JPH03504638A - 免疫診断薬を製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的には免疫学的分析法の使用に関する。特に。

本発明は、免疫学的分析が通常行われない物質の検出および定量に、このような 方法を使用することに関する。例えば。

水中、土壌中、および空気中に存在する極微量の汚染物質は。

通常、高速液体クロマトグラフィーにより検出されるが１本発明の方法で製造さ れる物質により簡便に検出され得る。

背景技術 医学および獣医学の分野で広範囲の生物学的化合物を検出するために免疫学的分 析法を利用することは非常に普及しており１分析を行うための方法およびその変 法がよく知られている。実際、最近では、構成を再設計することにより分析法の 簡便さを向上させることに多くの努力が払われている。例えば２粒子凝集法を記 載した。米国特許第４．４２７．７８１号を参照されたい。この方法は、所望の 低分子量のハブテンに対する抗体が、これらのハブテンが付着している粒子を凝 集させる能力に依存する。米国特許第４．４４７．５２６号には、別の変法、が 開示されており９分析されるべきハブテンが試薬へ特異的に結合する場合に、ラ ベルの性質が変化するという利点を有する分析法が記載されている。これらの開 示内容は９分析の簡便さまたは感度を高めるための特異的分析法を記載した何間 ものうちの２つにしかすぎない。これらの分析法は抗体分子（または抗体のフラ グメント）と検出されるべき分析物との間における特異的な相互作用に依存して いる。

この特異的な相互作用に依存しているために、いかなる特定の分析物に免疫に基 づく分析法を適応できるかは、要求される特異的な相互作用に対して適切な抗体 が得られる可能性に依存する。注意すべき２つの局面がある。第１に、抗体およ びそのフラグメントが１分析物と９分析される試料中の不純物であり得る他の物 質とを区別する能力が適切でなければならない。すなわち、特異性が高くなくて はならない。第２に、抗体またはそのフラグメントが分析物に強く結合する能力 も重要である。すなわち、親和性が分析法の感度を決定する。例えば＊　Ｄａｖ ｉｄの米国特許第４．３７６、１１０号には、モノクローナル抗体を使用して、 所望の相互作用の親和性を向上させることが開示されている。

検出のための候補である分析物は多数存在し、それに対して特異的に強く結合で きる抗体を標準的なインビボ法で産生させることは困難である。よく知られてい るように、特定の物質に対する抗体を得る通常の方法は、この物質をラットまた はマウスのような適切な分析物に投与すること、および適切な抗体を分泌し得る Ｂ細胞を生産する分析物の免疫系に依存することを含む。力価が充分に高ければ 、ポリクローナル抗血清が分析に直接使用されるために得られ、結果が充分に満 足なものであるか、あるいは膵臓のようなり細胞源が所望の抗体を分泌し得るハ イブリドーマを得るために融合パートナ−を提供するために使用されるかのいず れかである。これらのハイブリドーマは所望の分析物に特異的な抗体を生産する ためにスクリーニングされ得る。物質が免疫原性であるのに充分に大きく、抗体 を産生ずる前に動物を殺さなくてよいように充分に毒性がなく、この方法を実施 するのに充分な量が得られるように充分に費用がかからなければ、これらの方法 は良好に行える。このことは、常にそうであるとは限らない。

大きさが不充分であるという問題は１分析物またはそれらを修飾した形態のもの を担体と複合化させることにより、しばしば解決され得る。担体は、小さすぎる ので免疫系に無視されるものに、免疫原性を与えるために必要な大きさを与える 。現在では、このより便利な方法を使用することにより。

この範喝に属するある種の特異的分子に対する抗体を産生ずることが可能である 。例えば、米国特許第４．４５６．６９１号では。

ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ　）を化学的に修飾し、それを担体に複合化させる ことにより、　ＰＣＢと反応する抗体を調製する方法を開示している。除草剤の アトラジンについて類似した方法が米国特許第４．５３０．７８６号に記載され ている。しかし。

このような方法は繁雑であり、各分析物に対して再設計されなければならない。

また、複合体により産生される抗体は。

実際に９分析物に作用しないかもしれず、むしろ分析物と担体との接合部分に作 用するかもしれないので、成功するとは限らない。この方法により、「中和」抗 体（すなわち９分析物自体と反応する抗体）を得ることは、著しく困難である。

もちろん、毒性の問題が充分に重大で、方法全体を失敗に終らせるかどうかも、 偶然の問題である。必要とされる抗原量の利用度に関して、このパラメーターを 最小にするための必要生は、特定の抗原に依存する。

治療の分野においても、類似の問題が発生する。まだ開発段階ではあるが、治療 および／または診断のために９分析物自身の腫瘍と免疫特異的な、標識または毒 素と複合体を形成した。あるいは形成していないモノクローナル抗体を投与する 治療法が、ある程度は良好な結果を与えてきた。この分野で有用なモノクローナ ル抗体を得るためのある方法は、腫瘍組織を取り出し、この組織を免疫原として 使用し、そしてＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法と、適切なスクリー ニング法とを用いて、誘導されたモノクローナル抗体を調製して選び出す方法で ある。明らかに、これは繁雑な方法である。というのは。

モノクローナル抗体パネルを構築するのに充分な免疫処置を実施するには、数カ 月が必要であるからである。その時までに、被検体の病状が救済できないぐらい に悪化し得るし、または腫瘍の抗原性のプロフィールが実質的に変化し得る。適 切な抗体が、既存の大きいパネルから選択し得るならば、これらの困難を克服し 得る。腫瘍を治療するのに適切なパネルは、すでに存在する（Ｏｌｄｈａｍ、　 Ｒ，に、、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅ５ｐ　Ｍｏｄ（１９８７）術を使用して調製さ れ得る。適切な相手を得るためにこのパネルをスクリーニングする方法は、治療 のための正しい抗体を選択するのに有用である。

この後者の応用は９次のような事実を表している。つまり。

当該技術分野では、すべての可能な抗原に対して有効であり。

かつ繰り返すことができる一般的な手法を使用して、任意の抗原に関して所望の 親和性および特異性を有する抗体を得るための一般的な方法が、提供されないと いうことである。

しかし、逆の問題、すなわち所定の抗体に対するミモ）　−プを見い出すことが 、　Ｇｅｙｓｅｎ、　Ｈ，Ｍ、、　　ＰＣＴ出願１１１０８６１００９９１　（ １９８６年２月１３日付で公開）により提出されている。以下で使用される「ミ モトープ」という用語は、　Ｇｅｙｓｅｎの出願におけるこの用語の使用法にほ ぼ対応している。

発明の開示 本発明は、任意の所望分析物（以前は免疫分析を実施し得なかった分析物を含む ）に対する免疫学的試薬を製造して。

所望の標的を反応させるために既存のセットから適切な抗体を選択する方法を提 供する。本発明の方法の様々な局面はす（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｓｏ ｍａｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　）を利用すると 、より便利であり得る。

本発明はまた。様々な特異性を有する抗体のパネルに対する反応性の特異的なパ ターンを利用することにより、特定の分析物のプロフィールを表す方法を提供す る。本発明は、ミモトープの多様なセットと９分析物との間の競合を使用した競 合結合分析により、このようなプロフィールを確立する新規な方法を提供する。

それにより９本発明は、所望の分析物に対するミモトープを得るための新規な方 法を提供する。これらのミモトープは９分析物と免疫反応する抗体の増大した特 異性および親和性を得る際に有用であり、そして競合分析用の試薬としても有用 である。本発明はまた。リバースイメージモノクローナル抗体パネル（ｒｅｖｅ ｒｓｅ　ｉｍａｇｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐａｎｅｌ）に 対する標的をスクリーニングすることにより、所望の標的に対して高い特異性を 有する抗体を選択する方法を提供する。

このように、ある局面では９本発明は、所望の分析物と反応する抗体を得る方法 に関する。この方法は、無秩序に発生し、永久増殖化された抗体産生細胞のパネ ルを９分析物と競合する代表的なミモトーブの混合物と反応させること：および 、この分析物が充分に競合するような抗体を産生ずる細胞を取り出すことを包含 する。ミモトーブパネルは、無秩序（ｒａｎｄｏｍ）から最大多様性（ｍａｘｉ ｒｎａｌｌｙ　ｄｉｖｅｒｓｅ）に変化し得る：ミモトープの最大多様性パネル は、わずかなメンバーしか必要とせず、それゆえ有利である。適切な抗体または 抗体のセットが同定されているだけでなく、そのような抗体の連続した供給源が 提供されることは、直ちに理解される。このようにして得られた抗体は、この時 点で、所望の試薬を供給するのに充分に特異的であり、かつ充分に強く結合して いる。このことは、高濃度の既知成分を定常的にモニターすることが意図された 応用であるような分野では、特に正しい。しかしそうではない場合には１本発明 はこれらの性質を最適にする別の方法を提供する。

第２の局面では１本発明は、所望の分析物に対するミモトープを得る方法を提供 する。この方法は、上記の手法を実施すること：および選択された細胞によって 分泌される抗体の反応性について、ミモトーブ（一般的には、最初の混合物に含 まれていたミモトープ）のパネルをスクリーニングすること包含する。選択され た抗体と反応するミモトープは、このように、ある種の免疫グロブリンと結合す ることに関しては。

分析物と同様に挙動するが、毒性またはＴ細胞認識に関しては、必らずしもそう ではない。それゆえに９分析物と反応するポリクローナル抗血清は、ミモトープ を代用の免疫原として投与することにより得ることができる。

この可能性から本発明の第３の局面が導かれる。すなわち。

最初に得られた抗体の親和性および特異性を向上させる方法である。ミモトーブ は分析物に対する代用免疫原を与えるので、ミモトープは、ラット、マウスまた はヒツジのような動物を免疫し、そして、従来の永久増殖化法およびスクリーニ ング法を用いて、所望の特異性を有する抗体を得るために使用され得る。後者の インビボ法は、得られたＢ細胞のレパートリ−を永久増殖化してスクリーニング する方法に関しては従来のものであるが、ミモトープを使用するという点でユニ ークである。ミモトーブが分析物の代用となる能力は、化学的構造よりむしろ、 相同性の機能試験により定義される。これらのミモトープは９分析物を免疫し、 得られたパネルをスクリーニングするのに使用される。分析物自体は、これらの 方法のいずれにも使用される必要はない。

本発明はまた。上記の方法を実施するのに有用なキットにも関する。

簡単に言えば１本発明の一部をなす様々な方法は、スクリーニング法に単一のミ モトープまたは単一の抗体を使用することとして説明してきた。しかし、複数の 成功する候補を表わすパネルのサブセットを利用することも１本発明に含まれ。

ある種の抗体あるいはある種のミモトープを使用する方法の改良となる。この変 法では、永久増殖化された抗体産生細胞の最初のグループから、単一の抗体を産 生ずるものを選択する代わりに９例えば、約ｌＯまたは１５個のこのような細胞 のサブセットを使用する。このセットから産生される抗体は１次いで、ミモトー プのパネルをスクリーニングするための混合物として使用され、そして再び、単 一の最も反応性を有するミモトープを選択する代わりに９例えば、１０または１ ５個のミモトープのサブセットが選択される。この混合物は９次いで。

免疫処置法に使用され、免疫された生物は好ましいミモトープのグループに共通 する特徴に応答するＢ細胞を特異的に増化させることによって得られたモノクロ ーナルパネルは、ミモトープのサブセットプールと抗原との間で競合を起こさせ る二とにより再びスクリーニングされ得、そして最も成功したものが選択される 。

分析物と非常に特異的にかつ強く結合する単一の抗体を提供することに加え、ス クリーニングは、さらにサブセットを提供する。分析物に関するサブセットの反 応性パターンは保存され、特定の目的分析物の存在を、不完全に交叉反応する同 種のものと区別されるように特徴付けるのに利用され得る。

この概念のある応用においては１例えば、２５〜７５個の抗体の扱いやすいパネ ルが使用され得る。このようなパネルのプロフィールは、従来の免疫分析法によ り形成され、あるいは標識も修飾されていない分析物と、標識されたミモトープ 混合物との競合分析により有利に形成され得る。パネルは分析物の同定に使用さ れるか、あるいは特定の分析物との反応性により形成されたパターンの大きさを 分析物の濃度の関数としてモニターするために繰り返し使用され得る。

このように９本発明の他の局面は、１つまたはいくつかの無秩序パネルから選択 された限られた抗体パネルに関する特異的な分析物の反応性パターンを利用する ことに関する。この局面では１本発明は、所望の分析物に対して様々な反応性を 有する抗体のパネルに関する。また、必要に応じて２本発明は標識されたミモト ープ混合物に関する。このミモトープ混合物は、それと競合する分析物と、パネ ル上の各抗体との様々な反応性レベルを確認するのに有用である。所望のプロフ ィールを形成することを容易にするために、固体支持体上のパネルを提供する新 規な方法もまた本発明に含まれる。

本発明のさらに他の局面では、モノクローナル抗体の相補的なセットを形成する ために、ミモトープの最大多様性セットが利用される。このモノクローナル抗体 の相補的なセットは、ミモトープのインバースイメージを構成する。これら２つ の参照セット（一方はミモトープのセットであり、他方は抗体のセットである） の間の厳密な相補性は、指標化システムを提供する点で、さらに有用である。こ の指標化システムにより、交叉反応を起こす可能性がある抗体の大きなコレクシ ョンに対して、少量の分析物が間接的に試験される。このような予備選択法が低 コストであり、かつ敏速に行えることは１例えば患者に特異的な腫瘍抗原に対す る抗体を探索するのに、しばしば有益である。本発明はまた。ミモトープの最大 多様化セットを特定する方法に関し、そしてこのように特定されたセットに関す る。

図面の簡単な説明 第１図は本発明の方法による固形支持体に結合した抗体のパネルを示す。

第２図は３個の異なる抗原に関する３３５個のメンバーからなる基礎抗体パネル の結合係数のパターンを示す。

第３図は疎水性指数（ｈｉ）および疎水性モーメン）　（ｈａ）に関して変化す るように設計された多様性ミモトープのりストを示す。

第４図は第３図のペプチドにおけるｈｉおよびｈｍの範囲を示す。

第５図は分析物のプロフィールの展開を示す。

第６図は２個のミモトープ間の競合分析を示す。

第７図は２４個の多様性ナノペプチドアミ下からなるセットのアミノ酸配列を示 す。

第８図は第７図に示すセットの１６個のメンバーが任意の抗体と結合することを 試験した分析結果を示す。

ここで使用されているように、「ミモトープＪ　（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）は、所望 の抗原あるいは分析物と免疫特異的に結合する抗体の抗原結合領域に対して相補 性を有する分子の部分を意味する。すなわち、一般的には９分析物のエピトープ に対応する領域を意味するミモトーブは、一般的には、エピトープが示す空間的 構造および電荷構造と正確に同じものを有さない。

しかし、ミモトープがまた。それを有する分子を所望の抗原結合抗体に特異的に 結合させるのであれば、この定義が満足されるミモトープは短いペプチド配列で あるのが便利である。

というのは、非常に様々なペプチドが容易に合成され得るからである。しかし、 このことは理論的根拠に必要ではない。

例えば、糖質または界面活性剤もまた。この定義を満足するように挙動する。こ のようなミモトープの無秩序パネル（ｒａｎｄｏｍｐａｎｅｌ）および多様性パ ネル（ｄｉｖｅｒｓｅ　ｐａｎｅｌ）のいずれもを得ない手段が、これらの分子 に関連する現在の利用可能な合成技術に含まれることは容易に理解される。もち ろん、これらの化学的タイプの各ミモトープは構築され得る。

典型的には、抗体との反応性を有するエピトープは、大きな分子の内部に存在す る。例えば、ペプチドの場合、この分子の部分はペプチド鎖の伸長部分であり得 るか、あるいは同時にペプチドはある種の他の物質と複合体を形成し得る。場合 によっては９分子の付加的な部分が特定の機能を果すこともある。ミモトープが 免疫原として使用されるべき場合には。

付加的な大きさが必要とされる。というのは、たいていのミモトープ領域は３〜 ６個のアミノ酸からなる比較的短いアミノ酸配列によって表現されるからである 。他方、ミモトープは標識可能な物質と複合体を形成し得る。標識は、蛍光体と 複合体を形成する場合または放射標識された物質を隔離（ｓｅ−ｑｕｅｓｔｅｒ 　ｉｎｇ）する場合のように直接的であり得るし、また。

例えば、アビジンが標識を有するビオチン／アビジン結合のビオチンと複合体を 形成する場合のように、標識された物質を引き続いて特異的結合により付着させ 得る。いずれにしても、ミモトープ自体は、しばしば付加的な分子構造の内部に 見い出される。ミモトープという用語は抗体結合の原因となる領域に関連するも のとして定義されるが、この用語は、しばしば複合体を記述するために互換的に 使用される。ある特定の場合に、複合体全体について言及されているのか、ある いは結合特異的領域について言及されているかは文脈より明らかである。

「抗体フラグメント」は、抗体全体の特異的結合性を保持している抗体のフラグ メントを意味する。当該技術分野では。

例えばＰ（ａｂ’）２．　Ｆａｂ　、およびＦａｂ’のような特定のフラグメン トがよく知られている。これらのフラグメントは様々なプロテアーゼの消化によ り得られる。もちろん１組換えにより調製される場合には、抗原認識特性を保持 している任意のフラグメントを同様にして得ることができる。これらのフラグメ ントは、抗体全体はど免疫原性が高くないので、しばしばインビボで有用である 。抗体に代えてフラグメントを使用し。

同様に特異的結合させる際に、いくつかの利点があるようである。特に断わらな い限り、インビボあるいはインビトロでの分析において、抗体について言及され ている場合には、免疫特異的フラグメントもまた使用され得ることを理解すべき である。

「無秩序に刺激された抗体産生細胞」は９例えば培地に細菌性リポ多糖類（ＬＰ Ｓ　）を加えることによって非特異的に刺激され、永久増殖化された抗体分泌細 胞を意味する。このようにして得られた個々の哺乳類の一般的なり細胞集団の標 本抽出には、中程度の親和性ではあるが、可能性のあるいかなる抗原とも特異的 に反応できる抗体を生産する細胞が含まれることが知られている。

［無秩序な構造を有するミモトープ」は、様々な空間的構造および電荷構造を有 する表面領域を含むミモトープを意味する。以下に述べるように、このような任 意の混合物は、アミノ酸配列からなるペプチドを調製することにより得られる。

個々の位置にあるアミノ酸が数の候補の中から任意に選ばれるようなしかし、潜 在的なエピトープに対応する種々様々な表面領域を有する分子のあらゆる混合物 が含まれる。

「最大の多様性を有するミモトープ」は様々な特性が最大の多様性を示す代表的 な性質を有するパネルを形成するように慎重に操作されるミモトープのセットを 意味する多様性パネルを構築する際に考慮される適切な性質は次のものを含むが 、必らずしもこれらに限定されない：等電点（ｐｉ）　、疎水性指数（ｈｉ）　 、疎水性モーメン）　（ｈｍ）　、双極子モーメント（ｄａ）および「平滑度」 。ミモトープパネルのメンバー間で。

これらの性質を多様化させることにより、ペプチドを無秩序に選択して同等の多 様性が得られるパネルに比べて、パネル中のミモトーブ数を劇的に減少させるこ とができる。

与えられたパラメーターのセットに関して「最大の多様性を有する」ペプチドの 混合物は各パラメーターの全範囲にわたってメンバーが広がっている混合物を意 味し、この混合物のメンバーはその範囲内に均一に位置する。様々なパラメータ ーの尺度の適切な規格化は、多様性をもたらす方法を容易にする。例えば、疎水 性指数に関してメンバーが最大の多様性を示すペプチドの混合物は、疎水性指数 の全範囲内に見い出される混合物であり、この混合物中の２個のメンバーが他の 選択された任意の対よりも疎水性指数が互いにかなり接近していることはない。

完全な最大の多様性を得ることは困難であるで、この用語は特定のパラメーター について最も大きな多様性が得られる混合物に適用される。このように、疎水性 指数（ｈｉ）およびｐ＋に関して最大の多様性を有する混合物においては、類似 ｐ＋を有するすべてのペプチドは疎水性指数に関して変化し、類似したｈｌを有 するすべてのペプチドはｐｌに関して変化する。

「インバースイメージパネルまたはリバースイメージパネルあるいはその組合せ 」は、抗原／抗体間の相互作用のうちエピトープ／バラトープ間の相互作用の電 荷／空間的な相補性を意味する。このように、各メンバーがミモトープパネルの 他のメンバーに比べてミモトープパネルの単一メンバーに対して高い特異性を有 するようなモノクローナル抗体のパネルは、対応するミモトープパネルのリバー スイメージを有するパネルとなる。このようなリバースイメージは１例えば５０ 個のメンバーからなるパネルの各ミモトープに対して、特定のミモトープに対す る高い親和性を有しているが、残りの４９個のいずれのミモトープともほとんど 結合しないような抗体が見い出され得ると考えられる。このようなパネルは最大 の多様性を有するミモトーブのセットに対して最も簡便に調製される。

上で述べたように、インバースイメージパネルは１例えば競合分析に使用して分 析物または抗体のいずれかを特徴付は得る。好ましくは、インバースイメージパ ネルのメンノく−は。

実用的なセットを構成するように充分に少数ではあるが、意味するパターンを与 えるのに充分に多数であるべきである。

それゆえ、このようなパネルは、典型的には、１０〜１００個のメンバーを含み 、好ましくは約４０〜５０個のメンノく−を含む。

モノクローナル抗体インバースイメージパネルに対する分析物の反応性あるいは ミモトープパネルに対する抗体の反応性は、以下で述べるように、様々な方法を 使用して評価され得る。

（以下余白） Ｂ、一般説明 本発明は、免疫検定法に用いる所望の分析材料を得る方法と、得られた材料に関 する。その方法のいくつかの局面には。

多数のランダムに生成した抗体産生細胞および多数の潜在的ミモトープの使用が 含まれる。

本発明の方法が進行するにつれて、特定のパネルもしくはサブセット内の抗体と ミモトープの数が著しく減少する。得られた１分析に使用する材料は、高度に特 異的で１強い結合性のミモトープと抗体とを含有し、あるいは、この材料は。

さらに分析物に対して特徴的な反応パターンを示す、これら材料のパネルであり 得る。得られた抗体のパネルは、目的とする分析法に対して、ますます特徴的か つ特異的になる。

要約すれば、この方法は、特定の選択された分析物に対応する物質を産生ずる出 発点の働きをする。永久増殖化モノクローナル抗体産生細胞のパネルの生成によ って開始される。

反復してスクリーニングするために、このパネルは例えば１０．０００程度の処 理し易い数に制限することが好ましい。潜在的分析物の数は数百刃であるから、 特異性が犠牲になるとしても。

最初のパネルは適切な範囲をもっているであろう。経験によれば、パネルの数が ９例えば３００〜５００のように非常に少なくても、初期のプロフィールに対す る特異性をそれほど大きく犠牲にしない。広い特異性は、ランダムに刺激された Ｂ細胞の固有の性質である。これらのクローンは主として１ｇＭ免疫グロブリン を産生ずる。組換えにより産生された免疫グロブリンのセットも使用することが できる。

所望の分析物のレパートリ−に適確に適合させるのに必要な、可能性のあるバラ トープを何百万も産生じてスクリーニングすることが容易に実施できれば、上記 のことは直接に行うことができる。しかしこれは実際的ではない。したがって。

本発明のシステムは、スクリーニング法を実際的な選択範囲に集中させる方法を 提供する。

本発明を最も簡単な形態で実施する場合では、必要な特異性に最も近い基礎パネ ル抗体が、ランダムに生成したセットからミモトープを選択するのに利用され、 そのセットは、やはり妥当な数のメンバーを含有していなければならないので。

何百万もの利用しつる分析物の構造の各々に完全に忠実であることはできない。

それ故に、広い範囲を持った候補ミモトープのパネルが用いられ、最適な選択物 が選ばれる。この“ブートストラップ”段階をすぎてから９本発明の方法は、そ の抗体／ミモトーブ結合反応における第１のパートナ−を。

次いで他方のパートナ−を体系的に最適化することを包含する。最適化の基準は ２分析物を検出する性能によって機能的に定義される。

初期のミモトープが選択されたならば、抗原に応答して通常活性化される。動物 の免疫系の体細胞の多様化プロセスを刺激する際に、ミモトープが分析物に代わ り得る。この免疫化に応答して産生されるモノクローナル抗体のパネルは９次に ミモトープもしくはミモトープの混合物と競合する分析物を用いるか、または分 析物を直接用いてスクリーニングして。

最適な候補を選択することができる。その抗体は、主としてＩｇＧ形であるが、 その基礎レバー）　ＩＪ−前駆体より多様であることは知られている。充分に試 験された場合、いくつかは免疫原に対して高い親和性を示し、いくつかは免疫原 に対して低い親和性を示す。ミモトープが有効な代替抗原である範囲では、多様 化されたクローンは９分析物自体に対して高い親和性を有するメンバーを含む。

あるいは、抗体クローンは。

免疫グロブリンをコードするＤＮＡの部位特異的変異導入法により、インビトロ でランダム化することができる。

この改良法が不充分な場合は、改良抗体がミモトーブパネルをスクリーニングす るのに使用可能であり、その結果、恐らく先に利用したミモトープと異なるミモ トープが選択され。

それは分析物に最も密接にマツチするものである。この第２の選択されたミモト ープは、インビボで発生するＢ細胞が分泌する。スクリーニングされるべきモノ クローナルの第２パネルを得るために第２免疫化を行うのに利用できる。この方 法はさらに繰返すことができる。

この方法のさらに簡潔で有効な形態では、各段階で選択された単一のミモトープ または抗体が１分析物に対して機能的に相同な共通の特徴を有するサブセットに 置き換えられる。

これは好ましいことである。なぜならば、特定の分析物は。

その全表面の構造を再生するために重なっている多数のエピトープを持ち得、そ のコレクションは、コレクションの個々の部分より有用に全表面を模倣すること ができるからである。

逆にいえば、ミモトープは１表面の一部だけが分析物に相同な、広い表面を持っ ていてもよい。多数のミモトープおよび／または抗体を用いることによって、共 通の特徴が強調される。さらに、抗体のサブセットは、関連する分析物によって 生成するものとは異なる。単一分析物との相互作用の、特徴的で再現性のあるパ ターンを提供するので、特異性は１個々の抗体自体の反応性によるきいうよりも むしろ前記パターン自体によって与えることができる。

