HUT65493A - Vaccine compositions - Google Patents

Vaccine compositions Download PDF

Info

Publication number
HUT65493A
HUT65493A HU9203480A HU348092A HUT65493A HU T65493 A HUT65493 A HU T65493A HU 9203480 A HU9203480 A HU 9203480A HU 348092 A HU348092 A HU 348092A HU T65493 A HUT65493 A HU T65493A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
composition
amino acid
adjuvant
polypeptide
homogeneous
Prior art date
Application number
HU9203480A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9203480D0 (en
Inventor
Christopher L Penny
Original Assignee
North American Vaccine Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by North American Vaccine Inc filed Critical North American Vaccine Inc
Publication of HU9203480D0 publication Critical patent/HU9203480D0/hu
Publication of HUT65493A publication Critical patent/HUT65493A/hu

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011Details
    • C12N2730/10011Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011Details
    • C12N2740/10011Retroviridae
    • C12N2740/16011Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Oscillators With Electromechanical Resonators (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

A jelen találmány megnövelt immunogenitású vakcina készítményekkel kapcsolatos. Pontosabban, a találmány szerinti készítmények egy immunogén polipeptidet tartalmaznak egy hosszú szénláncú alkilvegyülettel együtt, mely utóbbi immunadjuvánsként szolgál.
Jól ismert, hogy a vakcinák fontos szerepet játszanak a betegségek megelőzésében. A vakcinák úgy működnek, hogy a gazdaállatot az immunrendszer aktiválására képes idegen anyaggal hozza kölcsönhatásba és az anyaggal szemben immunitást nyújt a gazdaszervezetnek anélkül, hogy betegség veszélyének tenné ki. Jelenleg kb. 20 vakcinát fejlesztettek ki kereskedelmi használatra. A legtöbb vakcinát betegséget okozó organizmus vagy ennek egy részének detoxifikálásával készítik számos eljárás valamelyikével, pl. az organizmus egy specifikus nemtoxikus részének izolálásával vagy egy toxikus rész kémiai úton,hővel vagy genetikai úton való attenuálásával (legyengítésével) . A detoxif ikálási eljárás gyakran toxikus melléktermékekkel szennyezett, bizonytalan összetételű heterogén termékeket eredményez. Ennek következtében a nem tiszta detoxifikált vakcinák immunogén anyagként való alkalmazás hatékonysága csökkenhet. Ráadásul kellemetlen, esetenként káros mellékhatásokat eredményezhetnek. Egy jól ismert példa az intakt
B. pertussis baktérium vakcinaként való alkalmazása a gyermekkori szamárköhögés esetén. Napjainkban az USA-ban használatos vakcina gyakorlatilag azonos az 1940-es években kidolgozott vakcinával. A mellékhatások változóak, az enyhe reakcióktól egészen a bénulásig, állandósult agykárosodásig vagy a halálig terjedhetnek.
·· · * I • · ··· · · · • · · · ··· · ··· «·a
- 3 A rekombináns technológia és más bonyolult kémiai technológiák elősegítették a tisztább, és így biztonságosabb vakcinák kifejlesztését. A megnövekedett tisztaságuk következtében azonban, ami gyakran a természetes immunstimulánsok eltávolítását jelenti, ezen új vakcinák gyakran gyenge vagy rossz immunogének, különösen, ha ezeket a megelőző vakcinákkal hasonlítjuk össze. Ennek a hatásnak az ellensúlyozása miatt a vakcinákat immunadjuvánsokkal együtt alkalmazzák jobb antitestképződés kiváltása céljából.
Jelenleg a kereskedelemben kapható vakcinák csak alumínium és kálciumsókat alkalmaznak adjuvánsként. Az alumínium és kálciumsók azonban nem jó immunadjuvánsok. A kálciumsók alkalmazhatóságát korlátozottnak találták) az aluminiumsók átmeneti vagy krónikus helyi granulómát okozhatnak az oltás helyén. L. H. Collier, Láncét, 1364-1367 (1970) szerint a tetanusz toxin vakcinával szembeni reakciók bekövetkezése és súlyossága az antigén tisztaságától és az alumínium adjuváns jelenlététől függ. Az alumínium adjuvánsok előállítása nem mindig reprodukálható. Továbbá az alumínium önmaga IgE antitestek termelődését stimulálhatja, melyek az azonnali túlérzékenységi reakciók bekövetkezéséért felelősek. Ezt a jelenséget T. Matuhasi és mtsai, J. Infectious Disease, 146, 290 (1982) műben írták le.
Az elmúlt években az érdeklődés a szerves vegyületek adjuvánsokként való használatára irányult. Csak néhány szerves vegyület működik a kereskedelemben elfogadott szervetlen sókhoz hasonló módon, azaz lassú felszívódást biztosító anyagként vagy antigén (vakcina) depóként, amiből az antigén az oltás helyén viszonylag hosszú időn keresztül szabadul fel. Ilyen szerves ve4
·. «... g... ....
• · ·· ··· ··· • · * • · · ··· ··· gyületek lehetnek például szerves felületaktív anyagok és emulzióképzők, mint pl. a Pluronics és Tetronics, melyek a BASF Corporation által gyártott nem ionos polioxietilén és polioxipropilén blokk kopolimerek. Az adjuvánsok ilyen lassú kibocsátást biztosító mechanizmusa már régen elfogadott emberi felhasználásra, mivel ez csökkenti az immunrendszer túlzott aktiválásának lehetőségét. Az immunrendszer túlaktiválása autoimmun válaszhoz vezethet, ami pl. egy erős immunstimuláns, pl. a Freund adjuváns használatakor következne be. Ezért a lassú felszívódás mechanizmusa előnyös.
Míg a szerves adjuvánsok nagy részéről kimutatták, hogy ezek erős, jó immunstimulánsok, az ilyen nagyon aktív adjuvánsok általában toxikusak, így emberi használatra nem alkalmasak. Ismert szerves adjuvánsok pl. a Freund komplett adjuváns és a muramii- dipeptid, melyek hatékony immunstimulánsok, de mindkét vegyület használata csak az állatokkal kapcsolatos kutatásra korlátozódik toxicitási megfontolások miatt. Számos, az aluminiumsókat utánozó szerves vegyület sokkal toxikusabb, mint az aluminiumsók maguk. Például a hosszú láncú alkilaminokról leírták (D. Gall in Immunology, 11, 369386, 1966 műben), hogy olyan toxikus vegyületek, melyek a sejtmembrán szerkezetét károsítják.
Ismert, hogy diverz összetételű nagy molekulatömegű heterogén antigének komplexet képeznek oldhatatlan szerves molekulákkal, és ez utóbbiak adjuvánsként működnek. Ez egy nem specifikus kötődés abban a tekintetben, hogyha az antigén elég nagy és elég diverz, ez bármilyen oldhatatlan szerves anyaghoz kötődni fog függetlenül a töltésétől és polaritásától. A .: ···:·'·· χ··· :··.
