ES2284743T3 - Sustitutos para dianas y paneles de referencia mejorados. - Google Patents

Abstract

Un método para identificar una sustancia candidata como reactiva con una diana deseada, cuyo método comprende: (a) proporcionar una fórmula que se deriva de una combinación de los perfiles de reactividad de al menos dos elementos de un panel de referencia con un conjunto de compuestos, cuya fórmula calcula un perfil pronosticado que se ajusta mejor al perfil de reactividad de la diana con respecto a dicho conjunto de compuestos; (b) probar la reactividad de dichos al menos dos elementos del panel con respecto a dicha sustancia candidata; (c) calcular una reactividad estimada con respecto a la diana para dicha sustancia candidata mediante la aplicación de dicha fórmula a las reactividades determinadas en la etapa (b) para estimar la reactividad de dicha sustancia candidata con respecto a la diana; y (d) basándose en los resultados de (c), identificar dicha sustancia candidata como reactiva con la diana.

Description

Sustitutos para dianas y paneles de referencia mejorados.

Campo técnico

La invención se refiere a la identificación de compuestos que son útiles en análisis, terapia y otras aplicaciones en las que es deseable proporcionar una sustancia que se una específicamente a una molécula diana, es decir, una técnica específica de con el patrón que permita seleccionar sustancias de unión candidatas en ausencia de la molécula diana. La invención también se refiere a una mejora en la construcción de paneles de referencia para su uso en obtención de perfiles y ajuste con patrones. Específicamente, la invención se refiere al uso de paneles de referencia para la producción de huellas de reacciones cruzadas que comprenden enzimas y/u otras proteínas no inmunoglobulínicas como dianas de afinidad.

Técnica anterior

Hay numerosos casos en los que es deseable encontrar un ligando que se una específicamente a un receptor o a otra diana. Para citar los ejemplos más obvios, si un receptor es responsable de la activación de un tipo de célula particular, los ligandos que se unen al receptor pueden alcanzar un uso terapéutico al activar o al evitar la activación del receptor, con un efecto fisiológico correspondiente sobre la célula. Si la célula está contenida en un animal o una planta, el efecto puede sentirse en todo el organismo. Por tanto, un enfoque muy común para diseñar nuevos fármacos radica en encontrar agentes de unión apropiados para estos receptores.

Los ligandos que se unen a dianas específicas también pueden encontrar aplicaciones en contextos analíticos. Por ejemplo, los anticuerpos son componentes útiles en procedimientos de inmunoensayo. Todos estos procedimientos se basan en la interacción específica entre un antígeno y un anticuerpo; cualquiera de los dos puede ser el analito.

Además, los procedimientos de separación y otros procedimientos con aplicación industrial pueden tener la ventaja de la unión específica. Para dar un ejemplo muy sencillo, una impureza puede eliminarse eficazmente de una composición tratando la composición con un soporte sólido al que se une un "receptor" capaz de unir la impureza hasta la exclusión relativa de los otros componentes de la composición, siempre que la afinidad del receptor por la impureza sea suficientemente mayor que por los componentes deseados.

En todos los casos anteriores, la cantidad de afinidad que caracteriza a la unión específica y el grado de especificidad requerido depende de las circunstancias. Algunas aplicaciones se benefician por una interacción relativamente débil, mientras que otras requieren una afinidad elevada. Algunas aplicaciones demandan más especificidad que otras.

El método obvio por la fuerza bruta para encontrar un ligando que se unirá a una diana de interés es probar físicamente la capacidad de un gran numero de compuestos que son ligandos potenciales con respecto a su capacidad para unirse a la diana. Sin ninguna duda, este método conduciría finalmente a encontrar un ligando satisfactorio en prácticamente todos los casos, pero claramente invierte más tiempo y requiere mucho más trabajo de lo que sería deseable para una utilidad práctica. En primer lugar, la diana, por ejemplo, un receptor, debe producirse en alguna forma física que pueda probarse y deben proporcionarse cantidades suficientes para probar la gama de compuestos que son candidatos. En segundo lugar, si los compuestos se prueban simplemente en orden aleatorio, será necesaria una gran cantidad de dianas. Esto puede ser prohibitivamente caro, especialmente en el caso de los receptores celulares.

Se han sugerido varios enfoques para minimizar estas dificultades. En primer lugar, en lugar de probar los compuestos aleatoriamente, podría usarse un panel sistemáticamente variado de compuestos. Tales paneles sistemáticamente variados pueden construirse convenientemente mediante polímeros formadores a partir de unidades monoméricas de características predeterminadas. Los más convenientes de tales polímeros son los péptidos, aunque también podrían usarse polisacáridos, polinucleótidos y similares. Los parámetros que son importantes y la forma de construir tales paneles se describen en las patentes de los EE. UU. 4.963.263, 5.133.866 y 5.340.474.

Además de usar paneles sistemáticamente variados de compuestos como candidatos, o en lugar de ello, la propia selección puede llevarse a cabo de tal forma que se minimice el número de mediciones físicas que se requieren. Por ejemplo, tal como se expone en la patente de los EE. UU. 5.217.869, puede establecerse un perfil de reactividad para que un ligando conocido reaccione con una diana proporcionando un panel estándar de agentes de unión. El perfil obtenido caracteriza este ligando particular que se sabe que se une al receptor. Los compuestos candidatos pueden probarse entonces frente al mismo panel para obtener sus perfiles correspondientes. Cuando un perfil correspondiente se ajusta al de un ligando que se sabe que se une con éxito a la diana, el compuesto que generó el perfil de ajuste tendrá una elevada probabilidad de unirse a la diana. En una alternativa, se preparan paneles de imagen inversa con características variables y se ajustan los perfiles obtenidos para el receptor y el ligando frente a los paneles
opuestos.

Otras tecnologías diversas están dirigidas a métodos para mejorar la facilidad con la que puede medirse la unión física del receptor al ligando candidato, tal como el uso de robótica, detección por fluorescencia de la reactividad, disposiciones físicas de los paneles, etc.

Otros métodos que buscan encontrar elementos de un par de unión específica incluyen métodos basados en ordenador, tales como las búsquedas en bases de datos tridimensionales, la cristalografía de rayos x, la obtención de modelos moleculares y similares. Otros métodos emplean anticuerpos como moléculas diana sustitutas o simplemente se basan en el comportamiento del compuesto con respecto a los receptores diana relacionados. Por ejemplo, el comportamiento de un compuesto como un inhibidor de una serín proteasa particular o de varias serín proteasas, podrían conducir a suponer que será un inhibidor útil de una serín proteasa adicional para la que todavía no se ha determinado su actividad de inhibición. La validez de este último método mencionado se basa en la similitud de las serín proteasas que son los "receptores de referencia" para los que se conocen las características de unión del compuesto de prueba al receptor diana (serín proteasa) para el que no se conocen las características de unión.

La presente invención proporciona otro método para ajustar el ligando con una diana. Es especialmente práctico cuando se dispone de suministros limitados de la diana. El método de la invención es especialmente útil en proyectos de diseño de fármacos donde la diana nunca se ha purificado completamente, es inestable o, en caso contrario, no está disponible en cantidades adecuadas para una selección a gran escala, o cuando el procedimiento del ensayo para la molécula diana es complejo y costoso. Además, el método minimiza el consumo del receptor en un programa de selección frente a muchos ligandos potenciales.

La patente de los EE. UU. número 5.300.425 describe métodos para preparar perfiles característicos de un analito particular, ajustar perfiles similares a las propiedades de unión correlacionadas entre varios analitos y el uso de paneles de imagen inversa para crear perfiles para este propósito. En los métodos descritos en la patente número 5.300.425, se usaron inmunoglobulinas o sus fragmentos inmunológicamente reactivos como elementos de los paneles de ligandos de unión para obtener los perfiles característicos usados en la caracterización y la correlación. Una modificación de esta tecnología, descrita en la patente de los EE. UU. número 5.340.474 mencionada anteriormente, sustituye los paneles de diversos parálogos por los anticuerpos y fragmentos usados en los paneles de formación de perfiles. Los parálogos se definen como restos poliméricos preferiblemente de PM inferior a 7,5 kD compuestos de monómeros con características tales que podría obtenerse una diversidad máxima a través de los elementos del panel con un número mínimo de parálogos. Al maximizar la diversidad, el intervalo de contornos de espacio/carga que caracteriza al "espacio químico" puede lograrse entonces con un número relativamente pequeño de compuestos.

Tal como se describe en las patentes anteriormente mencionadas, tales paneles de referencia son útiles en varios contextos. El panel puede usarse para obtener una "huella" que caracterice a un analito particular. La huella puede usarse como una herramienta analítica para identificar una sustancia particular, sustancialmente en la misma forma en que podría usarse un espectro IR o un espectro de RMN. Además, se reconoció que los analitos que tienen huellas similares o características similares contenidas en sus huellas, tienen propiedades de unión o reactividad similares, en general o con respecto a la propiedad asociada con la característica similar. Por tanto, si por ejemplo un receptor de interés tiene un ligando conocido, pueden encontrarse otros compuestos que se unirán al receptor ajustando sus huellas con el panel de referencia con la huella obtenida del ligando conocido. Pueden obtenerse ajustes similares de los elementos complementarios de un par de unión usando conjuntos de imagen inversa, en donde una huella para un ligando frente a un panel de referencia se ajustará con la huella del receptor frente a un conjunto de compuestos que es una imagen inversa de la del panel de referencia.

Todavía otra aplicación para la que los paneles de reactivos son útiles es en la determinación de la composición del analito de una muestra. Esta aplicación se describe en el documento U.S. 5.338.659. La huella obtenida para una muestra desconocida se ajusta con las huellas predeterminadas o los perfiles determinados en composiciones conocidas estándar. Pueden emplearse ciertas técnicas computacionales para facilitar esta comparación, tal como se describe en esta patente. En este caso, sin embargo, generalmente no se cree que se requiera un amplio intervalo de capacidades de unión, puesto que la aplicación se enfoca en composiciones que contienen analitos, generalmente con estructuras relacionadas y no son necesarios medios para correlacionar las huellas con las otras propiedades inherentes de los propios analitos. Por tanto, en este caso, podría considerarse lógico usar los elementos del panel que no son necesariamente anticuerpos ni parálogos sumamente diversos.

En la presente solicitud se describe un método adicional de identificar parejas de unión usando una combinación computacional de los resultados con un panel de referencia como sustituto para una diana deseada. El panel de referencia ilustrado se compone de enzimas. Así se encuentra, sorprendentemente, que puede obtenerse suficiente diversidad de reactividad para lograr resultados significativos, aun cuando las enzimas usadas en el panel de referencia ilustrativo no se diseñaran por naturaleza para tener una gran multiplicidad de actividades de unión (como ocurre con los anticuerpos). Tampoco se esperaba que las enzimas tuvieran la diversidad máxima atribuible a un pequeño número de elementos del panel que se logró mediante el diseño de parálogos. No obstante, mediante la utilización de enzimas, incluso de isoenzimas con actividades similares, como elementos de los paneles de referencia, puede lograrse un sustituto satisfactorio para predecir la unión de los ligandos candidatos a las dianas, incluyendo dianas en absoluto relacionadas por cualquier similitud de la secuencia de aminoácidos con las enzimas que son elementos del panel. Así se ha encontrado que tales enzimas o moléculas de referencia en general también deben ser útiles en la obtención de perfiles y en los métodos de ajuste con el patrón descritos en las patentes anteriormente mencionadas y en los métodos descritos en el presente documento.

