HU214059B

HU214059B - Process for producing pharmaceutical composition containing immunoglobulin a, immunoglobulin b and transferine, and the active components

Info

Publication number: HU214059B
Application number: HU9200925A
Authority: HU
Inventors: Johann Eibl; Martha Eibl; Yendra Linnau
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1991-03-25
Filing date: 1992-03-20
Publication date: 1997-12-29
Also published as: CA2063872A1; FI921309A0; EP0506651A3; CA2063872C; HU9200925D0; ATE144148T1; FI107779B; EP0506651A2; EP0506651B1; DE59207358D1; HUT60920A; AT402789B; FI921309A; JPH0570370A; ATA65191A

Abstract

(57) KIVONAT A találmány szerinti eljárással plazmaprőtein alapú, megnövelt mikrőbaellenes, gyűlladás ellenes és allergia ellenes hatású gyógyászatikészítményt állítanak elő őly módőn, hőgy I A-t és annak 1 tömegrészmennyiségére számítva 0,40–0,80 tömegrész IgG-t és 0,15–0,45 tömegrésztranszferrint – kívánt esetben az esetlegesen jelenlévő fertőzőanyagők inaktiválása és/vagy eltávőlítá a űtán – egy vagy több ismertgyógyászati segéd- és/vagy adalékanyaggal összekevernek és gyógyászatikészítménnyé elkészítik. A találmány tárgya tővábbá új eljárás akészítmény hatóanyagainak az előállítására őly módőn, hőgy egy IgA-t,IgG-t és transzferrint tartalmazó plazmafrakciót vagy plazmát – kívántesetben az esetleg sen jelenlévő fertőző anyagők inaktiválása és/vagyeltávőlítása űtán – aniőncserélővel hőznak érintkezésbe, azadszőrbeált IgA-t, IgG-t és transzferrint ismert módőn mőssák éselűálják, az elűátűmőt nem kívánt kísérő prőteinektől elválasztják, akapőtt, tisztítőtt IgA, IgG és transzferrin tartalmú őldatból az IgA-t, IgG-t és transzferrint kicsapják, a kicsapőtt IgA-t, IgG-t éstranszferrint elv lasztják, liőfilizálják, majd a fertőző anyagőkatinaktiválják. ŕ

Description

A találmány szerinti eljárással plazmaprotein alapú, megnövelt mikroba ellenes, gyulladás ellenes és allergia ellenes hatású gyógyászati készítményt állítanak elő oly módon, hogy IgA-t és annak 1 tömegrész mennyiségére számítva 0,40-0,80 tömegrész IgG-t és 0,15-0,45 tömegrész transzferrint - kívánt esetben az esetlegesen jelenlévő fertőző anyagok inaktiválása és/vagy eltávolítása után - egy vagy több ismert gyógyászati segédés/vagy adalékanyaggal összekevernek és gyógyászati készítménnyé elkészítik.

A találmány tárgya továbbá új eljárás a készítmény hatóanyagainak az előállítására oly módon, hogy egy IgA-t, IgG-t és transzferrint tartalmazó plazmafrakciót vagy plazmát - kívánt esetben az esetlegesen jelenlévő fertőző anyagok inaktiválása és/vagy eltávolítása után anioncserélővei hoznak érintkezésbe, az adszorbeált IgA-t, IgG-t és transzferrint ismert módon mossák és eluálják, az eluátumot a nem kívánt kísérő proteinektől elválasztják, a kapott, tisztított IgA, IgG és transzferrin tartalmú oldatból az IgA-t, IgG-t és transzferrint kicsapják, a kicsapott IgA-t, IgG-t és transzferrint elválasztják, liofilizálják, majd a fertőző anyagokat inaktiválják.

A leírás terjedelme: 5 oldal

HU 214 059 B

HU 214 059 Β

A találmány tárgya eljárás plazmaprotein alapú megnövelt mikroba ellenes, gyulladás ellenes és allergia ellenes hatású és széles hatásspektrumú gyógyászati készítmény és a hatóanyag előállítására.

