JPH02215797A - ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃｌ１．　　　　　ＮＨ＊　　　　　　　　　　　ＮＨ
Ｃ＝ＮＨ １１１Ｈ。

（式中、＊印を付した炭素原子の絶対配置がＬ一配装で
あり、マロニル残基の炭素原子の絶対配置がＬ−又はＤ
一配装である）で表されるタフトシンに類似のレトロ逆
転化合物又は薬学上許容される塩基付加塩又は酸付加塩
を、生体組織における天然又は合成の抗原に対する抗体
応答を促進するためにアジュバントとして使用すること
と共に、アジュバント量の上記一般式（Ｉ）の化合物又
は付加塩の１つと共に１以上の前記抗原を含有するワク
チン用組成物に係る。

「抗原」とは、生体組織に対して外来のものであって、
一旦免疫系と接触すると、一連の複雑な細胞間の相互作
用を活性化させて、該抗原を排除し、以前に存在してい
た平衡を再度確立するような物質を意味する。抗原に関
する代表的な特徴は、免疫原性（すなわち、特異な抗体
の作成を誘導する能力）、及び抗原性（すなわち、誘発
された抗体によって選択的に認識される能力）である。

多くの場合、抗原刺激を起こす生体組織の反応性は投与
法以外に、使用する抗原の用量にも左右される。さらに
、いくつかの抗原では、高用量で使用される場合であっ
ても、低い免疫原性しか示さないことがある。すなわち
、生体に効果的な保護を付与するには充分ではない抗体
応答しか誘発されない。かかる事実は、合成形のワクチ
ンの調製に使用される抗原、又は組換ＤＮＡ技術によっ
て得られた抗原に関して特に適合する。

いずれにしても、抗原の免疫原性は、免疫系に直接作用
することによって、又は抗原の薬動学的特性を変化させ
ることによって抗原に対する抗体応答を促進し、これに
より免疫系との相互作用の時間を増大させる物質（いわ
ゆるアジュバント）と共に前記抗原を投与することによ
って改善される。

ヒトの治療に使用されるワクチンの調製に当たり最も一
般的に使用されているアジュバントはアラム（すなわち
水酸化アルミニウム）である０該アジユバントは、組織
内において抗原の永久性を延長させ、免疫系の非特異的
活性化を発生させる。

しかしながら、特定の合成抗原及び胸腺依存抗原に対す
る効力が乏しいことに加えて、好ましくない副作用（灼
熱感又は激痛の発生率）が存在するため、水酸化アルミ
ニウムの使用は完全には満足できるものではない。従っ
て、特定の抗原に対する免疫応答をインビボで増大でき
、従来技術の欠点が解消された物質が求められている。

発明者らは、一般式（Ｉ） で表される化合物が、１以上の天然又は合成の抗原の投
与前に又は同時に投与される際、好ましくない副作用を
生ずることなく、抗体応答をかなりの程度まで増大でき
ることを見出し、本発明に至った。

上記一般式（Ｉ）において、＊印を付した炭素原子の絶
対配置はＬ一配装であり、マロニル残基の炭素原子の絶
対配置はＬ−又はＤ一配装である。

特に、テストに供した化合物は、Ｎ末端残基から数えて
配列の第１番目、第３番目及び第４番目のアミノ酸残基
又は擬似アミノ酸残基の不斉炭素原子（＊印を付した炭
素原子）の部分においてＬ一配装、及びマロニル残基の
不斉炭素原子の部分において、Ｄ−又はＬ一配装を有す
る２種類のジアステレオ異性体の混合物である。

一般式（Ｉ）の化合物はタフトシンに類似のレトロ逆転
化合物であり、ヨーロッパ特許出願公開第２５３、１９
０号に開示されている。

タフトシンは米国の研究者グループによって１９７０年
に単離された配列 Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ を含有するテトラペプチドである。該ペプチドは、特殊
な免疫グロブリンであるインターロイキンから２種類の
酵素、すなわちタフトシン−エンドカルボキシペプチダ
ーゼ及びロイコキナーゼによって切断される。前者の酵
素は、膵臓において見出される酵素であって、ロイコキ
ニンの環化に作用し、Ａｒｇ−Ｇｌｕ結合を開裂し、こ
れによりタフトシンのカルボキシ末端を解放し、後者は
、好中球、単核球及びマクロファージ（ＭＯ）の膜性酵
素であり、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ結合を開裂し、これによりタ
フトシンのアミノ末端を解放する。