• · 999 ·· · «·« * · · · 9 ··· · ··· ··« ··· szerves adjuváns és a biomolekula közötti komplex képződés számos gyenge, nem kovalens erők, pl. hidrofób kölcsönhatások és hidrogén kötések révén jön létre.
Ez a jelenség megtalálható az Overell által közzétett
425 932 számú szabadalmi leírásban és Moloney és mtsai
258 0294 számú USA-beli szabadalmi leírásban. Overell arról számolt be, hogy az alkiltirozin adjuvánsként működik allergia deszenzitizációs terápia során,mikor heterogén, többkomponensű, nagy molekulatömegű allergénekkel, pl. rozs, fű és pollen extraktummal alkot komplexet. Moloney és mtsai az aminosavak hosszú láncú alkohol észtereinek adjuvánsként való alkalmazásával foglalkozik heterogén, többkomponensű, nagy molekulatomegű tetanusz toxoiddal és I, II. és III. típusú poliomyelitis vírussal komplexet alkotva.
Ezért szükséges olyan nemtoxikus vakcina adjuváns készítmények kifejlesztése, melyek megnövekedett immunogenitásuak és melyekben sem az immunogén, sem az adjuváns nem toxikus.
A jelen találmány olyan vakcina készítményekre vonatkozik, melyek homogén immunogén polipeptidből és nemtoxikus hosszú láncú alkil immunadjuvánsokból állnak. így a jelen találmány egyik vonatkozása szerint egy vakcina készítményt szolgáltatunk, mely egy homogén immunogén polipeptidet és immunadjuvánsként nemtoxikus hosszú láncú alkilvegyületet tartalmaz, ez utóbbit olyan mennyiségben, mely hatékonyan erősíti a polipeptid immunogenitását.
A találmány másik vonatkozásaként immunválasz kiváltására adunk eljárást, mely során melegvérű állatoknak, beleértve az embert is, a találmány szerinti vakcinakészítmény hatékony
mennyiségét adjuk be.
A jelen találmány szerint meglepő módon azt figyeljük meg, hogy a nem toxikus, pozitívan töltött hosszú láncú alkilvegyületek, főleg az aminosavak vagy peptidek észterei, képesek szelektíven homogén polipeptidekhez kötődni.
Ez egy specifikus jelenség, mely függ az oldhatatlan észterben jelenlévő aminosavak és a homogén polipeptid típusától. Ez a meglepő specificitás jellemző a találmányban alkalmazott homogén polipeptidekre, és ezt az ugyanolyan molekulatömegű poliszacharidok nem mutatják. A jelen találmány kapcsán azt is megfigyeljük, hogyha a standard alumínium-tartalmú adjuvánst felcseréljük egy nem toxikus hosszú láncú alkilvegyülettel, különösen egy hosszú láncú alkil aminosavészterrel, a termelődött antitest izotípusát tekintve egy vagy több hatás jelentkezhet. Az egyik hatás az IgE termelődéssel kapcsolatos. Főleg, amikor a találmány szerinti hosszú láncú alkil adjuváns készítményt alkalmazzuk, az IgE antitest szintje nem növekszik jelentősen összehasonlítva az alumínium-tartalmú adjuvánsok alkalmazásakor megfigyelt megnövekedett IgE szinttel és ekkor gyakorlatilag olyan szint figyelhető meg, mintha semmilyen adjuvánst nem használnánk. Az IgE antitestek felelősek az azonnali túlérzékenységi reakciók közvetítéséért. Anafilaxiás reakciókról, sőt halálos esetről is beszámoltak az alumínium adjuvánst tartalmazó vakcinákkal történő immunizálás hatására bekövetkező IgE termelés eredményeképpen (lásd Matuhasi és mtsai fent említett művét). Ezért a találmány szerinti hosszú láncú alkiladjuváns készítményeknél megfigyelt alacsony IgE képződés előnyös terápiás hatással bír.
• · · · ··« «««
- 7 A másik hatás az, hogy a találmány szerinti készítmények hosszú láncú alkil adjuvánsainak alkalmazásakor mind az IgG2a mind az IgGl antitest szintje növekszik és az IgG2a antitest aránya az IgGl-hez képest nagyobb az alumínium adjuvánsoknál megfigyelhető aránynál. Ez az aránynövekedés szintén előnyös hatású, mivel az IgG2a antitest fontos, hiszen ez a leghatékonyabb egér antitest a komplementaktiváciő és az antitest-függő sejt citotoxicitási mechanizmus tekintetében a tumorokkal és a parazitákkal szembeni védelemben.
Az itt használt homogén kifejezés a találmány szerinti vakcina-készítményekben alkalmazott polipeptidek meghatározására olyan immunogén polipeptid fajtákat jelent, melyek alapvetően egy patogén ágens kémiai szintézissel vagy biológiai szintézissel előállított egy vagy több epitópját tartalmazzák. Abban az esetben, ha egy vagy több epitóp van jelen, akkor a homogén immunogén polipeptid az immundomináns epitópot vagy epitópokat tartalmazza. Kémiai szintézist általában akkor alkalmazunk, ha egy epitóp van jelen, míg egynél több epitóp esetén kémiai vagy biológiai szintézist használhatunk. A homogén polipeptid tartalmazhatja a patogén ágens más részeit, melyek nem toxikusak, és melyek nem befolyásolják kedvezőtlenül a homogén polipeptid immunogenitását.
Előnyösen a nem toxikus adjuváns egy aminosav vagy peptid pozitívan töltött észtere, különösen egy 14-20 szénatomot és egy aminosavat, dipeptidet vagy tripeptidet tartalmazó alkil alkohol észtere.
A találmány szerinti készítményekben alkalmazott homogén immunogén polipeptid nem toxikus és képes a gazdaszervezetben • · · • · «
- 8 immunválasz kiváltására. Az immunogén polipeptid lényegében a következő patogén ágensekből származó egy vagy több epitópját tartalmazza: az AIDS-ért felelős patogén ágens, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, tetanusz, polio, pertussis (limfocitózist elősegítő faktor (LPF) toxin), herpes simplex, légúti szincitium vírus, kanyaró, influenza vírus, veszettség vírus, lassa-láz, rotavírus, adenovírus, rinovírus, száj- és körömfájás vírusa, borjú- és macskaleukémia vírus, marhavész vírus, dengue-láz vírus, kullancs általi agyvelőgyulladás, malária és parainfluenza vírus.
Számos esetben kívánatos, hogy az immunogén polipeptid természetben előforduló aminosav szekvenciáját úgy módosítsuk, hogy a homogén polipeptidet még hasznosabbá tegyük vakcina-készítményekhez, eközben immunogenikus tulajdonságait ne változtassuk meg. Ilyen változtatások magukba foglalják pl. az aminosav oldalláncok módosítását a poszt-transzlációs módosítások mintájára vagy az immunogén kémiai tulajdonságainak megváltoztatását. A polipeptid módosítása az immunogén in vivő élettartamának növelése céljából szintén lehetséges. Továbbá, a polipeptid amino- vagy karboxil végén cisztein származék kialakítása szintén lehetséges annak érdekében, hogy elősegítsük a polipeptid fehérjéhez való kapcsolását.
Ezen változtatások vagy módosítások lehetnek inzerciók, deléciók és szubsztitúciók konzervatív vagy nem konzervatív módon. Ilyen változtatások magukba foglalják a fehérje szintézishez használt, a természetben előforduló aminosavak kombinációit, pl. gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; phe, tyr; ala, ser; ala thr; ala, val; ala, pro; ala, glu; leu, • ·
