HUT55143A - Method for obtaining immunodiagnostic reagents - Google Patents

Description

A találmány tárgyai immunesszé eljárások, illetve ezen eljárások alkalmazása olyan anyagok kimutatására és mérésére, amelyekre általában nem alkalmazhatók az immun asszék. Például a vízben, talajban, vagy levegőben lévő nyom-szennyezőket, melyeket általában nagynyomású folyadékkromatográfiával mutatnak ki, sokkal kényelmesebben ki lehet mutatni a találmány szerinti módszerekkel.

Az immunesszé alkalmazása orvosi vagy mezőgazdasági környezetben nagyszámú biológiai hatóanyag kimutatására széles körben elterjedt, és a módszerek, valamint a vizsgálatok kivitelezésének variánsai jól ismertek. Tény, hogy újabban nagy energiákat koncentrálnak az esszék kivitelezésének kényelmére, a formátum újratervezésével. Lásd például a 4 427 781 sorszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leirást, ahol egy részecske agglutinációs módszert Írnak le, ami az antitestnek azon a képességén alapul, hogy a keresett kismolekulsulyu hapténekhez kötődve összecsapzódásra készteti azokat a részecskéket, amelyekhez a haptének kötődnek. Egy másik variációt a 4 447 526 sorszámú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi bejelentésben közölnek, amelyben olyan vizsgálatot Írnak le, amely azt használja ki, hogy a jelzés tulajdonságaiban változás áll be, ha az analizálandó haptén specifikusan kötődik a reagenshez. Ez csak két leírás a sokszáz közül, amelyek specifikus analitikai technikákat írnak le a vizsgálatok érzékenységének vagy könnyű végrehajthatóságának javítására, és amelyek az antitest molekulák (vagy az antitestek fragmentjei) és a detektálandó molekulák közötti specifikus kölcsönhatásoktól függenek.

Ennek a specifikus kölcsönhatástól való függésnek a következtében egy immunológiai alapú, bármely molekulára kidolgozott esszé attól függ, hogy lehet-e a kivánt specifikus kölcsönhatásnak megfelelő antitesteket előállítani. Két megjegyzésre méltó szempont van. Először, mennyire képes az antitest vagy az antitest fragmentje a vizsgálandó anyag és más anyagok között különbséget tenni, amelyek a mintában szennyezőként fordulhatnak elő, azaz a specifitásnak magasnak kell lennie. Másodszor, az antitestnek vagy frag mentjének az a képessége is fontos, hogy erősen kötődik-e a vizsgálandó molekulához, azaz az affinitás meghatározza az esszé érzékenységét, A Dávid féle 4 376 110 sorszámú Amerikai Egyesült Államok-beK szabadalmi leirás a monoklonális antitestek olyan alkalmazását írja le, amely megnöveli a kivánt kölcsönhatás affinitás! tulajdonságait.

Számos olyan, kimutatásra alkalmas vizsgálandó molekula létezik, amelyek ellen standard in vivő technikákkal nehéz specifikus és erősen kötődő antitesteket előállítani. Amint az közismert, az általános eljárás antitestek előállítására egy adott anyaggal szemben abból áll, hogy az anyagot megfelelő alanynak, például egérnek vagy patkánynak adjuk be, és az alanynak az immunrendszerére bízzuk a megfelelő antitestet szS-kretáló B-sejtek előállítását. Vagy poliklonális antiszérumot állítunk elő az esszében való közvetlen felhasználás céljára* vagy a B-sejt forrást, például a lépet használjuk fúziós partnerként a keresett antitesteket szekretáló hibridómák előállítására. Ezeket a hibridómákat vizsgálhatjuk át a keresett molekulára specifikus antitestek termelése szempontjából. Ezek a folyamatok jól működnek, ha az l anyag elég nagy ahhoz, hogy immunogén legyen, eléggé atoxikus ahhoz, hogy az állat ne pusztuljon el mielőtt az antitestek létrejönnének, és eléggé olcsó ahhoz, hogy megfelelő mennyiséget lehessen használni az eljárás végrehajtása során. Ez az n eset nem mindig áll fent,

A nem megfelelő méret problémáját gyakran úgy lehat megoldani, hogy a vizsgált molekulát, vagy annak módosított az, formáját egy hordozóhoz kötjük, amely biztositja^immunogenitáshoz szükséges méretet, mivel másként a vizsgált molekuláról nem venne tudomást az immunrendszer, mivel túl kicsi. Lehetséges volt antitesteket előállítani bizonyos, ebbe a kategóriába tartozó specifikus molekulákkal szemben a ma már meglehetősen konvencionális technikával. Például a 4 456 691 sorszámú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás eljárást közöl olyan antitestek előállítására, amelyek a poliklórozott bifenil (PCB) molekulával reagálnak a PCB~t kémiailag módosítva, majd egy hordozóhoz kapcsolva. Hasonló eljárást közölnek a 4 530 786 sorszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban az atrazin nevű herbicidre. Azonban ez a megközelítés nagyon fáradságos, mindegyik vizsgálandó molekulához újra kell tervezni, és a siker nincs biztosítva, mivel a konjugátum által indukált antitestekkel előfordulhat.

hogy nem a vizsgálandó molekula ellen irányulnak, hanem inkább a vizsgálandó molekula és a hordozó kapcsolódási pontja ellen. Ezzel a módszerrel lényegesen nehezebb semlegesitő antitesteket kapni, azaz olyanokat, amelyek a vizsgálandó molekulával magával reagálnak.

Az is szerencse dolga, hogy a toxicitás van-e annyira súlyos probléma, hogy lehetetlenné tegye az egészjeljárás kivitelezését. Attól függően, hogy a vizsgálandó antigénből milyen mennyiség áll rendelkezésre, ezen paraméter minimalizálásának szükségessége természetesen az adott antigéntől függ.

Hasonló problémával állunk szemben terápiás vonatkozásban is. Oóllehet még fejlesztési fázisban van, azzal a terápiás eljárással, amely során a betegnek a saját tumora ellen immunspecifikus monoklonális antitestet adnak be, adott esetben egy jelzéssel vagy toxinnal konjugálva vagy anélkül, elértek pozitív eredményeket. Egy megközelítési módjaannak, hogy az ebben az esetben használható monoklonális antitesteket állítsanak elő, az az, hogy izolálják a tumor-szövetet és a szövetet használják immunogénként, ezt követően előállítják és átvizsgálják a kapott monoklonális antitesteket Kohler és Milstein módszerével, valamint egy megfelelő szűrési eljárással. Ez nyilvánvalóan egy nagyon mónkaigényes megközelítési mód, mivel több hónapra van szükség ahhoz, hogy a monoklonális antitest panel készítéséhez szükséges megfelelő immunizálási szintet elérjék. Ez alatt az idő alatt a beteg állapota jóvátehetetlenül leromolhat, illetve a tumor antigén profilja

- 6 változhat meg lényegesen. Ha megfelelő antitestet lehet szelektálni, egy nagy, már meglévő panelből, akkor ezek a nehézségek leküzdhetők. Tumorok kezelésére alkalmas panel már létezik (Oldham, R,K,, □, Bioi, Resp, Mód, 6, 227-234 /1987/), További nagy panelek is előállithatók rekombináns DNS technológiával. Olyan technikák, amelyek alkalmasak ennek a panelnek a levizsgálására, hasznosak lennének a kezeléshez megfelelő antitest kiválasztásában.

Ez utóbbi alkalmazási mód is azt mutatja, hogy a szakterületsn nincs általános módszer a keresett affinitással és specifitással rendelkező antitest előállítására tetszőleges antigénnel szemben, az összes lehetséges antigén esetében működőképes és megismételhető eljárás alkalmazásával.

Az ellenkező problémát, azaz egy adott antitestnek megfelelő mimotóp megtalálását már megpróbálták (Geysen, Η,M,, WO86/OO991 sorszámú PCT bejelentés, publikálva 1986, február 13-án), A mimotóp szó alkalmazása a továbbiakban durván megfelel annak,ahogy a Geysen féle bejelentésben alC kalmazták,

A találmány tárgya eljárás immunológiai reagens előállításira bármely vizsgálandó molekulával szemben, beleértve azokat a molekulákat is, amelyeket korábban nem lehetett immunesszével vizsgálni, olymódon, hogy megfelelő antitestet szelektálunk egy meglévő készletből a keresett cél-molekulával való reakció céljára, A találmány összes különböző előnyös megvalósítási módját kivitelezhetjük elvileg in vitro körülmények között is, de bizonyos körülmények között az immunoglobulin szomatikus diverzifikációs rendszerének alkalmazása sokkal megfelelőbb lehet,

A találmány tárgya továbbá eljárás egy vizsgálandó molekula jellemzésére, kihasználva annak specifikus reakcióképességi mintázatát egy adott, különböző specifitással rendelkező antitestekből álló panellel szemben, A találmány tárgya továbbá eljárás ilyen profilok megállapítására, kompetitiv kötődési esszét alkalmazva, kihasználva a kompeticiót a vizsgálandó molekula és a mimotópok széles köre között, A találmány tárgya továbbá uj eljárás mimotópok előállítására egy a-, őott, vizsgálandó molekulával szemben. Ezek a mimotópok jól használhatók a vizsgálandó molekulával immunológiailag reagáló, megnövekedett specifitással és affinitással rendelkező antitestek előállítására, valamint reagensként a kompetíciós vizsgálatok során. A találmány tárgya továbbá eljárás a keresett cél-molekulával magas specifikus aktivitással reagáló antitest szelektálására, a cél-molekulát egy reverse image antitest panellel reagáltatva.

Tehát egyik szempontból a találmány tárgya eljárás egy adott vizsgálandó molekulával reagáló antitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy véletlenszerűen válogatott, halhatatlanná tett antitest-termelő sejteket reagáltatunk reprezentatív mimotópokkal, a vizsgálandó molekulával kompeticióban, majd kiválasztjuk azokat a sejteket^amelyekért sikeresen

... ..., .

• · · · « «· • · ····· · · • · · · ···· ··

- 8 vetélkednek a vizsgálandó molekulák. A mimotóp panel a véletlenszerűtől a maximálisan divergálóig változhat; a mimotópok maximálisan divergáló paneljei kevesebb tagot igényelnek, ennélfogva előnyösek. Az azonnal látható, hogy nemcsak egy megfelelő antitestet, vagy antitest készletet azonosítunk igy, hanem az antitest folyamatos előállításának forrását is biztositjuk. Az igy előállított antitest ennél a pontnál megfelelően specifikus lehet, valamint elég erősen kötődik ahhoz, hogy a keresett reagens legyen belőle. Ez különösen olyan összefüggésben igaz, ahol egy ismert komponens magas koncentrációban való előfordulásának rutinszerű követése a tervezett alkalmazás. Ha azonban nem ez a helyzet, akkor a találmány további eljárásokat biztosit ezeknek a tulajdonságoknak az optimalizálására.

Egy másik szempontból a találmány tárgya eljárás a vizsgálandó molekulához egy mimotóp előállítására, azzal jellemezve, hogy az említett eljárást hajtjuk végre, majd átvizsgáljuk a mimotópok paneljét (általában azokat, amelyek az eredeti keverékben fordulnak elő), hogy melyik reagál a szelektált, sejtek által kiválasztott antitesttel. Azok a mimotópok, amelyek reagálnak a kiválasztott antitesttel, azok utánozzák a vizsgálandó molekulát abból a szempontból, hogy miként kötődnek bizonyos immunglobulinokhoz, jóllehet nem szükségszerűen a toxicitás vagy a T-sejt felismerés szempontjából. A vizsgálandó molekulával reagáló poliklonális antiszérumokat ezután úgy állíthatjuk elő, hogy a mimotópokat

4 • « 4 4 44 · • «4 · 4 4 « · «« ·♦ « · 4444··

- 9adjuk be helyettesítő antigénként.

Ez a lehetőség vezet a találmány harmadik regvalósítási módjához, azaz az eredetileg előállított antitestek specifitásának és affinitásának megnöveléséhez. Mivel a mimotóp a vizsgálandó molekulának egy helyettesitő antigénje, ezért a mimotópot használhatjuk egy állat, például patkány, egér vagy birka immunizálására, majd ismert halhatatlanná tevő és átvizsgáló technikák alkalmazásával a keresett specifitással rendelkező antitestek előállítására. Ez utóbbi in vivő eljárás, miközben a halhatatlanná tevő eljárások és a keletkező B-sejt reperbár átvizsgálása szempontjából konvencionális, egyedülálló a mimotópok felhasználása szempontjából, amelyeknek a vizsgálandó molekulát helyettesítő képességét a homológia funkcionális vizsgálatával, és nem a kémiai szerkezet alapján határozzuk meg. Ezeket a mimotópokat használjuk az alany immunizálására és a keletkező panel átvizsgálására. A vizsgálandó molekulát nem kell alkalmazni egyik emlitett eljárásban sem,

A találmány tárgyai továbbá az emlitett eljárásokban alkalmazható kitek.

Az egyszerűség kedvéért a találmány részét képező különböző eljárásokat úgy írjuk le, hogy egyetlen mimotópot vagy egyetlen antitestet használunk az átvizsgáló eljárásokban. A találmány tárgya továbbá azonban, valamint a technika továbbfejlesztése egyetlen antitest vagy egyetlen mimotóp alkalmazása esetében, panelek olyan részcsoportjainak alkalmazása, amelyek többféle sikeres jelöltből állnak. Ebben ·*·♦ ·*·♦ · ·· ·· • · · · « · · • · · · · · · • ·· ····· · · • · · · ·«·· ··

- 10 a módosításban ahelyett,hogy az eredeti, halhatatlanná tett antitest-termelő sejtcsoportból választanánk egyetlen antitestet termelőt, egy körülbelül tiz, tizenöt ilyen sejttől álló részcsoportot használunk. Az ezzel a részcsoporttal termelt antitesteket használjuk a mimotóp panel átvizsgálására alkalmas keverékként, és ismét, ahelyett, hogy kiválasztanánk az egyetlen, légreakcióképesebb mimotóp ot, egy tíz-, tizenöt, tagból álló részcsoportot választunk ki. Ezt a keveréket használjuk azután az immunizálási eljárásban, ezáltal hagyjuk hogy differenciáltan szaporodjanak az immunizált szervezetben azok a B-sejtek, amelyek az előnyös mimotópok csoportjának közös tulajdonságaiért felelősek. Azt a monoklonális panelt, amelyet az immunizált állat halhatatlanná tett B-sejt antitest kiválasztó sejtjeiből kapunk, ismét átvizsgálhatjuk a mimotópok részcsoportja és az antigén közötti kompetició alapján és a legsikeresebbet választjuk ki. Amellett, hogy a vizsgálandó molekulára erősen specifikus és ahhoz erősen kötődő antitestet állítunk elő, a szűréssel további részcsoportot állítunk elő, amelynek a vizsgálandó molekulával szembeni reaktivitási mintázata megőrizhető, és felhasználható az éppen érdekes vizsgálandó molekula jelenlétének jellemzésére, a tökéletlen kerészt-reakciót adó rokon szerkezetű molekuláktól való ^különböztet és céljára.

Ennek a koncepciónak egyik alkalmazási módja szerint egy kezelhető, például 25-75 antitestből álló panelt használhatunk. Egy ilyen panelnek a mintázatát szokványos immunesszé technológiával állíthatjuk elő, vagy előnyösen, jelzetlen, módosítatlan vizsgálandó molekula és jelzett mimotóp keverék közötti kompetíciós vizsgálattal. A panelt felhasználhatjuk a vizsgálandó molekula azonosítására, vagy ismételten felhasználhatjuk azon mintázat nagyságrendjének a követésére, amelyet a vizsgálandó molekulának a vizsgálandó molekula koncentrációja függvényében mért reaktivitása alapján állítunk elő.

