CS131891A3

CS131891A3 - Vaccine

Info

Publication number: CS131891A3
Application number: CS911318A
Authority: CS
Inventors: Christopher L Penny
Original assignee: North American Vaccine
Priority date: 1990-05-07
Filing date: 1991-05-06
Publication date: 1992-02-19
Also published as: WO1991016926A1; HUT65493A; CA2082425A1; MX172210B; ZA913214B; HU9203480D0; NO924271D0; ATE173936T1; EP0597838B1; IL97985A0; AU7777991A; NZ238042A; NO924271L; HRP930658A2; IE911527A1; JPH05506234A; TW221676B; ES2124701T3; FI925032A; DK0597838T3

Description

Tento vynález se týká vakcínových prostředků se zlepše-nou. imunogenicitou. Prostředky podle tohoto vynálezu se vy-značují tím, že .obsahují polypeptidový imunogen v kombinacis alkylovou sloučeninou s dlouhým řetězcem, která fungujejako imunoandjuvans.

Dosavadní stav techniky’

Je dobře známo, že vakcíny jsou důležité pro profylaxionemocnění. Vakcíny fungují tak, že vystavují hostitelskéhoživočicha cizímu materiálu, který· je navržen tak, aby akti-voval imunní systém, čímž udělují hostiteli imunitu na tentoby; byl hostitel wsteven riziku onemocnění. materiál, anižV dnešní době je cro komerční neužití vyvinuto asi dva cel vakcín. Většina těchto vakcín se připravuje detoxikací or-ganismu, který způsobuje onemocnění nebo detoxikací částitohoto organismu. Detoxikace se provádí jedním z několikazpůsobů, jako je například isolace specifické netoxické Čás-ti organismu nebo tím, že se toxická část organismu necházreagovat s chemikáliemi, působením tepla a nebo genetickýmoslabením. Detoxikačnim postupem se často produkují hetero-genní produkty znečištěné toxickými vedlejšími produkty onejistém složení. Důsledkem toho je, že účinnosti nečistýchdetoxikovaných vakcín jako imunogenních materiálů může býtsnížena. Navíc může docházet k nepříjemným a někdy trvalýmškodlivým vedlejším účinkům. Dobře známým příkladem je po-užití neporušené bakterie 3. pertussis jako základu provakcínu dětského Černého kašle. Vakcína, která se běžně po-užívá ve Spojených státech, je v podstatě stejná jako versezavedená kolen roku 1940. Vedlejší účinky mohou být velmirozmanité a to od nepatrných reakcí'až po potvrzené příkla-dy’ paralysy, trvalého poškození mozku nebo dokonce smrti. Příchod rekombinantních a dalších sofistických chemickýchtechnologií usnadnil vývoj čistších a tedy bezpečnějších vakcín. KvůlL této zvýšené čistotě, která často znamená, žepřírodní imunostimulanty byly odstraněny, jsou často tytonové.vakcíny slabé nebo špatně imunogenní, zvláště při sro-vnání se svými předchůdci. Abychom se tomuto efektu vyhnuli,vakcíny se používají společně s imunoadjuvans, která vyvo-lávají zvýšenou tvorbu protilátek.

Jako adjuvans (pomocná činidla, pomocné látky) komerčníchvakcín se v dnešní době používají pouze hlinité a vápenatésoli. Hlinité a vápenaté soli však nejsou silnými imunoad-juvans. Vápenaté soli mají pouze omezené použití a hlinité soli mohou vyvolávat přechodné nebo chronické místní granu-lomy v místě injekce. L. H. Collier v Lancet na stranách 1J64 až I367 (I97O) uvádí, že výskytcíny toxoidu tetanu závisí na čistot; intensita reakci vax-sntigenu a ne příto-;omoc ných mnosti hlinité pomocné látky. Příprava hlinitýchlátek není vždy reprodukovatelná. Navíc samotná hlinitá sůlmůže stimulovat produkci IgB protilátek, které jsou zodpověd-né za vyvolání bezprostředních hypersensibilních reakcí. Ten-to jev byl popsán T. ííatuhssim a spol. : J. Infections Bisease146, 290 (1932). V posledních letech byla soustředěna pozornost na pou-žití organických sloučenin jako pomocných látek. Jenom něko-lik organických sloučenin funguje podobným způsobem jako komer-čně přijatelné anorganické soli, tj. jako pomalu uvolňujícívehikula nebo jako zásobárna antigenu (vakcíny) , při čemž antigen se uvolňuje v místě injekce po poměrně dlouhou dobu.Příklady takových organických sloučenin jsou povrchově ak-tivní činidla a emulgační činidla, jako je například Phero-nics a Tetr-onics, což jsou neiontové blokové kopolymery pó-ly oxy ethylenu a pólyoxypropylenu vyráběné firmou BAS? Cor-poration. Takový pornalu-uvolňující mechanismus pomocných činidelbyl dlouho u člověka akceptován, jelikož snižuje možnost pře-stimulování imunního systému. Přestimulování imunního systé- mu může vést k autoimunní odpovědi,ke které by mohlo dojít při použití jako je například odpověd,silných imunostimulačních činidel, například Freundova adjuvans. Výhodným mechanismem je tedy pomalu-uvolnující mechanismus

činidel jsou silná imunostimulační činidla, máji tato vysoce

dipeptid, což jsou silná imunostimulační činidla. Avšak po- užití obou těchto sloučenin ve výzkumu živočichů je omezeno

nerozpustnou organickou molekulu bez ohledu na náboj a pola-ritu. Ke komplexaci mezi organickým pomocným činidlem a bio-molekulou dochází prostřednictvím různých slabých a neko-

vodíkové vazby.

Tento jev je popsán v USA patentu č. 4 423 932 (Overell)a USA patentu č. 4 258 0294 (Moloney a spol.). Overell popi-suje, že alkyl-tyřosin funguje jako pomocné činidlo při de-sentibilizační terapii alergie, pokud je v komplexu s hetero-geními víceložkovými alergeny o vysokých molekulových hmo-tách, jako je například extrakt z rýže, trav a pylů. Moloneya spol. popisují použití esterů alkoholů s dlouhým řetězcems aminokyselinami jako adjuvans při komplexaci s heterogen-ním vícBožkovým vysokomolekulárním toxoidem tetanu a virempoliomyelitidy (dětské obrny) typu I, II ε III.

Existuje tedy potřeba vývoje prostředků netoxická vak-cína-pomocná látka se zlepšenou imunogenicitou, při čemž aniimunogen ani pomocná látka nejsou toxické»

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká zlepšených vakcínových prostředk-ků, vyznačujících se tím, že obsahují homogenní imunogennípolypeptid a netoxický alkylový imunoadjuvant s dlouhým ře-tězcem. Podle jednoho aspektu tohoto vynálezu se získávávakcínový prostředek obsahující imunogenní polypeptid a ad-juvans, kterými je netoxická sloučenina s dlouhým alkylovýmřetězcem, které jsou přítomny v takovém množství, které jeefektivní pro zvýšení imunogenicity polypeptidu.

