上皮障礙症治療劑 係針對角膜切開術施行後產生之角膜上皮障礙症爲治療或 減輕角膜上皮障礙症而使用之藥劑。 做爲上述之角膜切開術沒有特別的限定，能列舉’使 用準分子雷射器械進行切開之光學屈光角膜整形術（p R κ )等。 上述角膜切開術施行後角膜上皮障礙症可推想成例如 ，PRK手術時之準分子雷射的角膜上皮照射而引起者。 準分子雷射係波長1 9 3 n m之紫外線，因此，能預防及 /或治療起因於波長1 9 3 n m之紫外線之角膜上皮障礙 症之物，而能達到上述目的。 本發明者等深入硏究之結果，查明出針對上述目的 Udnastatin乃是十分有效，而完成本發明。 針對角膜切開術施行後之角膜上皮障礙症，將 Urinastatin適用即是至今未被知曉的第三之本發明的要旨 所在。 將上述Urinastatin與藥理學容許之添加劑混合，能製 造本發明之角膜切開術施行後角膜上皮障礙症適用劑。 做爲第三之本發明的角膜切開術施行後角膜上皮障礙 症適用劑之劑型，能舉出與上述第一之本發明的角膜上皮 障礙症適用劑相同之物，又，關於能混合倂用之物，用法 、用量等，能同樣舉出與關於上述第一之本發明的角膜上 皮障礙症適用劑之物。 ______26 本紙張通财關家( CNS ) 44祕（2丨0X297公釐) --- (請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) 装 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 443931 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（Λ ) 做爲構成第三之本發明的角膜切開術施行後角膜上皮 障礙症適用劑之對象的角膜上皮障礙症，例如，做爲產生 於角膜各層者，能舉出上皮欠損、上皮下混濁、角膜內皮 細胞數減少等之針對角膜內皮之障礙等；做爲遍佈角膜-全 層者，能舉出角膜穿孔、角膜感染症等；做爲視機能障礙 者，能舉出暈輪、眩光、低矯正、過矯正、返回等。 第四之本發明，係一爲適用於因眼科用藥劑引起之角 結膜上皮障礙症之藥劑性角結膜上皮障礙症治療劑，其特 徵在於含有做爲有效成份之Urinastatin。 藥劑性角結膜上皮障礙症治療劑係針對因種種的眼科 用藥劑產生之角結膜上皮障礙症爲治療或減輕而使用之藥 劑= 本發明者等深入硏究之結果，查明出針對因種種的眼 科用藥劑產生之角結膜上皮障礙症Urinastatin十分有效， 完成本發明。 做爲上述眼科用藥劑，只要是因投藥而有發生角結膜 上皮障礙症之危險性者即可，並不特別限定，例如，能舉 出以下之物。 內服眼科用劑：二氯苯二磺胺、核勒年、二碘硬脂酸 鈣、美合咪唑、濃甘油。 縮瞳劑：鹽酸毛果鹼、水楊酸毒扁豆鹼、乙基膦酸對 硝基苯乙基、碘r化二乙氧隣醯硫膽驗、溴化distigmine、 碳醯膽鹼。 青光眼治療劑：馬來酸瞳嗎心安、鹽酸苯呋心安、鹽 JH ^^^1 - I .^^1 I I - - I ^^1· -I-~R- - - - I ---- . ---1. Tw e-=6 f請先s讀背面之注意事項再填寫本頁j 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） 4439 3 1 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（>) 酸喹酮心安、異丙基烏洛普洛司通、拉他諾普洛司。 散瞳劑：鹽酸環戊通、氫溴酸後馬托品、硫酸阿托品 、鹽酸脫羥腎上腺素、托品醯胺、腎上腺素、酒石酸氫腎 上腺素、鹽酸雙比貝服林。 白內障治療劑：Pirenoxine、品狀體溶素（商品名。 曰本傑利雅新藥公司製）、谷胱甘肽。 角膜保護·治療劑：硫酸鈉軟骨素、Flavitan (商品 名。山之內製藥公司製）、氰鈷胺素、甘草甜味素酸二鉀 、透明質酸鈉。 酵素製劑：α胰凝乳蛋白酶。 血管收縮劑：硝酸萘唑咐。 防腐收斂劑：硝酸銀、硼酸、硼砂。 抗生物質。抗真菌劑。合成抗菌劑。磺胺劑。抗病毒 劑。 副腎皮質荷爾蒙劑：乙酸氫化可的松、乙酸氫化潑尼 松、磷酸地塞米松鈉、地塞米松、磷酸貝他米松鈉、氟甲 松龍1^ 其他：硫酸鋅、葜磺酸鈉、氯化溶菌酶、Tego-51、 聚乙烯醇。 非類固醇消炎劑：雙氯滅痛鈉、消炎痛、雙吡苯丙酸 〇 抗過敏劑：馬來酸氯苯胺、色甘酸鈉、安列基沙諾克 斯、富馬酸 ketotifen、tranilast。 局部麻醉劑：鹽酸羥基四卡因、德卡因。 _^_28_ 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本育) -

、1T 4439 31 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（>Ί ) 第四之本發明，係如上述眼科用藥劑之副作用的角結 膜上皮障礙作用發生時，將其副作用消失，讓該眼科用藥 劑有效適用。 針對爲適用於因眼科用藥劑之角結膜上皮障礙症之藥 劑性角結膜上皮障礙症治療劑，將Urinastatin適用即是至 今未被知曉的第四之本發明的要旨所在。 將上述Urinastatin與藥理學容許之添加劑一起混合， 能製造本發明之藥劑性角結膜上皮障礙症適用劑。 做爲第四之本發明的藥劑性角結膜上皮障礙症治療劑 之劑型，能舉出與上述第一之本發明的角膜上皮障礙症適 用劑相同之物，又，關於能混合倂用之物，用法 '用量等 ，能同樣舉出與關於上述第一之本發明的角膜上皮障礙症 適用劑之物。 做爲第四之本發明的藥劑性角結膜上皮障礙症治療劑 之對象的角結膜上皮障礙症，除與上述第一之本發明的角 膜上皮障礙症適用劑相同外，也能舉出因使用眼科用藥劑 產生之結膜上皮障礙症。 第五之本發明，係一爲預防及/或治療乾眼症之乾眼 症適用劑，其特徵在於含有做爲有效成份之Urinastatin。 在此，乾眼症適用劑係適用於乾眼症（眼球乾燥症候 群）之藥劑，能例舉’乾眼症預防劑、乾眼症治療劑等。 乾眼症預防劑係在有可能發生乾眼症之場合爲預防其發生 而使用之藥劑，乾眼症治療劑係針對發病之乾眼症爲治療 或減輕乾眼症而使用之藥劑。 _ ___29 本紙張尺度適用中國國家標华（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4439 3 A7 B7 五、發明説明（α) 如後詳述’能確認Urinastatin能確實預防使用動物樣 本之乾眼症’此事實，也確認了 Urinastatin藉具有·對·角糸吉 膜上皮細胞之粘蛋白1產生促進效果。這些事實滿足做爲 非常革新之乾眼症適用劑之條件，爲本發明的要旨所在。 將上述Urinastatin與藥理學容許之添加劑一起混合， 能製造本發明之乾眼症適用劑。 將上述Urinastatin做爲本發明之乾眼症適用劑之有效 成分使用之場合’ Urinastatin之濃度範圍無限制，但因於 Q .05〜1 0000//g/ml促進人角結膜上皮細胞 之粘蛋白1的產生，及能確認在同濃度下能預防使用老鼠 樣本之乾眼症，故在該濃度範圍使用爲佳。又再將濃度範 圍訂於0 _5〜5 0 0 0 eg/ml，因能察覺到人角結 膜上皮細胞之顯著粘蛋白產生，故在該濃度範圍使用爲更 佳。 做爲第五之本發明的乾眼症適用劑之劑型，能舉出與 上述第一之本發明的角膜上皮障礙症適用劑相同之物，又 ，關於能混合倂用之物，用法、用量等，能同樣舉出與關 於上述第一之本發明的角膜上皮障礙症適用劑之物。 做爲本發明之乾眼症適用劑對象之適用症，只要係淚 液低下或引起質異常之狀態，不問是否有角結膜障礙’能 例舉，淚液減少症、乏淚症、眼乾燥症、謝格連氏症候群 '史迪文斯·強森症候群、眼類天疱瘡、眼瞼緣症 '閉眼 不全、知覺神經麻痺等之疾病等起因之乾眼症。 本發明之角膜上皮障礙症適用劑、紫外線角結膜上皮 ____30_____ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) i装，