タフトシンの主な生物学的効果は、多核顆粒球及び組織
性マクロファージの多数の機能を促進することであり、
キャリヤーであるロイコキニン分子から遊離される際に
のみ、その活性を発揮する。

マクロファージは貧食細胞である以外に、補助細胞（す
なわち、リンパ球との相互作用による「抗原の提示」が
運命づけられた細胞）として基本的な役割を果たすため
、タフトシンは、免疫系の数種の成分の多形質発現性免
疫調節剤として作用することにより、宿主生物の反応性
に影響を及ぼしうるちのと考えられる。

タフトシンは、貧食細胞の細胞質膜上の特殊なレセプタ
ーと結合し、ついで膜を通過し、細胞質内においていく
つかの細胞質性酵素によって代謝される。かかる酵素の
最も活性なものは、トレオニン残基を開裂して、トリペ
プチド Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ （タフトシンの活性の強力な阻害剤である）を形成する
アミノペプチダーゼである。

上述のヨーロッパ特許出願公開の開示の如く、一般式（
Ｉ）の化合物［該化合物は、国際的レベルで認められて
いる用語によって簡略化して表示すれば、 ｇＴｈｒ−ｍＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＯＨ（ここで、
トレオニン（Ｔｈｒ）の直前の「ｇ」は、かかるアミノ
酸残基が相当するｇｅｍ−ジアミノアルキル誘導体に変
換されたことを意味し、リシン（Ｌｙｓ）の直前のｒｍ
Ｊは、かかるアミノ酸残基が相当するマロニル誘導体に
変換されたことを意味する）で表される］は、タフトシ
ンと実質的に同じ薬理活性が付与されており、細胞質性
ペプチダーゼに対する良好な安定性を有している。

しかしながら、タフトシン（抗原の投与の数日前、適当
な用量で投与される場合にのみ、該特定の抗原に対する
抗体応答をインビボで増大しつる）とは異なり、一般式
（Ｉ）の化合物（薬学上許容される塩基付加塩又は酸付
加塩を含む）は、抗原の投与の数日前に投与される際及
び抗原と同時に投与される際のいずれにおいても、胴線
依存抗原に対する一次抗体応答を増大しうる。

従って、本発明は、１回の投与によって、低用員の免疫
原性抗原で効果的な特異抗体応答を誘発し、又は抗原（
特に免疫原性の乏しい抗原）の用量が同じ場合にも、１
回の投与により完全な免疫を提供するワクチンの調製を
可能にする。

一般式（Ｉ）の化合物（薬学上許容される酸付加塩及び
塩基付加塩を含む）は、タンパク質、多糖又は糖タンパ
ク質構造の１以上の抗原を含有する細菌性又はウィルス
性ワクチンの調製に使用される。複数の抗原を含有する
ワクチンの調製に当っては、１つの病気又は複数の病気
（多価ワクチン）に対する免疫を誘発するために抗原を
使用できる。

さらに、一般式（Ｉ）の化合物（経口投与される際にも
一次抗体応答を増大させる能力が付与されている）は、
適当な抗原と共に、経口ワクチンの調製にも使用される
。天然又は合成の抗原の調製法は、ワクチン組成物の調
製技術と共に、当分野で公知のものと実質的に同一であ
る。

かかるワクチンは、一般に、適当な用量の抗原及び一般
式（Ｉ）のアジュバントを別個に又は併せて凍結乾燥し
、使用時に適当な水性キャリヤー（蒸留水、生理食塩水
、適当な緩衝剤）によって再構。

成することにより調製される。該ワクチンは、他の成分
（たとえば安定剤、防腐剤等）を含有しうる。

経口用の処方の場合には、香料を含有させることもでき
、薬学の技術分野で公知のように、活性物質が胃レベル
で変性及び酵素的劣化を受けることを阻止するため、ワ
クチン全体を胃酸抵抗性の剤形（代表的には胃酸抵抗性
カプセル）とする。