Podle jiného afektu tohoto vynálezuvyvolání imunitní odpovědi a to tím, ževočichovi včetně člověka podá efektivníprostředku, podle tohoto vynálezu. se získává způsobse teplokrevnému ži-množství vakcínového

Podle tohoto vynálezu bylo překvapivě zjištěno, že ne-toxické positivně nabité sloučeniny s dlouhým alkylovým ře-tězcem, zvláště estery mainokyselin nebo peptidů, mohou se-lektivním způsobem vázat homogenní polypeptidy. Toto je spe-cifický jev, který závisí na typu aminokyseliny přítomné vnerozpustném esteru a také na typu homogenního polypeptidu.Tato neočekávaná specifičnost je charakteristická pro homo-genní pdypeptidy používané podle vynálezu. Tuto vlastnostnemají pólysacharidy o podobné molekulové hmotě. Podle to-hoto vynálezu bylo zjištěno, že nahradí-li se standardníadjuvans obsahující hliník netoxickou sloučeninou s dlouhýmalkylovým řetězcem, typicxy esterem aminokyseliny s dlouhýmalkylovým řetězcem, může dojít k jednomu nebo více efektůmtýkajících se isotypu produkované protilátky. Jeden efektse týká produkce IgE protilátky. Zvláště tehdy, když se po-užívají prostředky s adjuvans s dlouhým alkylovým řetězcempodle tohoto vynálezu, hladiny IgE protilátky v podstatě ne-jsou zvýšeny a zůstávají na úrovních, které byly zjištěny nepoužívá-li se žádný adjuvans ne rozdíl od zvýšených hladinIgE pozorovaných při použití adjuvans obsahujících hliník. IgEprotilátky jsou zodpovědné za vyvolání bezprostředních hyper-sensitivmích reakcí. Jsou popsány anafylaktické reakce a do-konce smrt jako důsledek IgE produkce při odpovědi na imuni-zaci vakcínou s pomocnou látkou (adjuvans) obsahující hliník.Viz shora diskutovanou práci IVIatahashiho a spol. Pozorovanésnížené hladiny tvorby IgE u prostředků obsahujících pomoc-nou látku s dlouhým alkylovým řetězcem podle tohoto vynálezumají prospěšný terapeutický účinek.

Jiným efektem je skutečnost, že poměr IgG2a protilátky hladiny protilátkových isotypův prostředcích podle vynálezu po-s dlouhým alkylovým řetězcem naobsahujících hliník. Toto zvýšení k IgGl je vyšší nebot obějsou zvýšeny, jestliže seužívají pomocné prostředkyrozdíl od pomocných látek poměru je také prospěšným efektem, neboř IgS2a protilátka je důležitá jako nejúčinnější myší protilátka'vzhledem k akti- vaci doplňkových a natoxických mechanismech protilátkách závislých buněčných cyto·a ochraně proti nádorům a parasitům.

Pojem ‘'homogenní”, jak je používán při definici polypep-tidů používaných ve vakcínových prostředcích podle vynálezu,znamená imunogenní polypeptidové druhy sestávající v podsta-tě z jednoho nebo více epitopů patogenního činidla připra-veného chemickou nebo biologickou syntézou. Jestliže je pří-tomen více než jeden epitop, potom homogenní imunogenní pó-ly peptid bude obsahovat imunodominantní epitop nebo epitopy.Chemická syntéza se používá obvykle tehdy, jestliže je pří-přítomen jeden epitop. Jestliže je přítomno více než jedenepitop, lze použít bučí chemickou nebo biologickou syntézu.Homogenní polyj^tid může obsahovat další části patogenníhočinidla, které nejsou toxické a neovlivňují nepříznivě imuno-genicitu homogenního polypeptidu.

Hetoxň-cká pomocná látka znamená s výhodou positivněnabitý ester aminokyseliny nebo peptidu, zvláště esteralkylalkoholu se čtrnácti až dvaceti atomy uhlíku s amino- kyselinou, dipeptidem nebo tripeptidem.

Homogenní imunogenní polypeptid používaný v prostředcíchpodle vynálezu je netoxický a schopný vyvolávat imunní od-pověď v hostiteli. Imunogenní polypeptid sestává v podstatěz jednoho nebo více epitopů odvozených od patogenních činidelzodpovědných za AIDS, hepatitidu A, hepatitidu B, hepatitiduG, tetanus, polio (dětská obrna), černý kašel (toxin LPI:Lymphocytosis Promoting Pactor), herpes simplex, syncy.ciálnívirus, spalničky, virus chřipky, rabies (vzteklina), aréna-virus (”lassa fever“)» rotavirus, adenovirus, rhinovirus,onemocnění nohou a úst, virus leukemie hovězího dobytka akoček, virus dobytčího moru, virus horečky dengue, klíšto-vé encefalitidy, malarie a virus parainfluenza. V mnoha ořiosdech ;adou odifkovat orirozene se vyskytující aminokyselinovou sekvenci polypeptidového imuno-genu, aby byl homogenní polypeptid užitečnější ve vskcíno-vých prostředcích a při tom neměnil své imunogenní vlast-nosti. líži příklady takových změn patří modifikace aminoky-selinových postranních řetězců, aby se napodobily post-tran-slační modifikace nebo aby se změnily chemické vlastnostiimunogenu. Je možné modifikovat polypeptid také proto, abyse zvýšila doba života imunogenu in vivo. Navíc je možnépřidat cysteinový zbytek na aminový nebo karboxylový konecpolypeptidu, aby se usnadnila kondenzace polypeptidu s nos-ným proteinem. Těmito změnami nebo modifikacemi mohou být inserce,delece a substituce, a to buú konservativní nebo nekonserva-tivní. Lfezi takové změny patří kombinace přirozeně se vysky-tujících aminokyselin používaných pro syntézu proteinů, ja-ko je například gly, ala; val, ile, leu; a os, glu; snís, gin;ser, thr; lys, arg; phe, tyr; ais, ser; ais, thr;. ala, vsi;ala, pro; ala, glu; leu, gin; gly, phe; ile, ser; ile, met.

Imunogenní homogenní polypeptid může být připravován,jakýmkoliv vhodným způsobem. Polypeptid může být připravován rekombinantními nebo synthetickými technikami nebo jejichkombinacemi. Známé rekombinantní techniky jsou popsány vknize: “Ivíolecular Cloning. A Laboratory Manuel”, Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1932, T.