Tehát a találmány tárgya továbbá egy specifikus vizsgálandó molekula reaktivitás! mintázatának alkalmazása egy vagy több véletlenszerű antitest panelből szelektált korlátozott antitest panelre. Ebből a szempontból a találmány olyan antitestek paneljére vonatkozik, amelyek különböző reaktivitással rendelkeznek a keresett vizsgálandó molekulával szemben, és adott esetben a jelzett mimotópok olyan kompetíciós keverékére, amelyek alkalmasak arra, hogy meghatározzuk a vizsgálandó molekula és a panelben lévő minden egyes antitest közötti változó mértékű reakcióképességet a mimotóp eleggyel kompéticióban, A keresett mintázatok előállításának megkönnyitéséra, a találmány tárgya tovább uj eljárás a panel előállítására szilárd hordozón, A találmány tárgya továbbá egy maximálisan divergáló mimotóp készlet alkalmazása monoklonális antitestek komplementer készletének

előállit ás áraimély a mimotópok fordított képét alkotja.

Ezen két referencia készlet (az egyik a mimotópok, a másik az antitestek) közötti szigorú komplementritás használható arra is, hogy egy index rendszert állítsunk elő, ami lehetővé teszi, hogy a vizsgálandó molekulából igen kis mennyiséget indirekt módon vizsgálhassunk egy potenciálé an kereszt-reakciót adó n'agy antitest kollekcióval szemben; az ilyen elő-szelekciós módszer alacsony költsége és gyorsasága gyakran nagy érték, például beteg-specifikus tumor-antigének elleni antitestek keresésénél. A találmány tárgya továbbá eljárás maximálisan divergáló mimotóp készlet meghatározására, valamint az igy meghatározott készlet.

Az ábrák rövid ismertetése

Az 1. ábrán a találmány szerinti módszerrel szilárd hordozóhoz kötött antitest panelt mutatunk be,

A 2. ábrán a 335 tagú alap antitest panel három különböző antigénnel szemben mutatott kapcsolódási koefficiensét látjuk.

A 3. ábrán azoknak különböző mimotópoknak a listáját látjuk, amelyeket úgy terveztünk, hogy a hidrofóbiás index (hi) és a hidrofóbiás momentum (hm) alapján különbözzenek egymástól.

A 4, ábrán a hi és hm értékét láthatjuk a 3, ábrán látható peptideken keresztül.

Az 5, ábrán egy vizsgálandó molekula profiljának kifejlesztését látjuk.

- 13 A 6, ábrán két mimotóp kompetitiv esszéjét láthatjuk.

A 7. ábrán 24 különböző nonapeptid-amid aminosav-szekvenciáját láthatjuk,

A 8. ábrán annak a vizsgálatnak az eredményét látjuk, amelynek során a 7, ábrán látható molekulákból tizenhatnak a kötődését vizsgáltuk egy kiválasztott antitesthez.

A továbbiakban a mimotóp*· szakkifejezés egy molekulának arra a részére vonatkozik, amely komplementaritással rendelkezik egy olyan antitest antigénkötő régiójához, amely immunspecifikusan kötődik egy keresett antigénhez vagy vizsgálandó molekulához, azaz általában az a régió, amely megfelel a vizsgálandó molekulán egy epitópnak. A mimotóp általában nem rendelkezik pontosan ugyanazzal a térbeli és töltésbeli szerkezettel mint amilyennel az epitóp, de a definíció helyes, ha a mimotóp is képes azt a molekulát, amelyben található, specifikusan a keresett antigén-kötő antitesthez kapcsolni. A mimotópok általában célszerűen rövid peptid szekvenciák, mivel a peptideket könnyű nagy mennyiségben, nagy változatosságban előállítani, de elméletileg erre nincs szükség. Például szénhidrátok vagy detergensek is viselkedhetnek úgy, hogy megfeleljenek ennek a definíciónak;

a helyzet az, hogy az ilyen mimotópoknak sem a véletlenszerű, sem a divergáló paneljének az előállítását nem tartják szem előtt a jelenleg elérhető, ezekhez a molekulákhoz kapcsolódó ···· ···· · ·· ·· • · · » · ♦ · • · · · 4·· • · · ···· · · * •· « V *·····

- 14szintetikus technikák. Az ilyen kémisi típushoz tartozó egyes mimotópokat természetesen elő lehet állítani. Tipikusén egy antitesttel reagálni képes epitóp, amelyet a mimotóp helyettesit, egy olyan nagyobb molekulában található, amely például a peptidek esetében a peptidlánc nyúlványa lehet, vagy hasonlóképpen, a peptid konjugálva lehet valami más anyaghoz. Néhány esetben a molekulához hozzáadott rész külön funkciókat tölt be. Ha a mimotópot immunogénként akarjuk használni, akkor megnövelt méretre van szükség, mivel a legtöbb mimotóp régiót 3-6 aminosavból álló, viszonylag rövid aminosav-ezekvsnciák képviselik. Másrészről, a mimotópot olyan anyaghoz köthetjük, amely lehetővé teszi a jelölést, A jelölés lehet közvetlen, mint például egy fluorofor konjugációjánál, vagy egy radioaktivan jelzett anyag elkülönítésénél, illetve lehetővé teszi a jelzett anyag későbbi hozzákapcsolását specifikus kötéssel, mint például a biotinnak a biotin/avidin komplexhez való kapcsolásánál, mikor az avidin viszi a jelölést. Bármelyik is helyzet, a mimotópot magát gyakran találjuk más molekuláris szerkezetben, és mig a mimotóp szakkifejezést úgy határozzuk meg, mint aa antitest kötődésért felelős régiót, a szakkifejezést gyakran a konjugátum jelzésére is használjuk, felcserélve. Az az összefüggésből nyilvánvaló, lesz, hogy a teljes kon.jugátumot vagy a kötődésért felelős régiót értjük a mimotóp szakkifejezés alatt az adott esetben.

Az antitest fragment'* szakkifejezés az antitestek olyan fragmentjeire utal, amelyek megtartják a tel··* ··

- 15 jes antitest specifikus kötési jellemzőit· Az egyes fragmentek jól ismertek a szakterületen, például a F(ab*)2» Fab és Fab*, amelyeket különböző proteázokkal emésztve kapunk meg. Természetesen, ha rekombináns utón állítjuk elő, akkor tetszőleges az antigén-felismerési jellemzőket megtartó fragmenteket is előállíthatunk. Ezek a fragmentek gyakran hasznosak in vivő, mivel kevésbé immunogének mint a teljes antitestek; annak is van bizonyos előnye, ha in vitro vizsgálatokban a specifikus megkötésre fragmenteket használunk a teljes antitestek helyett. Hacsak külön nem utalunk rá, akkor ha a szövegben antitesteket említünk in vitro vagy in vivő vizsgálatokban, abban az esetben immunspecifikus fragmenteket is használhattunk volna,

A véletlenszerűen stimulált antitest termelő sejtek szakkifejezés olyan szekretáló sejtekre vonatkozik, amelyeket aspecifikus módon stimuláltak, például bakteriális lipopoliszacharidnak (LPS) a tenyészetbe adagolásával. Egy adott emlős igy kapott általános B-sejt populációjából vett mintáról ismert, hogy olyan sejtek tartoznak ide, amelyek bármely lehetséges antigénnel epcifikusan, bár alacsony affinitással reagáló antitesteket termelnek, A véletlenszerű konturu mimotópok szakkifejezés olyan mimotópokra utal, amelyek különböző térbeli és töltésbeli szerkezettel rendelkező felületi régiókat tartalmaznak. Amint azt a továbbiakban ismertetjük, egy ilyen véletlenszerű keveréket úgy állíthatunk elő, hogy olyan aminosav-szekvenciával rendelkező peptideket készítünk, amelyekben az egyes pozíciókban lévő aminosavakat véletlenszerűen választjuk jelentős számú jelölt közül.' Azonbanbármely olyan molekula - keverék ide tartozik, amely a potenciális epitópoknak megfelelő, sokféle régiót tartalmazza.

A maximálisan diverz tulajdonságokkal rendelkező momotópok szakkifejezés olyan mimotóp csoportra utal, amelyben a különböző jellemzőket célirányosan befolyásoljuk, abból a célból, hogy maximálisan diverz jellemző tulajdonságokkal rendelkező panelt állítsunk elő.

Diverz panelek készítésénél megfontolandó alkalmas tulajdonságoktözé tartoznak a következők, nem korlátozó jelleggel:

izoelektromos pont(pl) hidrofóbiás index(hi) hidrofóbiás momentum(hm) dipólusmomentum(dm) simaság

Ezeknek a tulajdonságoknak a diverzifikálásával' a mimotóp-panel tagjai között mimotópok számát a panelben drasztikusan csökkenteni lehet, olyan panelekhez viszonyítva, amelyekben a hasonló diverzitást peptidek véletlenszerű szelektálásával érik el.

Azok a peptid-keverékek, amelyek maximálisan diverzek egy adott paraméter - sorra vonatkoztatva, olyan • · · ·

- 17 keverékek, amelyekben a tagok lefedik minden egyes paraméter teljes tartományát, és a keverék tagjai egyenlő távolságban helyezkednek el a tartományon belül. Az egyes paraméterek skáláinak megfelelő normalizálása megkönyiti a diverzifikálási eljárást, Például olyan peptid-keverék, amelyben a tagok maximálisan diverzek a hidrofóbiás indexre vonatkoztatva, olyan keveréket jelent, amelyben a tagok a hidrofóbiás index teljes tartományát lefedik, és a keveréknek nincs két olyan tagja, amelynek hidrofóbiás indexe közelebb lenne egymáshoz mint bármely más kiválasztott páré. Nyilvánvaló, hogy a maximális diverzitás szempontjából nehéz a tökéletességet elérni, és a szakkifejezést olyan keverékekre alkalmazzák, ahol a specifikált paraméterre a legnagyobb diverzitás elérhető, így például egy olyan keverékben, amely maximálisan diverz a hidrofóbiás index (hi) éa a pl szempontjából, mindegyik hasonló pl-vel rendelkező Deptidnek el fog térni a hidrofóbiás indexe, és mindegyik, hasonló hi-vel rendelkező neptidnek el fog térni a pl—je,

Inverz vagy reverz képű panelek vagy keverékek szakkifejezés az antigén/antitsst kölcsönhatások epitóp/ paratóp kölcsönhatásának töltés/tér kontúrjának komplementaritására utal, így egy monoklonális antitest panel, amelyben minden egyes tag magas specifitással rendelkezik egy mimotóp panel egyetlen tagjához,egy olyan panel, amely a megfelelő mimotóp panel inverz vagy reverz képe^Az^^l^en inverz leképezés feltételezi, hogy például egy 50 tagu^nTinden egyes mimotópra található egy antitest, amely magas affinitással rendelkezik a specifikált mimotóphoz, és jószerivel egyáltalán nem kötődik a többi 49-hez. Ilyen paneleket legegyszerűbben egy maximálisan diverz mimotóp csoporttal szemben lehet előállítani.

^Amint azt az előzőekben kifejtettük, az inverz képű paneleket akár a vizsgálandó molekula, akár az antitestek jellemzésére használhatjuk kompetíciós esszékben. Az inverz képű panelek tagjai előnyösen elég kisszámuak ahhoz, hogy egy a gyakorlatban használható csoportot alkossanak, de elég nsgyszámuak ahhoz, hogy értelmes mintázatot adjanak, ^Λζ ilyen panelekbe ennélfogva tiDikusan 10-100, előnyösen körülbelül 40-50 tag tartozik. Egy vizsgálandó molekulának a monoklonális antitest fordított képű paneljével való reakcióképességét, vagy az antitestnek a mimotóp panellel való reakcióképességét az alábbiakban ismertetett különböző technikákkal lehet meghatározni, ^Δ találmány tárgya eljárás a kívánt analitikai anyagok előállítására az immunesszékben való felhasználás céljára, valamint az igy előállított anyagok, A találmány néhány megvalósítási módja magába foglal. nagyszámú véletlenszerűen előállított antitest-termelő sejtet, valamint nagyszámú potenciális mimotópot.

Ahogy a találmány szerinti eljárást végrehajtjuk, az antitestek és mimotópok száma egy adott panelben vagy csoportban lényegesen lecsökkent, és a kapott, analízis céljára használható anyag erősen specifikus és erősen kötődő mimotópokat és antitesteket tartalmazhat, vagy emellett ezeknek az anyagoknak olyan paneljei lehetnek, amelyek jellegzetes

- 19 reakció - mintázatot mutatnék a vizsgálandó molekulával szemben, A kapott antitestek paneljei egyre jellegzetesebbé és specifikusabbá válnak azokra az analitikai eljárásokra, amelyek számára előállítottuk.

Röviden összefoglalva ez az eljárás halhatatlanná tett, monoklonális antitesteket termelő sejtek paneljének előállításával kezdődik, amely kiindulási pontként szolgál bármely kiválasztott vizsgálandó molekula előállításában. Az ismételt szűrővizsgálatok szempontjából előnyös. Ιέ ezt a panelt egy kezelhető számra, mondnuk 10 000 körülire korlátozzuk} mível a potenciális vizsgálandó molekulák száma milliós nagyságrendű, ezért a kezdő panelnek csak akkor lesz megfelelő hatóköre, ha a specifitást feláldozzuk, λ gyakorlatban még kisebb tagszámú (300-500 tagú) panelek sem áldoznak fel túl nagy specifitást egy kiindulási profilban, A széles specifitás belső tulajdonsága a véletlenszerűen stimulált B-sejteknek, Ezek a sejtek főleg TgM immunglobulinokat termelnek. Egy rekombináns módszerrel előállított immunoiobulin csoport is használható.

Ha annak lenne gyakorlati értelme, hogy a keresett vizsgálandó molekula repertoárjához való pontos illesztéshez szükséges lehetséges paratópok millióit előállítsuk és levizsgáljuk, akkor ezt meg lehetne tenni közvetlenöl. Ennek azonban nincs gyakorlati értelme, ennélfogva a találmány szerinti rendszer módot nyújt arra, hogy a vizsgáló eljárást a választások kezelhető tartományára korlátozzuk.

Ha a találmányt a legegyszerűbb formájában hajtjuk végre, akkor az alap panel antitestet, amelyik legközelebb van a szükséges specifitáshoz, használjuk egy mímotónnak • · ·

- 20 véletlenszerűen generált csoportból való szelektálására, amely csoport ismét, mivel egy ésszerű számú tagból kell állnia, nem képes az elérhető vizsgálandó molekula kontúrok millióit teljes hűséggel szolgáltatni. Ezért nagy hatókörű mimotóp jelöltek paneljét használjuk, és a legjobbat kiválasztjuk. Ha egyszer túl vagyunk ezen a bootstrap lépésen, akkor a találmány szerinti módszer magába foglalja az antitest/mimotóp kapcsolódási reakciónak először az egyik partnerének , majd a másik partnerének a rendszeres optimalizálását, Azjoptimalizálás kritériumát funkcionálisan úgy határozzuk meg, hogy képes legyen a vizsgálandó molekula kimutatlására.