- 9 gin; gly, phe; ile, ser és ile, met.
Immunogén homogén polipeptidek bármely alkalmas módszerrel előállíthatók. így a polipeptid előállítható rekombináns vagy szintetikus eljárásokkal vagy ezek kombinálásával. Ismert rekombináns technikákat mutat be T. Maniatis és mtsai a Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982) művükben. Pl. a polipeptidet kódoló génnel történő transzfekcióval tervezhetünk egy olyan sejtet, mely a kívánt polipeptidet túlexpresszálja.
Alkalmas kémiai szintézis eljárások lehetnek a szilárd vagy folyadék fázisú peptid szintézis vagy az enzimatikus szintézis. Megfelelő eljárásokat ismertetnek a következő művekben: Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, 1984, M. Bodanszky; Solid Phase Peptide Synthesis, 2. kiadás, 1984, Pierce Chemical Company, John Morrow Stuart és Janis Dillaha Young.
A polipeptid lehet rövidebb, hosszabb vagy más ismert eljárásokkal módosított, továbbá a polipeptid lehet lineáris vagy ciklikus.
Az immunogén polipeptid tisztítását végezhetjük bármely általánosan használt eljárással. Alkalmazhatunk bármilyen kémiai vagy bioszintetikus módszert, mely másfajta biomolekulákat és nemkívánatos anyagokat megsemmisíti vagy eltávolítja és a kívánt immunogén polipeptideket változatlanul hagyja. Előnyösen az immunogén polipeptidet kromatográfiás technikákkal tisztítjuk. Főleg a méret szerinti, az ioncserés, az affinitás-kromatográfiás technikák, leginkább pedig a nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia vagy ezek kombinációi * · · • · • · ·
- 10 alkalmazhatók. Az immunogén polipeptid tisztaságát gélelektroforézissel igazolhatjuk.
Az immunogén polipeptid méretének olyannak kell lenni, hogy a gazdaszervezet felismerje és idegenként azonosítsa. Egy immunogén molekulatömege általában legalább 10 000 dalton. Ha a polipeptid kisebb annál a kritikus méretnél, hogy az adott gazdaszervezet felismerje, olyan hordozóhoz kell kapcsolni, mely a polipeptid-hordozó konjugátumnak immunogenitást biztosít. Előnyös hordozók a fehérjék lehetnek. Állatok esetén előnyös hordozók lehetnek a borjuszérum albumin (BSA) és a kulcslyuk tengeri csiga hemociancin (KLH). Humán alkalmazás esetén alkalmas hordozók lehetnek a következők: tetanusz toxoid, diftéria toxoid, nem celluláris pertussis vakcina (LPF), keresztreagáló anyagok (CRM-ek), mely antigenitás szempontjából hasonlóak a bakteriális toxinokhoz, de mutáció révén nem toxikusak, előnyösen CRM197, melyet Pappenheimer és mtsai (An Immunological Study of the Diphtheria Toxin Molecule, Immunochemistry 9, 891-906 (1972)) szerint nyerünk, és más bakteriális fehérjehordozók, pl. meningococcus külső membrán fehérje. Előnyösen a hordozó fehérje maga is immunogén.
A polipeptidet a tudományterületen ismert bármely alkalmas eljárással hordozókhoz kapcsolhatjuk. Miközben a szimmetrikus kapcsolók pl. alkil-aldehid (pl. glutáraldehid) vagy alkil-diimidát (pl. dimetil-parafaimidát) alkalmazása a találmány területébe tartozik, előnyös a heterobifunkcionális kapcsolók használata. Ez utóbbi biztosítja, hogy a polipeptid hordozóhoz való kötődése meghatározott és reprodukálható módon menjen végbe a mellékreakciókat pl. a hordozó molekulák
• · ·
- 11 keresztkötését megakadályozva, ami szennyezett heterogén végterméket eredményezne. Heterobifunkcionális kapcsolók lehetnek pl. a következők N-szukcinimidil-3-(2-piridil-ditio)-propionát,
J. Carlsson és mtsai, BioChem. J. 173, 723-737 (1978) és szulfoszukcinimidil-4-(p-maleimido-fenil)-butirát, J. D. Bangs és mtsai, J. Cell Biology 103, 255-263 (1986). Előnyös a szulf oszukcinimidil-4- (N-maleimido-metil) -ciklohexán-1karboxilát, S. Hashida és mtsai, J. Applied Biochem 6, 56-63 (1984) .
Alkalmas homogén polipeptidek lehetnek azok, melyek nagymértékben egy hepatitis vírus egyik felszíni antigénjével azonos aminosavszekvenciát tartalmazzák, mint pl. a homogén polipeptid, mely a hepatitis B felszíni antigénnel gyakorlatilag azonos aminosavszekvenciából áll. A másik példa egy olyan homogén polipeptid, amely a hepatitis egyik felszíni antigénjének egy vagy több epitópját tartalmazza. További példák: egy herpes simplex vírus gD alegységének felszíni antigénjével nagymértékben azonos aminosavszekvenciájú homogén polipeptid; egy humán immun deficiencia vírus gpl20 részének gyakorlatilag egy vagy több epitópját tartalmazó homogén polipeptid; egy humán immun deficiencia vírus gp41 részének gyakorlatilag egy vagy több epitópjából álló homogén polipeptid vagy a limfocitózist elősegítő faktor (LPF) aminosav szekvenciájával nagymértékben azonos homogén polipeptid.
A hosszú láncú alkil adjuvánsok vagy a gazdaszervezetben ennek metabolizmusából származó bármely vegyület nem lehet toxikus. Jól ismert, hogy a hosszú láncú zsíralkoholok természetben előforduló nem toxikus anyagok. Pl. az
- 12 oktadekanolt emberben teljesen nem toxikusnak találták, amit az orális LD50 érték jelez, mely nagyobb, mint 15 g/kg (Gosselin's Clinical Toxicology of Commercial Products 4. kiadás, 1976). Az oktadecil-tirozin állatokban nem toxikus és a természetben előforduló aminosavak többsége szintén nem toxikus
C. L. Penney és mtsai, Vaccine, 4, 99-10, 1986). Ezért várható, hogy az oktadecil- tirozin és más alkoholok és aminosavak észterei emberben nem fejtenek ki toxicitást.
Az adjuvánsoknak kb. 150 Mm-tői 1 mm (18-100 szemcseméret) előnyösen kb. 250 μια (60 szemcseméret) méretű mikrorészecskék képzésére kell képesnek lenni vizes közegben, ezzel egységes konzisztenciájú szuszpenziót kialakítani. Továbbá az adjuváns mikrorészecskéinek az immunogén adszorpcióját kell lehetővé tenni és ezáltal a gazdaszervezetben az immunogén lassú kibocsátást lehetővé tenni.
A jelen találmány egyik előnyben részesített megvalósításában az adjuváns az (I) általános képletü vegyület. A képletben C jelentése hidrogénatom, egy aminosavgyök vagy maximálisan 10 aminosavból álló (azaz maximálisan dekapeptidből származó) peptidgyök; D jelentése hidrogénatom vagy egy gyógyászatilag elfogadható sav, pl. hidrogén-klorid, hidrogén-bromid, foszforsav, kénsav, borkősav, tejsav vagy ecetsav; E jelentése 4-hidroxi-benzil-, benzil-, 4hidroxi-fenil-, fenil-, 4-amino-butil-, izopropil-, metilcsoport, hidrogénatom vagy más, természetben előforduló aminosav származék; A jelentése (CH2) n“csoPort, oxigénatom vagy Cl^Ocsoport és B jelentése (CH2)n-csoport vagy oxigénatom, ahol n jelentése 0-4, azzal a kikötéssel, hogy A és B nem lehet • · · · ♦ ·· · ··· • · · · · • · · · ··· ··· · · ·