Immunglobulinokon alapuló gyógyászati készítményeket eddig is alkalmaztak bakteriális és virális fertőzések megelőzésére és kezelésére. így például az US 4 35 099 számú szabadalmi leírás olyan szájon át alkalmazható készítményt ismertet, amely immunglobulin A-t (IgA-t) és immunglobulin G-t (IgG-t) tartalmaz és bélfertőzések kezelésére alkalmas. Ismeretes továbbá, hogy egy olyan immunglobulin készítmény, amelyben az össz-globulin 73%-a Igl, 26%-a IgA, koraszülötteken profilaktikusan alkalmazva képes arra, hogy csökkentse a nekrotizáló enterocolitis-ben való megbetegedés veszélyét [Eibl, Martha M. és társai: New Journal of Medicine, 319, 1-7.(1988.)].

Azt is kimutatták, hogy a szérum bakteriosztatikus hatást fejt ki a Staphylococcus aureus-ra, és ez a hatás a szérumban lévő sziderofilin (transzferrin) vastelítettségétől függ [Schade, Arthur L., Protides Biolog. Fluids, Proc. Colloq., 8., 261/263. (1961)]. Vassal dúsított szérummintát vizsgáltak, amely 1 tömegrész IgA-ra 15 tömegrész IgG-t és 2,6 tömegrész transzferrint tartalmazott, és azt találták, hogy a minta csak kevés kórokozóra hat.

Az összes ismert IgA tartalmú gyógyászati készítménynek viszonylag kicsi a hatásspektruma.

A találmány feladata, hogy olyan antimikrobiális hatású, plazmaprotein alapú gyógyászati készítményt biztosítson, amely széles hatásspektrummal rendelkezik. Ezenkívül e készítménynek gyulladás ellenes és allergia ellenes hatással kell rendelkeznie.

Azt tapasztaltuk, hogy egy IgA és IgG tartalmú készítménynek nemcsak a bakteriális és virális kórokozókkal szembeni hatásának erősségét, hanem a hatásspektrumát is meg lehet növelni, ha transzferrint is tartalmaz, és ha a három komponenst, az IgA-t, IgG-t és transzferrint a találmány szerinti tömegarányban tartalmazza. Ezek az arányok az anyatejben és a kolosztrumban lévő arányokhoz hasonlóak.

A találmány szerinti készítményt az jellemzi, hogy 1 tömegrész immunglobulin A-ra (IgA-ra) vonatkoztatva 0,40-0,80 tömegrész immunglobulin G-t (IgG-t) és 0,15-0,45 tömegrész transzferrint tartalmaz.

A találmány szerinti készítményben az IgA előnyösen olyan formában van jelen, amely az úgynevezett „szekretoros IgA”-t (secretory piece, Mestecky és McGhee, Advances in Immunology, 40. kötet, 156-157. oldal, 1987.) tartalmazza. Ez a protein képessé teszi az IgA-t arra, hogy a nyálkahártyán áthatoljon.

A találmány szerinti készítmény egy előnyös kiviteli alakját az jellemzi, hogy az alkalmazandó oldat milliliterenként 10-100 mg IgA-t, 4-80 mg IgG-t és 1,4—45 mg transzferrint tartalmaz.

A találmány szerinti gyógyászati készítmény előállítása során előnyösen úgy járunk el, hogy a komponensek összekeverése előtt egy vagy több inaktiváló lépést hajtunk végre, ahol ezekben a lépésekben a fertőző anyagokat, különösen a vírusokat inaktiváljuk, illetve eltávolítjuk. Fertőző anyagokon vírusokat, baktériumokat, viroidokat, gombákat stb. értünk, ezeket ismert módon, így kicsapással vagy szűréssel maktiválhatjuk, illetve távolíthatjuk el.

A találmány szerinti készítmény különösen a nyálkahártya fertőzések, főként a nektorizáló enterocolitis, gyulladások, valamint allergiák megelőzésére és gyógyítására alkalmas. Helyettesítheti ezenkívül az anyatejet a humorális immunitás átadásának funkciójában.

