DE3844667A1

DE3844667A1 - Verwendung von transferrin zur bekaempfung der toxischen wirkung des endotoxins bei der endotoxinaemie

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Publication number: DE3844667A1
Application number: DE3844667A
Authority: DE
Inventors: Dietrich Dr Nitsche
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-12-15
Filing date: 1988-12-15
Publication date: 1990-06-21

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Transferrin als Therapeutikum zum Zwecke der Bekämpfung der toxischen Wirkung des Endotoxins, insbesondere bei der Endotoxinämie.

Transferrin ist ein Glykoprotein mit einem durchschnittlichen Moleku largewicht von 80 000 D. Es ist im menschlichen und tierischen Plasma in einer Konzentration von ca. 290 mg/dl (Normalbereich beim Menschen: 400 mg/dl - 200 mg/dl) vorhanden. Bisher wird als Hauptfunktion des Transferrins seine Fähigkeit angesehen, spezifisch dreiwertiges Eisen zu binden und zu transportieren, wobei es ein oder zwei Moleküle Eisen binden kann. Auf diese Weise wird das Eisen nach seiner Resorption im Dünndarm zu den Eisendepots in der Leber, in der Milz und zu den Retikulozyten im blutbildenden Gewebe transportiert.

Als einer weitere wichtige Funktion des Transferrins wird seine bakterio statische Eigenschaft angesehen (Martin CM, Jandl JH, Finland M; J. Infect. Dis. (1963) 112: 158-163; Fletcher J; Immunology (1971) 20: 493- 500). Eisen ist ein wesentlicher Wachstumsfaktor für die Bakterien. Durch die Komplexbildung des Eisens mit dem Transferrin wird die Konzentration an freiem Eisen im Plasma unter dem Wert gehalten, der für das Wachstum der Bakterien erforderlich ist. Aus dem bakteriostatischen Effekt des Transferrins wird von Berger und Beger (Berger und Beger: Arzneim.- Forsch./Drug Res. (1988) 38: S. 817-820; und Prog. Clin. Biol. Res. (1988) 272: S. 115-124) geschlossen, daß dem Transferrin, in der eisenfreien Form, bei ausgedehnten gramnegativen Infektionen sogar eine gewisse Bedeutung als Zusatztherapeutikum für die antimikrobielle Therapie als Ergänzung zu der herkömmlichen Antibiotikatherapie zukommen könnte. Es bietet den Vorteil, daß aufgrund seines Wirkungsmechanismus keine Resistenzentwicklung zu erwarten ist.

Das Endotoxin ist ein Zellwandbestandteil der gramnegativen Bakterien, das erst bei dem Bakterienzerfall freigesetzt wird. Es ist ein Makro molekül mit einem Molekulargewicht bis zu 1 × 10⁶ Dalton, das sich vorwiegend aus Zuckerverbindungen und Fettsäuren zusammensetzt. Daneben kann es noch Proteinreste angelagert haben, die von der Bakterienwand stammen. Das Endotoxinmolekül ist aus drei strukturell und immunbio logisch unterschiedlichen Subregionen aufgebaut:

Die Subregion 1, die 0-spezifische Kette, besteht aus mehreren, sich wiederholenden Oligosaccharideinheiten, die jeweils von maximal 5 Neutral zuckern gebildet werden. Die Anzahl der Oligosaccharide ist von der Bakterienart abhängig; z. B. hat das hier untersuchte Endotoxin von S. abortus equi in dieser Region 8 Oligosaccharid-Einheiten.

Die Subregion 2, das Kernoligosaccharid besteht u. .a. aus N-Acetyl glucosamin, Glucose, Galactose, Heptose und 2-Keto-3-Desoxyocton säure.

Die Subregion 3, das Lipid-A (MG 2000 Dalton) besteht aus einem phosphorylierten D-Glukosamin-Disaccharid, an das mehrere - ca. 7 - langkettige Fettsäuren in Amid- und Esterbindung geknüpft sind. Der Träger der toxischen Eigenschaften ist das Lipid-A, wobei die toxische Wirkung von einigen Fettsäureresten in dieser Region ausgeht.