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Resumen de la invención

La invención utiliza lo que es, en efecto, un sustituto para la diana para seleccionar un número arbitrario de ligandos potenciales. En primer lugar, se prepara un perfil de unión por reactividad de la diana con respecto a un "conjunto de ensayo" de compuestos, que tienen preferiblemente características que son sistemáticamente diversas. El conjunto de ensayo podría incluir, por ejemplo, diez compuestos diferentes que tendrán grados de afinidad variables por la diana. Por tanto, el perfil de la diana mostrará un conjunto de afinidades variables con estos compuestos. En lugar de probar los ligandos candidatos adicionales con respecto a la propia diana, se crea artificialmente un "sustituto" probando la reactividad de este mismo conjunto de diez compuestos de ensayo frente a un panel de referencia de moléculas para las que el conjunto de ensayo también muestra grados de reactividad variables. Esto podría denominarse un panel de referencia. Por tanto, cada compuesto en el conjunto de ensayo mostrará un patrón de reactividades con respecto a este panel de referencia.

Esto da como resultado una matriz bidimensional en la que se registra el nivel de reactividad de cada elemento del conjunto de ensayo con respecto a cada elemento del panel de referencia. El nivel de reactividad de cada elemento del panel de referencia con cada uno de los compuestos de ensayo se registra así simultáneamente en una dimensión ortogonal.

Naturalmente, cada elemento del panel de referencia mostrará un perfil diferente con respecto al conjunto de ensayo del de la diana real. Sin embargo, cierta combinación computacional, preferiblemente una combinación lineal, de estos perfiles del panel de referencia generará un perfil que se ajusta lo más exactamente posible al obtenido a partir de la propia diana. Esta aproximación óptima constituye un sustituto para la diana. Se usan las fórmulas que resultan del cómputo con respecto al panel de referencia para estimar las reactividades para los compuestos recientemente probados. Empíricamente, tales sustitutos tienen buen poder de predicción cuando se aplican a ligandos fuera del conjunto de ensayo. Por tanto, puede buscarse computacionalmente una librería de perfiles de ligandos frente al panel de referencia, con resultados comparables a una selección física directa de los ligandos.

Así, para cada compuesto posteriormente probado, se obtiene la reactividad frente a cada elemento del panel de referencia y se aplica la fórmula derivada del conjunto de ensayo para obtener un valor pronosticado con respecto a la diana. En lugar de probar directamente la reactividad de un compuesto candidato con una diana, es posible, en cambio, probar su reactividad con respecto a un panel de receptores de referencia fácilmente disponibles, aplicar la fórmula a los resultados y predecir qué habría ocurrido si se hubiera utilizado la propia diana. Cuanto mayor es la librería de perfiles de ligandos almacenados frente a un conjunto de referencia, mayor es el aumento en la eficacia para la selección mediante un sustituto.

Ahora también se ha encontrado que las proteínas no inmunoglobulínicas (algunas de las cuales se producen naturalmente, pero sin tener en cuenta cómo se producen en realidad) pueden usarse satisfactoriamente para constituir un panel de referencia para el uso de analitos de perfil, pronosticando las capacidades de unión de los compuestos candidatos con respecto a las dianas, así como para los propósitos analíticos descritos en el documento U.S. 5.338.659. Por tanto, paneles útiles en los métodos de la presente invención pueden estar compuestos en su totalidad de proteínas tales como enzimas, receptores de células T, receptores olfativos, lectinas y proteínas artificialmente modificadas que contienen sitios de unión arbitrarios. Los paneles también pueden incluir anticuerpos o fragmentos de los mismos, o parálogos como elementos; sin embargo, en los paneles útiles en los métodos de la presente invención, los elementos no-Ig/no parálogos deben "enriquecer" el panel más allá de la contribución de cualquier proteína inmunoglobulínica y parálogos también contenidos en los paneles, tal como se describe más adelante en el presente documento.

En un aspecto, la invención puede usarse para determinar la capacidad de un compuesto candidato para reaccionar con una diana proporcionando un sustituto para la diana. El sustituto es una fórmula que represente una combinación computacional, preferiblemente una combinación lineal, de al menos 2 perfiles de reactividad de referencia, que mejor concuerde con los datos empíricos de unión de la molécula diana frente al conjunto de ensayo de compuestos. Los perfiles de reactividad de referencia representan la reacción de cada elemento de un panel de receptores de referencia con respecto a un conjunto de compuestos, conjunto de compuestos que puede designarse como "un conjunto de ensayo". La fórmula se aplica entonces a las reactividades con respecto a cada uno de los elementos del panel de receptores de referencia que se obtiene para cada compuesto candidato. El resultado de aplicar esta fórmula imita el que se encontraría si el compuesto se hubiera probado directamente con el receptor diana.

El aspecto de la invención se refiere, así, a un método para identificar una sustancia candidata como reactiva con una diana deseada, cuyo método comprende:

(a) proporcionar una fórmula que se deriva de una combinación de los perfiles de reactividad de al menos dos elementos de un panel de referencia con un conjunto de compuestos, cuya fórmula calcula un perfil pronosticado que se ajusta mejor al perfil de reactividad de la diana con respecto a dicho conjunto de compuestos;

(b) probar la reactividad de dichos al menos dos elementos del panel con respecto a dicha sustancia candidata;

(c) calcular una reactividad estimada con respecto a la diana para dicha sustancia candidata mediante la aplicación de dicha fórmula a las reactividades determinadas en la etapa (b) para estimar la reactividad de dicha sustancia candidata con respecto a la diana; y

(d) basándose en los resultados de (c), identificar dicha sustancia candidata como reactiva con la diana.

Un candidato satisfactorio se identifica entonces y se sintetiza a partir de los materiales de partida apropiados.

En el presente documento se describe una combinación particularmente preferida de un conjunto de ensayo y panel. En esta matriz preferida, cada elemento del panel de referencia tiene eficazmente un elemento de imagen inversa en el conjunto de ensayo de los compuestos. De esta forma, el número de elementos del panel de referencia y de los compuestos de ensayo se minimiza mediante la eliminación de coincidencias redundantes.

También se describe en el presente documento una base de datos de huellas obtenidas con respecto a un panel de referencia. La base de datos puede usarse para una variedad de propósitos según se describe más abajo.

También se describen en el presente documento métodos para construir los paneles de referencia.

Se describe en el presente documento un método de caracterización de un único analito, método que comprende: poner en contacto dicho analito con cada elemento de un panel enriquecido o constituido mediante las proteínas no-Ig antes mencionadas que reaccionan en una multiplicidad de grados diferentes con dicho único analito; detectar el grado de reactividad de dicho analito con cada uno de dichos elementos; registrar dicho grado de reactividad de dicho analito con cada uno de dichos elementos del panel; y disponer dichos grados de reactividad registrados de manera que se proporcione un perfil característico de dicho analito.

En el presente documento también se describen paneles que contienen proteínas no-Ig útiles en los métodos que se ajustan a varios modelos y en realizaciones físicas de las huellas obtenidas mediante los cuatro métodos.

También se describe en el presente documento un método de identificación de un candidato, candidato que será eficaz en su reacción con una diana, en el que dicha diana tiene un ligando conocido con el que reacciona, método que comprende: poner en contacto dicho candidato con cada elemento del panel enriquecido o constituido mediante las proteínas no-Ig arriba descritas que reaccionan en una multiplicidad de grados diferentes con dicho candidato; detectar el grado de reactividad de dicho candidato con cada uno de dichos elementos del panel; registrar cada grado de reactividad mencionado de dicho candidato con cada uno de dichos elementos del panel; disponer dichos grados de reactividad registrados de manera que se proporcione un perfil característico de dicho candidato; comparar dicho perfil con un perfil análogamente obtenido de dicho ligando con respecto a dicha multiplicidad de elementos del panel; en donde la similitud del perfil de dicho candidato con el perfil de dicho ligando indica la capacidad del candidato de reaccionar con dicha diana. Una sustancia identificada como candidato satisfactorio es entonces identificada y sintetizada a partir de los materiales de partida apropiados.

También se describe en el presente documento un método de selección de un candidato, a partir de una multiplicidad de candidatos, que reacciona específicamente con una diana conocida, método que comprende: proporcionar un perfil de reactividad de dicha diana frente a un conjunto de compuestos máximamente diverso; proporcionar un panel que incluye proteínas no-Ig según se ha descrito anteriormente que es una imagen inversa de dicho conjunto máximamente diverso; preparar un perfil de la reactividad del candidato al panel de imagen inversa, comparar el perfil del conjunto máximamente diverso de la diana con el perfil del panel de imagen inversa del candidato, y en el que la similitud del perfil del panel de imagen inversa con el perfil del conjunto diverso indica la probabilidad de que el candidato se una a la diana. Un candidato satisfactorio es entonces identificado y sintetizado a partir de los materiales de partida apropiados. Este método puede "revertirse" ya que la elección de qué sustancia se considera que es un "candidato" y cuál es una "diana" es arbitraria - es decir, la diana puede perfilarse contra el panel de imagen inversa y el candidato contra el panel máximamente diverso.

También se describe en el presente documento un método para determinar la capacidad de un candidato de reaccionar con una diana, método que comprende proporcionar un sustituto para la diana, según se ha descrito anteriormente, e incluir proteínas no-Ig en el panel de referencia.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama de flujo del método para calcular la probabilidad de que un candidato se una a una diana usando un sustituto.

La figura 2 muestra una realización preferida del conjunto de ensayo/matriz de referencia.

La figura 3 es un diagrama de flujo del método para determinar el perfil de un analito.

Las figuras 4a y 4b muestran realizaciones típicas de huellas obtenidas mediante diversos métodos.

La figura 5 es un diagrama de flujo del método para comparar los perfiles de un ligando con un compuesto candidato.

La figura 6 es un diagrama de flujo del método para comparar perfiles de imagen inversa.

Las figuras 7a, 7b y 7c representan distribuciones de distancia para los perfiles de 800 compuestos determinados con respecto a los paneles de referencia de 5, 7 y 10 proteínas de referencia, respectivamente.

Las figuras 8a-8c son distribuciones de distancia para puntos en un espacio decadimensional representando perfiles de 50, 100 y 1000 compuestos, respectivamente, con respecto a un panel de 10 proteínas de referencia.