Ha már a kiindulási mimotópot kiválasztottuk, akkor az helyettesítheti a vizsgálandó molekulát egy állat immunrendszerének szomatikus diverzifikálási folyamata stimulálásában, amit általában egy antigénre adott válasz aktivál, ^Δζ erre az immunizálásra adott válaszból kapott monoklonális antitestek paneljét vizsgálhatjuk át, a vizsgálandó molekulát kompeticióban alkalmazva a mimotóppal, vagy a mimotópok keverékével, vagy közvetlenül alkalmazva a legjobb jelölt kiválasztására. Dói tanulmányozott esetekben néhányan magasabb, néhányBn alacsonyabb affinitást mutatnak az antigénhez. Addig a mértékig amig a mimotóp egy hatékony helyettesítő antigén, addig a diverzifikált kiónok közé a vizsgálandó molekulához magasabb affinitással rendelkező tagok is tartoznak. Egy másik módszer szerint az antitest kiónokat in vitro lehet randomizálni az immunglobulin kódoló DNS helyspecifikus mutagenezisével.

• ·

- 21 Ha ez a javítás nem elegendő, akkor a javított antitestet lehet használni egy mimotóp panel átvizsgálására, és ennek eredménye lehet az előzőekben alkalmazott mimotóptól l eltérő mimotóp szelekciója; egy olyané, amely sokkal jobban illeszkedik a vizsgálandó molekulához, Fz a második szelektált mimotóp,használható egy második immunizáláshoz olyan in vivő generált B-sejtek paneljének előállításában, amelyek átvizsgálandó monoklonális antitesteket szekretálnak, ^cz a folyamat ismételhető, ^nnek az eljárásnak egy sokkal elegánsabb és hatékonyabb formáiéban az eqyes lépésekben kiválasztott egyetlen mimotópot vagy antitestet olyan részcsoporttal helyettesítjük, amelynek a vizsgálandó molekula funkcionális homológiájával közös jellemzői vannak. Ez előnyös, mivel az adott vizsgálandó molekula számos olyan epitóppal rendelkezhet, amelyek átfedve regenerálják a teljes felületi körvonalait, és egy kollekció együtt sokkal hasznosabban utánozhatja a teljes felületet mint annak egyetlen része. Ezzel szemben egy mimotóp rendelkezhet egy megnyujtott felülettel, amelynek cs& egy része homológ és vizsgált molekulával. Többszörös mimotópok és/vagy antitestek alkalmazásával a közös tulajdonságok kihangsulyozódnak. Emellett, mivel az antitest részcsoportok olyan jellemzőket és reprodukálható kölcsönhatási mintázatot mutatnak egyetlen vizsgálandó molekulával, amelyek különböznek a rokonszerkezetű vizsgálandó molekulákkal kapottól, a spacifitást inkább a mintázatnak magának lehet juttatni mint egvstlen antitestnek.

• · · ·

- 22 Tehát ebben a módosított eljárásban az eredeti antitest panelnek csak egy kis részét, mondjuk 10-15 tagot használunk a mimotópok paneljének átvizsgálására. A mimotóp panel eredmények újabb részcsoportot eredményeznek, mondjuk 10-15 tagból állót, amelyet immunizálásra lehet használni. Az immunizált állat immunrendszerét a legintenzivebben tesszük ki a közös tulajdonságoknak, és ez immunizált állatból kapott monoklonális antitest-panelt el lehet téríteni ezeknek a közös tulajdonságoknak az irányába /Chua, M.M. , 3. Immunoi. 138, 1281-1288 (1988)/. Emellett, az immunizált állatokból kapott panel , akár ebben az esetben, akár abban az esetben amikor csak egyetlen mimotópot használunk, olyan részcsoport paneleket szolgáltat, amelyek kötődési tömbjük következtében használhatók egy adott vizsgálandó molekula felismerésére a panelen keresztül a kötődési specifitás mintázata alapján.

A következőkben részletesen ismertetjük a találmány szerinti módszerben szereplő lépéseket.

A kiindulási anyagok előállítása

A kiindulási antitest-panel

Az antitestet termelő sejtek random paneljét különböző módon lehet előállítani. Körülbelül 10 éve ismert, hogy a mitogénnel aktivált B-sejtek random antitest-csoportot állítanak elő, amelyek képesek bármely lehetséges antigénhez kapcsolódni. Ezen stimulált sejtek által szekretált immunoglobulinok legnagyobb része azonban TgM, és viszonylag alacsony affinitással és specifitással rendelkeznek. A kezelhető repertoár elegendőnek tűnik ahhoz, hogy bizonyos szinten kötődjön • « · ·

- 23 azon antigének millióihoz, amelyekkel szemben védelemre van szükség; ennélfogva kereszt-reaktivitásra van szükség.

Nagyszámú B-sejt halhatatlanná tételét korábban mitogénekkel, például lipopoliszacharid alkalmazásával, sejtfúzióval vagy virus-fertőzéssel stimulálták, ennek eredménye egv nagyszámú, nagy változatosságu, általában állandó antitest forrás.

Az LPS stimulálás a B-sejtek részleges differenciálódását okozza, ezzel jó fúziós partnerré téve őket.

Az antitestek termelésének stimulálását és az ilyen fúziók végrehajtásának módját leírták, például a következő közleményekben: Andsrsson, □, et al. , Current Topics on Microbiol and Immunoi,, 81 , 130-138 (1981 ); Andsrsson, □. et al. , Proc. Natl. Acad, Sci. USA; 78. 2497-2501 (1981); Goldsby, R.A, et. al. , Current

Microbiol,, 2. 157-162 (1979).·További, a fúziótól eltérő módszereket a limfociíák megőrzésére Howard, M, és munkatársai közöltek (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 5788-5792 /1981/), valamint ezeknek a hibridómáknak az antigén-specifitás alapján való szortírozását Parks és munkatársai közölték (Proc, Natl. Acad, Sci, USA, 1962-1966 /1979/), Az in vitro immunogénként használt antigénekre specifikus immunoglobulinokat szeknetáló hibridómák előállítását is közölték (Luben, R.A. et, , Holecular Immunoi., 17, 635-639 /1980/),

Abból a célból, hogy a számokat kezelhetőbbé tegyük a nagy random panel általános használatának módosítása magában foglalja az előszelektálást, hogy a legjobb jelöltek paneljét csökkentsük. Például Casali, P, és munkatársai /Science, 234, 476-478 (1986)/ közük a fluoreszcenciával aktivált sejt• · • « «

-szortírozó alkalmazását a jelzett antigénhez kötődni képes humán limföciták elválaszására. Az egyes sejtek ezután kinyerhetők majd az Epstein-Barr vírussal transzformálhatók mikrotenyészetben való növesztés céljából. Ez a preszelekció lehetséges a jelen találmány összefüggésében ha a keresett vizsgálandó molekula hatékonyan jelezhető.

Ha ez a jelzés végrehajtható, például a vizsgálandó molekulának a fluoreszceinhez való közvetlen konjugálásával, vagy egy kapcsoló egy séghez, úgymint avidinhez való konjugálással, a fluoreszcenciásan jelzett biotinnal való kapcsolódás céljából, akkor a Casali által leirt eljárás alkalmazható (az előzőekben hivatkoztunk rá) arra,hogy egy korlátozott számú 10-15 tagú monoklonális panelt kapjunk a mimotóp panel ezt követő átvizsgálásához, A kiválasztott sejtek halhatatlanná tételét nem kell szükségszerűen Epstsin-Barr vírussal végezni, megtehető ez standard fúziós módszerekkel vagy a ma már elérhető elektro fuziós technikákkal, például azzal, amelyet a Biotechnológies and Experimental Research Incorporated (San Diego, Kalifor nia) hoz kereskedelmi forgalomba.

Legújabban lehetséges immunoglobulinok előállítása rekombináns technikákkal. Tehát egy eltérő módszer antitest termelő sejtek random paneljének előállítására amikor véletlenszerűen mutagenizáljuk az immunoglobulint kódoló DNS-t és a mutált elegyet olyan sejtekbe transzferáljuk, amelyek képesek a kódolt mutáns immunoglobulinok expresseálására. Az immunoglobulin fehérjékét sikerrel expresszálták· _s

E. coliban valamint élesztőben} az éleeztő immunológiailag aktív formájúra processzálja a keletkező fehérjéket. Például az immunoglobulinok szintézisét és in vivő összeállítását leírták élesztőben CWood, C, R. et al. , Natúré, 314, 446-448 (1980)]. Mind a natív, mind a dimer antigén kötésére képes antitest fragmentek E. coli-ban való szintézisét közölték [Skerra, A. Science 240, 1038-1041 (1988)} Butler, M. et el. ibid: 1041-1043J.

Az emlitett módszerek bármelyikével előállítható sejtek, akár halhatatlanná tett B-sejtek, akár immunoglobulint expresszáló rendszereket tartalmazó rekombináne gazdasejtek psnelja. Ha egy teljesen randon panelt használunk, akkor körülbelül 10 000 tagra van szükségünk. Egy körülbelül 50 000 tagú panel jobb keresztmetszetet ad. Azonban az újabb gyakorlati tapasztalatok azt mutatják, hogy kevesebb tagszám is elegendő bizonyos célokra.

Ezeknek a munkáknak az eredményét látjuk a 2. ábrán.

A 2A ábrán láthatjuk az 1. példa szerint előállított 335 monoklonális antitest kötődési konstansait, amelyeket mennyiségileg vizsgáltunk le a kaesinin nevű rövid peptiddel szemben begy meghatározzuk a kötődési koefficienst, azaz a megfigyelt kötődést korrigáltuk a háttérrel szemben. (A vizsgálatot a kereskedelmi forgalomban lévő Bio-Rad dot-blot egy variánsával végeztük). Amint az a 2A ábráról látható, a 335 Mab közül csak az egyik rendelkezik 3500-4000-es kapcsolódási koefficienssel; két másik Mab-nak van 1500 vagy e körüli kapcsolódási koefficiense, és van néhány antitest ezer körüli • ·

Í« ·· ·· • · · · t • · « » · · mm e · e • · · « · · ·

- 26 kapcsolódási koefficiense, de a legnagyobb többségnek nagyon kicsi a kötődése ehhez a nagyon egyszerű antigénhez,

A 2B, ábra ugyanezeket az eredményeket mutatja egy eokkal komplexebb antigén, az egyszerű F1 fonalas fággal szemben vizsgálva. Ebben a példában néhány, véletlenszerűen nagyobb számban ismétlődő epitóppal majdnem az egész panel lényeges kapcsolódást mutat az antigénhez, aholie a kapcsolódást feltételezhetően növeli az IgM többértékű természete,

A 2C, azokat az eredményeket mutatja, amikor hasonló vizsgálatokat végeznek egy nagyon komplex antigén, a furócsiga hemocianinnal (KLH) szemben. Ebben az esetben több epitóp van jelen, és ennek következtében nagyobb számú antitest mutat lényeges affinitást az antigénhez,

A 2A, 2B és 2C ábrán bemutatott eredményeket a 2D ábrán foglaljuk össze, amely a rágcsáló alap repertoárban mutatja a kötődési koefficiensek eloszlását erre a három anyagra, Amint az az ábrán látható, azoknak a monoklonális antitesteknek a százaléka, amelyek erősen kötődnek a kasszininhez, viszonylag alacsonyt mégis, a csak 335 Mab-ot tartalmazó panelben legalább néhány, jelentős affinitással rendelkező antitest található.

Ezeknek az eredményeknek néhány fontos következményűk van. Először, az alap panelnek nem kell túl nagynak lennie, ha az antigén a megfelelő komplexitással rendelkezik ahhoz, hogy biztosítsa a ezegregálódást a panelben lévő kisszámú antitest között, ez a helyzet a 2A ábrán. Másodszor, az erősen kötődő Mab-ok részcsoport panelje maga is lehet egy hasznos

eszköz· A kasszininnek a panellel szemben mutatott ujjlenyomatát** , amely a 2A ébrén mutatott mintázatból származik, hatékonyan alkalmazhatjuk a teszt mintákban lev kasszinin kimutatására· A kasszinin szint növekedését vagy csökkentéeét ki lehet mutatni két vagy három magas kötőképességű antitesthez való kötődés önmagában következetes kimutatásával.

Bárhogyan állítjuk elő az alap monoklonális antitest panelt, ezeket a tenyészeteket növeszthetjük mikrotiter lemezeken vagy más megfelelő szubeztrátumokon, amelyek lehetővé teszik a felüluszók kényelmes elemzését a vizsgálandó molekulához vagy a mimotópokhoz való kapcsolódási képesség alapján· A találmány egyik tárgya egy kit, amit az jellemez hogy ezt vagy egykésőbb előállított, megfelelő hordozón lévő antltest-termelő sejtek paneljét tartalmazza a találmány szerinti eljárásokban ezkrinelés céljából. A kit előnyösen mikrotiter lemezeket, nitrocellulóz, aktivált formájú nylon vagy más, lemez formában hozzáférhető polimert, valamint szűrőpapírra szilárdított agaróz-származékot tartalmaz.

Mivel a kezdeti random panelről úgy vélik, hegy olyan antitestek kollekcióját tartalmazza, amelyek a epecifitást és affinitást feláldozták a hatókör érdekében, amihez nagy tagszámra van szükség, ezért sokkal kevésbé hasznos egy adott vizsgálandó molekula analízisére szolgáló kitbe foglalni, mint olyan eszközként használni, amely alkalmas nagyszámú eltérő vizsgálandó molekula analízisére alkalmas további anyagok előállítására. Tehát ez a Panel sokkal inkább alkalmas terme-

lést és kutatási eszközként való alkalmazásra aint teszt kltként. Azonban ezeknek az elsőként előállított antitesteknek a részcsoportja egy adott vizsgálandó molekulához elég jellegzetes mintázatot ad ahhoz, hogy teszt szubsztrátként alkalmazható legyen.

A Miaotópok

A találmány szerinti eljárás kezdeti fázisaiban olyan mimotóp keverékre is szükség van, amelyek képesek utánozni, legalább kielégítő mértékben a vizsgálandó molekula kötődési képességét. Egy korai kísérletet Írnak le AteSsi, Μ. Z. és munkatársai £□. Biochem, 252. 8784-8787 (1977)1 ismert háromdimenziós szerkezetű antigén szintetikus előállítására.

Amint azt az előzőekben említettük, a miaotópok kémiai természete inkább kényelem dolga mint elméleti jelentőségű. Potenciális mimotópok csoportjának előállítására két ellentétes megközelítést lehet alkalmazni. Az egyik megközelítés szerint egy véletlenszerű csoportbannagyon nagyszámú tag van. A véletlenszerű és nagy változatosságu háromdimenziós molekuláris szerkezetek egyszerű módja véletlenszerű szekvencláju

3-6 amlnosavból álló peptidek előállítása. Csak a formálisan kódolt 20 aminosav alkalmazásával 20^, vagy 8000 lehetséges tripeptld létezik. Legalább 500 tripeptidből álló elegyre van szükség, előnyösen 5000 vagy 10 000 szükséges. Az adott esetben szükséges tagszámot minimalizálni lehet a csoportok megválasztásának optimallizálásával. Például ha az alanint valinnal helyettesítjük, az nem jelent egy lényegesen különböző psptidet.

0· • · • · • · ···· ·«·· • · · •·· * · ····9»

- 29 _alg az alanin tirozinnal való helyettesítése nagy különbséget jelent. Természetesen az elméletileg lehetséges 3 aminosavból álló mimotópok száma legalább nyolcszorosára emelhető az aminosav jelöltek számának megduplázásával, ha szintetikus peptidelőállitási módszereket alkalmazunk. Ezt úgy tehetjük meg» hogy további 20, módosított oldallánccal rendelkező aminoaavat vonunk be a módszerbe a szekvenciába való beépítés céljából, vagy bevesszük a 0-izomereket. Ebben az esetben 40³ lehetséges tripeptidet kapunk. Egy lehetséges megközelítési módot ir Is Geysen, H,M, (W0/00991 , lm.) nagyszámú mimotóp szerkezet előállítására, amelyben többszörös peptidsket kapunk egyidőben, olymódon, hogy több csoportot viszünk be a lánchosszabbítási eljárásban szilárd fázisú szintézis többszörös hordozóján· Geysen leírja egy antitest tesztelését mind a 400 lehetségee természetes** dipeptiddel szemben· egy mimotóp konstrukció kiindulási lépéseként, A hozzáférhető peptidek száma természetesen nő, amikor a peptidlánc az epitóp méretén túl nő (egészen hat aminosavig).