、1T 經濟部智慧財產局員工消资合作社印製 443931 A7 B7 五、發明説明（z) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 障礙症適用劑、角膜切開術施行後障礙症適用劑、藥劑性 角結膜上皮障礙症治療劑，及乾眼症適用劑，不管哪一個 做爲眼科用藥劑能適用於包括人之動物上，例如，依點眼 等方法能適用。依上述點眼等方法，將上述本發明之眼科 用藥劑，爲治療及/或預防之目的適用於包括人之動物上 ，並處理之方法也是本發明之一。 爲將上述本發明之眼科用藥劑工業生產而使用與本發 明有關之UHnastatin也是本發明之一。 本發明之角膜上皮障礙症適用劑、紫外線角結膜上皮 障礙症適用劑、角膜切開術施行後障礙症適用劑、藥劑性 角結膜上皮障礙症治療劑，及乾眼症適用劑，不管哪一個 都將Urinastatin做爲有效成分而含有之眼科用藥劑，但如 上詳述，只要將Urinastatin做爲有效成分含有，其他成分 有無含有，都包括在本發明之範圍。 經濟部智慧財產局員K消費合作社印製 本發明之角膜上皮障礙症適用劑、紫外線角結膜上皮 障礙症適用劑、角膜切開術施行後障礙症適用劑、藥劑性 角結膜上皮障礙症治療劑，及乾眼症適用劑，因做爲醫藥 組成物能使用於包括人之動物上，各自能稱爲角膜上皮障 礙症適用醫藥組成物、紫外線角結膜上皮障礙症適用醫藥 組成物、角膜切開術施行後障礙症適用醫藥組成物、藥劑 性角結膜上皮障礙症治療醫藥組成物，及乾眼症適用醫藥 組成物。 【爲實施發明之最良狀態】 以下舉出參考例及實施例，將本發明更加詳細說明， 本紙張尺度適用中國國家標孳（CNS } A4规格（210X297公麓） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 443931 A7 ___________B7__ 五、發明説明（功） 但本發明不是只限定於這些。 參考例1

Urinastatin 之製造 將健康成人尿約l〇〇〇L用6N NaOH調整至 Ρ Η 1 〇 〇約3 〇分放置後，將產生之不溶物用特多龍 綿柱除去，將通液尿用6 Ν Η 2 S 0 4調整至ρ Η 7 _〇 °將空氣吹入此液9 9 0 L內讓它起泡，採集泡沫部分1 4 0 L。 將採集到之泡沬部分尿用6 N H C 1調整至ρ Η 5 . 0， 用矽膠5 D (富士大衛森公司製）1 〇 〇 m L於約1 0 °C 藉分批處理法吸附4小時。 將矽膠5 D充塡於柱，用〇 . 〇 5 N磷酸一鈉_ 0 . 5 Μ N a C 1 ( ρ Η 5 . 0 )水溶液洗淨後，用0 . 3 Μ氯化 銨-氨水（Ρ Η 9 . 5 )洗提Urinastatin。將洗提液於室 溫下進行7 0 %硫銨分離，一晝夜靜置後，回收生成之沈 澱物。將此沈澱物溶解於磷酸一鈉水溶液（Ρ Η 4 . 0 ) ，用含有0 . 1 Μ N a C 1之磷酸一鈉水溶液（Ρ Η 4 . 0 )通液於已平衡化之D E A Ε _賽璐玢A 2 0 0柱（樹 脂量3 0 0 m 1 )，用相同緩衝液洗淨後，用含有0 . 3 M NaCl之磷酸一鈉水溶液（ΡΗ4.0)洗提 Urinastatin，將此液再用純水稀釋，以同樣的操作再進行 色譜吸附分析。將得到之洗提液用〇 ‘ 3 N N a 0 Η返回 至ρ Η 7 . 0，令抑肽酶.瓊脂糖C L - 4 Β柱通液，以 除去微量之混入血管舒緩素。將此通過液通過ΡΜ— 1 ◦ _32_ 本紙张尺度適用中國國家標隼（CMS ) Α4規格（2丨0>< 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

4439 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（V ) 0 (阿米康公司製）超濾膜，再將通過液用PΜ- 1 〇 ( 阿米康公司製）超濾膜進行濃縮，最後通過〇 . 2 2 之除菌膜，得到比活性2 7 0 0單位/m g蛋白質之精製 Udnastatin (批號 A ) 6 0 萬單位。 依同樣之精製操作，再得到3批（批號B :比活性2 8 0 0單位/mg蛋白質，收量5 9萬單位，批號PW-2 :比活性2 8 0 0單位/m g蛋白質，收量56 .5萬 單位，批號PW- 3 :比活性2 600單位/mg蛋白質 ，收量6 5萬單位）精製Udnastatin。 依同樣之精製操作，得到精製Urinastatin (批號6 7 B 8 :比活性2 7 4 0單位/m g蛋白質，收量6 0萬單 位）。 本精製Urinastatin，於S D S電泳（1 2 %凝膠）在 分子量3 4 0 0 0呈現單一帶，與以Urinastatin標準品做 爲抗原而調製出之兔抗體以凝膠內雙重擴散沈降法形成沈 降線，在發熱性試驗、凝血激酶試驗等之生物規格試驗合 格。 實施例1 人角膜卜.皮細朐之接著、伸展（移動） 將人角膜上皮細胞系（huma n corneal epithelial cell line:HCEC) 用無血淸培養基（包含0 . 1m g/m 1硫酸卡那霉素之 D—MEM/F-12培養基；日硏生物醫學硏究所製） 調製成細胞數2 · 0 X 1 0 5/m 1之液3 0 0 # 1後播種 __33_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - - . ^^^1 -I -----1 -- 丈次 —^^1. ^^^1 nf— ^ Ύ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4439 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（β) 於浮遊細胞用燒瓶（住友貝克萊公司製），同時添加各種 濃度之 Urinastatin (批號 PW-2)。於 37°C，5%C 0 2恆溫箱內5小時培養後，完全除去培養基，再將新的同 樣之無血淸培養基3 0 0 // 1添加於各孔後，馬上於顯微 鏡觀察下照相，觀察人角膜上皮細胞之接著、伸展（移動 )之程度。做爲對照係取代Uurinastatin而添加生理食鹽 水之細胞群。 結果表示於圖1。於圖1，上段之2張相片表示對照 群（control)，中段之2張相片表示添加 Urinastatin (濃度〇 . 5 μ g / m 1 )之群，下段之2張相 片表示添加Urinastatin (濃度5 //g/m 1 )之群。依圖 1明顯地，與對照群（c ο n t r ο 1 )比較，人角膜上 皮細胞之接著、伸展（移動）之細胞群（箭頭記號）於添 加Urinastatin之多孔上明顯地多。 實施例2 人角膜上皮細朐之增殖 將人角膜上皮細胞株（huma n cornea 1 epithelial cell line:HCEC) 用包含1 %胎牛血淸之SHEM(supplement ary hormone epithelial med ium)改變培養基（從Araki K.et a 1.: Invest .Ophtha lmo 1 .Vis .Sci ，18，2665，1993記載之S Η E M培養液省 略表皮增殖因子之培養基）調整至細胞數3 x1 0 4/m 1 _；___ 34 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ ------^------------訂 (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) 4439 3 A7 ____B7 五、發明説明（A ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，將此細胞懸濁液1 Q Q " i _於g 6孔多孔板（康寧 公司），約同時將Udnastatinl 〇以1添加於各孔，於3 7 C ’ 5 % C〇2恆温箱內作4 8小時培養。使 用 2 批（批5虎 A ; 1 . 6，0 · 1 6 m g/m 1，批號 B ，2_2mg/ml)。48 小時培養後，將MT τ ( 3 —(4，5—二甲基—2 -噻唑基）—2，5 —二苯基— 2 Η -四唑鎗溴）5 m g/m 1液丄〇 " !添加於各孔， 再於3 7 C，5 % C〇2恆溫箱內作丄6小時培養。培養後 ’將20%SDS(s〇diUm d“ecyi su 1 f a t e) - 規定鹽酸液looyi添加於各 經濟部智慧財產局員工消资合作社印製 孔，停止細胞培養，再於3 7 t作6小時保溫。從依微板 讀取計之570nm- 660 n m之吸光値算出生成之青 色甲曙量’以測定人角膜上皮細胞之增殖。因Urinastatin 之細胞增殖活性，以代替Urinastatin而添加生理食鹽水1 0 V 1之細胞群作對照，而用（Urinastatiii添加細胞群之 吸光値+生理食鹽水添加細胞群之吸光値）X100(% )表示。又，使用之Urinastatin之各批異構物含量不同， 將各異構物之含量比表示於表1。將結果表示於表2。從 表2明顯地認知出，人角膜上皮細胞之增殖作用雖因異構 物種類之含量比不同而變化，但與對照比較皆非常優秀， 有約2倍以上之增殖。 表1 Urinastatin異構物之存在比 _馬構物㈤ U- 1 U- 2 _U- 3 U-4 35 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 44393" A7 B7 五、發明説明（0 )

