HU220069B

HU220069B - Karbonsavészterek, különösen peptidészterek átészterezése és másféle átalakítási reakciói egy amidinbázis és lítiumsó felhasználásával

Info

Publication number: HU220069B
Application number: HU9202315A
Authority: HU
Inventors: Karl Heinz Drauz; Matthias Kottenhahn; Thomas Müller; Dieter Seebach; Adrian Thaler
Original assignee: Degussa Ag.
Priority date: 1991-07-15
Filing date: 1992-07-14
Publication date: 2001-10-28
Also published as: US6090913A; CA2073818A1; EP0675101B1; CZ220292A3; HU221753B1; EP0523461A2; EP0523461B1; ATE148090T1; ES2097242T3; JPH05271104A; DE59209289D1; CZ286094B6; HU9202315D0; EP0523461A3; ATE165078T1; HUT61577A; HU0004999D0; DE4124283A1; EP0675101A1; DK0523461T3

Abstract

A találmány tárgya eljárás karbonsav-észterek, különösen peptid-észterek átészterezésére vagy hidrolízisére, vagy polimer hordozóhozkötött karbonsavak sav vagy észter formájában történő lehasításáraamidinbázis jelenlétében, amely abban áll, hogy a kívánt reakcióvégrehajtása során egy lítiumsót is alkalmaznak. A találmány szerintieljárás előnyösen alkalmazható érzékeny észterek kíméletes körülményekközötti átalakítására, és Merrifield-szintézisnél peptidek hordozórólvaló kíméletes lehasítására. ŕ

Description

A találmány karbonsav-észterek, különösen peptid-észterek valamilyen alkohollal vagy vízzel egy amidinbázis jelenlétében történő átalakítási eljárásaira, nevezetesen átészterezésére vagy hidrolízisére, vagy polimer hordozóhoz kötött karbonsavak sav vagy észter formájában történő lehasítására vonatkozik, melynek során egy lítíumsót is alkalmazunk.

A szakirodalomban már ismertetésre kerültek különféle eljárások a nevezett vegyületek átészterezésére. Ilyen eljárás például az erősen savas vagy bázikus körülmények között enzimekkel végzett reakció (D. Seebach, Angew. Chem., 1990,102,1363), a titanátokkal végzett reakció (D. Seebach, B. Weidmann, L. Widler, „Modem Synthetic Methods”, 1983), a KF/koronaéterrel végzett reagáltatás (B. Lejczak, P, Kafarski, J. Szewczyk, Synthesis, 1982, 412), az ioncserélő gyantákkal végzett kezelés (W. Pereira, V. Close, W. Patton, B. Halpfem, J. Org. Chem., 1969, 34, 2032) vagy a disztannoxánokkal történő reagáltatás (J. Otera, S. Ioka, H. Nozaki, J. Org. Chem., 1989, 54, 4013). Mindezeken túlmenően észterszármazékok átészterezésére és elszappanosítására leírtak már olyan eljárást, melynek során DBU amidinbázis került alkalmazásra oldatban (0 110 629 és 0 150 962 számú európai közrebocsátási iratok) vagy pedig polimeren kötött állapotban (T. Ishikawa, Y. Oshumi, T. Kawai, Bull. Chem. Soc. Jpn., 1990, 63, 819).

Amidinbázisok átészterezési célokra való alkalmazása az EP 0 110 629 Al számú közrebocsátási iratból vált ismertté. Az amidint ebben többnyire epoxidokkal támogatják. Különösen enyhe körülményeket, mint amilyenekre különösen az optikailag aktív biomolekulák reakcióinál van szükség, az említett publikációból nem lehet meríteni. Valamennyi példában egyszerű és stabil, további funkcionális csoportokat nem tartalmazó, optikai aktivitással nem rendelkező vegyületeket írnak le.

Az Int. J. Peptide Protein Rés., 37, 1991, 451-456 közleményből ismertté váltak olyan átészterezési műveletek, melyek során kalcium-acetátot alkalmaztak metanolban. Szubsztrátumként túlnyomórészt csak C-terminális glicincsoportot tartalmazó peptideket használtak; az ilyen peptidek érzéketlenek a racemizálódással szemben. C-terminális alanilcsoport alkalmazása esetén a reakció már gátolva van. Ezen túlmenően a szóban forgó reakció nagyon specifikus védőcsoportokat kíván meg. Általában enyhének mondható, és különösen biomolekulák reakciójához megfelelő eljárás egyáltalán nincs ismertetve a kalcium-acetát használata miatt.