したがって、この改変された方法では、少数の９例えば１゜もしくは１５の元の 抗体パネルが、ミモトーブのパネルをスクリーニングするのに使用される。この ミモトープパネルによってさらに別のサブセット、例えば１ｏもしくは１５のミ モトープのサブセットが得られ、これは免疫化に使用できる。このように、免疫 化された動物の免疫系は、共通の形態（ｆｅａｔｕｒｅｓ）に最も強く曝され、 免疫化された動物から得られたモノクローナルのパネルは、これらの共通の形態 の方向に充分にそれる（（１’ｈｕａ、　Ｍ、Ｍ、、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ（１ ９ｇ？）、　１３８：　、　１２８１−１２８８　）。

さらに、免疫化された動物から得たパネルは、この場合または単一のミモトープ だけが使用される場合を問わず、パネル全体にわたる結合特異性のパターンを用 いて、特定分析物を認識するパネルの結合配列によって、有用なサブセットパネ ルを提供する。

本発明の方法に包含される各段階について、以下に詳細に説明する。

（以下余白） Ｃ０出発物質の製造 抗体産生細胞のランダムパネルはいくつもの方法で作製することができる。マイ トジェンで活性化されたＢ細胞が、可能性のある抗原と潜在的に結合できる抗体 のランダムセットを産生ずるということは、はとんど１０年前から知られていた 。

しかし、これらの刺激された細胞から分泌される免疫グロブリンの大部分は、　 ＩｇＭであり、親和性と特異性が比較的低い。

前記の処理しやすいレパートリ−では、抗原に対する防御が必要であり得るため に、交差反応性が要求されるような何間万もの抗原のいずれに対してもあるレベ ルで結合するのに充分なようである。

リボ多糖類化ＰＳ）のようなマイトジェンを用いて、細胞融合もしくはウィルス 感染によって予め刺激された多数のＢ細胞を永久増殖化させると、広範な種類の 多数の抗体のほぼ永久的な起源になる。ＬＰＳで刺激するとＢ細胞は一部分が分 化を起こして良好な融合の参加体になる。抗体の産生を刺激し。

かような融合を実施する方法は１例えば、　Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ　Ｊ、ら。

され、これらのハイブリドーマを抗原特異性について選別することが、　Ｐａｒ ｋｓ、口、Ｒ０らＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９７９ 年）１９６２−１９６６頁、に報告されている。免疫原としてインビトロで用い られている抗原に特異的な免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマの製造につ いても報告されている（Ｌｕｂｅｎ、　Ｒ。

数をより処理しやすい数にするために、大きなランダムパネルを一般的に使用す る改変では、最高の候補に対するパネルを狭くする予備選別が行われる。例えば 、　Ｃａ５ａｌｉ、　Ｐ、ら。

と結合できるヒトリンパ球を分離するのに、蛍光で活性化された細胞のソータを 使用することが記載されている。その時。

個々の細胞は９回収することができ、エプスタイン・バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂ ａｒ）ウィルスで形質転換され、微細培地で増殖される。このような予備選択は 、所望の分析物に有効に標識を付けることができる場合１本発明の範囲内に含め ることができる。このような標識付け９例えば分析物をフルオレセインに直接接 合させることによって、またはフルオレセインで標識を付けたビオチンと結合し ているアビジンのようなリンカ一部分に接合することによって行えるならば、　 Ｃａ５ａｌｉが報告した方法（本願に援用する）が、ミモトープパネルの次のス クリーニングを行う為の、制限されたメンバー、例えば１０〜５０のメンバーの モノクローナルのパネルを得るのに使用できる。

選択された細胞の永久増殖化は、エプスタイン・バーウィルスを使用１−る場合 は必すしも必要では１工いＤｌ、標準の載台技術、またはＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｉｅｓ　ａｎｄ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃｏ ｒｐｏｒａｔｅｄ（カリフォルニア州、サン・ディエゴ）が市販しているような 、現在入手可能な有効な電気融合技術を使う場合は必要である。

ごく最近に１組換え技術を用いて免疫グロブリンを産生ずることが可能になった 。゛それ故に、抗体産生細胞のランダムパネルを得る他の方法は、免疫グロブリ ンをコードする°ＤＮＡをランダムに変異させ、その変異体混合物を、コードさ れた変異免疫グロブリンを発現可能な細胞にトランスフェクトする方法を包含す る。免疫グロブリンのタンパクを、イー・コ！ｊ　　（Ｅ、Ｃｏ１１）内および 酵母内で発現させるのに成功した。酵母は、生産されたタンパクを免疫学的に活 性な形に加工する。

例えば、酵母内での免疫グロブリンの合成と、インビボでの組立ては、　ｌ１ｏ ｏｄ、　Ｃ，Ｒ，ら、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８０年）３１４巻、　４４６−４ ４８頁、に報告されている。抗原と結合可能な“本来の″および“二量体”の抗 体断片のイー・コリ内での合成も報告されている（Ｓｋｅｒｒａ、＾、、　Ｓｃ ’１ｅｎｃｅ、　（１９８８年）２４０巻、　１０３８−１０４１頁；　Ｂｕｔ ｌｅｒ、　Ｍ、ら、上記文ｇ１０４１−１０４３頁）。

上記の方法のいずれかによって、永久増殖化されたＢ細胞。

用いる場合、約１０．０００のメンバーのパネルが必要であり得る。

少なくとも５０．０００のメンバーのパネルは、より良好な代表的な面（ｃｒｏ ｓｓ−ｓｅｃｔ　１ｏｎ）を提供する。しかし最近の実験結果は。

少ない数でもいくつかの目的に対しては満足し得る状態であることを示している 。

このような実験の結果を第２図に示す。第２図Ａは、実施例１に記載したように して生成し、短いペプチドのカシニン（ｋａｓｓｉｎｉｎ）に対して定量的にス クリーニングして“結合係数”（すなわちその結合はバックグランドに対して補 正して観察された）を測定した。３３５のモノクローナル抗体の結合定数を示す 。（スクリーニングは市販されているＢ１０−Ｒａｄ　ドツト・プロット法の変 形法で行った。第２図Ａに示すように、３３５のＭａｂのうちわずかに１つだけ が３５００〜４０００の結合係数を有し、２つの別のＭａｂが約１５００の結合 係数を有し、また約１０００の結合係数を有する抗体もいくつかあるが、大部分 は、この非常に単純な抗原に対する結合性が非常に低い。

第２図Ｂは、より複雑な抗原すなわち単純なフィラメント状のファージＦ１に対 して試験した同じ結果を示す。この例では、多数回ランダムに反復された少数の エピトープによって。

はとんどすべてのパネルは、　ＩｇＭの多価性によって多分結合が増大する場合 に、抗原に対してかなりの結合性を有する。

第２図Ｃは、高度に複雑な抗原であるキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ ＫＬＨ）に対して同様なアッセイを行った場合の結果を示す。この場合、さらに 多くのエピトープが存在し、その結果、抗原に対してかなりの親和性をもった多 数の抗体が存在する。

第２図Ａ、第２図Ｂおよび第２図Ｃに示す結果は、第２図りに要約され、第２図 りには、これらの３物質のネズミに対する基礎レパートリ−の結合係数の分布を プロットしている。

図に示すように、カシニンに対して高い結合性を有するモノクローナルの割合は 非常に小さい。それにもかかわらず、たった３３５　Ｍａｂのパネルの中には、 かなりの親和性を示す少なくとも少数の抗体が見出されている。

これらの結果には、いくつもの重要な結果が含まれている。

第１に、抗原が、正しい複雑性を有し、第２図への場合のように９、パネル内の 少数の抗体に確実に分離する場合、基礎パネルは過度に大きい必要はない。第２ に、高結合性Ｍａｂ自体のサブセットパネルが、有用な分析器具になる。このパ ネルに対するカシニンの′フィンガープリント”は１．第２図Ａに示すパターン 由来のものであるが、試験試料中のカシニンの濃度をモニターするのに有効に使 用できる。カシニンの濃度の増減は、２もしくは３の高い結合性の抗体への結合 の内部的にばらつきの少ない測定値によって示すことができる。

モノクローナル抗体の基礎パネルをどのようにして作製しても、これらの培養物 は、マイクロタイタープレート内か。

または分析物もしくはミモトーブと結合する性能について上清を容易に分析でき る他の通常の基質上で、増殖させることができる。本発明のひとつの態様はキッ トに関し、このキットは９本発明の方法においてスクリーニングするための適切 な基質上に支持された抗体産生細胞のこのパネルまたはこのあとで製造されたパ ネルで構成されている。適切な形態のキットは、マイクロタイタープレート；ニ トロセルロース；シートとして利用できる。活性化された形態のナイロンなどの ポリマー；およびフィルター紙の中に固化させたアガロース誘導体を含む。

初期のランダムパネルは、目的に対する特異性と親和性とを犠牲にした抗体のコ レクションを表すと考えられるので。

多数のメンバーが必要な場合、それは、広範囲の分析物の分析に有用な追加の物 質を産生ずる手段としてよりも、特定の分析物の分析用にキットに入れることは それほど有用ではない。したがってこのパネルは、試験キットとして包装される よりも、生産もしくはリサーチ用器具として、より適切に保持される。しかし、 これらの最初に製造された抗体のサブセットは、特定の分析物に関して、特徴的 な充分なパターンを産生じ、同様に試験用基質としても役に立つ。

本発明の方法の最初の段階で必要なのは、ミモトープ類の混合物であり、そのい くつかは、少なくとも満足すべき程度に１分析物の結合能力に似せることができ る。公知の三次元構造の抗原に対する合成のエピトープを提供しようとする初期 の試みは１例えばＡｔａｓｓｉ、　Ｍ、　Ｚ、　　ら、　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　 （１９７７年）上記のように、ミモトープ類の化学的性質は、理論的な異議より もむしろ簡単さの問題である。潜在的なミモトープのセットを構築する２つの極 端な方法を採用することができる。

一方の方法では、ランダムセットが非常に多数のメンバーを持っている。ランダ ムで広範囲の三次元の分子構造（ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ）の好適な起源は、ランダム配列の３〜６アミノ酸ペプチド類の合成である。単 に２０個の正式にコードされたアミノ酸を利用した場合、２０３すなわち５ｏｏ ｏの可能性があるトリペプチドが存在する。少なくとも５００個のトリペプチド の混合物が必要であり、　５０００もしくは１０．０００が好ましい。

実際に必要な数は、残基の選択を最適化することによって最少にすることができ る。例えばバリンの代わりにアラニンを用いることは物質的に異なるペプチドを 示さないが、チロシンの代わりにアラニンを用いると大きな問題になる。勿論。

３−アミノ酸配列に対する理論的に可能なミモトープの数は。

合成ペプチド法を用いる場合、アミノ酸の候補の数を２倍にすることによって少 なくとも８倍にすることができる。これは、配列に入れる候補として修飾した側 鎖を有する追加の２０個のアミノ酸を含めるか、またはそのロー異性体を含ませ ることによって実施できる。この場合、４０３の可能なトリペプチドが得られる 。多数のミモトーブ構造を提供するひとつの方法が、　Ｇｅｙｓｅｎ、　Ｈ，Ｍ 、の国際特許公開第ＷＯ６１００９９１号（前出）に記載されているが、この文 献には、固相合成用の多数の支持体上での連鎖延長工程に多数の残基を導入する ことによって多数のペプチドが同時に得られることが記載されている。

またＧｅｙｓｅｎは、ミモトープ構築の出発点として全体で４００個の可能性の ある“天然の”ジペプチドに対する抗体の試験について記載している。利用しつ るペプチドの数は、ペプチド連鎖がエピトープの大きさの領域（６個のアミノ酸 まで）を超えて増大すると、もちろんそれにしたがって増大する。

さらに、ランダムに構築するが必ずしもそれほど多様でない場合、多数のミモト ープのパネルが、天然に見出されるタンパク混合物を激しく加水分解することに よって得ることができる。例えば、酵母エキスは、トリプシン、キモトリプシン 、コラゲナーゼ、キモシン、エンテロキナーゼなどのようなプロテアーゼの混合 物で加水分解するか、またはこれらで順に処理して加水分解することができる。

生成物は多数の小分子量のタンパクであり、これらのタンパクは所望により。

ＳＤＳゲル上で１例えばＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒの１２５１法を用いて標識 を付けて分離することができる。これらの個々のＳＯＳバンドは、ウェスタンプ ロット紙に転写させて個々のミモトープのパネルを得ることができることが示さ れている。未標識の転写されたミモトープ、またはミモトープが候補抗体に結合 される場合に次の標識づけに競合した方法で標識をつけたミモトープは、候補ミ モトープを、基礎レバ、−トリーの予め選択されたメンバーについて同定する手 段として用いることができる。

１セツトのミモトープを構築する別の好ましい方法は、最大限に多様なセットを 構築する方法である。このセットによって、残基の選択を改良されたレベルに最 適化することによる。上記の数の最少化を達成することができる。概念的に。

ペプチドのようなミモトープの多様なセットの構築は、ある定義された性質が、 全範囲にわたって組織的に変動するペプチドを設計することによって行われる。

考慮すべき適切な性質は、ペプチドの全体の電荷、全体の疎水性、その疎水性モ ーメント、その形態の一般的な特性（すなわち滑らかか、もしくは凹凸がある） および電荷の分布である。ペプチドが。

ミモトープの最も簡便な例として用いられる場合、これらの特性は、利用される アミノ酸の公知の特性と、タンパクのＸ線結晶分析法由来のデータとを用いて、 そのアミノ酸配列から予測することができる。

さらに、ペプチドの三次元構造は熱攪拌で変動するので。

所望の形態を安定化する手段を利用することが有用である。

ペプチド類の形態を限定する方法は、当該技術の分野で公知６５６−６５８頁、 参照）。

６−ｍｅｒｓのパネルを得るこの方法の１態様を例示すれば以下の通りである。

電子雲のパターンを決定するパラメータは。

候補によって広く変動するはずである。例えば製造された候補のペプチドは、疎 水性指数が、パネルを横切って着実に増加するように選択されなければならない 。構造に関連する疎水性指数の考察は、　Ｊａｎｉｎ、　Ｊ、、　Ｎａｔｕｒｅ （１９７９年）２７７巻、　４９１−４９２頁に記載されている。その上、タン パクの両親媒性は。

残基の周期的な疎水性を調節することによって変動させるこは三次のコンホーメ ーションによってきまり９分子の一部分もしくは面が水溶性で、残りの部分が疎 水性であることによる。さらに、正もしくは負に帯電したアミノ酸残基が存在す ることによる電荷のパターンは、候補のパネルで組織的に変えることができる。

最初の候補パネルは、これらのパラメータが多様であるが。

市販されているミクロタイタープレートとタンパク合成装置のロー７ド（Ｃａａ ＋ｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の設計を反映 して、簡便にするために、約９０〜１００のペプチドで構成することができる。

これは、所望のミモトーブの特徴を組み立てるのに充分な数である。合成は９通 常の、一般に商業的に入手できる方法を用いて実施され９次に個々の候補のミモ トーブのパネルをスクリーニングのために用意する。

より完全な多様化は、アミノ酸の追加の性能を用いて行うことができる。このよ り多様なパネルを構築する際には９文献で知られている個々のアミノ酸の性質を 利用する。以下の第１表は、２０のコードされたアミノ酸のうちの１９の性質を 編集したものである。システィンはこの表すなわちこのセットに含めなかった。

というのは、標識、担体、固体支持体などのような付加部分に接合させるためこ の残基を用いることが好都合だからである。

第１表 ＡｌａＡ　　　Ｏ，２５Ｘ　　　　０　　９１．５　　　６ＡｓｐＤ　　−０， ７２３，８６−１１２４，５６Ｇｌｕ　Ｅ　　−０，６２４，２５−１１５５， １６ＰｈｅＰ　　　Ｏ，６１Ｘ　　　　０　　２０３．４　　　４ＧＩｙＧ　　 　Ｏ，１６Ｘ　　　　０　　６６．４　　　７）１ｉｓＨ−０，４０６，０＋０ ．１　　１６７．３　　　　３１１ｅｌ　　　Ｏ，７３Ｘ　　　　０　　１６８ ．８　　　４ＬｙｓＫ　　−１，１０１（１５３＋１　　１７１．３　　　７Ｌ ｅｕＬ　　　Ｏ，５３Ｘ　　　　０　　１６７．９　　　７ＭｅｔＭ　　　Ｏ， ２６Ｘ　　　　０　　１７０．８　　　２Ａｓｎ　Ｎ　　−０，６４Ｘ　　　　 ０　　１３５．２　　　４Ｐｒｏ　Ｐ　　−０，０７ｘ　　　　０　　１２９． ３　　　５Ｇｉｎ　　　　Ω　　　　　　−ＯＪ９　　　　　　　　　　　ｘ　 　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　１６１．１　　　　　@　　　 　　４ ＡｒｇＲ−１，７６１２，４８＋１　　２１０．９　　　４ＳｅｒＳ　　−０， ２６Ｘ　　　　０　　９９．１　　　８ＴｈｒＴ　　−（Ｌ１８　　　　Ｘ　　 　　０　　１２２．１　　　６ＶａｌＶ　　　０−５４　　　　Ｘ　　　　０　 　１４１．７　　　６ＴｒｐＷ　　　Ｏ，３７Ｘ　　　　０　　２３７，６　　 　２ＴｙｒＹ　　　Ｏ，０２１０，０７０２０３，６３第１表のパラメータから 、セットにわたって変え得る５つのパラメータを得ることができる。これらのパ ラメータは以下のとおりである。

１）疎水性指数（ｈｉ）は、アミノ酸成分の個々の疎水性指数の。

ペプチド内のアミノ酸についての合計である。これは、ｎ個のアミノ酸からなる ペプチドについて下記式で表すことができる。

２）等電点くすなわちｐｉ）は、イオン化可能な基のｐｋａの平均値で近似する ことができる。

ｌＥ３．　第４および第５のパラメータは、コンホーメーションに依存し、疎水 性モーメン）　（ｈｒｎ）、双極子モーメント（ｄ＋ｎ）および“波形因子″（ ｃｏｒｒｕｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）　（ｃｆ）として標識をつけることが でき、　ｃｆは平滑性を評価する。これらのパラメータは、類似の方法で計算す ることができ、それぞれの場合について、適切な性能関数、すなわち周期δの周 期性の要素の強度（但しδはα−ヘリックス（１００°）もしくはβ−シー　ト （１７０°）と一致すると定義する）のフーリエ変換のモジュラスである。正し いδ値の指定は、そのペプチドによって通常考えられるコンホーメーションか、 またはペプチドの設計者によって制御されるコンホーメーションによって決まる 。

しかし、得られたパラメータのセットのメンバーの間の一般的な関係は、コンホ ーメーションについてなされた仮定にかかわらず、明らかな変化がないことは明 白である。したがって、上記パラメータが９例えばα−ヘリックスコンホーメー シミンを考慮してセットの全メンバーについて計算された場合、得られた結果の パターンは、たとえペプチドが実際にα−ヘリックスの形態でなくても“真の” パターンからそれほど変わらないであろう。この結果は、認識され、指令された コンホーメーションを得るのに不充分な長さの非常に短いペプチドについて特に 重要である。

それ故、３つのパラメータ、すなわち疎水性モーメン）　（ｈｍ）。

双極子モーメン）　（ｄｍ）および波形因子（ｃｆ）の計算は次のようにして行 われる。

式中でｈｍについてはＨ：＝ｈｉ；ｄｍについてはＨはｐＨ７における全体の電 荷：およびｃｆについてはＨは体積である。

これらの５つのパラメータの変化を最大にすることに基づいた多様なセットの生 成は９種々の選別法を用いて行われるが、特に好ましい方法は次のとおりである 。候補ペプチドの配列をランダムに作り１次いで５つのパラメータの各々につい てすでに選択した候補からの差異について選別する。候補ペプチドを好都合な数 のプール、例えば天然に見い出されるタンパクでの頻度によって、９０〜１００ の起源中に分布している１９個の個々のアミノ酸の９０〜１００の起源から、ラ ンダムに選択される。第１表に示す様に、いくつかのアミノ酸は、天然のタンパ クで、他のアミノ酸より大きい頻度で出現する。

この頻度は、遺伝子コード中のこのアミノ酸に関連するコドンの重複性のレベル によって一般に測定される。

例えば、最初に組み立てられた６−ｍｅｒは、各位置が、９０〜１００起源のパ ネルからランダムに選択されたアミノ酸によって満たされている。次の候補も、 ９０〜１００起源からのランダム選択によって構築されるが５つの測定・計算さ れたパラメータにおける差について、第１の候補と比較される。かなりの差があ るか否かによって、この候補のペプチドは残されるかまたは廃棄される。さらに 次々に候補が試験されるにつれて、候補は、そのセットにすでに入っている候補 と非常に近い性質をもっていいるので残留を保証されない可能性が大きくなり、 メンバーをセット中に残す前に多数の候補を組み立ててスクリーニングする必要 がある。このプロセスは、すぐ前の候補が受容されてから、試験された候補の数 が受容されなくなるまで続けられる。一般に予測されるパターンは次のとおりで ある。

（以下余白） ４訊４露さノでるノｅフ・ヲツらつ収 上記の場合１組立てと選択のプロセスは提示した領域のどこかで停止するはずで ある。

４８の最終パネルを得るためには９手動で最終的に良好な調製を行うことができ るように最初に約９６の多様な候補を提供するのが好ましい。例えば、主鎖の双 極子モーメントに匹敵する側鎖の双極子モーメントが考慮される。最終パネルは 。

特性の分布がすべてのパラメータについて存在するように再調査しなければなら ない。すなわち各ペプチドは、少なくともＸ％まで（０〜１００単位の範囲に目 盛を規格化した後）他のすべてのペプチドと異なりＸの値は前記グラフの“非常 に扱いにくい（ｃｕｍｂｅｒｓｏｍｅ）”領域で決定される。したがって各ペプ チドは、５つのパラメータの少なくとも１つについて、そのセット中の他のすべ てのペプチドと実質的に異なる。この方法゛は、計算の方が合成より容易なので 有利である。しかし充分な多様性が、熱によってコンホーメーション中に誘発さ れる変動によっである程度損なわれる。

スクリーニングアッセイにおいてパネルのメンバーの総数を減らすために代表サ ンプルを使用することの有効性は、多くの情況において認められている。例えば 、カレイら（Ｗ、　Ｐ。

頁参照。

候補のミモトープセットの中からペプチドが選択されると。

個々のペプチドは既知の技術を用いて容易に入手しうる。たよれば、これらの物 質を肉眼で見ることができる量の合成が可能である。さらに、抗原構造の探索の ためのポリエチレン固体支持体に結合し、抗原／抗体相互作用についての理解を 得るために使用される多数のペプチドの合成が、ゲイセン（合成ミモトーブ混合 物は、たとえばファージ形質移入宿主における発現のために、λフアージベクタ ー内にショットガンクローニングされた任意の合成りＮＡ配列を使用して調製す ることもできる。このアプローチでは、標準的な市販の固相ＤＮＡ合成手法を使 用してランダム配列の９−ｍｅｒｓ、　１２−ｍｅｒｓ、　１５−ａ＋ｅｒｓま たは１ｇ−ｍｅｒｓを合成し、所望する場合にはさらに均一な配列に拡張し、宿 主細胞におけるトランスフェクションのために標準発現系に連結する。どのよう な組換え宿主も使用しうるが、都合のよい発現系はλフアージベクターおよび細 菌宿主細胞である。このようにしてトランスフェクトした物質を９次に発現に適 した条件下で培養して、ミモトープの混合物を得ることができる。あるいは、混 合物ではなくパネルを所望する場合には、以下に述べるように、トランスフェク トしたイー・コリを１個々のペプチドの生成のために個々のコロニーとしてブレ ーティングすることができる。ペプチド配列に適した発現系は当該技術において 既知であり、たとえば、マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ中に認められ、当該技術においては周知である。

組換え法によって得られるペプチドは、混合物としであるいは個々のペプチド配 列としても入手しうる。

ポリペプチドは極めて合成に都合がよいが、潜在的なミモトープの選択は、アミ ノ酸配列に限定すべきではないことを改めて強調しておかねばならない。アミノ 酸配列自体は、天然に見出されるアミノ酸と天然には見出されないアミノ酸。

及び天然に見い出しつるが遺伝暗号によってコードされないアミノ酸から誘導す ることができる。さらに、多糖類複合体構造及び形状や電子分布を変化させる様 々な置換部を含む多環構造の化学合成バリエーションも使用し得る。しかしなが ら、ポリペプチドの使用は、現在使用し得る技術の利用、並びにおそらく抗原の 表面外形の代表的なサンプルを得る為に他の合成アプローチの使用を必要とせず に、所望する形状のスペクトルを提供する数多くの変種の速やかな実現を可能に する。

（以下余白） Ｄ、スクリーニング工程 本発明工程の１つの側面は、所望する分析物と反応する抗体を得るための方法に 関する。いくつかの場合には、これは。

任意に作製した抗体パネルを使用する単一の反復しか必要としない。この工程で は、おそらく、抗体パネルを分析物で直接スクリーニングすることができるであ ろう。しかしながら。

この方法は１分析物が大量に入手できなければならず、標識を与えるために分析 物を化学的に変更するか、あるいはさもなければ１次に標識に結合することがで きる何らかの修飾物質に分析物を接合させなければならないという不利な点があ る。本発明の方法においては、標識していない分析物とミモトープの標識付けさ れた混合物との競合によって、これが回避されている。ミモトーブ混合物の標識 は、おそらくシスティン残基程度の簡単なリンカ−分子をペプチド鎖に接合し。

それを、ピアース・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　） が販売しているような市販のリンカ−を用いて標識に接合させることにより容易 に達成できる。その代りに、ペプチドをアビジンのようなその他のタンパクに接 合し、それを標識に結合するための手段として使用することもできる。標識は、 酵素、蛍光体、放射性成分９発色団等を含めて９種々の選択か可能である。代表 的な酵素標識には、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、トリプシン、カタラーゼ、 およびアルコールデヒドロゲナーゼが包含される。蛍光体は、フルオレセインお よびダンシルを包含する。種々の色素のような発色団も使用しうる。可能な標識 の数は多大であり、当業者にとっては周知である。標識は代表的にはペプチドホ モポリマーあるいはその他の簡単なペプチド、あるいはポリエチレングリコール のような適当な溶解度の短いオリゴマーを含むスペーサーを通してミモトープに 接合することができる。

次にパネルを、対照として、ミモトープ混合物と結合する能力に関して予備的に 試験する。結合のパターンおよび標識の強度を観察して、好ましい工程では、ミ モトーブに不十分にしか結合していない抗体は無視される。無視されるカテゴリ ーに属する抗体パネルの割合は大きくないであろう。その理由は、ミモトーブの 混合物の数はおこりつる種々の外形を包含するのに十分な数であり、従って想定 されるいずれの抗体にも結合することができる少なくとも２〜３のメンバーを含 んでいなければならないからである。これは特に最大の多様性を持ったミモトー ブ混合物の場合にあてはまる。今、すべてのメンバーがミモトープ混合物に結合 することが証明されたパネルを、標識していない分析物を使用してミモトーブ混 合物との競合により再びスクリーニングする。分析物とミモトープ混合物（ある いは個々の成分）の連続的希釈を用いて９分析物が最も良好に競合する抗体を確 認する。

さらに詳しくは、必要数のミモトープの混合物（固有の多様性に応じておよそ１ ０−１０００の；より多様な混合物については、範囲の下限の数で十分であろう ）を適当な方法、たとえばポルトンら（Ａ、Ｅ、Ｂｏｌｏｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ） 　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　　（１９７３年）５２９〜５３９頁が述べている。

　＋［：Ｎレイディオケミカルズ（ＩＣＮＲａｄｉｏｃｈｅａ＋１ｃａｌｓ）よ り市販のヨウ素同位体１２５を用いたアシルヨウ素化法によって標識する。アビ ジン／ビオチン結合フルオレセインのようなその他の標識方法も使用できる。上 記に述べたようにペプチドの混合物は９個々のメンバーの合成とそれらの混合に よって直接調製するか、あるいは大きなタンパクを任意の小さなペプチドに加水 分解することによって得られる。１つのアプローチは、たとえば、酵母溶解産物 の部分的なトリプシン加水分解産物を使用する（クリーブランドら（Ｄ、％１． Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ）、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　　（１９７７ 年）虱巻：　１１０２〜１１０６頁）。これは混合物として標識することができ る多数のペプチドを提供する。あるいは、それらの結合が個々に評価されれば、 たとえばＳＯＳゲル電気泳動を用いて分離し、　　Ｉ＊ｍｕｎｏｄｙｎｅ　（バ ーネット（Ｗ、Ｎ、　Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）　、　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋（ １９８１年）１１２巻＝１９５〜２０３頁）のような試験支持体に移すことがで きる。

標識ペプチド混合物を使用するにあたってパネル中のすべての候補抗体に関して 十分な結合が生じることを確認する必要があると考えられる。パネル全体を通じ てこのように均等結合を生じさせるための条件も、経験的に確立しなければなら ない。完全な条件下では、ペプチド混合物はパネルの全メンバーに均一に結合す る。しかしながら、多くの場合、類似のレベルの結合だけが見い出される。これ は分析物との競合に対して完全に適用しうる基準を提供する。その理由は、混合 物へのパネル・メンバーの結合体を、競合を評価する前と同じ数値、すなわち１ ００％に規格化することにより、単純化することができるからである。

標識したペプチド混合物が１分析物不在下ですべての候補抗体におよそ同等に結 合していることが確認された場合、あるいは同様の結合が規格化された場合に１ 分析物の存在下でスクリーニングを反復する。分析物に対して特異的親和性を有 する候補抗体は、標識ペプチド混合物の結合の低下を示し。

その低下は分析物に対する候補抗体の特異的親和性に比例する。これは１分析物 が抗体に関する標識ミモトープ混合物との競合に勝利したことを示唆するので１ 分析物と最大の親和性を持つ抗体最少レベルの標識を示す。分析物の競合能力を 評価することによって、標識取込みにおける最大の低下を示す抗体が９分析物を 結合するのに最も好適な）ｉ５メーターを持つものとして選択される。

時として、このようにして識別した抗体産生細胞あるいはパネルのサブセットが 、それ以上に処理を行なわずにイムノアッセイにおいて有用な所望分析物に対し て十分な特異性と親和性を持つ場合がある。このような場合には、永久増殖化さ れた１つの細胞系または複数の細胞系は、所望する抗体あるいはサブセットの永 久的な供給源を提供し、該分析物についてのイムノアッセイは、この抗体あるい はサブセ・ノドを特異的試薬として用いて実施することができる。

当該技術におい１広く理解されているように、かかるアッセイについては様々な プロトコルが使用できる。たとえば。

試験するサンプルをマイクロタイタープレートに被覆し１次に同定されている抗 体でプレートを処理した後洗浄する。次にこの抗原特異的抗体の種特性（たとえ ば抗マウスあるいは抗ヤギ）と反応性である標識抗体を使用して、結合抗体の存 在を検出することができる。このプロトコルは、言うまでもなく、使用し得る多 くのもののうちの１つにすぎず、その変形は当該技術において周知である。

その他のプロトコルでは、たとえば、標識された分析物を用いてサンプル中の未 標識分析物と競合させる競合アッセイを使用して、該分析物を測定することがで きる。これもやはり大量の分析物とその化学的修飾を必要とするという不便さが ある；追加的な分析物の必要性は、しかしながら、適当なミモトーブ（以下で定 められるような）を競合物として用いることにより回避することができる。

このような方法で選択されるサブセット、あるいは任意に選択されるサブセット に関して、場合によっては、パネルの個々のメンバーに関する分析物の結合強度 のパターンにより。

特異性を与えることができる。第２図に示す結果が示唆しているように、簡単な 分析物については、比較的小さな任意のサブセットの中で特性パターンを得るこ とができる。この概念を用いるために、該サブセットを基質上の都合のよいノｆ ターン内に支持し、パターンが現われるように、各抗体についての分析物の結合 強度を測定する。適切にデザインすれば。

たとえば、仮に１０〜１０．０００．好ましくは１０〜１００のかかる抗体のマ トリックスを含むカードから、直接パターンを読みとることができる。従って、 好ましいアプローチにおいては。

プロッティングあるいは個々の細胞系からの上清を移すことにより、サブセット のパターン化された配列を有する１つまたは複数の支持体が得られる。

パターンのパネルを１代表的にはパネルの各メンバーへの分析物の結合強度を確 立する適当なプロトコルによって９分析物に関して標準化する。このキャリブレ ーションへの１つのアプローチは、上記の杭柱標識抗体のような定量的検出系の 使用である。その代りに、標識していない分析物を標識したミモトープ混合物と 競合させることによって逆標準化パターンを得ることもできる。このキャリプレ ートしたパネルを使用すると次のようにしてサブセットを分析物に関して分析す ることができる。前述した直接的あるいは競合的プロトコル、およびキャリブレ ーションパネル上のパターンと一致する定量的結合の一貫したパターンをモニタ することによって分析できる。得られた標識量の変動が、上述したように直接的 に、あるいはサンプルと、標識分析物、下記に述べるような方法で同定されるよ うな、該分析物を擬態する標識ミモトーブ、または標識混合物上の間で競合的に 測定される場合には、これらは分析物の量の変動を示す。いかなる場合でも。

得られるパターンは個々の分析物に関しての特性であり、同じパネルあるいはパ ネル群がパターン認識によって適切な試験システムを提供する。

認識されたパターンは、さらに、一連のサンプル中の分析物レベルのモニタリン グ、たとえば化学的処理、廃棄物処理。

あるいはその他の進行中の工程のモニタリングにおいて使用するために定量化す ることができる。該分析物が可変的レベルで存在する場合には、認識されたパタ ーンにおける結合強度が、その一連のサンプル中の分析物濃度の関数となる。認 識パターンが、同じパネル上で重複しない範囲で、いくつかの分析物を同時に測 定することができる。そして無関係な特性づけられない夾雑物は、夾雑物の変動 が該分析物の変動に比べて小さければ干渉しない。

特定の分析物についての特性プロフィールを提供するための、多様な抗体パネル の使用の例を第５図に示す。抗体パネルは９選択された抗体の多様なセットを用 いて、たとえば。

パネル中の各々の抗体が１またはそれ以上の特定分析物と異なる定性的あるいは 定量的反応性を持つように、１または複数のランダムパネルから構築される。第 ５図においては、抗体パネルは２０の抗体から成っている；しかしながらそれ以 上またはそれ以下の数の抗体を使用してもよい。

たとえばＮ個のミモトープの混合物中のいくつかのミモトーブに関して個別の活 性を確認するには、パネルの各抗体を。

検出可能なシグナルを与えるように放射能などによって適切に標識したＮ個のミ モトープの各々と反応させる。抗体パネルと反応したかｐ）る各々のミモトープ （Ｍｔｐ　）は１個々の特定ミモトーブ、　Ｍｔｐ−１，Ｍｔｐ−２・・・Ｍｔ ｐ−Ｎ　（第５図、パネルＡ〜Ｃ）の特徴を示す、パネルについての結合プロフ ィールを生じる。次に、ミモトープ１〜Ｎの各々に関する結合シグナルをパネル の各抗体に対して添加し、パネルの各抗体に関するＮミモトープのセットについ ての総和した特性プロフィール（パネルＤ）を形成させる。従ってパネルＤはま たＮミモトープの混合物を表わす。各抗体に関するミモトープ結合シグナルの総 和を、該総和信号が各抗体に関して最大（１００％）の結合を示すように「規格 化」する（パネルＥ）。

与えられた分析物あるいは対象の抗原（ｒＡｇＡ　Ｊ　）についての特徴的なプ ロフィールあるいはフィンガープリントは。

ＡｇＡおよびミモトープ１〜Ｎの標識混合物をパネル中の各抗体と競合的に反応 させることによって得られる。ＡｇＡによって形成される競合プロフィール（パ ネルＦ）は、一般に、パネル中の特定の抗体に関してＡｇＡが競合に成功したこ とにより、パネル中のいくつかの抗体と標識ミモトーブとの結合を低下させる。

第５図のパネルＦは、　ＡｇＡが、パネルの４つの抗体に関してＮミモトープの 標識混合物の結合を低下させる原因となることを示している。

ＡｇＡが、それに関する標識ミモトーブ混合物との競合に勝利した抗体によって 示される結合の量（あるいは低下）を測定しくパネルＧ）、パネル中の各抗体に 関する結合の量（あるいは低下）を再びプロットして、抗体結合プロフィールを 作製する（パネルＨ）。これは、同じ参照抗体パネルおよび同じミモトープ混合 物競合セットを使用して、他の分析物（ＡｇＢ　、パネルＩ）に関する他のプロ フィールと比較した場合のＡｇＧの特徴を示す。

抗体パネルにおいて使用する多様な抗体セットの選択に応じて、検出およびその 定量にとって有用となり得る分析物に関して個別的なプロフィールが得られるこ とは明白である。

（以下余白） 分析物と競合するミモトープの選択 適切な競合ミモトーブを選択するためには、ミモトーブ混合物自体をパネル内に 分離し、スクリーニングしなければならない。スクリーニングのための道具（プ ローブ）はもとのパネルから選択された抗体の形態で既に用意されている。この 段階では、ミモトーブは、典型的には、ニトロセルロース。

マイクロタイタープレート、あるいはゲイセン（にｅｙｓｅｎ）のマルチペッグ ドシステムなどの固体支持体上に１個々の化合物として提供される。パネルが固 体支持体上に提供されれば。

標識していない（あるいは効果的に標識されていない）ミモトープを使用して１ 選択されたスクリーニング抗体あるいは二次検出抗体に接合する標識を得る上で 最も都合がよい。個々のミモトーブを１次に標識抗体で直接あるいは間接的にス クリーニングする。個々の抗体を使用してもよいし、あるいは、いくつかの抗体 を含むサブセットを使用してもよい。一般的に初期のパネルの個々のメンバーの 特異性がないという観点から、サブセットの方が都合がよい。最も結合に成功し ているものをスクリーニングサブセットのために選択する。

あるいは、適当な結合ミモトーブが得られるまで、より小さなサブセットのミモ トーブ混合物を順次使用して、ミモトープ混合物をスクリーニングすることもで きる。

ミモトーブのパネルを、標識抗体によって直接スクリーニングすることも、競合 的アッセイにおいてスクリーニングすることも有用である。十分に抗体と結合す るミモトープのサブセットを９分析物がこの結合を分断する能力に関して再びス クリーニングする。分析物が最も競合に成功するものが。

明らかに分析物を最も完全に模倣しており、そしてこれらが。

免疫化を用いて抗体特異性をさらに精製するための適切な候補である。これはま た９次の段落で述べるように免疫学的検定において直接使用するための適切な選 択でもある。

従って、適切なサブグループあるいは個々のミモトーブの選択によって、標識ミ モトープが分析物に対する競合者の役割を果す、競合免疫測定法のために必要な 試薬が提供される。

分析物を分析するための適切なキットも本発明の一部である。キットの内容物は 、検出あるいは測定のためのアッセイプロトコルのデザインに依存する。すべて のキットは、アッセイを実施するための使用説明書、適切な試薬と標識、および 必要に応じて固体支持体を含む。キットが、単一の高度に特異的な抗体を使用す る１分析物の簡単な検出アッセイ用にデザインされている場合には、このキット は、この高度に特異的な抗体およびこの抗体と分析物との反応を検出する何らか の手段を含む。たとえば、検出試薬は、単にその特異的抗体自体を標識すること を包含し得る。その場合にはアッセイは９分析物を固体支持体に非特異的に結合 させ、固体支持体が標識された抗体を保持する能力を検出することによって実施 される。分析物に特異的な１種以上の抗体が認められ、１種以上の抗体が同時に 結合することを防ぐ立体障害がなければ、抗原を捕獲するための１種の未標識特 異的抗体と捕獲した抗原を検出するための第２の抗体とを用いて、サンドイッチ 型アッセイが使用できる。あるいは、キットは、所望の分析物について認識パタ ーンが較正されている抗体パネルを含んでもよい。さらに、標識した競合ミモト ープまたは混合物を含有させて、サンプル中の未標識分析物と標！ミモトープと の競合によってアッセイを実施してもよい。

あるいは、パターンを逆にして、必要に応じて、競合分析物の存在下および不存 在下で、いくつかのミモトープへの競合パターンに関して、単一の抗体を特性付 けることもできる。

このパターンは、該分析物のプロフィール特性も提供する。

最大限に異なる特性を持つ、限られた数のミモトープ、たとえば約４０〜１００ ．好ましくは約５０〜６０のミモトープの多様なパネルを用いて実施する場合、 この工程は、多数の抗体の各々に関する認識プロフィールを構築するためにも使 用できる。

該認識プロフィールはコンピュータファイルに保存することができる。各々のプ ロフィールについて２〜３回のアッセイしか必要としないので、多くのプロフィ ールのコレクションが記録できる。新規の分析物に結合すると考えられる抗体は 。

下記に詳述するように、抗体についての保存されている認識プロフィールを、新 規分析物についてのミモトープ相同性プロフィールと照合することにより、電子 工学的に選択することができる。

分析物のミモトープ相同性プロフィールは、ミモトープパネルに関して調製され たインバースイメージ参照抗体セットを用いて極めて容易に測定される。５０ミ モトーブのパネルの場合、これは、　５０の抗体を含有し、ここで、　５０の抗 体の各々１つずつが、他の４９のいずれのミモトーブよりもｌＯ〜１００倍強＜ ５０のミモトープの１つに結合する。従ってたとえば、各モノクローナル抗体は 、その抗体に適合するミモトープに対して１０”　Ｉｔ　／ｍｏｌｅ以上の結合 力を持つが、残りの４９のミモトープのいずれに対してもＩＯ’ｌ／ｍｏｌｅ未 満の結合力しか持たない。

インバースイメージパネルは、ミモトープで免疫し、従来のスクリーニングアッ セイにおいて所望のミモトープでスクリーニングすることによる。標準的なモノ クローナル抗体産生手法を用いて得られる。残りの４９のミモトープと反応性が ないことを確認することにより、適切な特異性を持つモノクローナルを選択する 。従って好適な予備スクリーニングは。

上記のランダムパネルにおける抗体の同定に関して述べたのと同様の方法による 。候補でない４９の標識ミモトープの混合物と未標識の所望ミモトープとの間の 競合を包含する。

この概念の適用の非常に単純な例として、インバースイメージ参照パネルの抗体 ＃７によって単独で検出される新規分析物は、明らかに、他の４９のミモトーブ に比べて、参照ミモトープ＃７に非常によく似たモチーフを示す。その保存され ている認識プロフィールが、他の４９のミモトープに比較してミモトーブ＃７と 強い結合を示唆している抗体は、従って該新規分析物を認識する可能性が高い。

同様に、新規分析物が。

インバースイメージ参照パネルの抗体＃７および＃ｌｌに対して等しい結合力を 持ち、他のすべてに対しては低い結合力を示す場合、ミモトープ＃７および＃１ １を等しく認識し、その他については無視しつる程度である抗体は、該分析物を 認識する可能性が高い。

より一般的には、より複雑な認識パターンも使用できる。

上記大きなコレクションの中の各抗体に関して、ミモトープパネルの、たとえば ５０のメンバーの各々との結合係数あるいは免疫反応性のパターンが得られる。

たとえば、大きなパネルの抗体＃６６４は、ミモトープ＃１とは５０の結合係数 を示し。

ミモトープ＃２とは２５．ミモトープ＃３とは１２２．ミモトーブ＃４とは１０ ．　　ミモトープ＃５とは２００などの結合係数を示す。得られる５０点のパタ ーンが個々の抗体を定義する。

モノクローナル抗体のインバースイメージ参照パネルが。

すべての潜在的分析物あるいは標的抗原に対しても、最初の５０ミモトーブのパ ネルが上記大きな抗体コレクション中の抗体に対して持つのと同じ関係を有して いるので、任意の分析物を、インバースイメージ抗体セットの５０のメンバーに 対して試験することにより、この分析物を大きな抗体コレクションの中で最も緊 密に適合するものと間接的に照合することができ、該分析物のプロフィールある いはシグネチュア特性を決定することができる。インバースイメージセット中の 各モノクローナル抗体を標的分析物き反応させた場合に得られるプロフィールは 、その理想的パートナ−抗体を５０メンバーから成るミモトーブパネルによって 試験した場合に得られるプロフィールとマツチする。理想的な場合には、抗体＃ ６６４によって認識される分析物は、Ｍａｂ＃１について約５０．　Ｍａｂ　＃ ２について２５．　Ｍａｂ　＃　３について１２２　、　Ｍａｂ　＃　４につい て１０゜Ｍａｂ＃５について２００などの結合係数を示す反応性パターンを持つ であろう。

スクリーニングアプローチのこの修正法は、従って、多様なミモトープおよびイ ンバースイメージ抗体の補足的な小さなセットを参照指標として使用して、基礎 セット由来の、あるいは任意の分析物と反応性である大きなセット由来の特定の 抗体を同定するのに使用することができる。最初の大きな抗体セットの各メンバ ーを、　（たとえば）　５０メンバーの多様なミモトープのパネルに関してプロ フィールを明らかにし。

５０メンバーのミモトープパネルのインバースイメージ抗体セットを得、そして そのインバースイメージ抗体パネルを潜在的分析物あるいは抗原に対して試験す ると、適合するプロフィールが得られる。

このアプローチの適用に関する有用な例は、新規分析物が患者に特異的な腫瘍の 細胞表面抗原であって、抗体コレクションが、現在数千と推定される。抗腫瘍モ ノクローナル抗体の蓄積された総記列にあたる場合である。参照プロフィールの セットを得るために、抗腫瘍抗体の配列は、最初に小さなセットのミモトーブに 対して分類される。このミモトーブセットのインバースイメージによって各々の 細胞表面抗原のプロフィールを明らかにし、得られたプロフィールを抗体配列の メンバーの保存プロフィールと比較する。プロフィールが非常に適合することは 好ましい抗体であることを示す。抗原を特性付けるためのこのアプローチは次の ような利点を持つ：（ｉ）ごくわずかな生検サンプルで、多数の抗体に対して分 類することができる；（市）抗体の参照パネルへの結合を測定するための検出標 識（Ｔａｇ　）を抗体に連結することができるので、生検サンプルを化学的に変 性させる必要がない；そして（ｉｉｉ）抗体の候補配列を速やかに且つ安価に検 査することがミモトーブの予備セットが選択されると、第１段のスクリーニング パネル中で得られるものよりも高い親和性／特異性を持つものに関して、多数の Ｂ細胞をスクリーニングするのにこのセットを使用することができる。最も簡単 な場合では。

プローブとしての蛍光体に連結したミモトーブを用いて、約１０７細胞の完全な 体止Ｂ細胞のレパートリ−を蛍光活性化細胞ソーター上でスクリーニングするこ とができる。

通常のインビボでの免疫反応の「成熟」の分析は、より親和性の高いクローンが 、別の基礎レバー）　ＩＪ−のＢ細胞を検査するのではなく９分析物の結合部位 に対応する超可変性配列のランダム化を開始させることによって最も良好に産生 されることを示唆している。

従って、免疫学的検定における競合試薬として有用であることに加え、直接的な アプローチとして９選択したミモトープあるいはサブセットは、抗体特異性およ び／あるいは抗体親和性を改善するための免疫原として有用である。ある意味で は、この局面は、抗原の供給を必要とせず、抗原の毒性が回避されることを除け ば１分析物あるいは抗原による標準的なインビボでの免疫に類似している。さら に、抗自己Ｔ細胞反応の抑制および正規化が、キーホールリンペットヘモシアニ ン（ＫＬＨ）あるいは破傷風トキソイドのような適当な担体にミモトーブを接合 することによって可能となる。

従って、担体に連結した免疫原性ミモトープあるいはサブセット混合物による被 検哺乳類の免疫は、Ｂ細胞の供給を導き９次にこれらのＢ細胞を永久増殖化して 、たとえば上記で用いた方法を使用して、特定分析物に関する高親和性および特 異性をスクリーニングすることができる。この場合１分析物／ミモトーブの競合 は、特異性および親和性が特徴的である。あるいは、上記で示唆したように、ミ モトープを蛍光標識に接合し２選別の前にスクリーニングに使用される反応を実 施することにより、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて、産生される Ｂリンパ球を最初にスクリーニングすることもできる。次に同定された１！細胞 を永久増殖化し、所望に応じて再スクリーニングすることができる。

このレベルの抗体パネルには、初期スクリーニングで得られるよりもミモトーブ は特異的で、かつミモトーブに強く結合するものがいくらか含まれる。通常、そ れらは基礎レバートリーにおいて一般的な１ｇＭクラスではなくＩｇＧである。

被検時乳類の免疫系を、Ｂ細胞分化のための体細胞変異システムとして、ｉ６よ び、増殖する分化Ｂ細胞のセレクターとして使用すると、得られるパネルに、免 疫反応性補体に関してははるかに範囲が狭いが、焦点である補体分析物について ははるかに高い特異性と親和性が与えられる。ミモトーブが分析物の適切な特徴 を擬態する範囲で、得られる抗体は分析物に関してより高い特異性と親和性を持 つ。

免疫系によるこの工程の最初の局面、すなわち免疫グロブリンの可変部の外形を 変化させるＢ細胞の分化は、最初のパネル由来の候補抗体をコードするものから 、修飾される範囲において免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片をコードす るＤＮＡを作製することにより１組換えＤＮＡ手法を用いて擬態することができ る。このように、既知の分離手法を使用して、基礎レパートリ−パネルから選択 された細胞によって分泌される免疫グロブリンをコードするＤＮＡを、出発物質 のセットとして単離する。分離したＤＮＡに含まれる配列は、免疫グロブリンの 超可変部をコードしており、無作為にあるいは部位特異的変異を通して、生じる 抗体の超可変部を修飾するように変化させることができる。超可変部を同定し、 変化させるための手法は、当該技術において既知である。変異を起こしたＤＮＡ を１次に酵母あるいはバクテリアにおいて発現させ、第２段のパネルを得る。こ れは免疫産生パネルの知見を提供するが１選択性は提供しない。

再び、免疫系あるいは組換え手法のいずれかによって作製された第２段のパネル を用いて、特に有用な特性を持つ個々の抗体を選択することができ、あるいはよ り好ましくは、所定の分析物に対する親和性に関して特定のプロフィールを示す パネルを提供するサブセットを得る。一般的なアッセイ工程に選択パネルを使用 することをさらに下記に詳述する。

Ｆ６分析における抗体パネルの使用 ミモトープ（または分析物）によるスクリーニングあるいは免疫化によって得ら れる抗体レパートリ−（その産生は。

それらを産生ずるＢ細胞を永久増殖化することによって永続化し得る）は、被検 物質中の分析物に関する同定診断としても使用することができる。典型的には、 好適な小さなサブセットを使用するが、適切に形式化すれば、多数のものを以下 に述べるようにして操作できないという理論的根拠はない。

分析物は、その分析物に特徴的である特定の結合プロフィールを示すであろう。

上記に述べたように、インバースイメージパネルは分析物あるいは抗体のいずれ かを特徴づけるのに使用することができる。インバースイメージパネルのメンバ ーの数は、実用的なセットを構成しうるに十分なほど少ないが、意味のあるパタ ーンを与えるのに十分多いことが好ましい。このようなパネルは、従って典型的 には３０〜１００のメンバー、好ましくは約５０のメンバーを含んでいなければ ならない。モノクローナル抗体インバースイメージ参照パネルと分析物（あるい はミモトーブ参照パネルと抗体）との反応性は、直接あるいは競合的標識結合の ような当該技術において既知の様々な手法を用いて評価できる。

多くのプロトコールが想定できるが、少なくとも、パターン化され、裏づけられ たパネルは、特定分析物に関する反応性の１つまたは複数のプロフィールを得る ために好適な道具を提供する。プロフィールは極めて個別的であるので、その相 違を利用して、様々なタイプのプロスタグランジン、種々のアイソエンザイム、 あるいは非常に類似した薬剤などの。

密接に関係するクラスの分析物のメンバーを識別することができる。

従って、固体支持体上にパターン化された形式で配置された１分析物に関して親 和性あるいは特異性の異なるｌＯ〜約１０．０００゜好ましくは約５０の最大限 多様な抗体から成るパネルも１本発明の一部である。次にその固体支持体を使用 して、たまえば競合物としての標識ミモトープの連続希釈を用いて、結合親和力 および／あるいは特異性を測定することにより、あるいは直接的な分析において １分析物の存在に関してサンプルを評価することができる。得られるパターンは 特定の物質に固有のものであり、特徴的なものであるので、このような親和性の 特徴的パターンは該分析物の存在を示す。以下に述べるパネル表示（ｐｒｅｓｅ ｎｔａｔ　１ｏｎ）の方法は、パネル中に多数のメンバーを許容する。パターン は肉眼で読み取られるが、あるいはスキャニング手法に付してディジタルまたは アナログ読出し用に変換されてもよい。

簡便な包装形態で、必要に応じて適切な競合ミモトープと共に、適当な配列でこ の抗体あるいはミモトーブのレパートリ−を含有し、試験を実施するための使用 説明書を添付したキットも本発明に包含される。

Ｇ、パネルの表示 本発明の方法中の多くのステップ、ならびに本発明によって提供されるキットが １個々のメンバーあるいは個々のプールの体系的な配列としてミモトープあるい は抗体産生細胞を配置することを必要とるすことは注目されるであろう。そのよ うな配列を得る標準的方法が利用でき、その方法には、上述のようにマイクロタ イタープレート、およびニトロセルロースまたはポリスチレン上のそれらの複製 を使用することが包含される。

この順序正しい配列を保存する好ましい方法は、活性な膜の使用を包含する。こ の活性な膜は、市販のもの、あるいは市販のｒ　ＮｕＰｉｘＴｌ″Ｊアガロース で例示されるようなアガロース誘導体を使用して下記に述べるようにして調製さ れたものを含む。この材料を、シエイノフ、Ｊ、Ｒ，ら（Ｓｈａｉｎｏｆｆ、　 Ｊ、Ｒ。

ｅｔ　ａｌ　）　、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（１９８６）　４　：　１ ２０〜１２８による厚さ約１．５ｍのゲル状支持体きして使用した。アガロース 誘導体は、共有結合が形成されるので、ポリスチレンおよびニトロセルロースへ の吸着より、タンパクおよびペプチドの結合安定性を提供する。本発明の他の局 面は、アガロース誘導体を必要なパネルのための固体支持体として使用する改良 方法である。

この改良においては、取り扱いが困難で、完全に再現可能ではない結果を生じる アガロース誘導体ゲルを使用せずに。

アガロースをガラスファイバー濾紙のような不活性固体支持体内に含浸させる。

含浸した固体支持体を使用することにより、取り扱いの容易さと再現性が大きく 改善される。

本発明の支持体を調製するために＋　　ＮｕＰｉｘ”アガロースなどのアガロー ス誘導体を適量の水に溶解して約０．１〜０，５％。

好ましくは０．３％とし、煮沸した後、最終濃度の０．１Ｍのホウ酸ナトリウム などのアルカリを添加する。適当な大きさのガラスファイバー濾紙などの固相吸 着剤を、溶解したアガロース中に浸漬し、余分な液体を除去する。完成したシー トを冷却してアガロースを固体化させ、４℃の湿潤条件下にて保存する。

使用時には、アッセイ含浸紙のシートを、水素化シアノホウ酸ナトリウム（１■ ／ｍｆ）を新たに溶解させた。結合試薬を含有する新鮮ホウ酸す）　ＩＪウム中 で平衡化させ、余分な液体を除去し、サンプルを支持体上に所望のパターンでブ レーティングする。これは９６ウエルのマイクロタイタープレートのパターン内 に９６の平底金属ロッドの配列があるＣｈｏｎｅＭａｓｔｅｒ　＠（イミコンシ ン社（Ｉｍｍｕｎｓｉｎｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）　）などの多くの市販手 段、あるいはその他の簡便な転移機構によって実施され得る。転移した物質を５ 〜１５分間、好ましくは約１０分量線紙と反応させ１次に緩衝液、およびＢＳＡ などの適当なタンパクを含む溶液中に固定する。サンプル中に検出されるべき物 質に適した試験系を用いて、スポットを展開させる。

実施例 以下の実施例は本発明を例示することを意図したものであって９本発明を制限す ること意図したものではない。実施例１は、完全なり細胞レパートリ−を代表す るサブセットである。抗体分泌細胞のパネルを提供するための特定方法を述べて いる。上記明細書中に概説したように、その他の方法もこのパネルの作製に使用 し得る。また同時に、ミモトーブの代表的混合物を生成するための特定方法につ いても述べている；これもやはり、上述したように様々な工程によって、また多 くの標識方法を用いて実施し得る。

実施例２は１本発明の支持抗体パネルの調製を述べている。

標準的工程を用いて１０週令の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスから牌細胞を得、　　２ ００ｍ１の完全培地（イスコブの修正ダルベツコ培地（ＩＭＤＭ）　、　　１０ ％胎仔つ’／　血清、　０．４ｍＭ　２−１　ルカ７’　）　工９　／−ル、　 　２ｍＭ　　Ｌ−グルタミン）を含む６５０ｍ１フラスコに入れた。

すべり（ｇｌｉｄｉｎｇ　）細菌アジュバント　（２■）をポリクローナル刺激 剤として細胞に添加し、刺激された培養物を３７℃で４日間インキュベートした 。

１１０００ｒｐで１０分間遠心分離して細胞を回収し、あらかじめダルベツコ、 の二価陽イオンを含まないＰＨ３中で、同様にして回収し、　　５００ｒｐｍで ８分間遠心分離しておいた１０＠の骨髄腫細胞、　Ｐ３Ｘ６３ＡＧ８．６５３と 合わせた。上清を取り、ペレットを１分間５０ｗ／ｖ％のＰＥ６４０００　　（ ガスクロマトグラフィー規格）の０．６−中に再懸濁させた。再懸濁したペレッ トを含む試験管を３７℃で４５秒間ゆっくりと渦巻状に動かし、さらに４５秒間 休止させた。細胞を再び５００ｒｐｍで３分間ペレット化し、３７℃のＩＭＤ１ １５ｍｆを、ベレットを乱さないようにしてゆっくり試験管に加え、　５００ｒ ｐｍでさらに５分間遠心分離した。

上清を取り、ベレットをもう一度、　０．４ｍＭヒポキサンチンおよびｌ　６Ｘ 　１０−Ｓｍｏｌｅチミジンを含む完全培地（完全培地十）ＩＴ）　　（３７℃ ）１５ｍｊｉ中に再懸濁させた。懸濁液を、牌活性化培地（肺細胞回収物由来の 上清）３０ｄと共に、３７℃の完全培地十ＨＴ　１５５ｍｆに添加した。懸濁液 を６５０ｒｒ１１フラスコに注ぎ入れ。

３７℃で１２〜１８時間インキュベートした。懸濁した細胞を、２Ｘ　１０−’ ｍｏｌｅアミノプテリン（Ａ）と共に、マクロファージと２匹のＢＡＬＢ／ｃ　 １０週令雄性マウスの牌細胞とを用いて提供し。

懸濁液を９合計１０プレートの９６ウエルの組織培養プレートに。

ウェルあたり２００ｍｊ！ずつブレーティングした。ウェルあたり５〜１０クロ ーンを得た。従って最初の１つの活性牌から５０００以上の抗体産生細胞を得た 。コロニーをさらに個々の細胞系に分離するか、あるいは初期スクリーニングの ためのプールとして使用してもよい。

実施例２ ＮｕＦ　ｉｘ”アガロースを、製造者が指示しているように、　７０ｔで１０分 間、０．３％よりわずかに高い濃度で水に溶解させ１次に１０分間煮沸した。１ ／１０容量の０．１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ９）を添加し、溶液を５５℃水浴 中に置いた平林に注ぎ入れた。３インチ×５インチに裁断したガラスファイバー 濾紙のシート（シュレイチャーとジュール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ ｃｈｅｕｌｌ））をアガロースに浸漬させ、余分な液体を吸収紙に吸い取って除 去した。シートをパラフィン紙の上に置き、１０分間冷却してアガロースを固体 化させた；シートは湿潤箱の中で４℃で保存した。

使用時には、含浸させた紙を、水素化シアノホウ酸す）　ＩＪウム１■／ｄを含 む０．１Ｍ　　ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９）中で５分間平衡化させた。余分な液 体を流出させ、吸い取って。

シートをプラスチック製ラップの上に置いた。９６ウエルプレートの各々のウェ ルからのサンプル１μｌを、増殖するマウス細胞と共に、あるいはマウス細胞を 伴わずに、標準９６ドツトパターンとして紙に移し、移した培養プレート培地の ドツトを１０分間紙と反応させた。過剰な結合部位をブロックするために、シー トを、　１ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミンを含む０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐ Ｈ８＞　、　　ＯｌＩＭ　　ＮａＣ１の溶液中に浸した。液体を除去した後、同 じ緩衝液中で１＋３０００に希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス血清（ ザイムド、　Ｚｙｍｅｄ　）　５ｍｌをシ−ト上にピペット化し、シートを室温 で１５分間インキュベートするか、あるいは、試薬を浸透させた濾紙に対してブ ロッティングすることにより、試薬を付与した。結合していない抗体を吸引によ って除去し、０，１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水を何回も交換しながら 、５〜１０分間１紙を洗浄した。

結合したペルオキシダーゼを、あらかじめ過酸化水素を０．１％の最終濃度で添 加しておいた。５０％メタノール、５０％クエン酸中１０■／−のテトラメチル ベンジジンを用いて可視化した。反射濃度計あるいは写真によって結果を記録し た。

第１図は、プレート上の連続する横列のパイブリドーマ培。

獲物を連続的に希釈した結果を示す。強度の変動が明らかに認められる□。

被検物質のパネルは手操作であるいは定量的検出法を用いて読み取ることができ る。たとえば、配列させたパネルは。

個々のスポット各々からの蛍光シグナルのようなシグナルをディジタル化し、そ れをコンピュータの判読可能な形式で出力するように設計された特殊な装置で読 み取ってもよい。従って１個々のスポットについて定量的測定が得られる。

本発明の工程にふいて有用なパネルの特定形状は、　　１０ｏ個の横列と１００ 個の縦列のドツトを有する小さな面積、たとえば３インチ×３インチのカードを 包含する。この合計１０．０００の個別抗体あるいは抗体プールの配列は、特定 分析物との反応性の特徴的パターンを導く。

特表千３−５０４６３８　（１９） 疎水性の低下および疎水性モーメントの周期的変動に基づいて、８８種のペンタ ペプチドのパネルをデザインした。第３図は１合成したペンタペプチドに１〜８ ８の番号を付したリストを示す：第４図は、このパネルを横切る疎水性指数と疎 水性モーメントを示す。

該パネルは、９６ビンのロフトを使用する。ゲイセン、Ｈ，Ｍ。

ら（Ｇｅｙｓｅｎ　）Ｉ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ　）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ 　Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８４）　（前出）の方法を用いて合成する。残りの８個 のポリエチレンピンは、アミノ酸分析によって分析される９合成における対照と して使用する。

次にパネルのミモトープを混合し、上述したようにポルトン−ハンター試薬を用 いて１２５−１で標識して、マイクロタイターのウェル中で基礎抗体レパートリ −の個々のメンバーを用いて試験する。レパートリ−のすべての抗体メンバーに 対してほとんど均一な結合が認められる。次にマイクロタイターウェル中の混合 物に所定量の分析物を添加して試験を繰り返す。少数のウェルは標識が大きく低 下する。これらの抗体が９分析物と優先的に結合するものについての、成功した 初期スクリーニングの結果を表わしている。

実施例４ 抗体のスクリーニングにおける。非同−分析物に対する競合物として標識ミモト ーブが有効であることを第６図に示す。

２つの異なるモノクローナル抗体を、濾紙基質上の１横列あたり１２スポツトの 割合で２横列に付与した。第６図において。

横列１と２にはＭａｂ　３３−６をスポットし、横列３と４にはＭａｂ９−７− ９をスポットして、＠列５は抗体をスポットせずに対照として使用する。ウシ血 清アルブミンをすべてのスポットに適用して過剰結合部位をブロックした。パネ ルの縦列２〜１１には、標識ペプチド／ミモトーブのスボッｌ−，Ｍｎ４−ＦＩ ＴＣ（１４＝Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ　’−Ｔｒｐ− Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−）１　ｉ　ｓ−Ａ　Ｉａ−Ｌｙｓ）を、２ｘｌＯ− ｓＭのセット濃度で適用した。縦列２〜１１は、縦列２の４Ｘ１０−’Ｍの濃度 から始まって、縦列３〜１１へ連続的にｌ：１希釈して順次より低い濃度で、未 標識競合ペプチド／分析物　Ｍｎ２　　（ＭＢ３＝Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−３ ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ　”−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ −１１ｅ−ｓｅｒ）　（”＝アミノ酸残基の違い）を。

同時に含む。生じた基質をインキュベートして洗浄した（Ｂｉｏ−ロｏｔ装置） 。

第６図は、各々のＭａｂに関して、　ＭＢ３競合物が希釈されているので、標識 ＭＢ４ペプチドが未標識競合ペプチドＭＢ３との競合に成功したことを示してお り、試験した２つのＭａｂの各々についてパネル上に特徴的なパターンが生じて いる。

実施例５ 少数の多様のミモトープでも、任意に選択した抗体との結合に適したペプチドを 含み得ることを本実施例において示す。

第７図は、ハウテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）　　（前出）の方法に従って合成した ２４種のノナペプチドに関するアミノ酸配列を示す。これらのペプチドは、疎水 性モーメントおよび疎水性指数、ならびに電荷の分布と電荷の大きさにおける高 度の多様性を示すためにデザインされた。

これらのペプチドのうちの１６種を、任意に選択した。実施例４で述べたように ペプチドＭＢ３とＭｎ４に結合することがわかっている。マウス抗体Ｍａｂ　３ ３−６に結合する能力に関して試験した。結合は、市販のパイオーラッド（Ｂｊ ｏ−Ｒａｄ　）のドツト−プロット装置を用いて試験した。この装置は、基質上 に試験ドツト部位の横列と縦列を定義するパターン化した上敷きを有する活性紙 またはニトロセルロース基質を提供する。

結果を第８図に示す。

簡単に言えば、試験は、試験するペプチド溶液１λを指定のスポット、この場合 には３つのスポット上にピペットで付与することによって実施した。基質をカゼ インまたはＢＳＡでブロックし９次に、あらかじめＭａｂ　３３−６　１ｕｇ／ ｍｅを含む溶液２５λを付与しておいたサランラップ支持体上に基質を押しあて ることにより、抗体を付与した。基質を抗体溶液に接触させて室温で約１時間イ ンキュベートした後、取り出して緩衝液中で洗浄した。次に、あらかじめホース ラディツシュペルオキシダーゼで標識しておいた標識ヤギ抗マウスＩｇと共に基 質をインキュベートし、標準的方法によって標識の存在を検出した。

第８図に示すように、刺激した基質の横列２の最後の３ドツトは、既知のエピト ープの配列に対するペプチドの相同性に基づきＭａｂ　３３−６に競合すること が知られている。ペプチドＭＢ３を含む。横列３〜６は各々、第７図に示す多様 なセットの異なるペプチド１〜１６の４種類の各３つずつのサンプルを含む。横 列７と８は追加対照を含む。第８図の結果は、試験した１６ペプチドのうち３つ がＭａｂ　３３−６との結合に成功したことを示している。Ｍａｂ　３３−６の 代わりにＭａｂ　９−７−９を使用した同様のアッセイは、試験した１６のうち １つのペプチドだけがこの抗体に結合し得ることを示した。

ＦＩＧ、　　１ 力シニンｔ：すすする　９３５のルｂ ＦＩＧ、２Ａ カシニン〃−ジ１ｇ二文−ｒｉｂ’乃６のルｂＦＩＧ、　２Ｂ 耗に、４に敦 ＦＩＧ、　８ ２　　　Ｇ　　工　　ＦＡＳＳＳＹ　　　工３ＧＦＡＨＡＭＧＴＬ ４　　　　ＧＡＦＧＷＳＧＳ　　　入 ５　　　　Ｇ　　Ｌ　　Ｅ　　ｓＡＨＭＷＦ６　　ＧＡＰＧＴＹＴＳ入 ７　　Ｇ　工　　工　ＴＫＡＳＴＴ ｓ　　　ａ　　Ｎ　ｙｓｘｒ　　ｗ　ｙ　　Ｌ９　　　　ＧＬＧ　　　入　　入 　　Ｎ５ＫＡ１０　　　Ｇ　　　Ａ　　　Ａ　　　ＨＥ　　　Ｌ　　　Ｔ　　　 Ｓ　　　ＳＩ　　　Ｇ　　Ｎ　　Ｍ　　工　’］’ＥＴＤＬＬ２　　　Ｇ　　　 Ｅ　　　工　　入　　ＨＰＦＤＮ１３　　　Ｇ　　　Ｓ　　　Ｓ　　　Ｓ　　　 工　　Ｎ５ＫＡ１０　　　Ｇ　　Ｇ　　Ｇ　　Ｅ　　Ｔ　　Ｔ　　Ｅ　　Ｍ　　 Ｓｉ２　　　Ｇ　　Ｋ　　Ｇ　　　Ｓ　　　Ｎ　　Ｎ　　　Ｆ　　　Ｆ　　　Ｓ ｉ２　　　Ｇ　　　Ｆ　　　Ｄ　　　Ｅ　　　Ｔ　　Ｇ　　　Ｄ　　Ｗ　　ＤＬ ７　　　Ｇ　　　Ｄ　　Ｗ　　Ｄ　　　Ｇ　　’Ｔ’　　　Ｅ　　　Ｄ　　　Ｆ Ｌ８　　　Ｇ　　　Ｓ　　　Ｄ　　　Ｓ　　　ＨＡ　　　Ｓ　　　Ｄ　　　入１ ９　　　Ｇ　　　Ｋ　　　入　　工　　ＴＧＡＲＤ２０　　　Ｇ　　Ｆ　　Ｇ　 　Ｋ　　Ｋ　　ＨＴ　　Ｄ　　Ｇ２Ｌ　　　Ｇ　　Ｔ　　ＲＴ　　　Ｍ　　Ｌ　 　Ｔ　　　ＲＦ２２　　　Ｇ　　　入　　入　　ＫＳＳＫＨＴ２３　　　Ｇ　　 Ｆ？、　　　Ａ　　　Ｎ　　　Ｇ　　　Ｓ　　　Ｋ　　　Ｎ　　　入２４　　　 Ｇ　　　入　　ＮＫＳＧＮＡＲＦＩＧ、　７ 国際調査報告

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．所望の分析物と反応性を有する抗体を同定する方法であって， 該方法は次のａおよびｂを包含する： ａ）哺乳類の休止Ｂ細胞のレパートリーを表す抗体を分泌する永久増殖性細胞の 個々のコロニーの複数種を含むパネルを，ミモトープの混合物と反応させること ，ここで該ミモトープのメンバーは，該分析物との競合する，３次元的な電荷構 造と空間的構造の多様なセットを表している；およびｂ）該パネルから，分析物 が該ミモトープ混合物とうまく競合する抗体を生産する少なくとも１つのより小 さなサブセットを同定すること。
2. ２．請求項１に記載の方法を達成するのに有用なキットであって，該キットは， 永久増殖性細胞の個々のコロニーの複数種を含むパネル，基礎レパートリーを表 す抗体を分泌する，および３次元の電荷構造と空間的構造の多様なセットを表し ている多様なミモトープの混合物を包含する。
3. ３．請求項２に記載のキットであって，ミモトープ混合物が，設計された多種な ペプチドの混合物である。
4. ４．所望の分析物のミモトープを得るための方法であって，該方法は次のａ，ｂ ，ｃ，およびｄを包含する：ａ）哺乳類の休止Ｂ細胞のレパートリーを表す抗体 を分泌する永久増殖性細胞の個々のコロニーの複数種を含むパネルを，ミモトー プの混合物と反応させること，ここで該ミモトープのメンバーは，該分析物との 競合する，３次元的な電荷構造と空間的構造の多様なセットを表している；ｂ） 該パネルから，分析物が該ミモトープ混合物とうまく競合する抗体を生産する少 なくとも１つのより小さなサブセットを同定すること； ｃ）上記ｂ項で同定された抗体との反応性に対してミモトープのパネルをスクリ ーニングすること；およびｄ）該抗体と反応する少なくとも１つのミモトープを 同定すること。
5. ５．所望の分析物のミモトープを得るための方法であって，該方法は，分析物と 特異的に反応する抗体を用いて，３次的な電荷構造と空間的構造を最大限に多様 化したセットを有するメンバーを含有するミモトープのパネルをスクリーニング することを包含する。
6. ６．請求項１０の方法を達成するのに有用なキットであって，該キットは３次元 的な空間的構造と電荷構造の最大限に多様化したセットであるミモトープのパネ ル，および分析物に特異的な抗体を含有する。
7. ７．所望の分析物と特異的に強く反応する抗体を得るための方法であって，該方 法は以下のａ，ｂ，ｃおよびｄを包含する： ａ）請求項５の方法により得られた少なくとも１つのミモトープで被検体を免疫 すること；およびｂ）該被検体から抗体産生細胞の標本を得ること；ｃ）上記ｂ 項で得られた細胞を永久増殖化すること；および ｄ）分析物あるいはミモトープとの反応性について，該永久増殖化された細胞を スクリーニングすること。
8. ８．ミモトープの代表的な混合物を得るための方法であって，該方法は次のａ， ｂ，ｃ，ｄおよびｅを包含する：ａ）９から６０個のヌクレオチドの無作為のヌ クレオチド配列を包含する複数のＤＮＡ断片のセットを調製すること；ｂ）上記 のａ項の無作為なＤＮＡ断片を，ＡＴＧ開始コドンを有するリーディングフレー ム中に存在し，ペプチドをコードする付加的なＤＮＡに連結すること； ｃ）Ｎ端末あるいはＣ端末配列か保持されている融合タンパクをコードする遺伝 子を含む発現ベクターのセットが得られるように，ｂ項のＤＮＡを，宿主発現ベ クター中のコントロール配列を有する作動可能な結合の中に連結させること；ｄ ）上記ｃ項のベクターのセットを適切な宿主にトランスフェクトすること；およ び ｅ）発現させるのに適切な条件下でトランスフェクトされた宿主細胞を培養する こと。
9. ９．ミモトープのパネルを調製するための方法であって，該方法は，請求項８の トランスフェクトされた宿主細胞を限界希釈でプレートすることを包含する。
10. １０．それぞれのミモトープが３から１０個のアミノ酸のペプチドを含有するミ モトープの混合物であって，該混合物中のペプチドが，疎水性指数およびＰＩに 関して最大限に多様であり，そして該ペプチドが，必要に応じて疎水性モーメン ト，双極子モーメント，および波形因子に関してさらに，最大限に多様である， ミモトープの混合物。
11. １１．請求項１０に記載の混合物であって，該混合物は標識に接合している。
12. １２．請求項１０の混合物をコードするＤＮＡ配列の混合物。
13. １３．分析物を検出するためのキットであって，該キットは，固体支持体を包含 し，異なった度合で分析物と反応する複数の免疫グロブリンのパネルが，規則正 しい配列で該支持体に結合し，該差異は分析物の特徴的なプロフィールを提供す る。
14. １４．前記分析物と競合する標識されたミモトープをさらに包含する，請求項１ ３のキット。
15. １５．それぞれのミモトープが３から１０個のアミノ酸からなるペプチドを含有 するミモトープのパネルであって，混合物中のペプチドは疎水性指数およびｐｌ に関して最大限に多様であり，必要に応じて，該ペプチドが疎水性モーメント， 双極子モーメント，および波形因子に関してさらに最大限に多様である，ミモト ープのパネル。
16. １６．請求項１５のパネルのインバースイメージである抗体のパネル。
17. １７．特定の分析物を特徴づける方法であって，該方法は次のａ，ｂ，ｃ，ｄ， およびｅを包含する：（ａ）多様な抗体のパネルをミモトープの混合物の個々の 標識されたミモトープと連続して反応させること，ここで該ミモトープの混合物 は３次元構造の多様なセットを表し，該パネルの各抗体に関して，多様なミモト ープセットの各ミモトープについての結合プロフィールが得られる；（ｂ）該パ ネルの各抗体について多様なセットのすべてのミモトープについて結合シグナル を付与すること；（ｃ）上記ｂ項の工程の結合シグナルを規格化すること；（ｄ ）特徴づけられるべき，標識されていない分析物およびａ項の工程からの標識さ れたミモトープの多様なセットを該パネルの各抗体と競合的に反応させること； および（ｅ）分析物が該パネルの抗体に対する競合に成功した結果生じる，該パ ネルの各抗体に結合する混合標識ミモトープの減少量を決定すること。
18. １８．分析物と免疫反応性の多くの抗体の候補に包含される抗体と該分析物をマ ッチさせるための方法であって，該方法は次のａ，ｂ，ｃおよびｄを包含する： （ａ）ミモトープの最大限に多様なセットのインバースイメージである抗体のパ ネルを構築することであって，該パネルでは各抗体が，該ミモトープの１種と結 合し，該ミモトープの１種は，該セット中の他のミモトープの結合定数の少なく とも２０倍の結合定数を有する； （ｂ）上記ａ項のインバースイメージ抗体パネルのメンバーに対する該分析物の 結合度のプロフィールを得ること；（ｃ）該多様なセット中の各々のミモトープ によって，該多数の候補のセットに含有されている抗体の各々に対する結合度の プロフィールを得ること；および （ｄ）上記ｃ項で得られた，抗体の多数の候補のセットの各メンバーのミモトー プ結合プロフィールを，ｂ項で得られた分析物のインバースイメージ結合プロフ ィールとマッチさせること。
19. １９．分析物を該分析物と免疫反応性の抗体とマッチさせる方法であって，該方 法は次のａおよびｂを包含する：（ａ）すでに，抗体の候補のセット中の各抗体 を反応させたミモトープのパネルに対応するインバースイメージパネルと該分析 物を反応させること，および （ｂ）該分析物のインバースイメージでパネルとの反応性パターンを，候補のセ ットの抗体のミモトープパネルとの反応パターンとマッチさせること。