批號· A 批號.B

表2 Udnastatin之人角膜上皮細胞增殖作用 Urinastatin (終濃度） 增殖率（％ ) 批號 A ( 1 6 0// g/m i ) 1 9 4±2 Ο 批號 B(220yg/ml) 245±51 ---I ^^^^1 1— ^^^^1 ^^^^1 Mi I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 實施例3 人角膜上皮細朐之增殖 將人角膜上皮細胞株H C E C用包含1 %胎牛血淸之 S Η Ε Μ改變培養基調整至細胞數5 X 1 0 4/m 1，將止匕 細胞調整液3 0 0 # 1播種於4 8孔微孔板（康寧公司） ，同時添加各種濃度之Urinastatin (批號P W— 2、P W —3 ) 3 0 g i於各孔，調製成終濃度0 . 0 5〜1 # g /m 1，於3 7°C，5%C〇2恆溫箱內作6 4小時培養。 培養後，除去各孔之培養上淸，添加剝離液（包含0 .25%t ryps in (w/v) , 0 .02%EDT A之磷酸緩衝生理食鹽水）1 Ο 0 e 1，再於3 7 °C ’ 5 % C Ο 2恆溫箱內作六分鐘保溫。 經濟部智慧財產局員工消资合作社印製 保溫後，再進行吸量管吸取將上皮細胞十分剝離、分 散，在此添加0 . 1 % (W/V )錐蟲藍染色液1 〇 〇 # 1將細胞染色後，馬上用血球計算盤計測細胞數。取代1 Urinastatin以添加生理食鹽水3 0 β 1之細胞群做爲對照 〇 結果表示於表3。表3中，Urinastatin係顯不具濃度 依存性之明確的人角膜上皮細胞增殖作用。 表3 Urinastatin之人角膜上皮細胞增殖作用 36 ____ 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐） 爲439 31 A7 B7 五、發明説明（β

Urinastatin濃度（μ g/m 對照組 PW-2 Ο . Ο 5 0.1 0.2 0.5 1 ) PW 3 0-05 0.1 0.2 0.5 細胞數（χ 1 05cells/ml) 2.40 2.23 2.50 2.53 2.90 3.43 2-43 2.75 2-75 2-93 3.00 經濟部智慧財產局員工消贫合作社印製 實施例4 角膜上皮障礙症之治瘠 針對有關角膜上皮剝離糖尿病老鼠之角膜上皮被覆、 再生促進作用作檢討。 讓生下8週之Sp r a g u e—D awl e y系雄性 老鼠一夜絕食後，將溶解於3 mM檸檬酸緩衝劑（P H 4 .5 )之鏈脲霉素（西格瑪公司）以60mg/kg體重 之用量從尾靜脈投藥，其後飼育2週做成糖尿病老鼠。 將上述做成之糖尿病老鼠分成4群，將N emb u t a 1注射液（大日本製藥公司製）以每1 k g體重4 0 m g對腹腔內投藥，全身麻醉後，再將鹽酸丁氧普魯卡因0 • 4%液（參天製藥公司製）於一眼一滴點眼後局部麻醉 ，用眼科用手術刀從角膜輪廓至中心部剝離角膜上皮全域 。剝離角膜全上皮層後馬上將Urinastatin (批號PW- 2 )、500vg/ml兩液，貝爾雷因明0 • 3 (參天製藥公司製）及生理食鹽液（光製藥公司製） 一_ 37 ---- I - - -- 1 H I ^^^1 一β, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） 443931 A7 B7 五、發明說明（4) 於各群之老鼠各1日6回，2小時間隔下每次5 # 1點眼 〇 又，於角膜全上皮層剝離後馬上、經過2 4小時後、 經過3 2小時後將里查遜染色液（溶解於1 %硼酸鈉水溶 液之1 %亞甲藍與1 %天藍Π之1 : 1混合液）一滴點眼 後，用生理食鹽液（光製藥公司製）十分洗淨，將損傷部 染色後，在裝有錄影攝影機之實體顯微鏡下照相兩眼眼部 。角膜上皮創傷部面積係將得到之監視器畫面上之染色部 使用影像解析處理系統軟體（NIH imagel.61 )來測定。角膜上皮之再生、修復，將剛剝離後之創傷部 面積設爲1 0 0 %，創傷部面積之縮小表示於表4。於本 實施例使用之動物樣本，因係使用讓角膜上皮創傷治癒速 度降低之里查遜染色液（U b e 1 s J . e t a 1 .： Invest . Ophthalmol. Vis. Sc i.，23，127(1982))，比後述實施例6之 動物樣本更難治，於剝離3 2小時後對照組幾乎無治癒。 又，在角結膜上皮障礙治療用點眼劑之貝爾雷因明〇 . 3 (主藥爲透明質酸鈉0 . 3 %)點眼群也幾乎無治癒。但 ，Urinastatin點眼群其角膜創傷部位之面積有意義地縮小 。因此’ Urinastatin有意義地促進難治性角膜上皮創傷之 治癒是明顯的。 表4 針對糖尿病老鼠角膜上皮障礙之Urinastatin之效果 對照組 Urinastatin Urinastatin 0.3 (500 β g/ml) (5 β g/ml) 0 小時 100 100 100 100 38 $^尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I Γ ^---------- 裝---- (請先閱讀背面之迮意事項再填寫本頁) 訂---I I---* 線 Jr 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 443931 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消f合作社印製 五、發明説明（q) 24 小時 97.9±11.7 87.9±8.8 89.2±9.2 107‘3土3.7 32 小時 102.1 ±15.0 66.4±8.4㈣ 72.8±22.5* 96·6±11·6 將角膜上皮剝離後馬上（0時間）之角膜損傷部位之面積定爲1 0 0% *ρ<0.05， **ρ<0.01 實施例5 對人角膜h皮細朐件血纖錐蛋白溶酿原活件化因子（P A )之Urinastatin和抑吐醯之景今響 因種種原因受到障礙之角膜上皮細胞，於其修復過程 ，角膜上皮細胞分泌之P A伴演重要角色之事，於1 9 8 3年已被Thoft RA等提倡著（Thoft RA. ,e t al . ；Hypothesis of corne a 1 epithelial maintenance . ,Invest .Ophthalmol .Vis .Sc i·, 24， 1442-1443 (1983))。 另一方面，針對損傷治癒能阻礙血纖維蛋白溶酶活性 之抑肽酶爲有益之事，亦即間接抑制P A活性是重要的， Salonen E Μ等於1987年報告著（Sal〇 n e η Ε M.，et a 1 . ； Ρ 1 a s m i η in tear fluid of patients with cornea 1 ulcers ：basis. for n e w therapy., Acta Ophtha lmo 1 65, 3-12(1987), Cejkova J .,e t al . ；Histochemical s t u d y of alkali— burned rabbit anterior eye segment in w h i 39 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