Maniatis a spol. Lze nepříklad navrhnout buňku, která budenadexpresí poskytovat žádaný polypeptid transfekcí genem,který tento polypeptid kóduje.

Mezi vhodné methody chemické syntézy patří syntéza vpevné fázi nebo v roztoku nebo enzymatická syntéza. Vhodnépostupy jsou popsány v "Principles of Peptide Synthesis”,Springer Verlag, 1934, M. Bodenszky a '"Solid Phese Peptide

Synthesis”, druhé vydání, 1984, Pierce'Chemical Company,John Morrów Stuert and Janis Dillaha Young.

Polypeptid můžeProdloužen nebo jinak být známými technikami buň zkrácen,modifikován. Nevíc, oolyp^etid může být bud lineární nebo cyklic. čištění imunogenního polypeptidu se může provádět ja-kýmkoliv obvykle používaným způsobem. Lze použít jakoukolivchemickou nebo biochemickou metodu, která ničí nebo odstraňu-je jiné biomolekuly a nežádoucí materiál a při tom ponechávážádaný imunogenní polypptid neovlivněn. Imunogenní polypeptidse s výhodou čistí chromátografickými způsoby. Zvláště semohou používat takové chrométografické způsoby, jeko je na-příklad dělení ne základě velikostí, chrometografie na ion-toměniči, afinitní chromátografie nebo nejvýhodněji vysoko-účinná kapalinová chromátografie nebo jejich kombinace.Čistotu imunogenního polypeptidu lze ověřit gelovou elektro-foresou.

Imunogenní polypp.etidy by měly mít dostatečnou velikost, v/ aby je bylo mošno rozeznávat hostiteli a identifikovat jako cizí. Imunogen má obvykle molekulovou hmotnost alespoň 10 000.

Jestliže je polypeptid pod kritickou velikostí,,,která je roze-ná znávána příslušným hostitelem, polypeptid roušii napojen na no-sič, což způsobí, že konjugát polypeptid-nosič bude imunogen-ní. Výhodnými nosiči jsou proteiny. Výhodnými nosiči pro pou- žití u živočichů jsou hovězí serumalbumin a XLH (KeyholeLimpet Hemocyenin). kezi nosiče vhodné pro použití u člově-ka patří toxoid tetanu, toxoid difterie, nebuněčná vakcínačerného .kašle (LP?), zkříženě reagují materiály (CRk), kteréjsou antigenně'podobné bakteriálním toxinům, ale’nejsou to-xické pro mutaci, s výhodou ΟΞΜ-,θ?, který byl získán podlePappenheimera a spol.flmmunological Study of the DiphtheriaToxin Molecule”, Imunóchemistry 2» 391 až 906 (1972), a dal-ší nosiče baktériálních proteinů, například meningokokovýprotein vnější membrány. Rosným proteinem je s výhodou sámimunogen.

Polypeptid může být na nosič navázán jakýmkoliv vhodnýmzpůsobem známým odborníkům. I když použití symetrického lin-keru, jako je například alkyldialdehyd (například glutaral-dehyd) nebo alkyldiimidát (například dimethylsuberimidát) jev rozsahu tohoto vynálezu, je výhodné používat heterobifun-kční linker. Eeterobiíunkční linker zabezpečuje, že k navá-zání polypeptidu na nosič dochází definovaným a reprodukova-telným způsobem s vyhnutím se vedlejším reakcím, jako jenapříklad zesilováni molekul nosiče, což by vedlo k nečistýmheterogenním prostředkům. Mezi příklady heterobifunkčníchlinkerů patří K-sukcinimidyl-$-(2-pyridyldithio)propionát,který popsal J. Carlsson a spol.: Biochem. J. 17$, 72$ až7$7 (1978) a sulfosukcinimidyl-4-(p-meleinimidofenyl)butyrát,který popsal J.'D. Bangs a spol.: J. Cell .Biology 10$, 25$až 26$ (1986). Rejvýhodnější jA7$-^8-maíeiňimiíomethyl)cyklo-hexán-l-karboxylát, který popsaVS, Ksshida a spol.: J. Ap-plied Biochem. 6, $6 až 6$ (1984). Příklady vhodných homogenních polypeptidů jsou takovépolypeptidy, které sestávají v podstatě ze stejné aminokyse-linové sekvence jako povrchový antigen viru hepatitidy, jakoje například homogenní polypeptid sestávající v podstatě zestejné aminokyselinové sekvence jako povrchový antigen viruhepatitidy B. Jiným příkladem je homogenní polypeptid sestá-vající z jednoho nebo více epitopů povrchového antigenu he- patitidy. Dalšími pří] •dy jsou: homogenní polypeptid stá- vající v podstatě se stejné aminokyselinové sekvence jako povrchový antigen podjednotky gD viru herpex simplex, homo-genní polypeptid sestávající v podstatě z jednoho nebo víceepitopů gpl20 viru lidské imunodeficience, homogenní poly-peptid sestávající v podstatě z jednoho nebo více epitopůgp41 viru lidské imunodef icience nebo homogenní polypeptidsestávající v podstatě ze stejné aminokyselinové sekvence jakoLPF (Lymphocytosis Fromoting Factor).

Pomocné činidlo s alkylovou skupinou s dlouhým řetězcem,stejné jako jakékoliv sloučeniny pocházející z metabolismuv hostiteli, by měly být netoxické. Je dobře známo, že mast-né alkoholy s dlouhým řetězcem jsou přirozeně se vyskytujícínetoxické sloučeniny. Jako příklad lze uvést oktadekanol,o kterém bylo zjištěno, že je pro člověka naprosto netoxic-ký. To ukazuje hodnota orální LD^q, která je větší než15 g/kg (Gosselin: "Clinical Toxicology of Commercial Pro-ducts", 4. vydání, 1976.)«, Bylo zjištěno, že oktadecy 1-tyro-sin jě pro živočichy netoxický. Většina přirozené se vysky-tujících aminokyselin není toxická (0. L. Fen.n^’ a spol. :Vaccine 4, 99 sž 10 (1986).). Lze tedy očekávat, že okta- decyltyrosin a estery jiných alkoholů s aminokyselinami ne-budou vykazovat u lidí žádnou toxicitu.

Pomocná látka by měla být schopná vytvořit mikročásti-ce o velikostech mezi asi 150 yum a 1 mm, s výhodou 250ve vodném prostředí. Získá se tak jednotná suspenze. Navícby mikročástice pomocná látky měly umožnit adsorpci imuno-genu a tím umožnit pomalé uvolňování imunogenu do hostitele.