- 13 egyidejűleg (CH2)n-csoport vagy oxigénatom, R jelentése 12-20 szénatomot tartalmazó alkilcsoport.
Előnyösen C jelentése lehet hidrogénatom, egy aminosav-, dipeptid- vagy egy tripeptidgyök. Ha C egy aminosavgyök, az adjuváns aminosavgyök szekvenciáját az alábbiak közül választhatjuk: tirozil-glicin-, glicil-glicin-, glicil-tirozinvagy fenil-alanil-glicin-gyök. Ha C egy dipeptidgyök, az adjuváns aminosav szekvenciája pl. lehet tirozil-glicil-glicin- vagy tirozil-alanil-glicin-gyök. Ha az aminosavszármazék királis vegyület, a D-enantiomert, az L-enantiomert vagy ezek keverékét alkalmazhatjuk. Különösen előnyös, ha az adjuváns a-aminosavat tartalmaz.
Különösen előnyös, ha E jelentése 4-hidroxi-benzil-, benzil-, 4-hidroxi-fenil-csoport és hidrogénatom. Legelőnyösebben E egy 4-hidroxi-benzil-csoport.
Ha A egy CH20-csoport és B egy (CH2)n-csoport, a vegyület Namino-acil-etanol-amin-O-sztearát. Ha A egy CH2O- és B egy oxigénatom, a kapott vegyületek karbonátok.
Még előnyösebben az adjuváns egy aminosavészter hidroklorid, ahol C jelentése hidrogénatom, D jelentése hidrogén-klorid, A egy (CH2)n-csoport, ahol n 0-4-ig terjed és B jelentése oxigénatom.
Legelőnyösebben az adjuváns egy oktadecil-tirozinhidroklorid, ahol C jelentése hidrogénatom, D jelentése hidrogénklorid, E jelentése 4-hidroxi-benzil-csoport és R jelentése oktadecil-csoport, A egy (CH2)n-csoport, ahol n=O és B jelentése oxigénatom.
Általában ha C jelentése nem hidrogénatom, az adjuváns váza • · · · · · • · · · · ··· ··· • · · · · ··· · ··· ··· ···
- 14 gyakorlatilag peptid kötésekből áll, azaz az egyik aminosav származék karboxil vége közvetlenül a szomszédos aminosav aminocsoportjához kapcsolódik fejtől farkig módon. Esetleg a peptid kötést egy tioamid kötés helyettesítheti.
Az adjuváns bármely alkalmas eljárással előállítható, pl. az adjuváns aminosav-észter számos ismert módszer bármelyikével szintetizálható. Ezt M. Bodanszky és mtsai Peptid Synthesis 2. kiadás, Wiley, New York, 1976, és R. W. Roeske, Peptides (N. Y.) 3, 102 (1981) műben ismertetik. Egy különösen előnyös eljárás a C. Penney és mtsai, J. Organic Chemistry 50, 1457-1459 (1985) által leírt, a metán-szulfonsawal katalizált észterezési eljárás.
Ha az adjuváns egy di- vagy tripeptid, a peptidkötés a fent említett Peptides Syhtnesis műben ismertetett eljárások bármelyikével kialakítható. Ráadásul a peptidkötések kialakíthatók a szilárd- vagy folyadékfázisú eljárások után is. Számos eljárás és reagens létezik, melyek hasznosak amid-, tioamid- vagy tioészterkötések kialakítására.
Az adjuváns előállítása során kívánatos lehet a reaktív funkcionális csoportok átmeneti védelme. Az aminok például védhetők uretán-típusú csoportokkal, az alkoholok t-butil- vagy benzalcsoportokkal, a savak pedig észtercsoportokkal. A védésre illetve a védőcsoport eltávolítására alkalmas körülményeket és eljárásokat ismertetnek a fent említett Peptide Synthesis műben.
Az adjuváns tisztítása az előbbiekben ismertett technikák bármelyikével megvalósítható. Az előnyben részesített tisztítási eljárás a szilikagél kromatográfia különösen a W.
Clark Still és mtsai J. Organic Chemistry, 43, 2923-2925 (1978) műben ismertetett gyors kromatográfiás eljárás. Más kromatográfiás módszerek, a HPLC-t is beleértve, is alkalmazhatók azonban az adjuváns tisztítására. Az adjuváns tisztítására kristályosítás is alkalmazható. Néhány esetben tisztítás nem szükséges, mivel a szintézissel közvetlenül nyert termék analitikai tisztaságú.
A találmány szerinti vakcina-készítményeket az adjuváns és a homogén immunogén polipeptid fizikai keverésével állítjuk elő megfelelő steril körülmények között az adjuváns készítmények előállítására ismert eljárásainak megfelelően. Amint az a fentiekből nyilvánvaló, az immunogén polipeptidet magát vagy annak egy hordozóhoz kötött formáját keverjük az adjuvánshoz.
Az adjuváns és a homogén polipeptid immunogén vagy ez utóbbi hordozóhoz kapcsolt formájának azon mennyisége, ami humánban immunválasz kiváltására képes, egymással kapcsolt, de a hagyományos vakcináknál alkalmazott általános határok közé esik. Például növekvő mennyiségű adjuváns használata egyre kevesebb mennyiségű immunogén alkalmazását indokolja és fordítva. Az adjuváns előnyös mennyisége a készítményben 0,01-5 mg/ml, pl. 0,05 mg/ml-től 3 mg/ml, előnyösen 0,5-től 1 mg/ml. Az immunogén előnyös mennyisége a készítményben kb. 1-től 100 Mg/ml, előnyösen kb. 5-től 40 m9/m1· A dózis függ a vakcinát kapó gazdaszervezettől és más faktoroktól is, pl. a gazdaszervezet méretétől, tömegétől és korától.
A találmány szerinti vakcina-készítmény kiszerelhető más gyógyászati polipeptid készítményeknél használt eljárásokkal azonos módon. így az adjuváns és az immunogén liofilizált formában tárolható, és a beadást megelőzően egy fizológiásan • · * ♦ · · • · «·· ·«· ··· ♦ · · · · ··· · · · · ··· ···
- 16 elfogadható vivőanyagban felszuszpendálható. Az adjuváns és az immunogén esetleg tárolható a vivőanyagban is. Előnyös vivőanyagok lehetnek steril oldatok, különösen steril puffer oldatok, pl. foszfáttal pufferőit sóoldat. Az adjuváns és az immunogén vivőanyagban való keveréséhez bármely eljárás megfelelő, mely a keverék immunreaktivitását nem befolyásolja.
A vivőanyag tartalmazhat tartósítószereket vagy más ismert adalékanyagokat, melyeket a stabilitás javítása, vagy a keverék hatékonyságának növelése céljából használunk. Alkalmas tartósítószer pl. a timerozál.
A találmány szerinti vakcina egyszeri dózisának térfogata változhat, de a hagyományos vakcináknál alkalmazott általános határok közé esik. Egyszeri dózis térfogata előnyösen kb. 0,1-1,5 ml közötti, még előnyösebben kb. 0,2 - 0,5 ml közötti az immunogén és az adjuváns fent ismertetett koncentrációi mellett.
A találmány szerinti vakcina-készítmények bármely alkalmas módon beadhatók. Előnyös beadási módok pl. a szubkután, intramuszkuláris, intradermális vagy az orron keresztüli bejuttatás. Alternatív megoldásként a keverék egy biodiffúziós implantátumból is kiszabadítható. Egyszeri beadás is alkalmazható. Alternatívaként több napon vagy héten keresztüli oltássorozat is végezhető.