A találmány tárgyát képező eljárással tehát megnövelt mikroba ellenes, gyulladás ellenes és allergia ellenes hatású és széles hatásspektrumú gyógyászati készítményt állítunk elő oly módon, hogy hatóanyagként immunglobulin A-t (IgA) és annak egy tömegrész mennyiségére számítva 0,40-0,80 tömegrész IgG-t és 0,15-0,45 tömegrész transzferrint, ahol az említett komponenseket ismert módon vagy a találmány szerinti új eljárással állítottuk elő, mimellett az utóbbi esetben az egyes komponensek mennyiségét szükség esetén kiegészítettük kívánt esetben az esetlegesen jelenlévő fertőző anyagok inaktiválására és/vagy eltávolítására szolgáló kezelés után - egy vagy több ismert gyógyászati segéd- és/vagy adalékanyaggal összekeverünk és gyógyászati készítménnyé elkészítünk.

A találmány szerinti készítményhez, amint említettük, felhasználható a kereskedelemben kapható IgA és IgG és a szintén kereskedelmi IgA/IgG keveréket tartalmazó készítmény. Az IgA előállítását az US 4 335 099 számú szabadalmi leírás, az IgG előállítását az EP 0 122 909 számú szabadalmi leírás ismerteti. A transzferrint a Ann. Rév. Biochem., 49., 357. (1980) irodalmi helyen írták le és a Sigma Chemia GmbH gyártja és forgalmazza.

A találmány a készítményen kívül új, egyszerű és gazdaságos eljárást is nyújt az IgA, IgG és transzferrin együttes előállítására.

A találmány szerinti eljárás értelmében úgy járunk el, hogy egy IgA-t, IgG-t és transzferrint tartalmazó plazmafrakciót vagy plazmát - kívánt esetben az esetlegesen jelenlévő fertőző anyagok inaktiválására és/vagy eltávolítására szolgáló kezelés után - anioncserélővei hozunk érintkezésbe és így az IgA-t, IgG-t és transzferrint adszorbeáljuk, az ioncserélőn adszorbeált IgA-t, IgG-t és transzferrint ismert módon mossuk és eluáljuk, az eluátumot ismert módon kicsapással tisztítva a nem kívánt kísérő proteinektől elválasztjuk, így tisztított IgA, IgG és transzferrin tartalmú oldatot kapunk, az oldatot protein kicsapószerrel kezelve az IgA-t, IgG-t és transzferrint kicsapjuk, a kicsapott IgA-t, IgG-t és transzferrint elválasztjuk, - kívánt esetben az elválasztott IgA-, IgG- és transzferrin-tartalmú csapadékok egyesítése után - liofilizáljuk, majd a fertőző anyagok inaktiválása céljából kezeljük. A kapott terméket ismert módon orálisan, parenterálisan vagy helyileg alkalmazható gyógyászati készítménnyé dolgozzuk fel.

Kitűnt, hogy az említett előállítási lépések folyamán a kiindulási anyagban esetleg jelenlévő fertőző anyagok,

HU 214 059 Β például vírusok titetre csökken. Ez a hatás különösen akkor kifejezett, ha a találmány szerinti készítmény hatóanyagait az alábbiak szerint állítjuk elő:

a plazmát vagy a plazmafrakciókat Cohn-elj árással etanollal kezeljük és elválasztjuk a Cohn II+III frakciót, az elválasztott Cohn II+III frakciót vizes pufferrel, 5,0 és 6,5 közötti pH-értéken digerálva IgA, IgG és transzferrin tartalmú protein elegyet extrahálunk, az extrahált protein elegyhez etanolt adva kicsapjuk a nem kívánt kísérő proteineket, a kicsapott kísérő proteineket elválasztjuk, a kapott, IgA, IgG és transzferrin tartalmú oldatot

DEAE-ioncserélőre visszük, az adszorbeált IgA-t, IgG-t és transzferrint mossuk és nátrium-klorid oldattal eluáljuk, a kapott eluátumot kívánt esetben tisztítjuk, majd etanollal kezeljük és az IgA-t és IgG-t kicsapjuk, a kicsapott IgA-t és IgG-t elválasztjuk, így IgA és IgG tartalmú csapadékot és transzferrin tartalmú felülúszót kapunk, a felülúszót megsavanyítjuk és az így kicsapott transzferrint elválasztjuk, az elválasztott, IgA-, IgG- és transzferrin-tartalmú csapadékokat egyesítjük és kívánt esetben a fertőző anyagokat inaktiváljuk. A terméket gyógyászati készítménnyé alakíthatjuk.

