HU212767B - One-step process for producing 7-aminocephem compound or salts thereof, expression vector and microorganism for this purpose - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás 7-amino-cefém vegyületek vagy sóik előállítására. A találmány tárgya pontosabban eljárás 7-amino-cefém vegyületek vagy sóik, az említett eljárásban alkalmazott vektorok, az említett vektorokkal transzformált, cefalosporin-vegyületet termelő mikroorganizmusok és az Acremonium chrysogenum alkálikus proteáz gén promotor aktivitásával rendelkező DNS fragmentumok előállítására.

Az (I) általános képletű 7-amino-cefém vegyületek, ahol a képletben

R jelentése acetoxi- vagy hidroxi csoport, vagy hidrogénatom, a legfontosabb kiindulási anyagok a félszintetikus cefalosporin antibiotikumok előállításához, és ezeket világszerte számos gyógyszergyár alkalmazza. Jelenleg az (I) általános képletű 7-amino-cefém vegyületet egy kétlépéses eljárással állítják elő, amelyek közül az elsőben egy cefalosporinvegyületet-termelő, az Acremonium chrysrogenum fajhoz tartozó törzset tápközegben tenyésztenek, amikor is a (II) általános képletű cefalosporin vegyület keletkezik, ahol a képletben

R jelentése a fentebb megadott, és

X jelentése -CH(NH₂)-COOH, -CO-COOH vagy -COOH csoport, majd a tenyészközegből a (II) általános képletű vegyületet kinyerik; és a második lépésben a 7-es helyen levő acilcsoportot, pl. az α-amino-adipoil-csoportot, a (II) általános képletű vegyületből kémiai vagy enzimes úton eltávolítják. Az utóbbi lépés kémiai dezacetilezésének kivitelezésére az úgynevezett imino-éterezési eljárást [Huber M. és munkatársai; „Cephalosporins and Penicillins, Chemistry and biology” (Academic Press, 1972), 27. oldal] alkalmazzák, amely egy sor kémiai reakciót foglal magában; így tudják eltávolítani a (II) általános képletű vegyület 7. helyén levő acilcsoportot, pl. α-amino-adipoil csoportot. Sajnálatos módon azonban ez az eljárás nagyon költséges kémiai üzemet és bonyolult műveleteket igényel. Az enzimes dezacilezés szintén komplikált műveleteket, valamint külön fermentációs üzemet igényel.

Emiatt a jelent találmány feltalálói megkísérelték az (I) általános képletű 7-amino-cefem vegyületek közvetlen előállítását egy lépésben, a fentemlített dezacetilezési lépés nélkül, olyan mikroorganizmusokat alakítva ki, amelyek fermentatív úton (I) általános képletű 7-amino-cefém vegyületeket termelnek. A természet világában mindeddig még nem fedeztek fel olyan mikroorganizmusokat; amelyek képesek lettek volna közvetlenül valamely (I) általános képletű 7-amino-cefém vegyületet termelni, holott ez ügyben a kutatók az egész világos jelentős erőfeszítéseket tettek. Eddig még egyetlen közlemény sem számolt be sikerről (I) általános képletű 7-amino-cefém vegyületet termelő mikroorganizmusok megalkotásáról mutációs kezelés vagy genetikai manipulációs technikák segítségével módosított mikroorganizmusok révén, mivel ez a feladat igen nehéz.

Szembenézve ezzel a nehéz feladattal intenzív kutatásokat folytattunk, melyek segítségével újonnan megalkottuk az (I) általános képletű 7-amino-cefém vegyületek termelésére az Acremonium chrysogenum egy vagy több promotorát, valamint a (II) általános képletű cefalosporin vegyületeket az (I) általános képletű 7-amino-cefém vegyületekké átalakítani képes enzimek génjeit tartalmazó vektorokat, amelyekben az említett gének össze vannak kapcsolva az említett promotorokkal, és az Acrenbium-chrysogenum fajhoz tartozó, (II) általános képletű cefalosporin vegyületeket termelő mikroorganizmusokat ezekkel a vektorokkal transzformáltuk és tenyésztettük, meglepő módon a kívánt 7-amino-cefém vegyületet találtunk a tenyészetben összegyűlve. Az erre a tényre alapozott további kutatások vezettek el a jelen találmány szerinti eljárás teljessé tételéhez.

Az EP-A 0 322 032 sz. leírás cefalosporin C konverzióját ismerteti 7-amino-cefalosporánsavvá Bacillus megaterium ATCC 53 667 eredetű cefalosporin C amidázzal. A JP 8 874 488 Kohai Tokyo Kohno cefalosporin C átalakítását ismerteti 7-ACA-vá egy olyan transzformált E. coli törzzsel, melybe a Trigonopsis variábilis eredetű D-aminosav oxidáz génjét és egy Comamonas eredetű 7p-(4-karboxi-butánamid) cefalosporánsav aciláz gént építettek be.

A fenti irodalmak lényegében két szakaszból álló eljárást ismertetnek, míg a találmányunk szerinti fermentáció egylépéses. A fenti módszerek kiindulási anyagaként cefalosporin C-t alkalmaznak. A cefalosporin C-t acremonium chrysogenum fermentációjával nyerik majd a cefalosporin C-t izolálják és tisztítják. A második lépésben, külön fermentorban, az így nyert cefalosporin C-ből állítják elő a 7-ACA-t.

Találmányunk lényege, hogy a 7-amino-cefém-vegyületet egylépésben nyerjük. Nyilvánvaló, hogy ez jelentős gazdasági előnyt jelent az eddigi módszerekkel, szemben. A 7-ACA közvetlen fermentációjával régóta foglalkoznak a fermentáció területén, ez ideig azonban ez sikertelen volt. Eddig azonban szkrineléssel nem sikerült olyan természetes mikroorganizmust találni, amely ilyen termelésre képes lett volna.

Peptidek és proteinek rekombináns DNS módszerrel történő előállítására már számos eredményes módszert ismertettek, mely módszerek már rutinmunkává váltak. Ugyanakkor sehol nem ismertettek eljárást természetben nem előforduló, alacsonyabb molekulatömegű szerves vegyület, például 7-amino-cefém vegyület előállítására, melynek során idegen enzim géneket vittek be egy organizmusba, így módosítva egy bonyolult metabolizmus folyamatot.

A találmány tárgya eljárás expressziós vektor előállítására, melynek során egy vektorba a szokásos kifejeződést biztosító DNS-szekvenciákkal együtt az Acremonium chrysogenum egy vagy több promoterét a (II) általános képletű vegyület - ahol R jelentése hidrogénatom, acetoxi- vagy hidroxilcsoport és X jelentése a -CH(NH₂)-COOH, -CO-COOH vagy -COO-csoport - a megfelelő (I) általános képletű - ahol R jelentése a fenti - 7-amino-cefém vegyületté átalakítható enzimek génjeihez ligáljuk működőképesen az upstream irányból a downstream irányba haladva.

A találmány tárgya továbbá eljárás mikroorganiz2

HU 212 767 Β musok előállítására, melynek során egy, (II) általános képletű - ahol R és X jelentése a fentiekben megadott cefém vegyületet termelő, Acremonium chrysogenum fajba tartozó törzset egy fenti, találmány szerint előállított expressziós vektorral transzformálunk.

A találmány továbbá az (I) általános képletű - ahol

R jelentése a fenti - 7-amino-cefém vegyületek egylépésben történő előállítására is vonatkozik fermentációs úton a fenti transzformált mikroorganizmussal.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a bejelentés ábráit. Az

1-1. ábra vázlatosan bemutatja az 1. példában követett munkamenetet. Az

1-2. ábra egy alkálikus proteáz cDNS és egy genomikus alkálikus proteáz DNS restrikciós enzimes hasítási térképét mutatja be. Xgt-proteáz-2: a Xgtl 1-nek csak a beiktatott része van jelezve.

X-G-proteáz-1413 és X-G-proteáz-0112: csak a XgtWES, λΒ-be beiktatott részek vannak jelezve pGRP3-EH 1 és pgPR2-EHl: csak a pBR322be beiktatott részek vannak jelezve. Az

1-3. ábra az alkálikus proteáz cDNS és a genomikus alkálikus proteáz DNS restrikciós enzimes hasítási térképét mutatja be. Az

IH. ábra a genomikus alkálikus proteáz DNS nukleotidszekvenciáját mutatja be. Az M jelentése G vagy C. Az

1-5. ábra az alkálikus proteáz cDNS nukleotidszekvenciáját mutatja be. Az

1-6. ábra az alkálikus proteáz cDNS (gt-proteáz-2) és a Xgtll β-galaktozidáz gén közti fuzionált területben levő nukleotid-szekvenciát és az ebből következtetett aminosavszekvenciát mutatja be. Az

1-7. ábra az alkálikus proteáz cDNS (Xgt-proteáz-2) nyitott leolvasó keretének nukleotid-szekvenciáját és az ebből következtetett aminosavszekvenciát mutatja be. Az

1-8. ábra a genomikus alkálikus proteáz gént és egy szintetikus kapcsoló hozzáadásának helyét mutatja be. Az

1-9. ábra a nukleotid szekvenciát mutatja be (az EcoRl-gyel és BamHI-gyel végzett módosítás után) a genomikus alkálikus proteáz DNS promotorjának szomszédságában. Az

1-10. ábra a nukleotid szekvenciát mutatja be (a BamHI-gyel és a HindlII-mal végzett módosítás után) a genomikus alkálikus proteáz DNS terminátorának szomszédságában. Az

1-ll.ábraa pCYG-B2 plazmid megalkotási vázlatát mutatja be. Az

1-12. ábra a genomikus izopenicillin N szintetáz DNSt mutatja be és bemutatja a módosítási vázlatot ennek restrikciós enzimes hasítási helyéhez. Az

1-13. ábra a nukleotid szekvenciát mutatja be a genomikus izopenicillin N-szintetáz DNS-promotorjának szomszédságában. Az

1-14. ábra a restrikciós enzimes hasítást mutatja be a genomikus izopenicillin N-szintetáz DNS terminátorának szomszédságában. A BglII, PvuII, Sáli, SacII és Xhol restrikciós enzimekhez nem találhatók hasítási helyek. Az

1-15. ábra a pCYG-EB2 plazmid megalkotási vázlatát mutatja be:

□ : a proteáz gén promotorja és terminátora I : az IPNS gén promotorja és terminátora;

□ : A. chrysogenum eredetű ARS;

- : pBR325 DNS és Tn903 DNS. Az

1- 16. ábra a nukleotid szekvenciát mutatja be a genomikus izopenicillin N szintetáz DNS terminátorának szomszédságában. A

2- 1. ábra a pYG-HB51 plazmid megalkotási vázlatát mutatja be. A

2- 2. ábra a higromicin B rezisztencia gén nukleotid szekvenciáját és az ebből kikövetkeztetett aminosavszekvenciát mutatja be. A

3- 1. ábra vázlatosan bemutatja a 3. példában követett munkamenetet. A

3-2. ábra a cefalosporin C és a dezacetil-cefalosporin C átalakításának útját mutatja be 7ACA-vá illetve 7ADCA-vá. A

3-3. ábra a pDAO-EBlOl plazmid restrikciós enzimes hasítási térképét mutatja be. A 3-4. ábra a pVEB104 plazmid restrikciós enzimes hasítási térképét mutatja be. A

3-5. ábra a pCFS315 restrikciós enzimes hasítási térképét mutatja be. A

3-6. ábra a pV22B 1 plazmid megalkotásának vázlatos képét mutatja be. A

3-7. ábra a Pseudomonas diminuta V22-eredetű cefalosporin C aciláz gén nyitott leolvasó karakterének nukleotid szekvenciáját és az ebből következtetett aminosavszekvenciát mutatja be. A

3-8. ábra a pV22BS-Al 1 plazmid megalkotásának vázlatát mutatja be. A

3-9. ábra a pV22Bl plazmid aciláz ATG kodonjától felfelé levő hely módosítási vázlatát mutatja be. A

3-10. ábra a restrikciós enzim hasítási helyet mutatja be a cefalosporin C aciláz gén szomszédságában a pV22B2-Al 1 plazmidban. Az ábrában az α és β a becsült a illetve β-alegységet jelzi. A

3- 11. ábra a pCFS314 plazmidban található DAO gén kódoló területének nukleotid-szekvenciáját és az ebből következtetett nukleotid szekvenciát mutatja be. A

4- 1. ábra a 7ACA termelésre szolgáló pHBVl vektor megalkotásának vázlatát mutatja be. A

4-2. ábra a 7ACA termelésre szolgáló pHDVl 1 vektor megalkotásának vázlatát mutatja be. A

4-3. ábra a GL-7ACA termelésére szolgáló pHBD3 vektor megalkotásának vázlatát mutatja be.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányt.

Az (I) általános képletű 7-amino-cefém vegyülete3

HU 212 767 B két termelő, jelen találmány szerinti vektorok DNS fragmentumot tartalmaznak, amely úgy készül, hogy Acremonium chrysogenum (pl. amikor a gazdasejtek Acremonium chrysogenum sejtjei) legalább egy vagy több promotorát olyan enzimek génjeihez ligáljuk, amelyek képesek a (II) általános képletű cefalosporin vegyületeket a megfelelő (I) általános képletű 7-amino-cefém vegyületekké alakítani, a ligálást hagyományos eljárásokkal végezve a felfelé levő (upstream) oldaltól a lefelé levő (downstream) oldal felé haladó sorrendben. Az említett vektorba beiktathatunk hagyományos eljárásokkal megfelelő szelektív markert, Acremonium chrysogenumban működő, autonóm módon replikáló szekvenciát (ARS), terminátort, átírást aktiváló szekvenciát, stb. a megfelelő, kívánt helyre. A vektor sokszorozás Escherichia coliban kényelmes, ha az autonóm módon replikáló szekvencia Escherichia colihoz való (őri) és egy szelektív marker van beiktatva a vektorba.

Ilyen vektorokat lehet megalkotni pl. a jelen bejelentés példáiban később leírt eljárásokkal vagy azok változataival.

Az „Acremonium chrysogenumhoz szolgáló promotor” kifejezés olyan promotorra vonatkozik, amely képes egy kívánt polipeptidet kódoló gén kifejeződésének elősegítésére Acremonium chrysogenumban; az ilyen promotorok között találjuk a már ismert promotorokat, mint az Acremonium chrysogenumban ismerten jelenlevő izopenicillin N szintetáz gén promotorját (lásd pl. EP-A 0,200 425) és az Acremonium chrysogenum β-izopropil malát dehidrogenáz gén promotorját, valamint azt a DNS fragmentumot, amelyet a jelen találmány feltalálói újonnan izoláltak az Acremonium chrysogenumban kromoszómából, és amely az alkálikus proteáz gén promotorja. Ezek a promotorok tartalmazhatnak egy fokozó (enhancer) szekvenciát is.

Az olyan enzimeket kódoló gének között, amelyek képesek a (II) általános képletű cefalosporin vegyületeket átalakítani az (I) általános képletű 7-amino-cefém vegyületekké, találjuk a cefalosporin C aciláz géneket, amelyek egylépéses átalakítást katalizáló enzimek génjei {pl. a Pseudomonas sp. SE83 eredetű cefalosporin C aciláz gén [lásd Matsuda A. és munkatársai: J. Bacteriol. 169, 5815-5825 (1987)], valamint az a cefalosporin C aciláz gén, amelyet a jelen találmány feltalálói újonnan izoláltak Pseudomonas diminuta V22-ből). Az olyan enzimeket kódoló gének között, amelyek kétlépcsős átalakítást katalizálnak, említhetjük egy D-aminosav oxidáz (a későbbiekben „DAO”) gén és egy GL-7ACA aciláz gén kombinációját és egy cefalosporin C aciláz gén és egy DAO gén kombinációját (a cefalosporin C acilázok általában képesek átalakítani a GL-7ACA-t és GL-7ADCAt, valamint a keto-AD-7ACA-t és keto-AD-ADCA-t 7ACA-vá, illetve 7ADCA-vá). Azokban az esetekben, amikor a gazdaszervezetként alkalmazott, (II) általános képletű cefalosporin vegyületet termelő törzs GL-7ACAt, GL-7ADCA-t és/vagy keto-AD-ADCA-t termel, alkalmazhatunk egy cefalosporin C aciláz gént vagy GL7ACA aciláz gént egyedül.

D-amino-oxidáz génként említhetjük pl. a Trigonopsis variábilis eredetű DAO gént [lásd a 62-262 994 japán szabadalmi közzétételi iratot (Kokai Tokkyo Koho)], és a jelent találmány feltalálói által Fusarium solani Μ-0718-ból (FERM-P 2688) újonnan izolált DAO gént (lásd a 364 275 számon közzétett európai szabadalmi közrebocsátási iratot).

A GL-7ACA aciláz gének között említhetjük pl. a Pseudomonas putida (ATCC 950) eredetű GL-7ACA aciláz gént [lásd Agric. Bioi. Chem. 45, 1561 (1981)], valamint a fentebb már külön megemlített cefalosporin C aciláz géneket (a cefalosporin C aciláz géneket (a cefalosporin C azilázok GL-7ACA acilázokként is szolgálnak).