Ve výhodném uspořádání podle tohoto vynálezu se jako po-mocná látka používá sloučenina obecného vzorce E 0 C - b - R ’

I

D v němž C znamená atom vodíku, zbytek aminokyseliny nebo zbytek pep-tidu včetně zbytku s až deseti aminokyselinami (tj. až dodekapeptidu), D znamená atom vodíku nebe .farmaceuticky přija- - 10 - tenou sůl, jako je například sůl s kyselinou chlorovodíkovou,kyselinou bromovodíkovou, kyselinou fosforečnou, kyselinousírovou, kyselinou mléčnou nebo kyselinou octovou, E zname-ná 2-h.ydroxybenzylovou skupinu, benzylovou skupinu, 4-hy-droxyf enylovou skupinu, fenylovou skupinu, 4-aminobutylovouskupinu, isopropylovou skupinu, methylovou skupinu, atom vo-díku nebo jiný zbytek přirozeně se vyskytující aminokyseliny,á znamená skupinu , atom kyslíku nebo skupinu CH^O, B znamená skupinu nebo atom kyslíku, při čemž n zna- mená číslo nula až'čtyři a 1 neznamená stejnou skupinu jakoB v případě, že znamená skupinu nebo atom kyslíku, a R znamená alkylovou skupinu s dvanácti až dvaceti atomy u-hlíku. C znamená s výhodou bud atom vodíku, aminokyselinu, di-peptid nebo tripeptid. Jestliže C znamená aminokyselinu,pak aminokyselinová sekvence pomocné látky může být vybránaz následujících příkladů: tyrosyl-glycin, glycyl-glycin,glycyl-tyrosin nebo fenylalsnyl-glycin. Jestliže C znamenádipeptid, pak aminokyselinová sekvence pomocné látky můžebýt vybrána z následujících příkladů: tyrosyl-glycyl-glycinunebo tyrosyl-alanyl-glycinu. Jestliže aminokyselinový zbytekje chirální, lze použít D-enanciomer, L-enanciomer nebo je-jich směsi. Je zvláště výhodné, jestliže pomocná látka ob-sahuje alfa-aminokyselinu.

Zvláště výhodné je, jestliže E znamená skupinu vybra-nou ze skupiny sestávající ze 4-hyaroxybenzylové, benzylové,4-hydroxyfoyjnlové, fenylové skupiny a atomu vodíku. B znamená nej-výhodněji 4-hydroxybenzylovou skupinu.

Jestliže á znamená skupinu CHo0 a 3 znamená skupinutyto/ 2 ^C^2^n’ Paic sloučeniny znamenají E-aminoacylethanolamin-O-stearáty. Jestliže Λ znamená skupinu GHgO a B znamená atomkyslíku, pak tyto sloučeniny znamenají uhličitany. Výhodněji znamenáminokyseliny, kde C zn pomocná látka hydrochlorid esteru a-mená atom vodíku, D znamená kyselinu - 11 - chlorovodíkovou, A znamená skupinu (°¾) , kde n znamená čí-slo nula až čtyři a B znamená atom kyslíku.

Nejvýhodněji pomocná látka znamená hydrochlorid oktade-cyl-tyrosinu, kde C znamená atom vodíku, D znamená kyselinuchlorovodíkovou, E znamená 4-hydroxybenzylovou skupinu, Rznamená oktadecylovou skupinu, A znamená skupinu (0¾) , kde n znamená číslo nula, a B znamená atom kyslíku. (az.

Jestliže C^znemená atom vodíku, pak základ pomocné lát-ky obsahuje v podstatě peptidové vazby, tj. karboxylováskupina jednoho aminokyselinového zbytku je přímo navázánana aminovou skupinu přilehlého zbytku způsobem hlava-pata.Peptidová vazba může znamenat také thioamid. jak popisuj

Pomocná látka se může připravovat jakýmkoliv vhodnýmzpůsobem. Například aminoesterová část pomocné látky semůže syntetizovat jakýmkoliv z četných uvedených způsobů,m. Bodanszky a spol.: "Peptide Synthesis", "Peo- druhé vydání, Wiley, Neu York 1976,'a R. W. Poesketides" (N. Y.) 102 (1981). Zvláště výhodným způsobem je esterifikace kata. lyžovaná methensulfonovou kyselinou popsanáC. Penneyem a spol.: J. Org. Chem. 50, 1457 až 1459 (1985).

Jestliže pomocná látka znamená di- nebo tri-peptid,může se peptidová vazba vytvořit jakýmkoliv z postupů shorapopsaných v "Peptide Synthesis". Peptidová vazba se může vy-tvořit také podle postupů připravených pro práci v pevnéfázi nebo v roztoku. Existuje mnoho postupů a reakčních či-nidel, která jsou užitečná pro tvorbu amidových, thioamido-vých a thioesterových vazeb. Během přípravy pomocné látky může být žádoucí dočasněchránit reaktivní' funkční skupiny. Například aminy mohoubýt chráněny jako skupiny urethanového typu, alkoholy terč.butylovými nebo beazylovými skupinami a kyseliny jako esterové skupiny. Vhodné podmínky pro chránění a cdtraňování chrá-nících skupin jsou popsány ve shora uvedene citaci "PeptideSynthesis". - 12 -

Pomocná látka se může vyčistit jakýmkoliv dřivé popsanýmzpůsobem. Výhodným způsobem čištění je chromatografie na šilikagelu, zvláště způsob nazývaný ”flash” chromatografie (ry-chlá chromatografie), kterou popsali W. Clark Still a spol.:J. Org. Chem. 43, 2923 až 2925 (1978). Pro čištění pomocnélátky je možno použít také jiné chromatografické způsobyvčetně HPLC. Pro čištění pomocné látky je možno použít takékrystalizaci. V některých případech není potřeba žádné čiš-tění, neboř produkt se získává přímo při syntéze v analytickéčistotě·

Vakcínové prostředky podle vynálezu se připravují fyzi-kálním smícháním pomocné látky s homogenním imunogenním pó-ly peptidem za příslušných sterilních podmínek v souladu seznámými způsoby pro přípravu prostředku s pomocnou látkou.

Jak bude ze shora uvedené diskuse zřejmé, imunogenní polypep-tid se smíchá s pomocnou látkou bu3 samotnou nebo s vhodnýmnosičem. množství pomocné látky a množství homogenního polypeoti-dového imuncgenu, bud samotných nebo navázaných na nosič,která jsou potřebná pro vyvolání imunní odpovědi u člověka,se uved^ou do vzájemného vztahu, ale jsou při tom v rozme-zích obvykle používaných v konvenčních vakcínách. Napříkladpoužitím zvýšených množství pomocné látky můžeme předpokládatpoužití snížených množství imunogenu a neopij. Výhodným množ-stvím pomocné látky je 0,01 až 5 mg/ml prostředku, například0,05 mg/ml až 3 mg/ml, s výhodou 0,5 až 1,0 mg/ml. Výhodnýmmnožstvím imunogenu je množství mezi asi 1 až 100 /Ug/ml, svýhodou asi 5 až 40 ,ug/ml. Dávkování bude záviset na hosti-teli, ktere/oude vakcína podavana, stejně jako na takovýchfaktorech, jako je velikost, hmotnost a věk hostitele.