I 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS } A4说格（210X297公釐） 443931 A7 B7 五、發明説明（彳） c h severe lesions were pr.ev e n t e d by aprotinin t r e a t m e nt ., Histochemistry, q 2 441 -448(1989))。

但，於1991年，James D等報告出，抑肽 酶會濃度依存地阻礙於角膜上皮損傷治癒過程必要的角膜 上皮之移動（James D.，et a 1 . ； g f f e c t of protease inhibitors 0 n corneal epithelial migra t i 0 n . , Invest .Ophthalmol .V is.Sci ·，32，2073-2078 (1991 ))° 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 —^1 - I I 1 IV —^n- II 士^^ ^^^^1 ^^^^1 ^^^^1 11^^1 ^^^^1 ^^^^1 ^ J. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 又，1998年，Winston W YK.等報 告了決定之事實。他們使用血纖維蛋白溶酶原欠損老鼠， 作成機械的角膜上皮障礙，觀察損傷治癒之結果，發現嚴 重且持續的發炎反應、血纖維蛋白沈著於角膜上皮後方、 潰瘍生成、實質性血管新生等複雜之惡化症狀。然後，結 論出於角膜上皮之損傷治癒血纖維蛋白溶酶之生成是必須 的（Winston WYK.，et a 1 . ； H e a ling of cornea 1 epithelial defects in plasminogen and fibrinogen deficient mice. ，Invest .Ophthalmol .Vis .Sc i.， 39， 502-508(1998))。 _；__40_ 本紙張尺度適用中國國家橾準（CNS ) A4规格（210X 297公釐） 4439 3 1 A7 B7 ______ 五、發明説明（4 ) 此事證實擔當血纖維蛋白溶酶之生成之P A是必須的。又 ，近年，T h 〇 m a s D等，進行以PA做爲角膜上皮細 胞毒性試驗的指標之嘗試。亦即暗示著，抑制PA分泌的 藥劑具細胞毒性，對損傷的防禦不利；相反的，促進PA 分泌的藥劑對手術中角膜上皮的損傷防禦是有益的（T h 〇 mas D.，et al . ；Cytotoxicity of Viscoelastics on cultur e d cornea 1 epithelial cell s measured b y plasminogen a c t i v a t o r release., J.Refrac t. Corneal Surg., 10, 95-102 ( 1994))。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ^^^1 . _ I * - - - -I - If - - - - I - - -- n^i--aJ (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) P A之分泌及其活性保持對角膜上皮損傷治癒是必須 的，這件事被很多硏究者報告著（A n d r a s B _，e t a 1 . ； T e a r plasminogen act ivators — indicators of e p i t h e 1 i a 1 cell destruction. T he effect of scraping, n-he ptanol debridement, and a 1 k a 1 i burn of the cornea on t h e plasminogen activator a c t i v i t y of rabbi t tears.，Int er .Ophthalmol ., 15, 363-369 (1991). Chris P L.;Plasmin a _· _4J___ 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 4439 3 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（W ) n d plasminogen activator i nhibi tors after e x c i m e r 1 a ser photorefractive k e r a t e c t omy ： New concept in p r e v e n t i ο n of postoperative m y o pic regression and haze ., Re fract.& corneal Surg.，9，30 0-302(1993))。 又，：ί o z s e f T等報告著，於種種角結膜疾病 及謝格連氏症候群之淚液中發現很多P A阻礙因子（P A I)，而使PA之活性降低（Jozsef T.， et al . ； Plasminogen activator inhibitors in human tears ., Acta Ophthalmol ., 69, 426-43 1(19 9 1))。 從如此多數之硏究者之報告之角膜上皮損傷治癒中血 纖維蛋白溶酶原活性化因子/血纖維蛋白溶酶系的是非之 論爭，能結論出P A之分泌及其活性保持乃是必須條件。 因此，針對Udnastatin是否與抑肽酶具有同樣之欠陷 ，於以下之實施例作檢討。 實施例5 _ 1依Urinastatin之人角膜卜皮細朐件P A分泌促進作用 將人角膜上皮細胞H C E C用包含1 0 %胎牛血淸之 S HEM改變培養基調整至細胞數1X10 4/mi，將此 42 fl 0 u i^ijl «n - > 为 噹 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙乐尺度適用中國國家梯準（CNS ) A4規格（2I0X297公釐） 4439 3 1 A7 B7 五、發明説明) 細胞調整液5 0 0 v 1播種於2 4孔多孔板（康寧公司） 之各孔，於3 7°C ’ 5%C〇2恆溫箱內作不到3小時培養 。其後，添加 Urinastatin (批號 PW— 2，50yg/m 經濟部智葸財產局8工消贫合作社印製 I I li -- - s t— - - - I ·1ι ί J-eJ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1) 10# 1於各孔’於同樣條件再各自培養3天及6天 ，採集其培養上清。將採集到之上淸液用離心分離膜（烏 托拉伸特；東曹公司）約5倍濃縮後，用將P 1 0 u g J 等之方法（Ploug J.，et a 1 . ； B i o c h im.Biophys .Acta ., 24, 278 (1 9 5 7 ))部分改變之血纖維蛋白平板法，及，合成基質 3 1 4 5 - V (肽硏究所）之方法（K a w a b a t a S .，e t al . ；Eur .J .Biochem., 17 2 , 1 7 ( 1 9 8 8 ))測定P A活性。又，P A之鑑定 係將 Urokinase 抗體（TechnoClone G.m. b . H .;奧地利）與組織性血纖維蛋白溶酶原活性化因 子抗體（Accurate Chemical & Sc ient if ic Corporat ion;USA)之 交叉反應以Ouchterlony法（凝膠內二重擴散沈降法）作 確認。結果表示於表5。 三天之培養，並無法確認於Urinastatin添加、無添加 之兩群是否有差異。但，六天之培養，於Urinastatin添加 群與無添加群比較明顯地有P A分泌促進傾向。從此事可 確認出，Urinastatin進行將角膜上皮損傷治癒必須之P A 以不會進展至因過剩產生而組織破壞之程度的微少分泌促 進，而有效地提昇損傷治癒。 43 本紙张尺度適用申國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4439 31 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（w) 表5 因Urinastatin之人角膜上皮細胞性血纖維蛋白溶酶 原活化物分泌促進作用 培養曰數 血纖維蛋白溶酶原活化物活性（mU/ml)