A plazmafrakciókat a Cohn, Chemical Reivews, 28., (1941.) 395^117. irodalmi helyen leírt módon állítjuk elő. A kromatográfiás tisztítást a DE 39 27 111 számú szabadalmi leírásban részletesen ismertetett módon végezzük.

Amennyiben a kiindulási anyagban esetleg fertőző anyag van jelen, a találmány szerinti eljárás ezen változatával legalább 29 logaritmus egységet jelentő titercsökkenést érünk el.

Az alábbiakban a találmány szerinti készítmény előállítását és hatékonyságát részletesen ismertetjük, anélkül azonban, hogy ezzel a találmány oltalmi körét korlátoznánk.

Előállítás

1. példa

100 liter lefagyasztott humán plazmát felolvasztunk, a csapadékot (krioprecigpitátum) elválasztjuk és a felülúszóhoz (kriofelülőszó) -2 °C-on és 7,0 pH-értéken annyi etanolt adunk, hogy a koncentrációja 8% legyen. A kapott csapadékot elválasztjuk, majd a felülúszó etanol koncentrációját-5 °C-on 25%-ranöveljük. Az ekkor keletkező csapadékot (Cohn II+III frakció) foszfát-acetát pufferral extraháljuk, majd -2 °C-on 5,3 pH-értéken 12% etanolt adunk hozzá. Az ekkor keletkező csapadékot elválasztjuk. A felülúszót anioncserélővei - ilyen a DEAE-Sephadex anioncserélő - kezeljük 6,0 és 6,5 közötti pH-értéken az IgA, részben az IgG és a transzferrin adszorbeálása céljából. Más proteinek, például az albumin, szintén adszorbeálódnak.

A nem kötött proteineket foszfát-pufferrel, amely literenként 1,12 g Na₂HPO₄-2 H₂O-t tartalmaz és pH-értéke 6,0+0,1, végzett mosással távolítjuk el. Ennek a mosási lépésnek az intenzitásával befolyásolhatjuk a végtermékben az IgA IgG-hez viszonyított arányát. Ezután az adszorbeált proteineket foszfáttal pufferolt 3%os nátrium-klorid oldattal eluáljuk. A kapott oldathoz 6,4-6,5 pH-értéken, -3 °C-on 20% etanolt adunk, a kapott csapadékot eldobjuk és a felülúszó etanol koncentrációját 30%-ra növeljük, amikoris az IgA, IgG és transzferrin kicsapódik.

Ezt a csapadékot elválasztjuk, vízben feloldjuk és 6,5 pH-értéken és -5 °C-on az oldathoz 25% etanolt adunk. Az ekkor keletkező csapadékot, amely IgA-t, IgG- tartalmaz, elválasztjuk. A transzferrin oldatban marad és ha az oldat pH-ját 5,5-re állítjuk, kicsapódik.

Ezután a csapadékokban ismert módszerekkel meghatározzuk az IgA, IgG és transzferrin tartalmat, és a megfelelő mennyiségek elegyítésével beállítjuk a találmány szerinti összetételt, amikor is adott esetben az IgA-t, IgG-t és/vagy transzferrint kereskedelmi készítményekkel egészítjük ki és ezenkívül még a gyógyszergyártásban alkalmazott adalékanyagokat is hozzáadhatjuk.

Ezután az oldatot liofilizáljuk, vízzel megnedvesítjük és 10 órán át 60 °C-on hőkezeljük az esetleges előforduló kórokozók elölésére.

Annak érdekében, hogy a liofilizált, hőkezelt port felhasználásra alkalmassá tegyük, vagy nátrium-klorid tartalmú glükóz oldatban oldjuk, sterilre szűrjük és letöltjük, vagy orális alkalmazáshoz tablettázzuk vagy kapszulákba töltjük, amikor is a tablettákat és kapszulákat gyomomedvnek ellenálló réteggel kell bevonni.

2. példa liter humán plazmához literenként 140 g ammóniumszulfátot adunk, a pH-t 7,2-re állítjuk be. A csapadék elválasztása után az ammónium-szulfát koncentrációt 275 g/literre növeljük. Az ekkor kapott csapadékot 5 mmol/liter acetát pufferrel 5,0 pH-értéken feloldjuk, az oldhatatlan részt elválasztjuk és eldobjuk. A felülúszóból izoláljuk az IgA-t, IgG-t és a transzferrint, majd -5 °C-on és 6,6 pH-értéken 30% etanollal való kicsapással koncentráljuk.

