KR20010003195A - 지방산이 결합된 합성 펩타이드를 인지질 막에 재조합하여 제조한 조합물 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 지방산이 결합된 합성 펩타이드를 인지질 막에 재조합하여 제조한 조합물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 친수성(hydrophilic) 펩타이드의 N 말단, C 말단, 또는 그 중간 사슬에 지방산을 결합하여 리포펩타이드 (lipopeptide)를 제조하고, 이를 지질 또는 인지질 혼합물과 재조합하여 제조한 조합물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 조합물은 펩타이드를 직접 지질 또는 인지질과 혼합하여 제조한 조합물에 비해 안정성이 증가될 뿐만 아니라, 항원 펩타이드를 사용할 경우에는 안정적이고 면역원성이 높은 백신재료로 이용될 수 있으며, 약리활성을 가진 저분자량의 펩타이드를 사용할 경우에는 효과적인 약물 전달 시스템에 이용되는 등 사용하는 펩타이드의 종류에 따라 다양하게 응용될 수 있다.

Description

지방산이 결합된 합성 펩타이드를 인지질 막에 재조합하여 제조한 조합물 및 그 제조방법{Compound prepared by mixing synthetic peptide conjugated with fatty acid and phospholipid, and preparation process thereof}
본 발명은 지방산이 결합된 합성 펩타이드를 인지질 막에 재조합시켜 제조한 조합물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 친수성(hydrophilic) 펩타이드의 N 말단, C 말단, 또는 그 중간 사슬에 지방산을 결합하여 리포펩타이드(lipopeptide)를 제조하고, 이를 지질 또는 인지질 혼합물과 재조합시켜 제조한 조합물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
합성 펩타이드를 이용한 백신의 개발은 기존의 방법으로 조제된 백신에 비해 부작용이 적어 최근들어 활발히 연구되고 있다. 특히, B-세포 및 T-세포 에피토프(epitope)만을 포함하는 펩타이드를 항원으로 사용하여 제조된 백신의 경우에는 면역반응이 정해진 항원부위로 집중되므로 기타 불필요한 면역 반응이나 부작용을 미연에 방지할 수 있으며, 병원성 세균이나 바이러스의 변종 등의 다양한 항원형에 대해서도 동일한 수준의 면역반응을 이끌 수 있을 뿐만 아니라, subunit 백신으로서 유아에 사용해도 좋을 정도로 안전하다는 많은 장점을 가지고 있다.
그러나, 펩타이드 백신이 B-세포 및 T-세포 에피토프만으로 이루어지는 경우, 펩타이드 길이가 20∼30개 정도의 아미노산으로 짧기 때문에 면역반응성이 낮다는 단점이 있다.
이와 같은 펩타이드 백신의 낮은 면역원성을 높이기 위하여, 펩타이드에 수송체 단백질(carrier protein)을 결합시키는 방법, 면역 보조제(immunnoadjuvant)를 사용하는 방법, 또는 펩타이드에 지방산을 붙이는 방법 등의 여러가지 시도들이 이어져 왔다.
펩타이드에 수송체 단백질을 결합시키는 방법은 불필요한 면역반응을 일으키거나 반응정도를 제어하기 어려운 단점이 있어 그 사용에 한계가 있었다.
이에 백신 면역 보조제들이 개발되었는데, 면역보조제의 기능은 빠르고 강력한 면역반응을 유도하며, 방어적 면역반응(protective immunity)이 오랫동안 지속되도록 도와주는 것으로, 그들의 효용도는 면역반응의 크기와 질에 의해서 결정된다.
면역보조제는 일반적으로 두 종류의 T-helper cell(Th1/Th2)에 대해 면역반응인 Th1 타입 반응과 Th2 타입의 반응을 유발한다. 구체적으로, Th1 타입 반응은 IL-2(Interleukin-2)와 IFN-γ(Interferon-γ)와 같은 사이토카인의 생성을 유발하고 주로 바이러스 감염, 세포내 감염 세균 (intra-cellular bacteria) 또는 기생충 감염시에 주로 나타나며, 세포 매개 면역반응을 유도한다. Th1 타입의 반응은 상대적으로 IgG2a 항체의 생성정도가 높다. 반면에, Th2 타입의 반응은 IL-4와 IL-10의 생성을 주로 유도하며, IgG1과 IgE 항체가 주로 형성된다.
현재까지 개발중이거나 임상실험중인 여러 종류의 면역보조제들은 다음과 같다. 첫번째로 알루미늄 포스페이트(aluminum phosphate)와 알루미늄 하이드록사이드(aluminum hydroxide) 등의 알루미늄 화합물이 있다. 이러한 알루미늄 화합물은 주사시, 주사부위에 침착되어 서서히 항원을 방출시키고 항원전달세포에 의해 항원이 효과적으로 방출되도록 하며, 대식세포(macrophage) 및 보체(complement)를 활성화하여 면역에 관계되는 세포들을 자극함으로써 면역보조제로서의 활성을 나타낸다. 두번째로 프로인트 불완전(Freund's incomplete) 면역보조제를 포함하는 오일-유제(oil-emulsion)가 있다. 그러나, 이 오일-유제의 경우 안전성이 좋지 못하며, 최근에는 MF-59라는 보다 안정성이 향상된 오일-유제가 개발된 상태이다. 세번째로는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide)를 포함하는 지질 A(lipid A)류를 들 수 있는데, 그 자체로는 너무나 독성이 커서 사용할 수 없기 때문에, 면역보조제 효과는 그대로 유지시키면서 독성을 없앤 유도체들이 개발 중에 있다. 네번째로는 사포닌(saponin)과 퀼 A(Quil A) 및 면역 활성화 복합체 (immunostimulating complex, ISCOM) 등을 들 수 있다. 이 중 퀼 A와 면역 활성화 복합체는 동물용 백신에는 적용하고 있으나 사람의 경우에는 용혈 작용 등이 문제가 되어 아직 사용되고 있지 못하는 실정이다. 다섯째로는 리포좀 제제들인데 체액성(humoral)과 세포 매개성(cell-mediated) 면역반응을 모두 유발시킬 뿐만 아니라, 독성이 있는 다른 종류의 면역보조제에 피막형성제로 사용하면 그 부작용을 감소시키고 면역보조제 효능은 그대로 유지시키는 장점이 있다. 이러한 리포좀 제제들은 주사부위에 침착하여 항원을 서서히 방출시키며, 대식세포와 같은 항원제시세포에 의해 항원이 적절히 제시되도록 하는 작용기전을 갖는다.
최근에는 리포좀을 구성하는 인지질이 인체내에서 쉽게 분해되며 보관이 용이하지 않고 생산가가 높은 등의 단점 때문에 비인지질성 리포좀(non-phospholipid liposome, NOVASOMER vesicle)이 개발되어 가축용 백신에 사용될 수 있도록 미농무성에서 허가받은 상태이며, 이 비인지질성 리포좀을 사람에 적용시키기 위한 시도가 진행중에 있다.
이와 같이, 지난 70여 년간 여러 종류의 면역보조제 제제들이 개발되었으나 이들 중 대부분이 독성과 부작용 때문에 면역 보조제로서 사용되지 못하였고, 그 중의 일부에 대해서만 임상실험이 이루어졌다. 최근까지도 사람의 백신으로 쓸 수 있게 허가받은 유일한 면역보조제는 Th2 타입의 면역반응을 유도하는 것으로 알려져 있는 알루미늄 화합물(aluminium) 뿐이다. 그러나, 알루미늄 역시 여러 종류의 subunit 백신에 있어서 효과적이지 못하며 대부분이 체액성 면역 반응만을 자극한다는 보고가 있다.
한편, 최근에는 펩타이드 백신의 낮은 면역원성을 높이기 위한 방법으로 펩타이드에 지방산을 붙여 리포펩타이드를 제조하는 방법이 시도되고 있다. 리포펩타이드는 대부분 세포상해성 T세포(cytotoxic T lymphocyte)를 활성화시키며, 일부의 경우에는 세포상해성 T세포 뿐만 아니라 CD4+Th세포에도 영향을 미침으로써 면역반응을 상당히 향상시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 리포펩타이드에 의한 면역 반응은 팔미틴산(palmitic acid)이나 미리스틴산(myristic acid)과 같은 지방산이 단백질을 아실레이션하여 단백질을 세포막쪽으로 이동시키고, 이로 인해 항원제시세포로의 세포내이입(endocytosis)이나 세포 내로의 침투를 용이하게 하기 때문이다.
본 발명자들은 리포좀이 체액성과 세포 매개성 면역반응을 모두 유발시킬 뿐만 아니라 대식세포와 같은 항원제시세포에 의해 항원을 적절히 제시한다는 장점과 리포펩타이드가 세포상해성 T세포와 CD4+Th세포를 활성화 시킨다는 장점에 기초하여, 리포좀과 리포펩타이드를 재조합하여 제조한 새로운 조합물을 고안하였다.
즉, 본 발명에서는 인지질로 이루어진 리포좀을 생체내 운반 및 저장 수단으로 하고, 이 리포좀에 펩타이드를 안정하게 혼합할 수 있는 방법으로서, 친수성(hydrophilic) 펩타이드의 N 말단, C 말단, 또는 그 중간 사슬에 지방산을 붙인 리포펩타이드(lipopeptide)를 제조하고, 이를 지질 또는 인지질 혼합물과 재조합시켜 제조한 조합물을 제공한다.
본 발명의 조합물은 펩타이드를 직접 지질 또는 인지질과 혼합하여 제조한 조합물에 비해 안정성이 증가되었을 뿐만 아니라, 사용하는 펩타이드의 종류에 따라 백신재료로 사용되거나 약물전달 시스템에 적용되는 등 다양하게 응용될 수 있다.
본 발명의 목적은 지방산이 결합된 합성 펩타이드를 인지질 막에 재조합시켜 제조한 조합물 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
도 1 은 형광분석을 통한 p26펩타이드의 구조(conformation)를 측정한 결과를 나타낸 것이고,
― : p26펩타이드 … : C16-p26
―·― : 리포좀에 재조합된 C16-p26
도 2 는 항체를 1 μg/ml(A), 10 μg/ml(B), 및 50 μg/ml(C)을 사용하였을 때, 리포좀에 재조합된 C16-p26 시료에서 p26 펩타이드가 리포좀의 표면에 드러나 있는지를 FACScan을 이용하여 확인한 그래프를 나타낸 것이고,
검은 부분 : 리포좀에 재조합된 C16-p26 시료를 p26 펩타이드에 선택적인 단일클론 항체 (H8)을 이용하여 염색한 경우
흰 부분 : 대조군으로 사용한 HAM-19으로 염색한 경우
도 3 은 p26, p26 + 프로인트 보조제(p26/FA), C26-p26 및 리포좀에 재조합된 C26-p26, 즉 p26 펩타이드를 포함하는 4가지 제제의 항체생성능을 조사한 결과를 나타낸 것이고,
도 4 는 p26, p26 + 프로인트 보조제(p26/FA), C26-p26 및 리포좀에 재조합된 C26-p26, 즉 p26 펩타이드를 포함하는 4가지 제제의 항체 생성능을 시기별로 측정한 결과를 나타낸 것이며,
도 5 는 p26, p26 + 프로인트 보조제(p26/FA), C26-p26 및 리포좀에 재조합된 C26-p26, 즉 p26 펩타이드를 포함하는 4가지 제제에 의해 형성된 항체의 동위체(isotype)를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 합성 펩타이드에 지방산을 결합하여 리포펩타이드를 제조하고, 이를 인지질 막에 재조합하여 제조한 조합물을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명은
(1) 친수성(hydrophilic) 펩타이드의 N 말단, C 말단, 또는 그 중간 사슬에 지방산을 결합하여 리포펩타이드(lipopeptide)를 제조하는 단계;
(2) 상기 (1)의 리포펩타이드를 지질 또는 인지질 혼합물과 재조합시키는 단계;로 구성되는 것을 특징으로 하는 상기 조합물의 제조방법을 제공한다.
상기 조합물의 제조에 사용될 수 있는 펩타이드로는 p26 펩타이드(preS2(120-145)) 등이 있으며, 이외에도 에피토프로 작용하는 펩타이드가 사용될 수 있다. 또한, 약리활성을 가진 저분자량의 펩타이드도 사용이 가능하다.
지방산으로는 팔미트산(palmitic acid), 미리스틴산(myristic acid), 스테아린산(stearic acid), 올레인산(oleic acid), 아라키돈산(arachidonic acid) 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서는 리포펩타이드-인지질 조합물을 유효성분으로 하는 예방용 또는 치료용 백신 및 약물 전달 시스템을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 항원 펩타이드 p26은 인간 간염 바이러스(HBV)의 표면항원 preS2의 120-145번째 아미노산으로 구성되는 에피토프로서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다.
Fmoc(9-플루오레닐메톡시카느보닐)(Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)을 Nα-아미노산(amino acid)의 보호기로 사용하는 고상법에 의해 항원 펩타이드인 p26 펩타이드(preS2(120-145))를 합성한다. 펩타이드의 연장 반응은 N-하이드록시벤조트리아졸(N-hydroxybenzotriazole)-다이사이클로헥실카르보디이미드(dicyclohexyl-carbodiimide), 즉 HOBt-DCC 방법에 따라 수행한다.
N 말단의 아미노산까지 커플링된 상기의 p26 펩타이드에 지방산을 결합시켜 리포폴리펩타이드인 C16-p26를 합성하고, 그 결합 여부는 아미노산 분석기로 측정한다.
이렇게 합성된 C16-p26을 인지질 혼합물과 재조합한다. 이 때, 인지질 혼합물은 그 조성에 있어 포스파티딜콜린:스테아릴아민:콜레스테롤(phophatidyl- choline: stearylamine : cholesterol)이 70:20:10 v/v %의 비율을 갖는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이는 스테아릴아민에 의해 리포좀의 액성이 양성이 되도록 하고, 콜레스테롤에 의해 리포좀막에 유연성을 부여하기 위함이다.
C16-p26 펩타이드를 인지질 혼합물과 재조합하는 과정에 있어서, p26 펩타이드는 인지질 혼합물과의 재조합 전후에 상당한 구조(conformation)적 차이를 갖는다. 따라서, 리포좀에 재조합시키면서 나타나는 p26 펩타이드의 구조 변화를 조사하면, C16-p26 펩타이드와 인지질 혼합물과의 재조합이 제대로 수행되었는지를 확인할 수 있다. 이에 따라, 본 발명에서는 p26 펩타이드의 아미노산 서열에 티로신 잔기가 하나 있음에 기초하여, 트립토판(tryptophan)의 형광 발광 스펙트럼(fluorescence emission spectra)을 측정한다. 일반적으로 트립토판이 물과 같은 극성용매에 노출되어 있으면 최대 발광 파장이 350 nm인 반면, 트리토판 잔기가 더 소수성인 환경으로 움직이게 되면 최대 발광 파장이 350 nm보다 짧아지는 블루 쉬프트(blue shift)현상이 나타나게 되는데, 이와같이 소수성의 증가에 따른 블루 쉬프트 현상에 의해 인지질에 재조합되는 정도를 측정한다.
형광 분석기(spectrofluorometer)는 일본의 Shimazu RF-5000을 사용하며, 280 nm에서 여기(excitation) 시킨 후, 300∼450 nm의 발광 파장에서의 고유 형광(intrinsic fluorescence)을 측정한다.
C16-p26 펩타이드를 인지질 혼합물과 재조합하여 제조한 조합물인 '리포좀에 재조합된 C16-p26'에 있어서, C16-p26의 지질 꼬리(lipid tail)부분은 리포좀의 이중막쪽으로, 펩타이드로 이루어진 머리 부분은 바깥용매쪽으로 드러나도록 해야 한다. 이는 C16-p26 펩타이드가 인지질막에 끼어들어갔다 할지라도, 머리 부분인 펩타이드 부위가 리포좀막 바깥쪽에 드러나 있지 않으면, 개체내로 투여되었을 때 면역반응에 참여하는 여러 세포와 접할 수 없기 때문이다. 따라서, 본 발명에서는 '리포좀에 재조합된 C16-p26'내의 펩타이드 부위가 바깥쪽으로 드러나 있는지를 확인하기 위하여, p26 펩타이드에 특이적인 마우스 단일클론항체인 H8을 이용하여 FACScan (FACScan flow cytometer, Becton Dickinson Inc. USA)을 실시한다.
또한, 본 발명에서는 p26 펩타이드를 포함하는 4가지 제제, 즉 p26, p26 + 프로인트 보조제(p26/FA), C26-p26 및 리포좀에 재조합된 C26-p26의 면역원성을 측정한다. C16-p26 펩타이드와 리포좀에 재조합시킨 C16-p26 펩타이드 제제들은 p26 펩타이드 단독제제 또는 프로인트 보조제(Freund's adjuvant)가 첨가된 p26 펩타이드 제제에 비해 4배 내지 16배 높은 정도의 면역원성을 나타내며, 항체의 생성도 훨씬 빠름을 알 수 있다(도 4).
일반적으로 수직감염이 우려되는 고위험(high-risk) 그룹의 면역법은 수동 면역법(passive immunization)으로서, 투여하는 항체의 이성체 종류에 따라 체액성 면역이 유발되는지, 또는 세포 매개성 면역이 유도되는지를 간접적으로 알 수 있으므로, 항체 동위체의 면역활성을 측정하는 것은 중요한 의미를 갖는다.
이에, 본 발명에서는 p26 펩타이드를 포함하는 4가지 제제, 즉 p26, p26 + 프로인트 보조제(p26/FA), C26-p26 및 리포좀에 재조합된 C26-p26 제제에 의해 형성된 항체 동위체(isotype)의 면역원성을 측정한다. 상기 p26 펩타이드를 포함하는 4가지 제제들에 의해 형성된 항체 동위체의 면역 활성 측정은 마우스 Ig 동위체인 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM 및 IgA에 대해 선택적인 염소로부터 얻은 폴리클로날항체(Sigma, USA)를 이용한다. 면역화를 시작한 지 얼마되지 않은 기간 (2-4주)에는 일반적으로 초기에 나타나는 항체인 IgM 타입이 주로 많이 생성되며, p26 펩타이드의 경우 면역화 후 일정한 기간이 지났어도 IgM이 여전히 주류를 이루는 반면, C16-p26 의 경우에는 IgG2b의 생성이 우세하다.
본 발명의 합성 펩타이드에 지방산을 결합하여 리포펩타이드를 제조하고, 이를 인지질 막에 재조합하여 제조한 조합물은 펩타이드를 직접 지질 또는 인지질과 혼합하여 제조한 조합물에 비해 보다 증가된 안정성을 갖는다. 이는 펩타이드를 직접 지질 또는 인지질과 혼합하는 경우에는 펩타이드 자체의 양쪽 친매성 (amphiphilic)만을 이용해야 하므로 안정한 형태의 조합물을 얻기가 어려운 반면, 펩타이드에 지방산을 결합시킨 경우에는 펩타이드에 확실한 소수성(hydrophobic)을 부여하여 전체적으로는 양쪽 친매성인 리포펩타이드가 생성되기 때문이다.
본 발명의 조합물은 생체내 운반 및 저장이 용이한 리포좀 제제로서, 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며, 백신 재료로 사용시 '리포좀에 재조합된 C26-p26'의 유효량은 0.1∼8 mg/kg 이고, 바람직하기로는 0.4∼2 mg/kg 이며, 각각의 개별적인 필요조건에 따라 조절될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 항원으로 사용할 preS2(120-145) (p26)와 팔미틸레이티드 p26 (C16-p26)의 합성
(1) preS2 (120-145) (p26)
Fmoc(9-플루오레닐메톡시카르보닐)(Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)을 Nα-아미노산(amino acid)의 보호기로 사용하는 고상법에 의해 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 preS2 (120-145) (p26)를 합성하였다. 펩타이드의 연장 반응은 N-하이드록시벤조트리아졸(N-hydroxybenzotriazole)-다이사이클로헥실카르보디이미드 (dicyclohexylcarbodi- imide), 즉 HOBt-DCC 방법에 따라 수행하였다.
(2) 팔미틸레이티드 p26 (C16-p26)
N 말단의 아미노산까지 커플링된 상기 (1)의 p26 펩타이드에 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(piperidine/ N-methylpyrrolidone) 용액을 가하여 Fmoc기를 제거하고, N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄(dichloromethane)으로 세척한 다음 팔미틴산(palmitic acid)을 커플링시켰다. 합성이 끝난 후 N-메틸피롤리돈과 디클로로메탄(dichloromethane)으로 여러번 세척한 다음 질소가스로 건조하였다. 여기에 트리플루오로아세트산:페놀:치오아니솔:물:트리이소프로필실란(trifluoroacetic acid: phenol:thioanisole: Water:triisopropylsilane)의 85:5:5:3:2 v/v 용액으로 2-3시간 반응시켜 보호기를 제거하고, 레진(resin)으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음 디에틸에테르(diethylether)로 펩타이드를 침전시켰다. 이렇게 얻은 조(crude)펩타이드는 0.05 % 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토나이트릴로 그라디엔트(acetonitrile gradient)하고 정제 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼(purified reverse phase high performance liquid chromatography column)(Delta Pak, C18300Å, 1.9 × 30cm, Waters)을 이용하여 정제함으로써, 팔미틸레이티드 p26 (C16-p26)를 합성하였다.
(3) 팔미틸레이티드 p26 (C16-p26)의 확인
상기 (2)의 방법으로 합성된 정제 펩타이드 C16-p26를 6N HCl로 110 ℃에서 24시간 가수분해한 후, 잔사를 감압농축하고 0.02N HCl에 녹여 아미노산 분석기로 분석하여 펩타이드의 합성이 제대로 되었는지 확인하였다. 또한, 질량 분광광도계(mass spectrophotometer)로 C16-p26의 분자량을 측정하여 펩타이드에 팔미틸기가 붙어 있는지를 확인하였다. 합성된 정제 펩타이드의 양은 p26 펩타이드의 아미노산 서열내에 티로신(tyrosine) 잔기가 하나 있음에 기초하여, 280 nm에서의 흡광도를 측정하고 흡광계수(extinction coefficient)를 고려하여 계산하였다.
실시예 2. C16-p26과 인지질 혼합물의 조합과정 및 조합시의 p26 펩타이드의 구조(conformation) 변화
(1) C16-p26과 인지질 혼합물의 조합 과정
포스파티딜콜린:스테아릴아민:콜레스테롤(phophatidylcholine:stearylamine: cholesterol)이 70:20:10 v/v %의 비율이 되도록 인지질 혼합물을 제조하였다. 이는 스테아릴아민에 의해 리포좀의 액성이 양성이 되도록 하고, 콜레스테롤에 의해 리포좀막에 유연성을 부여하기 위함이다. 이 인지질 혼합물을 클로로포름에 녹이고, 실시예 1에서 합성한 (C16-p26) 펩타이드를 인지질 혼합물:펩타이드의 비율이 100:1 (wt/wt)이 되도록 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이 반응물을 질소 가스를 이용하여 용매를 제거하고, 진공 데시케이터(vacuum desiccator)에서 1시간이상 방치하였다. 건조된 인지질과 펩타이드의 혼합물에 인산염 완충액를 가하여 현탁시킨 후, 얼리는 과정과 녹이는 과정(freezing and thawing)을 5번 반복 시행함으로써, C16-p26을 인지질막에 재조합하였다. 이 때, C16-p26의 지질 꼬리(lipid tail)부분은 리포좀의 이중막(bilayer)쪽으로, 펩타이드로 이루어진 머리(head) 부분은 바깥용매쪽으로 드러나도록 하였다.
(2) C16-p26과 인지질 혼합물의 조합시의 p26 펩타이드의 구조 (conformation) 변화
본 발명에서는 p26 펩타이드의 아미노산 서열에 티로신 잔기가 하나 있음에 기초하여, p26, C26-p26 및 리포좀에 재조합된 C26-p26을 280 nm에서 여기 (excitation) 시킨 다음, 300∼450 nm의 발광 파장(emission wavelength)에서의 트립토판(tryptophan)의 고유 형광(intrinsic fluorescence)을 측정하였다. 이 모든 과정은 25 ℃에서 수행되었다.
일반적으로 트립토판이 물과 같은 극성용매에 노출되어 있으면 최대 발광 파장이 350 nm인 반면, 트리토판 잔기가 더 소수성인 환경으로 움직이게 되면 최대 발광 파장이 350 nm보다 짧아지는 블루 쉬프트(blue shift)현상이 나타나게 되는데, 이와같이 소수성의 증가에 따른 블루 쉬프트 현상에 의해 인지질에 재조합되는 정도를 측정할 수 있다.
p26 펩타이드 경우 인산염 완충액에서 350 nm일 때 최대 발광을 나타내지만, C16-p26의 경우는 최대 발광을 나타내는 파장이 342 nm로 약간 블루 쉬프트 되었으며, C16-p26을 리포좀에 재조합시킨 경우는 최대 발광 파장이 324nm로 매우 큰 정도의 블루 쉬프트 현상이 관찰되었다(도 1). 이로부터 C16-p26 펩타이드를 인지질 리포좀막과 재조합시켰을 경우 펩타이드가 소수성인 인지질막으로 성공적으로 끼어들어갔음을 알 수 있었다.
실시예 3. 리포좀에 재조합된 C16-p26에서 p26 펩타이드가 리포좀 표면에 드러나 있는지의 확인
C16-p26 펩타이드를 인지질 혼합물과 재조합하여 제조한 조합물인 '리포좀에 재조합된 C16-p26'에 있어서, C16-p26의 펩타이드가 인지질막에 끼어들어가 있어도 머리 부분인 펩타이드 부위가 리포좀막 바깥쪽으로 드러나 있어야 개체내로 투여되었을 때 면역반응에 참여하는 여러 세포와 접할 수 있다. 따라서, C16-p26을 리포좀에 재조합시켰을 경우 p26 펩타이드가 리포좀의 표면에 드러나 있는지를 확인하기 위하여, p26 펩타이드에 특이적인 쥐의 단일클론항체인 H8을 이용하여 FACScan(FACScan flow cytometer, Becton Dickinson Inc. USA)을 실시하였다.
C16-p26이 재조합된 리포좀에 H8 항체를 1, 10, 50 μg/ml 씩 각각 첨가하고, 음성대조군(negative control)으로는 C16-p26이 재조합된 리포좀에 말토오즈-결합 단백질(maltose-binding protein)에 대한 단일클론 항체인 HAM-19을 동일한 농도별로 첨가하여 4 ℃에서 30분간 반응시켰다. 마우스 항체에 대한 FITC-결합 염소 항체 IgG (FITC-conjugated goat anti-mouse IgG)로 4 ℃에서 30분간 염색하고 FACS 분석을 수행하였다.
C16-p26이 재조합된 리포좀의 경우, H8 항체의 양을 증가에 따라 H8과 결합한 리포좀의 형광도가 비례적으로 증가하고 있으므로(도 2), 펩타이드와 H8과의 반응은 특이적으로 일어나고 있으며 p26 펩타이드는 기대했던 대로 리포좀막의 바깥쪽에 노출되어있음을 알 수 있었다. 한편, 음성 대조군으로 사용한 HAM-19와 반응하는 리포좀은 거의 발견되지 않았다.
실시예 4. p26 펩타이드를 포함하는 4가지 제제의 면역원성 및 이들 제제에 의해 형성된 항체 동위체(isotype)의 면역원성 측정
(1) p26 펩타이드를 포함하는 4가지 제제의 면역원성 측정
p26, p26 + 프로인트 보조제(p26/FA), C26-p26 및 리포좀에 재조합된 C26-p26, 즉 p26 펩타이드를 포함하는 4가지 제제를 Balb/c mouse에 마리당 펩타이드 양으로 20 ??g씩 복강내 주사(intraperitoneal, IP)를 2주일에 한번씩, 3번에 걸쳐 실시하였다. 면역원성의 크기를 측정하기 위한 혈액은 꼬리 정맥으로부터 2주 마다 채취하였다. 각 제제에 대한 항체 생성능은 p26 펩타이드를 코팅한 96 웰 마이크로플레이트(well microplate)를 이용한 엘리자(ELISA)를 통해 측정하였다. 항원으로 사용한 p26 펩타이드를 96 웰 마이크로플레이트(NUNC)에 웰당 500 ng씩 코팅 완충액 (0.1M 소디움 카보네이트 용액, pH 9.6)에 녹여 상온에서 2시간 동안 코팅하였다. 이 마이크로플레이트를 3 % 카제인이 혼합된 트리스-완충 식염수(0.02M Tris-Cl, 0.9% NaCl, pH7.4, TBS) 용액 100 μl으로 처리하여 블로킹한 다음 세척액 (0.05 % Tween 20이 포함된 TBS) 으로 3번 세척하였다. 채취한 혈청을 희석액 (0.3 % 카제인이 포함된 TBS-Tween)에 1/100부터 시작하여 2배씩 연속적으로 희석하고, 37 ℃에서 2시간동안 결합시킨 다음 세척액으로 3번 세척하였다. 여기에 마우스 IgG에 특이적인 퍼옥시다아제 결합 항체를 가하여 37 ℃에서 2시간 반응시키고, 세척액으로 세척하였다. 인산염-구연산 완충액에 0.4 mg/ml인 ο-페닐린디아민 (ο-phenylenediamine) 및 0.4 μl/ml 과산화수소수가 들어있는 기질용액으로 10분간 발색시킨 후, 2.5M 황산용액으로 반응을 중지시키고 490nm에서의 흡광도를 측정하였다(Emax, Molecular Devices, USA). 마지막 적정값(end titer)은 혈청을 2배로 희석하면서 나타난 490 nm에서의 흡광도가 더 이상 1.6∼2배로 낮아지지 않을 때의 1/희석배수로 표시하였다.
그 결과를 살펴보면, C16-p26 펩타이드와 리포좀에 재조합시킨 C16-p26 펩타이드 제제들은 p26 펩타이드 단독제제 또는 프로인트 보조제가 첨가된 p26 펩타이드 제제에 비해 4배 내지 16배 높은 정도의 면역원성을 나타내었다(도 3). 또한, C16-p26 펩타이드와 리포좀에 재조합시킨 C16-p26 펩타이드 제제의 경우, p26 펩타이드를 면역화했을 때 보다 높은 마지막 적정값(end titer)을 가지는 것으로 보다 항체의 생성이 빠름을 알 수 있다(도 4). 따라서, 본 제제는 시급히 항체 형성이 요구되는 경우, 예를 들어 간염에 걸인 산모가 출산할 때 태아로의 수직 감염을 예방하기 위하여 출산 직후의 태아를 면역화시키기 위한 좋은 방법으로 기대된다.
(2) p26 펩타이드를 포함하는 4가지 제제에 의해 형성되는 항체 동위체의 면역원성 측정
p26 펩타이드를 코팅한 마이크로플레이트에 채취한 혈청을 희석액에서 100배 희석한 후 37 ℃에서 2시간동안 결합시켰다. 세척액으로 3번 세척한 후, 각각의 이성체 Ig에 특이한 폴리클로날항체(Sigma, USA)를 37 ℃에서 2시간동안 결합시켰다. 세척액으로 3번 세척한 후, 항-염소 IgG-HRP 결합체(anti-goat IgG-HRP conjugate)를 결합시키고, ο-페닐린디아민과 과산화수소수가 들어있는 기질용액으로 발색반응시킨후, 황산용액으로 반응을 중지시키고 490 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 살펴보면, 모든 종류의 항원을 면역화한 경우, 면역화를 시작한 지 얼마되지 않은 기간 (2-4주)에는 일반적으로 초기에 나타나는 항체인 IgM 타입이 주로 많이 생성되었다. p26 펩타이드의 경우는 면역화 후 일정한 기간이 지났어도 IgM이 여전히 주류를 이루었으며 그외로는 IgG3 등이 많은 반면, C16-p26 의 경우에는 IgG2b의 생성이 우세하였다(도 5). 이로부터, 팔미틸기를 붙인 형태의 리포펩타이드는 Th1 타입의 반응을 나타내어 세포성 면역을 유도하는 것으로 생각되며, 이것은 바이러스에 감염된 세포를 파괴하기위한 면역반응에 필수적인 것으로 기대된다.
본 발명의 합성 펩타이드에 지방산을 결합하여 리포펩타이드를 제조하고, 이를 인지질 막에 재조합하여 제조한 조합물은 펩타이드를 직접 지질 또는 인지질과 혼합하여 제조한 조합물에 비해 보다 증가된 안정성을 갖는다.
또한, 본 발명의 조합물은 펩타이드로서 항원 펩타이드를 사용할 경우에는 백신재료로, 약리 활성을 가진 저분자량의 펩타이드를 사용할 경우에는 약물 전달 시스템에 이용되는 등 사용하는 펩타이드의 종류에 따라 다양하게 응용될 수 있다.
항원 펩타이드를 사용한 본 발명의 조합물내의 리포펩타이드와 리포좀은 모두 세포상해성 T 세포를 활성화시킬 수 있는 것으로 알려져 있으므로, 이러한 기술은 치료용(therapeutic) 백신 개발 및 다른 종류의 질병에 대한 펩타이드 백신의 개발에도 이용될 수 있다.

Claims (9)

  1. (1) 친수성(hydrophilic) 펩타이드의 N 말단, C 말단, 또는 그 중간 사슬에 지방산을 결합하여 리포펩타이드(lipopeptide)를 제조하는 단계;
    (2) 상기 (1)의 리포펩타이드를 지질 또는 인지질 혼합물과 재조합시키는 단계;
    로 구성되는 것을 특징으로 조합물의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 p26 펩타이드(preS2(120-145))인 것을 특징으로 하는 조합물의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서, 지방산은 팔미트산(palmitic acid), 미리스틴산(myristic acid), 스테아린산(stearic acid), 올레인산(oleic acid), 아라키돈산(arachidonic acid)을 포함하는 지방산 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조합물의 제조방법.
  4. 제 1항의 제조방법에 의해 제조되는 리포펩타이드-인지질의 조합물.
  5. 제 4항에 있어서, 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 p26 펩타이드(preS2(120-145))인 것을 특징으로 하는 조합물.
  6. 제 4항에 있어서, 지방산은 팔미트산(palmitic acid), 미리스틴산(myristic acid), 스테아린산(stearic acid), 올레인산(oleic acid), 아라키돈산(arachidonic acid)을 포함하는 지방산 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조합물.
  7. 제 4항의 조합물을 유효성분으로 하는 예방용 또는 치료용 백신.
  8. 제 7항에 있어서, 조합물은 팔미테이티드 p26 펩타이드-인지질의 조합물인 것을 특징으로 하는 간염 예방용 또는 치료용 백신.
  9. 제 4항의 조합물을 유효성분으로 하는 약물 전달 시스템.
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