JPH07509778A - コラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの検出用のイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの検出用のイムノアッセイ 本発明はコラーゲンの抗体の産生のための抗原、このような抗原の生産方法、本 発明の抗原による免疫感作により得られるコラーゲンの抗体並びにコラーゲンの 検出のためのこのような抗体の使用に関する。

コラーゲンは、皮膚、軟骨及び骨の結合組織中の重要な構造タンパク質を代表す る。それぞれ３本の鎖を含む１１の型が知られている。それぞれの型は、αｌ、 Ｃ２およびＣ３と称される１〜３本の異なる鎖を含む（Ｅ、　Ｍｉ　１ｌｅｒら 、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　［！ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１４４における方法、構造 タンパク質および収縮性タンパク質、Ｌ、　Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、　Ａｃａｄ ｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、　１９８７．３−４１頁）。例えば、特定の骨ま たは軟骨中の特定の組織の成熟コラーゲンの特徴的な性質は、ヒドロキシリシル ピリジノリンまたはりシルピリジノリンによる隣接繊維の架橋である（ｏ、　Ｆ ｕｊｉｍｏｔＯら、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８３　（１９７８）。

８６３−８６７；　Ｄ、Ｅｙｒｅ　ら、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５ ３　（１９８４）、７１７−７４８およびり、Ｅｙｒｅ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１４４における方法（１９８７）。

１１５−１３９）。これらの架橋はコラーゲンの特異的検出のための生物マーカ ーとして利用し得る（Ｚ、Ｇｕｎｊａ−Ｓｍ１ｔｈら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ 、　１９７　（１９８１）、　７５９−７６２）。細胞外コラーゲンが分解され る場合、ＷＯ９１／１０１４１号明細書に記載されているようなヒドロキシリシ ルピリジノリンもしくはペプチド側鎖を含むリシルピリジノリン誘導体またはリ ノル残基もしくはヒドロキシリシル残基を有する遊離ピリジノリン誘導体が、血 液または尿の如き体液に侵入する。それ故、体液中のこれらの化合物の検出は、 例えば、骨粗しよう症において生じたり、また骨組織の腫瘍の結果として生じる ような細胞外コラーゲンの分解を示す。尿から単離し得る適当に架橋されたコラ ーゲンフラグメントによる免疫感作により得られたペプチド側鎖を有するヒドロ キシリシルピリジノリンまたはりシルピリジノリンの検出にっきＷｏ　８９／１ ２８２４号明細書にモノクローナル抗体が記載されていた。ＷＯ９１１０８４７ ８号明細書に記載された方法においては、コラーゲンは生体内で産生されたコラ ーゲンの天然の、即ち、架橋された分解生産物の抗体によっても検出される。

天然源から単離されたこれらのペプチドの欠点は、その試験において抗原または 結合パートナ−の再現可能な産生に信頼できる源がないことである。天然源から 単離されたペプチドの更に別の欠点は、感染性物質による汚染のリスクである。

特定の抗原は、例えば、抗原のエピトープに相当するペプチドの化学合成により 得られる。約７００−１５００　Ｄの分子量を有する小さいペプチドがこれに使 用される場合、免疫原作用を有する抗原を得るためにはキャリヤー分子への結合 が必要である。エピトープの構造は、このプロセスにおいてキャリヤー分子への 結合により変化してはならない。それ故、以前、キャリヤー分子へのカップリン グが、推定エピトープ領域から適当な距離にあるペプチド鎖の末端で行われてい る（ｔ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｃｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　、抗原としての合成ポリペ プチド、編集者Ｒ，Ｈ，ＢｕｒｄｏｎおよびＰ、Ｈ，ｖａｎ　Ｋｎｉｐｐｅｎｂ ｅｒｇ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　 ０ｘｆｏｒｄ　１９８８．　９５−１００頁）。

架橋コラーゲンの天然分解産物に相当する特定の抗原の化学合成における問題は 、架橋により生じるヒドロキシリシルピリジノリンまたはりンルピリジノリン構 造を化学合成することが従来可能ではなかったことである。

それ故、本発明の目的は、競合イムノアッセイにおけるコラーゲンまたはコラー ゲンフラグメントの抗体の特異的結合パートナ−として、またコラーゲンまたは コラーゲンフラグメントの検出のための競合イムノアッセイにおいて標準または 較正曲線を作成するための標準物質として使用するためのコラーゲンまたはコラ −ケンフラグメントの抗体の産生のための特定の抗原を提供することであった。

従来、試料中のコラーゲンまたはコラーゲン分解産物の検出のために、架橋結合 構造そのものまたはヒドロキシリシル残基もしくはリシル残基の架橋により生成 される所謂架橋ペプチドを検出することが必要であることが常に推定されていた 。何となれば、このヒドロキシリシルピリジノリンまたはりシルピリジノリン構 造はコラーゲンに特徴的であるからである。このような検出方法の例か、Ｗｏ　 ８９／１２８２４号、Ｗｏ　９１１０８４７８号、ＷＯ８９１０４４９１号およ びＷｏ　９１／１０１４１号に記載されている。

今、驚くことに、コラーゲンの非らせん線状Ｃ末端またはＮ末端領域の配列に相 当する合成線状ペプチドを含む特定の抗原、結合パートナ−または標準物質の使 用か上記の目的を達成するのに適することがわかった。イムノアッセイにおける 結合パートナ−として、標準物質として、または抗体産生の免疫原として、合成 線状ペプチドを使用することの利点は、これらのペプチドが、天然源からのペプ チドとは対照的に、正確に特定された構造で再現可能に生産し得ることである。

更に、このような短い合成ペプチドが使用されるイムノアッセイは、干渉に対す る低い感受性を示す。

それ故、本発明は、コラ−ケンの非らせんの線状Ｃ末端領域またはＮ末端領域の 配列に相当する合成線状ペプチドを含む結合パートナ−を、その合成線状ペプチ ドを結合できる抗体および試料でインキュベートし、そして結合パートナ−への 抗体の結合を適当な方法で測定することを特徴とする試料中のコラーゲンまたは コラーゲンフラグメントの検出のための競合イムノアッセイに関する。

更に、本発明は、コラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの検出のための競合 イムノアッセイにおいて標準または較正曲線を作成するための標準物質であって 、コラーゲンの非らせんの線状Ｃ末端領域またはＮ末端領域の配列に相当する合 成ペプチドを含む抗原を含むことを特徴とする標準物質に関する。

更にまた、本発明は、コラーゲンの非らせんのＣ末端領域またはＮ末端領域の配 列に相当する合成線状ペプチドを含むコラーゲンまたはコラーゲンフラグメント の抗体の産生のための抗原に関するものであり、また本発明はこの抗原を使用し て産生された抗体に関する。

コラーゲンの非らせんのＣ末端領域またはＮ末端領域の全ての連続アミノ酸配列 は、合成線状ペプチドとして適している。これらの領域は、Ｃｈｕら、　Ｎａｔ ｕｒｅ　３１０．３３７−３４０　（１９８４）、　Ｃ１１ｃｋら、・Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ飢４６９９−４７０６　（１９７０）、　Ｍｏｒｇａｎら、　 Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２４５、５０４２−５０４８　（１，９７０）およびＢｅｒｎａｒｄら、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２゜５２１３−５２２３　（１９８３）により知られ ている。５〜２５のアミノ酸、特に好ましくは８〜２０のアミノ酸を含むペプチ ドが使用されることが好ましい。この場合、その配列が架橋の領域を含むことは 必要で２はない。しかしながら、それはまた実際にこの領域と重なることもでき る。しかしながら、いかなる場合にも、合成ペプチド中にはヒドロキシリシルピ リジノリンまたはりシルピリジノリン架橋結合はない。コラーゲンのＣ末端領域 からの合成ペプチドが最も好適であることがわかった。何となれば、非らせんの Ｃ末端領域はコラーゲンの非らせんのＮ末端領域よりも大きいからである。

従って、この領域においては、Ｎ末端領域におけるよりもより可能性のあるエピ トープが利用できる。コラーゲンのαｌ鎖のＣ末端領域からの配列番号ｌ、２ま たは３に示された配列を有するペプチドが特に好適である。

コラーゲン分解産物の濃度は、骨溶解の程度に対する重要な診断マーカーである 。合成線状ペプチドの助けにより、コラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの 検出のための競合イムノアッセイを行うことが可能である。驚くことに、これら のペプチドはこれらのコラーゲンフラグメントの抗体に対し、天然試料、例えば 、血漿、血清または尿中で生じるコラーゲンフラグメントと非常に良く競合し、 従って、競合試験を可能にすることが判明した。

コラーゲンまたはコラーゲン分解産物のこのような抗体は、例えば、フィンラン ドのオリオン・ディアグノスチ力社（Ｏｒｉｏｎ　ＤｉａｇｎＯ５ｔｉＣａ　Ｃ ｏｍｐａｎｙ）からのテロペプチドＩＣＴＰ　［”Ｊ］ラジオイムノアッセイキ ットにおいて商業上利用できる。しかしながら、それらはまた本発明に従って合 成線状ペプチドにより産生じ得る。

競合イムノアッセイにおける適用につき、合成線状ペプチドは、固相に結合した 結合パートナ−として直接使用でき、またはそれは第二成分にカップリングして いてもよい。第二成分へのカップリングは、線状ペプチドのＮ末端アミノ酸お上 びＣ末端アミノ酸を介して達成されることが好ましい。必要により、更にスペー サーがペプチドと第二成分の間に挿入し得る。第二成分は、例えば、ペプチドを 固相に間接的にカップリングするのに利用できる。

この例は当業者には知られている。ペプチドはウシ血清アルブミンにカップリン グすることが好ましく、そしてそのカップリング生成物をプラスチック管の如き 固相に吸着結合させる。また、ペプチドはビオチンに共有結合し得る。次に、固 相への付着はアビジンまたはストレプトアビジンへの結合により達成され、これ は、順に、固相に結合されている。また、第二成分は、例えば、競合阻害免疫比 濁法（ＴＩＮＩＡ）において幾つかのペプチドのキャリヤーとして利用でき、こ の場合、幾つかのペプチドは、例えば、アルブミン、免疫グロブリン、β−ガラ クトシダーゼ、ＢＰ−Ａ−０５４５３５０に記載されているようなポリマー、例 えば、ポリリシン分子もしくはデキストラン分子またはラテックスの如き粒子に カップリングしている。３０〜４０のペプチド分子がそれぞれのキャリヤー分子 にカップリングされることが好ましい。また、ペプチドは、標識に相当する成分 にカップリングし得る。これらの試験のあらゆる変形の例が当業者に知られてい る。

試験操作において、抗体は試料および合成線状ペプチドを含む結合パートナ−と 同時に、または連続してインキュベートし得る。

続いて、結合された抗体または結合されていない抗体の量を通常の方法で測定す る。凝集試験、例えば、ＴＩＮＩＡ　、またはＦＰＩＡ　（蛍光偏光イムノアッ セイ）（Ｗ、　Ｄａｎｄｌｉｋｅｒら、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１２２（１９ ６５）、　１０２９）　、ＥＭＩＴ　（酵素多重イムノアッセイ）　（Ｇｕｎｚ ｅｒら。

“コンタクト（Ｋｏｎｔａｋｔｅ）ＩＩＩ”（１９８０）、　３−１１）および ＣＨＤＩＡ技術（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　３２　（１９８６）、１６３７−１６４１）が、例えば、結合された抗体ま たは結合されていない抗体の量を測定するための競合試験の変形として利用でき る。本発明のペプチドは抗体への結合に対して試料と競合する特定の結合ノ々− トナーとして使用するのに特に適していることがわかった。配列番号１１２また は３に示された配列を有する合成線状ペプチドが特に好ましい。

試料中の抗原の量の測定に相当する結合パートナ−への抗体結合の程度を測定し た後、試料中の抗原の正確な量を、同じ方法で処理された標準物質との比較によ り通常の方法で測定し得る。

天然物質から単離されたコラーゲン分解産物が、標準物質として使用し得る。し かしながら、これらは成る変化により自然に特性決定される。本発明の合成線状 ペプチドを含む抗原が、標準物質としてより適することがわかった。この標準物 質の抗原は単にこのペプチドを含むことができ、または、例えば、ペプチドの水 溶性を改良するのに利用できる好適なキャリヤーに力・ノブリングされたこのペ プチドを含むことができる。ペプチドの標準物質およびキャリヤーを生成するた めには、コラーゲンの非らせんのＣ末端領域またはＮ末端領域の配列に相当する 線状ペプチドを合成し、そして好適なカップリング方法によりそのＮ末端アミノ 酸またはＣ末端アミノ酸を介してキャリヤー分子に結合させる。一つまたは幾つ かのペプチドがキャリヤー分子に結合し得る。必要により、カップリングはスペ ーサーを介して達成し得る。凝集試験の如き一定の目的のために、特に、本発明 の抗原の助けにより産生されなかったポリクローナル抗体が試験に使用され、こ うして幾つかのエピトープを通常認識する場合には、異なる配列の本発明の幾つ かのペプチドをキャリヤー分子に結合することが有利であり得る。

コラーゲン分解産物の既に知られている抗体が、競合イムノアッセイにおいて抗 体として使用し得る。また、本発明の線状合成ペプチドを含む抗原の助けにより 得られた抗体も好適である。

免疫感作に関して、コラーゲンの非らせんのＣ末端領域またはＮ末端領域の一つ または幾つかの配列に相当する線状合成ペプチドは、好適なキャリヤータンパク 質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミンまたはエ デスチンに結合させる必要がある。

これらの抗原または免疫原を産生ずるために、線状ペプチドを最初に通常の方法 で化学合成する。続いて、合成ペプチドをマエインイミドーヘキサン酸−Ｎ−ヒ ドロキシスクシンイミドエステルによりＮ末端アミノ基を介して上記キャリヤー タンパク質にカップリングする。驚くことに、配列番号ｌ、２または３に示され た配列を有する合成線状ペプチドは、競合試験操作に適する抗体の産生に特に適 することが判明した。

コラーゲンの非らせんのＣ末端領域またはＮ末端領域の配列に相当する合成線状 ペプチドを含む本発明の抗原を使用して、本発明のペプチドを認識するだけでな く、体液中で生じるコラーゲンの分解産物をも認識する抗体を得ることが可能で ある。

それ故、本発明はまた、本発明の抗原による免疫感作そしてその免疫化された動 物の血清からの所望の抗体の既知の方法にょる単離によりコラーゲンまたはコラ ーゲンフラグメントの抗体の生産方法にも関する。所望の抗体は、キャリヤータ ンパク質、好ましくはセファロースにカップリングした配列番号ｌ、２または３ に示された配列を有するペプチドへの免疫吸着により単離することが好ましい。

本発明の好ましい主題は、本発明の抗原による免疫感作、免疫化された動物の膵 臓細胞の不死化、所望の抗体を産生ずるそれらの不死化膵臓細胞のクローニング そしてクローン化細胞またはこれらの細胞の培養上澄みからの抗体の単離によっ てコラーゲンまたはコラーゲンフラグメントのモノクローナル抗体を産生ずる方 法である。

免疫感作は、これに通常使用される動物中で行われる。マウスまたはウサギが使 用されることが好ましい。

免疫された動物の膵臓細胞は、当業者に良く知られている方法、例えば、ハイブ リドーマ技術（Ｋｏｈ　ｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ２５６ 　（１９７５）、　４９５−４９７）またはエプスタイン・バールウィルスによ る形質転換（ＥＢＶ形質転換）により不死化する。所望の抗体を産生ずるそれら の不活化された細胞を検出するために、培養上澄みの試料を免疫感作に使用され る本発明の抗原で通常のイムノアッセイにおいてインキュベートし、そして抗体 がこの抗原に結合するか否かを調べる。

加えて、本発明は本発明の方法により得られるポリクローナル抗体およびモノク ローナル抗体に関する。

これらのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は免疫感作に使用される 本発明のハブテンと反応するだけでなく、コラーゲン及び体液中に見られるコラ ーゲンの天然分解産物とも良く反応する。

それ故、本発明の抗体は、コラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの測定につ き上記した試験操作に使用し得る。

それ故、更に本発明は、本発明のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体 を組織試料でインキュベートし、そして抗体に結合しているコラーゲン分解産物 を測定することによる骨溶解の測定のためのその抗体の使用に関する。

本発明を配列表と組み合わせて下記の実施例により更に詳しく説明する。

配列番号ｌは、９のアミノ酸を含む本発明のペプチドの配列を示し、Ｘａａは任 意のアミノ酸を表す。

配列番号２は、１６のアミノ酸を含ε゛本発明のペプチドの配列を示す。

配列番号３は、１０のアミノ酸を含む本発明のペプチドの配列を示す。

配列表の配列番号２および３に示された配列を有するコラーゲンのアミノ酸配列 の部分配列を有するペプチドを、ａ）ラボルテック（Ｌａｂｏｒｔｅｃ）ＳＰ６ ４０ペプチド合成装置およびｂ）ジンサー・アナリティック（Ｚｉｎｓｓｅｒ　 Ａｎａｌｙｔｉｃ）ＳＭＰＳ３５０ペプチド合成装置によるフルオレニルメチル オキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成により調製する。

ａ）アセチル−３ｅｒ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　１ｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−５ｅｒ −Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇ　Ｉｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙ ｓ−アミド（配列番号２）の生産下記のＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体のそれぞれ４ ．０当量を記載の順序で使用する。

ｔｅｒｔ、ブチルオキシカルボニル保護基を有するＬｙｓｔｅｒｔ、ブチルエス テル保護基を有するＧｌｕＧｌｎ　側鎖保護基を有しないもの Ｐｒｏ　側鎖保護基を有しないもの Ｐｒｏ　側鎖保護基を有しないもの Ｇｌｎ　側鎖保護基を有しないもの Ｐｒｏ　側鎖保護基を有しないもの １、ｅｕ　側鎖保護基を有しないもの Ｐｈｅ　側鎖保護基を有しないもの Ｓｅｒ　ｔｅｒｔ、ブチルエステル保護基を有するもの１’ｈｅ　側鎖保護基を 有しないもの Ａｓｐ　ｔｅｒｍ、　ブチルエステル保護基を有するものＰｈｅ　側鎖保護基を 有しないもの ｃ＋ｙ　側鎖保護基を有しないもの Ａｌａ　側鎖保護基を有しないもの Ｓｅｒ　ｔｅｒｔ、　ブチルエステル保護基を有するものアセチル　無水酢酸 アミノ酸またはアミノ酸誘導体をＮ−メチルピロリドンに溶解する。

そのペプチドを０．８７　ミリモル／ｇの装填量で４−（２’　、　４’−ジメ トキシ−フェニル−ＦＤＩＯＣ−アミノメチル）−フェノキシ樹脂（Ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ　２８　（１９８７）、　２１０７）　３ｇで合成 する（ＪＡＣ３９５（１９７３）。

１３２８）。そのカップリング反応をＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体に関する反応媒 体としてのジメチルホルムアミド中で４．４当量のジシクロへキシルカルボジイ ミドおよび４．８当量のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いて６０分間に わたって行う。イソプロパツールで洗浄した合成樹脂をカイザー試験（Ａｎａｌ 、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３４　（１９７０）。

５９５）によりカップリング収率につき監視する。これが、その変換が未だ完結 していないことを示す場合、その変換を上記の条件下で再カップリングにより完 結させる。合成のそれぞれの工程後にＦｍｏｃ基をジメチルホルムアミド中の２ ０％のピペリジンにより２０分以内に開裂する。樹脂の装填量を遊離されたフル ベン基のＵｖ吸収によりそれぞれのピペリジン処理後に測定する。合成後に、装 填量は未だ０．６８ミリモル／ｇである。

合成樹脂からのペプチドの遊離および酸不安定保護基の開裂を室温で６０分以内 にトリフルオロ酢酸８０ｍ１．エタンジチオール５ｍｌ、フェノール２．５ｇ、 ｍ−クレゾール２．５ｍｌおよび水５ｍｌを用いて行う。

続いて、その反応溶液を減圧で濃縮する。残渣をジイソプロピルエーテルに吸収 させ、ｌ／２〜２時間激しく攪拌し、次に濾過する。次にその物質を、溶離剤と して０．５％の酢酸を使用してセファデックスＧ１５によるゲル透過クロマトグ ラフィーにより予備精製する。続いて、得られた組物質を濾過し、１００％の緩 衝液Ａ（水、０．１％のトリフルオロ酢酸）から１００％の緩衝液Ｂ　（６０％ のアセトニトリル、４０％の水、０．１％のトリフルオロ酢酸）へのグラジェン トを使用してヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）ＲＰｌＢ（カラム４゜ｍｍ　 ｘ　２５０ｍｍ、３００人、５μｍ）による分取ＨＰＬＣにより１２０分以内に 単離する。溶離物質の同一性を高速原子衝撃質量分光分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）に より調べる。

ｂ）Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒ ｏ−Ｇｉｎ（配列番号３）の生産 ペプチドを、アドバンスト・ケムテック社からの４−（２’　、　４’−ジメト キシ−フェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキン樹脂ＳＡ３０３０３０ｍ ｇで０．４７　ミリモルフｇの装填量を使用して調製した。下記のＦｍ０Ｃアミ ノ酸誘導体のそれぞれを、ジメチルホルムアミドＤＭＦ中の１４０μモルの１− ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびＤＭＦ中の１０ｇモルのＮ、Ｎ−ジイソプ ロピルカルボジイミドと一緒にそれぞれの時に１４０μモルのアミノ酸誘導体を 使用して固相に結合されている合成すべきペプチドに２回カップリングした。

Ｇｌｕ　トリチル保護基を有するもの Ｓｅｒ　ｔｅｒｔ、ブチル保護基を有するものＡｓｐ　ｔｅｒｔ、ブチル保護基 を有するものＰｒｏ　ｌ Ｌｅｕ　１ Ｐｈｅ　＞それぞれ、側鎖保護基を有しないものｒｙ　Ｉ Ａｌａ　ｌ カップリング期間は３０分および４０分であった。開裂期間は２０分であり、Ｄ ＭＦ中５０％のピペリジンの溶液を用いて行った。洗浄工程はＤＭＦを用いてそ れぞれの反応工程後に８回行った。溶媒を濾過により除去した樹脂を処理するこ とによりペプチドを遊離し、これをジクロロメタンおよびメタノールで洗浄し、 ９０％のトリフルオロ酢酸、３％のチオアニソール、３％のエタンジチオールお よび３％のチオクレゾールで２０分以内そして１４０分以内で洗浄した。生産物 を、溜めた濾液への冷ジイソプロピルエーテル１５ｍ１の添加により沈殿させ、 そして濾過により単離した。残渣を５０％の酢酸に溶解し、凍結乾燥した。ＨＰ ＬＣにより７９％の純度の白色凍結乾燥物８ｍｇを得た。同一性を質量ＦＡＢ− 分光分析法により確認した。

実施例２ ペプチドの活性化 実施例１ａ）により合成したペプチドをマレインイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミド（ＭＨ３）によるアシル化により活性化する。これに関し て、ペプチドｏ、ｉミリモルを０．１モル／ｌのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７ ，５２０ｍ１に溶解し、ジオキサン６ｍｌ中０．１　ミリモルのＶＨ３の溶液と 混合し、２０℃で２０分間攪拌する。

続いて、ｐＨ値を氷酢酸でｐＨ４に調節し、その反応混合物を直ちに凍結乾燥す る。凍結乾燥物を水５ｍｌに溶解し、１００％のＡ（水０．１％のトリフルオロ 酢酸）から１００％のＢ　（９９，９％のアセトニトリル０．１％のトリフルオ ロ酢酸）への溶離グラジェントを使用してウォーターズ・デルタ−バック（Ｗａ ｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ）　（商標）ＣＩ８カラム（１００人、１５μｍ 　５０　ｘ　３００　ｍｍ）にょる分取ＨＰＬＣにより精製する。

実施例３ 活性化ペプチドをキャリヤータンパク質にカップリングすることによる免疫原の 生産 キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）　、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ ）およびβ−ガラクトシダーゼ（βＧａ１）への活性化ペプチドのカップリング を記載する。実施例２に従って！ＩＩＨｓで活性化したペプチドをカップリング するために、キャリヤータンパク質は遊離ＳＲ基を有することが必要である。β Ｇａｌは天然状態でこれらを既に有しており、それ故、更なる前処理を必要とし ない。ＫＬＨおよびＢＳＡの場合、リシン残基のε−アミノ側鎖のＮＬ基をＮ− スクシンイミジル−８−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）による処理に より誘導体化し、こうしてＳＨ基に変換する。

こうして、天然状態と較べてＳＨ基の数が増加したキャリヤータンパク質を得る 。これに関して、５ＡＴＰ　１１３．５１ｍｇ　（ジオキサン１０ｍ１に溶解） を２０分以内に０．１モル／１のリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８゜５５００　ｍｌ 中のＫＬＨｌ、　３９ｇの溶液に滴下して添加する。２０℃で３０分間攪拌した 後、その反応溶液のｐＨ値を０．１モル／１の水酸化ナトリウム溶液でｐＨ値８ ．５に再度調節し、更に２４時間攪拌する。続いてその溶液をアミコンセル（膜 ＹＭＩＯ）の助けにより１００　ｍｌに濃縮し、それぞれの時にＯ１モル／ｌの リン酸カリウム緩衝液ｐｉ（８，５１０，０５モル／１の塩化ナトリウム３リツ トルに対し３×１０時間にわたって透析し、続いて凍結乾燥する。

Ｓ−アセチル保護基を開裂するために、ＫＬＨ−３ＡＴＰ凍結乾燥物４８１ｍｇ をＱ、１モル／ｌのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８，５１０，０５モル／１の塩化 ナトリウム２０ｍ１に溶解し、新たに調製した１モル／１のヒドロキシルアミン 溶液０．５ｍｌと混合し、２０℃で９０分間攪拌する。

水４ｍｌ中の実施例２から得られた活性化ペプチド７．２３モルを誘導体化され たキャリヤータンパク質に添加し、２０℃で２０時間攪拌する。続いて、その濁 った溶液を０．１モル／ｌのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８，５７０，０５モル／ １の塩化ナトリウム１リツトルに対し２回透析する。透析物を遠心分離し、透明 な上澄みをデカントし、凍結乾燥する。

実施例４ 線状フラグメントのポリクローナル抗体の産生５匹のヒツジをそれぞれの場合に 既知の方法で実施例３がらの免疫原で免疫化した。免疫原は、コラーゲン型Ｉの α鎖の配列中のアミノ酸番号８９２〜９０７に相当する配列番号２に記載された 配列を有するペプチドを含んでいた。ＫＬＨ又はβ−ガラクトシダーゼはキャリ ヤータンパク質として利用した。これらの動物を完全フロインドアジュバント中 の免疫原で１ケ月の間隔で免疫化した。投与量は動物および免疫感作当たり５０ ０μｇであった。血液試料を最初の免疫感作の４ケ月後に回収し、得られた抗体 をコラーゲンフラグメントとの反応につき試験した。

抗血清とコラーゲンフラグメントの反応を試験するためのＥＬＩＳＡ下記の物質 および試薬を使用した。

マイクロタイタブレート：　Ｍａｘｉｓｏｒｐ　Ｆｅ２、ヌンク社被覆緩衝液： 　５０ｍＭの炭酸ナトリウムＩ）８９．６０．１％のＮａＮ　３ インキュベーション緩衝液：　１０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７，４０．１％ のトゥイーン２０ ０．９％のＮａＣ１ １％のウシ血清アルブミン 基質溶液：　ＡＢＴＳ　（商標）、ベーリンガー・マンハイムＧｍｂＨ。

カタログＮｏ、　８５７４２４ ２ｍｇ／ｍｌのバニリンをその溶液に添加してシグナルを増幅した。

洗浄液：０．１％のトウイーン２０ ０．９％にＮａＣ１ タイタブレートのウェルを、被覆緩衝液中に１０μｇ／ｍｌのコラーゲンフラグ メントを含む溶液１００μｌでそれぞれ満たした。コラーゲンフラグメントをＥ Ｐ−Ａ−０５０５２１０号明細書中の指示に従ってプロテアーゼ消化により骨か らのヒトコラーゲンから生成した。振とうしながら室温で１時間インキュベート した後、それを洗浄液で３回洗浄した。

抗血清をインキュベーション緩衝液で１：４０００に希釈し、それぞれ１００μ ｍをマイクロタイタブレートのウェル中で室温で振とうしながら１時間インキュ ベートした。続いてウェルを洗浄液で３回洗浄した。

ホースラディツシュペルオキシダーゼとヒツジ１ｌｉＧのＦｃ部分のウサギ抗体 の接合体をインキュベーション緩衝液中１２．５　ｍｕ／ｍｌの濃度に希釈し、 マイクロタイタブレートのウェルを、その１００μｌでそれぞれ被覆する。室温 で振とうしながら１時間インキュベートシた後、そのタイタブレートを洗浄液で ３回洗浄する。

基質溶液ｌＯＯμｍを添加し、そして発色が目視できるようになるまて（１０〜 ６０分）インキュベートする。吸光度を４０５ｎｍおよび４９２ｎｍにおける示 差測定として記録する。

これらの動物の殆どの血清は固相でコラーゲンフラグメントとの強い反応を示し た。免疫化されていない動物の血清は、同じ条件下で弱い測定シグナルを示した にすぎなかった。結果を表１に示す。

表１ 競合試験による体液中のコラーゲンおよびその分解産物の測定９６ウエルマイク ロタイタプレートのウェルをＥＰ−Ａ　０３４４５７８号に従って４℃で一夜に わたってストレプトアビジン（ＰＢＳ中ｌμｇ／ｍ１の溶液１００μＩ）で被覆 し、未だ遊離している非特異的結合部位を室温で２時間にわたってＢＳＡ（ウシ 血清アルブミン、１０ｍｇ／ｍ１）３００μＩによるインキュベーションにより ブロックする。

実施例１ｂ）に従って合成した配列番号３に示された配列を有するデカペプチド を、Ｄ−ビオチニル−ε−アミドカプロン酸−Ｎ−スクシンイミドエステル（ベ ーリンガーマンハイム、カタログＮｏ。

１００８９６０）を使用して製造業者の指示に従ってアミノ末端でビオチニル化 する。ビオチニル化ペプチドをＰＢＳ　、０．０５％のトウイーン２０．１％の ＢＳＡに１０　ｎｇ／ｍｌの濃度で溶解し、ウェル当たり１００μｍの１時間の インキュベーションによりストレプトアビジン被覆マイクロタイタブレートに結 合する。続いて、未結合のペプチドをＰＢＳ　、　０．０５％のトゥイーン２０ て３回洗浄することにより除去する。

それぞれの場合、試験すべき試料１５０μｌ（血清、血漿または標準物質）を実 施例４に従って本発明の抗体１５０μｌを用いて３７°Ｃて２時間（または４℃ で一夜）インキュベートする。この混合物１００μｌをそれぞれの場合にマイク ロタイタブレートのウェル中の結合デカペプチドに添加し、３７°Ｃて６０分間 インキュベートする。このプロセスにおいて、試料とのインキュベーション後に 未だ結合されていない抗血清の過剰の抗体のみが固定化デカペプチドに結合し得 る。

ＰＢＳ　１０．０５％のトゥイーン２０て３回洗浄した後、結合抗体を抗つサキ ー１ｇＧ−ＰＯＤ接合体（ベーリンガーマンハイムＧｍｂＨ、カタログＮｏ、　 １２３８８５０）およびＡＢＴＳ　（商標）（１ｍｇ／ｍｌ）によるその後のイ ンキュベーションにより検出する。

１６４人の患者の血清を、本発明の試験（ＭＴＰ競合試験）を使用して測定した 。これらの結果を、ランオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用して測定したデータ と比較した。このＲＩＡ　ＩＣＴＰ　（フィンランドのオリオン・ディアグノス チカからのテロペプチドＩｃＴＰ　［１２’！］　）は、酵素的消化および生化 学方法により生成され、単離される架橋コラーゲンフラグメントをベースとする 。本発明の方法がＲＩＡ値と良く相関関係がある測定値を生じることが、今、図 １から明らかであり、これは、本発明の方法が臨床上意味のあるデータを生じる ことを意味する。０．９５９の相関係数を測定した。

ｒｔｑ、１／１ 補正書の写しく翻訳文）提出書 平成７年１月２７日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．コラーゲンの非らせんのＣ末端領域またはＮ末端領域の配列に相当する合成 線状ペプチドを含む結合パートナーを、合成線状ペプチドを結合できる抗体、お よび試料でインキュベートし、そして結合パートナーへの抗体の結合を適当な方 法で測定することを特徴とする試料中のコラーゲンまたはコラーゲンフラグメン トの検出のための競合イムノアッセイ。 ２．合成線状ペプチドがコラーゲンの非らせんのＣ末端領域の配列に相当する請 求項１に記載の方法。 ３．合成線状ペプチドが５〜２５のアミノ酸、好ましくは８〜２０のアミノ酸を 含む請求項１および２のいずれか一つに記載の方法。 ４．合成ペプチドが配列番号１、２または３に示された配列に相当する請求項１ 〜３のいずれか一つに記載の方法。 ５．コラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの検出のための競合イムノアッセ イにおいて標準曲線または較正曲線を作成するための標準物質であって、コラー ゲンの非らせんのＣ末端領域またはＮ末端領域の配列に相当する合成線状ペプチ ドを含む抗原を含むことを特徴とする標準物質。 ６．コラーゲンの非らせんのＣ末端領域またはＮ末端領域の配列に相当する線状 ペプチドを合成し、そして好適なキャリヤー分子にそのＮ末端またはＣ末端アミ ノ酸を介してスペーサーによりカップリングすることを特徴とする請求項５に記 載の標準物質の生産方法。 ７．コラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの抗体の産生のための抗原であっ て、コラーゲンの非らせんのＣ末端領域またはＮ末端領域の配列に相当する合成 線状ペプチドを含むことを特徴とする抗原。 ８．合成線状ペプチドが好適なキャリヤータンパク質にカップリングされる請求 項７に記載の抗原。 ９．コラーゲンの非らせんのＣ末端領域またはＮ末端領域の配列に相当する線状 ペプチドを合成し、そして所望によりスペーサーを介してそのＮ末端またはＣ末 端アミノ酸によりキャリヤータンパク質にカップリングすることを特徴とする請 求項７に記載の抗原の生産方法。 １０．請求項７または８に記載の抗原を免疫感作に使用することを特徴とするコ ラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの抗体の生産方法。 １１．請求項６または７に記載の抗原による免疫感作そして免疫化された動物の 血清からの所望の抗体の単離により、または免疫化された動物の脾臓細胞を不死 化し、所望の抗体を産生する不死化脾臓細胞をクローニングし、そしてそのクロ ーン化細胞もしくはそれらの培養上澄みから抗体を単離することにより得られる コラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの抗体。 配列表 （２）配列番号１の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：９アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：配列番号：１： 【配列があります】 （２）配列番号２の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１６アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２： 【配列があります】 （２）配列番号３の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３： 【配列があります】