A J. Org. Chem., 38 (1973), 1223-1225 irodalmi közleményből ismert karbonsavak metil-észtereinek DBU-val végzett hasítása 165 °C hőmérsékleten és 48 órán át végzett reakcióval. Ezek a körülmények a legtöbb észterhasítási reakció számára túlságosan drasztikusak, ami különösen az olyan optikailag aktív észterekre nézve igaz, melyek az észtercsoporthoz képest ahelyzetben egy kiralitási centrummal rendelkeznek.

A CA 114,186011 (1991) és a Tetrahedron Letters, 21 (1980), 1181-1184 szakirodalmi fonásokból pedig egy β-eliminálás vált ismertté, melyet DBU-val vagy DBN-nel végeznek. Miként a β-eliminálásoknál általában szokásos és e helyeken is említik, általában véve minden bázist, így akár kálium-hidroxidot is lehet alkalmazni. Általánosságban alkalmazható enyhe reakciókörülményeket azonban nem írtak le a szóban forgó irodalmi fonásművekben.

Az enzimes módszerek kivételével az eddig ismertetett összes eljáráshoz a szokásos esetekben felemelt hőmérséklet, extrém pH-értékek, valamint hosszú reakcióidő alkalmazása szükséges. Érzékeny észterszármazékokhoz, melyek például további funkcionális csoportokat hordoznak, illetve melyekben egy vagy több királis szénatom van - de különösen azokhoz a vegyületekhez, melyekben az észterfunkcióhoz képest a-helyzetben egy királis szénatom van - a nevezett módszerek éppen a reakciókörülmények miatt nem megfelelők.

A jelen találmány feladata tehát egy olyan eljárás kidolgozása volt, amely karbonsav-észterek hidrolízisére vagy átészterezésére, valamint polimereken megkötött molekulák hasítására szolgál olyan enyhe reakciókörülmények között, hogy azt különösen optikailag aktív és biomolekulákhoz, így peptidekhez alkalmazni lehessen.

A fenti feladatot úgy oldottuk meg, hogy kombináltan egy amidinbázist és egy lítiumsót alkalmazunk karbonsav-észterek, különösen peptid-észterek átészterezésére vagy hidrolízisére vagy polimer hordozóról történő lehasítására, mint például Merrifield-szintézisnél.

Meglepő módon azt találtuk, hogy egy amidinbázisnak valamilyen lítiumsóval való kombinált alkalmazása a már említett észterek átészterezését vagy hidrolízisét olyan nagy mértékben meggyorsítja, hogy még az érzékeny észtereket is kíméletes körülmények között - vagyis alacsony hőmérsékleten és rövid reakcióidő alatt - lehet eredményesen reagáltatok így például érzékeny peptid-észterek a C-terminális helyzetű aminosavak α-szénatomján bekövetkező racemizálódás nélkül átészterezhetők vagy elhidrolizálhatók. Emellett az oldalláncban lévő, esetlegesen védett funkcionális csoportok, melyek nem tartalmaznak észterfúnkciót, érintetlenek maradnak. így például lehetséges volt egy heptapeptid-észtert DBU-val és lítium-bromiddal THF és víz elegyében rövid idő alatt, kvantitatív eredménnyel és racemizálódás nélkül elszappanosítani. A vizes nátrium-hidroxid-oldattal végzett hidrolízis ezzel szemben nem volt bomlástól mentes, és racemizálódáshoz vezetett.

Mindezeken túlmenően a találmány szerinti eljárás meglepő módon azt is lehetővé teszi, hogy valamilyen észtert, mint például metil-észtert egy komplex észterré, például mentil-észterré alakítsunk át.