A készítmény összetétele az alábbi:

IgA 63 mg/ml

IgG 28 mg/ml transzferrin 10 mg/ml

A vírus titer csökkentése

Annak szemléltetésére, hogy a találmány szerinti készítmény előállítása folyamán a kiindulási plazmában esetleg jelenlevő vírusok inaktiválása, illetve eltávolítása megtörténik, az 1. példában leírt eljárás lépéseit megismételtük úgy, hogy az eljárás minden egyes lépése előtt a mintában egy meghatározott vírus titert (HÍV) állítottunk be és a titert az illető lépés megvalósítása után meghatároztuk. Az eredményeket az 1. táblázatban foglaljuk össze.

I. lépés: Krioprocipitátum előállítása ml humán plazmához hozzáadunk 1 ml HIV-1 vírus szuszpenziót (vírus szuszpenzió I), amely 0,5 mlenként 10⁶ infektiv egységet tartalmaz. A szuszpenziót -20 °C-ra lefagyasztjuk és 0 —2 °C-on felolvasztjuk. A kapott csapadékot centrifugálással elválasztjuk. A felülúszóban (kriofelülúszó) meghatározott vírus titer

HU 214 059 Β

104 infektív egység volt. Az 1. lépésben tehát a vírus titer körülbelül egy tízes alapú kitevővel csökkent.

2. lépés: Frakcionálás 8% etanollal ml kriofelülúszóhoz hozzáadunk 0,6 ml vírus szuszpenzió I-et. Az elegy hőmérsékletét-1 °C és-2 °C között tartjuk és hozzáadunk 0,6 ml 96%-os etanolt (-20 °C), hogy 8%-os etanol koncentrációt kapjunk. A keletkezett csapadékot centrifugálással elválasztjuk. A felülúszóban a vírus koncentráció meghatározása 103 infektív egység/ml értéket adott, amely körülbelül 102 faktornak megfelelő csökkenést jelent.

3. lépés: Az albumin elválasztása az immunglobulinoktól

A 2. lépésben kapott felülúszó 8 ml-éhez hozzáadunk 10⁷ infektív egység/0,5 ml tartalmú HIV-1 vírus szuszpenziót (vírus szuszpenzió II). Az elegy hőmérsékletét -5 °C-on tartjuk és hozzáadunk 2,1 ml 96%-os etanolt, hogy 25%-os oldatot kapjunk. A keletkezett csapadékot centrifugálással választjuk el. Az 1 ml PBS-ben feloldott csapadékban nem lehetett vírust kimutatni, ami 10⁶ faktornak megfelelő csökkenést jelent.

4. lépés: Extrakció és kicsapás 12% etanollal

A 3. lépésben kapott csapadék 1 g-ját 30 ml foszfátacetát pufferben szuszpendáljuk. A szuszpenzió 10 miéhez hozzáadunk 1 ml vírus szuszpenzió I-et. Az elegyhez -22 °C hőmérsékleten hozzáadunk 1,6 ml 96%-os etanolt, így a végkoncentráció 12%-os lesz. A felülúszóban nem tudtunk vírust kimutatni, ami 10⁵ faktornak megfelelő csökkenést jelent.

5. lépés: Adszorpció, mosás, eluálás

A 4. lépésben kapott felülúszó 10 ml-éhez DEAESephadex ioncserélőt adunk 500 mg/g protein mennyiségben és 1 ml vírus szuszpenzió Π-t. Az elegyet -2 °Con keverjük és az adszorbeált anyagot elválasztjuk. A Sephadex-et mossuk, majd a proteineket eluáljuk. A mért vírus titer 10³ infektív egység/ml, ez 10³ faktornak megfelelő csökkenést jelent.

6. lépés: Kicsapás 20%> etanollal

Az 5. lépésben kapott eluátum 5 ml-éhez hozzáadunk 0,5 ml vírus szuszpenzió ΙΙ-t és 1,45 ml 96%-os etanolt. Az elegyet -2 °C-on keverjük és a csapadékot centrifugáljuk. A felülúszóban nem lehetett vírust kimutatni (csökkenés: 10⁶).