Aufgrund der Größe des Endotoxin-Moleküls und aufgrund seiner Ladungs verhältnisse können sich verschiedene Verbindungen und Proteine an den vielen Gruppen bzw. Seitenketten der drei verschiedenen Subregionen des Endotoxins anlagern, ohne dadurch irgendeine Beeinflussung der toxischen Eigenschaften des Endotoxins herbeizuführen. Physiologischerweise ist an das Lipid-A ein Protein gebunden, das sog. Lipid-A-assoziierte Protein. Die Abtrennung dieses Proteinanteils von dem Endotoxin führt bei einigen Endotoxinen zu keinerlei Veränderung der toxischen Wirkung. Bei vielen Endotoxinen wurde jedoch gefunden, daß die Bindung von Proteinen an das Endotoxin eine wesentliche Steigerung der toxischen Wirkung zur Folge haben kann (Rietschel E. TH. et al. (1982): "Bacterial Endotoxins: Chemical Structure, Biological Activity and Role in Septicaemia" Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 31: 8-21; S. 17). Beispielsweise wurde beobachtet, daß bestimmte Endotoxine mit einem angelagerten Proteinanteil ca. 100fach aktiver sein können, als die Endotoxine, von denen der Proteinanteil abge trennt wurde (Morrison DC, Oudes ZG, Betz J (1980): The role of lipid A and lipid A-associated protein in cell degranulation mechanisms. In: Eaker D. Wadstrom T (Eds). NATURAL TOXINS, pp 287-294, Pergamin Press. New York). Bei tierexperimentellen Untersuchungen wurde ebenfalls eine Abnahme der toxischen Wirkung der den Tieren applizirten Endotoxine beobachtet, wenn deren Proteinanteil abgespalten war (Hitchcock PJ and Morrison DC (1984) "The protein component of bacterial endotoxins". In: E. T. Rietschel (editor) HANDBOOK of ENDOTOXINS, Vol. 1: Chemistry of Endo toxin, pp 339-375, Elsevier Science Publishers B. V.).

Berger und Beger (Arzneim.-Forsch./Drug Res. (1988) 38: 817-820; und Prog. Clin. Biol. Res. (1988) 272: S. 115-124) haben durch Isotopen untersuchungen gezeigt, daß sich auch menschliches Transferrin, und zwar nur in der eisenfreien Form, an Endotoxin binden kann. Weiterhin wurde eine Anlagerung von α₂-Makroglobulin sowie von Gc-Globulin an Endotoxin nachgewiesen. Aufgrund dieser Untersuchungsergebnisse wurden von den Autoren der Druckschriften postulliert, daß dem Transferrin in seiner eisenfreien Form möglicherweise eine physiologische Bedeutung als "Carrier-Protein" für Endotoxin im Organismus zukommt. Eine ähnliche "Carrier-Funktion" wird den High-Density-Lipoproteinen zugeschrieben (Minford RS, Hall CL, Dietschy JM (1981): "Bindung of salmonella thyphimurium lipopolysacchari des to rat high-density lipoproteins" Infect. Immun. 34: 835-843). Aus dem mit Isotopen geführten Nachweis der Anlagerung von eisenfreiem Transferrin an das Makromolekül Endotoxin ergeben sich für den Fachmann jedoch keinerlei Hinweise bzw. Rückschlüsse darauf, ob und in welchem Ausmaß durch diese Anlagerung auch eine Beeinflussung der biologischen Aktivität, d. h. die toxischen Wirkung des Endotoxins zu erwarten ist.

Endotoxin tritt normalerweise auch beim Gesunden aus dem Darm in die Blutbahn über. Zum Schutz vor einer toxischen Organschädigung hat das Plasma des Gesunden die Fähigkeit, das ständig aus dem Darm übertretende Endotoxin zu inaktivieren. Bei einem massiven Endotoxineinstrom erschöpft sich die Fähigkeit des Plasmas zur Inaktivierung des Endotoxins rasch und es tritt vermehrt biologisch aktives Endotoxin im Plasma auf, welches dann zu dem klinischen Bild der Endotoxinämie führt.

Ein vermehrter Endotoxinübertritt in die Blutbahn ist besonders bei aus gedehnten gramnegativen Infektionen, nach Gabe eines bakteriziden Antibio tikums zu erwarten. Das Endotoxin führt dann zur Freisetzung schädigender Mediatoren sowie zur Störung des Energiestoffwechsels der Zelle, woraus ein Zelluntergang und - bei höherer Endotoxindosis - schließlich ein Organver sagen resultieren kann. Da klinische Bild der Sepsis korreliert in den meisten Fällen mit dem Verlauf und der Höhe der Endotoxinkonzentration im Blut (Nitsche et al., Intensive Care Med. 12 Suppl. (1986) 185). Aus diesem Grund sind bei Erkrankungen, bei denen durch einen vermehrten Endo toxinübertritt in das Blut eine Endotoxinämie auftritt, zusätzliche thera peutsche Maßnahmen wünschenswert, mit denen die Endotoxininaktivität im Blut herabgesetzt werden kann, um damit den klinischen Verlauf dieses Krankheitsbildes günstig zu beeinflussen.

Wie tierexperimentelle Studien gezeigt haben, scheint eine Herabsetzung der Endotoxinaktivität im Plasma durch Hyperimmunglobulin-Präparationen, die selektiv mit Antikörpern gegen den toxischen Teil des Endotoxins an gereichert sind (Lipid-A-Antikörper), möglich zu sein. Immunglobulin- Präparationen mit einer selektiven Anreicherung von Lipid-A-Antikörpern stehen jedoch bisher nur in geringen Mengen für therapeutische Zwecke zur Verfügung, da die Auswahl der Spender sehr aufwendig ist. Bis zu einem gewissen Grad kann die Endotoxinaktivität im Plasma auch durch die Gabe polyvalenter 7S-IgG-Präparationen herabgesetzt werden, was vermutlich auf deren Anteil an Lipid-A-Antikörper zurückzuführen ist.