Példák
A találmányt a következő példákkal illusztráljuk anélkül, hogy ezekre korlátozódnánk.
1. példa
Ez a példa a homogén Hepatitis B felszíni antigénjének (HBsAg) előállítását mutatja be. A rekombináns HBsAg-t a • · ·
- 17 hepatitis B vírus felszíni antigénjével transzfektált humán 3T3 sejtekből izoláljuk, melyet a Mount Sinai School of Medicine (Sells és mtsai, Production of Hepatitis B vírus particles in HepG2 cells transfected with cloned Hepatitis B vírus DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,1005 (1987)) bocsátotta rendelkezésünkre. A sejteket 10 % FCS-sel (Gibco), 1 mmol/1 nátrium-piruváttal és 0,5 % gentamicinnel kiegészített RPMI tápközegben (Gibco) növesztjük. Ezen a ponton két tisztítási eljárás, nevezetesen a sűrűség gradiens centrifugálás vagy immunaffinitás kromatográfia alkalmazható. A sűrűség gradiens centrifugálás során a sejtfelülúszót 2000-es fordulatszámon 10 percig centrifugáljuk a 3T3 sejtek eltávolítása céljából, és ezután az antigént 10 % (t/tf) polietilén-glikollal (Mt: 8000) való kicsapással tisztítjuk. A kapott csapadékot TNE pufferben (10 mmol/1, tris sósav /pH = 8,0/, 200 mmol/1 nátrium-klorid, 1 mmol/1 EDTA /pH = 8/) oldjuk fel és a centrifuálást 20-50 % (t/tf) cézium-klorid gradiensen TNE pufferben SW41 csövekben végezzük. A gradienst 35 000 fordulatszámon 60 órán keresztül centrifugáljuk 4 °C-on. A cső aljáról frakciókat gyűjtünk és a sűrűséget refraktométerrel határozzuk meg. Az 1,351-1,358 denzitású frakciókat összegyűjtjük és PBS-sel szemben dializáljuk, koncentráljuk és a homogén HBsAG koncentrációt analizáljuk egy Abbot RIA kit segítségével 20 ng/ml antigénnel azonos pozitív kontrollt használva.
Az immunaffinitás kromatográfiás eljárást általában a sejtfelülúszó 2000-es fordulatszámon való centrifugálással végezzük a 3T3 sejtek eltávolítása céljából. Az anti-HBsAG affinitás oszlopot anti-HBsAG monoklonális antitest bróm18 ciánnal aktivált Sepharose CL4B-vel való kovalens kötésével készítünk, PBS-sel mossuk. Az eluens OD280nm értékét ellenőrizzük, aminek 0,01-nél kisebbnek kell lennie (OD280nm ~ =280 nm-en mért optikai denzitás (abszorbancia). A felülúszót kétszer engedjük át az oszlopon azért, hogy biztosítsuk az antigén oszlophoz kötődését. Az oszlopot ezután háromszor mossuk a nem specifikusan kötődő fehérjék eltávolítása céljából (az OD280 111,1 < majd glicin/HCl (pH = 2,8) pufferrel eluáljuk.
csövet készítünk elő mindegyikbe a két ml-es glicin/HCl frakciók semlegesítésére elegendő tris puffért (pH = 11) mérve. A 10 csövet az OD280nm alapján analizáljuk, vagy RIA-val mérjük a HBsAG tartalmukat. A homogén polipeptidet tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és PBS-sel szemben dializáljuk. Az oszlopot háromszor PBS-sel mossuk. Az oszlopot PBS/nátrium-azidban tároljuk.
2. példa
A következőkben egy homogén polipeptid immunogén hosszú láncú alkil-amino-észter immunadjuvánssal való komplex képzésének általános eljárását mutatjuk be.
A hosszú láncú alkil-amino-észter immunoadjuvánst (50 mg) egy 25 ml-es térfogatú lombikba vagy kis Erlenmeyer flaskába helyezzük és vattadugóval vagy más laza tömítőanyaggal zárjuk le. Az immunadjuváns sóját egy kemencében az olvadáspontnak megfelelő hőmérsékleten való melegítéssel sterilizáljuk 20 óráig. A lehűtött flaskához szűréssel sterilizált 50 mmol/l-nél nagyobb koncentrációjú pH= 6-7 foszfáttal pufferolt sóoldatot adunk (25 ml) . A kapott szuszpenziót 3-20 órán át lassan keverjük, a vattadugót üvegdugóval cseréljük fel és az egész .: ···;·.···;···;··· • · ··· · · · · · · • · · · · ··· · ··· ··· ···
- 20 ng polipeptiddel erősítjük a 21. napon.
A szérumok antitest koncentrációját RIA-val határozzuk meg. Az antitest koncentrációját egy monoklonális antitesttel nyert standard görbével való összehasonlítás segítségével becsüljük. Az eredményeket az 1. táblázatban közöljük.
1. táblázat
Hepatitis B felszíni antigénre kapott antitest válasz okta decil aminosav immunadjuvánsok jelenlétében
Nap*
Adjuváns 1 11 21 28 35 61
Szalinaoldat 43 36 32 61 59 58
Alumínium 44 53 46 163 320 516
Oktadecil-tirozin 68 91 58 355 833 752
Oktadecil-B-alanin 31 45 44 120 337 373
Oktadecil-glicin 47 38 51 147 748 301
Oktadec i1-pro1in 49 35 41 72 409 168
Oktadeci1-1eucin 48 42 37 160 590 496
Oktadecil-lizin 33 55 - 39 51 67 53
Oktadecil-forfenicinol 31 40 26 65 306 98
Oktadecil-forfenicin 100 112 116 908 592 355
x jelentése anti-HBsAg antitest koncentráció (ng/ml)
A hepatitis B felszíni antigénjének 1-226 aminosav szekvenciáját (HBsAG - adw S géntermék) Bhatnagar P.
K. és mtsai, Proc. Natl. Aca. Science, USA vol. 80. 4400-4404 (1982), referenciaként specifikusan idézett) műben ismertetik.
Az 1. táblázat eredményei mutatják, hogy a hosszú láncú alkil-aminosav-észterek és egy immunogén polipeptid, a hepatitis B felszíni antigén között megfigyelt adjuváns hatás specifikus jelenség. Ez látható az oktadecil-tirozin és oktadecil-lizin illetve az oktadecil-forfenicinol és oktadecil-forfenicin összehasonlításából.
4. példa
Ez a példa az oktadecil-tirozil adjuváns hatását mutatja egy polipeptid dózisának függvényében, mely a hepatitis elleni vakcina jelöltje.
Az eljárás azonos a fent ismertetettel, azzal a különbséggel, hogy az egereket 80 ng hepatitis B felszíni antigénnel immunizáljuk, az immunválaszt 50 ng antigénnel erősítjük és a 7., 14., 28. és 35. napon véreztetünk. Az immunizálást adjuváns jelenlétében végezzük a nem kontroll egerek esetében, illetve adjuváns nélkül a kontroll egereknél. Az eredményeket a 2. táblázatban közöljük.
• · tf· « *«· ·····<
• ♦ · · • · » « · · ·· · 4
- 22 2. táblázat
A hepatitis B felszíni antigénre kapott antitest válasz oktadecil-tirozin jelenlétében
% Adszorbeált
Adjuváns Antiqén 7 14 21 28 35
Szalinaoldat 0 188 40 13 2388 702
Alumínium 73 880 761 639 12310 8726
100 μg 70 1107 537 1279 19679 13427
50 μg 60 2064 846 4000 18804 20616
10 M9 53 611 2314 342 8403 10005
x CPM, a véreztetés előtti érték 11,5
A 2. táblázatban közölt eredmények azt mutatják, hogy az adjuváns hatás függ a készítményben jelenlévő hosszú láncú alkilészter, az oktadecil-tirozin koncentrációjától. Ahogy a beadott adjuváns mennyiségét növeljük, az antitest titer arányosan nő, míg egy optimás titerértéket el nem ér, amin túl az antitest titere nem növekszik.
