JP2000152796A - ７―アミノセフェム化合物またはその塩類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】書面に垂直方向に対して傾斜した光路で受光す
ることで、書面の走査位置またはその直前（直後）を常
に目視可能とする。 【解決手段】レンズ系を介して書面２からの反射散乱光
を１次元イメージセンサに受光することで主走査を行
い、書面２を被覆したハウジング１を手送り移動するこ
とで副走査を行う図面イメージの入力手段において、該
ハウジング１内の上部に装着され、その受光面が図面と
平行になるように設定された１次元イメージセンサと、
書面２に垂直でセンサ列方向軸を含む平面に対して傾斜
し、かつ該センサ列方向軸と直交した光路面を構成する
レンズ系とを備え、該ハウジング１の被覆側端部で主走
査する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は７−アミノセフェム化
合物またはその塩類の製造法に関するものである。さら
に詳細には、７−アミノセフェム化合物またはその塩類
の製造法、それに使用するベクター、そのベクターで形
質転換されたセファロスポリン化合物生産菌、アクレモ
ニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）のア
ルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモーター活性を有する
DNA断片等に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】および

【この発明が解決しようとする課題】一般式

【化１】

【０００３】（式中、Ｒはアセトキシ基、ヒドロキシ基
または水素を意味する）で示される７−アミノセフェム
化合物は半合成セファロスポリン系抗生物質の最も重要
な製造原料であり、世界中の製薬工場で繁用されてい
る。現在、７−アミノセフェム化合物(I)はアクレモニ
ウム・クリソゲナムに属する一般式

【０００４】

【化２】 (式中、 Rは前と同じ意味、Xは

【化３】

【０００５】で示されるセファロスポリン化合物生産菌
を培地に培養し、培養物からセファロスポリン化合物
（II）を採取する工程とセファロスポリン化合物（II）
の７位のα−アミノアジポイル基等のアシル基を化学的
に脱離する方法または酵素的に脱離する方法の２工程に
より製造されている。後者の脱離工程を化学的方法で行
なう場合には、イミノエーテル化法(F. M. Huber et a
l. “Cephalosporins and Penicillins, Chemistry and
Biology”（1972）27, Academic Press）と称する多段
の化学反応により、セファロスポリン化合物（II）の７
位のα−アミノアジポイル基等のアシル基を脱離するこ
とにより行なわれるが、この方法では高価な化学プラン
トや繁雑な操作が必要となり、また酵素的方法による行
なう場合にも別の醗酵プラントと共に繁雑な操作が必要
となる。

【０００６】そこで、この発明者等は７−アミノセフェ
ム化合物(I)を微生物に直接醗酵生産させることによ
り、上記脱離工程なしに１工程で７−アミノセフェム化
合物(I)を製造することについて研究した。現在まで、
世界中の研究者の努力にもかかわらず、７−アミノセフ
ェム化合物(I)を直接生産するいかなる微生物も自然界
から発見されておらず、また、微生物を変異処理、遺伝
子工学的に改変して、７−アミノセフェム化合物生産菌
を創成することもその課題の著るしい困難さ故に、これ
までに成功したとの報告は全くない。

【０００７】発明の構成および効果 この発明者等はこのような困難な課題に挑み、種々研究
の末、アクレモニウム・クリソゲナム用プロモーターと
それに連結する、セファロスポリン化合物（II）を７−
アミノセフェム化合物(I)に転換する能力を有する酵素
の遺伝子を含有する７−アミノセフェム化合物生産用ベ
クターを新らたに構築し、このベクターでアクレモニウ
ム・クリソゲナムに属するセファロスポリン化合物(II)
生産菌を形質転換し、培養したところ、７−アミノセフ
ェム化合物(I)が培養物中に蓄積されてくるという驚く
べき事実を確認した。そして、この発明者等はさらに鋭
意研究の結果、この発明を完成した。

【０００８】この発明の７−アミノセフェム化合物(I)
の製造法は、７−アミノセフェム化合物生産菌、例えば、
アクレモニウム・クリソゲナム用プロモーターとそれに
連結する、セファロスポリン化合物(II)を７−アミノセ
フェム化合物(I)に転換する能力を有する酵素の遺伝子
を含有する７−アミノセフェム化合物(I)生産用ベクタ
ーで形質転換された、アクレモニウム・クリソゲナムに
属するセファロスポリン化合物（II）生産菌を培地に培
養し、得られる培養物から７−アミノセフェム化合物
(I)を採取することにより行なわれる。次に、この製造
法の詳細を説明する。

【０００９】この発明の７−アミノセフェム化合物生産
用ベクターは例えば宿主細胞がアクレモニウム・クリソ
ゲナムの場合には、少なくともアクレモニウム・クリソ
ゲナム用プロモーターならびにセファロスポリン化合物
（II）を７−アミノセフェム化合物(I)に転換する能力
を有する酵素の遺伝子を上流から下流へと常法により連
結したDNA断片を含む。さらにこのベクターには適当な
選択マーカー、アクレモニウム・クリソゲナム用自律的
複製配列（ARS）、ターミネター、翻訳活性化配列等を
ベクターの所望の部位に常法により挿入してもよい。さ
らに大腸菌用自律的複製配列（ori）と選択マーカーを
このベクターに挿入しておけば、大腸菌の中でベクター
の数を増やすために便利である。

【００１０】このようなベクターの具体的な構築は、例
えば本願実施例で示される方法あるいはこれと同様な方
法により行なえばよい。

【００１１】アクレモニウム・クリソゲナム用プロモー
ターとはアクレモニウム・クリソゲナム中で所望のポリ
ペプチドをコードする遺伝子を発現し得るプロモーター
を意味し、これまでに、例えば、アクレモニウム・クリ
ソゲナムのイソペニシリンＮ合成酵素の遺伝子のプロモ
ーター、アクレモニウム・クリソゲナムのβ−イソプロ
ピルマレート脱水素酵素遺伝子のプロモーターなどが知
られているが、これらの他、この発明者等がアクレモニ
ウム・クリソゲナムの染色体より、新らたに単離したア
ルカリプロテアーゼの遺伝子のプロモーター活性を有す
るDNA断片が挙げられる。これらのプロモーターにはエ
ンハンサー配列が含まれていてもよい。