Az enzim-gének előnyösen egyenként vannak beiktatva a vektorba valamely, az Acremonium chrysogenum promotorjától lefelé („downstream”) levő helyen. A jelen találmány szerinti, (I) általános képletű 7-amino-cefém vegyületeket termelő vektorok magukba beiktatva tartalmazhatnak egy vagy több olyan enzimet vagy enzimeket kódoló gént, amelyek képesek átalakítani a (II) általános képletű cefalosporin vegyületeket (I) általános képletű 7-amino-cefém vegyületekké.

A szelektív marker lehet bármely olyan marker, amely alkalmazható a transzformánsok átvizsgálására az Acremonium chrysogenumnak a vektorral való transzformálását követően. Széles körben alkalmazott pl. a (Hm^R) marker, amely higromicin rezisztens fenotípust biztosít.

Az Acremonium chrysogenumnál autonóm módon replikálódó szekvencia (ARS) pl. az Acremonium chrysogenum ARS-e [lásd 61-209 593 számú japán szabadalmi közrebocsátási iratot (Kokai Tokkyo Koho)]. Mivel azonban az Acremonium chrysogenum transzformálása a 7-amino-cefém vegyületet termelő vektorral főleg azt eredményezi, hogy az említett vektor beépül az Acremonium chrysogenum genomikus DNS-ébe és azt követően replikálódik, nem szükséges ilyen esetben, hogy a 7-amino-cefém vegyületet termelő vektor tartalmazzon ARS beiktatást. ARS jelenléte csak akkor szükséges, amikor a 7-amino-cefém vegyületet termelő vektor extrakromoszomális komponensként sokszorozódik Acremonium chrysogenumban. A terminátor, amely tartalmazhat egy poliadenilező helyet, pl. az Acremonium chrysogenum genomikus DNS eredetű terminátor, amelyeket a késó'bb leírt példákban is alkalmazunk.

A (II) általános képletű cefalosporin vegyületeket termelő törzsek, amelyek az Acremonium chrysogenum fajhoz tartoznak, hagyományos módon transzformálhatok a 7-amino-cefém vegyületeket termelő vektorokkal, pl. a protoplaszl transzformációs eljárással [lásd pl. Queener S. Q. és munkatársai: a „Microbiology” című szakkönyvben (kiadó: American Society of Microbiology, 1985), 468. oldal],

A (II) általános képletű cefalosporin vegyületeket termelő törzsek között találjuk többek között az A. chrysogenum ATCC 11 550 és ATCC 36 225 törzseket, mint cefalosporin C termelőket, az A. chrysogenum ATCC 20 371 törzset, mint dezacetil-cefalosporin C termelőt, az A. chrysogenum ATCC 11 550 és ATCC

HU 212 767 Β

416 törzseket, mint dezacetoxi-cefalosporin C termelőket, és az A. chrysogenum ATCC 20 416 és ATCC 20427 törzseket, mint GL-7ACA és keto-AD-7ACA termelőket. Számos más, Acremonium chrysogenumtól eltérő törzsről is ismeretes, hogy termel (II) általános képletű cefalosporin vegyületeket. Lehetséges 7-amino-cefém vegyületeket termelő törzseket előállítani olyan módon, hogy a fenti mikroorganizmusokat alkalmazzuk gazdasejtekként és ezeket olyan megfelelő vektorokkal transzformáljuk, amelyek 7-amino-cefém vegyületek termelésére képesek; a transzformáláshoz a genetikai manipulációk területén hagyományosan alkalmazott eljárásokat, pl. a fentebb említett eljárások valamelyikét alkalmazhatjuk.

Az így kapott, (I) általános képletű vegyületeket termelő mikroorganizmusokat [(II) általános képletű cefalosporin terméket termelő mikroorganizmusok 7-aminocefém vegyületeket termelő vektorokkal transzformálva] megfelelő tápközegben tenyésztjük. Elvileg ez a tenyésztés ugyanúgy történhet, mint a mikroorganizmusok tenyésztés ugyanúgy történhet, mint a mikroorganizmusok tenyésztése általában. Általában azonban a vizes tápközeget alkalmazandó tápközeg lehet szintetikus, félszintetikus vagy természetes. A tápközeg összetételében szereplő szénforrások közül megemlíthetjük pl. a glükózt, szacharózt, maltózt, glicerint, keményítőt, elfolyósított keményítőt és hasonlókat. A nitrogénfonások között megemlíthetjük a húskivonatot, kazein hidrolizátumot, peptont, gluténlisztet, kukoricalisztet, gyapotmaglisztet, szójabablisztet, kukoricalekvárt, szárított élesztőt, karbamidot, ammónium-foszfátot, stb. Szervetlen sókat, pl. dinátrium-hidrogén-foszfátot, kálium-dihidrogén-foszfátot, magnézium-kloridot, magnézium-szulfátot és kalcium-karbonátot is adhatunk a tápközeghez, ha szükséges.

Abban az esetben, ha a tápközeg habzik a tenyésztés során, valamely habgátlót, pl. étolajat (pl. szójaolajat vagy ricinusolajat), magasabb szénatomszámú alkoholt (pl. oktadekanolt, tetradekanolt vagy heptanolt) vagy valamely szilikonvegyületet adhatunk megfelelő mennyiségben.

A tenyésztést előnyösen 30 °C hőmérsékleten végezzük. Amikor a tenyészet térfogata nagy, megfelelő oltótenyészet alkalmazása legtöbb esetben jó eredményeket ad. A tenyésztés alkalmas időtartama mintegy 100-170 órát tesz ki, de ezt meg is lehet hosszabbítani, amikor nagy koncentrációjú tápközeget alkalmazunk.

A fentebb említett tenyésztési körülményeket módosíthatjuk az alkalmazott termelő törzs jellemzőitől függően úgy, hogy kiválaszthatjuk az optimális körülményeket és azokat alkalmazhatjuk.

A tenyésztés során keletkezett (I) általános képletű 7-amino-cefém vegyületeket általában a legtöbb esetben a sejten kívül halmozódnak fel a tenyészetben. Ennélfogva a kívánt (I) általános képletű 7-amino-cefém vegyületeket általában a szűrletből (vagy felülúszóból) izolálhatjuk, amelyeket a mikrobiológiai sejtekből centrifugálással, szűréssel vagy hasonló eljárással különítjük el; az izoláláshoz a szűrletet (felülúszót) egy sor eljárás (megfelelő sorrendű) kombinációjának és/vagy ismétlésének vetjük alá, ilyen eljárások pl. a koncentrálás csökkentett nyomáson, oldószeres extrakció, pH beállítás, kezelés gyantákkal (pl. anioncserélő gyantákkal, stb.) kezelés valamely adszorbenssel (pl. aktív szán, kovasav, szilikagél, timföld, cellulóz, stb.), nagyteljesítményű folyadékkromatográfia, kristályosítás, átkristályosítás, stb., amelyeket az antibiotikum vegyületek termelésében általában használnak.

A szabad formában kapott (I) általános képletű 7amino-cefém vegyületeket átalakíthatjuk valamely kívánt sóvá valamely bázissal, pl. nátrium-hidroxiddal vagy hasonlókkal reagáltatva.

Az alábbi példák jól illusztrálják a jelen találmányt. Ezekben a példákban az alábbi rövidítéseket alkalmazzuk: DNS: dezoxiribonukleinsav cDNS: komplementer DNS

RF DNS: a DNS replikatív formája

RNS: ribonukleinsav mRNS: hírvivő (messenger) RNS dNTP: dATP (dezoxiadenozin-trifoszfát) dCTP (dezoxicitidin-trifoszfát) dGTP (dezoxiguanidin-trifoszfát) és dTTP (dezoxitimidin-trifoszfát) keveréke bp: bázispár kbp: kilobázispár

Ap^R: ampicillin rezisztencia E. coliban

Ap^s: ampicillin érzékenység E. coliban

Cm^R: klóramfenikol rezisztencia E. coliban

Cm^s: klóramfenikol érzékenység E. coliban

Km^R: kanamicin rezisztencia E. coliban

Km^s: kanamicin érzékenység E. coliban

Tc^R: tetraciklin rezisztencia E. coliban

Tc^s: tetraciklin érzékenység E. coliban lac PO: laktóz operon promotor és operátor E.

coliban tac PO: trp-lac promotor és operátor E. coliban

Acy⁺: aciláz aktivitás

Hm^R: higromicin B rezisztencia

G418^r: rezisztencia a G418 antibiotikumra

DAO: D-aminosav-oxidáz

IPNS: izopenicillin N szintetáz

CC: cefalosporin C

CCNa: cefalosporin C nátrium

DCC: dezacetoxi-cefalosporin C

7ACA: 7-amino-3-acetoxi-metil-3-cefém-4-karbonsav

7ADCD: 7-amino-3-hidroxi-metiI-3-cefém-4-karbonsav keto-AD-7ACA: keto-adipil-7ACA [7-(5-karboxi-5oxo-pentán-amino)-3-acetoxi-metil-3cefém-4-karbonsav] keto-AD-7ADCA: keto-adipil-7ADCA [7-(5-karboxi-5 oxo-pentán-amido)-3-hidroxi-metil-3cefém-4-karbonsav]

GL-7ACA: glutaril-7ADCA [7-(4-karboxi-bután amido)-3-acetoxi-metil-3-cefém-4-karbonsav]

GL-7ADCA: glutaril-7ADCA [7-(4-karboxi-bután amido)-3-hidroxi-metil-3-cefém-4-karbonsav]

HU 212 767 Β

GL—7ADCA: glutaril-7ADCA [7-(4-karboxi-bután-

DTT:	amido)-3-hidroxi-metil-3-cefém-4-kar- bonsav] ditiotreitol
Trisz:	trisz(hidroxi-metil)amino-metán
EDTA:	etilén-diamin tetraecetsav
SDS:	nátrium-lauril-szulfát
PEG:	polietilénglikol
IPTG:	izopropil-p-D-tio-galaktopiranozid
X-gal:	5-bróm-4-klór-3-indolil-p-galaktozid
Met:	metionin
Thr:	treonin
Alá:	alanin
Gin:	glutamin
Gly:	glicin
Val:	valin
Pro:	prolin
Ile:	izoleucin
Lys:	lizin
Asn:	aszparagin
Glu:	glutamin
Phe:	fenil-alanin
Leu:	leucin
Asp	aszparaginsav
Tyr:	tirozin
Cys:	cisztein
Trp:	triptofán
Ser:	szerin
Arg:	arginin
His:	hisztidin

A példákban alkalmazott fontosabb pufferok és tápközegek összetétele az alábbi:

TE puffer:

mmól/1 triszHCl (pH 7,5)

0,5 mmól/1 EDTA

LB agar:

g/1 Bacto-tripton (DIFCO) g/1 élesztőkivonat (DIFCO) g/1 NaCl g/1 agar (DIFCO) pH 7,2

B3 agar:

g/1 D-galaktóz 2 g/1 Bacto-triton (DIFCO) g/1 MgSO₄-7H₂O I,5g/1KH₂PO₄ 1 g/1 NaNOj 20 g/1 agar (pH 5,6-6,0 között)

YPS tápközeg:

g/1 szacharóz g/1 polipepton (Daigo Nutritive Chemicals) g/1 élesztőkivonat-por (Daigo Nutritive Chemicals) 1 g/1 K₂HPO₄ g/1 MgSO₄-7H₂O (pH 7,0)

CS1 tápközeg:

g/1 szacharóz g/1 glükóz g/1 szójaliszt g/1 kukoricalekvár (CSL), (a pH 7,0-ra állítva NaOH-val) g/1 CaCO₃

Fő tenyésztő tápközeg:

g/1 földimogyoró-por 40 g/1 CSL 8 g/1 búzacsíra 16 g/1 glutén-liszt 8 g/1 (NH₄)₂SO₄ 20 g/1 glükóz 20 g/1 szacharóz (a pH 7,0-ra beállítva NaOH-val)

10g/lCaCO₃ ml/1 metil-oleát mól/literes KP puffer (pH 7,5):

mól/1 KC1 mmól/1 CaCl₂-2H₂O mmól/1 MgCl₂ mmól/1 trisz HCl (pH 7,5) mól/literes KP puffer (pH 5,8)

Ez a puffer úgy készül, hogy 1 mól/literes KP puffért (pH 7,5) pH 5,8-ra állítunk be HCl-lel

0,8 mól/l NaP puffer:

0,8 mól/1 NaCl 25 mmól/1 CaCl₂-2H₂O 10 mmól/1 MgCl₂ 10 mmól/1 trisz HCl (pH 7,5)

PDA-YE agar:

g/liter burgonya-glükóz agar tápközeg (Nissui Pharmaceutical) g/liter agar 5 g/liter élesztőkivonat

BRM agartápközeg [Al:

g NaNO₃ g KH₂PO₄

274 g szacharóz (végső koncentráció 0,8 mól/1) g agy-szív infúzió (DIFCO)

7.5 g agar (Hayashi Junyaku) (a pH 6,3 és 6,4 között) [B[:

g glükóz (végső koncentráció 2%)

1.5 g CaCl₂ 2H₂O (végső koncentráció 10 mmól/1)

Az [A] komponensek vizes oldatát (900 ml) és a [B] komponensek vizes oldatát (100 ml) külön-külön autoklávban sterilezzük, majd összekeverjük, s ezt a keveréket alkalmazzuk lemezek, stb. elkészítésére.

Hacsak másképpen nem jelezzük, a példákban alkalmazott genetikai manipulációknál azokra a manipu6

HU 212 767 Β lációkra utalunk, amelyek az alábbi szakkönyvekben találhatók: Maniatis T. és munkatársai: Molecular Cloning-A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory (1982).

1. példa

Az egész munkamenetet, amelyet ebben a példában követünk, az 1-1. ábrában körvonalazzuk (1) Alkálikus proteáz cDNS és kromoszomális DNS klónozása.

(1-i) A. chrysogenumból (ATCC 11 550) származó alkálikus proteáz tisztítása és antitestek készítése Yagi és munkatársai eljárását követve [Yagi J. és munkatársai: J. Ferment. Technoi. 50, 592 (1972)] A. chrysogenumot (ATCC 11 550) tenyésztjük és a tenyészet szűrletéből alkálikus proteázt nyerünk ki olyan módon, hogy ammónium-szulfáttal 70%-ig telítve kicsapást végzünk, majd CM (karboxi-metil)-cellulózt és Sehpadex G75-öt alkalmazva tisztítást végzünk. Mintegy 30 000 dalton molekulaméretét találunk 11 %-os SDS-PAGE-vel (SDS-poliakrilamid gélelektroforézis) végzett elemzéssel. Ezt az alkálikus proteázt összekeverjük komplett Freund-féle adjuvánssal (DIFCO) és a keveréket hím új-zélandi fehér nyulakba injektáljuk három alkalommal (ahol egy adag 2 mg injekcióként), hogy antitest termelést idézzük elő. Ezután a teljes vért összegyűjtjük és a szérumot elkülönítjük, majd a szérumot 56 °C hőmérsékleten 30 percen át kezeljük, ezután 35%-ig telítjük ammónium-szulfáttal. Az így létrejött csapadékot A-fehérje-szefarózos kezelésnek [Protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia)] vetjük alá az antitest tisztítása érdekében. Az antitest oldat teljes térfogatát 16 ml-re egészítjük ki. Az Ouchterlony vizsgálat igazolja, hogy immuncsapadékot ad. Egy kontroll nyúlból (amely nem kapott proteáz-injekciót) kapott IgG (immunoglobulin G) frakció nem mutat semmiféle immunkicsapási reakciót a proteázzal.

(1-ii) Genomikus DNS könyvtár kialakítása A. chrysogenum ATCC 11 550-ből.

A genomikus DNS-t az A. chrysogenum ATTCC

550-ből azzal az eljárással vonjuk ki, amelyet a 61209 593 számú japán szabadalmi közzétételi irat (Kokai Tokkyo Kohno) ismertet (Isogai és munkatársai; a nyilvánosságra kerülés napja 1986. szeptember 17.). Ezt a DNS-t (mintegy 25 pg) EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük (100 egység) 37 °C hőmérsékleten 3 órán át, hogy részleges hasítást érjünk el, és az emésztményt szacharóz sűrűség-gradiens centrifugálásnak vetjük alá (5—>20% szacharóz; Hitachi RPS 55T-2 ultracentrifuga rotor, 50 000 fordulat/perc, 4 óra), hogy tisztított DNS frakciókat kapjunk (mintegy 3 kbp vagy nagyobb méretűeket). A méret szerint frakcionált DNS-t végül feloldjuk 100 μΐ TE pufferben. Ezzel egyidejűleg XgtWES^B DNS-t [Bethesda Research Laboratories (BRL); mintegy 40 pg] teljességig emésztünk EcoRI-gyel és az emésztményt szacharóz sűrűség-gradiens centrifugálásnak vetjük alá (azonos körülmények közt, mint ahogyan fentebb leírtuk), ilyen módon egy 4,85 kbp-s DNS-t távolítunk el és egy 21,7 kbp-s bal kart és egy 13,8 kbp-s jobb kart tisztítunk. Az EcoRI részleges hasítással kapott jobb kart tisztítunk. Az EcoRI részleges hasítással kapott DNS fragmentumot (>3 kbp, mintegy 5 pg), és a XgtWESXB eredetű EcoRI karokat (mintegy 15 pg) összekeverjük és ligálásnak vetjük alá T4 DNS ligázt alkalmazva. A ligálási keveréket in vitro „csomagolás”-nak vetjük alá Packer Gene-t alkalmazva [λ fág in vitro csomagolási rendszer; Promega Biotec jimportálja és forgalomba hozza a Seikagaku Kogyo)]. A tarfoltképzés E. coli DP50 supF-et alkalmazva (amely benne van a PackerGene készletben) gazdasejtként mintegy 2x10⁶ tarfoltot ad. így egy mintegy 2x1076 kiónt tartalmazó genomikus DNS könyvtárat alkothatunk meg.