Egy még véletlanszsrűbbsn előállított· de nem szükségszerűen diverzebb többszörös mimotóp panelt állíthatunk elő ugy,hogy a természetben található fehérjekeverékst drasztikusan hidrplizéljuk. Például az élesztőkivonatot proteázok, úgymint tripszin, kimotripezin, kollagenáz, kimozin, snterokináz, stb. elegyével, vagy ezekkel egymás után kezelve hidrolizálhatjuk, A maradék nagyszámú· kié molskulasulyu fehérjék keveréke, amelyet szükség«esetén SOS gélen le el lehet vá• ·

- 30 lasztani, és például a Bolton-Hunter ¹²⁵l módszerrel meg lehet jelölni. Ezek a külön SDS sávok átvihetők Weetern-blot papírra, igy kaphatjuk külön mimotópok paneljét. A jelöletlen, átvitt mimotópokat, vagy azokat a miaotópokat, amelyek a későbbi jelöléssel, amikor a mimotópok a jelölt antitestekhez vannak kapcsolva, kompatibilis módon vannak jelezve, használhatjuk eszközként a jelölt mimotópok azonosítására az alap repertoár előszelektált tagjaival szemben.

Egy eltérő és előnyös megközelítése egy mimotóp csoport előállításának egy maximálisan diverz csoport előállítása. Ez a csoport a számoknak fent említett minimalizálását úgy éri el, hogy egy finomított szintre optimalizálja a csoportok választékát. Az elképzelés szerint a mimotópok, úgymint peptidek diverz csoportjának előállítását úgy alakítjuk, hogy olyan peptideket tervezünk, amelyekben bizonyos meghatározott tulajdonságok szisztematikusan változnak a teljes tartományban. A megfontolandó tulajdonságok közé tartozik például a peptid- teljee töltése, a teljes hidrofobicitása, hidrofóbiás momentuma, körvonalának általános jellemzése (azaz sima vagy érdes), valamint a töltéseloszlás. Ha peptideket használunk, ami a legkényelmesebb megvalósítási módja a mizotópoknak, akkor ezeket a jellemzőket megbecsülhetjük az amino® sav-szekvenciából, az alkalmazott aminosavak ismert jellemzőit, valamint a fehérjék röntgen-krisztallográfiás adatait alkalmazva.

• β

- 31 Emellett, mivel a fehérjék háromdimenziós szerkezete változik a hőmozgáe miatt, hasznos lehet olyan eszközök alkalmazása, amelyek stabilizálják a kívánt konformációt. Ismertek olyan módszerek, amelyekkel korlátozni lehet a peptidek konformáció-változását [Weber, D.F. et al,, Natúré, 292, 55-58 (1981); Friedinger, R.M, et al,, Science, 210, 656-658 (1980)1,

Ez a megközelítés egy hattagú panelre a következőképpen működik. Az elektrorfelhő mintázatát meghatározó paramétereket erősen változatni kell a jelölteknél. Például az előállított peptid-jelölteket úgy kell megválasztani, hogy a hidrof öbleit ás i index egyenletesen nőjön a panelben, A hldrofobicitáei indexeknek a szerkezettel való összefüggéeét Danin, D, Írja le [Natúré, 277, 491-492 (1979)1. Emellett a fehérjék amfipátiás tulajdonságát változtatni lehet a csoportok periodikus hidrofobicitásának beállításával [Eisenberg, 0, et al, , Proc, Natl, Acad, Sci. USA, 81, 140-144 (1984)$ Eisenberg, D, et al,, Natúré, 299, 371-374 (1982)1. Az amfipatikus tulajdonság a peptid szekunder illetve tercier szerkezetéből ered, olyan részeket vagy felületeket eredményezve a molekulában, amelyek vizoldhatók, és olyanokat, amelyek vízben nem oldhatók. Emellett a pozitív illetve negatív töltésű aminosav csoportok jelenléte miatti töltésmintázat is szisztematikusan változtatható a jelöltek paneljében,

A jelölteknek egy kezdeti panelje, amely ezekre a paraméterekre nézve diverz, általában 90-100 pepiidet tartalmaz ami a kereskedelmi forgalomban lévő mikrotiter lemezek és fehérjeszintetizáló pálcák (Cambridge Research Biochemicals) tervezését tükrözi. Ez a szám elegendő ahhoz, hogy a keresett mimotóp jellemzőit keretbe foglalja. A szintézist szokásos, kereskedelmi forgalomban lévő módszerekkel végezzük, majd az egyes jelölt mimotópok panelje készen áll az átvizsgálásra.

Egy teljesebb diverzifikálást úgy végezhetjük, hogy az aminosavakat a további tulajdonságokkal látjuk el. Ennek a sokkal diverzebb panelnek az előállítása során az egyes aminosavaknak az irodalomból ismert tulajdonságait alkalmazzuk. Az alábbi 1. táblázatban a 20 természetes aminovasból 19-nek a tulajdonságai vannak összegyűjtve, A ciszteint nem foglaljuk a táblázatba vagy a csoportba, mivel ezt a csoportot kényelmesen lehet további csoportokhoz, például jelölésekhez, hordozókhoz, szilárd hordozókhoz, stb. való konjugálásra használni.

1, táblázat

Hidrofóbiás index pka

Vált.pH7haz képest

Tér- Rel, frekv, fogat (A?)

Alá	A	0.25	X	0	91.5	6
Asp	D	-0.72	3.86	-1	124.5	6
Glu	E	-0.62	4.2S	-1	155.1	6
Phe	F	0.61	X	0	203.4	4
Gly	G	0.16	X	0	66.4	7
His	H	-0.40	6.0	+0.1	167.3	3
He	I	0.73	X	0	163.8	4
Lys	K	-1.10 ·	10.53	+1	171.3	7
Leu	L	0.53	X	0	167.9	1
Met	M	0.26	X	0	170.8	2
Asn	N	-0.64	X	. 0	135.2	4
Pro	P	-0.07	X	0	129.3	5
Gin	Q	-0.69	X	0	161.1	4
Arg	R	-1.76	12.48	+ 1	210.9	4
Ser	S	-0.26	X	0	99.1	8
Thr	T	-0.18	X	0	122.1	6
Val	V	0.54	X	0	141.7	6
Trp	w	0.37	X	0	23?.6	2
Tyr	Y	0.02	10.07	0	203.6	3

• · » • · · · ·

Az 1, táblázatban szereplő paraméterek (5 paraméter) variálhatók a csoporton belül. Ezek a következők:

1) A hidrofóbiás index (hl) a peptidben lévő egyes aminosav komponensek hidrofóbiás indexeinek összege. Ezt egy n aminsavat tartalmazó peptidre a következő képlettel lehet kiszámitani:

n hi (peptid) = _(hi) i=1

2) Az izoelektromoe pontot (pl) úgy lehet megközeliliteni, mint az ionizálható csoportok pk_ értékei- a nek átlagát,

A harmadik, negyedik ás ötödik paraméter konformációtól függ, jelzésük hidrofóbiás momentum (hm), dipólmomentum (dm) és a redőzöttségi faktor** (cf), ami a simaságot méri· Ezeket a paramétereket hasonló módszerekkel lehet számítani, amelyek minden setben a megfelelő tulajdonság-funkció - azaz a ö -peridóus peridicitása komponensének erőssége - Fourier transzformáltjának modulusa (cT-t úgy határozzák meg, hogy egy «-hélixbez (100°) vagy fi-lemezhez (170°) illeszkedjék, A megfelelő cT érték hozzárendelése a peptid normálisan feltételezett konformációjától függ, vagy attól a konformációtól, amelybe a peptid tervezője szabályozta.

Az azonban nyilvánvaló, hogy a kapott paraméterek általános kapcsolata egy csoport tagjai között nem változik l a konformációról tett feltételezésektől függetlenül. így ha a fenti paramétereket a csoport minden egyes tagjára kiszámítjuk, például «-hélíx konformációt feltételezve, akkor az eredmények mintázata nem fog az igazi mintázattól nyilvánvalóan függetlenül változni, még akkor sem, ha a paptidek valójában nincsenek κ-hélixek formájában. Ez az eredmény különösen fontos a nem rövid paptidek szempontjából, amelyek nem eléggé hosszúak ahhoz, hogy a felismert, rendezett konformációt vegyenek fel.

Ennélfogva a három paraméter, a hidrofóbiás momentum (hm), a dipólmomentum (dm) és a redőzöttségi faktor (cf) kiszámításának módja a következő:.

^{XŐ) =} {[.t ^{Hn Sín(5}'^{,) +} [Σ cos(^)J ⁴

IN

Σ e^iSe-l ahol a hm esetében H=i, dm esetében H= a teljes töltés pH»7 értéknél és a cf esetében Ha térfogat.

Ezen öt paraméter variációjának maximalizálásán alapuló diverz csoport előállítását különböző válogatási technikákkal lehet elvégezni, de egy különösen előnyös megközelítést írunk le az alábbiakban: A jelölt peptideket véletlenszerűen formáljuk, majd azon az alapon válogatjuk, hogy az 5 paraméter mindegyike szempontjából miként térnek el az előzőleg választott jelöltektől, A jelölt peptideket véletlenezerűen választjuk ki egy kezelhető számú, mondjuk a 19 aminosav 90-100 tagú forrásából, amelyben az egyes aminosavak a természetben található fehérjékben megfigyelt gyakoriságuk alapján találhatók. Amint az az 1, táblázatban látható, egyes aminosavak nagyobb gyakorisággal fordulnak elő a természetes fehérjékben mint más aminosavak, a gyakoriságot általában az adott aminosavat kódoló kodonok redundanciájának szintjével mérjük.

Az első formuláit hattagú peptid például minden egyes pozícióban 90-100 forrás paneljéből véletlenszerűen választott aminosavat tartalmaz, A kővetkező peptidet, amelyet szintén a 90-100 tagú forrásból véletlenszerű szelekcióval nyerünk ki, az első jelölthöz hasonlítjuk az 5 mért illetve számított paraméter alapján. Attól függően, hogy van-e lényeges különbség, ezt a jelölt peptidet megtartjuk vagy eldobjuk. Amint egyre újabb jelölteket vizsgálunk le, természetesen egyre nagyobb a valószínűsége annak, hogy a jelölt tulajdonságai túl közel vannak egy, már a panelben lévő Jelölthöz, igy nem tartjuk meg, ée nagyobb számú Jelöltet kell formuláim és levizsgálni ahhoz, hogy egyet megtartunk a csoporban. Az eljárást addig folytatjuk, amig az utolsó elfogadott óta vizsgált Jelöltek száma elfogadhatatlanul nagy. Általában a várható kép a következő:

• ·

- 37 a legutolsó elfogadott óta levizsgált psptidsk száma

ahol a formulálési és szelekciós eljárást valahol a jelzett régióban kell abbahagyni.

Abból a célból, hogy egy végső, 48 tagú panelt kapjunk' előnyös, ha először körülbelül 96 diverz jelöltből álló panelt készítsünk, ezzel lehetővé válik a végső, finom bshangolása a csoportnak. Például az oldalláncok dipólmomentumának a gerinc dipólmomsntumához való viszonyát is megfontolhatjuk. A végső panelt átnézhetjük abból a szempontból, hogy minden egyes paraméterre létezik-e a tulajdonságok eloszlása, azaz az egyes peptidek különböznek-e egymástól legalább X százalékban (a skála 0-100 egység közé való normalizálása után), X értékét a grafikon “munkaigényes** zónája alapján meghatározva. így minden egyes peptid lényegesen különbözik az összes többitől az öt paraméter közül legalább egyben. Ez a megközelítés azért előnyös, mert a számítás könnyebb mint a szintézis. A teljes diverzitást azonban bizonyos mértékig aláássa a konformáció hőindukálta fluktuációja.

A reprezentatív minták alkalmazásának értékét sgy panel össztagszámának csökkentésére egy átvizsgáló eljárás • · — 38 — során számos cikkben leírták, [Carex, W, P, et al, , Anal.Chem,,

59, 1529-1534 (1987)> Skilling, □., Natúré 309. 748-749 (1984)],

Ha a jelölt mlmotóp készletben lévő peptideket kiválasztottuk, akkor az egyes peptideket könnyen előállíthatjuk az Ismert módszerekkel.. Például a T-zsák szintézis iHoughten, R,, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5131-5135 (1986)], lehetővé teszi ezen anyagok mikroszkopikus mennyiségben való előállítását· Emellett az antigén szerkezet felderítésére, valamint az antigén/antitest kölcsönhatások megértése céljából készített szilárd polietilén hordozóhoz kötött nagyszámú peptid szintézisét közölték az irodalomban EGeyssn, Η, M,, Immunoi, Today 6, 364-369 (1985)> Geysen, Η, M, st al. , Molscular Immunoi,, 23, 709-715 (1986)> Geysen, H.M,, 25429/84 számú ausztrál szabadalmi bejelentési,

A szintetikus mlmotóp elegyet úgy is előállíthatjuk, hogy véletlenszerűen szintetizált DNS szekvenciákat shout-gun klónozással például lambda fágvektorokba klónozzuk,majd a fággal fertőzött gazdaszervezetekben expresszáljuk, Ebben a megközelítésben standard, kereskedelmi forgalomban lévő szilárdfázisú DNS-szintézis módsereket alkalmazunk 9-, 12-, 15- vagy 18-tagu, véletlenszerű szekvenciáju oligonuklsotidok előállítására, amelyek szükség esetén azonos szekvenciáju hosszabbításokat tartalmaznak, majd standard expressziós rendszerbe klónozzuk gazdasejtskbe való transzfskcló céljából·

Bármely rekombináns gazdasejt használható, de egy megfelelő expressziós rendszer lambda fágvektorból és bakteriális gazdasejtből áll. Ezeket a transzfektéit anyagokat .azután az expressziéhez megfelelő körülmények között tenyésztjük, hogy megkapjuk a mimotépok keverékét, vagy ha a keverék helyett egy panelre van szükség, akkor az alábbiakban tárgyaltak szerint a transzfektált E.coli sejteket külön telepek formájában lehet izolálni, hogy külön peptideket lehessen előállítani, A peptid-szekvenciák expresszálésára alkalmas rendszerek ismertek az irodalomban, és megtalálhatók például a Maniatis kézikönyvben CManiatis et al, , Laboratory Cloning Manual (1982), Cold Spring Marbor Pressl, A rekombináns módszerrel előállított peptideket is megkaphatjuk keverék formájában, vagy külön peptidek formájában.

Azt ismét hangsúlyozni kell, hogy míg a peptideket nagyon könnyű szintetizálni, addig a potenciális mimotépok választékát nem szabad az aminosav szekvenciákra korlátozni. Az aminoeav-szekvenciák maguk származhatnak mind a természetben előforduló aminosavakból, valamint olyanokból, amelyek nem fordulnak elő a természetben, és olyanokból, amelyek előfordulnak a természetben, de nem kódolja a genetikai kód. Emellett használhatók poliszacharid-komplex struktúrák, valamint kémiailag szintetizált policiklusos struktúrák, amelyek számos 8zub8ztitusn8t tartalmaznak az alakjuk és elektroneloszlásuk megváltoztatása céljából. Azonban a polipeptidek alkalmazása lehetővé teszi a legmodernebb technológiák alkalmazását • · · · · • ♦ ♦ · · · · • ··· · · · és nagyszámú olyan variáns gyors előállítását, amelyek adják a kivánt formák spektrumát anélkül, hogy más szintetikus megközelítést kellene alkalmazni az antigén felületi kontúrok reprezentativ mintáinak előállítására.