Alle bisher für die Therapie verfügbaren Möglichkeiten weisen entscheidend Nachteile auf, die darin liegen, daß sie nur einen gewissen Prozentsatz der in die Blutbahn übertretenden Endotoxine inaktivieren. Bei einem verstärkten Endotoxineinstrom, wie er beispielsweise auch bei der diffusen Peritonitis zu erwarten ist, zirkulieren trotz dieser therapeutischen Maßnahmen dann noch immer genügend biologisch aktive Endotoxine in der Blutbahn, was eine toxische Organschädigung herbeizuführen kann.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel zu finden, welches in der Lage ist, die biologische Wirkung des Endotoxins in ausreichendem Maße herabzusetzen und welches damit auch als Therapeutikum für die Bekämpfung der toxischen Wirkung der Endotoxine geeignet ist, wenn diese bei krankhaften Zuständen vermehrt in die Blutbahn übertreten.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Verwendung von Transferrin gelöst, welches Eisen gebunden hat.

Zur Prüfung der Endotoxininaktivierung durch humanes Transferrin wurden folgende Untersuchungen durchgeführt:

Transferrin in der eisenfreien Form (sog. Apotransferrin) und Transferrin, welches Eisen gebunden hat, wurden in vitro und in vivo untersucht, inwieweit sie in der Lage sind, die biologische Aktivität von Endotoxin herabzusetzen.

Untersuchungen in vitro A.) Quantitative Untersuchungen zum Einfluß auf die biologische Aktivität

Humanes Transferrin wurde mit Endotoxin in steigender Konzentration 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Abschluß der Inkubation erfolgte die quantitative Bestimmung der biologischen Aktivität des Endotoxins im Überstand mit einer Modifikation des Limulus-Test, unter Verwendung eines chromogenen Substrates (Nitsche et al. In: Watson, SW, Levin J, Novitsky TJ (eds) DETECTION OF BACTERIAL ENDOTOXINS WITH THE LIMULUS AMEBOCYTE LYSATE TEST. pp 417-429 (1987)). Die untere Nachweisgrenze liegt bei dieser Modifikation des Limulus-Tests bei 1 EU/dl. Die mit dem Limulus-Test erfaßte Endotoxinaktivität korrelliert mit der biologischen Aktivität des Endotoxins (Nitsche D, Flad HD und Blum B (1990) Endotoxin determination by the Limulus-Test and the biological activity of endotoxin. Does a correlation exist? In Vorbereitung).

Für die Untersuchungen wurde Transferrin (Trf.-Fe(A)) verwendet, welches in einer 5% Lösung einen Eisengehalt von 25 µg/dl hat, d. h. 5 µg Eisen pro Gramm Transferrin, sowie Transferrin (Trf.-Fe(B)) mit einem Eisengehalt von 950 µg/dl in einer 5% Lösung, d. h. 190 µg Eisen pro Gramm Transferrin.

Außerdem wurde Transferrin verwendet, welches weitgehend frei von Eisen war (Trf.-⌀). Hier konnte bei der Eisenbestimmung mit der von Megraw und Bouda (Megraw RE. Hritz AM, Babson AL und Carroll JJ (1973) Clin. Biochem. 6: 266; Bouda J. (1968) Clin. Chem. Acta 21: 159) beschriebenen Methode bis zu der unteren Nachweisgrenze, die bei 0,5 µg/dl liegt, in der 5% Lösung kein Eisen nachgewiesen werden.

Als Kontrolle wurde eine 7S IgG-Präparation (Sandoglobin ®) verwendet.

Von folgenden Bakterienstämmen wurden die Endotoxine untersucht:
Salmonella abortus equi (NOVOPYREXAL ®), Pseudomonas aeruginosa Fisher Typ 7, sowie der FDA Endotoxinstandard EC-5 von E. coli 0113 : H10 : KO.

Bestimmung der Inaktivierungskapazität für Endotoxin

Um die Fähigkeit von Transferrin zur Inaktivierung von Endotoxin zu quantifizieren, wurde die "Inaktivierungskapazität" bestimmt. Aus Gründen der Meßgenauigkeit wurde die Bestimmung dieser Größe nicht im Äquivalenzbereich, sondern bei einem Überschuß von 10 EU/dl und 100 EU/dl Endotoxin durchgeführt.