Vakcínové prostředky podle tohoto vynáoezu se mohou for-mulovat způsoby podobnými způsobům používaným u jiných farma-ceutických polypeptidových prostředků. Pomocná látka a·imuno-gen se tedy mohou skladovat tedy v lyofilizované formě arekonstituovat ve fysiologicky přijatelném vehikulu. Získá se - 13 - tak suspenze vhodná pro podávání. Pomocná látka a imunogense také mohou ve vehikulu skladovat. Výhodnými vehikuly jsousterilní roztoky, zvláště sterilní pufrované roztoky, jakoje například fosforečnanem pufrovaný solný roztok. Vhodný jejakýkoliv způsob kombinace pomocné látky s imunogenem ve ve-hikulu, kterým se zachovává imunoreaktivita.

Toto vehikulum může obsahovat ochranná činidla nebojiná aditiva, která^SSžívána pro zlepšení stability nebo ú-činnosti směsi. ívíezi vhodná ochranná činidla patří napříkladthiomersal.

Objem jednotlivé dávky vakcíny podle vynálezu může býtrůzný. Obecně se ale bude pohybovat v rozmezích obvykle po-užívaných u konvenčních vakcín. Objem jednotlivé dávky je svýhodou mezi asi 0,1 ml a asi 1,5 ml, nejvýhodněji mezi asi0,2 mi a asi 0,5 ml při shora uvedených koncentracích imuno-g e nu a pomocné 1átky.

Vakcínové prostředky podle tohoto vynálezu se mohou po-dávat jakýmikoliv vhodnými prostředky. mezi výhodné způsobypodávání patří subkutánní, intramuskulární, intradermálnía nosní podávání. Směs se může uvolňovat také z biodťfandova-telného implantu (štěpu). Lze použít jediného podávání, pro-středek lze však také podávat po dobu několika dnů nebo týdnů. Příklady provedení vynálezu

Tníeto vynález je ilustrován následujícími neomezujícímipříklady. Příklad 1

Tento příklad popisuje přípravu homogenního povrchovéhoantigenu hepatitidy 3 (HB&Ag). Pekombinantní HBság byl iso-lován z lidských JT3 buněk, které byly transfektovány povr-chovým antigenem viru hepatitidy 3, který byl získán od IúountSinai School of Medicine LSells a spol.: "Producticn of He- 14 - patitis 3 virus particles in HepG2 cells transfected withcloned Hepatitis 3 virus DNA”, Próc. Hati Acad. Sci. USA34, 1005 (1987).J. Buňky bylý kultivovány v mediu EPIvU (Gibco)dóp^ěném 10 % FCS (Gibco), 1 mlw pyrohroznanu sodného a 0,5 %gentamycinu. V tomto okamžiku se mohou použít dva postupyčištění, jmenovitě odstřelování v hustotním gradientu neboimunoafinitní chromátografie. Při odstřelování v hustotnímgradientu se buněčný supernatant odstřeuůje při 2000 otáč-kách za minutu, aby se odstranily všechny celé 5'I’5 buňky.Potom se antigen vyčistí vysrážením polyethylenglýkolém (mo-lekulová hmota 8 000) při koncentraci 10 % (hmotnostní dílyk objemovým dílům). Výsledná peleta se resuspenduje v TNEpuřru (10 mít Tris.HCl (pH 3,0), lOOmlví KaCl, Jmli EDTA (pH8,0)) a odstřeďuje se v gradientu 20 % až 50 % (hmotnostnídíly k objemovým dílům) chloridu sodného v TEH pufru vSW41 polyalomerových zkumavkách. Gradienty se odstřeuujíoři 55 000 otáčkách za minutu po teplotě 4 °C. Ze dna zkumavky se stanoví řefraktometrem. Frakce, které mají hustotu mezi1,551 až 1,558, se spojí, dialyzují se proti P3S, zahustí aanalyzují na koncentraci homogenního HBsAg pomocí sady AblotPIA kit, při čems se jako positivní kontrola používá ekviva-lent 20 n^/ml antigenu.

Lobu po dobu 60 hodin přiseberou frakce. Hustota se

Imunoafinitní chromatografie se obvykle provádí tak, žese odstřeauje buněčný supernatant při 2000 otáčkách za minu-tu po dobu deseti minut, aby se odstranily všechny celé 5T5buňky. Anti-HBsAg afinit^ní kolona), která se připraví tak,že se anti-HBsAg monoklonální protilátka kovalentně navážena bromkyanem aktivovanou Sepharosu CL4B, se promyje P3S.Zkontroluje se OOgSCnm eluentu, která by měla být menšínež 0,010 ΙΟΙ^θθ znamená optickou hustotu (absorbance)při 280 nm.J. Supernatant se nechá projít dvakrát kolonou,aby bylo zajištěno, že antigen se na kolonu naabsorbuje.

Kolona se pak třiiFát promyje, aby se odstranily veškerénespecifické navázané proteiny na kolonu (zkontrolovat: O.D.2g0 nn je menší než 0,01), následuje'eluce hydrochloridemglycinu (pH 2,8). Připraví se deset zkumavek s tri$ pufrem - 15 - (pH 11) v každé zkumavce, kterého je dostatečné množství prozneutralizování 2ml frakce hydrochloridu glycinu. Optickouhustotou při 280 nm (O^qq nm) nebo změřením HBsAg metodouRIA bylD analyzováno’deset zkumavek. Frakce, které obsahujíhomogenní polypeptid, se spojí a dialyzují proti PBS. Kolonase promyje třikrát pBS. Kolona se skladuje v PBS s a židemsodným. Příklad 2 V tomto příkladu je popsán obecný způsob komplexacehomogenního polypeptiduvého imunogenu s imunoadjuvantem,jímž je alkylester aminokyseliny, kde alkylová skupina zname-ná skupinu s dlouhým řetězcem.

Imunoadjuvans, jímž je alkylester aminokyseliny, kdealkylová skupina znamená skupinu s dlouhým řetězcem, (>0 mg),se umístí v 2pml nebo v malé Srlenmayerově baňce s tyčovýmmíchadlem uzavřené bavlněným smotkem nebo jiným volným utěs-ňovacím materiálem. Imunoadjuvans ve formě soli se sterilujezahřátím v peci na příslušnou teplotu (která je dána teplotoutání) dvacet hodin. Do ochlazené baňky se přidá fosforečnanempufrovaný sdný roztok (25 ml). Výsledný roztok se sterilujefiltrací (více než 50mM, pH = 6 až 7). Výsledná suspenze semírně míchá tři až dvacet hodin. Smotek se nahradí skleněnouzátkou a vše se skladuje při teplotě 4 °C, dokud není potře-ba pro komplexaci.