7. lépés: Kicsapás 30% etanollal

A 6. lépésben kapott felülúszó 5 ml-éhez hozzáadunk 0,5 ml vírus szuszpenzió ΙΙ-t és 0,83 ml etanolt. Az elegyet -5 °C hőmérsékleten keverjük, majd lecentrifugáljuk. A csapadékot 1 ml pufferben feloldjuk. Az oldatban nem lehetett vírust kimutatni (csökkenés: 10⁶).

A teljes vírus titer csökkenés (az eljárás 1-7. lépéseinek az összege) legalább 10²⁹ értéket tesz ki (lásd az 1. táblázatot).

1. táblázat Vírus titer csökkenés

Az eljárás lépései	Vírus titer Vírus titer (infektív egység/ml) a lépés	csökkenés
előtt	után
1.	10⁵	10⁴	10'
2.	10⁵	10³	10²
3.	10⁶	0	10⁶
4.	10⁵	0	>10⁵
5.	10⁶	10³	10³
6.	10⁶	0	>10⁶
7.	10⁶	0	>10⁶
Teljes vírus titer csökkenés		>29

3. példa

Az 1. példában kapott IgA, IgG és transzferrin csapadék megfelelő mennyiségeit elegyítjük, liofilizáljuk és hőkezeljük, majd nátrium-klorid-tartalmú glükóz-oldatban (10 tömeg% glükóz, 0,3 tömeg% nátrium-klorid) feloldjuk olyan mennyiségben, hogy az oldat milliliterenként 50 mg lg A-t, 30 mg IgG-t és 15 mg transzferrint tartalmazzon. Az oldat pH-ját 7,0±0,2 értékre állítjuk, az oldatot sterilre szűrjük és 2 ml-es adagokban üvegcsékbe töltjük. Az oldat 4 °C hőmérsékleten legalább 3 évig eltartható.

Baktériumok elleni hatékonyság

A találmány szerinti készítmény antibakteriális hatékonyságának vizsgálatához három oldatot (a, b és c) készítettünk a 2. táblázatban megadott összetétellel.

2. táblázat

Oldat	IgA	IgG	Transzferrin
a	50	30	15
b	25	20	11
c	90	40	15

(A számadatok mg/ml-t jelentenek)

Az a, b és c oldatból egyenként 3 ml-t kémcsövekbe mérünk és a csöveket 0,1 ml különböző baktérium szuszpenziókkal (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis és Candida albicans) oltjuk be. A csöveket összerázzuk, 2x0,1 ml-t Petii csészékbe pipettázunk. A csészéket tápagarral, illetve a Candida számára szójabab-kazein-agarral öntjük ki.

A telepeket 0,5,1,3,5 és 24 órás, 20-25 °C-on végzett inkubálás után megszámoljuk. Mindhárom készítmény (a, b és c) gátolta az öt baktérium növekedését. Csak a b oldat mutatott gyenge gátlást az E. coli növekedésére.

Összehasonlító vizsgálatot végeztünk az albumin, három IgA/IgG keverék és transzferrin hatására vonatkozóan. Az eredményeket a 3. táblázatban foglaljuk össze.

HU 214 059 Β

3. táblázat

Staph. E.coli Pseud. Bac. Cand. aur. aerug. subt. alb.

Albumin (50 mg) IgA (56 mg)

IgG (2 mg)

IgA (75 mg) +

IgG (26 mg)

IgA (3 mg)

IgG (100 mg) Transzferrin (56 mg)

Transzferrin (15 mg)

A számok jelentése: mg/ml oldat

-: a baktérium növekedés nem gátolt +: a baktérium növekedés gátolt

Vírusok elleni hatékonyság

A találmány szerinti készítmény vírusokra gyakorolt hatásának megállapítása céljából a fenti a) oldat 1-1 miéhez 0,1 ml HIV-, Sindbis- és VSV-vírus szuszpenziót adunk. A szuszpenziókat liofilizáljuk, majd megnedvesítve 10 órán át 60 °C-on zárt rendszerben melegítjük. A hőkezelés előtt és után meghatározzuk a vírus titert. Az eredményeket a 4. táblázatban foglaljuk össze.