【００１２】セファロスポリン化合物（II）を７−アミ
ノセフェム化合物(I)に転換する能力を有する酵素の遺
伝子としては、１段階転換を触媒する酵素の遺伝子とし
て、セファロスポリンＣアシラーゼの遺伝子｛例えば、
シュードモナス・エスピ−（Pseudomonas sp.）SE83株
由来のセファロスポリンＣアシラーゼの遺伝子が知られ
ている［A. Matsuda et al, J of Bacteriol, 169(198
7) 5815-5826参照］が、この他、この発明者等がシュ
ードモナス・ディミニュータ（Pseudomonas diminuta）
V22株から、新らたに単離したセファロスポリンＣアシ
ラーゼの遺伝子等が挙げられる。｝が挙げられる。さら
に２段階転換を触媒する酵素の遺伝子としてはＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼ（以下“DAO”と略称する）遺伝子とG
L-7ACAアシラーゼ遺伝子の組み合せの他、セファロスポ
リンＣアシラーゼが通常GL-7ACAおよびGL-7ADCAならび
にケト−AD-7ACAおよびケト-AD-7ADCAを7ACAおよび7ADC
Aに転換する活性も有するので、セファロスポリンＣア
シラーゼ遺伝子とDAO遺伝子の組み合せでもよい。ま
た、宿主細胞として使用するセファロスポリン化合物
（II）生産菌がGL-7ACA、GL-7ADCA、ケト−AD-7ACAおよ
び／またはケト-AD-7ADCAを生産している場合には、セ
ファロスポリンＣアシラーゼ遺伝子またはGL-7ACAアシ
ラーゼ遺伝子単独でもよい。

【００１３】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの遺伝子として
は、例えばトリゴノプシス・バリアビリス（Trigonopsi
s variabilis）由来のDAOの遺伝子（特開昭62−262994
号公報参照）の他、この発明者がフザリウム・ソラニ
（Fusarium solani）M-0718微工研菌寄第2688号（欧州
特許公開公報第364,275号参照）から新らたに単離したD
AOの遺伝子等が挙げられる。

【００１４】GL-7ACAアシラーゼの遺伝子としては例え
ばシュ−ドモナス・プチダ(Pseeudomonas putida)ATCC9
50由来のGL-7ACAアシラーゼ（Agric. Biol.Chem.,45, 1
561(1981)参照)の遺伝子の他、上記で例示したセファロ
スポリンＣアシラーゼがGL-7ACAアシラーゼとも促えら
れるので、それらが例示される。

【００１５】これらの酵素の遺伝子はアクレモニウム・
クリソゲナム用プロモーターの下流にそれぞれ単独で連
結されているのが好ましい。この発明の７−アミノセフ
ェム化合物生産用ベクターにはセファロスポリン化合物
（II）を７−アミノセフェム化合物(I)に転換する能力
を有する酵素の遺伝子が１または２以上挿入されていて
もよい。

【００１６】選択マーカーとしては、アクレモニウム・
クリソゲナムをベクターで形質転換した場合に、形質転
換体をスクリーニングにより選択できるマーカーであれ
ばいずれも使用可能で、例えばハイグロマイシン耐性表
現型を付与するマーカー(Hm^R)が繁用されている。

【００１７】アクレモニウム・クリソゲナム用自律的複
製配列（ARS）としては、例えばアクレモニウム・クリ
ソゲナムのARS（特開昭61−209593号公報参照）等が挙
げられるが、７−アミノセフェム化合物生産用ベクター
でアクレモニウム・クリソゲナムを形質転換した場合、
該ベクタ−は主にアクレモニウム・クリソゲナムの染色
体DNAに組み込まれて複製するので、このような場合に
は７−アミノセフェム化合物生産用ベクターにARSが挿
入されている必要はなく、７−アミノセフェム化合物生
産用ベクターがアクレモニウム・クリソゲナム中の染色
体外成分として増殖する場合にだけ必要となる。

【００１８】ターミネターはポリアデニル化部位を含ん
でいてもよく、例えば、本願実施例で使用されるアクレ
モニウム・クリソゲナム染色体DNA由来のターミネター
が挙げられる。

【００１９】７−アミノセフェム化合物生産用ベクター
により、アクレモニウム・クリソゲナムに属するセファ
ロスポリン化合物（II）生産菌を形質転換する方法は常
法、例えばプロトプラスト形質転換法［S. W. Queener,
et al：Microbiology 1985,American Society of Micr
obiology 468(1985) 参照］により行なえばよい。

【００２０】また、セファロスポリン化合物（II）生産
菌としては、セファロスポリンＣ生産菌として、A. chr
ysogenum ATCC11550、ATCC36225等、デアセチルセファ
ロスポリンＣ生産菌として、A.chrysogenum ATCC20371
等 デアセトキシセファロスポリンＣ生産菌として、A.
chrysogenum ATCC11550、ATCC20416等、GL-7ACAおよびケ
ト-AD-7ACA生産菌として、A. chrysogenum ATCC20416、
ATCC20427等のアクレモニウム・クリソゲナム以外にも
これまで多数の微生物が知られているが、このような微
生物を宿主細胞として用い、適当な７−アミノセフェム
化合物生産用ベクターでそれを形質転換して７−アミノ
セフェム化合物生産菌を、上述の方法を参照して遺伝子
工学の常法により得ることもできる。

【００２１】このようにして得られた７−アミノセフェ
ム化合物生産菌（７−アミノセフェム化合物生産用ベク
タ−で形質転換されたセファロスポリン化合物（II）生
産菌）を培地に培養する。この培養法は原則的には一般
微生物の培養方法に準ずるが、通常は液体培地による深
部培養法が有利である。培養に用いられる培地として
は、合成培地、半合成培地あるいは天然培地が用いら
れ、培地組成は炭素源としては、例えばグルコース、シ
ュークロース、マルトース、グリセリン、でん粉、液化
でん粉等が用いられ、窒素源として、例えば肉エキス、
カゼイン加水分解物、ペプトン、グルテンミール、コー
ンミール、綿実粉、大豆粉、コーンスチープリカー、乾
燥酵母、酵母エキス、尿素、りん酸アンモニウム等が用
いられる。このほか、例えばりん酸水素２ナトリウム、
りん酸２水素カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネ
シウム、炭酸カルシウム等の無機塩も必要に応じて培地
に添加される。

【００２２】また培養中発泡の著しい時には、例えば大
豆油、亜麻仁油等の植物油、オクタデカノール、テトラ
デカノール、ヘプタノール等の高級アルコール類、シリ
コン化合物等の消泡剤を適宜添加すればよい。

【００２３】培養温度は30℃前後が適当であり、培養容
量の増大に従って適宜種培養を行なうと好結果が得られ
ることが多い。本培養の培養時間は100〜170時間位が適
当であり、培地が濃厚になるのに従って、培養時間をさ
らに延長してもよい。以上述べた培養条件は使用生産菌
株の特性に応じてそれぞれの最適の条件を選択して適用
される。

【００２４】次に、培養により生成した７−アミノセフ
ェム化合物(I)は通常、培養物中の菌体外に蓄積される
ことが多いので、一般には遠心分離、ろ過等の手段によ
り菌体およびろ液（上澄液）に分離した後ろ液から一般
抗生物質の製造に用いられる手段により分離、精製およ
び採取される。すなわち、通常、上記ろ液(上澄液)に減
圧濃縮、溶媒抽出、液性変換、例えば陰イオン交換樹
脂、陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等の樹脂に
よる処理、例えば活性炭、けい酸、シリカゲル、アルミ
ナ、セルロース等の吸着剤による処理、高速液体クロマ
トグラフィー、結晶化、再結晶等の手段を任意の順序に
組合せまたは反復して適用することにより、目的物質、
７−アミノセフェム化合物(I)を分離、精製することが
できる。遊離の形で得られた７−アミノセフェム化合物
(I)は、例えば水酸化ナトリウムなどの塩基を作用させ
て、所望の塩類に導くことができる。

【００２５】次に実施例によりこの発明を説明するが、
実施例中で用いられる略語の解説を下記に示す。

【００２６】DNA ：デオキシリボ核酸 c-DNA ：相補DNA RF DNA：複製型DNA RNA ：リボ核酸 m-RNA ：メッセンジャーRNA dNTP ：dATP(デオキシアデノシン三リン酸)、dCTP(デオ
キシシチジン三リン酸) dGTP(デオキシグアノシン三リン酸)およびdTTP(デオキ
シチミジン三リン酸)の混合物 bp ：塩基対 Kbp ：キロ塩基対 Ap^R ：E. coliにおけるアンピシリン耐性 Ap^S ：E. coliにおけるアンピシリン感受性 Cm^R ：E. coliにおけるクロラムフェニコール耐性 Cm^S ：E. coliにおけるクロラムフェニコール感受性 Km^R ：E. coliにおけるカナマイシン耐性 Km^S ：E. coliにおけるカナマイシン感受性 Tc^R ：E. coliにおけるテトラサイクリン耐性 Tc^S ：E. coliにおけるテトラサイクリン感受性 lac PO：E. coliのラクトース・オペロン・プロモーター
およびオペレーター tac PO：E. coliのトリップラック・プロモーターおよび
オペレーター Acy⁺ ：アシラーゼ活性 Hm^R ：ハイグロマイシンＢ耐性 G418^R：抗生物質G418耐性

【００２７】DAO ：Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ IPNS ：イソペニシリンＮ合成酵素 CC ：セファロスポリンＣ CCNa ：セファロスポリンＣナトリウム DCC ：デアセチルセファロスポリンＣ 7ACA ：７−アミノ−３−アセトキシメチル−３−セフ
ェム−４−カルボン酸 7ADCD：７−アミノ−３−ヒドロキシメチル−３−セフ
ェム−４−カルボン酸 ケト−AD−7ACA：ケトアジピル−7ACA［７−（５−カル
ボキシ−５−オキソペンタンアミド）−３−アセトキシ
メチル−３−セフエム−４−カルボン酸］ ケト−AD−7ADCA：ケトアジピル−7ADCA［７−（５−カ
ルボキシ−５−オキソペンタンアミド）−３−ヒドロキ
シメチル−３−セフエム−４−カルボン酸］ GL−7ACA：グルタリル−7ACA［７−（４−カルボキシブ
タンアミド）−３−アセトキシメチル−３−セフエム−
４−カルボン酸］ GL−7ADCA：グルタリル−7ADCA［７−（４−カルボキシ
ブタンアミド）−３−ヒドロキシメチル−３−セフエム
−４−カルボン酸］ DTT ：ジチオスレイト−ル Tris ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン EDTA ：エチレンジアミンテトラ酢酸

【００２８】SDS ：ラウリル硫酸ナトリウム PEG ：ポリエチレングリコール IPTG ：イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド X-gal：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β
−ガラクトシド Met ：メチオニン Thr ：スレオニン Ala ：アラニン Gln ：グルタミン Gly ：グリシン Val ：バリン Pro ：プロリン Ile ：イソロイシン Lys ：リジン Asn ：アスパラギン Glu ：グルタミン酸 Phe ：フェニルアラニン Leu ：ロイシン Asp ：アスパラギン酸 Tyr ：チロシン Cys ：システイン Trp ：トリプトファン Ser ：セリン Arg ：アルギニン His ：ヒスチジン

【００２９】下記実施例で用いられる主な緩衝液および
培地の組成は次の通りである。

【００３０】

【００３１】

【００３２】

【００３３】なお、下記実施例における遺伝子操作は、
特に断わり書きのない限り、モレキュラ−・クロ−ニン
グ［T.Maniatis et al.; Molecular Cloning (1982) C
oldSpring Harbor Laboratory]に記載の方法により行な
った。

【００３４】実施例１ この実施例での全操作の概略を第１−１図に示す。 (1)アルカリプロテアーゼのｃ-DNAおよび染色体 DNAの
クローニング (i) A. chrysogenum ATCC11550株由来アルカリプロテア
ーゼの精製と抗体の作成：八木ら[J. Yagi et al., J.
Ferment. Technol., 50(1972)592]の方法に従って、A.
chrysogenum ATCC11550株を培養し、培養ろ液より、70
％飽和硫酸アンモニウム沈殿、CM(カルボキシメチル)セ
ルロース、セファデックスG75により精製することで、
アルカリプロテアーゼを取得した。11％SDS−PAGE（SDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で解析すると約３
万ダルトンの分子サイズであった。このアルカリプロテ
アーゼをフロイントの完全アジュバント(DIFCO)と混
ぜ、１回当り２mgで、３回ウサギ（ニュージーランドホ
ワイト♂）に注射し、抗体を作らせた。この後、全血採
血し、血清をとり、56℃、30分間処理後、35％飽和硫酸
アンモニウム沈殿、ProteinA−Sepharose CL-4Ｂ（ファ
ルマシア）で抗体を精製し、全量を16mlにした。オクタ
ロニーにより、プロテアーゼタンパク質と抗体が免疫沈
降をおこすことを確認した。この時、プロテアーゼを注
射していないウサギのIgG（イムノグロブリン Ｇ）画分
では、プロテアーゼとは免疫沈降をおこさなかった。

【００３５】(ii) A. chrysogenum ATCC11550 より、染
色体 DNAライブラリーの作成：公開特許公報昭61−2095
93［磯貝ら、公開昭和61年(1986)９月17日］の方法で、
A.chrysogenum ATCC11550より、染色体DNAを抽出した。
このDNA（約25μg）に制限酵素EcoRＩ（100ユニット）
を加え、37℃で３時間保温することにより部分切断した
後、ショ糖密度勾配遠心分離法（５〜20％シュークロー
ス、日立超遠心ローターRPS 55T−２、50krpm、４時
間）により約３Kbp以上のDNAサイズに精製 した。サイ
ズにより分別したDNAは最終的にTE緩衝液100μlに溶解
した。一方、λgtWES・λB DNA[Bethesda Research Lab
oratories (BRL)]（約40μg）をEcoRＩで完全切断後、
ショ糖密度勾配遠心分離法（上記条件）により、4.85Kb
pのDNAを除き、21.7KbpのLeft armおよび13.8KbpのRigh
t armを精製した。EcoRＩ部分切断(＞３Kbp)DNA断片(約
5μg)とλgtWES・λBのEcoRＩarm(約15μg)を混合し、T4
DNAリ ガーゼで結合した後、パッカージーン［λファー
ジインビトロパッケージングシステム、Promega Biotec
（生化学工業輸入販売）］により、インビトロパッケー
ジングをした。E. coli DP50 supF（パッカージーンの
キットに入っている。） を宿主として、プラークをつ
くらせると約２×10⁶ 個が得られた。すなわち、約２×
10⁶ 個の染色体DNAライブラリーが作成できた。

【００３６】(iii) A. chrysogenum ATCC11550株よりの
m-RNAの抽出、精製：4.5％可溶性デンプン、３％コーン
・スチープ・リカー(CSL)、1.5％大豆粉、0.35％CaCO₃ か
らなる水性培地100mlでA. chrysogenum ATCC11550株を2
5℃で４日間培養した。この菌体を液体窒素で乳鉢を氷
冷しながら低温下で破砕した後、40mlのグアニジンイソ
チオシアネート溶液［４Ｍグアニジンイソチオシアネー
ト、50mM Tris-HCl(pH7.5)、20mM EDTA、２％Ｎ−ラウ
ロイルサルコシンナトリウム、0.17Ｍ２−メルカプトエ
タノール］に懸濁し、60℃で５分間加熱した。10,000×
ｇで10分間遠心した後、グアニジン／塩化セシウム法
［Molecular Cloning(1982)196、Cold Spring Harbor L
aboratory参照］に従って、上澄液から全RNA 13mgを得
た。全RNA 13mgを１ｇオリゴ（dT）−セルロース(BRL)
により、２回精製する[Molecular Cloning(1982)197参
照]ことにより、460μgのポリ(A)RNA(m-RNA)を得た。

【００３７】(iv) オカヤマ−バーグ法によるc-DNAライ
ブラリーの作成：完全長に近いc-DNAを取得するために
オカヤマ−バーグ法［H. Okayama and P.Berg, Mol. Ce
ll. Biol.2(1982)161参照］を用いて、c-DNAライブラリ
ーを作成した。(iii)で得たm-RNA４μgとプライマー0.9
μg[３′−Oligo(dT)-Tailed pSV7186-Derived Plasmid
Primer(ファルマシア)]に逆転写酵素(生化学工業)を作
用させることにより、ss-c-DNA(一本鎖c-DNA)0.64μgを
合成した。これにターミナル トランスフェラーゼを作
用させて、平均18のＣ−テーリングをした。制限酵素Hi
ndIIIで切断した後、リンカー0.25μg［３′−Oligo（d
G)-Tailed pSV1932-Derived HindIII linker(ファルマ
シア)]とアニーリングし、E. coli DNAリガーゼを 作用
させた。次いで、RNaseH(BRL)、DNAポリメラーゼＩ(フ
ァルマシア)およびE. coli DNAリガーゼ（ファルマシ
ア）を作用させて、ds-c-DNA（二本鎖c-DNA）を合成し
た。次いで、このc-DNAを用い、D. Hanahanの方法[D. H
anahan, J.Mol.Biol., 166(1983)557参照]に従って、E.
coliDH1（ATCC33849)を形質転換し、3.6×10⁴個のアン
ピシリン耐性クローンを得た。すなわち、3.6×10⁴個の
c-DNAライブラリーが作成できた。

【００３８】(v) A. chrysogenum ATCC11550株のアルカ
リプロテアーゼc-DNAのクローニング：3.6×10⁴個のc-D
NAライブラリーよりプラスミドDNA を分離し、λgt11(A
TCC37194)へ再クローニングした後、(i)で作成したプロ
テアーゼ抗体を用いて、エクスプレスーブロット・アッ
セイにより、プロテアーゼ遺伝子を探索した。c-DNAのD
NA混合物20μgをPstＩで切断後、Bal31(BRL)1.2ユニッ
ト（最終液量600μl）で37℃５分間処理し、平滑末端に
した。フェノール抽出、エタノール沈殿 後、dNTPの存
在下でクレナウ断片(Large Fragment E. coli DNA Poly
meraseＩ)を作用させた。この後、フェノール抽出、エ
タノール沈殿をし、Ｓ−アデノシルメチオニンの存在下
でEcoRＩメチラーゼ(New England Biolabs)を作用させ
て、EcoRＩで切断されないようにEcoRＩ部位をメチル化
した。このDNA約10μgと、pEcoRＩリンカー[d(pG-G-A-A
-T-T-C-C)、宝酒造製]５μgを混合し、T4DNAリガーゼに
より結合した。65℃、15分間処理することにより酵素
を失活後、EcoRＩで切断し、５％アクリルアミドゲル電
気泳動によりpEcoRＩリンカーを除いた。アクリル アミ
ドゲルより、溶出緩衝液（0.5Ｍ CH₃COONH₄, 10mM 酢酸
マグネシウム, １mM EDTA,１％SDS）でDNAを溶出し、DE
52(ファルマシア)により精製した[10mMTris-HCl(PH7.
5),5mM EDTA中0.1M NaClで吸着、1MNaClで脱着;スパンカ
ラムによる]。

【００３９】λgt11 DNAを精製後、DNAリガーゼ、EcoR
Ｉ切断、アルカリ性フォスファターゼによる処理がなさ
れているプロトクローンGT11DNA（Promega Biotec、生
化学工業販売）２μgと上記処理したc-DNA混合物を混合
し、T4DNAリガーゼにより連結した。このDNA混合物を、
パッカージーン（λファージ、インビトロパッケージ
ングシステム、Promega Biotec）を用いて、インビトロ
パッケージングをした後、E. coli Y1090(r^-m⁺)(ATCC 3
7197)を宿主として、プラークをつくらせると約 ３×10
⁵個が得られた。X-galおよびIPTG存在下でプラークを見
ると約75％が白いプラークで、残りの約25％が青いプラ
ークだった。 アンピシリン50μg／ml含有LB寒天20ml
の入った直径約8.5cmのシャーレ上に、E. coli Y1090(r
^-m⁺)の培養液(0.1ml)、上記λgt11のc-DNAライブラリー
約１×10⁴ 個および上層寒天（LB寒天のうち寒天濃度の
み0.8％）３mlの混合物を広げた後、室温に１時間放置
して、 寒天をかため、42℃で４時間培養した。直径82.
5mmのニトロセルロースフィルター（Bio-Rad Laborator
ies）を10mM IPTG溶液にひたした（１時間）後、乾燥
（ 室温約１時間）した。このフィルターを上記培養シ
ャーレ上にのせ、さらに37℃で2.5時間培養することに
より、遺伝子の発現と、フィルターへのブロッティン
グ（Blotting）を行なった。このようにブロッティング
した約７×10⁴個のプラ ークよりエクスプレス−ブロッ
ト・アッセイ・キット［Express-Blot Assay Kit(Bio-R
ad)］と(i)で作成した抗体を用いることにより、６個の
陽性クローンを取得した。エクスプレス−ブロット・ア
ッセイ［T.V. Huynh et al, DNA Cloning volumeＩ(198
5)73〜75 IRL Press 参照］の方法は、キットについて
いるマニュ アルに従って行なった。融合タンパク質発
現およびプラークリフトしたフィルターをゼラチンでブ
ロッキング後、E. coli lysate（キットに入っている）
で中和したウサギ由来プロテアーゼ抗体［antibody inc
ubation buffer（キットのマニュアル参照）20mlに対し
て、E. coli lysate 0.2mlおよびプロテーゼ抗体４μl
を加えて中和した］で反応した。次に、HRP（horse rad
ish peroxidase）標識ヤギ抗ウサギIgG(キットに入って
いる)で反応し、ついで、発色させた。ポジティブ ・ク
ローンよりは青紫色スポットが出るが、陰性クローンや
ウサギのコントロール抗体を用いてはこのようなスポッ
トは出なかった。

【００４０】上記６個の陽性クローンよりDNAを分離
し、制限酵素により切断し、c-DNAインサートの長さを
比較し、一番長いクローンをλgt-Protease２（第１−
２図参照）と命名した。他の５個のクローンも同様な制
限酵素切断地図だった。

【００４１】(vi) プロテアーゼc-DNAクローンλgt-Pro
tease2のpBR325へのサブクローニング：λgt-Protease
２のDNAをEcoRＩで切断し、アガロースゲル（0.8％）電
気泳動、電気泳動溶出法［Molecular Cloning(1982)p15
0およびp164、Cold Spring Harbor Loboratory 参照］
により、約0.5Kbpと約2.6KbpのDNAを単離した。一方、p
BR325（BRL）のDNAをEcoRＩで切断後、これに上記約0.5
Kbpおよび約2.6KbpのDNA断片を混合し、 T4DNAリガーゼ
により連結した。それぞれの混合物をE. coli DH1に形
質転換し、アンピシリン50μg／mlを含むLB寒天プレー
ト上で生育したコロニーのうち、クロラムフェニルコー
ル50μg／mlを含むLB寒天プレート上で生育できない形
質転換株を取得した。これらの株よりDNAを分離し、制
限酵素で切断し 確認後、約0.5KbpのDNAの入っているも
のの一つをpBR-Pro2-E2（プロテアーゼc-DNAのＮ末付
近）と、また、約2.6KbpのDNAの入っているものの一つ
をpBR-Pro2-E3（プロテアーゼc-DNAのＣ末側）と命名し
た。

【００４２】(vii) プロテアーゼ染色体DNAクローン,
λ-G-Protease-1413およびλ-G-Protease-0112のクロー
ニング：(ii)で作成したA. chrysogenum ATCC11550の染
色体DNAライブラリー約５×10⁴個より、pBR-Pro2-E2お
よびpBR-Pro2-E3をプローブとして、プロテアーゼ染色
体DNAクローンλ-G-Protease-1413およびλ-G-Protease
-0112（第１−２図参照）をクローニングした。

【００４３】10mM MgCl₂含有LB寒天20mlの入った直径約
8.5mのシャーレ上に、E. coli DP50supF（Promega Biot
ec）の培養液(0.1ml) (ii)で作成した染色体DNAライブ
ラリー約１×10⁴個および上層寒天（LB寒天のうち寒天
濃度のみ0.8％）３mlの混合物を広げた後、37℃で一夜
培養した。Advanced Bacterial Geneticsに示してある
方法［Advanced Bacterial Genetics(1980)p162およびp
174、Cold Spring Harbor Laboratory］によりファージ
をニトロセルロースフィルター(直径82mm,BioRad)に移
し、変性中和後、³²PでラベルしたpBR-Pro2-E2とpBR-Pr
o2-E3のDNA混合物をサザン雑種形成(Southern Hybridiz
ation)を行ない、陽性クローンをとった。 ³²PでのDNAの
ラベル化は、α-³²P-dCTPを用いた、ニックトランスレ
ーション(Nick translation)法［Molacular Cloning(19
82)p109, Cold Spring Harbor Laboratory］で行なっ
た。

【００４４】約５×10⁴個のプラークより、９個の陽性
クローンをとった。これらより上記と同様な方法で単プ
ラーク分離(monoplaque isolation)することにより８種
の陽性クローンを得た。これらのクローンよりDNAを分
離し、EcoRＩで切断後、アガロースゲル(0.8％)電気泳
動にかけ、サザーンの方法、［E. M. Southern, J. Mo
l. Biol., 98(1975)116］に従って、上記方法で³²Pラベ
ルしたpBR-Pro2-E2またはpBR-Pro2-E3のDNAプローブと
それぞれサザン雑種形成（Southern Hybridization）を
行った。pBR-Pro2-E2のプローブで陽性に出た４クロー
ンのうちの一つをλ-G-Protease-0112(第１−２図参照)
と命名し、pBR-Pro2-E3のプローブで陽性に出た４クロ
ーンのうちの一つをλ-G-Protease−1413（第１−２図
参照）と命名した。

【００４５】(viii) プロテアーゼ染色体DNA pGPR2-EH1
およびpGPR3-EH1の構築：λ-G-Protease-0112 DNAをpBR
322（BRL）にサブクローニングすることによりpGPR2-EH
1（第１−２図参照）を、λ-G-Protease-1413 DNAをpBR
322にサブクローニングすることによりpGPR3-EH1を構築
した。λ-G-Protease-0112 DNAをEcoRＩ、HindIIIで切
断し、アガロースゲル（0.8％）電気泳動、電気泳動溶
出法により、約3.5KbpのDNAを単離した。一方、pBR322
のDNAをEcoRＩ、HindIIIで切断後、上記約3.5KbpのDNA
断片と混合し、T4DNAリガーゼにより連結した。この混
合物をE. coli DH1に形質転換し、アンピシリン50μg／
mlを含むLB寒天プレートで生えてきたコロニーのうち、
テトラサイクリン10μg／mlを含むLB寒天プレートで生
えられない形質転換株を取得した。このうちの １株よ
りDNAを分離し、pGPR2-EH1（第１−２図参照）と命名し
た。同様にλ-G-Protease-1413 DNAをEcoRＩ, HindIII
で切断後、約3.7Kbp DNA断片をアガロース ゲル電気泳
動、電気泳動溶出法により単離し、pBR322のEcoRＩ-Hin
dIII断片へクローニングすることによりpGPR3-EH1（第
１−２図参照）を構築した。

【００４６】これらのpGPR2-EH1およびpGPR3-EH1が目的
のものであるかどうかを、(vii)のλ-G-Protease-0112
または、λ-G-Protease-1413と同様にして、サザン雑種
形成（Southern Hybridization）法によりたしかめた
（ただし、DNAはEcoRＩ, HindIIIの二重消化（double d
igestion）で使用³²Pプローブはそれぞれに対応するも
のを使用）。

【００４７】(ix) A. chrysogenum ATCC11550由来のプ
ロテアーゼ遺伝子のc-DNAおよび染色体DNAの塩基配列の
決定：λgt-Protease2のc-DNA部分約1.5Kbp、pGPR2-EH1
のXhoＩ-EcoRＩ約1.4KbpおよびpGPR3-EH1のEcoRＩ-Pst
Ｉ約1.8KbpのDNA塩基配列を、M13mp10およびM13mp11ベ
クター(Amersham)とα-³²P-dCTPを用いるジデオキヌク
レオチド合成鎖停止法［F.Sanger et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. USA 74 (1977)5463］により決定した。この
結果を、第１−４図および第１−５図に示した。λgt-P
rotease2のロング・オープン・リーディング・フレーム
を第１−７図に示した。また、このc-DNAはλgt11のβ
−ガラクトシダーゼと融合蛋白として発現することによ
り抗体でスクリーニングし、取得したものであるので、
このβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とフレーム（frame）
を合わせて、翻訳させてみたのが第１−６図である。き
れいにフレームの合うことがわかる。また21塩基対のGC
テーリングがされている部分でλgt11に結合されている
ことがわかった。オカヤマ・バーグ法でc-DNAを作成し
たことと、この作成した時のGCテーリングがついている
ことより、λgt-Protease2のc-DNAは、ほぼ完全長に近
いものと推定される。このc-DNAの塩基配列の解析結果
が第１−３図のＡに示してある。c-DNAと染色体DNAの塩
基配列を比較することにより、染色体DNAのうちm-RNAに
転写される部分が判明した（第１−３図のＢ参照）。こ
の前後の部分のプロモーターおよびターミネーターが存
在する推定位置を、第１−３図のＢに示した。

【００４８】なお、第１−７図で明らかになったA. chr
ysogenum由来のアルカリプロテア−ゼのプレプロタンパ
クのアミノ酸配列とAspergillus oryzae由来の公知のア
ルカリプロテア−ゼのそれ [Molecular General Geneti
cs 219(1989)33〜38]と比較してみると、前者の402アミ
ノ酸残基中230アミノ酸残基が後者のそれと一致し、57.
2％の相同性を示しセリンプロテア−ゼであることが判
明した。このデ−タおよび別途研究の結果から、A.chry
sogenum由来の成熟アルカリプロテア−ゼの一次 構造は
第１−７図に示すアミノ酸配列１〜285により表わされ
ると推定された。

【００４９】(2) プラスミドpCYG-B2の構築 (i) A. chrysogenum ATCC11550株由来のプロテアーゼ遺
伝子の染色体DNAのプロモーターへのEcoRＩおよびBamH
Ｉ合成DNAリンカーの導入：pGPR2-EH1(第１−２図参照)
のDNAをSmaＩで切断後、合成EcoRＩリンカー［d(CCGAAT
TCGG), 宝酒造］を加え、T4DNAリガーゼにより連結し
た。この後、EcoRＩ,BglIIで切断し、EcoRＩ-BglII断片
（約1.02Kbp）をアガロースゲル（0.8％）電気泳動、電
気泳動溶出法により単離した。このDNA断片(約1.02Kbp)
とベクタープラスミドpBR322EcoRＩ-BamHＩDNA断片(4.0
Kbp)を混合後、T4DNAリガーゼで連結することによりプ
ラスミドpGPR-PA3を得た。

【００５０】pGPR-PA3のDNAをAluＩで切断後、合成pBam
HＩリンカー[d(pCGGATCCG)、宝酒造]を加え、T4DNAリガ
ーゼにより連結した。この後、EcoRＩ、BamHＩで切断
し、EcoRＩ-BamHＩ断片(約0.59Kbp)をポリアクリルアミ
ドゲル（８％）電気泳動、電気泳動溶出法により単離し
た。このDNA断片(約0.59Kbp)とベクタープラスミド pBR
322のEcoRＩ-BamHＩDNA断片(4.0Kbp)を混合後、T4DNAリ
ガーゼで連結することによりプラスミドpGPR-PA3Q2を得
た。 プロテアーゼ遺伝子DNAのプロモーター部位へのE
coRＩおよびBamHＩリンカーの導入部位を第１−８図に
示した。また、この約0.59KbpのDNA塩基配列を第１−９
図に示した。

【００５１】(ii) A. chrysogenum ATCC11550株由来の
プロテアーゼ遺伝子の染色体DNAのターミネーターへのB
amHＩ合成DNAリンカーの導入：pGPR3-EH1(第１−２図参
照)のDNAをBalＩで切断後、合成BamHＩリンカー［d(CCG
GATCCGG)、宝酒造］を加え、T4DNAリガーゼにより連結
した。この後、BamHＩ、PstＩ、XhoＩで切断し、BamHＩ
-PstＩDNA断片(約0.92Kbp)をアガロースゲル(0.8％) 電
気泳動、電気泳動溶出法により単離した。このDNA断片
（約0.92Kbp）とベクタープラスミドpUC18のBamHＩ-Pst
ＩDNA断片（2.7Kbp）を混合後、T4DNAリガーゼで連結す
ることによりプラスミドpGPR-TB1を得た。プロテアーゼ
遺伝子DNAのターミネーター部位へのBamHＩリンカーの
導入部位を第１−８図に示した。また、この約0.92Kbp
のDNAを含むDNA塩基配列を第１−10図に示した。

【００５２】(iii) プロモーターおよびターミネーター
のpCEP97へのクローニング（pCYG-B2の構築）：（第１
−11図参照） pCEP97[磯貝ら、公開特許公報昭61−209593号参照。こ
のベクタ−はEsherichia coli C600r-m-(pCEP97) ATCC3
9971から常法により単離することができる。]のDNA(Ap^R
Cm^R)（第１−11図参照）をEcoRＩ、HindIIIで切断し、p
GPR-PA3Q2[(i)を参照、プロモーター（約0.59Kbp）]のD
NA（Ap^RCm^S)をEcoRＩ、BamHＩで切断し、さらに、pGPR-
TB1［(ii)を参照、ターミネーター（約0.92Kbp）］のDN
A（Ap^RCm^S）をBamHＩ、HindIIIで切断した。pCEP97の E
coRＩ-HindIIIDNA断片(約6.1Kbp)およびpGPR-TB1のBamH
Ｉ-HindIIIDNA断片(約0.93Kbp)をアガロースゲル(0.8
％)電気泳動、電気泳動溶出法によりそれぞれ単離し
た。また、pGPR-PA3Q2のEcoRＩ-BamHＩDNA断片（約0.59
Kbp）をアクリルアミドゲル（８％）電気泳動、電気泳
動溶出法により単離した。さらに、これら３種のDNA断
片を混合後、T4DNAリガーゼで連結し、E. coli DH1へ形
質転換した。アンピシリン50μg／ml含有LB寒天プレー
ト上で生育し、クロラムフェニコール50μg／ml含有LB
寒天プレート上で生育しない形質転換株を取得した。こ
のうちの１株よりDNA 分離し、pCYG-B2(第１−11図参
照)と命名し、制限酵素により確認した。

【００５３】(3) IPNS遺伝子の染色体DNAのクローニン
グ (i) A. chrysogenum 3112株よりの染色体DNAの抽出・精
製 １％グルコース、３％可溶性デンプン、３％コーンスチ
ープリカー（CSL）、1.5％大豆粉、0.5％CaCO₃（pH6.
5）からなる培地（100ml）で、A. chrysogenum 3112株
を培養した（30℃５日間）。この菌体を、液体窒素で氷
冷しながら乳鉢で破砕した後、50mM Tris-HCl（pH7.
5）、10mM EDTA、１％SDSになるように緩衝液を加え、6
5℃で10分間加熱した。フェノール抽出２回とエタノー
ル沈殿をし、５μg／ml RNase A(シグマ)、ついで100μ
g／ml Protease K(メルク)で処理した。さらに、フェノ
ール抽出、エタノール沈殿後、ショ糖密度勾配遠心分離
法（５〜20％シュクロース、日立超遠心ローターSRP28,
22krpm,13時間）により染色体DNA を精製した。

【００５４】(ii) イソペニシリンＮ合成酵素（IPNS）
の染色体DNAサイズの同定 S. M. Samson ら[S. M. Samson et al., Nature, 318(1
985)191]のクローニングした、A. chrysogenum由来のIP
NS遺伝子のDNA塩基配列を参考にして、15mer２本および
12mer１本の下記配列のDNAを合成した。DNA合成法は、
「大塚栄子 分子遺伝学実験法（1983）298−307共立出
版」に従って行なった。 プローブ 5’-CTATTCGGCGATGAC-3’ プローブ 5’-AAGGAGAAGAAGCTC-3’ プローブ 5’-CTCCTTGTCATC-3’

【００５５】プローブおよびプローブをイングリア
ら［Inglia et al., Nucleic AcidsRes., 9(1982)162
7］の方法に従い、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(BRL)と
γ−^{3 2}P ATPとを用いて、それぞれラベルした。この
後、プローブ、プローブ、プローブのDNA溶液を
混合し、95℃で２分間加熱し、徐々に室温にもどすこと
によりアニーリングした。次に、NENSORB20（Du Pont,
第一化学輸入販売）により精製した(付属のマニュアル
に従う)。一方、(i)で取ったA. chrysogenum 3112の染
色体DNA(約５μg)をBamHＩで切断し、アガロースゲル
(0.8％)電気泳動にかけた後、サザーンの方法[E. M. So
uthern, J. Mol, Biol., 98(1975)503]に従って、ニト
ロセルロースフィルターに移し、サザーン・ハイブリダ
イゼーションに付した。ハイブリダイゼーションの条件
は、６×SSC（0.9Ｍ NaCl, 0.09Ｍクエン酸 ナトリウム
pH7.0）、５×BFP[１×BFP：0.02％牛血清アルブミン、
0.02％フィコール(MW：400,000)、0.02％ポリビニルピ
ロリドン]、0.5％SDS、100μg／ml担体DNA(Calf Thymus
DNA)およびラベルした上記DNAを用いて、42℃で一夜ハ
イブリダイゼーションさせた後、６×SSCを用いて、55
℃で１回、ついで37℃で２×SSC（２×SSCは６×SSCの
３分の１の濃度）を用いて２回洗浄した。その結果、約
3.1KbpのDNA断片と、ハイブリダイゼーション陽性を示
した。

【００５６】(iii) IPNS遺伝子のクローニング (i)で取ったA. chrysogenum 3112株由来の染色体DNA約2
0μgをBamHＩで切断し、アガロースゲル（0.8％）電気
泳動、電気泳動溶出法により約2.5〜4.4KbpのDNA混合物
を分離した。一方、ベクタープラスミドpBR322をBamHＩ
で切断後、上記約2.5〜4.4KbpのDNA混合物と混合し、T4
DNAリガーゼにより連結したのち、E. coli DH1を形質転
換した。アンピシリン50μg／ml含有LB寒天プレート上
に約2.4×10⁵個のコロニーが出てきた。このうち約５％
のコロニーが10μg／mlテトラサイクリン含有LB寒天プ
レート上で生えられなかった。すなわち、約1.2×10⁴個
のコロニーにA. chrysogenum3112株由来のDNAが入って
いた。約2.4×10⁵個の形質転換 株よりプラスミドDNAを
分離し、EcoRＩで切断した。A. chrysogenum 3112株由
来のDNAの入っていないもとのベクタープラスミドを除
くために、EcoRＩで切断し たDNAより、アガロースゲル
（0.8％）電気泳動、電気泳動溶出法により約6.5〜9.5K
bpのDNA混合物を分離した。このDNA混合物をT4DNAリガ
ーゼで結合後、E. coli DH1に形質転換し、50μg／mlア
ンピシリン耐性の形質転換株約2.6×10⁴個を得 た。

【００５７】上記約2.6×10⁴ 個の染色体DNAを含むE. c
oli DH1をアンピシリン50μg／mlを含んだLB寒天プレー
ト上でコロニーとして生育させ（37℃９時間）、ニトロ
セルロースフィルターに移した後、さらにクロラムフェ
ニコール250μg／mlを含んだLB寒天プレート上で、37℃
において12時間保温した。次に、0.5Ｎ NaOH−1.5Ｍ Na
Clで処理（室温、４分間）して溶菌およびDNA変性を行
い、0.5Ｍ Tris−HCl（pH7.0）−1.5Ｍ NaClにより中和
（室温５分間を２回）した後、³²Pでラベルした30merの
プローブとプローブの結合DNAと(ii)に示した方法
でハイブリダイゼ ーションを行なった。この結果、５
個のハイブリダイゼーション陽性の株を得た。これらの
株より、プラスミドDNAを分離し、制限酵素で切断して
比較すると全 く同一であった。これらのうち一つをpIP
S105（第１−12図参照）と命名した。