Las figuras 9a-9c muestran distribuciones para los perfiles con respecto a 10 proteínas de referencia de diversos grupos de compuestos. La figura 9a es la misma que la figura 8a que muestra la distribución de distancias, representado perfiles de 50 compuestos aleatorios. La figura 9b muestra la distribución de distancias para perfiles de 50 compuestos conocidos farmacéuticamente activos. La figura 9c representa una distribución similar para 50 péptidos de actividad biológica variable.

La figura 10 muestra los resultados obtenidos cuando se prueba un conjunto de ensayo de compuestos con respecto a un panel de isoenzimas de la GST de referencia para generar un sustituto para un receptor diana. Los resultados de probar una multiplicidad de compuestos adicionales frente al panel de enzimas de referencia y de aplicar la fórmula que define al sustituto se comparan con las pruebas de los compuestos adicionales directamente con el receptor diana. La escala de grises indica los valores de CI_{50}.

La figura 11a muestra las predicciones y los datos empíricos reales de la figura 10 como una representación de dispersión, indicando un grado elevado de correlación. La figura 11b muestra los errores residuales de la figura 11a.

La figura 12 muestra una lista de 122 compuestos y sus símbolos usados como la librería de compuestos en los resultados obtenidos frente a un panel de referencia enriquecido de ocho enzimas seleccionadas.

La figura 13 muestra la capacidad experimental y pronosticada de los compuestos de la figura 12 para unirse a GRd y AdDH, así como los perfiles característicos de estos compuestos frente a un panel de referencia, en el que los 12 primeros compuestos enumerados son el conjunto de ensayo inicial. Un conjunto adicional de 10 compuestos de ensayo usado en las segundas predicciones de iteración se indica mediante barras negras adyacentes, con un conjunto diferente de 10 por cada diana.

Las figuras 14a y 14b muestran representaciones de correlación de los valores pronosticados y experimentales según los resultados mostrados en la figura 13.

La figura 15 muestra la correlación entre las uniones fijadas y experimentales de una multiplicidad de compuestos frente a nueve dianas diferentes.

Modos de llevar a cabo la invención

El método de la invención permite un gran número de compuestos candidatos que han de probarse para determinar su capacidad de reaccionar con, y en particular de unirse a, una diana sin necesidad de grandes cantidades de la diana en sí. La propia diana sólo se requiere en cantidad y pureza suficientes para generar la fórmula que crea el sustituto.

Tal como se usa en el presente documento, el término "diana" incluye, por ejemplo, moléculas que residen en la superficie de las células y que median en la activación de las células mediante la activación de los ligandos, pero también se usa genéricamente para referirse a cualquier molécula que se une específicamente a un homólogo. Un elemento de un par de unión específico podría denominarse arbitrariamente un "receptor" o "diana" y el otro un "ligando". No se necesita asociar ninguna función fisiológica particular a esta unión específica. Por tanto, por ejemplo, una "diana" podría incluir anticuerpos, partes inmunológicamente reactivas de anticuerpos, moléculas que están diseñadas para complementar a otras moléculas, etc. Además, en el contexto de la presente invención, la distinción entre "diana" y "ligando" es completamente irrelevante; la invención se refiere a pares de moléculas que se unen específicamente entre sí, no covalentemente, con mayor afinidad de lo que cada una se une a otras moléculas. Sin embargo, para facilitar la explicación, los métodos de la invención se tratarán a menudo en lo que se refiere a la diana, tal como una enzima (de nuevo, simplemente una molécula para la que se busca un homólogo que reaccionará o se unirá con ella) y "ligando" simplemente representa a ese homólogo (tal como un inhibidor de bajo peso molecular).

Uso de sustitutos

Con el fin de poner en práctica el método de sustitutos de la presente invención, son necesarios los elementos siguientes:

En primer lugar, un conjunto de referencia de dianas modelo frente al que pueda evaluarse la actividad medible. Son posibles diversas técnicas para determinar la reactividad de los compuestos con este conjunto de dianas de referencia, y dentro de la capacidad de la técnica, tal como se ha descrito anteriormente. Es importante hacer hincapié en que no es necesario que los elementos del panel de referencia estén en cualquier forma relacionados por la secuencia primaria de aminoácidos ni por la estructura química empírica ni mediante la función biológica conocida para la diana para la que constituyen un modelo. Por ejemplo, en el caso dado más adelante, se usan diversas enzimas, incluyendo la glutatión S-transferasa (GST), como receptores de referencia, mientras que la molécula diana real es la glutatión reductasa (GRd), la aldehído deshidrogenasa, o una variedad de otras proteínas. No hay ninguna similitud previamente discernible entre las enzimas del panel y cualquiera de las dianas ni a los niveles de la estructura primaria ni de la función enzimática conocida. Una de las ventajas de la presente invención es que las proteínas de referencia pueden ser bastante diferentes en la reactividad conocida y en la estructura primara de la diana, porque la información predictiva está presente en sus correlaciones relativas con la diana, no en su homología. El panel de referencia puede contener tan sólo 1, pero preferiblemente 2-50 y más preferiblemente 8-25 proteínas no-Ig; el número total de elementos del panel también puede describirse de manera similar.

En segundo lugar, se requiere un conjunto de ensayo de ligandos representativo de los compuestos deseados que van a probarse adicionalmente con respecto a sus reactividades con el panel de referencia. Si hay una librería de compuestos que se va a probar adicionalmente, puede usarse un método de agregación multifactorial para determinar los compuestos representativos de la librería, o similares a los de la librería, para su uso en el conjunto de ensayo. De manera similar, también pueden usarse compuestos con propiedades que varían sumamente de manera sistemática. En general, este conjunto de ensayo de compuestos debería incluir al menos tantos compuestos como número de proteínas de referencia y, preferiblemente aproximadamente 3 veces ese número.

En tercer lugar, debe haber suficiente diana disponible para probar empíricamente el conjunto de ensayo, aunque no es necesario que la diana sea pura. Sin embargo, la diana debe estar libre de impurezas no deseadas que interfieran.

Con estos compuestos y los paneles de referencia que nos ocupan, pueden obtenerse los perfiles de cada elemento del panel de referencia con respecto al conjunto de ensayo y el perfil de la molécula diana con respecto al conjunto de ensayo, mediante medición física. Un cuarto requisito es entonces un procedimiento de fijación para ajustar el perfil de la diana con una combinación de los perfiles de los elementos del panel de referencia. Además de las técnicas para la regresión lineal, también pueden usarse métodos de regresión no lineal para este propósito, incluyendo modelos parcialmente lineales, así como métodos basados en reglas, tales como la agrupación por subdivisión recurrente. De hecho, generalmente puede combinarse cualquier algoritmo usado en el análisis hemométrico o reconocimiento de patrón con los datos del ensayo físico, representado por huellas preparadas tal como se enseña en el presente documento, con el fin de clasificar los compuestos. Tales técnicas matemáticas son bien conocidas en la técnica, y dan como resultado la fórmula que sirve como un sustituto para probar compuestos adicionales.

La aplicación de la fórmula al perfil obtenido para un compuesto probado ex novo con respecto al panel de referencia da como resultado un cálculo de la capacidad de los compuestos probados ex novo para unirse a la diana. Naturalmente, esto representa una probabilidad y no un absoluto. El resultado estimado equivale a un procedimiento de selección para identificar compuestos con una probabilidad elevada de unirse a la diana (o de no unirse a la diana).

Aunque un compuesto en un momento dado puede probarse con respecto al panel de referencia y la fórmula aplicada para estimar un valor de reactividad de la diana, la aplicación más útil del método de la invención se refiere a seleccionar librerías o compuestos candidatos. Por tanto, con bastante frecuencia, se dispone de un gran número de compuestos candidatos y el método de la invención puede usarse para seleccionar los que se unen y los que no se unen a la diana. Cuando el método se aplica de esta manera a las librerías, los resultados de los candidatos seleccionados ex novo pueden añadirse, si se desea, al conjunto de ensayo y el proceso se repite en un ciclo iterativo. Por tanto, el conjunto de ensayo original podría complementarse con compuestos seleccionados que se cree que se unen fuertemente a la diana y compuestos seleccionados que se cree que se unen a la diana sólo débil o indetectablemente y aquellos compuestos usados además de, o en lugar de ciertos elementos del conjunto de ensayo para obtener los perfiles con respecto a los elementos del panel de referencia y a las dianas reales. La fórmula puede recalcularse entonces, teniendo en cuenta estos elementos adicionales.

Además, no es necesario incluir al final en la fórmula todos los perfiles de las proteínas del panel de referencia con respecto al conjunto de ensayo. Es decir, algunos de los coeficientes para los perfiles del receptor modelo en la combinación lineal pueden ser cero o negativos.

El enfoque general para el uso de sustitutos se representa en la figura 1.

En la figura 1, se crea primero una base de datos de huellas según el procedimiento mostrado en la figura 3, descrito más adelante, para una multiplicidad de compuestos frente a un panel de referencia representativo. El propio panel de referencia se seleccionará usando datos preliminares para incluir elementos que tengan la capacidad de reaccionar, colectivamente, con una amplia variedad de compuestos, pero en el que cada elemento del panel reacciona con conjuntos diferentes de tales compuestos.

Cuando se ha elegido un panel adecuado, también se selecciona un conjunto de ensayo de entre los perfiles para las pruebas frente a la diana. Por tanto, se prueba cada uno de los elementos del conjunto de ensayo y se obtiene el resultante con respecto a la diana para cada elemento del conjunto de ensayo. Esto supone un perfil de diana usando el conjunto de ensayo como elementos del panel. Las huellas de los conjuntos de ensayo pueden invertirse entonces conceptualmente, puesto que están implicados los mismos puntos de datos, para proporcionar un perfil de cada elemento del panel con respecto a los compuestos del conjunto de ensayo. Estos perfiles conceptualmente invertidos pueden analizarse matemáticamente, por ejemplo, usando análisis de regresión lineal, para obtener un sustituto matemático como el mostrado en la figura 1.

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El perfil de cualquier candidato, incluyendo los candidatos para los que ya están disponibles los perfiles en la base de datos, pueden tratarse matemáticamente de acuerdo con el sustituto para predecir la reactividad con la diana. Los candidatos satisfactorios pueden identificarse usando las predicciones generadas por el sustituto y los candidatos satisfactorios se sintetizaron usando los materiales de partida pertinentes. También hay un ciclo de retroalimentación que permite que tales estimaciones se prueben y que las revisiones para el conjunto de ensayo se hagan partiendo de la base de estas predicciones que conducen a modificaciones del sustituto.

Método ilustrativo

El método de la invención puede ilustrarse adicionalmente usando una matriz hipotética simplificada y un método de regresión lineal de combinación.