Für die Berechnung dieses Parameters wurde diejenige Endotoxinmenge [EU/dl] ermittelt, die der jeweiligen Proteinpräparation zugesetzt werden muß, damit die Konzentration der freien Endotoxine im Überstand nach Inkubation (60 Minuten, 37°C) mit Transferrin noch 10 EU/dl bzw. 100 EU/dl beträgt. Diese Endotoxinkonzentration wurde aus der Beziehung berechnet, die zwischen der zugesetzten Endotoxinmenge und der nach der Inkubation im Überstand gemessenen Endotoxinkonzentration für die jeweilige Transferrin-Präparation gefunden wurde. Zur Bestimmung der Inaktivierungskapazität wurde eine Meßserie durchgeführt, bei der Endotoxin in steigender Konzentration (10 EU/dl, 25 EU/dl, 50 EU/dl, 100 EU/dl, 200 EU/dl, 300 EU/dl, 500 EU/dl sowie 750 EU/dl und 1000 EU/dl] mit den verschiedenen Transferrin-Präparationen 60 Minuten inkubiert wurde. Die Transferrinkonzentration im Reaktionsansatz betrug 312,5 mg/dl.

Die auf diese Weise ermittelte Endotoxinmenge stellt nach Abzug des vorgegebenen Endotoxinüberschuß von 10 EU/dl bzw. 100 EU/dl die mittlere Endotoxinaktivität [EU/dl] dar, die von der entsprechenden Transferrin lösung [mg/dl] unter den jeweiligen Bedingungen inaktiviert werden kann. Bezogen auf eine Transferrinkonzentration von 100 mg/dl stellt diese Endotoxinaktivität ein Maß für die "mittlere Inaktivierungs kapazität [EU/100 mg]" der jeweiligen Präparation dar.

Ergebnisse: (Abb. 1, 2) 1. Transferrin

Bei Inkubation von Endotoxin mit Transferrin (Trf.-⌀), welches frei von Eisen ist, findet sich, je nach Art des Endotoxins und der Endotoxinkonzentration eine mittlere Abnahme der Endotoxinaktivi tät von 26,2% bis 36%.

Bei Inkubation von Endotoxin mit Transferrin (Trf.-Fe(A)), welches einen Eisengehalt von 25 µg/dl - bezogen auf eine 5% Transferrin- Lösung - hat, kommt es je nach Endotoxin zu einer mittleren Abnahme der Endotoxinaktivität von 72% bis 78,7%.

Bei einem Eisengehalt des Transferrins (Trf.-Fe(B)) von 950 µg/dl - bezogen auf eine 5% Transferrin-Lösung - wird eine Abnahme der Aktivität, je nach Endotoxin, von 85,3% bis 95,5% erreicht.

a) Bezogen auf einen Endotoxinüberschuß von 10 EU/dl beträgt die Inaktivierungskapazität:
- I.) bei Trf.-⌀ für S. abortus equi 1,8 EU/100 mg, für E. Coli 1,5 EU/100 mg und für Pseudomonas aeruginosa 1,7 EU/100 mg.
- II.) bei Trf.-Fe(A) für S. abortus equi 7,1 EU/100 mg, für E. Coli 11,0 EU/100 mg und für Pseudomonas aeruginosa 10,4 EU/100 mg.
- III.) bei Trf.-Fe(B) für S. abortus equi 61,5 EU/100 mg, für E. Coli 52,3 EU/100 mg und für Pseudomonas aeruginosa 64,5 EU/100 mg.
b) Bezogen auf einen Endotoxinüberschuß von 100 EU/dl beträgt die Inaktivierungskapazität:
- I.) bei Trf.-⌀ für S. abortus equi 17,8 EU/100 mg, für E. Coli 11,4 EU/100 mg und für Pseudomonas aeruginosa 17,6 EU/100 mg,
- II.) bei Trf.-Fe(A) für S. abortus equi 89,9 EU/100 mg, für E. Coli 108,2 EU/100 mg und für Pseudomonas aeruginosa 105,4 EU/100 mg.
- III.) bei Trf.-Fe(B) für S. abortus equi 176,7 EU/100 mg, für E. Coli 334,2 EU/100 mg und für Pseudomonas aeruginosa 433,4 EU/100 mg.

2. Immunglobulin (7S IgG)

Bei Inkubation von Endotoxin mit 7S IgG (312 mg/dl) wird die Endo toxinantivität je nach Endotoxin um ca. 21,5% bis 33% herabgesetzt.

a) Wird ein Endotoxinüberschuß von 10 EU/dl zugrunde gelegt, dann beträgt die Inaktivierungskapazität von 7S IgG für S. abortus equi 1,8 EU/100 mg, für E. Coli 0,9 EU/100 mg und für Pseudomonas aeruginosa 1,3 EU/100 mg.
b) Bezogen auf einen Endotoxinüberschuß von 100 EU/dl beträgt die Inaktivierungskapazität von 7S IgG für S. abortus equi 19,3 EU/100 mg, für E. Coli 9,4 EU/100 mg und für Pseudomonas aeruginosa 16,7 EU/100 mg.

B) Einfluß auf die Freisetzung der Mediatoren IL-1 und IL-6

Als zusätzlicher Parameter für den Einfluß des Transferrins auf die biologische Aktivität des Endotoxins wurde die Freisetzung von IL-1 und IL-6 aus Monocyten herangezogen. Hierzu wurde Endotoxin zunächst mit Transferrin inkubiert. Anschließend wurde der Überstand mit Monocyten inkubiert und die Konzentration der aus den Monocyten freigesetzten Mediatoren Interleukin-1 und Interleukin-6 im Überstand bestimmt.

Es wurde Transferrin (Trf.Fe(A)) verwendet, welches einen Eisengehalt von 5 µg pro Gramm Transferrin hat, sowie Transferrin (Trf.-Fe(B)) mit einem Eisengehalt von 190 µg pro Gramm Transferrin. Als Kontrolle wurden Albumin sowie eine 7S IgG-Präparation (Sandoglobin ®) verwendet.

Von folgenden Bakterienstämmen wurden die Enddotoxine untersucht:
Salmonella abortus equi (NOVOPYREXAL ®), sowie der FDA Endotoxin standard EC-5 von E. coli 0113 : H10 : KO.

Transferrin bzw. das Kontrollprotein wurde mit Endotoxin 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Konzentration des jeweiligen Proteins im Ansatz betrug: 625 mg/dl, 312 mg/dl und 156 mg/dl.

Die Inkubation wurde mit Endotoxinkonzentrationen von 50 EU/dl bis 500 EU/dl durchgeführt.

Nach der Inkubation wurde die jeweilige Endotoxinlösung mit mono nukleären Zellen von gesunden Spendern inkubiert (16 Std. bei 37°C). Anschließend wurde die Konzentration der freigesetzten Mediatoren IL-1 und IL-6 bestimmt. Die Bestimmung von IL-1 erfolgte mit Hilfe des Fibroblasten-Proliferationstest (Loppnow H; Flad HD, Ulmer AJ et al (1989) "Detection od Interleukin 1 with Human Dermal Fibroblasts. Immunbiol. 179, 283-291), unter Verwendung einer EL4-6.1 Thymomzell- Linie. Die Konzentration von IL-6 wurde ebenfalls über einen Prolifera tionstest unter Verwendung eines IL-6 abhängigen murinen Hybridoms (7TD1) bestimmt (Van Damme J, Cayphas S. et al (1987) Eur. J. Biochem. 168: 543-550; sowie Van Oers MHJ, Van der Heyden A, und Aarden LA (1988); Clin. exp. Immunol. 71: 314-419).

Es zeigte sich, daß die Inkubation von Endotoxin mit Transferrin zu einer starken Herabsetzung der Freisetzung von Mediatoren aus den mononukleären Zellen durch das Endotoxin führt. Dieser Effekt ist vom Eisengehalt des Transferrins abhängig, und zwar derart, daß der durch Erhöhung des Eisengehaltes verbessert werden kann.

Ergebnisse: (Abb. 3) I. Transferrin

a) Bei Inkubation von 500 EU/dl Endotoxin mit Trf.Fe(A) betrug die mittlere Freisetzung von IL-1 bei S. abortus equi 211 U/Ml und bei E. Coli 126 U/ml. Die Freisetzung von IL-6 betrug bei S. abortus equi 761 U/ml und bei E. Coli 1065 U/ml.
b) Nach Inkubation von Endotoxin (500 EU/dl) mit Trf.-Fe(B) betrug die mittlere Freisetzung von IL-1 bei S. abortus equi 81 U/ml und bei E. Coli 35 U/ml. Die Freisetzung von IL-6 betrug bei S- abortus 481 U/ml und bei E. Coli 415 U/ml.

II. Immunglobulin (7S IgG)

a) Nach Inkubation von Endotoxin (500 EU/dl) mit einer 7S IgG-Präpara tion beträgt die mittlere Freisetzung von IL-1 bei Verwendung des Endotoxins von S. abortus equi 1260 U/ml und bei E. Coli von 1787 U/ml.
Die IL-6-Menge, die nach der Inkubation mit 7S IgG freigesetzt wurde, betrug bei S. abortus 1969 U/ml und bei E. Coli 6104 U/ml.

III. Albumin

Nach Inkubation von Endotoxin (500 EU/dl) mit Albumin, welches zum Vergleich verwendet wird, beträgt, die mittlere Freisetzung von IL-1 bei Verwendung des Endotoxin von S. abortus equi 2975 U/ml und bei E. Coli 2676 U/ml. Die Freisetzung von IL-6 beträgt bei S. abortus equi 3018 U/ml und bei E. Coli 6233 U/ml.

C) Einfluß auf die Endotoxinaktivität im Plasma

Humanplasma von gesunden Spendern wurde mit Transferrin versetzt, derart, daß der natürlich vorhandene Transferringehalt im Plasma um 312 mg-% erhöht wurde. Den Kontrollproben wurde die gleiche Menge Albumin zugesetzt.

Zu dem mit Transferrin bzw. Albumin versetzten Plasma wurde dann Endotoxin (Pseudomonas-Endotoxin, Salmonellen-Endotoxin) zugesetzt, so daß im Ansatz eine Endotoxinaktivität von 800 EU/dl und 300 EU/dl im Plasma erreicht wurde. Der Ansatz wurde dann 60 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die verbliebene Endotoxinkonzentration bestimmt.

Es zeigte sich, daß die Fähigkeit des Plasmas zur Inaktivierung von Endotoxin gegenüber den Proben, denen nur Albumin zugesetzt wurde, durch den Transferrinzusatz signifikant gesteigert wird.

a) bei Zusatz von Transferrin (Trf.-Fe(B)) betrug die Steigerung der Endotoxininaktivierung: 73,8% bei 800 EU/dl Endotoxin und bei 300 EU/dl Endotoxin: 56,5%
b) bei Zusatz von Trf.-Fe(A) wurde die Endotoxininaktivierung im Plasma bei einer Endotoxinkonzentration von 800 EU/dl um 66,6% und bei 300 EU/dl Endotoxin um 42,8% gesteigert.

Tierexperimentelle Untersuchungen

Die tierexperimentellen Untersuchungen zur Frage der Wirkung von Transferrin auf die Endotoxinaktivität wurden an folgendem Tiermodell durchgeführt:
Narkotisierten Wistar-Ratten (250-300 g) wurde zur Blutabnahme zunächst ein Katheter in die rechte Halsvene (Vena Jugularis) eingelegt. Anschließend wurde eine definierte Zahl verschiedener Bakterien (E. Coli, Klebsiella species und Pseudomonas aeruginosa; in einer Konzentration von jeweils 0,75 × 10⁵ CFU/ml) in die Bauchhöhle appliziert. 30 Minuten nach Gabe der Bakterien in die Bauchhöhle wurde über den Venen katheter mit einem Perfusor langsam das zu prüfende Präparat (Transferrin) in einer Dosierung von 250 mg/kg Körpergewicht intravenös verabreicht. Die Kontrolltiere erhielten Albumin in entsprechender Dosierung.

Zur Erzeugung eines starken Endotoxineinstroms in das Blut wurde eine Stunde nach der Bakteriengabe ein bakterizides Antibiotikum (IMIPENEM = Zienam ®) intravenös appliziert.

Die Blutabnahmen zur Bestimmung der Endotoxinaktivität sowie der Bakterienzahl im Blut erfolgten vor, sowie - in 30 minütigem Abstand - nach Bakteriengabe über insgesamt 5 Stunden.

Folgende Präparationen wurden i. v. verabreicht:

Transferrin (Trf.-Fe(A)) mit einem Eisengehalt von 25 µg/dl - bezogen auf eine 5% Transferrinlösung - sowie Transferrin (Trf.-Fe(B)) mit einem Eisengehalt von 950 µg/gl in einer 5% Transferrin-Lösung;

Ergebnisse: (Abb. 4)

a) Bei Gabe von Albumin steigt die Endotoxinaktivität im Plasma nach Applikation des Antibiotikums sehr stark an. Bereits eine Stunde nach Gabe des Antibiotikums wird eine mittlere Endotoxin aktivität von 192 EU/dl erreicht. Vier Stunden nach Gabe des Antibiotikums beträgt die Endotoxinaktivität im Plasma 210 EU/dl.
b) Bei Gabe von Transferrin (Trf.-Fe(A)) wurde die initiale Zunahme der Endotoxinaktivität im Plasma - eine Stunde nach Gabe des Antibio tikums - im Vergleich zur Albumin-Kontrollgruppe um ca. 36% reduziert.
c) Bei Gabe von Transferrin (Trf.-Fe(B)) beträgt die Reduzierung der initialen Zunahme der Endotoxinaktivität im Plasma - eine Stunde nach Gabe des Antibiotikums - im Vergleich zur Albuminkontrollgruppe ca. 72,5%. Vier Stunden nach Gabe des Antibiotikums ist die Endotoxinaktivität bei der Gruppe, die Trf.-Fe(B) erhalten hat, noch um ca. 63% niedriger, als bei der Albumin-Gruppe.

Zusammenfassende Beurteilung der Ergebnisse

1. Transferrin ist geeignet, bei intravenöser Applikation konzen trationsabhängig die biologische Aktivität des Endotoxins im Blut herabzusetzen.
2. Das Ausmaß, in dem die toxische Wirkung des Endotoxins durch das Transferrin herabgesetzt wird, nimmt mit der Eisenbeladung des Transferrins zu.
Der Eisengehalt des Transferrins sollte hierbei mindestens 0,4 µg pro Gramm Transferrin betragen, vorzugsweise jedoch höher als 100 µg Eisen pro Gramm Transferrin sein.
3. Transferrin, welches frei von Eisen ist, hat nur eine schwache Wirkung auf die Endotoxinaktivität.
4. Aufgrund seiner Fähigkeit, die biologische Aktivität des Endotoxins im Blut herabzusetzen, eignet sich besonders das eisenbeladene Trans ferrin als Therapeutikum für die Bekämpfung der toxischen Wirkung von Endotoxin, welches in die Blutbahn übergetreten ist. Bei recht zeitiger Gabe von Transferrin ist ein günstiger Effekt auf den klinischen Verlauf bei Endotoxinämien jeglicher Genese zu erwarten.

Die Erfindung wird durch folgende Beispiele erläutert Beispiel 1

Bei Inkubation von 200 EU/dl Endotoxin von S. abortus equi mit einem Immunglobulin, welches mit 12% IgM-angereichert ist (IgG/A/M), in einer Konzentration von 312 mg/dl, wird die Endotoxinaktivität in vitro um ca. 42% herabgesetzt. Bei der gleichen Konzentration (313 mg/dl) von Transferrin (Trf.-Fe(A)) mit einem Eisengehalt von 25 µg/dl - bezogen auf eine 5% Lösung - wird die Endotoxinaktivität in vitro um 73% (S. abortus equi) bzw. 76% (Pseudomonas aeruginosa) und durch Transferrin (Trf.-Fe(B)) mit einem Eisengehalt von 950 µg/dl - bezogen auf eine 5% Transferrin-Lösung - um maximal 85% (S. abortus equi) bzw. 91% (Pseudom. aeruginosa) herabgesetzt.

Durch die Kombination von Trf.-Fe(B) mit dem Immunglobulin (IgG/A/M) wird bei niedriger Endotoxinaktivität, d. h. bis 200 EU/dl, im Vergleich zu der Inaktivierung bei alleiniger Gabe von Trf.-Fe(B), keine signifikante Verbesserung der Inaktivierung erreicht. Dagegen zeichnet sich die Kombination von Trf.-Fe(B) mit Immunglobulin da durch aus, daß sie auch bei höherer Endotoxinaktivität - d. h. über 300 E/dl Endotoxin - signifikant mehr Endotoxin inaktiviert, als es die beiden Proteine allein vermögen. Während die Kombination von Trf.-Fe(B) mit IgG/A/M (12%) bei Inkubation mit 750 EU/dl Endotoxin von S. abortus equi 92% des Endotoxins inaktivieren kann, werden durch Trf.-Fe(B) nur maximal 85% der Aktivität neutralisiert.

Die Unterschiede zwischen Trf.-FE(B) und der Kombination mit Immun globulin werden durch die Angabe der Inaktivierungskapazität (Abb. 2) wesentlich deutlicher, als durch die Angabe der mittleren prozentualen Inaktivierung. Beispielsweise ist diese Kapazität - bezogen auf einen Endotoxinüberschuß von 100 EU/dl - für die Inaktivierung des Endotoxins von Pseud. aeruginosa bei Verwendung der Kombination von Trf.-Fe(B) und Immunglobulin (IgGA/M) um einen Faktor von 2,7 größer, als die Inaktivierungskapazität von Trf.-Fe(B) allein und um einen Faktor von 17,3 größer als die Inaktivierungskapazität der Immunglobulinpräparation IgG/A/M (12%).

Die Steigerung der Inaktivierungskapazität durch die Kombination von Transferrin mit Immunglobulin eröffnet die Möglichkeit, daß durch eine therapeutische Zufuhr dieser Kombination auch stärke und länger andauernde Endotoxineinschwemmungen in die Blutbahn, wie sie beispiels weise auch bei der diffusen Peritonitis auftreten können, aufgefangen und behandelt werden können.

Beispiel 2

Entsprechend den Bedingungen, wie sie bei der Therapie von gramnegativen Infektionen mit Antibiotika auftreten können, wurde im Tierversuch ein Endotoxinanstieg im Blut dadurch induziert, daß zunächst Bakterien in die Bauchhöhle gegeben werden und durch die anschließende intra venöse Gabe eines bakteriziden Antibiotikums ein rascher Zerfall dieser Bakterien ausgelöst wird. Vom Zeitpunkt der Gabe des Antibiotikums an kann im Blut ein starker Anstieg der Endotoxinaktivität gemessen werden. Wird vorher ein Immunglobulin oder eisenhaltiges Transferrin oder die Kombination von Transferrin (Trf.-Fe(B)) mit Immunglobulin intravenös verabreicht, dann wird der Anstieg des Endotoxinspiegels im Vergleich zu einer Kontrollgruppe, die stattdessen Albumin i. v. erhielt, je nach verwendetem Plasma-Protein, mehr oder minder stark herabgesetzt. Beispielsweise wird die mittlere maximale Endotoxinaktivität, die bei der Kontrollgruppe bei Versuchsende 210 EU/dl beträgt durch die Gabe von Transferrin auf 77 EU/dl gesenkt. Bei Gabe der Kombination von Transferrin (Trf.-Fe(B)) und Immunglobulin (IgG/A/M) beträgt die Endotoxinaktivität im Plasma nur noch 22 EU/dl.