一般に、抗原の使用用量は、従来のものよりも低いか、
又は同等である。これに対して、一般式（Ｉ）のアジュ
バントに関しては、投与法及び使用する抗原の種類に応
じて１μ？ないし１１１９／に９の範囲の用量で所望の
免疫増大効果を発揮する。

アジュバントとして一般式（Ｉ）の化合物を使用するこ
とによって良好に調製されるワクチンとしては、胃酸抵
抗性網形として経口投与される細胞を含有しない抗コレ
ラワクチン及び他の同様のワクチン以外にも、たとえば
細胞を含まない抗百日咳ワクチン、抗ＡＳＢ及びＣ骨膜
炎菌ワクチン、抗多糖肺炎双球菌ワクチン、抗ジフテリ
ア及び抗破傷風ワクチン及び肝炎に対する組換ワクチン
及び細胞質性ワクチンがある。

以下の実施例は、本発明を説明するために例示したもの
であり、本発明の精神を限定するものではない。

実施例１ 生民 一般式（Ｉ）の化合物（ヨーロッパ特許出願公開第２５
３，１９０号の実施例１の開示の如くして得られたもの
）のヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）　（胸腺依存抗体）に対
する一次抗体応答を促進する能力を、Ｃｕｎｎｉｇｈａ
ｍ及びＳｚｅｎｂｅｒｇによって開示された溶血プラー
ク法［「イミュノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）Ｊ　
１４，５９９（Ｉ９６８）コによって評価した。この方
法は、特異な抗５ＲＢＣ抗体を分泌する細胞の数の定量
を可能にするものであり、マウスを５ＲＢＣで免疫し、
免疫したマウスの膵臓から得たリンパ球を免疫に使用し
た同一の抗体と接触させ、最後に補体の添加によって溶
血プラークを証明することにより実施される。

抗原−抗体反応が起る部位では、すなわち特異な抗５Ｒ
ＢＣ抗体を生成する各細胞に応じて、溶解領域の形成が
観察される（プラーク形成細胞：　ＰＦＣ）。

この方法（直接法と称される）により、免疫化剤に対す
る一次抗体応答を代表する１３Ｍクラスの抗体を分泌す
る細胞が明示される。

１３Ｍクラスの抗体を分泌する細胞を、５ＲＢＣ抗原で
明示したラットの膵臓からリンパ球を単離することによ
って定量し、異なる方法に従い、各種用量の一般式（ｉ
）の化合物で処理する。

マウスに酔注する前に、５ＲＢＣ抗原を洗浄し、非発熱
性（ａｐｙｒｏｇｅｎｅｔ　ｉｃ）塩溶液に懸濁化させ
る。

これに対して、一般式（Ｉ）の化合物を、生理食塩水の
殺菌溶液として１回投与当たりの濃度Ｑ、ＯＯ１ないし
１０ｘｇ／ｋｇで、抗原と別個に又は同時に被検動物に
経口及び静脈投与する。マウスに接種する前に、得られ
た溶液を中性ｐｌに調節する。

並行して、一般式（［）の化合物の代りにタフトシンを
使用して同じテストを行う。

免疫後４日で１３Ｍクラスの抗体を分泌する細胞（ＰＣ
Ｆ／膵臓として定量）に基づき、免疫促進活性を証明す
る。

生後１Ｇ−１２週、体重的２５９のＣ３Ｈ／■ｅＮｃｒ
ｌＢＲ近交系雄性マウス３匹でなるグループ（複数）に
、−７日の時点で、非発熱性塩溶液（０、２３１１２）
単独、又は一般式（Ｉ）の化合物又はタフトシン０．１
．１．０及び１０Ｒｇ／ｋｇを含有する溶液を静脈投与
した。０日の時点で、５ＲＢＣ（Ｓｃ　１ａｖｏ社）２
−３ＸｌＯ＠を含有する塩溶液０．２ｇＮを静脈投与し
た。４日後、すべてのマウスを殺し、膵臓を摘出し、リ
ンパ球を分離するため機械的に分離した。この上うにし
て雫離しｌ、：リンパ球を、Ｅａｒｌｅ塩（Ｍ、Ｅ、Ｍ
−ＭＡ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）（３Ｘ　１５＊Ｑ）
を含有する最少量の溶媒で洗浄し、同じ溶媒（ｌｘｆｆ
）に最終濃度１５０，０００（細胞数）で再び懸濁化さ
せた。各細胞懸濁液のサンプル（Ｉ００μＱ）をＭ、Ｅ
、Ｍ、溶媒によりｉ　：１００で希釈し、各希釈液１０
０μＣをマイクロプレートの凹部に充填した（各希釈液
について２サンプル）。各凹部はＭ、Ｅ、Ｍ、溶媒２５
μｅＳｌＯ％５ＲＢｃ懸濁液２５ａ　Ｑ、及び最終的に
１：′６４で希釈してモルモットから得た補体２５μＱ
を収容する。懸濁液全体を、直ちに、毛管現象を利用し
て、各回部から積み重ねたガラススライド上に移した。