Aby se vytvořil komplex imunoadjuvans s homogenním poly-peptidem, suspenze se zahřeje na teplotu místnosti a řádně seprotřepe. Potřebný objem suspenze se přenese pipetou se širo-kým otvorem do stejného objemu poly^peptidového roztoku ato tak, aby konečná koncentrace imunoadjuvans byla 1 mg/ml.Objem lze však podle potřeby upravit tak, aby se získala ja-kákoliv jiná žádoucí koncentrace imunoadjuvans. Suspenzeimunoadjuvans - polypeptid se mírně míchá přes noc při 4 °C.Ka konci komplexační reakce se suspenze nechá usadit a od-střeňuje se, je-li to nutné. Množství nenavázaného polypep- 16 tidu se stanoví změřením absorbsnce supernatantu při 230 nm.Dobrý imunogenní komplex imunoadjuvans-polypeptid obvýkleznamená, že 30 až 90 % polypeptidu je navázáno. Příklad 3 Ténto příklad ukazuje použitelnost některých oktadecyl·esterů aminol^selin jako pomocných látek (adjuvans) homogen-ního polypeptidu, který je kandidátem vakčíny hepatitidy. ve 100 yUg oktadecylesterupsaným v příkladu 2. Tato £

Myši BALB/c se imunizují 50 ng povrchového antigenuhepatitidy B v přítomnosti pomocné látky u nekontrolních my-ší a v nepřítomnosti pomocné látky u kontrolních myší» Povr-chový antigen hepatitidy 3 byl získán z 373 buněk transfek-továných genem povrchového antigenu. Byl připraven komplexrinokyseliny postupem shora po-paauyui v prxiufcuu ¢:. lauu toiuSS (o Celkovém ODjemU 0,1 ml)byla podána injekcí (intramuskulárně) první den. myším byla 3., 35. , 4p. a 61, den. Myším odebrána krev 7., 14., 21.,bylo 21. den podáno '35 ng póly ;tidn

Koncentrace protilátky v seru se stanovuje radioimuno-analýzou. Koncentrace protilátky se vyhodnotí srovnáním sestandardní křivkou získanou pomocí monoklonální protilátky.Výsledky jsou uvedeny v tabulce I.

Tabulka I

Protilátková odpověá na povrchový antigen hepatitidy 3 vpřítomnosti oktadecylesteru aminokyseliny jako imunoadjuvans adjuvans den 7. 14. 21. 28. 35. 61. sůl 43 33 32 61 59 58 hlinitá sůl 44 53 46 163 320 516 oktadecyltyrosin 63 51 53 355 855 752 oktadecyl-3-slanin 31 45 44 120 357 573 okta de cy1gly vin 47 33 51 147 743 301 - 17 -

Tabulka I (pokračování) adjuvans den+ 7. 14. 21. 28. 55. 61. oktadecylgSoIin 49 35 41 72 409 163 oktadecylleuc in 48 42 37 160 590 496 oktadecyllysin 33 55 39 51 67 53 oktadecylf orf enicino 131 40 25 65 30 6 93 oktadecylforfenicin 1® 112 116 903 592 355 + Koncentrace anti-EEság protilátky (ng/ml)

Sekvence aminokyselin 1 sž 226 (HBsAg-adv; S genovýprodukt) povrchového antigenu hepatitidy 3 je popsána Bhat- nagarexn. P. K. aož 4404 (1932); spol.: Proč. Kati. Acad. Sci. USA 79» 4400tato práce je zde zahrnuta jako odkaz. vý sledkv v bule ;zuar, že účinek oomocné 1; pozorovaný mezi alkylestery aminokyseliny (kde elkylová sku-pina znamená alkylovou skupinu s dlouhým řetězcem) a imuno-genním polypeptid.es, povrchovým antigenem hepatitidy 3, jespecifický jev. To lze- vidět ze srovnání oktsdecyltyrosinu a oktadecyllysinu a srovnáním okte.decyl-f orf enicinolu a ok- tadecyl-forfenicinu. Příklad 4

Tento příklad ukazuje použitelnost oktadecyl-tyrosinuve funkci pomocné látky (adjuvans) jako funkci dávky poly-peptidu, který je kandidátem vskcíny hepatitidy.

Postupuje se jak shora popsáno až na to, že se myši imu-nizují 80 ng povrchového antigenu hepatitidy B, přidá se 50 nga krev se odebere 7.» 14., 23. a 35· den. Imunizace se pro-vede v přítomnosti pomocné Itáky u nekontrolních myší a vnepřítomnosti pomocné látky’ u kontrolních myši. Výsledky jsouuvedeny v tabulce II. 18 -

Tabulka II

Protilátková odpověů na povrchový antigen hepstitidy S vpřítomnosti oktadecyltyrosinu adjuvsns % adsorbova-ného anti- - den+ 14. 21. 28. . 55« genu 7» sůl 0. 188 40 15 2538 702 áSlum. 75 880 761 659 12510 8726 ICO /Ug 70 1107 557 1279 19679 15427 50 /Ug 60 2064 846 4000 18804 20616 10 /Ug 55 611 2514 542 8405 10005 + CPM, hodnota před odebráním krve byla 11,5 Výsledky v tabulce II ukazují, že účinek pomocné látkyje závislý na koncentraci esteru s alkylovou skupinou s dlou-hým řetězcem, oktadecyl-tyrosinu, přítomného v prostředku.Jakmile se množství podávaného pomocného činidla zvýší,dojde k.úměrnému zvýšení titru protilátky? a to až do opti-mální hodnoty titru. Za touto hranicí se titr protilátky Příklad 5

Tento příklad ukazuje použitelnost oktadecyltyrosinujako pomocné látky jako funkci dávky? a (u různých živočichů)polypeptidu, který odpovídá napojitelné sekvenci z obalovéhoproteinu viru lidské imunodeficien.ee, HIV-1» 1) HIV peptidová sekvence

Peptidová sekvence HIV byla následující: Produkt: 30-101505- K-Val-áls-Pro-Thr—Lys-Als-Lys-Arg-árg-Ve1-Vsl-Gln-Arg-Glu-Lys-Árg-Als-Vsl-Gly-Ile-Gly-Ala-Leu-Phe-Leu-Gly-Phe-Leu-Gly-ála-áls-Gly-Ser- 555 holekulová hmota: 55θ5,1Ί (základ) - 19 - 2) Pokusy na myších

Myši BALB/c byly imunizovány 100 ^ug chemicky synteti-zovaného polypeptidu (odpovídajícího aminokyselinové sek-venci zbytků 503 až 535 HIV-1) nakondenzovaného na ELH (Key-hole Limpet Hemocyanin). Připraví se komplex hydrochloriduoktadecyltyrosinu (10 yug až 100 yug) s polypeptidem jakshora popsáno v příkladu 2. Tato směs (o celkovém objemu0,1 ml) se podá injekčně 1. den a opět 21. den. Myším se ode-bere krev 7., 14., 21., 28. a 35· den.