Az újabb technika segítségével manapság polimer hordozókon lehet peptideket és polinukleotidokat szintetizálni (Merrifield-szintézis). A polimer hordozókhoz való kapcsolódás emellett a legtöbb esetben észter- vagy amidkötés. A hordozóanyagról történő lehasítás gyakran drasztikus reakciókörülményeket követel meg, és rendszerint a peptid vagy a polinukleotid esetlegesen védett funkcióinak valamennyi védőcsoportja tekintetében veszteségekkel jár. így lehasító reagensként szokásosan trifluor-ecetsav/HBr/TMS-trifluor-metánszulfonát,

HU 220 069 Β

Az amidinbázisok olyan szerves vegyületek, melyekben az alábbi képletnek megfelelő szerkezeti elem van:

HF/anizol, NaOH/dioxán/H₂O₂ vagy dimetil-amino-etanol/tallium-etanolát rendszert alkalmaznak. Ezen drasztikus körülményekkel ellentétben az amidinbázis/lítium reagens kombináció kiválóan alkalmas egy peptid vagy polinukleotid kötésének polimer hordozóról történő lehasítására. Emellett a lehasítás során bomlástól és racemizálódástól mentesen, választásunknak megfelelően a peptid vagy a polinukleotid észterét vagy a megfelelő szabad savat kaphatjuk meg.

Emellett a molekulában esetleg jelen lévő, további funkcionális csoportok nem bázislabilis védőcsoportjai érintetlenek maradnak. A találmány szerinti eljárás így különösen alkalmas érzékeny molekulák szabaddá tételére, valamint olyan védett peptidszegmensek polimer hordozón történő előállítására, melyek hosszabb peptidláncok további szegmenscsatolásához szükségesek. Mindezeken túlmenően a találmány szerinti eljárás további előnye, hogy az érzékeny és részben veszélyes reagensek, így a hidrogén-fluorid, tallium-etanolát és hasonlók alkalmazásától el lehet tekinteni.

Karbonsav-észterek átészterezése során a találmány szerinti eljárás értelmében szokásosan az alábbiakban leírt módon járunk el:

Az észtert valamilyen alkoholban oldjuk vagy szuszpendáljuk, esetleg egy további oldószer, mint például tetrahidrofurán (THF), metilén-diklorid (CH₂C1₂) és hasonlók hozzáadása mellett. Az így kapott oldathoz az amidinbázist, mint például DBU-t vagy DBN-t 0,01-10 mólnyi, előnyösen 0,2-4 mólnyi mennyiségben adjuk hozzá, a lítiumsót 0,1-20 mólnyi, előnyösen 2-10 mólnyi mennyiségben adjuk hozzá, és a reagáltatást -30 °C és 120 °C közötti, előnyösen -20 °C és 65 °C közötti hőmérsékleten végezzük. Racemizálódásra érzékeny észtereknél a reakciót -20 °C és 30 °C közötti hőmérséklettartományban, rövid (az éppen szükséges) reakcióidőt alkalmazva valósítjuk meg.

A rövid szénláncú alkoholok észtereinek komplexebb alkoholokkal történő átészterezésénél előnyös lehet, ha a felszabadult rövid szénláncú alkoholt a reakciólefolytatás közben desztillációs művelettel eltávolítjuk a rendszerből.

Karbonsav-észterek hidrolízisére a találmány szerinti eljárás értelmében rendszerint az alábbiakban ismertetett módon járunk el:

A karbonsav-észtert feloldjuk vagy felszuszpendáljuk valamilyen oldószerben, ami előnyösen egy éter, így például THF vagy dioxán. Ezután ehhez tetszőleges sorrendben hozzáadunk egynél több, előnyösen 10-100 mólnyi vizet, 1-10 mólnyi, előnyösen 1-4 mólnyi mennyiségben amidinbázist, például DBU-t vagy DBN-t és 0,1-20 mólnyi mennyiségben, előnyösen 2-10 mólnyi mennyiségben valamely lítiumsót, és mindezeket -20 °C és 65 °C közötti hőmérsékleten reagáltatjuk. Racemizálódásra érzékeny származékok reagáltatását előnyösen -20 °C és 30 °C közötti hőmérsékleten és rövid reakcióidő alatt végezzük.

A találmány szerinti eljárás során lítiumsóként halogenideket, különösen bromidokat, kloridokat alkalmazunk, de a perklorátok, acetátok, szulfátok vagy karbonátok használata is előnyös.

ahol a nitrogénatomok szabad vegyértékeihez előnyösen (különösen előnyösen valamennyihez) hidrogénatomok kapcsolódnak. A szénatom szabad vegyértékét előnyösen egy további hidrogénatom köti le, de ehhez a vegyértékhez például még egy további nitrogénatom is kapcsolódhat.