La matriz que se expone más adelante representa una matriz hipotética usada para ilustrar la generación de la fórmula pertinente como sustituto. A través de la parte superior marcada MR1-MR5 hay cinco elementos de panel que representan elementos de panel, tales como enzimas usadas como dianas modelo de referencia para el receptor diana TR real. A lo largo del lateral, marcado como TC1-TC5, hay cinco compuestos de ensayo que se unen o, en caso contrario, reaccionan en grados variables con cada uno de los elementos del panel de referencia. Al grado de reactividad se le asigna arbitrariamente un valor en una escala de 1-10, en la que 10 indica reactividad elevada y 1 indica reactividad baja. Generalmente se usa una escala logarítmica de los valores medidos.

Matriz de muestra

1

En estos resultados hipotéticos, los perfiles para cada uno de los conjuntos de los compuestos de ensayo con respecto al panel de referencia se muestran en las filas horizontales y los perfiles para cada enzima de referencia con respecto al conjunto de ensayo de los compuestos se muestran en las columnas verticales. Por tanto, por ejemplo, para MR1, hay un nivel moderadamente elevado de reactividad con TC1, baja reactividad con TC2, muy baja con TC3, reactividad moderada con TC4 y reactividad muy elevada con TC5. Por tanto, cada uno de MR1-MR5 tiene un perfil de reactividad particular con respecto al conjunto de ensayo. A la derecha, marcado como TR, el receptor diana muestra un perfil frente al conjunto de ensayo con reactividades que aumentan monótonamente con respecto al intervalo TC1-TC5, un patrón extremadamente diferente de cualquiera de los perfiles de referencia.

Se genera entonces una fórmula mediante la asignación de pesos a cada uno de los elementos de los cinco perfiles MR1-MR5 para obtener un perfil pronosticado del receptor diana que se ajuste al obtenido realmente para la diana. Será necesario que los valores ponderados sean los mismos para cada elemento de los perfiles. Por tanto, los pesos aplicados al elemento TC1 con respecto a cómo se cuentan los valores de MR1-MR5 han de ser los mismos que los aplicados a TC2. En última instancia, el algoritmo será de la forma A(MR1) + B(MR2) + C(MR3) + D(MR4) + E(MR5) = el valor asignado al valor pronosticado de acuerdo con el sustituto, mostrado en la tabla como PR. Cada uno de los coeficientes A-E tendrá un valor numérico; algunos de los coeficientes pueden ser cero. Esta misma ecuación, con los mismos valores de A-E, se usará para calcular la reactividad estimada con el receptor diana para cualquier compuesto candidato individual.

En el ejemplo anterior, A=+2; B=+3; C=-1; D=-2; E=+1. Aquí, los coeficientes permiten un ajuste perfecto entre el perfil del Receptor Estimado (ER) y el perfil del receptor diana (TR) con respecto al conjunto de ensayo. En general, y si se incluyen más compuestos en el conjunto de ensayo, puede que no sea posible un ajuste perfecto; sin embargo, la aproximación más ajustada que puede obtenerse es útil para el mismo fin.

Por tanto, para cualquier nuevo compuesto, se obtiene una predicción para su reactividad con la molécula diana tal como sigue: Se obtiene un perfil que proporciona valores de reactividad para MR1-MR5. Los valores obtenidos se sustituyen entonces en la fórmula expuesta anteriormente, con los valores estimados de A-E. Se calcula un valor pronosticado. Por tanto, un nuevo compuesto candidato, que da un perfil con valores de MR1=8, MR2=9, MR3=4, MR4=7 y M5=5, se evaluará de acuerdo con la fórmula:

(+2)(8) + (+3)(9) + (-1)(4) + (-2)(7) + (+1)(5) = PR

para proporcionar un valor de reactividad pronosticado de 30. Esto demuestra que el método puede predecir una reactividad mayor que la disponible en el conjunto de ensayo. Pueden añadirse compuestos de alta reactividad confirmada para perfeccionar la fórmula.

Los ejemplos 3 y 4 expuestos más adelante indican que este enfoque general consigue predecir satisfactoriamente la reactividad de cualquier compuesto candidato con una molécula diana; de acuerdo con esto, no se requieren suministros adicionales del receptor diana para probar un número arbitrario de compuestos.

En una realización preferida de la matriz original, tanto el panel de referencia como el conjunto de ensayo son sumamente diversos y representan imágenes inversas. Esto se ilustra en la figura 2 que muestra una matriz hipotética de elementos del panel de referencia y agentes de unión de referencia. Tal como se ilustra en la figura, el elemento 1 del panel de referencia y el elemento 1' del conjunto interactúan fuertemente; el elemento 2 del panel de referencia y el elemento 2' del conjunto, también; el elemento 3 del panel de referencia y el elemento 3' del conjunto, etc. Hay una interacción relativamente débil entre, digamos, el elemento 3' del conjunto y el elemento 2 del panel de referencia o el elemento 1 del panel de referencia. En efecto, el panel de referencia y el conjunto de ensayo representan imágenes inversas.

Pueden prepararse kits que incluyan, en recipientes separados, cada uno de los elementos del conjunto de ensayo, cada uno de los elementos del panel de referencia y la diana, junto con reactivos para probar su reactividad.

Inclusión de proteínas no Ig

La actuación del método sustituto anterior dio como resultado el sorprendente descubrimiento de que la huella que se ajusta para identificar los compuestos con propiedades deseables, tales como la capacidad de unirse a una diana deseada, la capacidad de comportarse como un inhibidor enzimático, una actividad farmacológica específica, etc., puede basarse en paneles que se enriquecen sustancialmente mediante proteínas que no son ni inmunoglobulinas ni sus fragmentos ni parálogos sumamente diversos específicamente diseñados. Sorprendentemente, puede lograrse un intervalo de complementaridad u otra capacidad interactiva suficiente para cubrir sustancialmente todo el "espacio químico" empleando proteínas que se producen naturalmente, tales como enzimas, lectinas, receptores de células T, receptores olfativos y similares, o empleando proteínas que son formas modificadas de proteínas que se producen naturalmente. Mediante la elección de un conjunto adecuado de estas proteínas, puede obtenerse un intervalo suficiente de reactividad para proporcionar huellas intensificadas en estos contextos. Por tanto, los paneles enriquecidos o constituidos por proteínas no inmunoglobulínicas sirven para proporcionar conjuntos de referencia adecuados de puntos de datos para obtener un perfil característico de una sustancia individual. Los perfiles pueden manipularse de varias formas, tal como se describe más adelante adicionalmente.

Sería posible, y está dentro del alcance de la invención, construir paneles que contengan como elementos, no sólo estas proteínas, sino también anticuerpos y/o parálogos u otros casos de reactividad cuantitativa arbitrariamente escogida. Cuando se usa la palabra "reactividad" en la presente solicitud, se refiere a la interacción no covalente entre los participantes establecidos. En este sentido, entonces, "reactividad" es sustancialmente similar a unión no covalente. Tal unión puede o no asociarse con respuestas catalíticas o alostéricas.

Sin embargo, el panel debe enriquecerse al menos mediante proteínas alternativas. Una proteína "enriquece" el panel si su participación en el panel realiza una de las funciones siguientes o algunas combinaciones:

(a)

expande la cobertura del panel con respecto al espacio químico (véase más adelante);

(b)

aumenta la distancia media entre las huellas de los diferentes compuestos en la librería (véase más adelante);

(c)

disminuye el número de elementos del panel de referencia requerido para obtener un número dado de componentes principales (véase más adelante).

(a) Por supuesto, se desea cubrir todo el espacio químico. Sin embargo, generalmente es satisfactorio un 90%, aunque preferiblemente un 95% de la cobertura. "Cubrir" el espacio químico significa que todos los compuestos pro-
bados frente al panel muestran al menos cierta reactividad con al menos un elemento del panel y preferiblemente, 3-5.

(b) La "distancia" entre las huellas o los perfiles puede entenderse mejor mediante el recurso de la asignación de cada perfil a un punto en el espacio n-dimensional en el que la reactividad con respecto a cada uno de los n elementos del panel de referencia se representa individualmente en n dimensiones. La distancia entre los puntos es entonces la distancia entre los perfiles. Se observa fácilmente, sin embargo, que esto es sólo una forma conveniente para cuantificar las diferencias entre los perfiles; también podría usarse cualquier otro método para cuantificar los perfiles, tal como la subdivisión recurrente de los datos, tal como en una jerarquía de agrupación en dendrograma.

(c) "Principales componentes" se refiere al grado de correlación en la reactividad de acuerdo con la utilización estadística multifactorial estándar. Por ejemplo, si hay 10 elementos en el panel y todos reaccionan casi uniformemente con un conjunto dado de compuestos, sólo proporcionan un componente principal. Si cada par posible de los elementos del panel no muestra correlación en la reactividad de unión a un conjunto dado de compuestos, hay 10 componentes principales.

Por tanto, las proteínas incluidas en los paneles usados en el método de la invención deben intensificar o enriquecer el panel en al menos una de las formas anteriores. Los paneles útiles en la invención pueden incluir al menos una proteína no-Ig que enriquezca el panel. Preferiblemente, el 10% de los elementos son proteínas no-Ig, más preferiblemente el 20% y más preferiblemente el 50%, o más.

Los paneles pueden estar constituidos completamente por proteínas no-Ig o, es más, completamente por enzimas, o completamente por lectinas, o completamente por receptores de células T, o completamente por proteínas receptoras olfativas, o completamente por proteínas receptoras, en general, o pueden estar compuestos de mezclas de éstos. Tomando como ejemplo los paneles en los que la inclusión de enzimas es el punto central, normalmente los paneles contendrán al menos 2 enzimas, preferiblemente 3 enzimas, más preferiblemente 4-6 enzimas y más preferiblemente 7-25 enzimas. Se ha encontrado que el empleo de no más de 15 enzimas puede dar todavía resultados aceptables sobre prácticamente todo el espacio químico; sin embargo, no hay límite superior arbitrario para el número de enzimas en el panel, aparte de la consideración práctica de que la ley de disminución del rendimiento se establece en números bastante claramente por encima en este intervalo. Comentarios similares podrían hacerse en relación con cualquier otra clase particular de proteínas mencionadas anteriormente.

Las proteínas en el panel pueden escogerse preferiblemente tal como sigue:

Se usa un proceso iterativo para seleccionar los elementos de cualquier panel para su uso en la obtención de huellas. Algunos elementos candidatos del panel que incluyen proteínas no-Ig se escogen arbitrariamente y se obtienen huellas para cualquier conjunto arbitrario de compuestos. Se hacen comparaciones entre las huellas. Podría usarse cualquier método de comparación, pero algunos métodos particularmente eficaces se describen más adelante en el presente documento. Cualquiera que sea el método de comparación, los compuestos que tienen huellas muy similares son elementos claramente redundantes de la librería de compuestos para este propósito y sólo debe mantenerse uno de los compuestos en tal grupo en el conjunto de selección. Las huellas restantes se comparan entonces de nuevo para determinar su similitud, sólo que esta vez se obtiene un perfil inverso para cada uno de los elementos del panel de referencia, con respecto a los compuestos restantes en el conjunto de selección. Ahora se hace posible desechar los elementos del panel que proporcionan perfiles inversos similares con respecto a la librería de compuestos. Por tanto, si tres elementos candidatos en el panel parecen proporcionar patrones de reacción similares a través de la librería de compuestos probada, sólo uno de los elementos se mantiene en el panel.

Si el panel, incluyendo proteínas no-Ig, en el que se ha reducido así la redundancia, continúa generando huellas viables para todos los nuevos compuestos y si los nuevos compuestos no revelan ninguna redundancia adicional en el panel, entonces el panel es satisfactorio. Sin embargo, si el panel no proporciona una huella significativa para ningún nuevo compuesto, es necesario añadir al panel elementos adicionales, aunque se hace cada vez más difícil encontrar un elemento nuevo que proporcione distintos patrones en comparación con los ya presentes. La selección de los nuevos elementos en los paneles se realiza preferiblemente sobre compuestos que no se detectaron con los elementos ya presentes. Los nuevos elementos candidatos se evalúan entonces en un conjunto sumamente diverso de los compuestos ya probados. El panel ideal proporciona una alta cobertura con alta independencia y un número pequeño de elementos, preferiblemente inferior a 100, más preferiblemente inferior a 25 y más preferiblemente inferior a 15.

Se ha encontrado que entre 100 enzimas de función ampliamente variable, 12 de ellas proporcionan una cobertura del 95% frente a 1000 compuestos de una amplia variedad de clases químicas. Las 12 enzimas son independientes, ya que aproximadamente son necesarios 9 componentes principales estadísticamente significativos para describir las 12; si fueran totalmente independientes, serían necesarios 12.

Disposición del panel

Los elementos, incluyendo las proteínas no-Ig, que comprenden el panel deben incorporarse físicamente de tal manera que pueda recuperarse un resultado individual para cada elemento y registrarse de manera que se construya el perfil. Naturalmente, es posible simplemente hacer reaccionar cada elemento independientemente en un recipiente de reacción individual con el analito pertinente; registrar los resultados de cada recipiente individualmente; y construir manualmente el perfil que resulta. Un enfoque alternativo más conveniente implica la presentación de los elementos del panel de una forma ordenada sobre algún tipo de soporte sólido, tal como una placa de microtitulación u otro soporte con múltiples regiones de prueba y escanear las regiones para obtener los resultados individuales. El escaneo puede evaluar los resultados en cada región secuencial o simultáneamente usando tecnología conocida.

En general, la reactividad del analito con cada región o recipiente de prueba se evalúa en lo que se refiere a la afinidad de unión del analito al elemento del panel contenido en el mismo. La técnica está repleta de metodologías para detectar el grado de unión de una sustancia a otra. En un enfoque prototípico, un componente, en este caso el elemento del panel, se une a un soporte sólido y el otro componente, en este caso el analito, se marca usando radioisótopos, fluorescencia, enzimas y similares, y tras poner en contacto el analito con el elemento del panel unido al soporte, el soporte se lava, si es necesario, para eliminar el analito no unido y la cantidad de marcador medido. Alternativamente, la afinidad de unión puede medirse por la competencia entre el analito y un competidor marcado. Un método de tal unión competitiva descrito en las patentes anteriormente mencionadas implica la competencia entre el analito y una mezcla diversa de compuestos marcados, mezcla que es suficientemente diversa como para que la mezcla se una uniformemente a todo elemento del panel de la prueba, de manera que la disminución en el marcador dé directamente una medida del grado de unión para el analito competidor. También se dispone de métodos para detectar el grado de unión entre dos sustancias en medios homogéneos como en, por ejemplo, la tecnología EMIT. En todos estos métodos puede usarse cualquier método convencional de marcado. Entre los métodos preferidos está el uso de competencia con marcador fluorescente, por ejemplo, usando polarización fluorescente. La invención no se refiere a métodos específicos de detección del grado de unión y puede usarse cualquier procedimiento convencionalmente usado para medir la afinidad de unión entre el analito y el elemento del panel.

Es preferible usar métodos de ensayo con un amplio intervalo dinámico. La cuantificación de la afinidad mediante la CI_{50} para la inhibición del recambio del sustrato, u otros casos de unión competitiva, pueden medirse a menudo en más de cinco unidades logarítmicas de potencia, por ejemplo.

Determinación del perfil

La determinación de un perfil característico proporciona la herramienta básica para las técnicas de ajuste de la invención. Cada perfil o huella se determina midiendo las reactividades individuales, tales como las afinidades de unión del analito para cada elemento del panel. Las reactividades se registran entonces en una disposición ordenada, de manera que proporcionen este perfil característico.

La figura 3 es un diagrama de flujo que muestra las etapas de la obtención del perfil característico para un analito.

En primer lugar, el analito se pone en contacto con cada elemento del panel (elemento i del panel) en un panel de n elementos. Para cada uno de estos contactos se detecta y se mide la reacción del analito con el elemento del panel. A continuación, se registra la extensión de la reacción para obtener un punto de datos para la reactividad asociada con cada uno de los n elementos del panel. Después, los puntos de datos registrados se disponen de una manera ordenada para obtener el perfil. Una forma conveniente de disponer estos puntos de datos es representar cada reactividad en una de las dimensiones del espacio n-dimensional. Sin embargo, también se dispone de otros medios de registrar los perfiles.

Las figuras 4a-4b proporcionan ejemplos de la manera en la que pueden registrarse tales perfiles. En la figura 4a, el analito se prueba directamente con respecto a la afinidad de unión para un panel teórico que contiene diez enzimas. Los resultados se registran en la forma de un gráfico de barras. Alternativamente, tal como se muestra en la figura 4b, los resultados pueden tabularse en términos de categorías arbitrarias de fuerza de unión representadas por un espectro de blanco-negro para indicar el grado de afinidad. Para el análisis informático, los valores numéricos son más útiles, aunque difíciles de interpretar mediante inspección visual.

Una vez registrado el perfil característico de un analito, o bien tal como se muestra en las figuras 4a-4b, o en otro gráfico, en forma numérica o en forma electrónica, puede usarse para una variedad de propósitos. Un propósito claro sería simplemente caracterizar el analito con el fin de poder ajustar el perfil con el de un compuesto desconocido. El perfil también puede usarse para analizar la concentración del analito en una muestra, incluyendo muestras que contienen mezclas de analitos. El perfil también puede utilizarse para comparar la capacidad de unión de una sustancia candidata con la de un ligando que se sabe que se une a una diana. Esto puede lograrse a través del ajuste directo o a través del ajuste del perfil con el de un receptor usando paneles de imagen inversa, tal como se describe más adelante.

Ajuste con el patrón para identificar las reactividades deseadas

Una aplicación del panel da como resultado la identificación de características de diagnóstico de moléculas o "farmacóforos" que interactúan con dianas receptoras. Las técnicas de ajuste con el patrón son exactamente las mismas que las descritas para los paneles que contienen anticuerpos o parálogos, tal como se expone en las patentes 5.300.425 y 5.340.474 y en el documento U.S. 5.338.659, anteriormente mencionados.

El ajuste con el patrón puede usarse para identificar compuestos que tienen una actividad fisiológicamente deseada. Por ejemplo, puede predecirse que los compuestos que proporcionan huellas frente a los paneles de referencia que son similares a las de compuestos que tienen actividad antiinflamatoria, tienen actividad inflamatoria. Las técnicas de ajuste pueden variar, pero las descritas en el documento U.S. 5.338.654 anteriormente mencionado, son particularmente útiles.

La figura 5 muestra un método directo de identificar una sustancia que será satisfactoria en la unión a una diana deseada.

Tal como se muestra, se obtiene un perfil para el candidato de una manera similar a la descrita anteriormente para un analito en general. Se realizan las mismas etapas, usando los mismos elementos del panel, con respecto a un ligando que se sabe que se une a la diana deseada. De esta manera se obtiene el perfil de la sustancia candidata y el de un ligando. Estos perfiles se comparan, por ejemplo, de la manera descrita en el presente documento, mediante la determinación de la distancia entre los puntos generados por la representación de las reactividades frente a los elementos del panel en el espacio n-dimensional, y se identifica un candidato que tiene un perfil similar al del ligando (es decir, por ejemplo, cerca de la posición del punto que representa el perfil para el ligando en el espacio n-dimensional) como un candidato satisfactorio. El candidato satisfactorio se sintetiza entonces usando los materiales de partida pertinentes apropiados para obtener la sustancia deseada.

Un enfoque alternativo es ajustar perfiles determinados para la sustancia candidata y la molécula diana deseada, que se obtienen con respecto de los paneles de imagen inversa. Este enfoque se representa en la figura 6.

Un conjunto de imagen inversa se refiere a un conjunto de elementos, cada uno de los cuales es complementario a un elemento del panel de referencia descrito anteriormente. La figura 2 será útil en relación con la siguiente descripción. La figura 2 muestra un panel de referencia en el que las moléculas representativas tienen formas particulares definidas numeradas 1-n. Un panel de imagen inversa correspondería a un conjunto de moléculas que es complementario a estas formas mostradas como 1'-n' en la figura. Tal como se ha establecido anteriormente, tal panel de imagen inversa formaría un conjunto de ensayo ideal en la construcción de los sustitutos. También puede construirse deliberadamente para su uso en las técnicas de ajuste con el patrón que se van a describir. Los elementos del panel de imagen inversa se denominan "complementos de referencia" debido a su forma complementaria. Por tanto, por ejemplo, el complemento 1' de referencia encaja y se une exactamente al elemento #1 del panel de referencia; el complemento 4' de referencia se une y encaja exactamente en el elemento #4 del panel de referencia, etc. La construcción de paneles de imagen inversa también se describe en la patente de los EE. UU. 5.300.425.

El procedimiento general de ajuste con el patrón pertinente en el presente documento se explica resumidamente en la figura 6.

En la figura 6, se obtiene un perfil del compuesto candidato de una manera similar a la de la figura 3, tratando el candidato con cada elemento del panel y obteniendo un perfil, tal como se muestra en la columna de la izquierda. El perfil de la diana deseada se obtiene con respecto a cada complemento de referencia de un conjunto de n elementos, que presentan la imagen inversa del panel de referencia, tal como se muestra en la columna de la derecha. De nuevo, los perfiles se comparan y los perfiles similares se identifican para obtener una sustancia candidata satisfactoria que se unirá a la diana. La sustancia candidata satisfactoria se sintetiza entonces a partir de los materiales de partida apropiados.

Naturalmente, los paneles de imagen inversa podrían invertirse; el perfil de la diana se obtiene con respecto al panel de referencia y el del candidato con respecto a su panel complemento de referencia de imagen inversa.

Por tanto, independientemente de lo complejo de su estructura, si el compuesto candidato tiene una característica estructural que logre su unión a un elemento del panel de referencia, tal como la configuración de punta de flecha diseñada para encajar en la cavidad de forma triangular mostrada para el elemento #1 del panel de referencia en la figura 2, se unirá con una diana que tenga una característica superficial (de nuevo, independientemente de lo complejo del resto de la molécula) que se parezca a la cavidad triangular mostrada en el elemento #1 del panel de referencia de la figura 2. Naturalmente, esta característica hará que una sustancia a la que se una en virtud de esta característica, se una al complemento 1' de referencia en el panel de imagen inversa. Debido a esta característica común, entonces, el perfil del candidato con respecto al panel de referencia se ajustará al de la diana con respecto al panel de imagen inversa. Naturalmente, dado que los métodos de la invención funcionan sobre huellas empíricas, no es necesario saber cuáles son los motivos complementarios en lo que se refiere a su estructura molecular.

El documento U.S. 5.338.659, mencionado anteriormente, describe un enfoque particularmente eficaz para hacer comparaciones entre perfiles. Este enfoque consiste en representar los perfiles o huellas obtenidos en un espacio n-dimensional, en el que n es el número de elementos del panel pertinente y la localización del punto en cada dimensión es una función de su reactividad con cada elemento del panel. La proximidad de los puntos que representan los perfiles desconocidos y cualquiera de los perfiles predeterminados en el espacio n-dimensional representa la similitud de sus composiciones. También pueden emplearse técnicas estadísticas multiparamétricas para definir cuáles de las n dimensiones tienen el mayor contenido de información en relación con el ensayo, de manera que se permita una selección del número mínimo de características o dimensiones que han de medirse.

Con el fin de usar los perfiles como herramientas en las propiedades de predicción de las sustancias de la prueba o en otras aplicaciones de ajuste con el patrón, independientemente de las técnicas específicas usadas de ajuste con el patrón, el panel de referencia debería poder cubrir al menos el 90% del espacio químico y debería proporcionar una distancia media entre las huellas de todos los pares de al menos aproximadamente tres veces el nivel de ruido generado por la reproducción de la determinación de perfiles para un compuesto único. Además, la huella proporcionada por el panel de referencia debería proporcionar al menos cinco componentes principales con respecto a la gama de pequeños compuestos orgánicos que están disponibles comercialmente. Por ejemplo, esta gama se tipifica mediante cualquier conjunto de aproximadamente 1.000 compuestos entre los disponibles del Aldrich Catalog of Fine Chemicals.

Uso de sustitutos

Los paneles también se usan para crear sustitutos para una diana deseada con el fin de evaluar la unión de los compuestos candidatos, tal como se describió anteriormente.

Aplicaciones

Las aplicaciones de estos procedimientos de ajuste con el patrón con respecto a los perfiles o huellas son múltiples. Por ejemplo, es posible, debido a su facilidad de síntesis o debido a su aparición natural, obtener péptidos o proteínas que se comporten en formas biológicamente importantes. Sin embargo, los péptidos y las proteínas no son atractivos como fármacos, ya que no pueden administrarse fácilmente de forma oral, ni metabolizarse, y presentan problemas en la fabricación y el almacenamiento; se prefieren las moléculas pequeñas. Mediante el ajuste de perfiles, o bien mediante el ajuste directo con el patrón, paneles inversos o sustitutos, pueden encontrarse sustitutos adecuados de pequeñas moléculas.

Otra aplicación importante es la predicción de la toxicidad en los fármacos candidatos. La comparación de los aspectos apropiados de la huella del fármaco candidato con características de huellas de toxinas conocidas permite tal predicción. Asimismo, la construcción de sustitutos para proteínas similares en secuencia o función a la diana permite que se estimen los efectos secundarios debidos a las reacciones cruzadas antes de realizar pruebas en animales, usando sólo cantidades traza de la proteína relacionada.

Todavía otra aplicación de los perfiles y su correlación se refiere a proporcionar parámetros para mejorar los modelos tridimensionales de disposición espacial de los farmacóforos obtenidos mediante la obtención del modelo informático convencional. La comparación de la huella para un compuesto candidato particular, cuya estructura tridimensional ha de compararse con una descripción idealizada de un ligando apropiado (el farmacóforo), con las huellas de compuestos que tienen actividades relacionadas proporciona información empírica adicional sustancial que puede permitir la construcción de representaciones tridimensionales más exactas de péptidos u otras macromoléculas sometidas a variación conformacional.

Esas técnicas también permiten la reducción de las grandes librerías de compuestos a conjuntos más pequeños que, no obstante, contendrán los compuestos que es más probable que tengan una actividad biológica deseada. El tamaño reducido de la librería permite que se apliquen herramientas más sofisticadas para la predicción de la afinidad de los compuestos en la librería reducida para una diana. Por tanto, dado que el tamaño de la librería es reducido, el amplio análisis conformacional del ligando en el sitio activo, así como los cambios conformacionales del sitio activo en presencia del ligando, pueden estudiarse para los elementos de la librería. Esto también permite un análisis más exacto de las interacciones electrostáticas entre el ligando y el sitio de unión, incluyendo los efectos de solvatación que están relacionados con la desolvatación de la cavidad de unión y el ligando cuando éstos interactúan. La librería reducida posibilitada por la invención es considerablemente más pequeña que la generalmente usada en las bases de datos tridimensionales, lo que permite que se invierta proporcionalmente más esfuerzo computacional en cada compuesto.

La aplicación más general es simplemente proporcionar la máxima diversidad funcional para un tamaño dado de librería química; esta librería química proporciona un conjunto central para la selección, un conjunto central para la selección informática, conjuntos de formación, generalmente, y ligandos cromatográficos. Esta aplicación es especialmente útil aplicada a una librería combinatoria, en la que normalmente se encuentran grandes números de compuestos bastante similares.

La utilidad del enfoque de comparación con el patrón ha demostrado que es satisfactorio para identificar fármacos antiinflamatorios no esteorideos (AINE). Muchos AINE se han seleccionado basándose en su capacidad para inhibir a la ciclooxigenasa (COX, también conocida como prostaglandina sintetasa) que cataliza la primera etapa de la síntesis de las prostaglandinas, así como en su actividad en modelos animales. Una segunda ciclooxigenasa, la COX-II, se ha descubierto recientemente que es una isoenzima de la originalmente conocida COX-I. COX-II está en buena parte restringida a las células del sistema inmune y se cree que es más importante que la COX-I en la inflamación.

Tal como se explica en más detalle en el ejemplo 2, se obtuvieron huellas para varios cientos de compuestos, incluyendo dos AINE, usando los paneles de proteínas (que contenían 8-10 proteínas). El examen de las huellas de estos dos compuestos mostró una característica común que se probó que era compartida con varios AINE adicionales conocidos para los que se obtuvieron posteriormente perfiles o huellas. Se investigaron entonces las huellas para varios cientos de compuestos ya probados para determinar la presencia o ausencia de esta característica. Se encontraron doce compuestos y se probaron éstos para determinar su capacidad para inhibir la COX-I. Dos compuestos mostraron una capacidad moderada y uno, una capacidad medible pero baja a este respecto, aunque no se había informado de ninguna actividad de AINE para estos compuestos.

El panel de proteínas se optimizó entonces tal como se describió antes generalmente y se usó para evaluar un grupo de compuestos estructuralmente diversos que contenían siete inhibidores conocidos de COX y seis inhibidores de otras dianas. Las huellas obtenidas permitieron la predicción completamente exacta de si el compuesto era o no inhibidor de COX, aunque las proteínas en el panel no representaban ninguna proteína que estuviera relacionada con COX ni en su homología ni en su actividad enzimática.

Base de datos de huellas

Los paneles de referencia descritos en el presente documento y los paneles de referencia generalmente, pueden usarse para generar una base de datos de huellas que contenga las huellas de una librería de compuestos en forma físicamente almacenada para permitir su recuperación. Esta forma puede ser, o bien una base de datos en "papel" o bien, preferiblemente, en una forma legible en el ordenador. La base de datos contendrá las huellas de generalmente más de 1.000 compuestos con respecto a un panel de proteínas u otros elementos, en donde el número de elementos del panel es inferior a tres veces el número de componentes principales representados en el panel. Los compuestos representarán un intervalo de afinidades de unión para los elementos del panel que es superior a tres logaritmos representados como CI_{50}. En la base de datos seleccionada, más del 95% de los compuestos proporcionarán huellas que son visibles - es decir, son mayores que la distancia ruido desde el origen y tendrán una separación media desde sus vecinos más cercanos de más de tres veces la distancia ruido.

Estas bases de datos son útiles en una variedad de contextos. Mediante la aplicación de métodos estadísticos multifactoriales, pueden obtenerse subconjuntos igualmente diversos, de manera que puede verificarse que un subconjunto seleccionado a partir de la base de datos es de igual interés que la diversidad representada por un subconjunto alternativo obtenido mediante otro método. Los métodos estadísticos multifactoriales también pueden usarse para seleccionar un subconjunto de máxima diversidad para un tamaño definido de la librería; por ejemplo, si el tamaño definido es de cinco veces el número de elementos del panel de referencia, puede usarse como un conjunto de ensayo, tal como se describió anteriormente. La base de datos también puede usarse como origen para un conjunto diverso de ligandos cromatográficos.

Los ejemplos siguientes están destinados a ilustrar, pero no limitan la invención.

Ejemplo 1

Factores que determinan los requisitos mínimos para la construcción de sustitutos

Con el fin de construir un sustituto, tanto el panel de referencia como el conjunto de ensayo deben ser adecuados. Con el fin de obtener compuestos candidatos satisfactorios para una propiedad deseada, la librería también debe ser adecuada.

La confirmación de que el panel de referencia contiene un número adecuado de proteínas apropiadamente escogidas puede llevarse a cabo obteniendo una representación X-Y de la distancia entre los puntos en el espacio n-dimensional (eje X) frente a la frecuencia de esta distancia observada (eje Y) (distribución de distancias). Se recordará que cada punto en el espacio n-dimensional representa el perfil obtenido para un compuesto único de la librería de compuestos con respecto a un panel de referencia de n elementos. La altura, la forma y la separación máxima de esta distribución de distancias proporciona información en cuanto a la idoneidad del panel y de la librería. Idealmente, debe obtenerse una distribución de Poisson en la que el máximo de la distribución es un valor elevado de la distancia entre pares.

Las figuras 7a, 7b y 7c representan las distribuciones de distancias para el mismo conjunto de compuestos con respecto a los paneles de referencia que contienen 5, 7 y 10 proteínas, respectivamente. Se observa que, cuando sólo se usan cinco proteínas en el panel, la forma de la distribución es un tanto irregular y la distancia más frecuente entre los puntos es relativamente baja. Sin embargo, cuando se aumenta el número de proteínas en el panel, surge una distribución de Poisson de forma más regular con una distancia mayor entre los puntos y su máximo. El número de elementos en el panel es adecuado cuando la adición de más elementos no mejora la posición ni la forma de esta distribución.

A la inversa, las figuras 8a-8c reflejan los progresos hacia el logro de una distribución ideal mediante un simple aumento en el número de compuestos elegidos aleatoriamente en la librería de compuestos. La representación de las distancias de parejas entre compuestos en una librería química debe proporcionar una distribución aleatoria de distancias, si la colección de compuestos es completa. Si hay discontinuidades, la colección es incompleta. Además, los valores grandes de la distancia máxima entre los elementos de un par indican más diversidad en un conjunto de compuestos. Esto se ilustra en las figuras 8a-8c. La figura 8a muestra la representación de la frecuencia frente a la distancia para los puntos que representan las huellas determinadas frente a un conjunto de diez proteínas de referencia para 50 compuestos seleccionados aleatoriamente. Los datos no dan como resultado una distribución de Poisson y la separación máxima de la distancia es ligeramente superior a ocho unidades. La figura 8b muestra resultados similares cuando se incluyen las huellas de 100 compuestos; la distribución se ha hecho más regular y la separación máxima ha aumentado hasta aproximadamente 12 unidades. Cuando se obtuvieron y se compararon las huellas para 1000 compuestos, la separación máxima entre los puntos en un espacio n-dimensional alcanza 15 unidades y la distribución asume la forma típica de Poisson (figura 8c).

Pueden usarse comparaciones similares para evaluar la idoneidad de números más pequeños de compuestos supuestamente más representativos, por ejemplo, para evaluar la idoneidad de librerías combinatorias compuestas en su totalidad por péptidos. La figura 9b muestra la distribución de distancias para 50 fármacos comercialmente disponibles. Al comparar esta distribución con la mostrada en la figura 9a (la misma que la de la figura 8a) para 50 compuestos aleatorios estructuralmente diversos revela que las distribuciones son bastante similares. Sin embargo, cuando estas distribuciones se comparan con las obtenidas para una librería de péptidos que oscilan desde dipéptidos hasta 32-meros, tal como se muestra en la figura 9c, la parte del espacio separado es más de una unidad más pequeña. Esto conduce a la conclusión de que las librerías de péptidos en sí mismas pueden ser inadecuadas para representar todo el espacio químico.

El carácter de la distribución de distancias también puede usarse como una medida de la diversidad de un conjunto particular de compuestos candidatos, por ejemplo sustancias disponibles como ligandos cromatográficos. Usando la distribución de distancias como criterio, puede suministrarse un número mínimo de ligandos para ofrecer el espectro más amplio posible de eficacia de la separación. En otras palabras, tales distribuciones de distancias pueden usarse para verificar la diversidad máxima de paneles de ligandos cromatográficos construidos tal como se describe en la patente de los EE. UU. 4.963.263 o para seleccionar compuestos no poliméricos para que sirvan como diversos ligandos cromatográficos.

Ejemplo 2

Descubrimiento de AINE adicionales

Se preparó una base de datos de compuestos de los que se habían obtenido las huellas, que incluyó fenoprofeno, ácido flufenámico, ibuprofeno, endoprofeno, ketoprofeno, ácido mefenámico, naproxeno, piroxicam y sulindac. Se preparó un panel de proteínas que se obtuvieron comercialmente o se expresaron recombinantemente en E. coli y se purificaron. Todas las proteínas eran enzimas en el panel inicial y se determinó una CI_{50} en un ensayo enzimático. Un panel revisado incluyó otras proteínas y la unión pudo determinarse mediante polarización de fluorescencia. Ninguna de estas proteínas tenía ninguna homología con la diana de los AINE, la ciclooxigenasa.

La verificación de los inhibidores pronosticados de la COX se realizó evaluando la actividad de la COX en presencia y ausencia del compuesto del que se había obtenido la huella. Se probó la COX-I de carnero y la COX-II de oveja. Los ensayos se realizaron incubando la enzima a 37ºC en ácido araquidónico 0,1 mM contenido en TRIS 0,1 M, pH 8,0 con fenol 20 mM. La reacción se agitó vigorosamente para mantener una concentración significativa de oxígeno disuelto durante 3 minutos. La reacción se detuvo entonces añadiendo ácido cítrico 5 mM y las muestras se diluyeron. La concentración de PGE_{2} se midió mediante EIA (inmunoensayo enzimático) usando un kit estándar de Caymen Chemicals.

Los primeros varios cientos de compuestos probados frente al panel inicial de 10 enzimas contenían ibuprofeno e indometacina, dos AINE conocidos. Las 10 enzimas en este panel son las mostradas en el presente documento en la figura 10 y se enumeran en el ejemplo 3 más adelante. Ambos comparten características comunes en sus huellas que provisionalmente se consideró que eran diagnósticas de un AINE. En la evaluación de las huellas de los compuestos restantes, se seleccionaron 12 compuestos adicionales que compartían esta característica. Estos se evaluaron para determinar su capacidad para inhibir COX-I y COX-II. Se encontraron dos inhibidores de COX-I con afinidad moderada y un inhibidor de COX-I de baja afinidad. Por tanto, nueve compuestos que se habían identificado provisionalmente no inhibieron estas enzimas, pero se encontraron dos nuevos ejemplos sin seleccionar toda la librería frente a COX. Estos ejemplos novedosos son significativamente diferentes en su estructura de los AINE conocidos: el ibuprofeno y la indometacina.

El panel de referencia se revisó entonces para incluir enzimas que enriquecieran el panel ampliando la gama de productos químicos de los que pudieran obtenerse huellas y aumentando las distancias medias y máximas entre las huellas. Las proteínas en el panel son las enumeradas en la figura 13 y se enumeran en el ejemplo 4 más adelante. Se volvieron a obtener las huellas de los compuestos. De los nueve compuestos originalmente seleccionados que luego no inhibieron a COX, sólo dos siguieron siendo supuestamente similares al perfil de AINE frente a este panel revisado.

El panel revisado se usó para obtener las huellas de un grupo de 13 compuestos no identificados y las huellas se compararon con las huellas consenso de AINE obtenidas a partir del ibuprofeno y de la indometacina. Cuando se compararon, siete de los compuestos mostraron características que predecían que inhibirían a COX y seis condujeron a la predicción de que no lo harían. Las huellas identificaron exactamente a flosulide, fenilbutazona, pirprofeno, prinomida, oxindanaco, análogo de oxindanaco y diclofenaco como inhibidores de COX y a los compuestos clordiazepóxido, maprotilina, imipramina, metoprolol y pentopril como no inhibidores. Entre los no inhibidores pronosticados también se incluyó un profármaco de diclofenaco que por sí mismo no inhibió a esta enzima.

Ejemplo 3

Construcción de un sustituto

En este ejemplo, los elementos del panel de referencia cuyos perfiles se obtendrán con respecto a un conjunto de ensayo de compuestos fueron isoenzimas de la glutatión-S-transferasa (GST). El panel de referencia que contiene diez de tales isoenzimas se muestra en la parte superior de la figura 10. La molécula diana en este ejemplo fue la glutatión reductasa (GRd) mostrada a la derecha. Los primeros 20 compuestos enumerados a la izquierda se usaron como conjunto de ensayo y, cuando se probaron para determinar su unión a la glutatión reductasa, generaron el perfil marcado GRd a la derecha. En esta "escala de grises", cuanto más oscuro es el cuadrado, más estrechamente se une el compuesto; cuanto más claro, menos estrechamente se une. La lista de compuestos y las abreviaturas se facilitan a la izquierda de la figura 10.

Para el panel de referencia, las GST A1-1, P1-1, M1a-1a y M2-2 se facilitaron como enzimas humanas recombinantes; R1-1, R8-8 son enzimas de rata de la clase alfa; R1(25)-8 es un mutante dirigido contra el sitio de R8-8. HF2 y HF3 son enzimas GST de la mosca doméstica purificadas mediante cromatografía de afinidad a hexil-glutatión a partir de líneas celulares facilitadas por M. Syvanen en UC Davis; el esquistosoma GSTS1 está disponible de Pharmacia como parte de un vector de clonación de una proteína de fusión. La glutatión reductasa de levadura se compró de Sigma.

Con el fin de probar el grado de unión entre las GTS y los compuestos de la izquierda de la tabla, se probaron cinco diluciones seriadas 5 veces desde 250 \muM hasta 0,4 \muM y se calculó la concentración de inhibición al 50% (CI_{50}) a partir de una curva ajustada a los datos. Para los compuestos con una CI_{50} inferior a 0,4 \muM, se probaron diluciones adicionales hasta que se catalogó la verdadera CI_{50}. Se seleccionaron cuatro de las GST y 20 compuestos como sumamente diversos. Las CI_{50} se indicaron en la figura en una escala de desde menos de 0,4 \muM; menos de 2,0 \muM, menos de 10,0 \muM, menos de 50 \muM, menos de 250 \muM y menos de 1000 \muM. Por tanto, las CI_{50} de menos de 0,4 \muM aparecerían en negro en esta escala; aquéllas con CI_{50} de menos de 1000 \muM aparecerían en blanco. Los valores intermedios tienen tonos variables de gris.

La columna marcada como "valores pronosticados fijados" en la figura 10 se obtiene mediante una combinación lineal de los resultados para las cuatro enzimas usadas en el panel de los receptores de referencia probados frente a los 20 compuestos que aparecen primero en el gráfico. Esta misma combinación de fijación se usó entonces para predecir la unión de GRd a los compuestos restantes. Los resultados pronosticados se comparan con los resultados reales frente a la diana en las columnas de la derecha de la figura. Se obtiene una buena correlación; el coeficiente de regresión es de 0,8, con un factor de dispersión de 0,7, tal como se muestra en las figuras 11a y 11b; esto es más que adecuado para realizar predicciones sobre los nuevos compuestos. La figura 11a muestra los datos para los 80 compuestos de prueba de la figura 10 no usados en el procedimiento de fijación y la figura 11b muestra los errores residuales (experimentales-pronosticados) de la figura 11a.

La forma matemática para la regresión lineal es:

log(CI_{50})_{i,T} = \sum\limits^{n}_{j=1} C^{Rj}log(CI_{50})_{i,Rj}.

Tal como se muestra en esta fórmula, la CI_{50} del compuesto i se mide frente a la molécula diana T o la proteína R_{j} de referencia ponderada mediante un coeficiente fijado C^{Rj}.

La correlación satisfactoria obtenida anteriormente es sorprendente, puesto que la GRd derivada de la levadura es una proteína dependiente de NADPH, que tiene una función enzimática diferente de GST. Estas enzimas no comparten homología de secuencia y la comparación de las estructuras cristalinas de GST y GRd no revela similitudes en la estructura terciaria. El uso común del glutatión no parece contribuir a la correlación, puesto que los seis variantes peptídicos del glutatión que se unen a diversas GTS no se unen particularmente bien a GRd.

Ejemplo 4

Panel de referencia mejorado/combinaciones de la librería de compuestos

Se siguió el procedimiento general explicado en el ejemplo 3, pero usando un panel de referencia diferente y una librería de compuestos ampliada.

Se escogió un conjunto inicial de ocho proteínas mediante la selección preliminar de aproximadamente 100 proteínas que se esperaba generalmente que presentaran una gran reactividad cruzada frente a pequeñas moléculas orgánicas. Los ocho elementos del panel se escogieron basándose en el enriquecimiento del panel de GST usado en el ejemplo 3, tal como se describió anteriormente. Cuatro de los elementos finales del panel fueron isoenzimas de la glutatión-S-transferasa (GST): A1 humana, R8 de rata, HF2 de la mosca doméstica y S1 de esquistosoma. Los elementos restantes del panel fueron la D-aminoácido oxidasa (DAO) de riñón porcino (EC1.4.3.3); la butiril colinesterasa (BCh) del suero de caballo (EC3.1.1.8); la papaína (Pap) (EC3.4.22.2) y la fosfodiesterasa I de veneno de serpiente (PDE) de Crotalus adamantaeus (EC3.1.4.1). Se obtuvieron los perfiles de la reactividad cruzada con respecto a este panel de ocho proteínas para una muestra representativa de 122 compuestos diversos enumerados, junto con sus códigos de identificación en la figura 12.

Por conveniencia, en la determinación de las huellas, la unión de cada compuesto a cada proteína se cuantificó como la concentración necesaria para inhibir el 50% de la actividad de la proteína (CI_{50}). Los valores de CI_{50} oscilaron en más de cuatro unidades logarítmicas desde 1 mM hasta menos de 0,05 \muM.

Se eligió un subconjunto de 12 de los 122 compuestos inicialmente probados, basándose en una elevada selectividad de estos compuestos por una u otra de las proteínas en el panel de referencia. Este conjunto de ensayo inicial de 12 compuestos se ensayó para determinar la actividad inhibitoria con respecto a dos enzimas diana: la glutatión reductasa (GRd) y la aldehído deshidrogenasa (AdDH). Estas dos proteínas no están relacionadas entre sí y no están relacionadas por la homología de los aminoácidos ni por la actividad a ninguna de las proteínas de referencia en el panel. Los 12 compuestos seleccionados para el conjunto de ensayo son los primeros 12 compuestos para los que se muestran los resultados en la figura 13. Se obtuvo un sustituto en este conjunto de ensayo aplicando una regresión lineal a los datos para obtener los coeficientes en la ecuación (1) anterior. Esto dio como resultado las siguientes ecuaciones de regresión para esta iteración:

Para la glutatión reductasa: 0,11 BCh + 0,19 HF2 + 1,79;

Para la aldehído deshidrogenasa: 0,55 PDE + 1,35.

El sustituto resultante se usó para escoger (para cada molécula diana) un segundo conjunto de 10 compuestos (de los 110 restantes) que se esperaba que fuera más representativo del intervalo de potencias para las dianas. Estos 10 compuestos (marcados por barras verticales en la figura 13, y diferentes en la mayoría de los casos para cada diana) se probaron entonces directamente frente a los compuestos diana y los datos obtenidos de estas pruebas se usaron para complementar los resultados de los 12 primeros compuestos, proporcionando un conjunto de ensayo total de 22 compuestos para cada diana. La regresión lineal aplicada a este conjunto de ensayo recién definido dio las siguientes formas de ecuación (1) para las dos dianas:

Para la glutatión reductasa: 0,21 BCh + 0,72 HF2 + 0,24S1 - 0,05;

Para la aldehído deshidrogenasa: 0,58 PDE + 0,25 R8 + 0,43

Las predicciones basadas en esta segunda iteración para los 100 compuestos restantes se compararon entonces con los valores empíricos reales medidos separadamente, tal como se muestra en las figuras 14a y 14b. Cada uno de estos gráficos representa una representación de correlación de -logCI_{50} para la diana obtenida experimentalmente (en el eje X) con la -logCI_{50} pronosticada (en el eje Y).

Los parámetros estadísticos así obtenidos mostraron que se obtuvo una correlación razonable y que la correlación se mejoró en la segunda iteración. Para la glutatión reductasa, el coeficiente de regresión (R), que mide la correlación entre el experimento y la predicción, fue de 0,72 para la primera iteración y de 0,85 para la segunda. Las dispersiones (\sigma), que miden la dispersión alrededor de la línea de regresión para el conjunto de ensayo o el conjunto de predicción, fueron de 0,22 y de 0,59, respectivamente, para la iteración 1, y de 0,41 y 0,46, respectivamente, para la iteración 2. El valor de la prueba F (F) que mide la mejora de la fijación como la razón de dispersión para la fijación actual en comparación con la iteración anterior, usando datos aleatorios para la comparación inicial, fue de 4,7 para la iteración 1 y de 15,9 para la iteración 2.

Para la aldehído deshidrogenasa, R fue de 0,4 para la iteración 1, y de 0,86 para la iteración 2, una mejora considerable. Las sigmas para el conjunto de ensayo y el conjunto de predicción fueron de 0,51 y 0,6, respectivamente para la iteración 1, y de 0,50 y 0,48, respectivamente, para la iteración 2. El valor de F fue de 6,9 para la iteración 1 y de 27,4 para la iteración 2.

Las técnicas matemáticas empleadas para generar los datos anteriores se describen en Green, J.R. et al. "Statistical Treatment of Experimental Data" (Elsevier, Amsterdam, 1987) y Massart, D et al. Chemometrics (Elsevier, Nueva York, 1988).

Ejemplo 5

Correlaciones adicionales de la molécula diana

Las técnicas descritas en el ejemplo 4 se aplicaron a varias moléculas diana, además de a la aldehído deshidrogenasa y la glutatión reductasa, usando un panel de 13 proteínas que se había enriquecido adicionalmente con respecto al panel del ejemplo 4, de la misma forma que el ejemplo 4 usó un panel enriquecido con respecto al del ejemplo 3. Los sustitutos se construyeron frente a dianas adicionales: receptor de estrógeno, glicerol quinasa, esquistosoma GST, nucleósido 5'-difosfato quinasa, Factor Xa humano, tripsina y glioxalasa I. En cada caso, se usó para la fijación un conjunto diverso de 15-50 compuestos, extraído de un catálogo de base de datos de más de 1.000 compuestos. Para cada determinación, el panel incluyó al menos las enzimas siguientes: GST A1-1; glicoproteína \alpha-1 ácida; GST P1-1; albúmina sérica humana; papaína; GST de rata 12:12(\theta); GST de la mosca doméstica 3; butiril colinesterasa; GST de rata 8:8; tripsina; y alcohol deshidrogenasa. Naturalmente, la tripsina no se incluyó en el panel para el que la tripsina era la diana homóloga. En algunos casos, se sustituyó la GST de rata 8:8 por la plasmina y/o la alcohol deshidrogenasa se sustituyó por la antitripsina.

Estos sustitutos se correlacionaron con uniones determinadas experimentalmente, tal como se muestra en la figura 15. Las correlaciones generalmente mostraron un buen ajuste entre el sustituto y la diana real. En cada caso, una combinación lineal diferente de las proteínas de referencia demostró ser la mejor fijación. En todos los casos, no hay homología de secuencia entre la molécula diana y las proteínas de fijación.

Claims (6)

1. Un método para identificar una sustancia candidata como reactiva con una diana deseada, cuyo método comprende:

(a) proporcionar una fórmula que se deriva de una combinación de los perfiles de reactividad de al menos dos elementos de un panel de referencia con un conjunto de compuestos, cuya fórmula calcula un perfil pronosticado que se ajusta mejor al perfil de reactividad de la diana con respecto a dicho conjunto de compuestos;

(b) probar la reactividad de dichos al menos dos elementos del panel con respecto a dicha sustancia candidata;

(c) calcular una reactividad estimada con respecto a la diana para dicha sustancia candidata mediante la aplicación de dicha fórmula a las reactividades determinadas en la etapa (b) para estimar la reactividad de dicha sustancia candidata con respecto a la diana; y

(d) basándose en los resultados de (c), identificar dicha sustancia candidata como reactiva con la diana.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la sustancia candidata identificada en la etapa (d) es una molécula orgánica pequeña.

3. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicho panel de referencia comprende proteínas, y en el que al menos uno de los elementos del panel es una proteína distinta de una inmunoglobulina (Ig) o de un fragmento de la misma; y

en el que dicho panel proporciona elementos que se unen en una multiplicidad de grados diferentes con respecto a una población de compuestos; y

en el que la presencia de dicha proteína no-Ig enriquece el panel.

4. El método de la reivindicación 3, en el que dicho panel comprende al menos 2 enzimas, o al menos 2 lectinas, o al menos 2 receptores de células T, o al menos 2 receptores olfativos, y/o en el que dicho panel comprende al menos el 10% de proteínas no-Ig.

5. El método de la reivindicación 3, en el que

(a) dicho panel cubre el 90% del espacio químico; y/o

(b) dicho panel proporciona al menos 5 componentes principales con respecto a la gama de compuestos comercializados como pequeñas moléculas orgánicas; y/o

(c) para dicho panel, la media de las diferencias entre un perfil para cualquier primer compuesto respecto del de cualquier segundo compuesto es al menos tres veces las diferencias observadas para las determinaciones repetidas del perfil de dicho primer compuesto.

6. El método de la reivindicación 5, en el que dicho panel de referencia se construye mediante un método que comprende:

identificar arbitrariamente un conjunto inicial de elementos potenciales del panel;

obtener perfiles de reactividad para un conjunto inicial de compuestos de ensayo potenciales escogidos arbitrariamente con respecto a dicho conjunto inicial de elementos potenciales del panel;

comparar los perfiles obtenidos;

descartar los compuestos de ensayo potenciales y los elementos potenciales del panel que den como resultado perfiles redundantes;

sustituir los elementos potenciales del panel y los compuestos de ensayo potenciales, descartados, por elementos potenciales del panel y compuestos de ensayo potenciales adicionales, para obtener un segundo conjunto de elementos potenciales del panel y un segundo conjunto de compuestos de ensayo potenciales;

obtener perfiles para el segundo conjunto de compuestos de ensayo potenciales con respecto a dicho segundo conjunto de elementos potenciales del panel;

comparar de nuevo los perfiles obtenidos y descartar los compuestos de ensayo potenciales y los elementos potenciales del panel que den como resultado perfiles redundantes; y

repetir las etapas anteriores hasta que

(a) se obtenga un panel que cubra al menos el 90% del espacio químico; y/o

(b) se obtenga un panel que proporcione al menos 5 componentes principales con respecto a la gama de compuestos comercializados como pequeñas moléculas orgánicas; y/o

(c) se obtenga un panel, en el que la media de las diferencias entre un perfil para cualquier primer compuesto respecto del de cualquier segundo compuesto sea al menos tres veces las diferencias observadas respecto de las determinaciones repetidas del perfil de dicho primer compuesto.