スライドをその縁に沿ってパラフィンで密閉し、ついで
恒温オーブン内において３７℃で１時間インキュベート
した。この時間の経過時、ライト−コントラスト・ビュ
ーア−（ｌｉｇｈｔ−ｃｏｎｔｒａｓｔ　ｖｆｅｗｅｒ
）によって、溶血の直接プラーク数（抗体を分泌するリ
ンパ球（ＰＥＣ）の数を示す）を計数した。

このようにして明らかになった抗体は、−次抗体応答を
代表する１ｇＭクラスに属する。５ＲＢＣに対する一次
応答に関する促進効果（直接ＰＦＣ／ＩＩ臓として測定
）を第１図に示′４．図では、抗体のみを投与したコン
トロール動物の応答に対する百分率値として表示する。

得られた結果は、一般式（Ｉ）の化合物（−ｍ−）は、
タフトシン（ローロ）の活性用量の１００倍低い用量で
あっても、かなり高い免疫促進活性を有することを示し
ている。

第１図に報告したデータの統計上の要点は次のとおりで
ある。

一タフトシン０．Ｌｘ９／に９ｖｓ、コントロール：あ
まり重要でない 一他のすべてのグループＶＳ、コントロール；ｐ＜０．
０１ 一一般式（Ｉ）の化合物０．１ｙｉ９／に９ｖｓ、タフ
トシンａＡｘｖ／ｋｖ：　ｐ＜０．０１ 一一般式（Ｉ）の化合物の他のすべてのグループＶＳ、
相当するタフトシンのグループ二あまり重要でない との比較） それぞれマウス３匹でなるグル−プＩこ、０日の時点で
、５ＲＢＣ２−３ＸＩＯ″を含有する塩溶液（０，４ｘ
（２）、又は５ＲＢＣ２−３ｘ　１０”及び一般式（Ｉ
）の化合物又はタフトシフ０．０吋、０．０１．０．１
、ｉ、ｏ及Ｕ】Ｏｘ９／に９を含有する塩溶液（Ｑ、４
ｉｅ）を静脈投与した。投与４日後、上述と同じ方法に
従って、溶血プラークテストを行った。

第２図に報告する結果（第１図に関して述べたものと同
様に表示される）は、一般式（Ｉ）の化合物（−−ＩＩ
）の重要な免疫促進活性（用量に応じて変動し、ｏ、ｉ
ｏ／１ｍこ最大ピークを有する）を示しており、一方、
関連文献（Ｆ　１ｏｒｅｎｔ　ｉｎら、１９８３）にも
報告されているように、これら条件下ではタフトシン（
ローロ）は決して活性でない。

第２図に報告した芦−夕の統計上の要点は次のとおりで
ある。

タフトシンのすべてのグループＶＢ、コントロール：あ
まり重要でない 一一般式（Ｉ）の化合物０，１及びり、Ｏｘｙ／ｋｇ　
ｖｓ、　コントロール：　ｐ＜０．０１ 一他のすべてのグループＶＳ、コントロール二あまり重
要でない それぞれマウス３匹でなるグル−プに、−７日の時点で
、非発熱性塩溶液（０，２３１１２）単独、又は−般式
（Ｔ）の化合物又はタフトシン０．０１．０．ｌ及び１
゜Ｏｚｇ／ｋｇを含有する溶液を経口（胃挿管法）投与
した。０日の時点で、５ＲＢＣ２−３Ｘ　ｊ、０＠を含
有する塩溶液（０，２１１１２）を静脈役すした。４日
後、常法に従って溶血プラークテストを行った。