Urinastatin 無添加 Urinastatin 添加 3 日後 1500±44 1700±49 6 日後 1500±29 1900±110 實施例5 - 2 因Urinastatin及抑肽醃之人角膜上皮細胞性P A活件阳礙 之比較 將人角膜上皮細胞H C E C用包含1 〇 %胎牛血淸 之S Η Ε Μ改變培養基以6天，37°C，5%CO 2恆溫箱 內培養後，將其培養上淸4 9 0 m 1進行6 0%飽和硫銨 分離，產生之沈澱用離心分離機回收，溶解於5 0 mM磷 酸緩衝液（PH7 ·0) 25ml。將此溶解液裝塡於經 5 0 mM磷酸緩衝液（p Η 7 . 0 )平衡化之鋅螫合之瓊 脂糖 C L — 6 Β 柱（Amersham . Pharmacia Biotech 公司製 )2 3 m 1，用相同緩衝液十分洗淨後，用於相同緩衝液 包含0.3莫耳食鹽及0.1莫耳咪唑之溶離液洗提？夂 。將洗提液1 7 m 1用PM_ 1 0 (阿米康公司製）濃@ ，又，將濃縮液3 m 1用謝法可利爾S 2 0 〇柱（ Amersham . Pharmacia Biotech 公司製）3 0 m 1 進丫了凝膝 過濾色譜吸附分析，得到比活性3 5 0 0 0單位/蛋白= 部分精製P A。將此部分精製P A ( 1 〇單位/m 1 ) 5 0 Μ 1添加於含有5 0 mM食鹽之0 . 1莫耳三羥甲基氣 基甲烷鹽酸緩衝液（P Η 8 . 0 ) 0 . 5 m 1 ’其次’將 44 _______ —^--------A------訂------嚷 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度通用中國國家標牟{ CNS ) A4規格（210X 297公釐） 443931 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（A ) U rinastatin ( 1 7 〇 〇 單位/m 1 )及抑肽酶（1 7 〇 〇 單位/m1:拜耳公司）添加於各之試驗管，於3分鐘， 3 5 °C加溫。接著於兩試驗管加入2 5微莫耳之合成基質 3145—V 0,5ml於30分鐘，35 t：加溫。加溫 後’添加2 0 %乙酸水溶液2 m 1停止反應。將因P A之 合成基質3 1 4 5 -V之肽加水分解以螢光光度計（激發 波長3 8 0 n m，螢光波長4 6 0 n m)測定，按照下式 ’求出因Urinastatin及抑肽酶之P A活性之阻礙率。 PA活性之阻礙率=(1一阻礙劑添加群之殘存pA活性 /阻礙劑非添加群之PA活性）X100 結果表示於表6。如表6，因Urinastatin之P A活性 之阻礙率爲3 %以下，能解釋爲幾乎沒有。又報告著對血 纖維蛋白溶酶之阻礙也弱（5 0%阻礙率=+ 8 3 0單位/ ml，大西治夫等，曰藥理誌，81, 235 — 244, 1 9 8 3 )。另一方面，抑肽酶具有3 0 %以上之阻礙， 能說阻礙從血纖維蛋白溶酶原朝血纖維蛋白溶酶之變換。 又，由於上述文獻中也報告著抑肽酶之強烈阻礙血纖維蛋 白溶酶於（5 0 %阻礙率=6 . 4單位/m 1 )，故完全 阻止因血纖維蛋白溶酶原活性化因子/血纖維蛋白溶酶系 之角膜上皮損傷治癒之第一相機構之可能性非常高。因此 ，做爲角膜上皮損傷之治療劑之有效性Urinastatin比抑月太 酶更優秀是明白的。 表6 因Urinastatin及抑肽酶之人角膜上皮細胞性血纖維 蛋白溶酶原活化物活性阻礙之比較 ____45 本紙張尺度適用中國固家榡隼（CNS ) A4規格（2丨OX 297公釐） ^^^1 ^^^^1 ^^^^1 ^^^^1 ^^^^1 mB ^^^^1 TJ - 名-a (請先w讀背面之注意事項再填寫本頁) 4439 31 經濟部智恶財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明) 阻礙率

Urinastatin( 1700U/ml) 3% 抑狀酶(1700U/ml) 32% 實施例6 钍_對糖尿病老鼠角膜上皮創傷之Urinastatin之治療效果 S D系雄性老鼠（出生後7週，從日本查爾如利巴公 司購入）抵達後，進行一星期之預備飼育。於出生後8週 ’將溶解於3 mM檸檬酸緩衝液（p Η 4 . 5 )之鏈脲霉 素（S Τ Ζ ;西格瑪公司）從老鼠尾靜脈投藥（6 0 m g /kg)，又，二星期飼養讓其罹患糖尿病。於STZ注 射1 1日後藉使用普雷特斯特3 a (和光純藥公司製）測 定老鼠尿中之葡萄糖量進行糖尿病樣本作成之確認。ST Z注射二星期後，將戊巴比妥注射液（Dainabot)對腹腔 內投藥（4 0 m g/k g )後全身麻醉，又，將眼科用表 面麻醉劑鹽酸丁氧普魯卡因0 · 4%液（參天製藥公司製 )1滴點眼後，進行從輪廓部至中央之角膜上皮全層剝離 。角膜上皮全層剝離後馬上，以1 % (w/v )螢光素鈉 水溶液1滴點眼，用生理食鹽水洗淨後，於實體顯微鏡下 確認創傷部位之染色，進行錄影記錄。Urinastatin (批號 PW— 2:50〜500//g/ml_)、老鼠血淸及貝爾 雷因明0 . 3 (參天製藥公司製）之各被檢物質，從角膜 上皮全層剝離後馬上，1日6回，約2小時間隔每一眼5 # 1點眼，1群有4匹使用兩眼。又，將生理食鹽水做爲 對照。將因螢光素鈉染色之創傷部位面積之錄影記錄於角 膜上皮剝離後馬上、8小時後、2 4小時後、3 2小時後 46 tn —^^1 ^^^1 ^^^1 ^^^1 ^^^1 ^^^1 n n^i ^^^1 ^^^1 ^^^1 ^^^1 ^^^1 T.J - 为 Ί ' Μ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0X29?公釐） 4439 3 1 A7 ___B7_ 五、發明説明（/ ) 、4 8小時後、7 2小時後6回實施，用奧林帕斯video micrometer — VM— 50 (NIH image 1 ‘ 6 1 )進行 創傷部位面積之計測。 角膜上皮創傷治癒效果係將針對角膜上皮全層剝離後 馬上之創傷部位面積値（1 0 0%)之經時的測定値以比 率算出，表示於表7。從表7之結果判明Urinastatin與其 他藥劑比較角膜上皮創傷治癒效果十分優秀。 ^^1- HI - ---1 1^1 ^^^1 .^1^1 ^^^1 ^ J 癸 、v* (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 表7 針對糖尿病老鼠角膜損傷樣本之Urinastatin之治癒 效果 對照組 Urinastatin Urinastatin 老鼠血淸貝爾雷因明0.3 0小時 100% 100% 100% 100% 100% 8小時 100 土 20.7 91.5±19.2* 103.2 土 7_0 100±8,0 89_9±3.7 24小時 78.9 士 12.4 55.(^13.51^ 63.6±113 65.7 ±6.2 64.1 ±10.5 32小時 51.5±6.6 31·1±13.0** 43.3 ±12.2 51.4±12.5 48.8±12.1 48小時 13.7±4.4 5.2±5·9* 14.3±10.8 17.3 ±12.3 15.6±6.8 72小時 0 0.1 ±0.2 2.0土3.9 3.8±6.2 0.4±0,6 角膜上皮剝離後馬上（0小時）之角膜損傷部位之面積定爲10 0%。 *ρ<0.05, **ρ<〇.〇1 經濟部智慧財產局貝工消費合作社印製 實施例7 針對因紫外線眧射夕人角膜上皮細胞障礙之Urinastatin之 效果 將人角膜上皮細胞H C E C用包含1 0 %胎牛血淸之 S HEM改變培養基調整至細胞數1X10 5/ml ’將此 細胞調整液5 0 0 # 1播種於2 4孔多孔板（康寧公司製 )之各孔，於3 7°C，5%C 〇2恆溫箱內1 6〜1 7小時 培養。其後，培養上淸全部除去，將包含試料之1 〇 %胎 牛血淸一 S Η EM改變培養基5 0 0 μ 1添加於各孔’再 _；___£7_ 本紙張尺度^4用中國國家標準{ CNS ) Α4規格（2 ΐϋ7公釐） A7 B7 五、發明説明（Λ ) 於同條件2小時培養。與試料接觸培養後，全部除去此培 養上淸液，使試料幾乎無殘存於多孔板內。 於此狀態之多孔板內在2 0〜3 0 c m之距離進行5 秒鐘殺傷力最大之紫外線U V — C照射。U V - C照射後 ，包含與剛才同樣之1 0%胎牛血淸—SHEM改變培養 基5 0 0 μ 1再添加於各孔，同條件1 6〜1 7小時培養 。其後，除去各孔之培養上淸，添加剝離液（包含0 . 2 5%Tryps in (w/v)，0 .02%EDTA之 PBS) 100/zl，於 37°C，5%C O 2恆溫箱內 6 分 鐘保溫。保溫後，又，吸量管吸取充分剝離、分散生存之 上皮細胞，於此加上0 _ 1 % ( w/ν)錐蟲藍染色液1 0 0 # 1細胞染色後，馬上用血球計算盤計測生細胞數。 針對人角膜上皮細胞之紫外線障礙的試料之防禦'效果如下 所示算出。 防禦效果（％)=(試料添加群之生細胞數+試料無添加 群之生細胞數）X1 0 0 結果表示於表8 - 1、8 - 2。 表8 - 1 針對因紫外線照射之人角膜上皮細胞障礙之 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Urinastatin 之效果 試料（濃度） Urinastatin ( 〇 . 3 jU Μ ) Urinastatin ( 3 Μ) 抑肽酶（0 . 3//Μ) 抑肽酶（3“Μ) 防禦效果（％) 1 5 5±7 . CT 2 1 1±8 . 3* 8 6 · 6±13 77 . 2±5 ·: **P< 0 . 0 1 表8 - 2 針對因紫外線照射之人角膜上皮細胞障礙之 48 本紙張尺度通用中囷國家標準{ CNS ) A4規格（210Χ：297公嫠） Q 3 a 9 ο·3 44 d 4.·