Koncentrace protilátek v seru byla stanovována rádio-imunoanalýzou. Koncentrace protilátek byla vyhodnocovánasrovnáním se standardní křivkou získanou pomocí polyklo-nální protilátky. Výsledky jsou uvedeny v tabulce III o

Tabulka III

Protilátková odpověž na ELV-l polypeptid (zbytky 503 až 535)v přítomnosti oktadecyltyrosinu aujuvsím 7. 14. 21. 28. 35. sůl 1,04 0,84 1,03 8,56 11,19 alum. 1,55 5,54 3,16 86,6 82,1 100 /Ug 0,87 1,65 2,04 155,3 133,0 50 /Ug 1,18 0,75 2,59 54,2 86,2 10 /Ug 1,61 3,15 1,49 35,9 131,9 + Koncentrace anti-peptidové protilátky (yug/ml). Výsledky v tabulce III ukazují, že alkylester s dlouhýmřetězcem, oktadecyltyrosin, vykazuje na koncentraci závislývliv pomocné látky s jiným imunogenním polyffptidem, konkrét-ně polypeptidem odvozeným od aminokyselin 503 až 535 HIVproteinu gp41. Opět se dosáhne optimum titru protilátky,po němž se titr nezvyšuje. 3) Pokusy na. paviánech

Dva paviáni byli imunizováni 300 ^ug cremicky synteti-zovaného polypeptidu (odpovídajícího aminokyselinové sekvenci - 20 - zbytků 505 až 555) HIV-1) nekondenzovaného ns KLH (Keyhole

Limpet Hemocyanin). Připraví se,komplex hydrochloridu okta-6 decyltyrosinu (500 /us) s polypeptidem jak shora popsánov příkladu. 2. Tato směs (o celkovém objemu 1,0 ml) se podáinjekčně 1. den a opět 55· den. Zvířatům se odebere krev dny před první imunizací, 14. den, 52. den. a 49. den.Tentýž pokus se provede s jinými dvěma paviány, ale s poly-peptidem odpovídajícím aminokyselinové sekvenci 526 až 555z HIV-1.

Koncentrace protilátek v seru byla měřena nepřímo ra-dioimunoanalýzou. Titrace se provede inkubací vzorku na des-kách potažených konjugátem peptid-albumin a reakcí s králi-čím protiopičím imunoglobulinem označeným jodem-125. Výsledkyjsou uvedeny v tabulce IV.

Tabulka IV

Protilátková odp ověu na HIV- 1 pólypeptid u paviánů v příto- mnosti 5θθ yug hydrochloridu okta decyltyrosinu pólypeptid zvíře 1 zvíře 2 den* den* -5. 14. 52. 49. -5. 14. 52. 49- 505 až 555 1020 2004 2185 5943 1550 2160 2121 447Ο 526 až 555 500 686 1685 5121 220 '500 965 4575 + CPÍď, po odečtení pozadí na deskách potažených hovězím se-rumalbúminem Výsledky v tabulce IV ukazují, že u vyšších zvířat,například u paviánů, je pozorován účinek pomocné látky mezialkylesterem s dlouhým řetězcem, oktadecyltyrosinem, a i-munogenním HIV oolyoeotidem. Příklad 6

Tento oříklsdu ukazuje změnu isotyou. které dochází, - 21 - jestliže přejdeme od vekcíny (která je kandidátem vakcínyhepatitidy), která má jako má jako pomocnou látku hlinitousloučeninu, k vakcině, která má jako pomocnou látku oktadecyl-tyrosin.

Postup byl popsán v sekci 2 (myši) přikladu 5 aí ní co. že se jak' při primární tak sekundární (21. den) imunizacipoužívá 50 /Ug oktadecyltyrosinu. Isotyp protilátkové odpo-vědi se stanoví radioimunoanalýzou. Používá se protimyšíisotypová protilátka značená triciem. Titrace se provedeinkubací vzorku na deskách potažených imunoaíinitně vyčiště-ným povrchovým entigenem hepstitidy 3. Výsledky1 uvedené jalcoradioaktivita (počet impulsů za minutu) vázané isotypovéprotilátky1 jsou uvedeny v tabulce V.

Tabulka V

Isotypová variace protilátkové odpovědi povrchového anti-genu snti-hepatitidy 3 imuni-zace 1.a 21.den v: den ode- brá- ní krve IgM • • IgG3 IgGl IgG2b IgG2a IgB -1 587+81+ 201+36 205+41 324+42 471+80 30+11 sůl 14 475+102 216+38 208+11 185+29 286+66 19±53 55 568+50 409+85 2541+127 1453+99 2856+448 59+53 42 437+84 154+20 1926+129 628+59 1486+173 34+8 alum. 14 250+8 123+10 417+107 280+34 333±41 29+1 55 695+48 1750+125 5542+352 3100+650 2808+73 f 706+106. 42 272+149 138+24 2048+142 1782+166 2378+57 : L825+154 OT 14 347+37 144+19 568+32 290+31 483444 33+10 * 55 826+8 555+17 8030+155 4710+115 1233^336 55±33 42 545+87 165+24 6176+496 1109+77 2271+215 29+12 isotypovákontrola+ 11299+549 9799±52 3572+245 5951+281 3954+272 1565+221 22 - Výsledky uvedené v tebulce V ukazují změnu isotypuprotilátkové odpovědi, ke které dochází při přechodu od hli-níku k alkylesteru s dlouhým řetězcem (okt&decyltyrosin: OT)jako pomocných látek imunogenního polypeptidu, povrchovéhoantigenu hepatitiay B. Zvláště je třeba poznamenat, že hladiny IgE protilátek jsou zvýšeny, jestliže se používá hliník,zatímco neexistuje žádné významné zvýšení hladin IgE přisrovnání s hlai^nami kontroly, jestliže se používá oktadecyltyrosin (OT).