(1-iii) mRNS kivonása és tisztítása A. chrysogenum ATCC 11 550-ből.

A. chrysogenum ATCC 11 550-et tenyésztünk olyan vizes tápközegben, amely 4,5% oldható keményítőt, 3% kukoricalekvárt (CSL), 1,5% szójalisztet és 0,35% CaCO₃-at tartalmaz, a tenyésztést 25 °C hőmérsékleten 4 napon át végezve. A kapott sejteket folyékony nitrogénnel alacsony hőmérsékletre hűtött mozsárban összezúzzuk, majd 40 ml guanidin-izotiocianát oldatban [4 mól/1 guanidin-izotiocianát, 50 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,5), 20 mmól/1 EDTA. 2% N-lauroilszarkozimnátrium, 0,17 mól/1 2-merkapto-etanol] szuszpendáljuk és 60 °C hőmérsékleten 5 percen át melegítjük. A szuszpenziót azután 10 000 g-nél centrifugáljuk 10 percen át, és a felülúszóból a guanidin-cézium-kloridos eljárással [lásd „Molecular Cloning” (korábban idézett munka, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) 196. oldal] 13 mg teljes RNS-t nyerünk ki.

A teljes RNS (13 mg) kétszeri tisztításával, 1 g oligo (dT) cellulózt (BRL) alkalmazva [lásd „Molecular Cloning” (korábban idézett munka) 197. oldal] 460 pg poli(A)-RNS-t (mRNS) kapunk.

(1—iv) cDNS könyvtár megalkotása az OkayamaBerg eljárással.

Abból a célból, hogy közel teljes hosszúságú cDNS-t kapjunk, cDNS könyvtárat alkotunk meg az Okayama-Berg eljárással [Okayama H. és Berg P: Mól. Cell. Bioi. 2, 161 (1982)]. Az (1-iii) lépésben kapott mRNS-t (4 pg) és 0,9 pg prímért [3'-oligo (dT)farokkal ellátott pSV7186-eredetű plazmid primer (Pharmacia)] kezelünk reverz transzkriptázzal (Seikagaku Kogyo), hogy 0,64 pg ss-cDNS-t (egyes szálú cDNS) szintetizáljuk. Ezt terminális transzferázzal kezeljük C-farokképzésre (18 C átlagosan), majd HindlII restrikciós enzimmel hasítjuk, ezután 0,25 g kapcsolóval [3'-oligo(dG)-farokkal ellátott pSV1932-eredetű HindlII kapcsoló (Pharmacia)] összeforrasztjuk és E. coli DNS ligázzal kezeljük. Ezután ds-cDNS-t (kettős szálú cDNS) szintetizálunk olyan módon, hogy a ligázzal kezelt keveréket RN-áz H-val (BRL), DNS polimeráz I-gyel (Pharmacia) és E. coli DNS ligázzal (Pharmacia) kezeljük. Ezt a cDNS-t alkalmazzuk E. coli DH1 (ATCC 33 849) transzformálására Hanahan D. eljárása szerint [Hanahan D.: J. Mól. Bioi. 166, 557 (1983)], így 3,6xl0⁴ ampicillin-rezisztens gént kapunk.

HU 212 767 Β

Így olyan cDNS könyvtárat alkotunk meg, amely 3,6x10⁴ kiónt tartalmaz.

(1—v)· Az A. chrysogenum alkálikus proteáz cDNSének klónozása.

A 3,6x1074 klónból cDNS könyvtárból plazmid DNS-t izolálunk és újra klónozzuk Ágtll-be (ATCC 37 194), és proteáz génre kutatunk expressz-folt vizsgálattal, az (1-i) pontban előállított proteáz antitestet alkalmazva.

A cDNS-eredetű DNS keveréket (20 μg) Pstl-gyel hasítjuk, majd 1,2 egység Bal31-gyel (BRL) kezeljük (végső térfogat: 600 pl) 37 ’C hőmérsékleten 5 percen át abból a célból, hogy a végeket tompává tegyük, majd fenolos extrahálást végzünk. Az etanolos kicsapással kinyert DNS-t a Klenow-fragmentummal kezeljük (az E. coli DNS polimeráz nagy fragmentuma) a dNTP-k jelenlétében, ezt fenolos extrahálás és etanolos kicsapás követi. A kinyert DNS-t EcoRI metilázzal kezeljük (New England Biolabs) S-adenozil-metionin jelenlétében az EcoRI hely metilezése céljából, hogy az említett helyet EcoRI számára nem hasíthatóvá tegyük. Ebből a DNS-ből mintegy 10 pg-ot és 5 pg pEcoRI kapcsolót [d(pG-G-A-A-T-T-C-C); Takara Shuzo] összekeverünk és ligáljuk egymással T4 DNS ligázt alkalmazva. Miután az enzimet 65 ’C hőmérsékleten 15 percig melegítve inaktiváltuk, a ligálási keveréket EcoRI-gyel hasítjuk. A pEcoRI kapcsolót 5%-os akrilamid gélen végzett elektroforézissel eltávolítjuk. A DNS-t az akrilamid gélről eluáló pufferral eluáljuk (0,5 mól/1 CH3COONH4, 10 mmól/1 magnézium-acetát, 1 mmól/1 EDTA, 1% SDS) és DE52-n (Pharmacia) tisztítjuk [10 mmól/1 trisz-HCl-t (pH 7,5) és 5 mmól/1 EDTA-t tartalmazó oldatban; adszorpció 0,1 mól/1 NaCl-lel; deszorpció 1 mól/1 NaCl-lel; centrifugált oszlopot alkalmazunk].

Protoklón GT11 DNS-t (2 pg; Promega Biotec, kereskedelmi forgalomba hozza a Seikagaku Kogyo; ezt tisztított Ágt 11 DNS-ből állítják elő DNS ligázos kezeléssel, EcoRI-gyel végzett hasítással és alkálikus foszfatázos kezeléssel) és a fentebb leírtak szerint kezelt cDNS keveréket összekeverjük és ligáljuk egymással, T4 DNS ligázt alkalmazva. Az így létrejövő DNS keveréket in vitro ,,csomagolás”-nak vetjük alá PackerGene alkalmazásával (λ-fág in vitro csomagoló rendszer, Promega Biotec), ezt követi a tarfolt-képzés E. coli Y1090 (r'm⁺) törzzsel (ATCC 37 197), mint gazdaszervezettel. Mintegy 3x1075 tarfoltot kapunk. A tartfoltok megfigyelése alapján X-gal és IPTG jelenlétében mintegy 75% fehér tarfolt van jelen, míg a többi (mintegy 25%) kék tarfolt.

E. coli Y1090 (fm⁺) 0,1 ml-es tenyészetének, a fentebb említett Xgtl 1-eredetű cDNS könyvtárnak (mintegy lxlO⁴ klón) és egy fedőréteg agamak (azonos az LB agarral az agar koncentráció kivételével, amely 0,8%) (3 ml) keverékét 20 ml, 50 pg/ml ampicillint is tartalmazó LB agarra rétegezzük, ahogyan ez a csészében (mintegy 8,5 cm átmérőjű) elhelyezkedik, és a csésze tartalmát szobahőmérsékleten állni hagyjuk 1 órán át, hogy az agar megszilárduljon, majd 42 ’C hőmérsékleten 4 órán át inkubáljuk. Nitrocellulóz szűrőt (82,5 mm átmérőjű; Bio-Rad Laboratories) merítünk 10 mmól/1 IPTG oldatba 1 órán át, majd szobahőmérsékleten szárítjuk mintegy 1 órán át. Ezt a szűrőt a fentebb említett csésze-tenyészetre helyezzük és az inkubálást tovább folytatjuk 37 ’C hőmérsékleten 2,5 órán át, hogy génkifejeződés és a szűrőn a foltképzés lehetővé váljék. A mintegy 7xl0⁴ tarfolt közül, amely az ilyen foltképzéssel keletkezik, hat pozitív kiónt izolálunk egy expressz-folt vizsgáló készlet (Express Biot Assay Kit; Bio-Rad), valamint az (1-i) fejezetben termek antitest segítségével. Az expressz-folt vizsgálatot [Huyn T. V. és munkatársai: DNA Cloning, I. kötet, 73-75. oldal; kiadó; IRL Press (1985)] úgy végezzük, ahogyan ez a készlethez tartozó kézikönyvben le van írva. A fúziós fehérje kifejeződése és a tarfoltokról leemelt szűrő zselatinnal végzett blokkolása utána szűrőt nyúl-eredetű, E. coli lizátummal (amely lizátum a készletben benne foglaltatik) semlegesített proteáz antitesttel [a semlegesítés úgy történik, hogy 0,2 ml E. coli lizátumot és 4 pl proteáz antitestet adunk 20 ml antitest-inkubáló pufferhez (lásd a készlethez tartozó kézikönyvet)], majd HRP-vel (torma-peroxidáz) jelzett anti-nyúl IgG-vel (amely a készletben benne foglaltatik) kezeljük. Az ezt követő színkifejlesztés után a pozitív kiónok kék-ibolya foltokat adnak, míg a negatív kiónok és a nyúl-eredetű kontroll antitestek nem adnak ilyen foltokat.

A fenti 6 pozitív klón mindegyikéből DNS-t izolálunk és restrikciós enzimekkel hasítjuk, hogy a cDNS beiktatásokat összehasonítsuk hosszúságuk alapján. A leghosszabb beiktatást tartalmazó kiónt Xgt-proteáz-2-nek nevezzük (lásd az 1-2. ábrát). A további 5 klón mindegyike hasonló restrikciós enzimes hasítási térképet ad.

(1—iv) A Kgt-proteáz.-2 proteáz cDNS klón klónozása pBR325-be.

A Xgt-proteáz-3 DNS-t EcoRI-gyel elhasítjuk és két DNS-t (mintegy 0,5 kbp és mintegy 2,6 kbp) izolálunk agaróz gélelektroforézissel (0,8%), amelyet elektroforetikus izolálás követ [lásd „Molecular Cloning” (korábban idézett munka, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) 150. és 164. oldal]. Ezzel egyidejűleg a pBR325 DNS-t (BRL) EcoRI-gyel elhasítjuk és összekeverjük és fentebb említett két fragmentum (mintegy 0,5 kbp és mintegy 2,6 kbp) egyikével, majd ligálást végzünk, T4 DNS ligázt alkalmazva. Az így kialakult egyes ligációs keverékeket E. coli DH1 transzformálásához használjuk. Az 50 pg/ml ampicillint is tartalmazó LB agar lemezen kinőtt telepek közül kiemeljük azokat, amelyek nem képesek nőni 50 pg/ml klóramfenikolt is tartalmazó LB agar lemezen. Ezek közül a transzformáns törzsek közül egyesekből plazmid DNS-t izolálunk és restrikciós enzimes hasításnak vetünk alá, hogy igazoljuk a beiktatás jelenlétét. A plazmidok egyikét, amely a 0,5 kbp-s DNS-t tartalmazza, pBR-Pro2-E2-nek nevezzük (egy egy olyan proteáz cDNS fragmentumot tartalmaz, amely az N-terminális szomszédságának felel meg), és a plazmidok egy másikát, amely a 2,6 kbps DNS-t tartalmazza, pBR-Pro2-E3-nak nevezzük (ez

HU 212 767 Β egy olyan proteáz cDNS fragmentumot tartalmaz, amely a C-terminális oldalnak felel meg).

(l-vii)A λ-G-proteáz-l 413 és a 2-G-proteáz-0112 genomikus proteáz DNS klánok klónozása.

Az (1—ii) fejezetben megalkotott A. chrysogenum (ATTC 11 550)-eredetű genomikus DNS könyvtár 5xl0⁴-klónjából két genomikus proteáz DNS ki ónt, a X-G-proteáz-1413-at és a λ-G-proteáz-Ol 12-t (lásd az

1-2. ábrát) klónozzuk, vizsgáló mintaként a pBR-ProE2-t és pBR-Pro2-E3-at alkalmazva.

E. coli DP50supF (promega Biotec; 0,1 ml) tenyészetének, az (1—ii) fejezetben előállított genomikus könyvtárnak (mintegy lxlO⁴ klón) és fedő agarnak (ez azonos az LB agarral, azzal a különbséggel, hogy az agar koncentráció 0,8%; 3 ml) keverékét 20 ml LB agama (amely 10 mmól/1 MgCl₂-t is tartalmaz) rétegezzük, ahol az LB agar egy csészében (mintegy 8,5 cm átmérő) helyezkedik el, és a csészét egy éjszakán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. Fág-átvitelt hajtunk végre nitrocellulóz szűrőre (82 mm átmérő; BioRad) azzal az eljárással, amely az Advanced Bacterial Genetics című szakkönyv [Cold Spring Harbor Laboratory (1980)] 162. és 174. oldalán van leírva, majd denaturáIás, semlegesítés és Southern hibridizálás következik, a pozitív kiónok kiválasztására pBR322-Pro2-E2 és pBR-Pro2-E3 ³²P-jelzett DNS-keverékét alkalmazva. A DNS jelzését ³²P-vel a nick (hézag) transzlációs eljárással [„Molecular Cloning” (korábban idézett munka, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), 109. oldal] hajtjuk végre, a³²P-dCTP-t alkalmazva.

A mintegy 5x10-4 tarfoltból 9 pozitív kiónt izolálunk. Ezekből 8 kiónt egyedi tarfolt izolálással hasonló módon, ahogyan fentebb említettük. Ezen kiónok mindegyikéből DNS-t nyerünk ki, EcoRI-gyel hasítjuk és agaróz gél (0,8%) elektroforézisnek vetjük alá. Ez után Southern-hibridizálás következik Southern eljárása szerint [Southern E. M.; J. Mól. Bioi. 98, 116 (1975)], vizsgáló mintaként a fentebb említett eljárással készített, ³²P-vel jelzett pBR-Pro2-E2 vagy pBRPor2-E3 DNBS vizsgáló mintával pozitívnak talált klón egyikét λ-G-proteáz-Ol 12-nek nevezzük (1-2. ábra), míg a pBR-Por2-E3 vizsgáló mintával pozitívnak talált klón egyikét λ-G-proteáz-l413-nak nevezzük (12. ábra).

(1-viii) A pGPR2-EHl és pGPR3-EHI genomikus proteáz DNS-ek megalkotása.

A pGPR2-EHl-et úgy alkotjuk meg, hogy a λ-Gproteáz-Ol 12 DNS-t pBR322-be (BRL) szubklónozzuk (lásd az 1-2. ábrát), a pGPR3-EHl-et pedig úgy, hogy a λ-Ο-ρΓθίεύζ-1413 DNS-t pBR322-be szubklónozzuk.

így tehát a λ-G-proteáz-Ol 12 DNS-t EcoRI-gyei és HindlII-mal elhasítjuk és egy mintegy 3,5 kbp-s DNS fragmentumot izolálunk agaróz gél (0,85) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Ezzel egyidejűleg a pBR322 DNS-t is hasítjuk EcoRI-gyel és HindlII-mal, és a hasítási keveréket összekeverjük a fentebb említett DNS fragmentummal (mintegy

3.5 kbp). A ligálást T4 DNS alkalmazásával hajtjuk végre. A ligálási keveréket E. coli DH1 transzformálására alkalmazzuk. Azok közül a telepek közül, amelyek az 50 pg/ml ampicillint is tartalmazó LB agar lemezen kinőnek, kinyerjük azokat a transzformánsokat, amelyek a 10 pg/ml tetraciklint is tartalmazó LB agar lemezen nem képesek kinőni. Ezen transzformációs törzsek egyikéből plazmid DNS-t izolálunk, ezt pGPR2EH 1-nek nevezzük (1-2. ábra). Hasonlóképpen a λ-Gproteáz-l 413 DNS-t EcoRI-gyel és HindlII-mal hasítjuk, egy mintegy 3,7 kbp-s DNS fragmentumot izolálunk agaróz gélelektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ, majd ezt a pBR322 EcoRI-HindlII fragmentumában klónozzuk. Ezen az úton alkotjuk meg a pGPR3-EHl-et (1-2. ábra).

A Southern hibridizálás, amelyet ugyanolyan módon végzünk, mint az (1—vii) fejezetben λ-G-proteáz0112-re vagy Z-g-proteáz-1413-ra, feltárja, hogy a fenti pGPR2-EHl és pGPR3-EHl plazmidok a kívánt plazmidok. (Ebben az esetben a DNS-eket kettős emésztésnek vetjük alá EcoRI-gyel és HindlII-mal, és a vonatkozó beiktatásoknak megfelelő ³²P vizsgáló mintákat alkalmazzuk.) (1-ix) Az A. chrysogenum ATCC 11 550-ből származó proteáz gén cDNS és genomikus DNS nukleotid-szekvenciáinak meghatározása.

A λgt-proteáz-2 cDNS-részének (mintegy 1,5 kbp), a pGPR2-EHl Xho-EcoRI fragmentumának (mintegy

1.5 kbp) és a pGPR3-EHl EcoRI-PstI fragmentumának (mintegy 1,8 kbp) nukleotidszekvenciáját a didezoxi-nukleotid szintetikus láncterminációs eljárással határoztuk meg [Sanger F. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)], az M13mpl0 és M13mpll vektorokat (Amershem) alkalmazva a-³²PdCTP-vel együtt. A kapott eredményeket az 1-4. és

1-5. ábrákban mutatjuk be. A λgt-proteáz-2 hosszú, nyitott leolvasó keretét az 1-7. ábrában mutatjuk be. Mivel ezt a cDNS-t egy λβΐ 11 β-galaktozidázzal fuzionált fehérje kifejeződésére alapozva kapjuk meg a fentebb említett antitesttel átvizsgálva, a cDNS-ről és a β-galaktozidáz génről feltételezhető, hogy azonos transzlációs leolvasó keretben vannak, és a transzláció eredményének tekinthetők. Az eredményeket az 1-6. ábrában mutatjuk be. Nyilvánvaló, hogy a két keret éppen fázisban van. Ezen kívül azt az eredményt is kaptuk, hogy a cDNS a Ágt 11-gyel egy 21 bp-s GC-farok résszel van összekapcsolva. Figyelembe véve azt a tényt, hogy az Okayama-Berg eljárást alkalmazzuk a cDNS előállításához, és hogy az említett cDNS készítményben képződött GC farkat rögzítettnek találjuk, a cDNS-t a Lgt-proteáz2-ben csaknem teljesnek becsülhetjük. Ezen cDNS nukleotid-szekvencia elemzésének eredményeit az 1-3. A ábrában mutatjuk be. Az összehasonlítás a nukleotid-szekvenciákban a cDNS és a genomikus DNS között azt jelzi, hogy a genomikus DNS egy része az, amely mRNS-sé átíródik (1-3. B ábra). A promotor és terminátor becsük elhelyezkedését az említett résztől fölfelé illetve lefelé az 1-3. B ábrában mutatjuk be.

HU 212 767 Β

Az aminosav-szekvencia összehasonlítása az A. chrysogenum-eredetű alkálikus proteáz elő-fehérje és az ismert Aspergillus oryzae-eredetű alkálikus proteáz elő-fehérje [Molecular and General Genetics, 279, 3338 (1989)] között feltárja, hogy az előbbiben a 402 aminosavgyök közül 230 azonos az utóbbiban levő megfelelő aminosavgyökök közül 230 azonos az utóbbiban levő megfelelő aminosavgyökökkel, amely 57,2% homológiának felel meg, továbbá feltárja azt, hogy az előbbi egy szerin-proteáz. Ezekre az adatokra és más tanulmányokból kapott adatokra támaszkodva felbecsülhetjük az A. chrysogenum-eredetű érett alkálikus proteáz primer szerkezetét, amelyet az 1-7. ábrában, az 1-285. gyökök közt található aminosav-szekvencia képvisel.

(2) A pCYG-B2 plazmid megalkotása.

(2-i) EcoRI és BamHI szintetikus DNS kapcsolók bevezetése az A. chrysogenum ATCC ll 550 eredetű proteáz gén genomikus DNS-be.

ApGPR2-EHl-DNS-t (1-2. ábra) Smal-gyel hasítjuk, szintetikus EcoRI kapcsolót [d(CCGAATTCGG); Takara Shuzo] adunk hozzá és ligálást végzünk T4 DNS ligázt alkalmazva, amelyet EcoRI-gyel és BglIIvel végzett hasítás követ. Egy EcoRI-BglII fragmentumot (mintegy 1,02 kbp) izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Ezt a DNS fragmentumot (mintegy 1,02 kbp) öszszekeverjük a pBR322 vektor plazmid EcoRI-BamHI fragmentumával (4,0 kbp), és ligálást végzünk T4 DNS ligás alkalmazásával, így kapjuk meg a pGPR-PA3 plazmidot.

ApGPR-PA3 DNS-t Alul-gyel hasítjuk, egy szintetikus pBamHI kapcsolót [d(pCGGATCCG); Takara Shuzo] adunk hozzá, és ligálást végzünk t! DNS ligáz jelenlétében. A ligálási terméket azután EcoRI-vel és BamHI-gyel hasítjuk, és egy EcoRI-BamHI fragmentumot (mintegy 0,59 kbp) izolálunk poliakrilamid (8%) gélelektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Ezt a DNS fragmentumot (mintegy 0,59 kbp) összekeverjük a pBR322 vektor plazmid EcoRI-BamHI fragmentumával (4,0 kbp), és ligálást hajtunk végre T4 DNS ligázt alkalmazva, így kapjuk meg a pGPRPA3Q2 plazmidot.

Az EcoRI és BamHI kapcsolók bevezetésének helyeit a proteáz gén DNS promotor területébe az 1-8. ábrában mutatjuk be. A 0,59 kbp-s DNS nukleotidszekvenciáját az 1-9. ábrában mutatjuk be.

(2-íí) Egy BamHI szintetikus DNS kapcsoló bevezetése az A. chrysogenum ATCC 11 550-eredetű proteáz genomikus DNS-be.

ApGPR3-EHl DNS-t (1-2. ábra) Ball-gyel hasítjuk, egy szintetikus BamHI kapcsolót [d(CCGGATCCG); Takara Shuzo] adunk hozzá, és ligálást végzünk T4 DNS ligázt alkalmazva, amelyet hasítás követ BamHI-gyel, Pstl-gyel és Xhol-gyel. Egy BamHI-PstI DNS fragmentumot (mintegy 0,92 kbp) izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel; ezt elektroforetikus elúció követi. Ezt a DNS fragmentumot (mintegy 0,92 bp) összekeverjük a pUC18 vektor plazmid BamHI-PstI DNS fragmentumával (2,7 kbp), és ligálást végzünk T4 DNS ligáz alkalmazásával; így kapjuk meg a pGPR-TB 1 plazmidot.

A BamHI kapcsoló bevezetésének helyét a proteáz gén DNS terminátor területébe az 1-8 ábrában mutatjuk be. A 0,92 kbp-s DNS-t tartalmazó nukleotid szekvenciát az 1-10. ábrában mutatjuk be.

(2-iii) Egy promotor és egy terminátor klónozása a pCEP97-be (a pCYG-B2 megalkotása) (1-11. ábra).

A pCEP97 plazmidot ΑρΤΜ^κ) [Isogai és munkatársai: 61-20 953 számú japán szabadalmi közzétételi irat (Kokai Tokkyo Koho); ez az Escherichia coli C600 rm~ (pCEP97)-ből (ATCC 39 971) izolálható hagyományos eljárásokkal] (1-11. ábra) hasítjuk EcoRI-gyel és HindlII-mal. Egyidejűleg pGPR-PA3Q2-t (Ap^RCm^s) [lásd (2-i) fejezet; ez egy mintegy 0,59 kbp-s promotort tartalmaz] hasítunk EcoRI-gyel és BamHI-gyel, ezen kívül pGPR-TB 1-et (Ap^RCm^s) [lásd (2—ii) fejezet; ez egy mintegy 0,92 kbp-s terminátort tartalmaz] hasítunk BamHI-gyel és HindlII-mal. A pCEP97 EcoRI-HindlII DNS fragmentumát (mintegy 6,1 kbp) és a PGPR-TB 1 BamHI-HindIII DNS fragmentumát (mintegy 0,93 kbp) izoláljuk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, majd az ezt követő elektroforetikus elúcióval.

A pGPR-PA3Q2 EcoRI-BamHI DNS fragmentumát izoláljuk akrilamid gél (8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Ezt a három DNS fragmentumot összekeverjük és ligáljuk egymással T4 DNS ligázt alkalmazva, és a ligálási keveréket E. coli DH1 transzformálására alkalmazzuk. Azokat a transzformáns törzseket, amelyek képesek növekedni 50 (lg/inl ampicillint is tartalmazó LB agar lemezeken, de nem képesek növekedni 50 pg/ml klóramfenikolt is tartalmazó LB agar lemezeken, kinyerjük. Ezen törzsek egyikéből plazmid DNS-t izolálunk, ezt pCYGB2-nek nevezzük el (1-11. ábra). Az említett DNS a kívánt DNS, amelyet restrikciós enzimeket alkalmazva igazolunk.

(3) A genomikus TPNS gén DNS klónozása.

(3-i) A genomikus DNS kivonása és tisztítása A. chrysogenum 3112-ből.

A. chrysogenum 3112-t növesztünk 30 °C hőmérsékleten, 100 ml térfogatban, 5 napon át olyan tápközegben, amely 1% glükózt, 3% oldható keményítőt, 3% kukoricalekvárt (CSL), 1,5% szójalisztet és 0,5% CaCO₃-at tartalmaz (pH 6,5). A sejteket folyékony nitrogénnel végzett hűtés közben mozsárban összetörjük és puffért adunk hozzá, amelynek összetétele a következő: 50 mmól/1 trisz-HCl (pH 7,5), 10 mmól/1 EDTA és 1% SDS. Az így létrejött keveréket 65 °C hőmérsékleten melegítjük 10 percen át. Kétszeri fenolos extrahálás után etanolos kicsapást végzünk. A csapadékot 5 pg/ml RN-áz A-val (Sigma), majd I00pg/ml proteáz K-val (merek) kezeljük. A fenolos extrahálos, etanolos kicsapás és szacharóz gradiens centrifugálás (5-+20% szacharóz; Hitachi SPR28 ultra10

HU 212 767 Β centrifuga rotor; 22 000 fordulat/perc; 13 óra) tisztított genomikus DNS-t szolgáltat.

3-ii) A genomikus izopenicillin N szintetáz (IPNS)

DNS méretazonosítása.

Az A. chrysogenum-eredetű IPNS gén DNS nukleotid szekvenciájára alapozva, amelyet Sámson S. M. és munkatársai klónoztak [Sámson S. M. és munkatársai: Natúré 318, 191 (1985)], az alábbi három szintetikus vizsgáló mintát (két 15-mer DNS-t és egy 12-mer DNS-t) szintetizálunk az Otsuka Eiko által leírt eljárással [Bunshi Idengaku Jikkenho (Experiments in Molecular Genetics), Kyoritsu Shuppan (1983), 298-307 oldal] (1) vizsgáló mint: 5'-CTATTCGGCGATGAC-3' (2) vizsgáló minta: 5'-AAGGAGAAGAAGCTC-3' (3) vizsgáló minta: 5-CTCCTTGTCATC-3'.

Az (1) és (2) vizsgáló mintát Inglia és munkatársai eljárásával jelezzük [Inglia és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 9, 1627 (1983)], T4 polinukleotid kinázt (BRL) és y^P-ATP-t alkalmazva. Ezután elkészítjük az (1), (2) és (3) vizsgáló mintákat tartalmazó kevert DNS oldatot, 95 °C hőmérsékleten 2 percig melegítjük, majd fokozatosan lehűtjük szobahőmérsékletre; ilyen módon visszük végbe az összeforrasztást. Az összeforrasztott terméket NENSORB 20-at alkalmazva tisztítjuk (DuPont; a terméket a Daiichi Kagaku importálja Japánba és forgalmazza), a gyártó cél által mellékelt kézikönyv szerint. Ezzel egyidejűleg a (3—i) fejezetben elkészített, A. chrysogenum 3112-eredetű genomikus DNS-t (mintegy 5 pg) BamHI-gyel elhasítjuk és a hasítási keveréket agaróz gél (0,8%) elektroforézisnek vetjük alá, amelyet átvitel követ nitrocellulóz szűrőre, majd Southern hibridizálás követ Southern eljárása szerint [Southern E. M.: J. Mól. Bioi. 98, 503 (1975)]. a hibridizál ást egy éjszakán át végezzük 42 °C hőmérsékleten 6xSSC-t [0,9 mól/1 NaCl, 0,09 mól/1 nátriumcitrát (pH 7,0), 5xBFP-t (lxBFP: 0,02% szarvasmarha szérum albumin, 0,02% Ficoll (molekulatömeg: 40 000), 0,02% poli vinilpirrolidon], 0,5% SDS-t, 100 mg/ml hordozó DNS-t (borjú timusz DNS) és a fentebb említett jelzett DNS-t alkalmazva. A szűrőt azután egyszer mossuk 6xSSC-vel 55 °C hőmérsékleten, majd kétszer 2xSSC-vel (2xSSC a 6xSSC háromszoros hígítása). A vizsgálat eredményeképpen egy mintegy 3,1 kbp-s DNS fragmentumot találunk a hibridizálás szempontjából pozitívnak.

(3—iii) Az IPNS gén klónozása

Mintegy 20 pg, a (3—i) fejezetben előállított A. chrysogenum 3112-eredetű genomikus DNS-t (mintegy

2,5-4,4 kbp) különítünk el agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Ezzel egyidejűleg pBR322 vektort hasítunk BamHI-gyel, az emésztményt összekeverjük a fentebb említett DNS keverékkel (mintegy 2,5-4,4 kbp), majd ligálást végzünk T4 DNS ligázt alkalmazva, és a ligálásikeveréket E. coli DH1 transzformálására használjuk fel. Mintegy 2,4x1ο⁵ telep tűnik fel egy 50 pg/ml ampicillint is tartalmazó LB agar lemezen. A telepek mintegy 5%-a nem növekszik a 10 pg/ml tetraciklint is tartalmazó LB agar lemezen. így mintegy 1,2-10⁴ telep tartalmazza az A. chrysogenum 3112-eredetű DNS-t, A plazmid DNS-t a 2,4x1ο⁵ transzformáns mindegyikéből izoláljuk és EcoRI-gyel hasítjuk. Abból a célból, hogy az A. chrysogenum 3112-eredetű DNS-től mentes eredeti vektor plazmidot kizárjuk, az EcoRI emésztményt agaróz gél (0,8%) elektroforézisnek vetjük alá, és a mintegy 6,5-9,5 kbp mérettartományban levő DNS-ek keverékét elektroforetikus elúcióval elkülönítjük. Ezt a DNS-keveréket ligálásnak vetjük alá T4 DNS ligázt alkalmazva, és a ligálási keveréket E. coli DH1 transzformálására alkalmazzuk. Ezen a módon mintegy 2,6-10⁴. 50 pg/ml ampicillinre rezisztens transzformánst kapunk.

A fentebb említett mintegy 2,6-10⁴, genomikus DNS-t tartalmazó E. coli transzformánst 50 pg/ml ampicillint is tartalmazó LB agar lemezen növesztjük 37 °C hőmérsékleten 9 órán át, hogy telepeket kapjuk, amelyeket azután nitrocellulóz szűrőre viszünk át és tovább inkubáljuk 250 pg/ml klórfenikolt is tartalmazó LB agar lemezen 37 °C hőmérsékleten 12 órán át. A szűrőt azután 0,5 n NaOH-1,5 mól/1 NaCl oldattal kezeljük szobahőmérsékleten 4 percig a baktériumok lízise és a DNS denaturálása érdekében, majd semlegesítünk két adag 0,5 mól/1 trisz-HCl (pH 7,0)-1,5 mól/I NaCl oldattal kezelve szobahőmérsékleten, adagonként 5-5 percig kezelve, majd a mintát hibridizálásnak vetjük alá, amelyet a (3-ii) fejezetben leírt eljárással hajtunk végre, az (1) és (2) vizsgáló minták összekapcsolásából létrejött, ³²P-jelzett 30-mer DNS-t alkalmazva. Öt, hibridizálás szempontjából pozitív törzset kapunk. Az ezekből a törzsekből izolált plazmid DNS-eket teljesen azonosnak találjuk egymással, amikor restrikciós enzimes hasításos elemzéssel összehasonlítjuk (1-12. ábra).

(3-iv)A pIPS105 klónozása MÍ3mpl0-be.

Az Amersham-féle M13 klónozó készletet alkalmazzuk, és a készlethez csatolt kézikönyvben leírt munkamenetet követjük. így a pIPS105 DNS-t Sallgyel hasítjuk és egy mintegy 0,63 kbp-s DNS fragmentumot izolálunk agaróz gél (1,5%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Ezt a DNS fragmentumot összekeverjük az M13mpl0 DNS Sallemésztményével, és ligálást végzünk T4 DNS ligázt alkalmazva. A ligálási keveréket alkalmazzuk E. coli JM105 (Amersham), mint gazdaszervezet transzformálására. A fehér tarfoltokat, amelyek X-gal és IPTG jelenlétében keletkeznek, összegyűjtjük és fág-sokszorozást végzünk, gazdaszervezetként E. coli JM 105-öt alkalmazva. Az RF (replikáló forma) DNS-t izoláljuk a gazdasejtekből; ezt M13mpl0-IPS3-2-nek nevezzük. Hasonlóképpen elhasítjuk a pIPS105 DNS-t Pstl-gyel és BamHI-gyel, és egy mintegy 1,0 kbp-s DNS fragmentumot izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Ezt a DNS fragmentumot (mintegy 1 kbp) az M13mpl0 PstI— BamHI DNS fragmentumaihoz ligáljuk, T4 DNS ligázt alkalmazva. A klónozást ugyanolyan módon végezzük, mint fentebb. A kapott fágot E. coli JM 105-öt, mint gazdasejtet alkalmazva sokszorozzuk, és az RF DNS-t izoláljuk; ezt M13mpl0-IPS3-nak nevezzük.

HU 212 767 Β

Az M13mplO-IPS4-2 ss-DNS-e (egyszálú DNS) mintegy 0,63 kbp-s Sáli területének DNS nukleotidszekvenciáját a didezoxinukleotid szintetikus lánc-terminációs eljárással határozzuk meg (az Amersham szekvenciaelemző készletet alkalmazva). Az említett területből a 478 bp-s Sall-NocI DNS fragmentumot az 1-13. ábrában mutatjuk be. Ilyen módon az IPNS gén jelenlétét igazolhatjuk és a promotor területet azonosíthatjuk. Az M13mpl0-IPS3 IPNS terminátor restrikciós enzim-térképét és az M13mpl0 multiklónozó hely részét az 1-14. ábrában mutatjuk be. Az IPNS gén promotor és terminátor könnyen szintetizálható egy DNS szintetizáló berendezés segítségével az 1-13. illetve 1-16. ábrákban bemutatott DNS nukleotid-szekvenciák alapján.

(4) A pCYG-EG2 megalkotása (1—15. ábra) (4-i) A BamHI hely kiiktatása az M13mplO-IPS3ból (1-12. ábra).

Az M13mplO-IPS3 RF DNS-ét BamHI-gyel hasítjuk, majd helyreállítjuk Klenow-fragmentumot alkalmazva (E. coli DNS polimeráz I nagy fragmentum; Amersham) a dNTP-k jelenlétében, ezután ligálásnak vetjük alá T4 DNS ligázt alkalmazva, majd ismét hasítunk BamHI-gyel. A hasítási keveréket E. coli JM105 transzformálására használjuk. A fágot E. coli JM105-öt, mint gazdasejtet alkalmazva sokszorozzuk és az RF DNS-t elkülönítjük a gazdasejtekből. Ezt a DNS-t M13mplO-IPS3-D8-nak nevezzük és igazoljuk, hogy az említett DNS nem hasítható BamHI-gyel. Az M13mpl0IPS3-D8 terminátort tartalmazó BclI-EcoRI területének (mintegy 1,0 kbp) DNS nukleotid-szekvenciáját a didezoxinukleotid szintetikus lánc-terminációs eljárással határozzuk meg, ce-³²P-dATP-t és szekvenázt alkalmazva. Ezt a szekvenciát az 1-16. ábra mutatja be.

(4-ii) Az IPNS promotor összekapcsolása a G4I8 rezisztencia génnel.

ATn903 [Oka A. és munkatársai: J. Mól. Bioi. 147, 217 (1987)] G418 rezisztencia génjét (1696 bp-s PvuII fragmentum) tisztítjuk a pCYG97-nek PvuII-vel hasított DNS-éből [61-209 593 számú japán szabadalmi közzétételi irat (Kokai Tokkyo Koho); Ez hagyományos eljárással izolálható Escherichia coli C600 rnr (pCYG97)-ből (ATCC 399 770)]. Ehhez az 1696 bp-s DNS fragmentumhoz egy szintetikus BamHI kapcsolót adunk [d(CCGGATCCGG); Takara Shuzo], és ligálást végzünk T4 ligázt alkalmazva. A ligálási keveréket BamHI-hasításnak és (háromszori) etanolos kicsapásnak vetjük alá, hogy ilyen módon eltávolítsuk a kötetlen maradt kapcsoló DNS-t. Ezzel egyidejűleg a pUC18 DNS-t (Takara Shuzo) BamHI-gyel hasítjuk, az emésztményt összekeverjük a fentebb említett, BamHI-kapcsolóval kötött 1,7 kb-s DNS fragmentummal, és ligálást végzünk T4 DNS ligázt alkalmazva. Az így létrejövő DNS oldatot E. coli JM109 (Takara Shuzo) transzformálásához alkalmazzuk és 20 pg/ml kanamicint is tartalmazó LB agar lemezen kinőtt transzformánsokat kapunk. Ezen transzformánsok egyikéből plazmid DNS-t izolálunk, és ezt pUC-Tn903-F 1-nak nevezzük el. Ennek szerkezetét restrikciós enzimeket alkalmazva igazoljuk. ApUC-Tn903-Fl DNS-t Xholgyel és BamHI-gyel hasítjuk és egy mintegy 1,21 kbps DNS fragmentumot izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Ezzel egyidejűleg az IPNS gén promotort izoláljuk az M13mpl0-IPS4-2 RF DNS-ből olyan módon, hogy HindlII-mal és Ncol-gyel hasítjuk, ezt követi az akrilamid gél (8%) elektroforézis és az elektroforetikus elúció, amelynek végén egy mintegy 0,48 kbp-s DNS fragmentumot (HindlII Pst Sall-NcoI) kapunk. Ebben az Ncol helyben ATG van. Ennélfogva a G418 rezisztencia (kanamicin rezisztencia) gén kifejeződésének lehetővé tételére az Ncol helyet az Xhol helyhez kapcsoljuk egy szintetikus DNS segítségével. így két 31mer szintetikus DNS-t (lásd alább) szintetizálunk, Applied Biosystems 381A modell DNS szintetizáló berendezést alkalmazva.

5'-CATGAGCCATATTCAACGGAAACGTCTTGC

-3'

5'-TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGC

T-3'

A két szintetikus DNS-t (10-10 pg) összekeverjük pl TE pufferben, 95 °C hőmérsékleten melegítjük 2 percen át, majd fokozatosan lehűtjük szobahőmérsékletre összeforrasztás céljából. A pBR322 vektor plazmádból származó 4,0 kbp-s HindlII-BamHI fragmentumot, az M13mpl00-IPS10-IPS4-2-eredetű HindlINcol fragmentumot (mintegy 0.49 kbp), az összeforrasztott szintetikus DNS-t (31 bp) és a pUC-Tn903-Fl eredetű XhoI-BamHI fragmentumot (mintegy

1,21 kbp) összekeverjük és ligálást végzünk T4 DNS ligázt alkalmazva. A ligálási keveréket E. coli DH1 transzformálására használjuk fel Hanahan D. eljárásával. [Hanahan D: J. Mól. Bioi. 166, 557 (1983)] és ampicillinre rezisztens , tetraciklinre érzékeny transzformánsokat kapunk. Ezekből a transzformánsokból egyenként plazmid DNS-t izolálunk és restrikciós enzimes elemzésnek vetjük alá a szerkezet bizonyítására. Ezen plazmidok egyikét pBCG-D3-nak nevezzük.

(4—iii) Az IPNS terminátor összekapcsolása a

G418 rezisztencia génnel.

A (4-i) fejezetben előállított M13mpl0-IPS3-D8nak RF DNS-ét PvuII-vel és BclI-gyel hasítjuk és egy mintegy 1,1 kbp-s DNS fragmentumot izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel. amelyet elektroforetikus elúció követ. Ezzel egyidejűleg a (4-ii) fejezetben előállított pBCG-D3 DNS-t BamHI-gyel és PvuII-vel hasítjuk és egy mintegy 4,05 kbp méretű BamHI-Pvu11 DNS fragmentumot izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követő A BclI-PvuII DNS fragmentumot (BclI-SacI-Smal SacI EcoRI-PvuII) (mintegy 1,1 kbp) összekeverjük, és ligálást végzünk T4 DNS ligázt alkalmazva. A ligálási keveréket E. coli DH1 transzformálására alkalmazzuk. Az egyes így kapott ampicillin-rezisztens transzformánsokból plazmid DNS-t izolálunk, és szerkezetüket restrikciós enzimes elemzéssel igazoljuk. A plazmidok egyikét pBCG-DTl-nek nevezzük.

HU 212 767 Β (4-iv) A G4I8 rezisztencia kifejező egység klónozása pCEP97-be (1-15. ábra).

Mintegy 10 pg pCEp97 DNS-t (1-15. ábra) 30 egység PvuII-vel kezelünk 37 ”C hőmérsékleten 1 órán át (végső térfogat: 200 pl), a DNS részleges hasítása céljából. Fenolos extrahálás és éteres extrahálás után a DNS-t etanollal kicsapjuk. Ezt a DNS-t azután teljességig hasítjuk Sall-gyel és egy mintegy 6 kbp-s DNS-t izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Ezzel egyidejűleg 1 mg, (4—iii) fejezetben előállított pBCG-DTl DNS-t 20 egység Smal-gyel kezelünk 37 °C hőmérsékleten 30 percen át (végső térfogat: 100 pl), hogy részleges hasítást érjünk el. Fenolos extrakció és éteres extrakció után a DNS-t etanollal kicsapjuk. Ezt a DNS-t azután teljességig hasítjuk Sall-gyel és egy mintegy 2,7 kbp-s DNS fragmentumot izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. A PvuII-PvuII-SalI DNS fragmentumot (mintegy 6 kbp) és a Sall-Smal-Smal DNS fragmentumot (mintegy

2,7 kbp) összekeverjük és ligálást végzünk T4 DNS ligázt alkalmazva. A ligálási keveréket E. coli DH1 transzformálására alkalmazzuk. Az 50 mg/ml ampicillint is tartalmazó LB agar lemezen kinőtt telepekből 64 olyan transzformánst kapunk, amely képes 35 pg/ml klórfenikolt is tartalmazó LB agar lemezen növekedni. Ezek mindegyikéből plazmid DNS-t izolálunk és megvizsgáljuk a plazmid méretére agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelynek során 13 olyan transzformánst találunk, amely a kívánt méretű. Ezek egyikét pCYGE15-nek (1-15. ábra) nevezzük, és ennek szerkezetét restrikciós enzimeket alkalmazó elemzéssel igazoljuk.

(4-v) Proteáz kifejező egység klónozása pCYGE15-be (a pCYG-EB2 megalkotása) (1-15. ábra). Mintegy 20 pg, a (4—iv) fejezetben előállított pCYGE15 DNS-t kezelünk 8 egység HindlII-mal 37 °C hőmérsékleten 30 percig (végző térfogat 200 pl), hogy a DNS-t részlegesen hasítsuk. Fenolos extrakció és éteres extrakció után a DNS-t etanollal kicsapjuk. Ezt a DNS-t azután teljességig hasítjuk EcoRI-gyel és egy mintegy 7,5 kbp méretű DNS fragmentumot izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus eluálás követ. A HindlII-HindlII-EcoRI DNS fragmentumot (mintegy

7,5 kbp) és az EcoRI-HindlII DNS fragmentumot (mintegy 1,5 kbp) összekeverjük és ligálást végzünk T4 DNS ligázt alkalmazva. A ligálási keveréket E. coli DH1 transzformálására használjuk. Az 50 pg/ml ampicillint is tartalmazó LB agar lemezeken kinőtt telepek közül kiválasztjuk azokat a transzformánsokat, amelyek nem tudnak kinőni 35 pg/ml klórfenikolt is tartalmazó LB agar lemezeken. Ezen transzformánsok mindegyikéből plazmid DNS-t izolálunk és a szerkezet igazolása céljából elemezzük restrikciós enzimeket alkalmazva. Az így kapott kívánt plazmidok egyikét pCYG-EB2-nek nevezzük (1-15. ábra).

2. példa

Egy pCYG-HB51-nek nevezett, A. chrysogenumban Hm^R kifejezésére képes plazmidot alkotunk meg olyan módon, hogy 5' oldalán egy szintetikus DNS-sel módosított pLG90 plazmid-eredetű Hm^R gént bevezetünk a pCYG-B2 plazmidba (1-11. ábra), amely BamHI helyénél egy proteáz gén kifejező egységet (1-11. ábra) tartalmaz. A pLG90 plazmid és a megalkotására szolgáló eljárás ismert [von den Elzen P. J. M. és munkatársai: Plantg Molecular Biology 5, 299-302 (1985)/ és Gritz L. és Davies J.: Gene 25, 179-188 (1983)].

(1) A pCYG-HB51 plazmid megalkotása.

(i) A pHMP—E5 plazmid megalkotása. pPGL90-et hasítunk Hphl restrikciós enzimmel, majd BamHI restrikciós enzimmel. így Phhl-BamHI fragmentumot (mintegy 1,03 kbp) izolálunk agaróz gél (1,5%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ [lásd „Molecular Cloning (fentebb idézett munka), 150. és 164. oldal].

Egyidejűleg abból a célból, hogy az ATG kodontól éppen felfelé levő ATG-t eltávolítsuk a pLG90 Hm^R BamHI DNS-ében, a 2-1. ábrában bemutatott 28-mer és 33-mer DNS-eket szintetizáljuk, Applied Biosystems 381A Modell DNS szintetizáló berendezést alkalmazva a berendezéshez tartozó kézikönyv szerint. A szintetizált DNS-eket Applied Biosystems oligonukleotid tisztító gyertyát (DPC gyertya) alkalmazva tisztítjuk a berendezéshez mellékelt kézikönyv szerint. A szintetizált DNS-eket (10-10 pg) összekeverjük 100 pg végső térfogatban, TE pufferben, és 95 °C hőmérsékleten 10 percen át melegítjük. A keveréket azután fokozatosan lehűtjük szobahőmérsékletre abból a célból, hogy a két DNS-t hatékonyan összeforrasszuk. 28 mer: 5-TTTTTCATAGCTGTTTCCTGTGGATCCG-3' mer: 5-AATTCGGATCCACAGGAAACAGCTATGAAAAAG-3'

Egy kevert oldatot készítünk, amely három DNS-t, nevezetesen az összeforrasztott szintetikus DNS-t, a fentebb kapott HphI-BamHI DNS fragmentumot (1,03 kbp) és a pUC 18 plazmid (Takara Shuzo) EcoRIBamHI fragmentumát (2,7 kbp), tartalmaz és ligálást végzünk T4 DNS ligázt alkalmazva. A ligálási keveréket E. coli JM109 (Takara Shuzo) transzformálására használjuk fel. Az 50 pg/ml ampicillint is tartalmazó LB agar lemezen kinőtt telepek közül kiválasztjuk azokat, amelyek 150 pg/ml higromicin B-t és 0,5 mmól/1 IPTG-t is tartalmazó LB agar lemezeken is képesek kinőni. A transzformánsok egyikéből izolált plazmidot pHMP-E5-nek (2-1. ábra) nevezzük. Ennek szerkezetét restrikciós enzimek alkalmazásával igazoljuk. A pHMP-E5 egy szintetikus DNS területet tartalmazó részének nukleotid-szekvenciáját a didezoxinukleotid szintetikus láncterminációs eljárással határozzuk meg, és úgy találjuk, hogy ez a tervezettel azonos.

(ii) A pCYG-HB51 megalkotása.

A pHMP-E5-öt BamHI-gyel hasítjuk és egy mintegy 1,06 kbp méretű DNS-t izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Egyidejűleg az A. chrysogenumban levő pCYG-B2 kifejező vektort (1-11. ábra) BamHI-gyel

HU 212 767 Β hasítjuk. A két BamHI DNS fragmentumot összekeverjük és ligáljuk egymással T4 DNS ligázt alkalmazva, és a ligálási keveréket E. coli JM109 transzformálására használjuk. Az 50 g/ml ampicillint is tartalmazó LB agar lemezeken kinőtt telepek közül összeszedjük azokat, amelyek 150 g/ml higromicin B-t is tartalmazó LB agar lemezeken is képesek nőni. Mivel az A. chrysogenum ATCC 11 550-eredetű proteáz gén mind promotorja, mind terminátora mutat promotor aktivitást E. coliban, egy SD szekvencia (riboszóma kötőhely szekvencia) jelenléte egy ATG kodon előtt transzlációt indukálhat E. coliban. Ennél fogva az Ap^RHm^R törzsek magukban foglalhatnak olyan törzseket, amelyek a Hm^R gént az egyik irányban tartalmazzák, és olyan törzseket, amelyek az említett gént az ellenkező irányban tartalmazzák. Ezért ezen törzsek mindegyikéből plazmid DNS-t izolálunk és EcoRI-gyel hasítjuk, és elbíráljuk a Hm^R gén irányát agaróz gél (0,8%) elektroforézissel. Azon plazmidok egyikét, amelyekben az említett gén azonos irányban van, mint a proteáz gén promotor, pCYG-HB51-nek nevezzük (2-1. ábra). Az ebbe a pCYG-HB51 plazmidba beiktatott higromicin B rezisztencia gén nukleotid-szekvenciáját a 2-2. ábrában mutatjuk be, az ezzel a nukleotid szekvenciával kódolt aminosavszekvenciával együtt.

3. példa (1) A pDAO-EBlOl plazmid (a D-aminosav-oxidáz génhez szolgáló kifejező vektor) és a pVEB104 plazmid (a CC aciláz génhez szolgáló kifejező vektor) megalkotása.

A 7ACA vagy 7 ADCA közvetlen fermentációs előállításához az Acremonium chrysogenum fajhoz tartozó, cefalosporin C (CC)- vagy dezacetil-cefalosporin C (DCC)-termelő mikroorganizmus alkalmazásával a 3-2. ábrában bemutatott utakat vehetjük figyelembe, így az utak magukba foglalják az alábbi változatokat:

(1) egy CC vagy DCC termelő törzs transzformálása valamely CC aciláz gént tartalmazó 7ACA vagy 7ADCA termelő vektorral;

(2) egy CC vagy DCC törzs transzformálása valamely D-aminosav oxidáz (DAO) gént és CC aciláz gént tartalmazó 7ACA vagy 7ADCA termelő vektorral;

(3) egy CC vagy DCC termelő törzs transzformálása valamely DAO gént és GL-7ACA aciláz gént tartalmazó 7ACA vagy 7ADCA termelő vektorral.

A fenti célokból egy CC aciláz gént tartalmazó kifejező vektort és egy DAO gént tartalmazó kifejező vektort alkotunk meg. Igazoljuk, hogy mindegyik enzim kifejezhető Saccharomyces cerevisiae-ban. A jelen

3. példában követett munkamenetet vázlatosan a 3-1. ábrában mutatjuk be.

(i) pDAO-EBlOl megalkotása.

ApCFS315 DAO-kifejezésű plazmidot (3-5. ábra) E. coli JM109 (pCFS315) FERM BP-1916) törzsből izoláljuk hagyományos eljárással, és BamHI-gyel hasítjuk, majd agaróz gél (0,8%) elektroforézissel és az ezt követő elektroforetikus elúcióval egy 1,24 kbp-s DNS-t izolálunk. A DAO cDNS, amelyet a pCFS315 plazmid tartalmaz, nukleotid szekvenciáját a 3-11. ábrában mutatjuk be. Egyidejűleg a pCYG-EB2 vektor DNS-t (1-15. ábra), amely egy A. chrysogenumban levő kifejező egységet tartalmaz, BamHI-gyel hasítjuk. A BamHI DNS fragmentumot összekeverjük és ligáljuk egymással T4 DNS ligázt alkalmazva. A ligálási keveréket E. coli DH1 (ATCC 33 849) transzformálására alkalmazzuk. Az 50 g/ml ampicillint is tartalmazó LB agar lemezeken növekedni képes transzformánsokat összegyűjtjük. Ezen transzformánsok mindegyikéből plazmid DNS-t izolálunk, BamHI-gyel vagy EcoRl+PvuII-vel hasítjuk, és agaróz gél (1,5%) elektroforézisnek vetjük alá. Az egyik olyan fragmentumot ad és EcoRI hasításakor egy 1,33 kbp-s DNS fragmentumot ad pDAO-EB 101-nek nevezzük (3-3. ábra).

(ii) A pVEBI04 megalkotása.

CC aciláz aktivitást mutató Pseudomonas diminuta V22 törzset izolálunk földmintából és ennek genomikus DNS-éből aciláz gént klónozunk, gazdaszervezetként E. colit használva és a CC aciláz aktivitást alkalmazva a kimutatáshoz. Ennek a génnek N-terminális oldatát Pstl-gyel kimetsszük, a C-terminális oldat Bal 31-gyei végzett kezeléssel eltüntetjük, hogy a gén méretét mintegy 3 kbp-re csökkentsük, így megalkotjuk a pCPV22P-t (3-6. ábra) ezt a gént és ehhez a Km^R pHSG298-at, mint vektort alkalmazva [Takara Shuzo; Takeshita S. és munkatársai: Gene 61, 63-74 (1987)].

A pCPV22P aciláz génjéből kiindulva és az N-terminális oldalt eltüntetve az ATG-től fölfelé elhelyezkedő Miül helyig, megalkotjuk a pV22B 1-et (3-6. ábra).

Úgy találjuk, hogy egy AatlI hely szomszédságában közvetlenül a V22 CC aciláz gén ATG kodonjától fölfelé van egy másik ATG, amely eltérő kerethez tartozik. Ezért ezt az ATG-t eltüntetjük olyan módon, hogy egy szintetikus DNS adaptert alkalmazunk, és megalkotjuk a pV22B5-All-et (3-8. ábra). Egy olyan aciláz gén, amelyből az említett ATG ki van iktatva, klónozásával pCYG-EB2 vektorba megalkotjuk a pVEB104-et (3-4. ábra).

(a) A pV22Bl megalkotása és az N-terminális oldali nukleotid-szekvencia meghatározása.

A pCPV22P plazmidot E. coli JM109 (pCPV22P)

FERM-BP 2704)-ből izoláljuk, és 15 pg ilyen DNS-t kezelünk 30 egység Miül restrikciós enzimmel (Toyobo) 37 °C hőmérsékleten 15 percen át, hogy a DNS-t részlegesen hasítsuk. Fenolos extrahálást és éteres extrahálást követően a DNS-t etanollal kicsapjuk és Klenow fragmentummal (az E. coli DNS polimeráz I nagy fragmentuma) (Takara Shuzo) kezeljük a dNTP-k jelenlétében, hogy a hasítási helyeket tompa végűvé tegyük. Fenolos extrahálást és éteres extrahálást követően a DNS-t etanollal kicsapjuk. A DNS-t EcoRI-gyel hasítjuk és egy mintegy 1,1 kbp méretű DNS-t izolálunk agaróz gél (1,5%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. A fenti DNS fragmentumot (mintegy 1,1 kbp) és a pUC19 plazmid vektor (Takara Shuzo) Smal-EcoRI DNS fragmentumát (2,7 kbp) összekeverjük és ligáljuk egymással T4 DNS

HU 212 767 Β ligázt alkalmazva, így kapjuk meg a pV22F2 plazmidot (3-6. ábra).

Mivel az aciláz C-terminális oldalán nincs BamHI hely, megkíséreljük egy BamHI hely bevezetését a C terminális oldalon olyan módon, hogy a pCPV22P aciláz génjének irányát megfordítjuk. A pCPV22P-t Pstlgyel hasítjuk és újraligálásnak vetjük alá T4 DNS ligázt alkalmazva, majd az újraligálási keveréket E. coli JM109 transzformálására alkalmazzuk. Az 50 g/ml .........-t, 100 g/ml X-galt és 0,5 mmól/1 IPTG-t is tartalmazó LB agar lemezeken kinőtt fehér transzformáns telepeket kinyerjük (a kék telepek olyan pHSG298 vektort tartalmaznak, amelyben nincs aciláz gén beiktatás). Az egyes transzformásokból a plazmid DNS-t izoláljuk és Sall-gyel hasítjuk, és a pV22R6-ot (3-6. ábra), amelybe az aciláz gén fordított irányban van beiktatva, agaróz gél (0,8%) elektroforézissel izoláljuk.

A pV22F2-t HindlII-mal és EcoRI-gyel hasítjuk, és egy HindlII-EcoRI fragmentumot (mintegy 1,2 kbp) izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Ezzel egyidejűleg pV22R6-ot hasítunk EcoRI-gyel és BamHI-gyel és egy EcoRI-BamHI fragmentumot (mintegy 1,4 kbp) izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. A fentebb említett HindlIIEcoRI fragmentumot (mintegy 1,2 kbp) és EcoRIBamHI fragmentumot (mintegy 1,4 kbp), továbbá a pHSG399 vektor plazmid HindlII-BamHI fragmentumot [Takara Shuzo; Cm^R-t, mint markert tartalmazó plazmid; az E. coli JM109 (pHSG399) képes növekedni 30 pg/ml klóramfenikolt is tartalmazó LB agar lemezen] összekeverjük és ligálást végzünk T4 DNS ligázt alkalmazva; így kapjuk meg a pV22Bl plazmidot (3-6. ábra).

A pV22Bl-et BamHI-gyel és EcoRI-gyel hasítjuk és egy BamHI-EcoRI fragmentumot (mintegy 2,5 kbp) izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Ezt a DNS fragmentumot az M13mpl8 és az Ml3mp 19 EcoRI-BamHI fragmentumába klónozzuk és a pV22Bl-be iktatott aciláz gén nyitott leolvasó keretének DNS nukleotid szekvenciáját meghatározzuk (3-7. ábra). A nukleotid szekvencia meghatározásához a-³²P-sATP-t és szekvenázt alkalmazunk [Tábor S. és Richardson C. C.: J. Bioi. Chem. 264, 6447 (1989)] (United States Biochemical Corporation) és Sanger és munkatársai didezoxinukleotid szintetikus láncterminációs eljárását [Sanger F. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)] követjük. A V22-eredetű aciláz és az ismert Pseudomonas sp. SE83-eredetű aciláz [Matsuda A. és munkatársai: J. Bacteriol. 169, 5821 (1987)] aminosav szekvenciájának összehasonlítása feltárja, hogy a 774 aminosavgyökből 53 különbözik.

(b) A pV22BS-All megalkotása (ATG kiiktatása az ATG-től fölfelé).

A pV22Bl-et EcoRI-gyel hasítjuk és a mintegy

3,3 kbp-s és mintegy 1,38 kbp-s DNS fragmentumokat izoláljuk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Az 1,38 kbp-s DNS fragmentumot a pV22BS-All megalkotásában használjuk fel pV22BDS 1-ből. A 3,3 kbp-s DNS fragmentumot ligálásnak vetjük alá T4 DNS ligázt alkalmazva, így kapjuk meg a pV22BD3 plazmidot (3-8. ábra).

A pV22BD3-at AatlI-vel és BamHI-gyel hasítjuk és egy mintegy 3,3 kbp-s DNS-t izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Ezzel egyidejűleg két szintetikus DNS-t (19-mer és 11-mer) készítünk hagyományos eljárásokkal.

19-mer: 5'-GATCC GGTACC AAG GACGT-3'

11-mer: 5-CCTTGGTACCG-3'

A szintetikus DNS-eket úgy tervezzük, hogy egy KpnI hely képződjék, amely megkönnyíti a beleiktatott klón azonosítását. A szintetikus DNS-eket (10-10 pg) összekeverjük 100 pl végső térfogatban, TE pufferben, 90 °C hőmérsékleten 2 percig hevítjük és fokozatosan lehűtjük szobahőmérsékletre, ilyen módon végezve el a két DNS összeforrasztását. A fentebb említett AatlIBamHI DNS fragmentumot (mintegy 3,3 kbp) és az összeforrasztási termék DNS-t összekeverjük és ligáljuk egymással T4 DNS ligázt alkalmazva, hogy megkapjuk a pV22BDSl plazmidot (3-8. ábra). Mivel ez a DNS tartalmazza az újonnan bevezetett KpnI helyet, könnyű meghatározni, vajon a szintetikus DNS rész jelen van-e egy későbbi termékben.

A pV22BDSl-et EcoRI-gyel hasítjuk, majd összekeverjük a fentebb említett EcoRI-EcoRI DNS fragmentummal (mintegy 1,38 kbp), és ligálást hajtunk végre a T4 DNS ligázt alkalmazva. A ligálási keveréket E. coli DH1 transzformálására alkalmazzuk, és kinyerjük azokat a transzformánsokat, amelyek 30 pg/ml klóramfenikolt is tartalmazó LB agaron növekednek. Ezen transzformánsokból plazmid DNS-t izolálunk és Pstl-gyel hasítjuk. Az agaróz gél (0,8%) elektroforézis a pV22BS-Al 1-et eredményezi, amely a kívánt irányban tartalmazza az 1,38 kbp-s EcoRI DNS fragmentumot (3-8. ábra). A pV22BS-Al 1 hasítása Pstl-gyel két DNS fragmentumot eredményez mintegy 2,5 kbp és

2,2 kbp mérettel, ezek könnyen megkülönböztethetők egymástól. A pV22BS-All aciláz gén területének (BamHI, mintegy 2,5 kbp) restrikciós enzimes hasítási térképét a 3-10. ábrában mutatjuk be.

(c)A pV22BS-AU aciláz génjének klónozása egyegy Λ. chrysogenumban működőképes gén kifejező egységbe.

A pV22BS-Al 1-et BamHI-gyel hasítjuk és egy mintegy 2,5 kbp-s DNS-t izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Ezzel egyidejűleg a pCYG-EB2 kifejező vektort (1-15. ábra), amely az A. chrysogenumban való felhasználáshoz alkalmas, BamHI-gyel hasítjuk. A két BamHI DNS-t összekeverjük és ligáljuk egymással T4 DNS ligáz alkalmazásával, és a ligálási keveréket E. coli DH1 transzformálására alkalmazzuk. Az 50 pg/ml ampicillint is tartalmazó LB agar lemezen növekvő transzformánsokat kinyerjük. A plazmid DNS-t izoláljuk ezekből a transzformánsokból és BamHI-gyel, valamint EcoRI-gyel hasítjuk. Ezen plazmidok egyikét, amely BamHI-gyel végzett hasításkor egy mintegy

HU 212 767 Β

2.5 kbp-s és EcoRI-gyel végzett hasításkor egy mintegy 1,67 kbp-s (ez 1,96 kbp akkor, ha az aciláz gén fordított irányban van) DNS fragmentumot ad, pVEB 104-nek nevezzük (3—4. ábra).

(iii) A pDAO-EBlOl és pVEB 104 kifejeződése S. cerevisiae-ban.

Megvizsgáljuk, vajon az A. chrysogenum ATCC 11 550-eredetű proteáz gén kifejező egység, a F. solani M-0718-eredetű D-aminosav oxidáz cDNS és a P. diminuta V22-eredetű aciláz gén működhetnek-e úgy, hogy enzimaktivitást adnak. S. cerevisiae YNN27-ben [Stinchcomb D. T. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4559 (1980)], amely az alacsonyabbrendű eukarióták egyike.

Az S. cerevisiae YNN27 transzformálását pDAOEB101-gyei vagy pVEB 104-gyel úgy végezzük el, amint ezt a 61-209 593 számú japán szabadalmi közzétételi iratban (Kokai Tokkyo Koho) leírták (Isogai és munkatársai; nyilvánosságra került 1986. szeptember 17-én) (a

2—iii. példában). így az S. cerevisiar YNN27 protoplasztokat összekeverjük 10-10 μΐ (mintegy 5-5 μg) DNS-sel és egy 20% PEG 4000-t tartalmazó puffért adunk a keverékhez, hogy a transzformálás végbemenjen. A szelektálás mintegy 300 pg/ml G418 antibiotikumot alkalmazva mintegy lxlO⁴ transzformán st ad.

Az egyes transzformánsokat YEPD tápközegbe (10 pg/liter élesztőkivonat, 20 g/liter pepton, 20 g/liter glükóz) 5 ml inokuláljuk, ahol a tápközeg tartalmaz még 10 pg/ml uracilt, 40 pg/ml triptofánt és 300 pg/ml G418at is, és tenyésztést végzünk 30 °C hőmérsékleten 3 napon át. A sejteket ezután centrifugálással összegyűjtjük. A sejteket CCNa-val vagy GL-7ACA-val reagáltatjuk és a sejtektől centrifugálással elkülönített felülúszót nagyteljesítményű folyadékkromatográfiának vetjük alá [oszlop; Inertsil ODS-2 (GasChro Kogyo); mozgó fázis:

6.6 mmól/1 foszfát pufferből (pH 7,3) és 3% metanolból összeállított oldat; kimutatás: 254 nm] a tennék mennyiségi értékelése érdekében.

A pDAO-EBlOl-et hordozó transzformánsok esetében 500 pl reaktáns oldatot, amely 5 mg/ml CCNa-t, 0,1 mól/1 foszfát puffért (pH 7,5) és 14 mmól/1 NaN₃-at és 5 ml toluolt tartalmaz, adunk a centrifugált sejtekhez és a reakciót 37 °C hőmérsékleten végezzük 3 órán át rázatás közben. NaN₃-at adunk hozzá úgy, hogy ez gátolja a katalázt és így lehetővé tegye a CCNa DAOval katalizált átalakulását GL-7ACA-vá anélkül, hogy az átalakulás leállna a keto-AD-7ACA stádiumában. Ezen a módon 840 pg/ml GL-7ACA keletkezik. Ebben az esetben azt is igazoljuk, hogy azok a pCYG-EB2-t hordozó transzformánsok, amelyek nem tartalmaznak DAO gént, és amelyek kontrollként szolgálnak, nem termelnek GL-7ACA-t. így azt találjuk, hogy az A. chrysogenum ATCC 11 50-eredetű proteáz gén kifejező egység működőképes S. cerevisiae YNN27-ben, Daminosav-oxidáz képződését idézve elő. Azt is észleljük, hogy a F. solani M-0718-eredetű DAO cDNS kifejezhető S. cerevisiae YNN27-ben.

A pVEN104-et hordozó transzformánsok esetében 2 mg/ml GL-7ACA-t, 0,1 mól/1 trisz-HCl puffért (pH 8,0) és 5 pl toluolt tartalmazó reakcióoldatot adunk a centrifugált sejtekhez, és a reakciót 30 °C hőmérsékleten 3 órán át rázatás közben hagyjuk végbemenni, ezáltal 7ACA keletkezik 15 pg/ml mennyiségben. A kontroll transzformánsok, amelyek pCYGEB2-t hordoznak, de nem tartalmaznak aciláz gént, nem idézik elő 7ACA képződését. Azt is észleljük továbbá, hogy a P. diminuta V22-eredetű aciláz gén képes kifejeződni S. cerevisiae YNN27-ben, bár kisebb mértékben.

4. példa (1) A pHBVl (7ACA és 7ADCA termelésére szolgáló vektor), a pHDVll (7ACA és 7ADCA termelésére szolgáló vektor) és pHBD3 (GE-7ACA és GL7ADCA termelésére szolgáló vektor) plazmidok megalkotása.

DNS bevezetésénél Acremonium chrysogenum BC2116 (FERM-BP 2707)-be, amely CC és DCC termelő törzs, a higromicin B rezisztenciát alkalmazzuk markerként, mivel a szelekció nehéz, amikor a G418 rezisztenciát alkalmazzuk szelekciós termelésre, a Daminosav-oxidáz gént, CC-aciláz gént (amely képes keto-AD-7ACA acilázként és GL-7ACA acilázként is működni) és Hm^R gént tartalmazó pHDVll plazmidot (4-2. ábra) 7ACA és 7ADCA termelésére, és a D-aminosav oxidáz gént és Hm^R gént tartalmazó pHBD3 plazmidot (4-3. ábra) GL-7ACA és GL-7ADCA termelésére.

(i) A pHBVl megalkotása (4—1. ábra).

Mintegy 15 pg pCYG-HBSl-et kezelünk 10 egység EcoRI-gyel 37 °C hőmérsékleten 15 percig (végső térfogat: 100 pl), a DNS részleges hasítása érdekében. Fenolos extrakciót és éteres extrakciót követően a DNS-t etanollal kicsapjuk. Ezt a DNS-t azután teljességig kicsapjuk Smal-gyel és egy mintegy 3,1 kbp-s DNS fragmentumot izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Ezzel egyidejűleg a pVEB104-et hasítjuk Sacl-gyel és PvuII-vel és egy mintegy 5,7 kbp-s DNS fragmentumot izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. A fentebb említett EcoRl-Smal fragmentumot (mintegy 3,1 kbp), a PvuIISacI DNS fragmentumot (mintegy 5,7 kbp), továbbá a pHSG298 vektor plazmid (Takara Shuzo) EcoRI-SacI fragmentumát (2,7 kbp) összekeverjük, és ligálást hajtunk végre T4 DNS ligázt alkalmazva. A ligálási keveréket E. coli JM109 transzformálására alkalmazzuk Hanahan D. eljárást követve [Hanahan D.: J. Mól. Bioi. 163, 557-580 (1983)], és olyan transzformánsokat kapunk, amelyek 20 pg/ml kanamicint, 0,5 mmól/1 IPTGt és 100 pg/ml X-galt is tartalmazó LB agar lemezeken fehér kiónokként nőnek. Ezek közül a transzformánsok közül azokat, amelyek képesek növekedni 150 pg/ml higromicint is tartalmazó LB agar lemezeken, de nem képesek nőni 50 pg/ml ampicillint is tartalmazó LB agar lemezeken, kiemeljük. Az egyes így kapott Km^RHm^RAp^s törzsekből plazmid DNS-t izolálunk, és restrikciós enzimes hasítással elemezzük. Az így talált

HU 212 767 Β és a kívánt szerkezettel bíró plazmidok egyikét pHBV 1-nek nevezzük (4-1. ábra).

(ii) A pHDVll megalkotása (4-2. ábra).

A pDAO-EBlOl-et Clal-gyel hasítjuk és egy mintegy 7,5 kbp-s DNS fragmentumot izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. pHBVl-et hasítunk Clal-gyel (itt csak egyetlen helyen történik hasítás). A hasítási keveréket összekeverjük a fentebb említett Clal fragmentummal (mintegy

7,5 kbp) és ligálást végzünk T4 DNS ligázt alkalmazva. A ligálási keveréket E. coli JM109 transzformálására használjuk, és összegyűjtjük azokat a transzformánsokat, amelyek 50 pg/ml ampicillint is tartalmazó LB agar lemezen növekednek. Ezek közül a transzformánsok közül kiválasztjuk azokat a törzseket, amelyek képesek növekedni 150 pg/ml higromicint is tartalmazó LB agar lemezeken, de nem képesek nőni 30 pg/ml kanamicint is tartalmazó LB agar lemezeken. Az egyes így kapott Ap^RHm^RKm^s törzsekből plazmid DNS-t izolálunk. A BamHI hasítási kép alapján elbíráljuk, vajon a plazmid a kívánt plazmid-e vagy sem, és meghatározzuk a gén beiktatásának irányát. Az így talált plazmidok egyikét pHDVl 1-nek nevezzük (4—2. ábra).

(iii) A pHBD3 megalkotása (4-3. ábra).

Mintegy 15 pg pCYG-HB51-et kezelünk 10 egység EcoRI-gyel 37 °C hőmérsékleten 15 percen át (végső térfogat: 100 pl), hogy a DNS-t részlegesen hasítsuk. Fenolos extrakciót és éteres extrakciót követően a DNS-t etanollal kicsapjuk. Ezt a DNS-t azután teljességig hasítjuk Clal-gyel, és egy mintegy 4,3 kbp-s DNS fragmentum-frakciót izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Az említett frakció egy 4,28 kbp-s fragmentum és egy 4,44 kbp-s fragmentum keveréke. Ha kívánatos azonban, a szükséges DNS fragmentumot (mintegy 4,28 kbp) izolálhatjuk a Hm^RAp^s hasznosításával is. Mintegy 20 pg pDAO-EBlOl-et kezelünk 50 egység Pstl-gyel 37 °C hőmérsékleten 5 percig (végső térfogat 200 pl), hogy a DNS-t részlegesen hasítsuk. Fenolos extrahálást és éteres extrahálást követően a DNS-t etanollal kicsapjuk. Ezt a DNS-t azután Clal-gyel hasítjuk és egy mintegy 6 kbp-s DNS fragmentum frakciót izolálunk agaróz gél (0,8%) elektroforézissel, amelyet elektroforetikus elúció követ. Ez a DNS fragmentum frakció magában foglalja az alábbi három fragmentumot. PstIDAOPstl-Clal (mintegy 5,63 kbp); PstlDAOPstl-Clal-Clal (mintegy 6,53 kbp); és Clal-PstlDAOPstl (mintegy 5,.80 kbp). Ha szükséges azonban, az utolsó fragmentumot (mintegy 5,80 kbp) el lehet távolítani az Ap^s transzformánsok szelektálásával.

A fentebb említett első DNS fragmentum keveréket (mintegy 4,3 kbp) és második DNS fragmentum keveréket (mintegy 6 kbp), továbbá a pHG298 vektor plazmid EcoRI-PstI fragmentumát (2,6 kbp) összekeverjük és ligálásnak vetjük alá T4 DNS ligáz alkalmazásával. A ligálási keveréket E. coli JM109 transzformálására alkalmazzuk Hanahan D. eljárása szerint, és kiemeljük azokat a transzformánsokat, amelyek fehér telepekként növekednek 20 mg/ml kanamicint, 0,5 mmól/1 IPTG-t és 100 pg/ml X-gal is tartalmazó LB agar lemezeken. Ezek közül a transzformánsok közül 80 törzset vizsgálunk át növekedésre olyan LB agar lemezeken, amelyek 150 pg/ml higromicint is tartalmaznak, és olyan LB agar lemezeken, amelyek 50 mg/ml ampicillint is tartalmaznak. Ilyen módon 19 Km^RHm^RAp^s transzformánst kapunk. Az egyes törzsekből plazmid DNS-t izolálunk, és restrikciós enzimes hasításos elemzésnek vetjük alá abból a célból, hogy igazoljuk: ez a kívánt plazmid, vagy sem. Az így kapott plazmidok egyikét pHBD3-nak nevezzük (4-3. ábra).

5. példa (1) A pHBVl, pHDVll és PHBD3 plazmidok bevezetése A. chrysogenum BC2116-ba, és a transzformánsok tenyésztése.

A. chrysogenum BC2116-ot transzformálunk pHBVl-gyel vagy pHDVll-gyel (A. chrysogenumban 7ACA és 7ADCA termelésére szolgáló vektorok), vagy pHBD3-mal (A. chrysogenumban GL-7ACA és GL7ADCA termelésére szolgáló vektor). Az így kapott higromicin-rezisztens transzformánsokat valamely CC-termelő tápközegben (higromicin B hozzáadása nélkül) tenyésztjük. Úgy találjuk, hogy az említett transzformánsok 7ACA-t vagy GL-7ACA-t képesek termelni a tápközegben.

(i)AzA. chrysogenum BC2116 transzformálása.

(a) Egyforma inokulum előállítása a sejt tenyésztéséhez.

Egy ampulla sejtszuszpenziót (20%-os glicerinben), amelyet A. chrysogenum BC2116 folyékony nitrogénben tárolt törzstenyészetéből kapunk 37 °C hőmérsékleten végzett felengedtetéssel, tíz B3 agar lemezre inokulálunk, ahol a nedvesség többé már nem volt megfigyelhető. Az így inokulált agar lemezeket 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 6 napon át. Amicéliumtömeget (a spórákat is beleértve), amely befedi az egyes agar lemezek felületét, lekaparjuk, elkerülve az agarfelület megsértését, és 3 ml 20-os glicerinben szuszpendáljuk. A szuszpenziót 5 ampullába osztjuk szét és folyékony nitrogénnel hűtött sejttároló kamrában fagyasztva tároljuk (a tíz B3 agar lemez 50 ampullát ad).

(b) A sejtek sokszorozása protoplaszt előállítására.

Az egy ampullában levő fagyasztott sejtszuszpenziót ( A. chrysogenum BC2116) felengedtetjük 37 °C hőmérsékleten és a teljes mennyiséget 50 ml, 250 mles rázólombikban levő YSP tápközegbe inokuláljuk, és rázatott tenyésztést végzünk 30 °C hőmérsékleten 4 napon át. Ennek az előtenyészetnek 5 ml-es adagját átvisszük 50 ml friss YPS tápközegbe, és tenyésztést végzünk 30 °C hőmérsékleten, amint fentebb jeleztük, 24 órán át.

(c) Protoplaszt készítése

Az így kapott 24 órás tenyészetből (200 ml) centrifugálással (3000 fordulat/perc, 5 perc) kinyerjük a sejteket, kétszer mossuk steril vízzel (200 ml) centrifugá17

HU 212 767 Β lás segítségével, és 80 ml 10 mmól/literes trisz-HClben, amely 10 mmól/1 DTT-t is tartalmaz, (pH 7,5) szuszpendáljuk. A szuszpenziót gyengéden rázatjuk 30 °C hőmérsékleten 1 órán át. A sejteket azután centrifugálással összegyűjtjük (3000 fordulat/perc, 5 perc), kétszer mossuk 100 ml 1 mól/literes KC1 pufferben (pH 5,8) centrifugálás segítségével, és 1 mól/literes KC1 pufferben (pH 5,8) szuszpendáljuk 20 ml szuszpenziótérfogatra. Ehhez a szuszpenzióhoz (20 ml) hozzáadunk 30 ml 1 mól/literes KC1 puffért (pH 5,8), amely 16,3 mg/ml novozyme 234-et (Novo Biolabs) is tartalmaz. A keveréket gyengéden rázatjuk 30 °C hőmérsékleten 30 percen át. Miután ezt a munkamenetet teljesen befejeztük, a létrejött protoplasztszuszpenziót eldobható centrifugacsőbe visszük át, 2-3 másodpercig kevertetjük, majd 50 ml 1 mól/literes KP pufféira! (pH 7,5) hígítjuk és centrifugáljuk (750 fordulat/perc, 2 perc). A centrifügálással leülepedett protoplasztokat újra szuszpendáljuk 50 ml 1 mól/literes KC1 pufferben (pH 7,5), majd kinyerjük és egyúttal mossuk is centrifugálással (1500 fordulat/perc, 5 perc). Ezt a mosási ciklust kétszer ismételjük. A mosott protoplasztokat 0,8 mól/1 NaP pufferben szuszpendáljuk, hogy a végső térfogat 5 ml legyen.

(d) Transzformálás

A transzformáláshoz felhasználandó egyes plazmid DNS oldatok 60 μΙ-éhez (mintegy 20 pg DNS) 240 pl 1 mól/literes KP puffért (pH 7,5) adunk. Összekeverés után ehhez 400 pl protoplaszt szuszpenziót adunk. Újabb összekeverés után a keveréket állni hagyjuk jégen 3 percen át, majd 4 ml 1 mmól/literes trisz-HCl-t (pH 7,5), amely 40% PEG-et 10,8% szacharózt és 5 mmól/1 CaCl₂-t is tartalmaz, adunk hozzá, majd összekeverés után - a keveréket szobahőmérsékleten 15 percig állni hagyjuk. Ezután 10 ml 0,8 mól/literes NaP puffért adunk a keverékhez és - összekeverés után - az egész keveréket 1000 fordulat/percnél centrifugáljuk 5 percen át. Az üledéket 1,2 ml 0,8 mól/literes NaP pufferben szuszpendáljuk.

(e) A higromicin B antibiotikumra rezisztens transzformánsok kiválasztása.

A transzformáns-szuszpenziót (0,2 ml) összekeverjük 5 ml BRM agar tápközeggel (48 °C), és a keveréket BRM agar tápközeg lemezre (25 ml) öntjük. 20 °C hőmérsékleten 20 órán át végzett inkubálás után 10 mg/ml higromicin B-t (Calbiochem Corporation, importálja és forgalmazza a Nakalai Tesque) szélesztünk el a lemez felületén 25 pg/ml és 50 pg/ml végső koncentrációra, szélesztőt alkalmazva (minden koncentrációhoz három lemezt alkalmazunk). Az inkubálás (30 °C) 2-3 hete után egyes telepeket, amelyek már feltűntek, átvisszük 50 pg/ml higromicin B-t is tartalmazó PDA-YE agar lemezre. Az inkubálást további 7 napon át folytatjuk 30 °C hőmérsékleten. Ilyen módon higromicin B-rezisztens transzformánsokat kapunk. Mivel a hibás transzformánsok nem képesek nőni friss tápközegben higromicin B jelenlétében ilyen, fentebb említett altenyészetekben, a stabil transzformánsok könnyen megkülönböztethetők az instabil transzformánsoktól. A transzformánsokat ismét elszélesztjük pg/ml higromicin B-t is tartalmazó PDA-YE agar lemezek felületén, és altenyésztést végzünk (30 °C, 57 nap).

A fenti munkamenet általában 1-3 higromicin B-rezisztens transzformánst szolgáltat 20 pg DNS-re számolva. A BRM agar tápközeges lemezen a fenti (c) fejezetben leírtak szerint kapott végső protoplaszt szuszpenzióból regenerált telepek száma mintegy 2xl0⁸/ml (2 hetes inkubálás után 30 °C hőmérsékleten).

(ii) 7ACA és GL-7ADCA termelése a higromicin

B-re rezisztens A. chrysogenum BC2116 transzformánsokkal.

Higromicin B-re rezisztens transzformánsokat (lásd az 1. táblázatot) állítunk elő olyan módon, hogy A. chrysogenum BC2116-ot transzformálunk pCYGHB51-gyel (csak Hm^R), pHBVl-gyel (7ACA és 7ADCA termelésére szolgáló vektor), pHDVll-gyel (7ACA és 7ADCA termelésére szolgáló vektor) vagy pHBD3-mal (HL7ACA és GL-7ADCA termelésére szolgáló vektor), amint ezt az (i) fejezetben leírtuk. Az egyes transzformánsokat 50 ml. 1250 ml-es rázólombikban levő CS1 tápközegbe inokuláljuk. 4 napos, 30 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után az így létrejött előtenyészet 1 ml-ét átvisszük 20 ml főtenyésztő tápközeget tartalmazó 250 ml-es rázólombikba, és rázott tenyésztést (kitérés -7,62 cm; 250 fordulat/perc) végzünk 25 °C hőmérsékleten 6-7 napon át. Az egyes főtenyészeteket Toyo N°2 szűrőpapíron átszűrjük és a szűrletet HPLC-val (nagyteljesítményű folyadékkromatográfia) megvizsgáljuk. A HPLC körülményei az alábbiak:

Oszlop: Két összekapcsolt oszlop, nevezetesen Cosmosil 5C_]8 oszlop (4,6x150 mm) (Nacalia-Tesque), amelyet közvetlenül követ az Inertsil ODS-2 oszlop (5x150 mm Gaskuro Kogyo).

Oszlophőmérséklet.· 40 °C.

Mozgó fázis: 4,0 mmól/ (0,567 g/liter) Na₂HPO₄,

2,6 mmól/1 (0,36 g/1) KH₂PO₄. 4% metanol.

Áramlási sebesség: 1 ml/perc.

UV kimutatás: 254 nm.

A fenti HPLC körülmények között vizsgálva az 1. táblázatban megadott eredményeket kapjuk. Az 7ACA, GL-7ACA és CCNA helyzetei (retenciós idői)

17,7 perc, 24,3 perc illetve 18,9 perc [Az egyes tenyészet-szűrleteket 10-szeresre hígítjuk 0,5 mól/1 citrát pufferral (pH 4,0), és a hígított anyagból 10 pl-t vetünk alá HPLC vizsgálatnak.] Az eredmények azt jelzik, hogy miközben a pCYG-HB51 plazmiddal, amelyet csak a higromicin B rezisztencia jellemez, kapott transzformánsok nem termelnek sem 7ACA-t, sem GL-7ACA-t, a pHBVl vektorral (amely 7ACA és 7ADCA termelésére szolgáló vektor) kapott transzformánsok mintegy 50 pg/ml mennyiségű 7ACA-t termelnek, és a pHBD3 vektorral (amely GL-7ACA és GL-7ADCA termelésére szolgáló vektor) kapott transzformánsok mintegy 130 pg/ml mennyiségű GL7ACA-t termelnek. ApHDVl 1 vektorral (amely 7ACA

HU 212 767 Β és 7ADCA termelésére szolgáló vektor), amely tartalmazza mind a D-aminosav-oxidáz gént, mind az aciláz gént, kapott transzformánsok, mintegy 150 μg/ml mennyiségű 7ACA-t termelnek, de nem termelnek sem GL-7ACA-t, sem keto-AD-7ACA-t. A GL-7ACA termelők sem termelnek keto-AD-7ACA-t. Ez valószínűleg azért van, így mivel a keto-AD-7ACA instabilitása következtében elbomlik.

1. táblázat

7ACA és GL-7ACA termelése A. chrysogenum BC21J 6-nak higromicin B-re rezisztens transzformánsaival

A törzs száma	A transzformáláshoz alkalmazott DNS	kitermelés
7ACA (pg/ml)	GL- 7ACA (pg/ml)	CC (mg/ml)
HM144	pCYG- HB51	ND	ND	8,7
HM 172	pHBVl	50	ND	7,8
Hml55	55	ND	7,3
Hm 146	65	ND	7,8
Hm 154	40	ND	7,9
Hml56	50	ND	7,0
Hmlól	45	ND	6,2
Hm 178	pHDVll	150	ND	4,9
Hm 165	145	ND	5,5
Hml64	pHBD3	ND	130	6,5
Hm 168	ND	125	6,4
Hml79	ND	145	6,6

ND: Nem mutatható ki

A 7ACA termék újbóli azonosítására további vizsgálatokat végzünk eltérő HPLC körülmények között, hogy azonos eredményeket kapjunk. Az újbóli vizsgálathoz alkalmazott HPLC körülmények az alábbiak: Oszlop: Cica-Merck előcsomagolt oszlop nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás oszlophoz (4x250 mm) LiChrospher 100 RP-18(e) (5 μ) (Kanto Chemical).

Oszlophőmérséklet: szobahőmérséklet.

Mozgó fázis: 0,94 g/1 nátrium-1-hexánszulfonát (Tokyo Kassei)

1,32 g/1 18-korona-6 (Nacalai Tesque) g/1 citromsav

2,47 g/1 trinátrium-citrát (dihidrát)

10% acetonitril.

Áramlási sebesség: 1 ml/perc.

UV kimutatás: 254 nm.

(iii) Λ higromicinre rezisztens transzformánsok elemzése Southern hibridizálással.

Higromicin B-re rezisztens transzformánsokat (A.

chrysogenum Hml44, Hml72, Hml55, Hml46, Hml54, Hml56, Hmlól, Hml78, Hml65, Hml64,

Hm 168 és Hm 179) egyenként tenyésztünk rázott tenyészetben 30 °C hőmérsékleten 5-7 napon át, 12,5 μg/ml higromicin B-t is tartalmazó YPS tápközegben (50 ml). A tenyésztett sejteket centrifugálással összegyűjtjük és -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A sejteket folyékony nitrogénnel hűtött mozsárban szétzúzzuk, hozzáadunk 10 mmól EDTA-t is tartalmazó 50 mmól/literes trisz HCl puffért (pH 7,5) 5 ml) és 20%-os SDS-t (0,35 ml), és a keveréket 65 °C hőmérsékleten 20 percen át melegítjük. Kétszeres fenolos extrahálás után a DNS-t etanollal kicsapjuk. A csapadékot feloldjuk 2,5 ml fentebb említett 10 mmól/liter EDTA-t tartalmazó pufferben, majd RN-áz A-t (ribonukleáz) adunk hozzá 4 g/ml koncentrációban, és a keveréket 37 °C hőmérsékleten tartjuk 1 órán át. Ezután K proteázt adunk hozzá 100 g/ml koncentrációban és a keveréket 37 °C hőmérsékleten tartjuk 2 órán át. Fenolos extrakciót követően a DNS kicsapódását idézzük elő etanollal, és a csapadékot feloldjuk 300 1 TE pufferben. A DNS oldatot TE puffer ellen dializáljuk [„Molecular Cloning”, korábban idézett munka (Cold Spring Harbor Laboratory (1982), 382-386. oldal], A pCPV22P DNS-t [3-6. ábra; ez a pHSG298 vektorból származik olyan módon, hogy a P. diminuta V22 eredetű aciláz gént (mintegy 3 kbp) beiktatjuk] PstI restrikciós enzimmel hasítjuk, majd ³²P-jelezzük egy kevert primer jelző rendszert alkalmazva (Clontech; ezt a Toyobo importálja és forgalmazza). Ezt a jelzett DNS-t és a fentebb említett DNS-hez kötött nitrocellulóz szűrőt Southern hibridizálásnak vetjük alá [„Advanced Bacterial Genetics”, korábban idézett munka (Cold Spring Harbor Laboratory, 1980), 174-177. oldal].

Miközben nem figyelhető meg hibridizálás az A. chrysogenum BC2116 DNS és a pCPV22P között, a 12 higromicin B-rezisztens transzformánsból származó DNS-ek világosan mutatnak hibridizálást. Ezenkívül az aciláz gént tartalmazó A. chrysogenum Hm 172, Hml55, Hml46, Hml54, Hml56, Hmlól, Hml78 és Hm 165 törzsekből származó, BamHI-gyel hasított DNS-ek erős hibrid csíkot adnak, amely a mintegy

2,5 kbp-s aciláz génnek felel meg. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a szóban forgó DNS-t sikeresen bevezettük a higromicin B rezisztens transzformánsokba. Ezen kívül a Southern hibridizálás eredményei azt jelzik, hogy a bevezetett DNS nem plazmid formájában, hanem a genomikus DNS-be integrálódva található.

6. példa

A 7ACA-t termelő Acremonium chrysogenum Hml78 törzset ugyanúgy tenyésztjük, mint az 5. példában. Az így kapott tenyészetet (10 ml) centrifugáljuk 8000 fordulat/percnél 5 percen át. A kapott felülúszót pH 5,0 értékre állítjuk be 1 n HCl-lel (mintegy 10 ml), és az így létrejött csapadékot szívatott szűréssel eltávolítjuk. A szűrletet (600 ml; 7ACA tartalom: 136 μ g/ml) oszlopkromatográfiának vetjük alá, Diaion ΗΡ-20-at (600 ml; Mitsubishi Kaséi) alkalmazva. 600 ml savanyított vízzel (pH 3,5) és 600 ml vízzel (pH 7,0) végzett mosás után eluálást végzünk 305-os vizes izopropil-alkohollal. Az egyesített 7ACA-tartalmú eluátum-frakciókat (1200 ml) 30 °C hőmérsékleten koncentráljuk csökken19

HU 212 767 B tett nyomás mellett, és a koncentrátumot (60 ml) YMC fordított fázisú oszlopra (ODS A60 200/60 mesh; Yamamura Kagaku Kenkyusho; 1 liter) visszük. Akifejlesztést vízzel végezzük. Az 7ACA-t (39,8 mg) a 360 ml és 1960 ml közti frakciókban eluáljuk. Az egyesített 7 ACA- 5 tartalmú eluátumokat (1600 ml) 114 ml-re koncentráljuk 30 °C hőmérsékleten, csökkentett nyomáson. Mivel ez a koncentrátum nagy fölöslegben tartalmaz CC-t a 7ACAra vonatkoztatva, 5,4 ml DAO-t [1-266-795 számú japán szabadalmi bejelentés (266 795/1989), 182 egy- 10 ség/ml], 2 ml kataláz C-l-et (Sigma; lOmg/ml) és 13 ml 1 mól/literes foszfát puffért (pH 7,3) adunk a koncentrátumhoz (114 ml) és a keveréket 25 °C hőmérsékleten rázatjuk 1 órán át, hogy a CC-t elbontsuk. A reakciókeveréket pH 1,5-re állítjuk be 1 n HCl-lel, majd azonos térfo- 15 gatú etil-acetáttal mossuk, és a kapott vizes réteget (127 ml; 7ACA:21,6 mg) 50 ml-re koncentráljuk 30 °C hőmérsékleten csökkentett nyomáson.

A koncentrátumot két 25 ml-es adagra osztjuk és nagy teljesítményű folyadékkromatográfiának vetjük alá 20 két YMC fordított fázisú oszlopot alkalmazva, amelyek előzőleg 2% metanol-6,6 mmól/1 foszfát puffer (pH 7,3) keverékkel voltak 50x300 mmx2 oszlop, Yamamura Kagaku Kenkyusho; UV kimutatás: 254 nm). Akifejlesztést ugyanazt az oldószerrendszert alkalmazva végezzük el, 25 mint amelyet az oszlop kiegyensúlyozásához alkalmaztunk, és 100 ml/perc áramlási sebességet alkalmazunk.

Az eluátumot frakcionáljuk. A7ACA-t tartalmazó frakciókat egyesítjük (600 ml), pH 5,0-ra állítjuk be, 1 n HCllel és oszlopkromatográfiának vetjük alá. Diaion HP-20- 30 at (60 ml) alkalmazva, és a kifejlesztést vízzel (1200 ml) végezve. A 7ACA-t a 600 és 1600 ml közti frakciókban eluáljuk. A 7ACA-t tartalmazó frakciókat egyesítjük és szárazra koncentráljuk 3 °C hőmérsékleten, csökkentett nyomáson, így 5,36 mg 7ACA-t kapunk fehér porként. 35 Ezen termék ’H NMR spektruma és IR spektruma jó egyezésben van egy megfelelő standard spektrumaival.

7. példa

Higromicin-B-rezisztens transzformánsokat készí- 40 tünk olyan módon, hogy A. chrysogenum BC2116-ot transzformálunk pCYG-HB51-gyel, (Hm^R egyedül), pHBVl-gyel (a 7ACA és 7ADCA termelésére szolgáló vektor), pHDll-gyel (a 7ACA és 7ADCA termelésére szolgáló vektor) vagy pHBD3-mal (a GL-7ACA vagy 45 GL/7ADCA termelésre szolgáló vektor) ugyanolyan módon, amint ezt az 5. példában leírtuk (lásd a 2. táblázatot). Ezeket a transzformánsokat egyenként inokuláljuk

5-50 ml CS 1 tápközegbe, amely 250 ml-es rázólombikban van, és tenyésztést végzünk 30 °C hőmérsékleten 4 napon át. Ebből az előtenyészetből 1-1 ml-t átviszünk egy-egy 250 ml-es rázólombikba, amelyek 20 ml főtenyésztő tápközeget tartalmaznak. Rázott tenyésztést (kitérés: -8 cm, 250 fordulat/perc) végzünk 25 °C hőmérsékleten 3,4,5,6 vagy 7 napig. A főtenyészetet (két lombik minden egyes tenyésztési periódushoz) leszűrjük Togo N°2 szűrőpapíron. A szűrlet egy 100 μΐ-es részletét hozzáadjuk 900 ml 0,1 mól/l-es foszfát pufferhez (pH 6,0) hígítás céljából, és HPLC-vel vizsgálatot végzünk az alábbi körülmények között.

Oszlop: Két oszlopot összekötünk, mégpedig Cosmosil

5C₁₈ oszlopot (4,6x150 mm) (Nacalai Tesque), amelyet azonnal követ az Intersil ODS-2 oszlop (5x150 mm) (Gaskuro Kogyo).

Oszlophőmérséklet: 40 °C.

Mozgó fázis: 2,2 mmól/1 tetra-n-butil-ammónium-hidroxid

2,8 g/1 (NH₄)₂HPO₄ (pH 7,3 értékre beállítva foszforsavval)

5,63% metanol.

Áramlási sebesség: 1 ml/perc.

UV kimutatás: 254 nm.

A fenti HPLC körülmények között vizsgálva kapott eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg. Ebben a vizsgálatban a DCC, 7ADCAés GL-7ADC A helyei (retenciós idői) 5,5 perc, 6,1 perc, illetve 26,9 perc. Amint az eredményekből nyilvánvaló, az egyedül csak higromicin B rezisztenciával jellemezhető pCYG-HB51 plazmiddal kapott transzformánsok nem termelnek sem 7ADCA-t, sem GL-7ADCA-t, míg a 7ACA-t és 7ADCA-t termelő pHBVl vektorral kapott transzformánsok mintegy 24pg/ml mennyiségű 7ADCA-t termelnek és a GL7ACA-t és GL-7ADCA-t termelő pHBD3 vektorral kapott transzformánsok mintegy 375 pg/ml mennyiségű GL-7ACA-t termelnek. A 7ACA-t és 7ADCA-t termelő pHDV 11 vektorral kapott transzformánsok pedig, amelyek tartalmaznak mind D-aminosav oxidáz, mind aciláz gént, mintegy 177 pg/rnl mennyiségű 7ADCA-t termelnek; ezen kívül a fentebb említett HPLC elemzés 7-amino-3-metil-3-cefém-4-karbonsav egyidejű termelését is jelzi ezekkel a transzformánsokkal (a 10 perces retenciós időnek megfelelő helyen kis csúcs található).

2. táblázat

AzA. chrysogenum BC2116-eredetű, higromicin B rezisztens transzformánsok 7ADCA és GL-7ADCA termelése

A törzs száma	A transzformáláshoz használt DNS	Tenyésztési időtartam (nap)	PH	Kitermelés
7ADCA (gg/ml)	GL-7ADCA (pg/ml)	DCC (mg/ml)
Hml44	pCYG-HB51	3	6,5	ND	ND	0,23
4	6,8	ND	ND	0,73
5	7,2	ND	ND	1,45
6	8,3	ND	ND	2,38
7	8,3	ND	ND	3,13

HU 212 767 Β

A törzs száma	A transzformáláshoz használt DNS	Tenyésztési időtartam (nap)	PH	Kitermelés
7ADCA (pg/ml)	GL-7ADCA (pg/ml)	DCC (mg/ml)
Hml72	pHBVl	3	6,2	ND	ND	0,11
4	7,1	ND	ND	0,46
5	7,4	ND	ND	1,31
6	7,8	20	ND	2,07
7	8,1	24	ND	2,86
Hml78	pHDVll	3	6,4	11	ND	0,48
4	6,8	70	42	1,08
5	7,1	105	82	1,92
6	8,0	159	65	2,63
7	8,4	177	97	4,21
Hm209	pHBD3	3	6,2	ND	ND	0,18
4	6,9	ND	36	0,50
5	7,3	ND	190	1,35
6	8,2	ND	324	2,11
7	8,3	ND	375	2,88

ND: Nem mutatható ki

Az alábbi mikroorganizmusokat deponáltuk 1989. december 25-én a Fermentation Research Institute-nál (Agency of Industrial Science and Technology, Miniatry of International Trade and Industry, Japán): Escherichia coli JM109 (pCV22P) FERM BP-2704 Escherichia coli JM109 (pHBVl), FERM BP-2703 Escherichia coli JM109 (pHDVl 1) FERM BP-2706 Escherichia coli JM109 (pHBD3) FERM BP-2705 Acremonium chrysogenum BC2116 FERM BP-2707

Claims (9)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy vektorba a kifejeződést biztosító DNS-szekvenciákkal együtt Acremonium chrysogenum egy vagy több promoterét egy (II) általános képletű cefém vegyületet

   - ahol R jelentése hidrogénatom, acetoxi- vagy hidroxilcsoport és X jelentése -CH(NH₂)-COOH, -CO-COOH vagy -COO-csoport - a megfelelő (I) általános képletű - ahol R jelentése a fenti 7-amino-cefém vegyületté átalakító enzim(ek) génjéhez ligáljuk működőképesen az upstream irányból a downstream irányba haladva.
2. 2. Eljárás mikroorganizmus előállítására, azzal jellemezve, hogy a (II) általános képletű - ahol R és X jelentése az 1. igénypontban megadott - cefém vegyületet termelő Acremonium chrysogenum fajba tartozó valamely törzset az 1. igénypont szerint előállított vektorral transzformálunk.
3. 3. Eljárás (I) általános képletű 7-amino-cefém vegyületek és sóik - ahol R jelentése az 1. igénypontban megadott - egylépésben történő előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 2. igénypont szerinti transzformáit mikroorganizmust alkalmas táptalajon tenyésztünk, és kívánt esetben az (I) általános képletű vegyületet a tenyészközegből kinyerjük.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy cefalosporin C aciláz gént tartalmazó vektorral transzformált mikroorganizmust alkalmazunk.
5. 5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy cefalosporin C aciláz gént és egy D-aminosav oxidáz gént tartalmazó vektorral transzformált mikroorganizmust alkalmazunk.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektorral transzformált mikroorganizmust alkalmazunk, amelyben egy Acremonium chrysogenum promoter a cefalosporin C aciláz géntől downstream irányban és az Acremonium chrysogenum promoter a D-aminosav-oxidáz géntől upstream irányban helyezkedik el.
7. 7. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy glutaril-7-ACA-aciláz gént és egy D-aminosav oxidáz gént tartalmazó vektorral transzformált mikroorganizmust alkalmazunk.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan vektorral transzformált mikroorganizmust alkalmazunk, melyben egy Acremonium chrysogenum promoter a glutaril-7-ACA-aciláz géntől upstream irányában, és egy Acremonium chrysogenum promoter a D-aminosav oxidáz géntől downstream irányban helyezkedik el.
9. 9. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként az Acremonium chrysogenum BC 2116 törzset alkalmazzuk.