4. táblázat
Vírus	Vírus kezelés előtt	titer 10 óra múlva
Sindbis	10⁵	<10°'⁵
VSV	10°·⁴	<10°⁵
HÍV	10⁴	<10°·⁵

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

1. Eljárás plazmaprotein alapú, mikroba ellenes, gyulladás ellenes és allergia ellenes gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként immunglobulin A-t (IgA) és annak 1 tömegrész mennyiségére számítva 0,40-0,80 tömegrész immunglobulin G-t (IgG) és 0,15-0,45 tömegrész transzferrint, ahol az említett komponenseket ismert módon vagy az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárással állítottuk elő, mimellett a két utóbbi esetben az egyes komponensek mennyiségét szükség esetén kiegészítjük - kívánt esetben az esetlegesen jelenlévő fertőző anyagok inaktiválására és/vagy eltávolítására szolgáló kezelés után - egy vagy több ismert gyógyászati segéd- és/vagy adalékanyaggal összekeverünk és gyógyászati készítménnyé elkészítünk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az IgA-t „szekretoros IgA”-t tartalmazó alakban alkalmazzuk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás alkalmazásra kész 5 oldat előállítására, azzal jellemezve, hogy 12 ml oldatra számítva 10-100 mg, előnyösen 45-55 mg IgA-t,

4-80, előnyösen 25-35 mg IgG-t és 1,5-45 mg, előnyösen 10-20 mg transzferrint összekeverünk és a szokásos adalékanyag(ok)kal oldatot készítünk.

10 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az összekeverés előtt inaktiváló lépést hajtunk végre, amelynek során a fertőző anyagokat inaktiváljuk és/vagy eltávolítjuk.

5. Eljárás az 1. igénypont szerinti készítmény ható15 anyagainak az előállítására, azzal jellemezve, hogy egy IgA-t, IgG-t és transzferrint tartalmazó plazmafrakciót vagy plazmát - kívánt esetben az esetlegesen jelenlévő fertőző anyagok inaktiválása és/vagy eltávolítása után - anioncserélővei hozunk érintkezésbe és így

20 az IgA-t, IgG-t és transzferrint adszorbeáljuk, az ioncserélőn adszorbeált IgA-t, IgG-t és transzferrint ismert módon mossuk és eluáljuk, az eluátumot ismert módon kicsapással tisztítva a nem kívánt kísérő proteinektől elválasztjuk, így tisztított IgA, 25 IgG és transzferrin tartalmú oldatot kapunk, az oldatot protein kicsapószerrel kezelve az IgA-t, IgG-t és transzferrint kicsapjuk, a kicsapott IgA-t, IgG-t és transzferrint elválasztjuk, - kívánt esetben az elválasztott IgA-, IgG- és transz30 ferrin-tartalmú csapadékok egyesítése után - liofílizáljuk, majd a fertőző anyagok inaktiválása céljából kezeljük.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy

35 a plazmát vagy a plazmafrakciókat Cohn-eljárással etanollal kezeljük és elválasztjuk a Cohn II+III frakciót, az elválasztott Cohn II+III frakciót vizes pufferrel, 5,0 és 6,5 közötti pH-értéken digerálva IgA, IgG és transzferrin tartalmú protein elegyet extrahálunk,

40 az extrahált protein elegyhez etanolt adva kicsapjuk a nem kívánt kísérő proteineket, a kicsapott kísérő proteineket elválasztjuk, a kapott, IgA, IgG és transzferrin tartalmú oldatot

DEAE-ioncserélőre visszük,

45 az adszorbeált IgA-t, IgG-t és transzferrint mossuk és nátrium-klorid oldattal eluáljuk, a kapott eluátumot kívánt esetben tisztítjuk, majd etanollal kezeljük és az IgA-t és IgG-t kicsapjuk, a kicsapott IgA-t és IgG-t elválasztjuk és így IgA és

50 IgG tartalmú csapadékot és transzferrin tartalmú felülúszót kapunk, a felülúszót megsavanyítjuk, az így kicsapott transzferrint elválasztjuk és az elválasztott, IgA-, IgG- és transzferrin-tartalmú

55 csapadékokat egyesítjük és kívánt esetben a fertőző anyagokat inaktiváljuk.