7 7 A B 防禦效果（％) 140 10 1 9 4 1 0 7 五、發明説明（4 )

Urinastatin 之效果 試料（濃度）

Urinastatin ( 〇 . 3 # Μ) (2 mM) Sigma 公司 (2mM)日本汽巴加基公司 維生素E(乙酸DL—α-生育酌，2〇yM) 關東化學公司 谷胱甘肽（2 mM)西格瑪公司 9 5 半胱氨酸（2 m Μ)和光純藥公司 4 6 維生素C (抗壞血酸，2mM)日本洛克公司

從表8 - 1明顯地看出，將Urinastatin (批號6 7 B 8 ) 0 3 及3 y Μ添加於1 〇 %胎牛血淸—s Η E Μ改變培養基接觸培養之細胞’因於紫外線照射前除去培 養上淸液’雖然於紫外線照射時Urinastatin在幾乎沒有之 狀態’但與無添加及抑肽酶添加群相比明顯地生細胞數多 。其生細胞數於Urinastatin 〇 . 3 mM添加群與紫外線非 照射之細胞增殖幾乎同樣程度，理解到能幾乎完全防禦細 胞受到因紫外線產生之所有障礙。 於Urinastatin 3 A Μ添加群，生細胞數比非照射之細 胞增加。能認爲此係除針對紫外線之防禦效果外，還顯現 與實施例2所示同樣之細胞增殖作用。 另一方面，因抑肽酶之防禦效果無法見到，反而見到 增加紫外線之殺傷力之傾向。因此* Urinastatin之防禦機 構，不是由於針對被抑肽酶阻礙之既知的蛋白酶之阻礙活 性，是明白的。 又，將其效果與既存之自由基消除（抑制）劑比較之 結果，如表8 — 2所示，Urinastatin顯示非常有效之效果 49 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4此格（210 X 297公嫠} i ^^^1 In 1 ---\ y (锖先閱讀背面之注意事項存填寫本育) 經濟部智慧財產局員工消脅合作社印製 A Q A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（4) 是明顯的。 於試管內之Urinastatin之自由基消除（抑制）作用之 5 0%有效濃度爲約1 被報告著（醫學之步履），1 42，895 — 896，1987)。但，於本實施例顯 示效果之Urinastatin濃度，於接觸培養時爲〇 . 3 ， 於自由基多量發生之紫外線照射時，因於照射前除去加有 Urinastatin之培養上淸液，推定降低至數％以下之濃度。 即使假如於照射時1^1^3!3^11有5%殘存也只是〇.〇1 5 μΜ，即使如此之極微量，知曉Urinastatin顯示針對紫 外線障礙之防禦效果。 即了解到，UHnastatiri之對紫外線照射障礙之防禦效 果的作用機構，除既知之自由基消除（抑制）作用以外， 因未知作用之要因非常大。 又，Urinastatin具有溶酶體膜之安定化作用，被報告 著。人角膜上皮細胞之紫外線照射障礙之防禦作用也可認 爲係因Urinastatin之上皮細胞膜之保護效果。 爲調査實施例7之各細胞群之膜破壞，測定了紫外線 照射前後之各細胞群之培養上淸液中之乳酸脫氫酶（L D Η )量。其結果，不管對照群、Urinastatin添加群、抑肽 酶添加群都沒發現L D Η活性。 因考慮到由於D Ν Α障礙之L D Η欠損，爲了作確認 ，將各細胞群各自用Twe e η 8 0界面活性劑膜溶解， 對於其溶胞產物調査了 L D Η活性。其結果’於全部之細 胞群發現了 L D Η活性之正常値。由此’知曉於實施例7 ______50__ ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4规格（210Χ297公釐） 4439 3 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（4) 之紫外線照射量沒達到破壞細胞膜之程度。而了解到，因 Udnastatin之上皮細胞之紫外線照射障礙之防禦效果，並 非由於與Urinastatin之既知之作用機構之溶酶體膜之安定 化作用類似之細胞膜保護效果。 從以上之事認知，因Urinastatin之人角膜上皮細胞之 紫外線照射障礙之主要防禦作用機構，不是與（1 )自由 基消除（抑制）作用，（2 )蛋白酶阻礙活性，（3 )溶 酶體膜之安定化作用等3者中之任一既知之作用機構有關 ，而爲未知之物。 實施例8 針對因波長1 9 3 n m之紫外線昭射之人角膜上皮細朐瞳 礙之Urinastatin之效吳 將人角膜上皮細胞H C E C用包含1 0 %胎牛血清一 SHE Μ改變培養基調整至細胞數ixl 〇5/ml，將此 細胞調整液5 Ο Ο μ 1播種於2 4孔多孔板（康寧公司製 )之各孔，於3 7°C，5%C 〇2恆溫箱內1 6〜1 7小時 培養。培養後，培養上淸全部除去，將包含試料之1 0 % 胎牛血淸一S Η E Μ改變培養基5 0 0 #丨添加於各孔* 再於同條件2小時接觸培養。與試料接觸培養後，培養上 淸全部除去，使試料幾乎無殘存於多孔板內。 於此狀態之多孔板內在1 0〜3 0 C m之距離進行1 9 3 n m之紫外線照射。照射後，包含與剛才同樣之1 0 %胎牛血淸一 S Η E Μ改變培養基5 0 0 # L再添加於各 孔，同條件1 6〜1 7小時培養。其後，用與實施例7同 51 ， (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐} 4439 3 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（β ) 樣之方法，計測生細胞數，算出了因Urinastatin (批號6 7B8)、抑肽酶之人角膜上皮細胞之紫外線障礙之防禦 效果。結果表示於表9，能確認Urinastatin顯示濃度依存 之防禦效果。另一方，抑肽酶無顯示防禦效果。 表9 針對因波長1 9 3 n m之紫外線照射之人角膜上皮 細胞障礙之Urinastatin之效果 _ (添加鰱vM) Urinastatin ( 〇 - 3 ) Urinastatin ( 3 . Ο ) mm ¢0-3)mm (3 * 〇) 實施例9 針對藥劑件人角膜上皮細胞障礙之Urinastatin之效果 將人角膜上皮細胞H C E C於包含1 0 %胎牛血淸一 SHEM改變培養基調整至細胞數lxl05/ml，將此 細胞調整液5 0 0 v 1播種於2 4孔多孔板（康寧公司製 )之各孔，於3 7°C，5%C 〇2恆溫箱內2 4小時培養。 