Durch die Steigerung der Inaktivierungskapazität bei Kombination von Transferrin mit Immunglobin erhält man damit die Möglichkeit, auch bei einem längeren Endotoxineinstrom einen stärkeren Anstieg der Endotoxinaktivität im Plasma zu verhindern. Die alleinige Gabe von eisengebundenem Transferrin bewirkt initial eine ähnlich starke Reduzierung der Endotoxinaktivität wie die Kombination von Trans ferrin mit Immunglobin. Ohne Erhöhung der Dosis reicht jedoch die Inaktivierungskapazität von Transferrin, allein, bei einem fort gesetzten Endotoxinübertritt in das Blut nach einer gewissen Zeit nicht mehr aus, wodurch es wieder zu einem Ansteigen der Endotoxinaktivität im Plasma kommen kann.

Beispiel 3

Bei einer Patientin, die das klinische Bild einer schweren abdominalen Sepsis mit Organversagen entwickelt hatte, konnte eine erhöhte Endotoxin aktivität im Plasma nachgewiesen werden. Die Konzentration des Transferrins im Plasma betrug 98 mg/dl (Normalbereich: 200-400 mg/dl).

Bei Inkubation dieses Plasmas mit einer Immunglobulin-Präparation, die mit IgM angereichert ist, (30 Minuten, 37°C) - Immunglobulinkonzentration im Ansatz: 312 mg/dl - konnte eine Abnahme der Endotoxinaktivität um 17% erreicht werden. Bei Inkubation mit Transferrin (Trf.-Fe(A)), in einer Konzentration von 312 mg/dl, werden 29% des Endotoxins inaktiviert. Bei Zugabe der gleichen Menge von Transferrin (Trf.-Fe(B)) mit einem höheren Eisengehalt, in entsprechender Konzentration, zum Patientenplasma werden 45% der Endotoxine inaktiviert, d. h. das 2,6fache der Endotoxin menge, die durch die Immunglobulin-Präparation inaktiviert wird.

Die starke Senkung der Endotoxinaktivität durch Transferrin, besonders durch Trf.-FE(B) geben bei intravenöser Applikation die Möglichkeit, die Prognose der Patienten bei Endotoxinämien jeglicher Genese entscheidend zu verbessern.

Beispiel 4 (Abb. 5)

Zur Prüfung der Frage, welchen Einfluß die Kombination von Transferrin mit einem Immunglobulin auf die Letalität im Tierversuch hat, wurde Wistar-Ratten eine definierte Zahl von Coli-Bakterien 9 × 10⁹ CFU/ml intraperitoneal verabreicht. Zur Erzeugung einer ausgeprägten Endotoxin ämie wurde 30 Minuten später ein bakterizides Antibiotikum [IMIPENEM: 28 mg/kg Körpergewicht] i. v. appliziert. Um eine möglichst radikale Sanierung der bakteriellen Infektion zu erreichen, wurde das Antibiotikum in einer Dosierung von 14 mg/kg in 4stündigem Abstand über insgesamt 3 Tage weiter verabreicht.

Einer Gruppe (n = 18) der Tiere wurde 15 Minuten vor Bakteriengabe eisen reiches Transferrin (Trf.-Fe(B)) in einer Dosierung von 250 mg/kg intrave nös verabreicht. Eine weitere Gruppe (n = 15) erhielt Transferrin (Trf.-Fe(B) in einer Dosierung von 150 mg/kg i. v. Eine andere Gruppe (n = 15) erhielt vor Gabe der Bakterien eine Immunglobulinpräparation mit einem IgM-Gehalt von 12% IgM (IgG/A/M) in einer Dosierung von 250 mg/kg intravenös. 15 Tiere erhielten eine Kombination von Transferrin (Trf.-FE(B)) und der mit 12% IgM-angereicherten polyvalenten IgG-Präparation (IgG/A/M) in einer Dosierung von jeweils 150 mg/kg. Die Kontrollgruppe erhielt vor Bak teriengabe nur Albumin i. v., in einer Dosierung von 250 mg/kg.

Während sämtliche Tiere der Albumingruppe und 80% der Tiere der Immunglo bulin-Gruppe (IgG/A/M) spätestens am 5. Tag nach Bakteriengabe verstorben waren, überlebten 89% der Tiere in der Gruppe, welche ausschließlich 250 mg/dl Transferrin (Trf.-Fe(B)) erhalten hatte. Im Gegensatz dazu verstarben 74% der Tiere, die Transferrin (Trf.-Fe(B)) in eine Dosierung von 150 mg/lg bekommen hatten. Von den Tieren, welche die Kombination von Transferrin (Trf.-Fe(B)) und Immunglobulin (IgG/A/M) erhalten hatten, überlebten 94%.

Claims

1. Verwendung von Transferrin als Therapeutikum zur Bekämpfung der toxischen Wirkung des Endotoxin bei Endotoxinämien, dadurch gekennzeichnet, daß das Transferrin Eisen gebunden hat.

2. Verwendung nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Transferrin Eisen enthält, wobei das Transferrin ein oder zwei Eisen gebunden hat.

3. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, gekenn zeichnet durch eine Kombination von Transferrin mit Immunglobulin.