5. példa
Ez a példa az oktadecil-tirozin adjuváns hatását mutatja a dózis függvényében és különböző állatokban egy olyan polipeptiddel, mely megfelel a HIV-1 humán immundeficiencia vírus burokfehérjéiből származó fúziogén szekvenciával.
1) A HÍV peptid szekvenciája
A HÍV peptid szekvenciája a következő:
- 23 termék: BC-101
303H-V H-Val-Ala-Pro-Thr-Lys-Ala-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Gln-ArgGlu-Lys-Arg-Ala-Val-Gly-Ile-Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly-PheLeu-Gly-Ala-Ala-Gly-Ser- 535 molekulasúly 3585,14 (váz).
2) Kísérletek egerekben
BALB/c egereket 100 pg kémiailag szintetizált, a HIV-1 503-535 aminosav szekvenciájának megfelelő polipeptiddel immunizálunk kulcslyuk tengericsiga hemocianinhoz (KHL) kapcsolt formájában. A polipeptiddel 10-100 pg oktadecil-tirozin-hidrokloridot hozunk komplexbe a 2. példában ismertetett módon. Ezt a keveréket 0,1 ml teljes térfogatban oltjuk az első napon, majd a 21. napon újra. Az egereket a 7., 14., 21., 28. és 35. napon véreztetjük.
A szérumon antitest koncentrációját RIA-val határozzuk meg. Az antitest koncentrációt egy poliklonális antitesttel kapott standard görbével való összehasonlítással becsüljük. Az eredményeket a 3. táblázatban közöljük.
3. táblázat
A HIV-1 503-535 aminosavainak megfelelő polipeptidre kapott a antitest válasz oktadecil-tirozin jelenlétében
Nap*
Adj uváns 7 - 11 21 28 35.
Szalinaoldat 1.04 0.84 1.03 8.56 11.19
Alumínium 1.59 5.54 3.16 86.6 82.1
100 μg 0.87 1.65 2.04 155.3 138.0
50 Mg 1.18 0.75 2.99 54.2 86.2
10 M9 1.61 3.15 1.49 85.9 131.9
x anti-peptid antitest koncentráció (Mg/ml)
A 3. táblázatban közölt eredmények szerint egy hosszú láncú alkilészter, az oktadecil-tirozin koncentráció függő adjuváns hatást mutat egy másik immunogén polipeptiddel, nevezetesen a HÍV gp41 fehérje 503-535 aminosavaiból származó polipeptiddel. Az antitest titer ismét optimumot ér el, amin túl a titer nem nő.
3) Kísérletek páviánokkal
Két páviánt 300 kémiailag szintetizált a HIV-1 503-535 aminosavainak megfelelő aminosav szekvenciával rendelkező polipeptiddel immunizálunk KLH-hoz kapcsolt formában. A polipeptidet 500 μς oktadecil-tirozin-hidrokloriddal hozzuk komplexbe a 2. példa szerint. Ezt a keveréket 1 ml teljes térfogatban oltjuk az 1. napon, majd a 35. napon ismét. Az állatokat az első immunizálás előtt 3 nappal és a 14., 32. és • ·
- 25 49. napokon véreztetjük. Hasonló kísérletet végzünk másik két páviánnal is azzal a különbséggel, hogy itt a HIV-1 526-535 aminosav szekvenciájának megfelelő polipeptidet használunk.
A szérumok antitest koncentrációját indirekt RIA-val mérjük. A titrálást úgy végezzük, hogy a mintákat peptidalbumin konjugátummal fedett lemezeken inkubáljuk és 125I-dal jelzett nyúl anti-majom immunglobulinnal reagáltatjuk. Az eredményeket a 4. táblázatban közöljük.
o
4. táblázat
A HIV-1 polipeptidre kapott antitest válasz páviánokban 500 pg oktadecil-tirozin-hidroklorid jelenlétében
1. Állat
2. Állat
NapK NapK
Polipeptid -3 14 32 49 -3 14 32 49
503-535 1020 2004 2185 5948 1530 2160 2121 4470
526-535 300 686 1685 3121 220 500 965 4383
x CPM, borjú szérumalbuminnal fedett lemezeken mért háttér érték kivonása után
A 4. táblázatban közölt eredmények azt mutatják, hogy adjuváns hatás figyelhető meg egy hosszú láncú alkilészter az oktadecil-tirozin és egy immunogén HÍV polipeptid között magasabb rendű állatokban, pl. páviánokban.
6. példa
Ez a példa az izotipus változást mutatja ki, mely alumínium adjuvánsról egy oktadecil-tirozin adjuvánsra való • ·
- 26 áttérésnél tapasztalható a hepatitis elleni vakcina jelöltje esetén.
Az eljárás az 5. példa 2. részében ismertetettel azonos azzal a különbséggel, hogy 50 pg oktadecil-tirozint alkalmazunk mind a primer, mind a szekunder (21. nap) immunizálásnál. Az antitest válasz izotipusát RIA-val határozzuk meg triciummal jelzett anti-egér izotípus antitest alkalmazásával. A titrálást úgy végezzük, hogy a mintákat immunaffinitás-tisztított hepatitis B felszíni antigénnel fedett lemezeken inkubáljuk. Az eredményeket a kötött izotípus antitest radioaktivitásában (cpm) adjuk meg és az 5. táblázatban közöljük.
- 2? • · ·· • ··· ·«···· • ··· · · ····
5. táblázat
Az anti-hepatitis B felszíni antigén antitest válaszának izotípus válasza <0 sr
11 m co. CO CO co. rH o rH m rH O rH co cn CM rH
M +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1
o cn cn sr <y> Φ in co m m
H co rH m cn <N o CM co in CM
r* 00
rH
00 co 10 in
o 10 *r r~ rH cn <r co rH
«0 00, 10. rH SÍ· r* in sr co CM
CM +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1
e rH <0 co u> <n 00 00 co rH rH
cn Γ- 00 in 00 <n o γ- 00 cn Γ*
H sT CM 00 cn 00 γο sí- cn CM
<M rH CN CM CM CM
rH
O u> in
CM <n <T> <n sr in <x> rH rH r~
x> sr CM cn in co 10 rH CO •H r-
CM +1 +1 +1 +1 +t +1 +1 +1 +1 +1
<J sr in cn co o o CM o o in
Ö> CM 00 in CM 00 o 00 <n rH o
H CO rH sr LO CM rH Γ' CM r* rH
rH <*) rH rH
Γ* cn r- CN CM tn ΙΟ
rH •H CM CM o in sT CM m <n
rH sr rH rH rH rH co rH cn rH sr
e> +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1
Ο» in co r-1 LD r- CM 00 00 o u>
H o o sr CM rH sí- st u> cn Γ
CM CM in cn St O in o rH
CM <H co CM 00 «0
X Ο»
M cn 'CD -H ω
+» n co
CD T-J U CL Ό Cü > C.
<r cn i—i 'co cm
I—I 'cü cn
N Ό) •rH c c □ Η O e o.
E n ra H -CD C in
10 co in o o CM σ» r-
C0 CO CN rH CM rH rH CN
+1 +1 + 1 +1 +1 + 1 +1 +1 + 1 +1
rH CO cn CO o oo sr cn in
o rH o in <M tn co sr cn <0
CM CM sr rH •H r* rH rH <n rH
« CM cn γ-
rH O o sr 00 sr γο. 00 co.
rH in co. co sr rH +1 +1 +1
+1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 r- <o in
r* m <90 r- o co CM sr CM sr
co r- 10 <n C0 <n r~ cn co in
in sr in sr CM u> CM-
h sr tn CM tn CM <0· in CM
1 rH CO sr rH cn sr rH cn sr
-P Cü ·□ i—I o Ό cn
c Ή
E □ r—i
o
Izotípus kontroll* 11299+349 9799+52 3572+245 5951 + 281 3934+272 1565+221
- 28 • ♦ ·· • ··· ······ • · · · • · · · ······
Az 5. táblázatban bemutatott eredmények az antitest válasz izotípus változását mutatja, amely az alumíniumról a hosszú láncú alkilészterre, az (oktadecil-tirozin-OT)-re való áttéréskor jelentkezik immunogén polipeptid a hepatitis B felszíni antigén esetén. Fontos megjegyezni, hogy az IgE antitestek szintje növekszik alumínium alkalmazásakor, míg az oktadecil-tirozin (OT) alkalmazásakor nincs jelentős IgE szint növekedés a kontrollal kapott eredményekkel összevetve.