Claims

PATE - 23 - O V É

1. Vakcínový prostředek, vyznačující se tím,že obsahuje homogenní imunogenní polypeptid a efektivnímnožství alespoň jedné pomocné látky (adjuvans) obecného vzorce

v němž C znamená atom vodíku, zbytek aminokyseliny nebozbytek peptidu včetně zbytku s až desetiaminokyselinami(tj. až do dekapeptidu), D znamená atom vodíku nebo far-maceuticky přijatelnou sůl kyseliny, E znamená 2-hydroxy-benzylovou skupinu, benzylovou skupinu, 4-hydroxyfenylo-vou skupinu, fenylovou skupinu, 4-sminobutylovou skupinu,isppropylovou skupinu, methylovou skupinu, atom vodíkunebo zbytek přirozeně se vyskytující aminokyseliny, Aznamená skupinu (Cl·^) , arom kyslíku nebo skupinu Cr^O, B znamená skupinu C^^^n ne’D0 kyslíku, při čemž n znamená číslo nula až čtyři s tím, že A neznamená stej-nou skupinu jako B v případě, že znamená skupinu (C®^)nebo atom kyslíku, a R znamená alkylovou skupinu s dva-nácti až dvaceti atomy uhlíku.
2. Prostředek podle bodu 1, vyznačující setím, že pomocná látka obsahuje aminokyselinu sL— ko nf i gur a c i.
5. Prostředek podle bodu 1, vyznačující setím, že pomocná látka obsahuje aminokyselinu sD-konfigurací.

4. Prostředek podle bodu 1, vyznačující setím, že pomocná látka obsahuje směs aminokyselins D- a L-konfigurací. . .- . _________________ - 24

5. Prostředek podle bodu 1, vyznačující setím, že E je vybrána ze skupiny sestávající ze 4~hy~droxybenzylové skupiny, benzylové skupiny, 4-hydroxyfeny-lové skupiny, fenylové skupiny a atomu vodíku.
6. Prostředek podle bodu 5» vyznačující setím, že Ξ znamená 4-hydroxybeazylovou skupinu.
7. Prostředek podle bodu 1, vyznačující setím, že G je vybrána ze skupiny sestávající z atomuvodíku, aminokyseliny a peptidového zbytku až do zbytkůs deseti aminokyselinami.
8. Prostředek podle bodu 7, vyznačující setím, že peptidový zbytek je vybrán z dipeptidu s tripeptidu. 9. -ťrostrec >odle bodu 7 tím, že C znamená aminokyselinuskupiny sestávající z tyrosyl-glycinu,glycyl-tyrosinu a fenylalanyl-glycinu. a je vybrán ze glycyl-glycinu,
10. Prostředek podle bodu 8, vyznačující setím, že G znamená dipeptid a je vybrán ze skupinysestávající z tyrosyl-glycyl-glycinu a tyrosyl-alanyl-elvcinu. v
11. Prostředek podle bodu 1, vyznačující se tím, že farmaceuticky přijatelná kyselina je vybránaze skupiny sestávající z kyseliny chlorovodíkové, kyselinbromovodikové, kyseliny fosforečné, kyseliny sírové, ky-seliny vinné, kyseliny mléčné a kyseliny octové.
12. Prostředek podle bodu 1, vyznačující že pomocná látka obsahuje α-eminoky selinu. 15· Prostředek podle bodu 1, vyznačujíc, že homogenní polypeptid je vybrán z; ruomv - 25 - sestávající z lineárního a cyklického polypeptidu.
14. Prostředek podle bodu 1, vyznačující setím, že homogenní polypeptid je nekondenzován nabiologický nosič. 15· Prostředek podle bodu 14, vyznačující setím, že nosič je vybrán ze skupiny sestávající ztoxoidu tetanu, toxoidu difterie, nebuněčné vakcíny čer-ného kašle (EPS), zkříženě reagujícího materiálu (CPlí)a bakteriálního proteinového nosiče.
16. Prostředek podle bodu 15, vyznačující setím, že se jako C3M používá
17. Prostředek nodle bodu 1, vyznačující seooly / tím, že homogenní peptid obsahuje v podstatě jedennebo více epitopů odvozených od patogenních činidel,která jsou zodpovědná za stav, jež je způsobem členemskupiny sestávající z AIDS, hepatitidy A, hepatitidy B,hepatitidy C, tetanu, polio (dětská obrna), černéhokašle (Lymphocytosis Promoting Pactor toxin), herpessimplex, respiračního syncyciálního viru, spalniček,viru chřipky, r-abies (vzteklina), arenaviru (lassa fe-ver), rotaviru, adenoviru, rhinoviru, onemocnění nohoua úst, viru leukemie hovězího dobytka a koček, dobyt-čího moru, viru horečky dengue, klíštové encefalitidy,malarie a parainfluenza viru.
18. Prostředek podle bodu 1, vyznačující setím, že homogenní polypeptid má v podstatě stejnouaminokyselinovou sekvenci jako povrchový antigen viruhepatitidy. ií í
19. Prostředek podle bodu 1, vyznačující setím, že homogenní polypeptid obsahuje jeden nebovíce epitopů povrchového antigenu viru hepatitidy. - 26 -
20. Prostředek podle bodu 1, vyznačující setím, že homogenní polypeptid obsahuje v podstatěstejnou aminokyselinovou sekvenci jako povrchový snti-gen hepatitidy B.
21. Prostředek podle bodu 1, vyznačující setím, že homogenní polypeptid má v podstatě stejnouaminokyselinovou sekvenci jako povrchový antigen gD pod-jednotky viru herpes simplex.
22. Prostředek podle bodu 1, vyznačující set í m , že homogenní polypeptid obsahuje jeden nebovíce epitopů gpl20 viru lidské imunodeficience. -t" j.'o s rrí >00. re t í m , že homogenní polypeptid obsahuje jeden nebovíce epitopů gp41 viru lidské imunodeficien.ee.
24. Prostředek podle bodu 1, vyznačující setím, že homogenní polypeptid má v podstatě stejnouaminokyselinovou sekvenci jako IPP (Lymphocytosis Pro-moting Pactor).
25. Prostředek podle bodu 1, vyznačující seθ 1 *1 / tím, že se jako pomocná látka používá esterhlkoholuse čtrnácti až dvaceti atomy uhlíku s aminokyselinou,dipeptidem nebo tripeptidem. 26 Prostředek podle bodu 25, vyznačující setím, že se jako pomocná látka používá oktádecyltyrosin.
27. Způsob vyvolání imunní oupovědi u pacienta, vyznaču-jící se tím, že tento způsob obsahuje stupeňpodávání terapeuticky účinného množství vskclnového pro-středku podle bodu 1 pacientovi.
28. Způsob podle bodu 27 ni, že se prostředek podává intramuskulárně, intradermálně,subkutánně nebo nosem.
29. Způsob podle bodu 27, vyznačující se t í: m,že podání vakcínověho prostředku v podstatě nezvyšuje hla-diny IgS protilátek a zvyšuje poměr protilátky IgG2a kIgGl. Zastupuje: