CZ286094B6

CZ286094B6 - Reesterifikace a jiné konverzní reakce derivátů kyseliny s amidinovou bází

Info

Publication number: CZ286094B6
Application number: CS19922202A
Authority: CZ
Inventors: Karl Heinz Dr. Drauz; Thomas Dr. Müller; Matthias Dr. Kottenhahn; Dieter Prof. Dr. Seebach; Adrian Dr. Thaler
Original assignee: Degussa Aktiengesellschaft
Priority date: 1991-07-15
Filing date: 1992-07-14
Publication date: 2000-01-12
Also published as: DE59207927D1; JPH05271104A; CA2073818A1; EP0523461A2; HU220069B; ES2097242T3; DE59209289D1; US6090913A; HUT61577A; EP0675101A1; DK0523461T3; EP0523461A3; HU221753B1; DE4124283A1; EP0675101B1; HU9202315D0; CZ220292A3; EP0523461B1; ATE148090T1; ATE165078T1

Abstract

Zmýdelnění se provádí s nejméně 0,1 molárním množstvím hydroxidu lithného jako báze, vztaženo na štěpící se ester. Kromě lithia se může použít sůl hořčíku nebo cézia. Sloučeninou kovu je bromid, chlorid, hydroxid, chloristan, octan, síran nebo uhličitan.ŕ

Description

Způsob zmýdelnění esteru aminokyseliny nebo esteru peptidu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu zmýdelnění esteru aminokyseliny nebo esteru peptidu ve vodném prostředí v přítomnosti sloučeniny kovu jako báze.

Dosavadní stav techniky

V literatuře byly popsány různé způsoby reesterifikace nebo zmýdelnění uvedených sloučenin. Při tom se pracuje například za silně kyselých nebo bazických podmínek, s enzymy /D. Seebach, Angew. Chem., 1990, 102, 13631/, a titanáty /D. Seebach, B. Weidmann, L. Widler v „Modem Synthetic Methods“, 1983/, s KF/korunovým etherem /B. Lejczak, P. Kafarski, J. Szewczyk, Synthesis 1982, 412/ a iontoměničovými pryskyřicemi /W. Pereira, V. Glose, W. Patton, B. Halpfem, J. Org. Chem. 1969, 34, 2032// nebo distanoxany /J. Otera, S. Ioka, H. Kozaki, J. Org. Chem. 1989, 54, 4013/. Dále byl popsán způsob reesterifikace popřípadě zmýdelnění derivátů esterů amidinové báze DBU v roztoku /EP 0 110 629, 0 150 962/ nebo polymemě vázané /T. Ishikava, Y. Ohsumi, T. Kawai, Bull. Chem. Soc. Jpn. 1990, 63 819/.

Z EP 0 110 629 Al je známo použití amidinové báze pro reesterifikaci. Amidin se zde nejčastěji podporuje epoxidy. Z tohoto spisu nelze seznat obzvláště mírné podmínky, které jsou nezbytné při reakci především opticky aktivních biomolekul. Ve všech příkladech se popisují jednoduché, stálé sloučeniny bez dalších funkčních skupin nebo optických aktivit.

Z Int. J. Peptide Protein Res. 37, 1991, 451—456 jsou známy reesterifikace za použití kalciumacetátu v methanolu. Jako substrát se nejčastěji používají pouze peptidy s C-terminálním glycinovým zbytkem. Takové peptidy jsou necitlivé vůči racemizaci. Při použití C-terminálního alanylového zbytku je reakce již inhibována. Kromě toho vyžaduje tato reakce zcela specifické chránící skupiny. Všeobecný mírný způsob reakce především biomolekul není použitím kalciumacetátu dán.

ZJ. Org. Chem. 38 /1973/, 1223-1225 je známo štěpení methylesterů karboxylové kyseliny sDBU při 165 °C po dobu 48 h. Takovéto podmínky jsou pro nejčastější štěpení esterů příliš drastické, to platí zejména pro opticky aktivní esteiy, které mají v α-poloze ke skupině esteru centrum chirality.

Z CA 114, 186011 /1991/ a Tetrahedron Letters 21 /1990/, 1181-1184 je známa β-eliminace s DBU nebo DBN. Jak je u β-eliminací všeobecně obvyklé a zde rovněž zmíněno, může se použít v principu téměř každá báze, například i kaliumhydroxid. Obecně použitelné mírné reakční podmínky nejsou ani zde popsány.

Všechny až dosud známé způsoby s výjimkou enzymatické metody vyžadují normálně zvýšené teploty, extrémní hodnoty pH a/nebo reakční doby. Pro citlivé deriváty esterů, které nesou například další funkční skupiny nebo mají jeden nebo několik chirálních atomů C, zejména pro takové sloučeniny, které mají v α-poloze k esterové funkci chirální atom C, je největší počet uvedených metod na základě reakčních podmínek nevhodný.

Úlohou předloženého vynálezu je proto způsob reakce, zmýdelnění a štěpení polymemě vázaných molekul, který má tak mírné reakční podmínky, že se mohou používat opticky aktivní sloučeniny a biomolekuly jako peptidy, aminokyseliny nebo nukleové kyseliny.

- 1 CZ 286094 B6

Podstata vynálezu

Tato úloha byla vyřešena způsobem zmýdelnění esteru aminokyseliny nebo esteru peptidu ve vodném prostředí pomocí báze, při kterém se zmýdelnění provádí s nejméně 0,1 molámím množstvím hydroxidu lithného jako báze, vztaženo na štěpící se ester.

Při zmýdelnění esterů peptidu se ukázalo, že se zde může štěpit i bez amidinové báze, již samotným lithiumhydroxidem za mírných podmínek.

S překvapením bylo zjištěno, že použití amidinové báze v kombinaci s kovovou solí urychlí tak velice zmýdelnění uvedených derivátů kyseliny, že se mohou nechat úspěšně zreagovat za šetrných podmínek, to znamená nízkých teplot a krátkých reakčních dob i citlivé deriváty kyseliny.

Podle výhodného provedení způsobu podle vynálezu se pracuje v přítomnosti sloučeniny kovu, vybrané ze solí lithia, hořčíku nebo cézia.

Sloučenina kovu se používá v 0,1 až 20 molámím množství, vztaženo na štěpící se ester.

Způsob se provádí při teplotě v rozmezí -20 °C až +65 °C.

Zmýdelňovat se mohou například citlivé estery peptidu bez racemizace na C-atomu C-terminální aminokyseliny. Při tom zůstávají případně chráněné funkčnosti bočních řetězců, které neobsahují žádnou funkci esteru. Tak bylo například možné zmýdelnit ester heptapeptidu s DBU/LiBr v THF/H2O při krátkých reakčních dobách kvantitativně a bez racemizace. Zmýdelnění neproběhlo naproti tomu s vodným NaOH bez rozkladu a racemizace.

Sloučeninou kovu je bromid, chlorid, hydroxid, chloristan, octan, síran nebo uhličitan.

Pro kompenzaci vznikající volné kyseliny se používá triethylamin.

Podle výhodného provedení způsobu podle vynálezu se používá hydroxid lithný v 1,0 až 20 molámím množství, vztaženo na štěpící se ester.

S překvapením je možné převést pomocí způsobu podle vynálezu jednoduše estery jako například methylester na komplexní ester, jako například methylester.

Pomocí novějších technik se dnes synthetizují peptidy a polynukleotidy na polymemích nosičích /Merrifieldova syntéza/. Spojení s polymemím nosičem tvoří při tom nejčastěji esterová nebo amidová vazba. Odštěpení od nosného materiálu vyžaduje často drastické reakční podmínky a vede zpravidla ke ztrátě všech chránících skupin popřípadě chráněných funkcí v peptidu nebo v polynukleotidu. Tak se jako běžná činidla pro odštěpování používají kyselina trifluoroctová/HBr/TMS-trifluormethansulfonát, HF/anisol, NaOH/dioxan/H₂O₂ nebo dimethylaminoethanol/thaliummethanolát. Oproti těmto drastickým podmínkám se hodí kombinace činidel amidinová báze/kovová sůl a zejména lithná sůl výborně ke štěpení vazby peptidu a polynukleotidu od polymemího nosiče. Při tom se mohou při odštěpení získat neštěpící se, neracemizující volitelné estery, amidy nebo odpovídající volné kyseliny peptidu nebo polynukleotidu.

Chrániči skupiny, které nejsou labilní vůči bázím, eventuelně další funkční skupiny v molekule, zůstanou při tom nedotčeny. Tato metoda se při tom hodí zejména pro uvolňování citlivých molekul, jakož i pro vytvoření chráněných segmentů peptidu na polymemím nosiči, které se

-2CZ 286094 B6 používají pro další kopulaci segmentu na delší řetězce peptidů. Obzvláště výhodné při tom dále je, že se může upustit od citlivých, zčásti nebezpečných činidel jako HF, TlOEt n.j.

Pro zmýdelnění derivátů kyseliny, s výhodou esteru se způsobem podle vynálezu pracuje obvykle následovně:

derivát kyseliny se rozpustí nebo suspenduje v rozpouštědle, s výhodou se používají ethery jako THF nebo dioxan. Po přídavku vody /1 +, s výhodou 10 až lOOnásobném molámím množství/, báze amidinu, například DBU nebo DBN, která se používá v 1 až 10 molámím množství, s výhodou 1 až 4 molámím množství, a přídavku kovové sloučeniny, s výhodou se používají sole lithia, hořčíku nebo cézia v 0,1 až 20 molámím množství, zejména 1 až 4 molámím množství, a přísadě kovové sloučeniny, s výhodou se přidávají sole lithia, hořčíku nebo cézia ve 2 až 10 molámím množství, se nechá zreagovat při teplotách -20 °C až 65 °C. Sled přídavků je libovolný. U derivátů citlivých na racemizaci se reakce provádí s výhodou mezi -20 °C až 30 °C při krátkých reakčních dobách.

Jako kovové sloučeniny se u výše uvedeného způsobu používají s výhodou halogenidy, zejména bromid nebo i chlorid /zejména při zmýdelňování/, hydroxid, chloristan, acetát, síran nebo uhličitan. Při reesterifíkaci nebo alkoholýze jsou vhodné i alkoholáty nebo sloučeniny kovů.

Amidinové báze jsou organické sloučeniny se strukturním prvkem přičemž volné valence atomů dusíku jsou spojeny s vodíkem a zejména /zejména všechny/ s atomy uhlíku. Volná valence na atomu uhlíku je s výhodou spojena s dalším uhlíkem, ale je možný například i další atom dusíku.

Jako amidinové báze se s výhodou používají nenukleofilní terciární báze. Obzvláště výhodné jsou bicyklické sloučeniny l,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en /DBU/ nebo l,5-diazabicyklo[4.3.0]non-5-en /DBN/. Amidinová báze se obvykle používá v 0,01 až 20 molámím množství vůči derivátu kyseliny. K lepším výsledkům vedla 0,2 až 4 molámí množství. Vzhledem k tomu, že při zmýdelnění esteru vznikne volná skupina kyseliny, musí se zde amidinová báze použít nejméně v molámím množství, když se funkčnost kyseliny nemá podpořit další pomocnou bází, s výhodou terciárním aminem, jako například triethylaminem. Pomocná báze může být přítomna i v pufračním systému.

Kovové sloučeniny, zvláště výhodné jsou lithné sole a dále hořečnaté a cézné sole, se používají obvykle v 0,1 až 20 molámím množství. Zejména výhodná jsou 2 až 10 molámí množství kovové sloučeniny, vždy vztaženo na ten který derivát kyseliny.

Při pokusech, které vedly k předloženému vynálezu, se ukázalo také, že se v některých případech může použít samotný lithiumhydroxid, nebo jiná lithná sůl a báze, takže v reakčním roztoku jsou přítomné lithné a hydroxidové ionty, pro zmýdelnění esterů aminokyseliny nebo esterů peptidů. Při tom je vhodné 1,0 až 20 molámí množství lithiumhydroxidu vůči sloučenině, která se má zmýdelnit. Jestliže je lithiumhydroxid přítomný v pufračním systému popřípadě je přítomna pomocná báze, pak se může používat lithná sloučenina již i v 0,1 molámím množství. Vznikající

-3CZ 286094 B6 volná kyselina se potom neutralizuje pomocnou bází a pufračním systémem, takže zůstane zachován alkalický charakter reakčního roztoku pro zmýdelnění.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Štěpení peptidu-pryskyřice, výroba Boc-Leu-Ala-Gly-Val-OH /15c/

Po suspendování Boc-Leu-Ala-Gly-Val-/PS-Pam-pryskyřice/ /15/ a /150 mg, 0,093 mmol peptidu/ v roztoku LiBr /40 mg, 0,46 mmol/ v THF /1,8 ml/ v roztoku LiBr /40 mg, 0,46 mmol/ v THF /1,8 ml/ a vodě /0,2 ml/ a míchání po dobu 15 minut při teplotě místnosti, byl přidán DBU /7 μΐ, 0,047 mmol/. Po 4 hodinovém míchání při teplotě místnosti byla reakční směs zfiltrována, pryskyřice byla promyta ethylacetátem /10 ml/, zpracována 1 N HC1 /10 ml/ a dvakrát extrahována ethylacetátem /10 ml/. Po usušení spojených organických extraktů sMgSO₄, filtraci a oddestilování rozpouštědla byla sušena při vysokém vakuu. Získaný produkt /81 mg/ byl mírně znečištěn podílem D-Val 1 % /plynová chromatografie GC/. Výtěžek byl určován pomocí ’Η-NMR na surovém produktu acetonitrilem jako vnitřním standardem: 34 mg /81%/. Esterifikace surového produktu CH₂N₂ vedla k produktu s ’Η-NMR spektrem odpovídajícím spektru 15 b.

Příklad 2

Štěpení peptidu pryskyřice, výroba Boc-Leu-Ala-Gly-Phe-OH /16c/

Po suspendování Boc-Leu-Ala-Gly-Phe /PS-Pam-pryskyřice/ /16a/ /150 mg, 0,084 mmolu peptidu/ v roztoku LiBr /36 mg, 0,41 mmol/ v THF /10 % obj/obj H₂O/ /2 ml/ se přidalo po 15ti minutovém míchání při teplotě místnosti DBU /6,3 μΐ, 0,042 mmol/. Po 4 hodinovém míchání při teplotě místnosti se reakční směs zfiltrovala, pryskyřice se promyla ethylacetátem /asi 10 ml/, zpracovala IN HC1 /asi 10 ml/ a dvakrát extrahovala ethylacetátem /asi 10 ml/. Po zpracování, jako výše, bylo izolováno 96 mg znečištěného 16c s podílem D-Phe 2% /plynová chromatografie GC/. Podíl 16c byl zjišťován pomocí ^lH-NMR u surového produktu s acetonitrilem jako vnitřním standardem ve výši 40 mg /93 %/. Esterifikace surového produktu CH₂H₂ poskytla ’Η-NMR spektrum odpovídající 16b.

Příklad 3

Ac-D-Nal-D-p-Phe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-OH

250 mg /0,233 mmolu/ Ac-D-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-OMe bylo suspendováno v 15 ml THF, suspenze byla doplněna 1 ml vody a roztokem 11,2 mg /0,468 mmolů/ LiOH v 1 ml vody a reakční směs se míchala 4 hodiny při teplotě místnosti. Pak již podle HPLC nebyl přítomen žádný adukt. Reakční roztok se pomocí 1 N kyseliny chlorovodíkové upravil na pH 4, ve vakuu se odstranil THF, zbytek se zředil 15 ml vody a odsál. Produkt byl digerován při 80 °C 30 ml acetonitrilu za horka, znovu odsát a usušen. Nakonec se získalo /220 mg /90 %/ Ac-D-Nal-D-p-Cl-Phe-D-Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-OH, podle HPLC s čistotou 98,5 %. V ’Η-NMR spektru nebyl signál methylesteru při 3,6 ppm již přítomný, jinak spektrum odpovídalo srovnávacímu spektru nezávisle vyrobenému Ac-D-Nal-D-p-Ci-Phe-D-Pal-Ser

-4CZ 286094 B6

Tyr-O-Cit-Leu-OH. Test na racemát prováděný plynovou chromatografii neukázal žádnou významnou racemizaci leucinu /D-Leu-0,5 %/.

Příklad 4

Amonolýza, výroba Boc-Phe-Ala-NH₂

Ve 30 ml suchého THF se rozpustí 300 mg /0,86 mmolů Boc-Phe-Ala-OMe a 274 mg /2,6 mmolů, 3 ekv./ a suspenduje se v něm 400 ml KF na A1₂O₃ /odpovídající 2,2 mmolů F7. Při 0 °C se nechá protékat suchý plynný NH₃. Po 24 h se adukt z největší části spotřebuje. ‘H-NMR poskytla podíl esteru asi 10%; chromatografii na tenké vrstvě nebyly zjištěny žádné vedlejší produkty.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob zmýdelnění esteru aminokyseliny nebo esteru peptidu ve vodném prostředí pomocí báze, vyznačující se tím, že se zmýdelnění provádí s nejméně 0,1 molámím množstvím hydroxidu lithného jako báze, vztaženo na štěpící se ester.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se provádí v přítomnosti sloučeniny kovu, vybrané ze solí lithia, hořčíku nebo cézia.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se sloučenina kovu používá v 0,1 až 20 molámím množství, vztaženo na štěpící se ester.
4. Způsob podle jednoho z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se provádí při teplotě v rozmezí -20 °C až +65 °C.
5. Způsob podle jednoho zpředcházejících nároků 2 až 4, vyznačuj ící se tím, že sloučeninou kovu je bromid, chlorid, hydroxid, chloristan, octan, síran nebo uhličitan.
6. Způsob podle jednoho zpředcházejících nároků, vyznačující se tím, že se pro kompenzaci vznikající volné kyseliny používá triethylamin.
7. Způsob podle jednoho zpředcházejících nároků, vyznačující se tím, že se používá hydroxid lithný v 1,0 až 20 molámím množství, vztaženo na štěpící se ester.