Claims (29)

1. Vakcina készítmény, azzal jellemezve, hogy egy homogén immunogén polipeptidet és legalább egy, az (I) általános képletű adjuváns - a képletben
C jelentése hidrogénatom, egy aminosav- vagy egy peptid-gyök;
D jelentése hidrogénatom vagy egy gyógyászatilag elfogadható sav;
E jelentése 4-hidroxi-benzil-, benzil-, 4-hidroxi-fenil-, fenil-, 4-amino-butil-, izopropil-, metilcsoport, hidrogénatom vagy egy természetben előforduló aminosavmaradék;
A jelentése (CH2)n-csoport, oxigénatom vagy CH2O-csoport és
B jelentése (CH2)n-csoport vagy oxigénatom, ahol n = 0-4, azzal a kikötéssel, hogy A és B nem lehet egyidejűleg (CH2)n-csoport vagy oxigénatom; és
R jelentése 12-20 szénatomot tartalmazó alkilcsoport hatékony mennyiségét tartalmazza,
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns egy L-konfigurációban lévő aminosavat tartalmaz.
3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns D-konfigurációban lévő aminosavat tartalmaz.
4. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns L- és D-konfigurációkban lévő aminosav keverékét tartalmazza.
• ··
5. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy E jelentése 4-hidroxi-benzil-, benzil-, 4-hidroxi-fenil-, fenil-csoport vagy hidrogénatom.
6. Az 5. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy E jelentése 4-hidroxi-benzil-csoport.
7. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy C jelentése hidrogénatom, egy aminosav- vagy maximálisan 10 aminosavsz árma z ékből álló peptidgyök.
8. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a peptidgyök dipeptid- vagy tripeptidgyök.
9. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy C jelentése egy aminosavgyök, mely lehet tirozil-glicin-, glicil-glicin-, glicil-tirozin- vagy fenilalanil-glicingyök.
10. A 8. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy C jelentése egy dipeptidgyök, mely lehet tirozil-glicilglicin- vagy tirozil-alanil-glicingyök.
11. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a gyógyászatilag elfogadható sav lehet hidrogén-klorid, hidrogén-bromid, foszforsav, kénsav, borkősav, tejsav vagy ecetsav.
12. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns a-aminosavat tartalmaz.
13. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a homogén polipeptid lehet lineáris vagy ciklikus polipeptid.
14. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a homogén polipeptidet egy biológiai hordozóhoz kapcsoljuk.
15. A 14. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a hordozó lehet tetanusz-toxoid, diftéria-toxoid, nem sejtes pertussis vakcina (LPS), egy keresztreagáló anyag (CRM) vagy egy bakteriális fehérjehordozó.
16. A 15. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a CRM-ként CRMi97-t alkalmazunk.
17. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a homogén polipeptid jelentős mértékben a következő betegségekért felelős patogén ágensből származó egy vagy több epitópot tartalmaz: AIDS, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, tetanus, polio, pertussis (limfocitózist elősegítő faktor toxin), herpes simplex, légúti szincitium, kanyaró, influenza, veszettség, lassa-láz, rotavírus, adenovírus, rhinovírus okozta betegségek, száj- és körömfájás, borjú- és macska leukémia, marhavész, dengue-láz, kullancs általi agyvelőgyu11adás, malária és parainfluenza.
18. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a homogén polipeptid jelentős mértékben egy hepatitis vírus egyik felszíni antigénjének aminosav szekvenciájával azonos.
19. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a homogén polipeptid egy hepatitis vírus egyik felszíni antigénjének egy vagy több epitópját tartalmazza.
20. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a homogén polipeptid a hepatitis felszíni antigénjével azonos aminosav szekvenciáját tartalmazza.
21. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a homogén polipeptid jelentős mértékben egy herpes simplex vírus gD alegysége egyik felszíni antigénjével azonos aminosav « · szekvenciát tartalmazza.
22. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a homogén polipeptid egy humán immun deficiencia vírus gpl20 részének egy vagy több epitópját tartalmazza.
23. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a homogén polipeptid egy humán immun deficiencia vírus gp41 részének egy vagy több epitópját tartalmazza.
24. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a homogén polipeptid jelentős mértékben a limfocitózist elősegítő faktor (LPF) aminosav szekvenciájával azonos.
25. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns egy 14-20 szénatomot tartalmazó alkil-alkohol és egy aminosav dipeptid vagy tripeptid észtere.
26. A 25. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az adjuváns oktadecil-tirozin.
27. Eljárás betegekbe immunválasz kiváltására, azzal jellemezve, hogy a betegekbe az 1. igénypont szerinti vakcina készítmény terápiásán hatékony mennyiségét juttatjuk be.
28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítményt intramuszkulárisan, intradermálisan, szubkután vagy orron keresztül juttatjuk be.
29. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vakcina-készítmény bejuttatása nem növeli jelentősen az IgE antitest szintet és növeli az IgG2a/IgGl antitest-arányt.
HU9203480A 1990-05-07 1991-05-01 Vaccine compositions HUT65493A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US51846090A 1990-05-07 1990-05-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9203480D0 HU9203480D0 (en) 1993-01-28
HUT65493A true HUT65493A (en) 1994-06-28