其後，除去培養上淸，用P B S (—)(日水製藥公司製 )5 0 0 A 1將細胞洗淨2次後，將培養基交換成無血淸 培養基5 00#1，於37°C，5%C 〇2恆溫箱內1 2小 時培養。培養後，除去培養上淸，用P B S (—)將細胞 洗淨2次後，加入包含Urinastatin (組6 7B8)之無血 淸培養基500^1於37 °C，5%c〇2恒溫箱內1 2小 時培養。培養後，除去培養上淸，用p B S (-）洗淨2 次後，加入將青光眼治療用點眼藥雷斯庫拉（主藥異丙基 烏洛普洛司通〇 · 1 2m g/m 1含有，上野製藥公司製 ；_52___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210 X 297公釐） 防禦效果（％) 1 34 · 145 9 4 8 3 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁} 44393 ? 經濟部智慧財產局員工消贵合作社印製 A7 B7 _ 五、發明説明（<\ ) )於無血淸培養基使異丙基烏洛普洛司通被稀釋爲0 . 〇 5mg/m i之液5 ΟΟ/ζ 1 *於室溫1 〇分鐘放置。放 置後，回收培養上淸，測定了細胞障礙度指標之L D Η活 性。結果表示於表1 0。能確認Urinastatin之添加濃度依 存之細胞障礙防響效果。 表1 0 針對藥劑性人角膜上皮細胞障礙之Urinastatin之 效果 Urinastatin添加濃度 (ug/m1) 0 1 1 0 10 0 對照（雷斯庫拉無添加） 實施例1 0 金+對η -庚醇誘發家兔角膜上皮損傷之Urinastatin之治癒 效果 動物是將體重2 .5〜3. Okg之日本白色家兔（ 北山兔）一星期以上預備飼育後，確認於角膜等無異常後 使用。於設定在室溫：23±3°C’溼度：50 土 20% 之飼育環境下實施實驗°將氯胺酮注射於家兔肌肉內施行 全身麻醉後，將0 · 4%鹽酸丁氧普魯卡因點眼於右眼局 部麻醉後，將浸過η -庚醇之直徑6 m m之濾紙6 0秒鐘 接觸角膜中央部，剝離角膜上皮誘發損傷。試料液之點眼 係從剝離後馬上2小時間隔6回（50// 1/1回），第 二天係從剝離2 4小時後2小時間隔6回點眼。又，以生 ___ 53_ 本紙張尺度速用中國國家士準（CNS ) A4規格（210X297公釐、 '~~~ L D Η活f生 (5 7 0 n m之吸光度，平均±標準偏差） 0.336±〇.06 0 . 3 04±0 06 0 . 065±0 · 05 0 . 0 1 8±0 . 07 0 . 014±0 . 005 --------------良--1 - n _ 丁 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4439 3 1 A7 _B7 五、發明説明（0) 理食鹽液做爲對照液。角膜上皮損傷部分之面積係於剝離 後馬上、剝離後12、24、30、36及48小時以〇 .5 %螢光素鈉液點眼將損傷部分染色’照相後測定了。 角膜上皮治癒效果表示於表11。至剝離12〜48 小時後爲止 Urinastadn 1 500U/ml 及 6〇〇〇U/ m 1之點眼與生理食鹽液點眼群比較，明顯地促進角膜損 .傷治癒。 表1 1 針對η -庚醇誘發家兔角膜上皮損傷之 Urinastatin之治癒效果 損傷面積（％) 剝離後之時間 對照 Urinastatin Urinastatin (生理食鹽液） ( 1500U/ml) (6000U/nil) 0小時 100 100 100 12小時 89.3 ±4.6 80.6±5·4* 79,3±7.3** 24小時 57.6±6.8 43.7±7.9*** 46.7±4.9** 30小時 44.5±H3.5 25.6 土 8‘5 … 29.6±6.1" 36/術 36·8±11.3 12.3±7.4*** 18.2±7.1*** 48小時 ]6.2±13.3 1.5±1.4* 3‘4±4.3* 角膜上皮剝離後馬上（0小時）之損傷部位之面積定爲10 0%。 各値表示7例之平均値土標準偏差 •^<0.05，**?<0,01，料*?<0. 0 0 1對對照 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 - - - ^ I - - II ^1— -* J. n nil— - - ^^^1 ^^^1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例1 1 針對因紫外線照射之人結膜上皮細朐障礙之Urinastatin之 效果 將人結膜上皮細胞A TCC CCL20.2用有1 0%胎牛血淸之DMEM/F 1 2培養基調整至1 X 1 〇 5 /ml ，將此細胞調整液500播種於24孔多孔板 (住友貝克萊公司製）之各孔，於3 7°C，5%C 〇2恆溫 ______J4__ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210/^7公釐） " 召439 3 經濟郜智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（A) 箱內1 6〜1 7小時培養。其後，培養上淸全部除去，將 添加試料（Urinastatin，批號6 7 B 8，終濃度1 〇 〇 μ g /m1)之有1〇%胎牛血淸之DMEM/F12培養基 5 0 〇 # 1添加於各孔，再於同條件下培養。與試料接觸 培養後，將此培養上淸全部除去。照射紫外線U V - B ( 312nm，l〇〇mJ/cm2)於此狀態之多孔板。U V - B照射後，將有1 〇 %胎牛血淸之D Μ E M/F 1 2 培養基5 0 0 y 1添加於各孔，於同條件1 6〜1 7小時 培養。其後，加上培養基1/1 0量之W S T - 8溶液（ Cell Counting Kit一8，同仁化學公司 製），於3 7°C4小時讓其反應後，藉進行因細胞內脫氫 酶生成之水溶性甲嵴之於4 5 0 n m之吸光度的測定，進 行生細胞數之測定，用與實施例7同樣之方法算出了防禦 效果。結果表示於表1 2。明顯地Urinastatin顯示針對紫 外線障礙之防禦效果。 表12 針對因紫外線照射之人結膜上皮細胞障礙之 Urinastatin 之效果 細胞增殖 防禦效果 (A4 5 0 nm 平均士SD) (%)