Amidinbázisként előnyösen egy nem nukleofil tercier bázist alkalmazunk. Különösen alkalmasak a biciklusos vegyületek, így az l,8-diaza-biciklo[5.4.0]undec7-én (DBU) vagy az l,5-diaza-biciklo[4.3.0]non-5-én (DBN). Az amidinbázisokat szokásosan 0,01-10 mólnyi mennyiségben alkalmazzuk a savszármazékra vonatkoztatva, a legjobb eredményeket a 0,2-4 mólnyi mennyiség használata eredményezi. Minthogy az észter hidrolízise során egy szabadsavcsoport keletkezik, az amidinbázist ebben az esetben legalább moláris mennyiségben kell alkalmazni, hacsak a savfunkciót egy további segédbázis, előnyösen valamilyen tercier bázis, mint például trietil-amin nem semlegesíti. A segédbázis emellett egy pufferrendszer is lehet.

A lítiumsót előnyösen 0,1-20 mólnyi, különösen előnyösen 2-10 mólnyi mennyiségben alkalmazzuk, mindig a savszármazékra vonatkoztatva. Lítiumsó helyett magnézium- vagy céziumsókat is használhatunk.

Az alábbiakban a találmányt - az oltalmi kör korlátozása nélkül - a példák segítségével közelebbről ismertetjük.

Általános módszerek karbonsav-észterek átészterezésére:

A) módszer: Lítium-bromidot (5 ekvivalens) és a megfelelő karbonsav-észtert (1 ekvivalens) száraz argongáz alatt feloldunk vagy szuszpendálunk a megfelelő mennyiségű, kívánt, abszolút alkoholban úgy, hogy az oldat vagy szuszpenzió 0,2-0,3 M koncentrációjú legyen. Ehhez frissen desztillált DBU-t (0,5 ekvivalens) adunk, és az oldatot szobahőmérsékleten keveijük. A reakció lefolyását vékonyréteg-kromatográfiás vagy gázkromatográfiás módszerrel követjük. Amikor további átalakulást már nem észlelünk, a reakcióelegyet forgó, bepárló berendezésben, vákuum alatt betöményítjük, és telített vizes ammónium-klorid-oldattal vagy IN sósavoldattal hidrolizáljuk. A terméket kétszer dietil-éterrel kirázzuk, az egyesített szerves frakciókat ezután nátrium-kloridoldattal semleges kémhatás eléréséig mossuk, majd nátrium-szulfáton szárítjuk. Az oldószer vákuumban történő eltávolítása után kapott nyersterméket desztillálással vagy gyorskromatografálással tisztítjuk.

B) módszer: Költségesebb alkoholok esetén a lítiumbromidot, a megfelelő metil-észtert, valamint a sztöchiometrikus vagy ezt kissé meghaladó mennyiségű alkoholt (1-2 ekvivalenst) az A) módszernek megfelelően tetrahidrofurán-metilén-diklorid (3:1, v/v) elegyben felold3

HU 220 069 Β juk. Ezután a reakcióelegyet száraz argongáz alatt viszszafolyatás közben forraljuk, miközben a felszabaduló metanolt 5 Á molekulaszitában felfogjuk, amely egy csepegtetőtölcsérben vagy a lombik és a visszafolyató hűtő közé beiktatott extraktorban van. A reakció lefolyását az A) módszernél leírtak szerint követjük, és az anyag feldolgozását is ennek megfelelően végezzük.

Általános módszer peptid-észterek feldolgozására:

A reakcióelegyet 200 ml etil-acetáthoz adagoljuk (150 ml etil-acetát egy másik adagolótölcsérben van), a kivonatot egymást követően 100 ml, majd 50 ml 1 N sósavval, 100 ml 1 mólos kálium-hidrogén-karbonát-oldattal, 50 ml 1 mólos kálium-hidrogén-karbonát-oldattal, majd két ízben 50 ml vízzel mossuk, ezt követően magnézium-szulfát felett szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A maradékot több órán át, csökkentett nyomás alatt szárítjuk.

1. példa

Fenil-ecetsav-metil-észter átészterezése fenil-ecetsav-etil-észterré

Az A) módszernek megfelelően fenil-ecetsav-metilésztert (4,51 g, 30 mmol) és lítium-bromidot (13,03 g, 150 mmol) etanolban (150 ml) oldunk. Ehhez DBU-t (2,28 g, 15 mmol) adunk hozzá, és a reakcióelegyet szobahőmérsékleten egy óra hosszat keveqük. Ezt követően hidrolizáljuk, és a már leírt módon feldolgozzuk. Vákuumdesztillációval 4,40 g (az elméletire számítva 90%-os kitermelés) tiszta fenil-ecetsav-etil-észtert kapunk, melynek forráspontja: 65,5-66 °C/133 Pa.

2. példa

Fenil-ecetsav-metil-észter átészterezése fenil-ecetsav-(R)-mentil-észterré

A B) módszernek megfelelően fenil-ecetsav-metilésztert (751 mg, 5 mmol), lítium-bromidot (2,17 g, 25 mmol) és (R)-(-)-mentolt (751 mg, 5 mmol) feloldunk tetrahidrofurán-metilén-diklorid (3:1 v/v, 20 ml) elegyben. Ehhez DBU-t (0,37 ml, 2,5 mmol) adunk hozzá, és a reakcióelegyet több órán át, visszafolyatás közben forraljuk. A vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat (szilícium-dioxid; pentán-dietil-éter 4:1 v/v elegy) azt mutatta, hogy az átészterezés 24 óráig tartó visszafolyatás közben végzett forralás után még nem volt teljes. Ennek ellenére a reakcióelegyet hidrolizáljuk és feldolgozzuk. Gyorskromatográfiás eljárással (szilícium-dioxid; pentán-dietil-éter 4:1, v/v elegy) 691 mg (50%-os kitermelés) fenil-ecetsav-(R)-mentil-észtert kapunk, lényegében véve tiszta olaj formájában, Ή-NMR-vizsgálat szerint.

3. példa

Fenil-ecetsav-metil-észter átészterezése fenil-ecetsav-2-trimetil-szilil-etil-észterré

A B) módszernek megfelelően fenil-ecetsav-metilésztert (751 mg, 5 mmol) 2-trimetil-szilil-etanollal (1,18 g, 1,43 ml, 10 mmol) tetrahidrofurán-metiléndiklorid (3:1 v/v, 20 ml) elegyben, visszafolyatás közbeni forralás után a reakcióelegyet hidrolizáljuk és feldolgozzuk. GC- és Ή-NMR-vizsgálat szerint kvantitatív kitermeléssel megkapjuk a nyersterméket, lényegében véve tiszta állapotban (>99% GC szerint).

4. példa

Rac-(4RS,5SR)-5-izopropil-2-oxazolidinon-4-karbonsav-etil-észter (3b) előállítása Rac-(4SR,5RS,8SR)-l-aza-3,7-dioxa-4-(2’-propil)8-(terc-butil)-biciklo[3.3.0]oktán-2,6-diont (302 mg, 1,25 mmol) és lítium-bromidot (543 mg, 6,25 mmol) etanolban (30 ml) oldunk. Ehhez DBU-t (0,37 ml, 2,5 mmol) adunk hozzá, és a kapott oldatot szobahőmérsékleten 2 órán át keveqük. Savas hidrolízis és a szokásos feldolgozás után gyorskromatografálással (szilícium-dioxid; metilén-diklorid-etil-acetát 4:1 v/v elegy) 192 mg (76%-os kitermelés) 3b jelű anyagot kapunk színtelen, viszkózus olaj alakjában.

5. példa

Boc-Phe-Ala-OEt előállítása

Boc-Phe-Alá-OMe (701 mg, 2 mmol) és lítiumbromid (869 mg, 10 mmol) etanollal (10 ml) készített oldatához szobahőmérsékleten DBU-t adunk (150 μΐ, 1 mmol). A reakcióoldatot 6 percig tartó reagáltatás után 1 N sósavval (3 ml) kezeljük és a fentiekben leírt módon feldolgozzuk.

A kitermelés: 700 mg (96%), melyben ~2% kiindulási anyag (’N-NMR) és 4%-nyi D-Ala (GC) rész van.

6. példa

Boc-Phe-Ala-OCHMe₂ előállítása

Boc-Phe-Ala-OMe (701 mg, 2 mmol) és lítiumbromid (869 mg, 10 mmol) izopropanolban (10 ml) történő feloldása után -10 °C hőmérsékleten az oldathoz DBU-t (150 μΐ, 1 mmol) adunk. Az említett hőmérsékleten történő 44 órás keverés után a reakcióelegyet híg sósav-dietil-éter (3 ml) eleggyel kezeljük, és a fentiekben leírt módon feldolgozzuk.

A kitermelés: 664 mg (88%), 4% kiindulási anyag (H-NMR) és 4%-nyi D-Ala résszel (GC).

7. példa

Boc-Phe-Ala-OCH₂CH=CH₂ (7d) előállítása

Boc-Phe-Ala-OMe (701 mg, 2 mmol) és lítiumbromid (869 mg, 10 mmol) allil-alkoholban (10 ml) történő feloldása után az oldathoz 0 °C hőmérsékleten DBU-t (150 μΐ, 1 mmol) adunk. A reakcióelegyet 6 órán át 0 °C-on keveqük, majd híg sósav-dietil-éter (3 ml) elegyet adunk hozzá, és a fentiekben leírt módon feldolgozzuk.

A kitermelés: 686 mg (91%) gyengén barnás színű anyag (7d), amely 3% kiindulási vegyületet (Ή-NMR) tartalmaz, valamint 5%-nyi D-Ala (GC) is van benne.

8. példa

Peptidgyanta-alkoholízis,

Boc-Leu-Ala-Gly-Val-OMe (15b)

Boc-Leu-Ala-Gly-Val-(PS-Pam-gyanta) (15a) (300 mg, 0,168 mmol peptid) 3 ml 0,28 mólos metanolos lítium-bromid-oldattal (20 ml metanolban 487 mg lítium-bromid) készített szuszpenzióját szobahőmérsék4

HU 220 069 Β létén 15 percig keverjük, majd ehhez DBU-t (50 μΐ, 0,34 mmol) adunk. A reakcióelegyet 4 órán át szobahőmérsékleten végzett keverés után szűrjük, a gyantát etilacetáttal (~10 ml) mossuk, 1 N sósavval (~10 ml) kezeljük, és ezt követően két ízben etil-acetáttal (~10 ml) extraháljuk. A szerves kivonatokat egyesítjük, magnézium-szulfáttal szárítjuk, szűrjük, az oldószert elpárologtatjuk, és az anyagot igen nagy vákuumban szárítjuk. Mindezen műveletekkel 78 mg 15b jelű anyagot kapunk, ami kis mértékben D-Val szennyezést tartalmaz (1%, GC). Ennek további tisztítása gyorskromatografálással (5% metanol dietil-éterben) és ezt követően igen nagy vákuumban végzett szárítással történik, melynek eredménye 66 mg (83%) fehér színű por, 71-72 °C olvadásponttal (15b).

9. példa

Peptidgyanta-hasítás,

Boc-Leu-Ala-Gly-Val-OH (15c) előállítása Boc-Leu-Ala-Gly-Val-(PS-Pam-gyanta) (15a) (150 mg, 0,093 mmol peptid) tetrahidrofürános (1,8 ml) és vizes (0,2 ml) lítium-bromid-oldattal (40 mg, 0,46 mmol) készített szuszpenzióját szobahőmérsékleten 15 percig keverjük, majd ehhez DBU-t (7 μΐ, 0,047 mmol) adunk. A reakcióelegyet 4 órán át szobahőmérsékleten végzett keverés után szűrjük, a gyantát etilacetáttal (~10 ml) mossuk, 1 N sósavval (~10 ml) kezeljük, és ezt követően két ízben etil-acetáttal (~10 ml) extraháljuk. A szerves kivonatokat egyesítjük, magnézium-szulfáttal szárítjuk, szűrjük, az oldószert elpárologtatjuk, és az anyagot igen nagy vákuumban szárítjuk. A kapott termék (81 mg) kissé szennyezett, a szenynyező anyag 1%-nyi D-Val (GC). A kitermelés meghatározása a nyerstermék Ή-NMR-vizsgálatával történt, belső standardként acetonitrillel; ennek értéke: 34 mg (81%). A nyersterméknek CH₂N₂-vel (diazo-metán) végzett észterezése a 15b jelű vegyülettel azonos terméket eredményezett 'H-NMR-spektrum szerint.

10. példa

Peptidgyanta-alkoholízis, Boc-Leu-Ala-Gly-Phe-Ome (16b) Boc-Leu-Ala-Gly-Phe-(PS-Pam-gyanta) (16a) (150 mg, 0,084 mmol peptid) metanolos (2 ml) lítiumbromid- (36 mg, 0,41 mmol) oldattal készített szuszpenzióját 15 percig 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd DBU-t (6,3 μΐ, 0,042 mmol) adunk hozzá. A reakcióelegyet ezután 8 óra hosszat 0 °C-on keverjük, szűrjük, a gyantát etil-acetáttal (körülbelül 10 ml) mossuk, 1 N sósavval (körülbelül 10 ml) kezeljük, és a fentiekben leírt módon (felényi oldószert alkalmazva) feldolgozzuk, így 64 mg 16b jelű anyagot kapunk színtelen olaj formájában, ebben 2% D-Phe (GC) van. A 16b anyagtartalmat a nyerstermék 'H-NMR-vizsgálatával határoztuk meg, belső standardként acetonitrilt alkalmazva; ennek értéke: 38 mg (86%). Gyorskromatográfiával történő további tisztítással (10% v/v metanol-dietil-éter elegy) és ezt követő 24 órás igen nagy vákuumban végzett szárítással 36 mg (82%) 16b jelű anyagot kapunk, fehér por formájában.

11. példa

Peptidgyanta-hasítás,

Boc-Leu-Ala-Gly-Phe-OH (16c) előállítása

Boc-Leu-Ala-Gly-Phe-(PS-Pam-gyanta) (16a) (150 mg, 0,084 mmol peptid) tetrahidrofurán-10% v/v víz elegyben levő lítium-bromid- (36 mg, 0,41 mmol) oldattal készített szuszpenziójához szobahőmérsékleten végzett, 15 percig tartó keverés után DBU-t (6,3 μΐ, 0,042 mmol) adunk. A reakcióelegyet 4 órán át, szobahőmérsékleten végzett keverés után szűrjük, a gyantát etil-acetáttal (körülbelül 10 ml) mossuk, 1 N sósavval (körülbelül 10 ml) kezeljük, és ezt követően két ízben etil-acetáttal (körülbelül 10 ml) extraháljuk. A korábban megadott módon végzett feldolgozással 96 mg szennyezett 16c terméket izolálunk, melyben a D-Phe részaránya: 2% (GC). A 16c részarányát a nyerstermékben Ή-NMR-vizsgálattal határoztuk meg, belső standardként acetonitrilt használva; ennek értéke: 40 mg (93%). A nyerstermék CH₂N₂-vel végzett észterezése 'H-NMR-spektrum szerint 16b vegyületet eredményezett.

12. összehasonlító példa

Boc-Phe-Ala-OEt előállítása

Boc-Phe-Ala-OMe átészterezésével Ca(OAc)₂ segítségével etanolban [Miranda et al.: Int. J. Pép. Prot. Rés., 37,451-456 (1991)]

1,7 g kalcium-acetátot oldunk és szuszpendálunk 200 ml vízmentes etanolban. 0,7 g (2 mmol) Boc-Phe-Ala-OMe-t adunk hozzá, és a reakcióelegyet 2 napon át, szobahőmérsékleten keverjük. Két nap után csak kiindulási anyagot lehet HPLC-vel kimutatni. Sőt néhány órás 40 °C-on végzett keverés után sem figyelhető meg konverziós reakció. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és a maradékot 100 ml etil-acetátban és 100 ml vízben felvesszük. Az etil-acetátos fázist alaposan mossuk 50 ml telített vizes NaHCO₃-oldattal és telített vizes NaCl-oldattal, majd nátrium-szulfáton szárítjuk. A szárítószert kiszűrjük, az oldószert vákuumban bepároljuk, és a maradékot nagy vákuumban (olajpumpa) szárítjuk, így 0,7 g szilárd anyagot kapunk, amely az 'H-NMR szerint a kiindulási anyagnak bizonyult.

Tehát ez az első összehasonlító példa azt mutatja, hogy Miranda et al. módszere szerint egyáltalán nem valósítható meg a Boc-Phe-Ala-OMe átészterezése Ca(Ac)₂-vel.

Ezzel szemben a Boc-Phe-Ala-OMe átészterezése etil-észterré a találmány szerinti eljárással, az 5. példában leírt módon, 96% hozammal szolgáltatja a kívánt etil-észtert.

13. összehasonlító példa

a) Z-Asn-Leu-OMe előállítása a találmány szerinti eljárással

0,81 g (2 mmol) Z-Asn-Leu-OEt-t feloldunk 25 ml vízmentes metanolban. Miután az oldatot lehűtöttük 0 °C-ra, 0,87 g (10 mmol) LiBr-ot és 0,15 ml (1 mmol) DBU-t adunk hozzá, és a reakcióelegyet ezen a hőmérsékleten, egy éjszakán át keverjük. Ezen idő elteltével kiindulási anyagot már nem lehet HPLC-vel ki5

HU 220 069 Β mutatni. Miután 1 ml 1 normál HCl-t adtunk az elegyhez, az oldószert vákuumban eltávolítjuk, és az olajos maradékot 100 ml vízzel teljes kikristályosodásig eldörzsöljük. A terméket nagy vákuumban szárítjuk. így 0,58 g (73,4%) fehér port kapunk, amely az ’H-NMRvizsgálat szerint az átésztereződött Z-Asn-Leu-OMe. Dietil-észtert nem lehetett sem HPLC-vel, sem Ή-NMR-vizsgálattal kimutatni. A gázkromatográfiás racemátteszt szerint a termékben a D-Leu mennyisége 1% (a kiindulásiban 0,45%), ami azt jelenti, hogy csak nagyon csekély mértékű racemizáció ment végbe a reakciókörülmények között.

b) Z-Asn-Leu-OMe előállítása Miranda et al. módszere (lásd fent) szerint (kalcium-acetát, metanol, 35 °C, 24 óra reakcióidő). Ezzel a reakcióval csak 13% metil-észtert kapunk (racemizációról nincs adat).

Tehát ez a második összehasonlító példa bemutatja a találmány szerinti eljárás előnyét a jóval magasabb kihozatalban (73,4%, szemben 13%-kal) Miranda módszerével szemben. Ráadásul azt találtuk, hogy gyakorlatilag nincs racemizáció.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás karbonsav-észterek, különösen peptidészterek átészterezésére vagy hidrolízisére, vagy polimer hordozóhoz kötött karbonsavak észter vagy sav formában történő lehasítására amidinbázis jelenlétében, azzal jellemezve, hogy a kívánt reakció végrehajtása során egy lítiumsót is alkalmazunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként karbonsav-észtert alkalmazunk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként peptid-észtert alkalmazunk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polimer hordozóhoz észter- vagy amidkötéssel kötött karbonsavat hasítunk le.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polimer hordozóról észter- vagy amidkötésben lévő peptidet hasítunk le.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy amidinbázisként egy N-szubsztituált, nem nukleofil tercier amidinbázist alkalmazunk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy amidinbázisként l,8-diaza-biciklo[5.4.0]undec-7ént (DBU) vagy l,5-diaza-biciklo-non[4.3.0]-5-ént (DBN) alkalmazunk.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az amidinbázist 0,01-10 mólnyi mennyiségben alkalmazzuk.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az amidinbázist 0,2-4 mólnyi mennyiségben alkalmazzuk.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lítiumsóként lítium-halogenidet alkalmazunk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lítium-halogenidként lítium-bromidot alkalmazunk.
12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lítiumsót 0,1-20 mólnyi mennyiségben alkalmazzuk.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lítiumsót 2-10 mólnyi mennyiségben alkalmazzuk.
14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kívánt reakciót -30 °C és +120 °C közötti hőmérsékleten valósítjuk meg.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a peptidek kívánt reakcióját -20 °C és 30 °C közötti hőmérsékleten valósítjuk meg.
16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kívánt reakciót egy további oldószer jelenlétében valósítjuk meg.
17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további oldószerként tetrahidrofuránt, metilén-kloridot vagy ezek elegyét alkalmazzuk.
18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás egy peptid polimer hordozóról sav formában történő lehasítására, azzal jellemezve, hogy a polimerhez kötött peptidet vízzel elhidrolizáljuk, és az amidinbázist és adott esetben egy további segédbázist legalább 1 mólnyi mennyiségben alkalmazzuk.