D, Átvizsgálás 1 módszerek

A vizsgálandó cél-molekulával reagáló imtnunoqlobulinok

A találmány szerinti elírás egyik fázisa módszer a kereseti vizsgálandó molekulával reagáló antitestek előállítására· Néhány esetben ez csak egyetlen inarálást igényel a véletlenszerűen előállított antitest panel előállításával. Ebben az eljárásban feltételezhetően az antitest panelt közvetlenül vizsgálhatjuk át a vizsgálandó molekulával. Ennek azonban az a hátránya, hogy a vizsgálandó molekulának nagy mennyiségben kell rendelkezésre állni, kémiailag meg kell változtatni, hogy jelölni lehessen, vagy valamely más módszerrel kell konjugálni egy módosító anyaggal, amelyek azután megköthetik a jelölést. A találmány szerinti eljárásban ezt a jelöletlen vizsgálandó molekula és a mimotópok jelölt keveréke kompeticiójával kerüljük el. A mimotóp keverék jelölését könnyen elvégezhetjük olymódon, hogy a peptidlánchoz egy kapcsoló molekulát konjugálunk, akár olyan egyszerűt mint például egy cisztein molekula, amelyet azután kereskedelmi forgalomban lévő linkerekkel (pl. a Piarcé and Co. által árusítottál) konjugáljuk a jelöléshez. Egy másik módszer szerint a peptidet más fehérjékkel lehet konjugálni, például avidinnel, amit azután a jelölés kapt • · · · · · · • · · ···· a a • · · · a a·« a*

- 41 csolására lehet használni. Számos különböző jelölést lehet használni, beleértve az enzimeket, fluoiofórokat, radioaktív ceo port okát, kromofórokat és hasonlókat, A tipikus' enzim-jelölés a torma-peroxidáz, tripszin, kataláz és az alkohol-dehidrogenáz, Fluorofór lehet a fluoreszcein és a danzil. Kromofórok, például külördöző festékek is használhatók, A lehetséges jelölések száma nagy, és jól ismert a szakemberek számára. A jelölést spacer-en keresztül konjugálhatjuk a mimotóphoz, a epacer lehet egy peptid homopolimer vagy más egyszerű peptid, vagy rövid, megfelelő oldhatósággal rendelkező oligomer, például a polietilén-glikol.

A panelt ezután kontrollként előzetesen levizsgáljuk, hogy képes-e a mis&óp elegyhez kapcsolódni. A kapcsolódás mintázatát és a jelölés intenzitását megfigyeljük, és egy előnyös eljárásban a mimotópokhoz kevésbé kötődő antitesteket kidobjuk. Az antitest panelnek nem túl nagy százaléka esik ebbe a kategóriába, mivel a mimotópok elegye elég nagy tagszámú ahhoz, hogy a lehetséges kontúrok nagy változatosságát tartalmazza, és ez legalább néhány olyan tagot tartalmaz, amelyek képesek bármely elképzelhető antitesthez kötődni. Főleg akkor van ez így ha a mimotóp elegy maximális diverzitással rendelkezik, Azt a panelt, amelyről kimutattuk, hogy minden tagja képes a mimotóp elegyhez kapcsolódni, újból átvizsgáljuk jelöletlen vizgálandó molekulát használva a mimotóp eleggyel kompeticióban, A vizsgálandó molekula és a mimotóp elegy (vagy egyes komponensei) használhatók arra, hogy meghatározzuk azokat az antitesteket, amelyekkel a vizsgálandó molekula legsikeresebben

- 42 versenyez.

Részletesebben, a megkívánt számú (körülbelül 10-1000, a belső diverzitástél függően} a diverzebb ©legyeknél a tartomány alsó részében lévő számok klelégitősk) mimotóp ©legyét megfelelő módon jelezzük, például az acil-jódozási módszerrel a 125-s jódizotópot használva Bolton, A,E, és munkatársai módszerével [Biochem. □., 529-539 (1973)], kereskedelmi forgalomba az ICN Radiochemlcals hozza. Más jelölési módszerek, például az avidin/biotin komplexhez kapcsolt fluoreszcein is használható. Amint az előzőekben megjegyeztük, a peptid-kevsréket előállíthatjuk az egyes tagok közvetlen szintézisével majd összekeverésével, vagy nagy fehérjék kis peptidskké való véletlenszerű hidrolízisével. Az egyik megközelítési mód szerint például élesztő-lizátum részleges tripszin-hidrolizétumát használják CClsvsland, D,W. et al. , □, Bioi, Chem., 252, 1102-1106 (1977)]. Ez nagyszámú peptidet eredményez, amelyet elsgykánt is lehet jelezni, vagy SOS gélelektroforézissel el lehet őket választani és egy teszt hordozóra, például Immunodyne-re lehet átvinni ÜBurnette, W,N. , Anal, Bicohem. 112, 195-203 (1981 )], ha a kötődésüket egyenként kell meghatározni,

A jelölt peptid-elegy alkalmazása során szükséges lehet annak igazolása, hogy kielégítő kötődés van a panelben szereplő összes jelölt antitesthez. Ennek az ekvivalens kötődésnek a teljes panelen való meghatározásához szükséges körülményeket is tapasztalatilag kell meghatározni. Egy tökéletes helyzetben a paptid-keverék tökéletesen kapcsolódik a * · ’··: 1

- 43 panel minden egyes tagjához. Gyakoribb azonban, hogy csak hasonló kötődési szintet találnak. Ez teljesen alkalmazható bázist jelent a vizsgálandó molekulával való kompetició szempontjából, mivel az eredmények értelmezése abban az esetben, ha kompetició is van, leegyszerűsíthető a panel tagjai kötődési értékeinek az elegy azonos értékére, azaz 100 százalékra, a kompetició kiértékelése előtt.

Ha az megerősítést nyer, hogy a jelzett peptidelegy durván egyformán kötődik az összes jelölt antitesthez a vizsgálandó molekula távollétében, vagy a hasonló kötődést normalizáltuk, akkor a vizsgálatot megismételjük a vizsgálandó molekula távollétében· Azok a jelöltek, amelyek specifikus affinitással rendelkeznek a vizsgálandó molekulához, csökkenő mértékben fogják kötni a jelzett peptidelegyet, a csökkenés arányos a jelöltnek a vizsgálandó molekulához való specifikus affinitásával, A vizsgálandó molekulához legnagyobb affinitást mutató antitestek mutatják a legalacsonyabb szintű jelzést,mivel ez a vizsgálandó molekula sikeres kompeticióját mutatja az antitesthez a jelzett mimotóp eleggyel. A vizsgálandó molekula f kompéticióra való képességét felbecsülve, azok az antitesteket választjuk ki, amelyek a legnagyobb csökkenést mutatják a jelzés felvételében, mivel olyan paraméterekkel rendelkeznek, amelyek a legelőnyösebbek a vizsgált molekula megkötésére.

Néha az az eset fordul elő, hogy egy antitestet termelő eejt, vagy a panelnek egy ilymódon megkülönböztetett részcsoportja kielégítő specifitással és affinitással rendelkezik a vizsgálandó molekulához ahhoz, hogy immunesszékben ♦ ·· · « • · · ···· · használható legyen további kezelés nélkül. Ha ez az eset, akkor a halhatatlanná tett sejtvonal vagy sejtvonalak szolgáltatják a keresett antitest vagy részcsoport állandó forrását, és a vizsgálandó molekula immunesszéjét ezzel az antitesttel vagy alcsoporttal lehet végrehajtani mint specifikus reagenssel.

Az ilyen vizsgálatokra számos különböző protokoll létezik, amint az közismert a szakterületen jártas szakemberek között. Például a vizsgálandó mintát mikrotiter lemezekre viszik fel, a lemezeket ezután az azonosított antitesttel kezelik,majd mossák. Ennek az antigén-specifikus antitestnek a faj-jellemzőivel reagálni képes jelzett antitesteket (azaz anti-rágcsáló vagy anti-kecske) unk, ^ezután a megkötött antitest kimutatására. Ez a protokoll természetesen csak egy a használhatók közül, és a variációk is jól ismertek a szakterületen.

Más protokollokban például a vizsgálandó molekulát kompetíciós vizsgálattal mérhetjük, amely normális körülmények között egy jelzett vizsgálandó molekulát alkalmaz a mintában lévő jelöletlen vizsgálandó molekulával való kompetició céljából. Ennek megint az a hátránya, hogy a vizsgálandó molekulából nagy mennyiségre van szükség, valamint kémiailag is módositani kell; a további vizsgálandó molekula alkalmazásának ezüksé gszerüséget azonban úgy lehet megkerülni, hogy a megfelelő mimotópot (lásd az alábbiakban) alkalmazzuk kompetitorként.

Az ilymódon kiválasztott részcsoportnak, vagy a véletlenszerűen kiválasztott részcsoportnak néhány esetben a • oee «··· · • 4 ·

- 45 specifitását a vizsgálandó molekula és a panel egyes tagjai közötti kapcsolódás mintázata adja. A 2. ábrán közölt eredmények alapján az egyszerű vizsgálandó molekuláknál a jellegzetes mintázatot viszonylag alacsony tagszámú részcsoportnál meg lehet kapni. Ennek az elképzelésnek a megvalósításához a részcsoportot egy megfelelő mintázatban egy szubeztráton hordozzuk, és mérjük a vizsgálandó molekula kapcsolódásának intenzitását az egyes antitestekhez, igy kialakul a mintázat. Ha megfelelően tervezzük, akkor közvetlenül leolvasható például egy olyan kártyáról, amely 10- 10 000, előnyösen 10-100 ilyen antitestet tartalmaz, így, egy előnyös megközelítési mód szerint egy vagy több, a részcsoport mintázatos tömbjeit tartalmazó hordozót kapunk, akár blottolással, akár más módszerrel átvivő a felüluszókat az egyes sejtvonalakból.

A mintázat-panelt standardizáljuk a vizsgálandó molekulára, tipikusan egy megfelelő protokoll alapján, amely meghatározza a vizsgálandó molekula kapcsolódási intenzitását a panel minden egyes tagjához. Ennek a kalibrációnak egyik megközelít és ivódja az, hogy a panelt tisztított vizsgálandó molekulával kezeljük, és egy kvantitatív detektálási rendszert használunk, például az előzőkben ismertetett, az adott faj elleni, jel-’ zett antitestet. Egy másik módszer szerint egy fordított standardizáló mintázatot úgy kapunk, hogy a jelöletlen vizsgálandó molekulát a jelzett mimotóp eleggyel versengtetjük. A kalibrált panelt használhatjuk azután a vizsgálandó molekula mintájának **·«

V * 9· •·· • · · ······

- 46elemzésére az ismertetett direkt vagy kompetitiv protokoll alapján és a kvantitatív kapcsolódási konstansok következetes mintázatát a kalibrációs panelével hasonlítjuk össze. Ahol a kapott jelölés mennyiségének fluktuációját a leirt módon közvetlenül mérjük vagy kompetitiv módon a minta és a Jelzett vizsgálandó molekula, és az alábbiakban ismertetett módon a vizsgálandó molekulát utánzó jelzett mimotóp, vagy jelzett elegy között, ezek jelzik a fluktuációt a jelzett vizsgálandó molekula mennyiségében· Mindegyik esetben a kapott mintázat jellemző az adott vizsgálandó molekulára, és ugyanaz a panel vagy panelcsoport megfelelő teszt-rendszert biztosit a mintázat-felismeréssel,

A felismert panelt kvantitatívvá is tehetjük, hogy kimutassuk a vizsgálandó molekula szintjét egy mlntasorozatban, például kémiai eljárások, szennyvíztisztítás, vagy egyéb futó eljárások ellenőrzése során. Ahol a vizsgálandó molekula változó koncentrációban van jelen, ott a kapcsolódás intenzitása a felismert mintázaton belül a sorozatban lévő vizsgálandó molekula függvénye lesz. Számos vizsgálandó molekulát lehet egyszerre megmérni egészen addig, amíg a felismerési mintázatuk nem fed át ugyanazon a panelen, és a lényegtelen, jellemzetlen szennyezők jelei nem zavarnak, ha változásuk a vizsgálandó molekulához képes elhanyagolható.

Az 5, ábrán annak illusztrálása látható, hogy miként lehet a diverz antitest panaleket egy adott vizsgálandó molekula jellegzetes profiljának előállítására használni· Egy antitest panelt például előállíthatunk kiválasztott antitestek diverz csoportjából, például egy vagy több random panelből, úgy, hogy a panelben szereplő minden egyes antitest eltérő mennyiségi vagy minőségi reaktivitással rendelkezik egy vagy több adott vizegálandó molekulával. Az 5. ébrén az antitest-panel 20 antitestből áll; azonban kisebb vagy nagyobb számú antitest is használható.

Hogy igazoljuk egy például N mimotópból álló keverékben néhány mimotóppal a megkülönböztetett aktivitást, a panelnek minden egyes antitestjét mind az N, megfelelően, (például radioaktivitáeeal) jelzett mimotóppal reagáltatjuk, hogy kimutatható jelzéseket kapjunk. Minden egyes ilyen, az antitestek paneljével reagáló mimotóp (Mtp) egy kötési profilt hoz létre a panelhez, ami jellemző az adott Mtp-1 , Mtp-2, ,,,Mtp-N mimotópra (5, ábra, A-C panelek). Az 1-N mimotópok kapcsolódási jeleit ezután a panel minden egyes antitestjére összegezzük, Így állítunk elő egy jellegzetes összegzési profilt (0 panel) az N mimotóp csoportjára a panel minden egyes antitestjét figyelembe véve. Tehát a 0 panel is az N mimotóp keverékét reprezentálja. Az egyes antitestekre a mimotóp kötődési jelek összegzését ezután normalizáljuk, úgy hogy az összegzési jel jelentla maximális (100 %) kötődést az egyes antitestekhez (E panel).

Egy adott vizsgálandó molekula vagy érdekes antigén (Ag A**) profilját vagy ujjlenyomat jellemzőit úgy kapjuk meg, hogy az Ag A-t ée az 1-N mimotóp jelzett keverékét a panel minden egyes antitestjével reagáltatjuk. Az Ag A (F panel) által létrehozott kompetíciós profil általában azt eredményezi, hogy a jelzett mimotópok kevésbé fognak kötődni a panelben lévő néhány antitesthez, mivel az Ag A sikeresen verseng a panelben lévő néhány antitestttel. Az 5. ábrán lévő F panel azt mutatja, hogy az Ag A hatására az N mimotóp jelzett keveréke kevésbé kötődik a panelben lévő négy antitesthez.

Azon antitestek kötődésének mértékét (vagy csökkenését) amelyekkel az Ag a sikeresen verseng a jelzett mimotóp elegyért, meghatározzuk (G panel), és a panel minden egyes tagjára a kötődés mértékét (vagy csökkenését) újra ábrázoljuk, igy kapunk egy olyan antitest kötési profilt (H panel), amely jellemző az Ag A-ra, ha más vizsgálandó molekulák profiljával (Ag B, I panel) hasonlítjuk össze, az antitesteknek ugyanazt a referencia paneljét, és ugyanazt a mimotóp elegy₍kompetitiv csoportot használva.

Az azonnal látható,hogy az antitest panelben felhasználandó antitestek diverz csoportjának megválasztása egy vizsgálandó molekula olyan individualizált profilját eredményezheti, amely hasznos lehet annak kimutatásában és mennyiségi meghatározásában.

A vizsgálandó molekulával kompétitiv mimotóp kiválasztása

Abból a célból, hogy kiválasszuk a megfelelő kompetitiv mimotópo(ka)t, a mimotóp elegyet magát egy panelbe kell ezegregálni és átvizsgálni. Az átvizsgáló eszköz (próba) már hozzáférhető az eredeti panelből választott antitset(sk) formájában. Ebben a fázisban a mimotópokat egyedi vegyűletekként alkalmazzuk, tipikusan egy szilárd hordozón, úgymint nitrocellulózon, mikrotiter lemezen, vagy a Geysen féle többcsapu rendszeren. Ha a panelt szilárd hordozóra vive alkalmazzuk, akkor a legkényelmesebb jelzetlen (vagy nem elég hatékonyan jelzett) mimotópot használni, és a jelzést a kiválasztott átvizsgáló antitesthez, vagy szekunder detektáló antitesthez konjugálva bevinni a rendszerbe. Az egyes mimotópokat ezután közvetlenül vagy közvetve vizsgálhatjuk át a jelzett antitesttel. Használható egyetlen antitest, vagy egy néhányat tartalamzó részcsoport. A részcsoport lehet előnyős, a kiindulási panel egyse tagjai epscifitásának általános hiánya fényében. Azokat választjuk ki az átvizsgáló részcsoportba, amelyek legsikeresebben kötődnek. Egy másik módszer szerint a mimotóp slsgyst úgy lehet átvizsgálni, hogy a mimotóp slsgyből egyre kisebb részcsoportot használunk, egészen addig, amig egy megfelelően kötődő mimotópot kapunk.

Előnyös, ha a mimotóp panelt mind direkt módon, a jelzett antitesttel, mind kompetíciós esszével átvizsgáljuk. A mimotópóknak azt az alcsoportját, amelyek sikeresen, kőtik az antitestet, ismét átvizsgáljuk abból a szempontból, hogy a vizsgálandó molekula képes-e megbontani ezt a kapcsolódást. Amelyekkel a vizsgálandó molekula a legsikeresebben verseng, nyilvánvalóan azok utánozzák legtökéletesebben a vizsgálandó molekulát, és ezek a megfelelő jelöltek az antitest specifitás további finomitására immunizéclóval. Ez is egy megfelelő váleztás az immunesszében való közvetlen felhasználásra, amint azt a kővetkező paragrafusban leírjuk,

A megfelelő alcsoport vagy egy mimotóp szolgáltatja a szükséges reagenst a kompetitiv immunesszéhez, ahol a jelzett mimotóp szolgál a vizsgálandó molekula kompetitoraként,

A vizsgálandó molekula mérésére szolgáló megfelelő kitek is a találmány részét képezik, A kit összetétele a kimutatás vagy mérés protokolljának tervezésétől függ. Mindegyik kit tartalmaz utasításokat az esszé végrehajtására, valamint megfelelő reagenseket és jelzést, és szükség esetén szilárd hordozót· Ha a kitst egy vizsgálandó molekula egyszerű kimutatására tervezték, egyetlen nagyon specifikus antitest felhasználásával, akkor a kit ezt a nagyon specifikus antitestet tartalmazza, valamint néhány eszközt ennek az antitestnek a vizsgálandó molekulával való reakciójának a detektáláséra, A detekáló reagens például tartalmazhatja aspscifikus antitest jelölését magát, amikoris a vizsgálatot a vizsgálandó molekula szilárd hordozóhoz való aspscifikus kötődésével hajtjuk végre, és azt vizsgáljuk, hogy a szilárd hordozó képes-e megkötni a Jelzett antitestet. Ha a vizsgálandó molekulára egynél több specifikus antitestet találunk, és nincs olyan szférikus gátlás, amely megakadályozná, hogy egynél több antitest kapcsolódjon a vizsgálandó molekulához, akkor szendvics tipusu esszét használhatunk, olymódon, hogy sgy Jelzetlen antitestet használunk az antigén befogására, és egy másodikat a befogott antigén kimutatására. Egy másik módszer szerint a kitek olyan antitest-paneleket tartalmazhatnak, amelyeknek a felismerési mintázatét a keresett vizsgálandó molekulára kalibrálták, Emellett a jelzett kompetitiv mimotópot vagy keveréket is tartalmazhat a kit, ami lehetővé teszi az esszét a mintában lévő jelzetlen vizsgálandó molekula és a jelzett mimotóp között.

Egy másik módszer szerint a mintázatot megfordíthatjuk, és egy antitestet ha szükséges akkor jellemezhetünk abból a szempontból, hogy milyen a kötődés mintázata néhány mimotóphoz, mind a mimotóppal való kompeticlóval, mind anélkül. Ez a mintázat a vizsgálandó molekulára jellemző profilt is szolgáltat. Ha egy korlátozott számú, például 40-100,előnyösen körülbelül 50-60 mimotópot tartalmazó diverz panellel végezzük, amelyek a tulajdonságok szempontjából maximálisan különbözőek, akkor ezt az eljárást arra is használhatjuk, hogy minden egyes antitest multiplicitásra felismerési mintázatot készítsünk, A felismerési profilokat egy számitógép file-ban tárolhatjuk. Mivel csak néhány esszére van szükség minden egyes profilhoz, ezért a profiloknak egy nagy kollekcióját Jegyezhetjük fal. Azokat az antitesteket, amelyekről valószínű hogy egy uj vizsgálandó molekulához kötődnek, elektronikusan válogathatjuk ki olymódon, hogy az antitestek tárolt felismerési profiljait illesztjük az uj vizsgálandó molekula mimotóp homológia profiljához, amint azt az alábbiakban ismertetjük,

A vizsgálandó molekula mimotóp profilját legkönnyebben úgy határozhatjuk meg, hogy a mimotóp panelre egy fordított képű referencia antitest csoportot használunk. Egy 50 tagú mimotóp panel esetében ez 50 antitestet tartalmaz, és az 50 antitest mindegyike 10-100-szor erősebben kötődik az 50 mimotóp közöl egyhez, mint a másik 49-hez, Tehát például mindegyik monoklonális antitest kötődési affinitása nagyobb lehet 10 1/mol értéknél, arra a mimotópra, amelyikhez illik, de 10^ 1/mól-nál kisebb bármelyik másik 49 mlmotóphoz,

Λ

A fordított képű panelt úgy kaphatjuk, hogy standard monoklonális antitest előállítási módszereket használunk, a mimotóppal immunizálva, és a keresett mimotóppal szelektálva bármely kontencionális szűrővizsgálati eljárásban. Azokat a monoklonális antitesteket választjuk ki, amelyek a megfelelő specifitással rendelkeznek, igazolva, hogy nem képesek a fennmaradó 49 mimotóppal reagálni. Egy kényelmes előzetes szűrővizsgálat tehát tartalmazhatja a kompetíciót a 49 jelzett nem-jelölt mimotóp és a jelzett keresett mimotóp között, ahhoz hasonló módon, mint amit a fentiekben a random panelből az antitestetk azonosítására leírtak.

Ennek az elképzelésnek egy nagyon egyszerű megvalósítási módja sorén egy uj vizsgálandó molekula, amelyet csupán az inverz képű referencia panel //7 antitestjével detektálunk, néhány olyan motívumot mutat, amelyek erősen analógok a referencia mlmotóphoz, a többi 49 mimdtóphoz viszonyítva, Egy antitest, amelynek tárolt felismerési profilja erős kötődést mutat a mlmotóphoz a többi 49 mlmotóphoz viszonyítva, nagyon valószínű, hogy felismeri az uj vizsgálandó molekulát. Hasonlóképpen, ha az uj vizsgálandó molekula egyformán kötődik az inverz képű referencia panel //7 és //11 sorszámú antitesteihez, és gyengén bármelyik másikhoz, majd azokat az antitesteket, amelyek egyformán felismerik a //7 és //11 mimotópokat, a többieket csak elhanyagolható módon, akkor nagy a valószínűsége, hogy felismeri a vizsgálandó molekulát.

Még általánosabban, komplexebb felismerési mintázat is alkalmazható. Egy nagy kollekció minden egyes antitestére a mondjuk 50 tagú mimotóp panel minden egyes tagjára a kötődési koefficiens vagy immunreaktivitás határozható meg. Például a nagy panel 664-es számú antitestje 50-es kötődési koefficienst mutat az 1-es számú mimotóppal, 25-öst a 2-ee számú mimotóppal, 122-est a 3-as számú mimotóppal, 10-est a

4-es számú mimotóppal, 200-ast az 5-ös számú mimotóppal, és igy tovább, A kapott 50 pontos mintázat határozza meg az egyes antitestet.

Mivel a monoklonális antitestek fordított képű referencia panelje ugyanabban a kapcsolatban áll bármely potenciális vizsgálandó molekulával vagy cél-antigénnel mint amilyen kapcsolatban az eredeti 50 tagú mimotóp panel a nagy antitest kollekcióban lévő antitestekkel, egy tetszőleges vizsgálandó molekulát közvetve azonosíthatunk a nagy antitest kollekció legerősebb illesztési mintája alapján, olymódon, hogy a vizsgálandó molekulát az 50 tagú fordított képű antitest csoportjára vizsgáljuk le a vizsgálandó molekula profilja vagy jellemzői meghatározásának céljából. Az a profil, amelyet úgy kapunk, hogy a fordított képű csoportban minden egyee monoklonális antitestet reagáltatunk a cél vizsgálandó molekulával, az megfelel annak a profilnak, amelyet úgy kapunk, ha az ideális antitest partnert vizegéljuk le az 50 tagú mimotóp panellel szemben. Egy ideális esetben a 664-es antitest által felismert vizsgálandó molekula olyan reaktivitás! mintázattal rendelkezik, amely körülbelül 50-es kötődési koefficienssel rendelkezik az 1-es számú monoklonális antitesthez, 25-össel a 2-ee számú monoklonális antitesthez, 122-sel a 3-as számú monoklonális antitesthez, 10-sel a 4-es számú monoklonális antitesthez, 200-assál az 5-ös számú monoklonális antitesthez, stb.

A vizsgáló eljárás ilyen megközelítését használhatjuk egy adott antitest kiválasztására egy alap-csoportból, vagy bármely nagy csoportból, amely egy tetszőleges vizsgálandó molekulával reagál referencia indexként diverz mi^otópok kisebb kiegészítő csoportjait és fordított képű antitesteket használva. Az eredeti nagy antitest csoport minden egyes tagját egy (például) 50 tagú diverz mimotóp panellel szemben jellemezzük, igy az 50 tagú mimotóp panelnek egy fordított képű antitest készletét kapjuk, ée a potenciális vizsgálandó molekulával vagy antigénnel szemben vizsgáljuk a fordított képű antitest panelt, igy kapunk illeszkedő profilokat.

Ennek a megközelítési módnak egy hasznos alkalmazása az, amelyben az uj vizsgálandó molekula bsteg-specifikus ráksejt felületi antigén, és az antitest kollskció képviseli az anti-tumor monoklonális antitestek teljes akkumulált tömbjét, amit ma többezres nagyságúnak becsülnek. Az antitumor antitestek tömbjét először mimotópok kis csoportjával szemben tipizáljuk, igyjkapjuk?referencla profilok csoportját. Mindegyik sejtfelszíni antigént ennek a mimotóp csoportnak a fordított képével jellemzőnk, és a kapott profilt hasonlítjuk össze az antitest tömb tagjainak tárolt profiljaival, A profil legjobb illeszkedése mutatja az előnyős antitestet. Ennek a megközelítésnek az előnye az antigének jellemzésében a következő:

(i) kisméretű biópszia mintákat tipizálhatunk nagyszámú antitesttegezemben» (ii) a biopszia-mintát nem kell kémiailag módosítani, mivel a detektálási jelzést, ami ahhoz kell, hogy az antitestek referencia paneljéhez való kötődést mérjük, azt az antitesthez is kapcsolhatjukj és (iii) az antitest-jelöltek tömbjét gyorsan és olcsón át lehet tekintetni,

E, Az antitest jellemzők .javítása az immunrendszer felhasználásával

Miután a mimotópoknak egy előzetes csoportját kiválasztottuk, ez arra használható,hogy nagyszámú B-ssjtet • · · · · « « · vizsgáljunk át sgy olyat keresve, amelyik nagyobb affinitással/ specifitással rendelkezik mint azok, amelyek az első vizsgáló panelben találhatók. A legegyszerűbb esetben a teljes pihető B-sejt repertoárt (körülbelül l0⁷sejtet) át lehet vizsgálni Fluorescencs Acitivated Coll Sorter-rel, a fluorofórhoz kapcsolt mimotópokat használva próbaként.

A normál in vivő immunválasz “érésének” elemzése azt sugallja, hogy magasabb affinitásu kiónokat nem úgy a legjobb előállítani, hogy további alap repertoár B-sejteket vizsgálunk át, hanem úgy, hogy a vizsgálandó molekula kombináló helyének megfelelő hiperváltozékony szekvenciák randomizálását iniciáljuk.

Egy lényegre törő megközelítés szerint, amellett hogy immunesszében jól használható kompetitiv reagens, a szelektált mimotóp vagy részcsoport immunogénként is használható az antitest specifltás és/vagy affinitás javítására. Bizonyos szempontból ez az aspektus hasonlít a vizsgálandó molekulával vagy antigénnel végzett standard in vivő immunizáclóhoz, azzal a különbséggel, hogy antigén utánpótlásra nincs szükség, és az antigén toxicitásnak elejét lehet venni. Emellett az önmaga ellen irányuló T-sejt válasz elnyomása és normalizálása úgy érhető el, hogy a mimotópokat megfelelő hordozóhoz, például furócsiga hemocianinhoz (KLH) vagy tetanusz toxoidhoz konjugálják.

A kísérletnek alávetett emlős immunizálása a hordozóhoz kötött immunogén mimotóppal vagy részcsoport keverék* · · · · • · · · · « · kel olyan B-sejtek termelődését eredményezi, amelyek halhatatlanná tehetők és az adott vizsgálandó molekulával szembeni magas affinitásuk és specifitásuk megvizsgálható, például a fent említett módszerrel, amelyben a vizsgálandó molekula/mimotóp kompetició a specifitás és affinitás digenosztikai jellemzője. Egy másik módszer szerint a keletkező B-llmfocitákat először a fentiekben javasolt módon vizsgálhatjuk át, fluoreszcencia-aktivált sejt-osztályozót (FACS) használva, a mimotópot egy fluoreszcencia jelzéshez kötve, és igy hajtva végre az átvizsgáláshoz használt reakciót az osztályozás előtt. Az azonosított jelzett sejteket ezután halhatatlanná tehetjük, és szükség esetén átvizsgálhatjuk.

Az antitestek panelje ezen a szinten néhány olyat is tartalmazhat, amelyek specifikueabbak és erősebben kötődnek a mimotópokhoz mint azok, amelyek a kezdeti átvizsgálás idején hozzáférhetők voltak. Normális körülmények között ezek inkább az IgG osztályba tartoznak és nem az IgM osztályba, amely az alap repertoránál általános* A kísérletnek alávetett emlősállat immunrendszerét használva szomatikus mutációs mechanizmusként a B-sejt differenciálódáshoz, valamint a szaporítandó differenciálódott B-sejtek kiválasztójaként a keletkező panelnek egy sokkal szükebb kört biztosit az immunreaktiv komplementek szempontjából, de egy sokkal nagyobb speclfitást és affinitást a komplementer vizsgálandó molekulával szemben, amelyre összpontosítunk,. Addig a mértékig, ameddig a mimotópok utánozzák a vizsgálandó molekula megfelelő

- 58 tulajdonságait, a keletkező antitestek a vizsgálandó molekulával szemben nagyobb specifitással és affinitással rendelkeznek.

Ennek az immunrendszerrel végzett preocesszálásnak az első aspektusa, azaz a B-sejtek differenciálódása változások keltése céljából az immunoglobulinok variábilis régiói kontúrjaiban, utánozható rekombináns DNS technikák alkalmazásával az eredeti panel jelölt antitestjeit kódoló DNS-t a módosítások tartaányában megváltoztatva, és igy állítva elő immunoglobulint vagy immonoglobulin fragmentet kódoló DNS-szakaszokat. Tehát ismert izolálás! technikák alkalmazásával az alap repertoár panelből választott sejtek által kiválasztott immunoglobulinokat kódoló DNS-t izoláljuk, mint a kiindulási anyagok csoportját. Az izolált DNS.ek szekvenciáit, amelyek az immunoglobulinok hiperváltozékony régióit kódolják, ezután akár véletlenszerűen, akár helyspecifikus mutagenezissel megváltoztathatjuk, hogy a keletkező antitestek hipervariábilis régióiban módosításokat hozzunk létre. A hiperváltozékony régiók azonosítására és megváltoztatására a szakirodalomban ismert technikák vannak leírva. A mutáne DNS-t ezután élesztőben vagy baktériumban expresszáljuk, igy kapjuk a második sorozatú panelt, amelyek az Immunrendszer által generált panelnek a hatókörét szolgáltatják, de a szelektivitását nem.

Ismét, az immunrendszerrel vagy rekombináns DNS módszerrel készített második sorozatú panellel egy különösen előnyös jellemzőkkel rendelkező antitest választható ki, vagy • · • * · ····· · · ·· · · ···· · ·

- 59 előnyösebben egy részcsoportot kaphatunk, amely olyan panelt eredményez, amely egy adott vizsgálandó molekulához való affinitás szempontjából egy adott profilt mutat, A kiválasztott panel alkalmazását általános vizsgáló eljárásokban az alábbiakban ismertetjük,

F, Az antitest panelek alkalmazása az elemzésekben

A mimotópos (vagy a vizsgálandó molekulával végzett) immunizálással kapott antitestek repertoárját (amelyeknek a termelését állandóvá tehetjük a termelő δ-sejtek halhatatlanná tételével) is használhatjuk azonosító diagnosztikumként a tesztmintában lévő vizsgálandó molekulára. Tipikusan egy kezelhető kis részcsoportot alkalmazunk, de nincs elvi akadálya annak, hogy nagyobb tagszámú csoportot manipuláljunk az alábbiak szerint, ha megfelelően formázva vannak, A vizsgálandó molekula egy bizonyos kötődési profilt mutat, ami jellemző a vizsgálandó molekulára.

Amint az előzőekben kijelentettük, fordított képű panelek használhatók akár vizsgálandó molekulák, akár antitestek jellemezésére, A fordított képű panelek tagjai előnyösen kisszámuak ahhoz, hogy a gyakorlatban használható csoportot képezzenek, de elég nagyszámuak ahhoz, hogy értelmes panelt adjanak. Ezek a panelek általában 30-100 taguak, előnyösen körülbelül 50 taguak, A vizsgált molekula reaktivitása a monoklonális antitest fordított képű paneljével (vagy a mimotóp referencia panel antitestjével) megbecsülhető a szakíró dalomban ismert számoe módszerrel, például a közvetlen vagy

• · ♦·»· · · *· · · · ··· ·· kompetitiv jelzés kötéssel.

Számos protokoll felidézhető, de minimumként a mintázattal rendelkező, hordozón lévő panel nagyon kényelmes eszköz sgy vagy több reaktivitás! profil megállapítására egy adott vizsgálandó molekula esetében. Mivel a profilok annyira egyéniek, a bennük lévő különbségeket használhatjuk arra, hogy megkülönböztessük az egymással szoros rokoni kapcsolatban álló vizsgálandó molekulák tagjait, például a különböző tipusu prosztaglandinokat, a különböző izosnzimskst vagy az egymásra erősen hasonlító gyógyszereket.

A találmány tárgya továbbá körülbelül 10-10 000 tagú, előnyösen 50 tagú maximálisan diverz antitest panelje, amely antitestek a vizsgálandó molekulához változó affinitással vagy specifitással rendelkeznek, miniázatos formában elrendezve egy szilárd hordozón. Ezután a szilárd hordozót használhatjuk arra, hogy a kötődési affinitás és/vagy specifitás mérésével, például jelzett mlmotóp mint kompetitiv sorozathigitásával, vagy direkt esszével megvizsgáljuk, a minta tartalmaz-e vizsgálandó molekulát. Az ilyen affinitás jellemző mintázata jelzi a vizsgálandó molekula jelenlétét, mivel a kapott mintázat egyedi, és jellemző egy adott anyagra.

Az alábbiakban ismertetett panel reprezentáció lehetővé teszi, hogy nagyszámú tag legyen a panelben. A mintázatot leolvashatjuk szemmel, vagy pásztázó technikákkal, digitális vagy analóg értékekké alakítva.

A találmány tárgyai továbbá az antitesteknek vagy mimotopoknak ezt a repertoárját tartalmazó kitek meg-

··»*

- 61 felelő tömbben, igény esetén a megfelelő kompetitiv mimotóppal (mimotópokkal) egy kényelmes csomagolási formában, ée a teszt végrehajtásához szükséges használati utasítással,

G, A panelek bemutatása

Meg kell jegyezni, hogy a találmány szerinti módszerek számos lépése, valamint a találmány szerint előállított kitek megkövetelik a mimotópoknak vagy antitest-termelő sejteknek az egyes tagok vagy egyes csoportok szerint szervezett tömbben való elrendezését. Ismertek standard módszerek az ilyen tömbök előállítására, amint azt az előzőkben kifejtettük, beleértve a mikrotíter lemezek ée nitrocellulóz vagy polisztirol lemezeken való replikáik alkalmazáeát.

Ennek a rendezett: tömbnek a megőrzésére egy előnyős módszer az aktivált membránok használata, beleértve azokat, amelyek kereskedelmi forgalomban vannak, vagy azokat, amelyeket az alábbiakban Írunk le derivatizált agaróz felhaszTM nálásával (példa erre a kereskedelmi forgalomban lévő NuFix agaróz). Ezt az anyagot használták hordozóként körülbelül 1,5 mm vastag gélek formájában EShainoff, □.R, et al,, Biotechniquee, 4, 120-128 (1986)3, A derivatizált agaróz fehérjék és peptidek nagyobb kötési stabilitását eredményezi mint a polisztirolhoz és nitrocellulózhoz való adszorpció, mivel kovalens kötés jön létre, A jelen találmány tárgya továbbá egy javított módszer a derivatizált agaróz mint szilárd hordozó felhasználására a szükséges panelekben.

Ebben a javított eljárásban a derívatizált agaráz gélek felhasználása helyett, amelyeket nehéz kezelni, és nem adnak teljesen reprodukálható eredményeket, egy semleges hordozót, például üvegszövet szűrőpapírt impregnálunk az agarózzal. Az impregált szilárd hordozó alkalmazásával a kezelés egyszerűsége és reprodukálhatósága nagymértékben megjavul.

A találmány szerinti hordozók előállítása céljából a derívatizált agarózt, például a NuFix^** agarózt megfelelő térfogatú vízben oldjuk kb. 0,1 - 0,5 előnyösen 0,3 % koncentrációban, majd a lúg, például 0,1 mól végkoncentrációju nátrium-borát hozzáadása előtt felforraljuk. A szilárd fázisú adszorbenst, azaz a.megfelelő méretű üvegszövet szűrőpapírt a feloldott agarózba mártjuk,majd a feleslegben lévő folyadékot eltávolítjuk. Az elkészült lemezeket lehűtjük, lehetővé téve az agaróz megszilárdulását, majd nedves körülmények között 4 °C-on tároljuk.

Amikor használatra kész, akkor az agarózzal Impregált papírokat a kötő reagenst, frissen oldott nátrium-ciano- borohidridet (1 mg/ml), tartalmazó friss nátrium-borát oldattal hozzuk egyensúlyba, a fölösleges folyadékot eltávolítjuk, és a lemezeket kívánt mintázat szerint elhelyezzük a hordozón. Ezt számos, kereskedelmi irgalomban lévő eszközzel elR végezhetjük, beleértve a CloneMaster -t (Immunslne Corporation), ami 96 laposvégü fémpálca a 96 lukas mikrotitsr lemezek mintázata szerint elrendezve, vagy más kényelmes átvivő mecha63 ··«· <··* · ·· ·* • ♦ · ♦ · · · • * · · · * · • · · ···· · · » nizmussal. Az átvitt anyagokat hagyjuk reagálni a papírral

5-15 percig, előnyösen körülbelül 10 percig, majd egy puffért és megfelelő fehérjét, például BSA-t tartalmazó oldatban fixáljuk, A foltokat a mintában lévő anyagnak megfelelő reagens-rendszerrel hivjuk elő.

Példák

A kővetkező példák célja a találmány illusztrálása, nem tekinthetők a hatókör korlátozásának. Az 1, példában egy bizonyos módszert írunk le olyan antitest-szekretáló sejtek paneljének előállítására, amely a teljes B-sejt repertoár részcsoportja, jellemzi azt a részcsoportot. Más, a fentiekben ismertetett módszerek is használhatók ennek a panelnek az előállítására· Ismertetünk továbbá egy módszert mimotópok reprezentatív elegyének előállítására; ezt is megtehetjük számos más módszerrel és jelzési eljárással,a fentiek szerint,

A 2, példában a találmány szerinti hordozós antitest panel készítését írjuk le.

1, példa

Antitestet kiválasztó halhatatlanná tett sejtek paneljének előállítása hetes him BALB/C egerekből standard módszerekkel lépesjtsket izolálunk, majd 200 ml komplett táptalajt (Iscovs féle módosított Oulbscco táptalaj (IMOM), 1O % borjumagzat szérum, 0,4 mmól 2-merkapto-stanol, 2 mmól L-glutamin) tartalmazó 650 ml-es lombikba tesszük. Nyélkabaktérium adjuvéns* ···: ···» :

• « · · • · · ···« (2 mg) adunk a sejtekhez poliklonálls stimulátorként, majd a stimulált tenyészeteket négy napon át 37 °C-on tartjuk,

A sejteket centrifugálással nyerjük ki (10 perc, 1000/perc), majd 10® mieloma sejttel elegyítjük (P3X63AG8,653), amelyet hasonlóképpen nyertünk ki Oulbecco féle kétértékű kation mentes PBS-ből, 8 percig 500/perc fordulatszámmal centrifugálva, A felüluszót eltávolítjuk, és az üledéket 0,6 ml 50 v%-os PEG 4000-ben szuszpendáljuk (gázkromatográfiás minőség) 1 percre,A szuszpendált üledéket tartalmazó csövet óvatosan rázogatjuk 45 másodpercig 37 °C-on, majd további 45 másodpercig állni hagyjuk. A sejteket újra ülepítjük 3 perces, 500/perc fordulatszámú centrifugálással, azüledék felzavarása nélkül 15 ml 37 °C-oa IMDM-et adunk a csőhöz, majd újra lecentrifugáljuk (5 perc, 5000/perc),

A felüluszót eltávolítjuk, majd az üledéket ismét felszuszpendáljuk 15 ml komplett táptalajban (37 °C), amely 0,4 •5 mmól hipoxantint és 1,6 x 10 mól timidint tartalmaz (komplett táptalaj + HT). A szuszpenziót 155 ml komplett táptalaj + HT oldathoz adjuk, 30 ml lép-aktiváló anyaggal együtt (a lépsejt kinyerés fslüluszója), A szuszpenziót 650 ml-es lombikba öntjük,majd 12-18 órán át 37 °C-on inkubáljuk, A szuszpendált sejteket két tizhetes BALB/C nőstény egérből elősütött makrofágokkal és lépsejtökkel tápláljuk, valamint 2 x 10**? mól aminopterint (A) adunk hozzá, és a szuszpenziót 200/ul-enként szétmérjük 96 lyukas szövsttenyéeztő lemezekbe (összesen 10 lemez).

Lyukanként 5-10 kiónt kapunk. Tehát egyetlen kiindulási aktivált lépből több mint 5000 antitest-termelő sejtet nyerünk. A telepeket tovább szeparálhatjuk egyedi sejtvonalakká, vagy a kezdeti szűrővizsgálatban csoportként használhatjuk.

2. példa

Panelek készítése aqaróz hordozón

NuFix™ agarózt oldunk valamivel több mint 0,3%ban vízben, 70 °C-on 10 percig, majd 10 percig forraljuk a gyártó előírásai szerint. Egytized térfogatnyi 0,1 mólos nátrium borátot (pH s 9.0) adunk hozzá, majd az oldatot 55 °C-os vízfürdőben lévő edényekbe öntjük. 7,5 x 12.5 cm-es darabokra vágott Üveg<« szövet szűrőpapír lapokat (Schlelcher and Schuell) merítünk az agarózba, majd a fölöslegben lévő folyadékot szűrőpapírra fektetve távolitjuk el róluk. A lapokat viaszpapirra helyezzük, majd 10 percig hütjük, hagyjuk az agarózt megszilárdulni; a lapokat nedves kamrában tároljuk 4 °C-on.

Felhasználáskor az impregnált papirt 5 percig egyönsúlyba hozzuk 0,1 mól nátrium-boráttal (pH 9,0), amely 1 mg/ml'nátrlum-ciano-bórhidridst tartalmaz. A fölösleges folyadékot leszivatjuk és a lapot műanyag fóliára helyezzük. A 96 lyukas lemeznek minden egyes lyukából egy mikrolitsrnyi mintát (növekvő rágcsálósejtekkel vagy anélkül) átviszünk a papirra standard 96 pontos elrendezésben, majd a tenyésztő lemez táptalajának átvitt pontjait reagáltatjuk a papírral 10 percig. A fölöslegben lévő kötőhelyek blokkolása céljából a lapot ezután • · · · · · · _ · · · · · ·· • · · ···· · · · ·· · · *··· ··

0,1 mól TRIS-HC1 (pH=8.0), 0,1 mól NaCl, 1 v% szarvasmarha szérumalbumin összetételű oldatba msritjül$· A folyadék eltávolítása után 5 ml peroxidázhoz kötött kecske anti-egér szérumot (Zymed), amelyet azonos összetételű pufferben 1:3000 arányban hígítottunk, pipettázunk a lapra, majd a lapot szobahőmérsékleten inkubáljuk 15 percig, vagy a reagenst úgy használjuk, hogy a reagenssel átitatott szűrőpapírral szemben blottoljuk, A megkötetlen antitesteket leszívjuk, majd a papírt 5-10 percig 0,1 % BSA-t tartalmazó, foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, többször cserélve az oldatot,

A megkötött peroxidázt 10 mg/ml tatrámátil-benzidin % metanol, 50 % citromsav összetételű oldatban tesszük lát hatóvá, amelyhez hidrogén-peroxidot adunk 0,1 % végkoncentrációban, Az eredményeket vagy reflexiós denzitométerrel, vagy fényképezéssel rögzítjük.

Az 1« ébra egy hibridoma tenyészet sorozathigitásával kapott eredményeket mutatja a lemez egymást kővető soraiban, Az intenzitás változása tisztán látható,

A teszt-anyagok paneljeit manuálisan vagy kvantitatív detektálási módszerekkel olvassuk le. Például az elrendezett panelt egy specializált berendezéssel lehet leolvasni, amelyet arra terveztek, hogy digitalizálja a jeleket, például a fluoreszcencia jeleket minden egyes pontban, és számítógéppel feldolgozható formában adja ki. Tehát Így minden egyes pontról kvantitatív mérési eredményűnk lehet,

A panel adott konfigurációi, amelyek hasznosak lehetnek a találmány szerinti eljárás végrehajtásában, lehetnek kis méretűek, például 7,5 x 7,5 cm-esek, 100 oszlopot és 100 sort tartalmazók. Ez a 10 000 különböző antitest teljes tömbje, vagy antiteetek poolja, mutatja az adott vizsgálandó molekula reaktivitásának karakterisztikus mintázatát,

3, példa

Diverz mimotóp panelek szintézise pentapeptidböl álló panelt tervezünk azon az alapon, hogy csökkenjen a hidrofobicitások, a hidrofóbiás momentumok pedig periodikusan változzon, A 3, ábrán látható az 1-88-as sorszámmal ellátott megezintetizált pentapeptidek$ a 4,ábra mutatja a hidrofóbiás index és a hidrofóbiás momentum változását a panelben,

A panelt Geysen és munkatársai módszerével [Proc, Natl, Acad, Sci, USA, (supra) (1984)] szintetizáljuk meg, amely 96 fejes elrendezést alkalmaz, A megmaradó nyolc fejet a szintézis kontrolijainak szintézisére használnak, amelyeket aminosav analízissel elemeznek.

125

A panel mimotópjait ezután összekeverjük, I -tel jelöljük a Bolton-Hunter reagenssel, amint azt a fentiekben leírtuk, majd az alap antitest repertoár egyes tagjaival teszteljük mikrotiter lemezeken, A repertoár minden egyes antitest tagjához közel egyforma kötődést tapasztalunk, A vizsgálatot ezután megismételjük meghatározott mennyiségű vizsgá68 landó molekulának az elegyhez adásával, mikrotiter lyukakban· Kisszámú lyuk mutat nagymértékben lecsökkent jelzést· l

Ezek az antitestek jelentik egy kezdő szűrővizsgálat sikeres eredményét olyan antitestek iránt, amelyek hajlandók megkötni a vizsgálandó molekulát.

4. példa

A jelzett mimotóp hatékonyságát mint a nem-azonos vizsgálandó molekulával versengőt az antitestek átvizsgálásában, a 6« ábrán mutatjuk be· Két különböző monoklonális antitestet alkalmazunk kettős sorokban,, 12 pont van egy sorban, szűrőpapír szubsztrátumon. A 6. ábrán a 1-2. sort Mab 33-6 monoklonális antitesttel kezeljük, a 3-4. sort Mab 9-7-9 monoklonális antitesttel, míg az 5, sor a kontroll, antitest nélkül· Szarvasmarha szérumalbumint használunk minden egyes pontra a fölösleges kötési hely blokkolása céljából. A jelzett peptid/mimotóp MB4-FITC (MB4 = Cys-Asn-Ty-rSer-Lys-Tyr*-Trp-Tyr-Leu-Glu-His-Ala-Lys) pontjait, amelyek a panel 2-11.

—5 oszlopéban helyezkednek el, használjuk 2 x 10 beállított koncentrációban. A 2-11, oszlop is tartalmaz jelzetlen kompetitor peptid/vizsgálandó molekulát (MB3 Cys-Asn-Tyr-Ser-Lys-Phe^H-Trp-Tyr-Leu-Glu-His-Ala-Ile-Ser) (m jelenti az eltérést az aminosav sorrendben) egyre csökkenő hígításban, —4 amely 4 x 10 móllal kezdődik a 2. oszlopban és ezt követik 1:1 arányú hígítások a 3-11. oszlopban. A kapott szubsztrátumot

- 69 azután inkubáljuk és mossuk (Bio-Dot berendezés).

A 6, ábrán az látható, hogy az egyes monoklonális antitestek esetében a jelzett MB4 peptid sikeresen versengett a jelzetlen MB3 kompetitor peptiddel, ahogy az MB3 kompatitort higitották, és ez jellegzetes mintázatot eredményez a panelen mind a két vizsgált monoklonális antitestre.

5, példa

Ebben a példában azt demonstráljuk, hogy még kisszámú diverz mimotóp is megfelelő pepiidet tartalmaz tetszőlegesen megválasztott antitesthez való kötődés szempontjából. A 7, ábra mutatja a Houghten (supra) által szintetizált 24 nonapeptid aminosav szekvenciáját. Ezeket ,a peptideket úgy tervezték, hogy nagy diverzitást mutassanak a hidrofóbiás momentum és hidrofóbiás index, valamint a töltéseloszlás és méret szempontjából.

Ezek közül a péptidek közül tizenhatot vizsgáltunk le abból a szempontból, hogy kötődik-e a véletlenszerűen kiválasztott Mab 33-6 rágcsáló antitesthez, amelyről ismert, hogy köti a 4, példában ismertetett MB3 és MB4 peptideket, A kötést a kereskedelmi forgalomban lévő Bio-Rad Dot-Blot berendezéssel vizsgáltuk le, amiben egy aktivált papir vagy nitrocellulóz hordozó van egy mintázatos fedőréteggel, ami a teszt-pontok sorait és oszlopait határozza meg a hordozón. Az eredmények a 8, ábrán láthatók.

gálandó peptid-oldatot pipettázunk egy megjelölt pontra, ebben az esetben három párhuzamosban. A hordozót kazeinnel vagy BSAval blokkoljuk, majd a használt antitestet úgy visszük fel, hogy g/ml koncentrációjú Mab 33-6-ot vittünk fel. A hordozót szobahőmérsékleten inkubáljuk az antitest oldattal egy órán át, majd eltávolítjuk és puffsrrel mossuk. A hordozót ezután jelzett kecske anti-egér lgG-vei inkubáljuk, (a jelzés torma-psroxidáz), majd a jelzés jelenlétét standard módszerrel mutatjuk ki.

Amint az a 8. ábrán látható, az aktualizált hordozó

2. sorában lévő utolsó három pont tartalmazza az MB3 pepiidet, amelyről ismert, hogy köti a Mab 33-6-ot a peptid és az ismert epitóp szekvenciája közötti analógia alapján. A 3-6. sorok mindegyike a 7. ábrán bemutatott diverz csoport 1-16, különböző peptidjét tartalmazza három párhuzamosban. A 7. és 8. sor további kontrollokat tartalmaz. A 8. ábra eredményei azt mutatják, ogy a vizsgált 16 peptidből 3 sikeresen köti a Mab 33-6-ot. Egy hasonló vizsgálat, amelyben a Mab 33-6 helyett a Mab 9-7-9-at használtuk, egy olyan peptidet eredményezett, amely képes ezt az antitestet megkötni.

Claims (19)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1· Eljárás egy adott vizsgálandó molekulával reagáló antitestek azonosítására, azzal jellemezv e , hogy

   a) egy emlős pihenő B-sejt repertoárjára jellemző antitesteket ezekretáló halhatatlanná tett sejtek több egyedi telepét tartalmazó panelt reagáltatunk kompéticióban az említett vizsgálandó molekulával olyan mimotóp keverékkel, amelynek tagjai jellemzik egy diverz csoport 3-dimenziós töltését és felszíni körvonalát; és

   b) a panelből legalább egy telepet tartalmazó kisebb részcsoportot azonosítunk, amely olyan antitesteket termel, amelyekkel szemben a vizsgálandó molekula sikeresen verseng a mimotóp keverékkel.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti módszer kivitelezésére alkalmas kit, azzal jellemezve, hogy az alap repertoárt képviselő antitesteket szekretáló halhatatlanná tett sejtek több egyedi telepét tartalmazó panelt, valamint egy háromdimenziós töltés és térkonturokkel rendelkező diverz csoportot képviselő diverz mimotópok keverékét tartalmazza.
3. 3. A 2. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy a mimotóp elegy tervezett diverzitással rendelkező peptidek keveréke.

   • ·
4. 4. Eljárás mimotóp előállítására egy kiválasztott vizsgálandó molekulával szemben, azzal jellemezve, hogy;

   a) egy emlős pihenő B-sejt repertoárjára jellemző antitesteket szekretáló halhatatlanná tett sejtek több egyedi telepét tartalmazó panelt reagáltatunk kompeticióban az említett vizsgálandó molekulával olyan mimotóp keverékkel, amelynek tagjai jellemzik egy dlverz csoport 3-dimenziós töltését és felszíni körvonalát;

   b) a panelből legalább egy telepet tartalmazó kisebb részcsoportot azonosítunk, amely olyan antitesteket termál, amelyekkel szemben a vizsgálandó molekula sikeresen verseng a mimotóp keverékkel;

   c) a ffiimotópok egy paneljének reaktivitását levizsgáljuk a b) pontban azonosított antitestekkel; és

   d) legalább egy mimotópot azonosítunk, amely reagál az említett antitestekkel.

   u
5. 5, Eljárás mimotóp elállítására a kiválasztott vizsgálandó molekulához, azzal jellemezve, hogy maximálisan dierzifikált háromdimenziós töltés és térkonturokkal rendelkező mimotópok paneljét átvizsgáljuk a vizsgálandó molekulával specifikusan reagáló antitesttel.

   • · • · · ·
6. 6. A 10. igénypont szerinti módszer kivitelezésére alkalmas kit, azzal jellemezve, hogy olyan mimotópok paneljét tartalmazza, amely maximálisan diverzifikált háromdimenzióe töltés és felszíni kontúrral rendelkező tagokból áll, valamint egy, a vizsgálandó molekulára specifikus antitestet,
7. 7. Eljárás a kiválasztott vizsgálandó molekulával specifikusan és erősen reagáló antitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy;

   a) egy kiválasztott alanyt az 5, igénypont szerint előállított mimotópok közül legalább eggyel immunizálunk; és

   b) az említett alanyból antitestet termelő sejtek preparátumát állítjuk elő;

   c) a b) pontban előállított sejteket halhatatlanná tesszük; és

   d) a halhatatlanná tett sejteket átvizsgáljuk, hogy melyik reagál a vizsgálandó molekulával vagy mimotóppal,
8. 8. Eljárás mimotópok jellemző elegyének előállítására, azzal jellemezve, hogy;

   a) 9-60 nukleotidból álló random nukleotid szekvenciák csoportját állítjuk elő;

   b) az a) pont szerinti random DNS fragmenteket más, peptidet kódoló DNS-hez ligálunk egy ATG startkodonnaL leolvasási fázisjsan;

   t · » · · ·· • · · · · ·« • · · ··«·· · « •· · · ···«·e

   c) ab) pont szerinti ONS-t működőképes kapcsolatban ligáljuk össze kontroll szekvenciákkal egy gazda expreszsziós vektorában,igy olyan expressziós vektorokat kapunk, amelyek megtartott hl-terminális vagy C-terminális szekvenciával rendelkező fúziós fehérjéket kódoló géneket tartalmaznak;

   d) egy megfelelő gazdaszervezetet a c) pont szerinti vektorcsoporttal transzfektáljuk; és

   e) a transzfektált gazdasejteket az expressziót elősegítő körülmények között tenyésztjük.
9. 9. Eljárás mimotópok paneljének előállítására, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerinti transzfektéit gazdasejteket határhigitásban szélesztjük.
10. 10. Mimotópok keveréke, amelyben mindegyik mimotóp

    3-10 aminosavból álló peptid, azzal jellemezve, hogy a keverékben lévő peptidek maximálisan diverzek a hidrofóbiás index és a pl szempontjából, valamint szükség esetén emellett maximálisan diverzek a hidrofóbiás momentum, a dipólmomentum és a simasági faktor szempontjából.
11. 11. A 10. igénypont szerinti elegy, azzal jellemez- ve, hogy jelzéssel van konjugálva.
12. 12. A 10. igénypont szerinti keveréket kódoló DNS-szekvencia keverék.

    « · · · · · · • · · « · · ·

    9 ·· ····· · * • · · · · · · · ··
13. 13, Egy vizsgálandó molekula detektálására alkalmas kit, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy szilárd hordozót, amelyre tőmbszerű elrendezésben immunoglobulinok panelje van felvive, amelyek eltérő mértékben reagálnak a vizsgálandó molekulávak, és a különbnek szolgáltatják a vizsgálandó molekula jellegzetes profilját,
14. 14, A 13, igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy a vizsgálandó molekulával kompetitiv jelzett mimotópot tartalmaz,
15. 15, Mimotóp panel, amelyben mindegyik mimotóp 3-10 aminosavból álló peptid, azzal jellemezve, hogy a keverékben lévő peptidek maximálisan diverzek a hidrofóbiás index és a pl szempontjából, valamint szükség esetén emellett maximálisan diverzek a hidrofóbiás momentum, a dipólmomsntum és a simasági faktor szempontjából,
16. 16« Antitest panel, azzal jellemezve, hogy a 15, igénypont szerinti panel fordított képe,
17. 17, Eljárás egy adott vizsgálandó molekula jellemzésére, azzal jellemezve, hogy;

    a) egymás után reagáltatjuk diverz antitestek paneljét olyan mimotópok keverékének jelzett mimotópjaival, amelyek háromdimenziós kontúrok diverz csoportját képezik, igy a diverz mimotóp csoport mindegyik mimotópjára egy kötési profilt kapunk a panel minden egyes antitestjs szempontjából;

    • · • · · « • *· r • · · ···· ·« e ♦· · · ·«··· e

    b) a panel minden egyes antitestjének kötési jelet hozzáadjuk a diverz csoport mindegyik mimotőpjához;

    c) a b) lépés szerinti kötési jeleket normalizáljuk

    d) a jellemzendő vizsgálandó molekulát és az a) )

    lépésből származó jelzett mimotópok diverz csoportjáí kompetitive reagáltatjuk a panel minden egyes antitestjével; és

    e) a panel minden egyes antitestjére meghatározzuk a kevert jelzett mimotóp kötődésének csökkenését, amely a vizsgálandó molekulának a panel antitestért való sikeres versengéséből ered.
18. 18, Eljárás egy vizsgálandó molekula illesztésére az említett vizsgálandó molekulával immunológiailag reagáló nagy jelölt antitest csoportból származó antitesthez, azzal jellemezve,hogy:

    a) olyan antitest panelt készítünk, amely mimotópok maximálisan diverz csoportjának fordított képe, amelyben mindegyik antitest az amlitett mimotópok közül egyhez kötődik, legalább hússzor nagyobb kötési állandóval mint a csoportban lévő bármely más mimotóphoz;

    b) a vizsgálandó molekulának az a) pont szerinti fordított képű antitest panel tagjaihoz való kötődésének mértékéből egy profilt készítünk;

    c) az említett nagy jelölt-csoportban lévő minden egyes antitestnek az említett diverz csoportban lévő minden egyes mimotóphoz való kötődésének mértékéből egy profilt készítünk; és

    d) az antitestek nagy Jelölt-csoportja minden egyes tagjának a c) pontban előállított mimotóp kötő profilját illesztjük a vizsgálandó molekula b) pontban előállított fordított képet kötő profiljával.
19. 19. Eljárás egy vizsgálandó molekulának egy vele immunológiailag reagáló antitesthez való illesztésére, azzal Jellemezve, hogy;

    a) az említett vizsgálandó molekulát egy olyan fordított képű panellel reagáltatjuk, amely megfelel olyan mimotópok paneljének, amellyel az antitestek jelölt csoportjának minden egyes antitsstje reagált, és

    b) a vizsgálandó molekula és a fordított képű panel reagktivitéeának paneljét illesztjük a Jelölt-csoport egy antitsstje és a mimotóp panel reaktivitásának paneljével.