第３図に報告する結果（第１図に関して述べたものと同
様に表示される）は、テストしたすべての用量（０，０
１ｘ９／　ｋｇにピークを示す）で、一般式（Ｉ）の化
合物（ＩＩ−Ｉｍ）のかなりの免疫促進活性を示してお
り、一方、タフトシン（ローロ）は１．ＯＱ／＆９での
み活性であった。

第３図に報告するデータの統計上の要点は次のとおりで
ある。

一タフトシン０．Ｏ１及び０．ＬＲ９／に９　ｖｓ、コ
ントロール：　　ｐ＜Ｑ、ＯＬ −タフトシンｌｘ９／ｋｇｖｓ、コントロ・−ル：ｐ＜
　０．０１ 一一般式（Ｉ）の化合物のすべてのグループｖｇコント
ロール：　ｐ＜０．０１ ・〜−一般式１）の化合物０．０１及び０．１ｚ９／に
９ｖｓ、タフトシンの相当するグループ：　ｐ＜０．０
１−一般式（Ｉ）の化合物！麓ｇ／ｋｇｖｓ、タフトシ
ンｌｚｇ／ｋｇｘあまり重要でない 定（タフトシンとの比較） それぞれマウス３匹でなるグループに、５ＲＢＣ２−３
Ｘ　１０”を含有する塩溶液（０，２ｘσ）を静脈投与
し、ついで、塩溶液（０，２１１２）単独、又は一般式
（Ｉ）の化合物又はタフトシン０．０１．０，１．１．
０及びＬｏ１ｔｇ／に９を含有する溶液を経口投与した
。投与４日後、上述と同じ操作法に従って溶血プラーク
テストを行った。

第４図に報告する結果（第１図に関して述べたものと同
様に表示される）は、一般式（Ｉ）の化合物（−一閣）
がテストしたすべての用量において抗５ＲＢＣ−次応答
の顕著な増大（０，０１ｚｙ／＆９に最大ピークを有す
る）を誘発することを示した。一方、タフトシン（ロー
ロ）はこれら条件下では決して活性ではない。

第４図に報告したデータの統計りの要点は次のとおりで
ある。

一タフトシンのすべてのグループＶＳ、コントロール二
あまり重要でない 一般式（Ｉ）の化合物のすべてのグループＶＳ。

コントロール：　ｐ＜０．０１ 一一般式（Ｉ）の化合物０１吋及びＯ，ｌｘ９／に９ｖ
ｓ、タフトシンの相当するグループ：　ｐ＜０．０１−
一般式（Ｉ）の化合物ｌ及びｌ０ｚ９／に９　ｖｓ、タ
フトシンの相当するグループ：　ｐ＜０．０：（

【図面の簡単な説明】

第１〜４図は本発明による一般式（Ｉ）で表される化合
物による免疫促進効果を証明するグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、＊印を付した炭素原子の絶対配置がＬ−配置で
   あり、マロニル残基の炭素原子の絶対配置がＬ−又はＤ
   −配置である）で表される、ワクチンの調製におけるア
   ジュバントとして使用される化合物又は薬学上許容され
   る塩基付加塩又は酸付加塩。 ２　アジュバント量の一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、＊印を付した炭素原子の絶対配置がＬ−配置で
   あり、マロニル残基の炭素原子の絶対配置がＬ−又はＤ
   −配置である）で表される化合物又は薬学上許容される
   塩基付加塩又は酸付加塩と共に、天然又は合成の１以上
   の抗原を含有してなる、ワクチン。 ３　請求項２記載のものにおいて、前記抗原がタンパク
   質又は糖タンパク質である、ワクチン。 ４　請求項２記載のものにおいて、アジュバントとして
   前記一般式（ I ）の化合物を使用する、ワクチン。 ５　請求項４記載のものにおいて、アジュバントとして
   、＊印を付した炭素原子の部分で絶対Ｌ−配置、マロニ
   ル残基の不斉炭素原子の部分でＬ−及びＤ−配置を有す
   るジアステレオ異性体の混合物を使用する、ワクチン。