Family

ID=24064028

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9203480A HUT65493A (en) 1990-05-07 1991-05-01 Vaccine compositions

Country Status (22)

Country Link
EP (1) EP0597838B1 (hu)
JP (1) JPH05506234A (hu)
CN (1) CN1056816A (hu)
AT (1) ATE173936T1 (hu)
AU (1) AU7777991A (hu)
CA (1) CA2082425A1 (hu)
CS (1) CS131891A3 (hu)
DE (1) DE69130576T2 (hu)
DK (1) DK0597838T3 (hu)
ES (1) ES2124701T3 (hu)
FI (1) FI925032A0 (hu)
HR (1) HRP930658A2 (hu)
HU (1) HUT65493A (hu)
IE (1) IE911527A1 (hu)
IL (1) IL97985A0 (hu)
MX (1) MX172210B (hu)
NO (1) NO924271L (hu)
NZ (1) NZ238042A (hu)
TW (1) TW221676B (hu)
WO (1) WO1991016926A1 (hu)
YU (1) YU79691A (hu)
ZA (1) ZA913214B (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY111880A (en) * 1992-03-27 2001-02-28 Smithkline Beecham Biologicals S A Hepatitis vaccines containing 3-0 deacylated monophosphoryl lipid a
US6620414B2 (en) 1992-03-27 2003-09-16 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hepatitis vaccines containing 3-0-deacylated monophoshoryl lipid A
AU3541495A (en) * 1994-09-01 1996-03-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Therapeutic remodeling in aids
FR2726471B1 (fr) * 1994-11-07 1997-01-31 Pf Medicament Procede pour ameliorer l'immunogenicite d'un compose immunogene ou d'un haptene et application a la preparation de vaccins
US6027731A (en) * 1998-11-17 2000-02-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Pertussis toxin induced lymphocytosis
JP2003523721A (ja) 1998-12-31 2003-08-12 カイロン コーポレイション 抗原性hivc型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびそれらの使用
ES2299276T3 (es) 1998-12-31 2008-05-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Polipeptidos env del vih modificados.
US7211659B2 (en) 2001-07-05 2007-05-01 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic HIV type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
US20030170614A1 (en) 2001-08-31 2003-09-11 Megede Jan Zur Polynucleotides encoding antigenic HIV type B polypeptides, polypeptides and uses thereof
JP2006502213A (ja) * 2002-10-10 2006-01-19 イエダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド 脂肪族アルコール類の塩基性エステルおよび抗炎症薬または免疫調整薬としての使用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1138773A (en) * 1979-04-18 1983-01-04 George Wojcik Synthetic adjuvants for stimulation of antigenic responses
US4639371A (en) * 1984-10-02 1987-01-27 New York Blood Center, Inc. Hepatitis B antigenic compositions and vaccines against hepatitis B derived therefrom
GB8807860D0 (en) * 1988-04-05 1988-05-05 Connaught Lab Pertussis vaccine
NZ230424A (en) * 1988-08-25 1992-05-26 Liposome Co Inc Liposomal composition comprising an externally disposed antigen

Also Published As

Publication number Publication date
EP0597838A1 (en) 1994-05-25
HRP930658A2 (en) 1997-12-31
HU9203480D0 (en) 1993-01-28
NO924271D0 (no) 1992-11-06
MX172210B (es) 1993-12-07
TW221676B (hu) 1994-03-11
FI925032A (fi) 1992-11-06
IE911527A1 (en) 1991-11-20
DK0597838T3 (da) 1999-08-16
EP0597838B1 (en) 1998-12-02
NZ238042A (en) 1993-12-23
DE69130576D1 (de) 1999-01-14
CN1056816A (zh) 1991-12-11
ZA913214B (en) 1992-09-30
ATE173936T1 (de) 1998-12-15
JPH05506234A (ja) 1993-09-16
NO924271L (no) 1993-01-07
AU7777991A (en) 1991-11-27
WO1991016926A1 (en) 1991-11-14
YU79691A (sh) 1994-06-10
IL97985A0 (en) 1992-06-21
CA2082425A1 (en) 1991-11-08
FI925032A0 (fi) 1992-11-06
ES2124701T3 (es) 1999-02-16
DE69130576T2 (de) 1999-07-29
CS131891A3 (en) 1992-02-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1543039B1 (en) Novel immunogenic lipopeptides comprising t-helper and b-cell epitopes
ES2207177T3 (es) Proteinas nucleo de la hepatitis b estrategicamente modificas y sus derivados.
EP1649861B1 (en) Adjuvant compositions comprising a mineral salt and another immunostimulating compound
TWI379839B (en) Aβ immunogenic peptide carrier conjugates and methods of producing same
CA1329766C (en) T cell epitopes of the hepatitis b virus nucleocapsid protein
US6099846A (en) Enhancement of B cell lymphoma and tumor resistance using idiotype/cytokine conjugates
HUT64237A (en) Improved vaccina preparatives
US5019383A (en) Fatty acid carriers for synthetic peptides
JPH09510975A (ja) アレルギー治療用合成ペプチドベース免疫原
HUT65493A (en) Vaccine compositions
AU4100800A (en) Method for down-regulating il5 activity
US4584195A (en) Broad spectrum vaccine against gonorrhea
JP4651753B2 (ja) 不安定結合による担体結合抗原から成るワクチン
JP4974441B2 (ja) 抗原性凝集物を得る方法と製剤におけるその使用
US4622223A (en) Broad spectrum vaccine against gonorrhea
JP4099059B2 (ja) 特定交叉反応性を高める抗原構造を得る方法
ES2315405T3 (es) Proteina pre-s del virus de la hepatitis b (vhb) como adyuvante y un componente de una vacuna frente a vhb.
US11793873B2 (en) Bivalent dengue/hepatitis B vaccines
JP2004509846A (ja) 肝炎c型ウイルスコンジュゲート
JPH02215797A (ja) ポリペプチド
Penney Stearyl tyrosine: An organic equivalent of aluminum-based immunoadjuvants
KR20010003195A (ko) 지방산이 결합된 합성 펩타이드를 인지질 막에 재조합하여 제조한 조합물 및 그 제조방법
MXPA00007859A (en) Strategically modified hepatitis b core proteins and their derivatives

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee