HU221753B1 - Eljárás peptidészter elszappanosítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás peptidészterek vizes közegben, báziskéntvalamilyen fémvegyület jelenlétében történő elszappanosítására. Atalálmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy bázisként Li+ éshidroxid kerül alkalmazásra legalább 0,1 mol mennyiségben és akeletkezett szabad sav kompenzálására adott esetben egy segédbázistvagy egy pufferrendszert alkalmaznak. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás peptidészter elszappanosítására vizes közegben. A szakirodalomban már ismertetésre kerültek különféle eljárások a nevezett vegyületek elszappanosítására. Ilyen eljárás például az erősen savas vagy bázikus körülmények között enzimekkel végzett reakció (D. Seebach, Angew. Chem. 1990 102, 1363), vagy az ioncserélő gyantákkal végzett kezelés (W. Pereira, V. Close, W. Patton, B. Halpfem, J. Org. Chem. 1969, 34, 2032). Ezeken túlmenően észterszármazékok átészterezésére, illetve elszappanosítására leírtak már olyan eljárásf melynek során DBU amidinbázis került alkalmazásra oldatban (0110629 és 0150962 számú európai szabadalmi leírások), vagy pedig polimeren kötött állapotban (T. Ishikawa, Y. Oshumi, T. Kawai, Bull. Chem. Soc. Jpn. 1990,63, 819).

A J. Org. Chem. 38, (1973) 1223-1225 irodalmi közleményből ismert karbonsavak metil-észtereinek DBU-val végzett hasítása 165 °C hőmérsékleten és 48 órán át végzett reakcióval. Ezek a körülmények a legtöbb észterhasítási reakció számára túlságosan drasztikusak, ami különösen az olyan optikailag aktív észterekre nézve igaz, melyek az észtercsoporthoz képest α-helyzetben egy királis centrummal rendelkeznek.

A CA 114,186011 (1991) és a Tetrahedron Letters 21, (1980) 1181-1184 szakirodalmi forrásokból pedig egy β-eliminálás vált ismertté, melyet DBU-val vagy DBN-nel végeznek. Miként a β-eliminálásoknál általában szokásos és e helyeken is említik, általában véve minden bázist, így akár kálium-hidroxidot is lehet alkalmazni. Általánosságban alkalmazható enyhe reakciókörülményeket azonban nem írtak le a szóban forgó irodalmi fonásművekben.

Az „Aminosáuren, Peptide, Proteiné”, Chemie Weinheim kiadó által gondozott szakkönyv 47. és ezt követő oldalain leírtakból ismert továbbá peptidek és proteinek lúgos hidrolízisére szolgáló eljárás Ba(OH)jvel, nagy nyomás alkalmazásával. Ennek az eljárásnak az a hátránya, hogy az aminosavak részlegesen vagy akár teljesen racemizálódnak.

Az enzimes oldószerek kivételével az eddig ismertetett összes eljáráshoz a szokásos esetekben magasabb hőmérséklet, extrém pH-értékek, valamint hosszú reakcióidő alkalmazása szükséges. Érzékeny észterszármazékokhoz, melyek például további funkcionális csoportokat hordoznak, illetve melyekben egy vagy több királis szénatom van - de különösen azokhoz a vegyületekhez, melyekben az észterfunkcióhoz képest a-helyzetben egy királis szénatom van - a nevezett módszerek éppen a reakciókörülmények miatt nem megfelelőek.

A jelen találmány feladata tehát egy olyan rendszer kidolgozása volt, amely peptidészterek elszappanosítására szolgál olyan enyhe reakciókörülmények között, hogy azt különösen optikailag aktív és biomolekulákhoz, így peptidekhez lehessen alkalmazni.

Meglepő módon azt találtuk, hogy egy amidinbázisnak valamilyen fémsóval, így lítium-hidroxiddal való kombinált alkalmazása a már említett peptidészterek elszappanosítását olyan nagy mértékben meggyorsítja, hogy még az érzékeny peptidésztereket is kíméletes körülmények között - vagyis alacsony hőmérsékleten és rövid reakcióidő alatt - sikeresen lehet elszappanosítani.

így például érzékeny peptidészterek a C-terminális helyzetű aminosavak α-szénatomján bekövetkező racemizálódás nélkül elszappanosíthatók. Emellett az oldalláncban lévő esetlegesen védett funkcionális csoportok, melyek nem tartalmaznak észterfunkciót, érintetlenek maiadnak.

Peptidszármazékok, előnyösen egy észter elszappanosítására, a találmány szerinti eljárás értelmében, rendszerint az alábbiakban ismertetett módon dolgozunk:

A peptidszármazékot feloldjuk vagy felszuszpendáljuk valamilyen oldószerben, ami előnyösen egy éter, igy THF vagy dioxán. Ezután tetszőleges sorrendben ehhez (1+, előnyösen 10-100 moláris mennyiségben) vizet, 1-10 moláris mennyiségben, előnyösen 1-4 moláris mennyiségben amidinbázist, például DBU-t vagy DBN-t és 0,1-20 moláris mennyiségben, különösen 2-10 moláris mennyiségben a fémvegyületet, előnyösen valamilyen lítium-, magnézium- vagy céziumsót adunk és mindezeket -20 °C és 65 °C közötti hőmérsékleten reagáltatjuk. Racemizálódásra érzékeny származékok reagáltatását előnyösen -20 °C-30 °C közötti hőmérsékleten és rövid reakcióidő alatt végezzük.

A fenti eljárás során fémvegyületként halogenideket, különösen bromidokathasználunk, de kloridokat is alkalmazhatunk, míg (különösen elszappanosításnál) a hidroxidok, a perklorátok, az acetátok, a szulfátok vagy a karbonátok használata előnyös. Átészterezési vagy alkoholízises reakcióhoz még a fémvegyületek alkoholátjai is alkalmasak. 4

A találmány szerint a feladatot a lítium-hidroxid alkalmazásával oldottuk meg egymagában, vagy pedig; egy másféle litiumsó és egy bázis - vagyis a reakcióol·* datban lítium- és hidroxidionok jelenléte - peptidészterek elszappanosítására alkalmazható. Ebben az esetben az elszappanosítani kívánt vegyületre vonatkoztatva 1,0-20, előnyösen 2-20 mólnyi lítium-hidroxid használatára van szükség. Amennyiben a lítium-hidroxid egy pufferrendszerben van, vagy pedig ha egy segédbázis van jelen, úgy a lítiumvegyületet már 0,1 mólnak megfelelő mennyiségben is alkalmazhatjuk. A keletkezett szabad savat azután egy segédbázis vagy a pufferrendszer semlegesíti, úgyhogy a reakcióoldat alkalikus jellege, ami az elszappanosításhoz szükséges, megmarad.

Az alábbiakban következő példák segítségével a találmányt közelebbről is megmagyarázzuk.

I. példa

Ac-D-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-OH

250 mg (0,223 mmol) Ac-D-Nal-D-p-CI-Phe-DPal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-OME 15 ml tetrahidrofuránnal készített szuszpenziójához 1 ml vizet és 1 ml vízben

II, 2 mg (0,468 mmol) lítium-hidroxidot adunk, majd a reakcióelegyet 4 órán át szobahőmérsékleten keveijük. Ennek utána nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálattal (HPLC) kiindulási anyagot már nem lehet kimutatni. A reakcióoldatot ekkor 1 normál sósavval pH=4 értékre megsavanyitjuk, a tetrahidrofüránt vá2

HU 221 753 Bl kuumban eltávolítjuk, a kapott maradékot 15 ml vízzel hígítjuk és leszivatjuk. Az anyagot 30 ml acetonitrilben forrón, 80 °C-on, digeráljuk, majd újból leszivatjuk és szárítjuk. így végül 220 mg (90%) Ac-D-Nal-D-p-CIPhe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-OH terméket kapunk, melynek tisztasága 98,5%-os, HPLC szerint. Az Ή-NMR-spektrumban a metil-észter jele 3,6 ppm-nél már nem volt kimutatható. Egyébként a spektrum megfelelt egy olyan összehasonlító spektrumnak, melyet független úton készített Ac-D-Nal-D-p-CI-Phe-D-PalSer-Tyr-D-Cit-Leu-OH vegyületről vettünk fel. A GCracemátteszt leucinra nézve szignifikáns racemizálódást nem mutatott (D-Leu: 0,5%).

2.példa

Összehasonlító vizsgálatok egy heptapeptidészter elszappanosítása esetén NaOH-dal, illetve LiOH-dal g (4,05 mmol) Ac-D-Nal-D-p-CI-Phe-D-PalSer(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-OME-t 180 ml THF/50 ml metanol oldatában szuszpendáljuk, majd 0 °C-ra való hűtés után 192 mg (8,1 mmol) 8 ml vízben oldott LiOHdal, illetve 8,1 ml 1 normál NaOH-dal elszappanosítjuk és ezután 4 napon át ezen a hőmérsékleten keveijük. Ezután HPLC-vel kiindulási anyag már nem volt kimutatható. A reakcióelegyet 1 normál HCl-dal kb. pH=5-re savanyítjuk, az oldószert vákuumban eltávolítjuk, a maradékot vízzel felvesszük, leszivatjuk és szárítjuk.

Ac-D-NaI-D-p-CI-Phe-D-Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)D-Cit-Leu-OH kitermelés LiOH-dal 4,3 g, illetve NaOH-dal 4,4 g.

Analitikai adatok: a) LiOH

HPLC (tisztaság FI%): 97,5% gázkromatográfiás racemátteszt: nincs jelentős racemizáció a hét aminosavnál 'H-NMR (500 MHz, DMSO): csekély szennyezés.

b)NaOH

HPLC (tisztaság FI%): 67,9% gázkromatográfiás racemátteszt: nincs jelentős racemizáció a NaI-on (L-rész kb. 6%) és a Leu-n (D-részkb.7%).

'H-NMR (500 MHz, DMSO): nagy mennyiségű melléktennék található.

Claims (5)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás peptidészterek vizes közegben, bázisként valamilyen fémvegyület jelenlétében történő elszappanosítására, azzal jellemezve, hogy bázisként Li⁺ és hidroxid kerül alkalmazásra legalább 0,1 mól mennyiségben és a keletkezett szabad sav kompenzálására adott esetben egy segédbázist vagy egy pufferrendszert alkalmazunk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve* hogy a fémvegyületet 0,1-20 közötti moláris mennyiségben alkalmazzuk.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fémvegyületet 2-10 közötti moláris mennyiségben alkalmazzuk.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás^ azzaljellemezve, hogy az eljárást -20 °C-tól +20 °C-ig terjedő hőmérséklet-tartományban valósítjuk meg.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,: hogy a peptidszármazékok elszappanosítását 30 °C-ig terjedő hőmérsékleten valósítjuk meg.