Urinastatin (0.3Μ) 0.556±0.015 173

Urinastatin (3^ Μ) 0.765±0·009 2 3 8 實施例1 2 針對藥劑件人結膜h皮細胞障礙之Urinastatin之效果 將用有10%胎牛血淸之DMEM/F12培養基懸 濁之人結膜上皮細胞A T CC CCL20_2(lxl〇 ______ _______ ____ 55 本紙悵尺度適用中國囤家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ~ I - - I - I -Γ —I— I I ·1 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 4439 3 1 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ----- 五、發明說明（i+) 5/m 1 ) 3 Ο Ο β 1分注於4 8孔板，於3 7t，5%C 〇2之恆溫箱內培養。4 8小時後，確認細胞已變成完全之 融合，除去上淸，用P B S ( — ) 2回洗淨後，懸濁於血 淸無添加之D M EM/F12培養基。於37°C，5%C 〇2 1 2小時保溫後，再除去上淸，用P B S ( —）2回洗 淨’加上用PBS (-）稀釋成各濃度之Urinastatin (組 67B8) 30〇μ1。於 37°C，5%C〇212 小時保 溫後，再除去上淸，用P B S ( —）2回洗淨，加上將青 光眼治療用點眼藥Timoptol (含有主藥馬來酸噻嗎心安5 0 m g/m 1，萬有製藥公司製）用P B S ( —）稀釋成 馬來酸_嗎心安濃度爲1 . 2 5 m g/m 1之液3 0 0 β 1。2 0分鐘後，再將板用P B S (-）2回洗淨，加上 3Q〇#1DMEM/F12。1 2小時後，添加WS T —8，於3 7 °C 2小時讓其反應，藉測定於4 5 0 nm之 吸光度測定了生細胞數。結果表示於表1 3。明顯地顯示 Urinastatin之濃度依存之防禦效果。 表1 3 針對藥劑性人結膜上皮細胞障礙之Urinastatin之 效果 Urinastatin添加濃度 (βg/m1) 控制組（藥劑無添加） 0 1 10 100 實施例1 3 56 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公g ) {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 細胞增殖 (A4 5 0 nm 平均土SD) 0.738±0.025 0.277±0.090 0 · 5 77±0 . 1 20 0.686±0·065 0.747±0.096 η= 6 439 3 1 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消旁合作社印製 五、發明説明（4) 渉及人結膜上皮細朐夕粘蛋白1產生之Urinastatin之效里 將人結膜上皮細胞（ATCC CCL20.2)於 有1 0 %胎牛血淸之D Μ E M/ F 1 2培養基（Gibco公 司製）懸濁，以5 0 0 0細胞/孔播種於9 6孔板，於一 晚3 7 °C，5 % C 〇 2恆溫箱內培養，讓細胞接著於板後， 交換成已加試料之培養基再兩天培養。其後，將粘蛋白1 產生量用以下之酵素免疫法測定。用7 0 %乙醇將細胞固 定後，加上每一孔2 5 0 # 1之有1 %牛血淸白蛋白之P B S，於室溫2小時放置。加上用P B S稀釋之抗粘蛋白 1老鼠抗體（法明原公司製），於室溫2小時讓其反應後 ，用P B S 3回洗淨。加上用P B S稀釋之過氧化酶標識 抗老鼠 I g G 抗體（SantaCruz Biotechnology 公司製）’ 於室溫2小時讓其反應後，用P B S 4回洗淨。加上過氧 化酶之基質液（有0 _ 0 1 2%過氧化氫、1 . 6mg/ m 1鄰苯二胺之0 . 1 Μ磷酸緩衝液，p Η 6 . 2 ) 2 0 0 β 1，於室溫2 0分鐘讓其反應，加入4 . 5 Ν硫酸5 0 μ 1停止反應。藉使用多孔板讀取計之測定吸光度（4 9 0 nm—6 6 0 nm)以測定粘蛋白1產生量。結果表 示於表1 4。將於未含有Udnastatin之培養基培養之對照 之吸光度的平均値以1 〇 〇 %表示。明顯地Urinastatin顯 示濃度依存之粘蛋白1產生促進效果。 表14 涉及人結膜上皮細胞之粘蛋白1產生之 Urinastatin 之效果 試料（添加濃度Mg/m1) 粘蛋白1產生量（％土SE) 無添加（0) 100 57 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210 X 297公釐） ^439 3 1 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（+) Urinastatin (50) 111±6‘〇 Urinastatin (200) 123±6·8* η= 5 ψρ < 0 . 0 5 實施例1 4 針對於考鼠強制黽瞼.送」風乾眼症樣本之角結膜h皮障礙之 Urinastatin 之效果 使用出生6週之S p r a g u e —D aw 1 e y系雄 性老鼠。又’預先確認眼部、眼瞼無異常。將Urinastatin 溶液（將批號6 7 B 8用生理食鹽液稀釋成5 0 0 μ g/ m 1之液）1回5 // 1，1日6回，1星期點眼於1 0匹 老鼠之左眼β將生理食鹽液做爲對照同樣地點眼於右眼。 於最終點眼後2小時後用以下之方法，將角結膜乾燥，誘 發角結膜上皮障礙，評價針對障礙之Urinastatin之效果。 將上述已點眼處置之老鼠（1 〇匹）於戊巴比妥4 〇mg /k g (腹腔內注射）麻醉下，將眼強制地充分開瞼，從 眼正面6 c m之距離進行1 5分鐘以吹風機之送風，藉將 風接觸前眼部全體讓淚液蒸發，乾燥角結膜，誘發角結膜 上皮障礙。障礙誘發後，將1 %孟加拉紅溶液5 μ i點眼 ，用生理食鹽液十分洗淨，將角結膜之粘蛋白欠損部染色 後，以過量之戊巴比妥注射液靜脈注射讓其安樂死後，包 含球結膜部小心地不傷及下摘出眼球，馬上觀察沒被以孟 加拉紅染色之粘蛋白覆蓋之障礙部分。此時，孟加拉紅陽 性之量按照乾眼症診斷基準（乾眼症硏究會，19 9 5 ) ，將關於球結膜之鼻側、耳側及角膜染色之程度以各自0 〜3點，合計9點點數化。數値越高角結膜上皮障礙越嚴 ____ 58________ 本紙張只^度適用f國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297^釐> ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 443931 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 五、發明説明（4 ) 重。此點數化全數由同一檢查者進行’又以無法區別左右 兩眼的方式作蒙面評價。 結果表不於表 1 5。5 0 0 1 Urinastatin 點眼群與生理食鹽液點眼群比較’因乾燥之角結膜上皮障 礙有意義地被抑制著（P < 〇 . 〇 5 )。因此明顯的， Urinastatin能抑制乾眼症中角結膜之粘蛋白被覆障礙。 表1 5 針對因乾眼症之角結膜上皮障礙之Urinastatin之 效果 於眼球角結膜之判定點數（匹數） 點數 Urinastatin 對照 9 0 0 8 0 1 7 0 0 6 0 2 5 1 0 4 0 2 3 2 1 2 1 3 1 5 1 0 1 0 平均點數 1 . 8 ± 1 . 5 3 . 8±2 . 3 製劑例1 Urinastatin (比活性 4000 〜2000 unit/mg蛋白）50mg 氯丁醇 1 0m g 氯化鈉 2 4 Omg 磷酸氫二鈉 2 4 〇m g 磷酸二氫鈉 2 0 Omg 將上述各成分溶解於減菌蒸餾水1 0 0 m 1後，減菌 過濾’各1 0 m 1充塡於已減菌之眼科用容器’做爲點眼 劑。 ---- 59 ____ 本紙張尺度通用中國國家榡準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐) ---I tn —Ί—t - - - * H n^i m Hi、一seJ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4439 3 1 A7 B7________ 五、發明説明（j ) 【產業上之利用可能性】 本發明之角膜上皮障礙症適用劑，做爲包含人之哺乳 動物之角膜上皮障礙症，即角膜泡疹、細菌性角膜潰瘍、 神經麻痒性角膜炎、糖尿病性角膜症' 起因於物理的、化 學的障礙之角膜上皮障礙症之預防劑及治療劑是有用的。 又，本發明之紫外線角結膜上皮障礙症適用劑’做爲 因紫外線之角結膜上皮障礙症之預防劑及治療劑是有用的 0 又，本發明之角膜切開術施行後角膜上皮障礙症適用 劑，做爲爲了適用於角膜切開術施行後之角膜上皮障礙症 之角膜切開術施行後角膜上皮障礙症之預防劑及治療劑是 有用的。 又，本發明之藥劑性角結膜上皮障礙症治療劑，讓具 有做爲副作用存在之角結膜上皮障礙作用之眼科用藥劑之 該副作用消失，做爲讓該眼科用藥劑有效適用之藥劑性角 結膜上皮障礙症之治療劑是有用的。 又，本發明之乾眼症適用劑，做爲乾眼症之預防劑及 治療劑是有用的。 ^ϋ· J^i 1^1 -- . - i I—-Rn^i nn n^i ^14 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ______ _60 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（2[0 X297公釐）

Claims (1)

1. ^439 3 1 , βΙ [ ! C8 ' D8 I - - , ' -, 六、申請專利範圍f:、Λ.'η ' ! ： , '" ' l . 一種用’以贯傲及:/¾治療角膜上皮障礙症之醫藥 組成物，其特徵在於，係含有0_05〜10000 // g/ml Urinastatin做爲有效成份。 2. —種用以預防及/或治療因紫外線所造成的角結 膜上皮障礙症之醫藥組成物，其特徵在於，係含有 0.05〜10000 以 g/ml Urinastatin 做爲有效成份。 3. —種用以預防及/或治療角膜切開術施行後的角 膜上皮障礙症之醫藥組成物，其特徵在於，係含有 0·05〜10000 μ g/ml Urinastatin 做爲有效成份。 4·一種用以治療起因於使用眼科用藥劑所造成的角 結膜上皮障礙症之醫藥組成物，其特徵在於，係含有 0_05〜10000 /z g/ml Urinastatin 做爲有效成份。 5.—種用以預防及/或治療乾眼症之醫藥組成物’ 其特徵在於，係含有0.05〜1000〇Mg/ml Urinastatin做爲有 效成份。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 H 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^439 3 1 , βΙ [ ! C8 ' D8 I - - , ' -, 六、申請專利範圍f:、Λ.'η ' ! ： , '" ' l . 一種用’以贯傲及:/¾治療角膜上皮障礙症之醫藥 組成物，其特徵在於，係含有0_05〜10000 // g/ml Urinastatin做爲有效成份。 2. —種用以預防及/或治療因紫外線所造成的角結 膜上皮障礙症之醫藥組成物，其特徵在於，係含有 0.05〜10000 以 g/ml Urinastatin 做爲有效成份。 3. —種用以預防及/或治療角膜切開術施行後的角 膜上皮障礙症之醫藥組成物，其特徵在於，係含有 0·05〜10000 μ g/ml Urinastatin 做爲有效成份。 4·一種用以治療起因於使用眼科用藥劑所造成的角 結膜上皮障礙症之醫藥組成物，其特徵在於，係含有 0_05〜10000 /z g/ml Urinastatin 做爲有效成份。 5.—種用以預防及/或治療乾眼症之醫藥組成物’ 其特徵在於，係含有0.05〜1000〇Mg/ml Urinastatin做爲有 效成份。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 H 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）