【００５８】(iv) pIPS105のM13mp10へのクローニング アマーシャム社のM13クローニングキットを用いて、こ
のマニュアルにしたがって行なった。pIPS105DNAをSal
で切断し、アガロースゲル(1.5％)電気泳動、電気泳動
溶出法により、約0.63KbpのDNA断片を単離した。このDN
A断片とSalＩで切断したM13mp10 DNAを混合し、T4DNAリ
ガーゼで連結後、E, coli JM105（Amersham）を宿主と
して形質転換した。X-galおよびIPTG存在下で白いプラ
ークを取得し、E. coli JM105を宿主として、ファージ
をふやした。この菌体よりRF（replicating form）DNA
を分離し、M13mp10-IPS4-2と命名した。同様に、pIPS10
5DNAをPstＩ、BamHＩで切断し、アガロースゲル（0.8
％）電気泳動、電気泳動溶出法により約1.0KbpのDNA断
片を単離した。このDNA断片（約1.0Kbp）とM13mp10のPs
tＩ-BamHＩDNA断片をT4DNAリガーゼで結合し、上記方法
によりクローニングした。このファージをE. coli JM10
5を宿主として培養することによりRF DNAを分離し、M13
mp10-IPS3と命名した。

【００５９】M13mp10-IPS4-2のss-DNA（single strande
d DNA）のSalＩ約0.63Kbp部分のDNA塩基配列を、ジデオ
キシヌクレオチド合成鎖停止法により決定した(Amersha
mのシークエンシングキットを使用した）。 このうちの
SalＩ-NcoＩDNA断片478bpを第１−13図に示した。 これ
により、IPNS遺伝子であることと、プロモーター部分が
同定できた。また、M13mp10-IPS3のIPNSターミネーター
およびM13mp10のマルチクローニングサイト部分の制限
酵素地図を第１−14図に示した。IPNS遺伝子のプロモー
ターおよびタ−ミネ−タ−は第１−13図および第１−16
図にそれぞれ示したDNA塩基配列をもとにして、DNA合成
機で容易に合成できる。

【００６０】(4) pCYG-EB2の構築（第１−15図参照） (i) M13mp10-IPS3のBamHＩ部位の欠失（第１−12図参
照） M13mp10-IPS3のRF DNAをBamHＩで切断後、dNTPの存在下
でクレナウ 断片(Large Fragment E. coli DNA Polyme
raseＩ, Amersham)により修復した。この後、T4DNAリガ
ーゼで結合し、再度BamHＩで切断した。これを、E. col
i JM105を宿主として、形質転換し、ファージプラーク
を取得した。このファージをE. coli JM105を宿主とし
て、ふやし、菌体よりRF DNAを分離した。このDNAをM13
mp10-IPS3-D8と命名し、BamHＩで切れないことを確認し
た。M13mp10-IPS3-D8のBclＩ-EcoRＩ約1.0Kbp部分(タ−
ミネ−タ−含む部分)のDNA塩基配列をα−³²P−dATPと
シ−クエナ−ゼを用いるジデオキシヌクレオチド合成鎖
停止法により決定した。第１−16図にその配列を示す。

【００６１】(ii) IPNSプロモーターとG418耐性遺伝子
の結合 Tn903のG418耐性遺伝子［A. Oka et al., J. Mol. Bio
l, 147(1987)217］をpCYG97[公開特許公報昭61−209593
号参照。このpCYG97はEscherichiacoli C600r-m-(pCYG9
7) ATCC399770から常法により単離することができる]の
PvuII切断DNAから精製した（PvuII1696bp断片）。この1
696bpDNA断片に、合成BamHＩリンカー［d(CCGGATCCG
G)、宝酒造］を加え、T4DNAリガーゼにより連結した。
この後BamHＩで切断し、エタノール沈殿を３回くり返す
ことにより、未結合リンカーDNAを除いた。一方、pUC18
（宝酒造）DNAをBamHＩで切断し、上記BamHＩリンカー
を結合した1.7KbpDNA断片と混合し、T4DNAリガーゼで連
結した。このDNA溶液をE. coli JM109(宝酒造)に形質転
換し、カナマイシン20μg／ml含有LB寒天プレート上に
生えてくる形質転換株を得た。これらの株の一つよりDN
Aを分離し、pUC-Tn903-F1と 命名し、制限酵素により確
認した。pUC-Tn903-F1DNAをXhoＩ、BamHＩで切断し、ア
ガロースゲル(0.8％)電気泳動、電気泳動溶出法によ
り、約1.21KbpのDNA断片 を単離した。次に、IPNS遺伝
子のプロモーターをM13mp10-IPS4-2RF DNAより、HindII
I, NcoＩで切断後アクリルアミドゲル(８％)電気泳動、
電気泳動溶出法により約0.49KbpのDNA断片(HindIII・Pst
Ｉ・SalＩ−NcoＩ)を単離した。このNcoＩの 部位にATG
が存在する。そこで、NcoＩ-XhoＩの間を合成DNAでつな
ぐことによりG418耐性（カナマイシン耐性）遺伝子が発
現できるようにした。31merの合成DNA ２本(下記)をDNA
合成機381A（Applied Biosystems）で合成した。

【００６２】5’-CATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGC-
3’ 5’-TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCT-3’

【００６３】各合成DNA10μgをTE緩衝液100μlになるよ
うに混合し、95℃で２分間加熱後、徐々に室温にもどす
ことにより２本の合成DNAをアニーリングした。一方、
ベクタ ープラスミドpBR322のHindIII-BamHＩDNA断片
（4.0Kbp）とM13mp10-IPS4-2 HindIII−NcoＩ(約0.49Kb
p）、アニーリングした合成DNA(31bp)、pUC-Tn903-F1 X
ho Ｉ-BamHＩ(約1.21Kbp)のDNA断片を混合し、T4DNAリ
ガーゼで連結した。この後、D. Hanahanの方法［D. Han
ahan, J. Mol. Biol., 166(1983)557］に従って、E. co
li DH1を形質転換し、アンピシリン耐性でテトラサイク
リン感受性の形質転換株を得た。これらの形質転換株よ
りプラスミドDNAを分離し、制限酵素により確 認した。
このうちの一つをpBCG-D3と命名した。

【００６４】(iii) G418耐性遺伝子へのIPNSターミネー
ターの結合 (i)で作成したM13mp10-IPS3-D8のRF DNAをPvuII、BclＩ
で切断し、アガロースゲル(0.8％)電気泳動、電気泳動
溶出法により約1.1KbpのDNA断片を単離した。一方、(i
i)で作成したpBCG-D3のDNAをBamHＩ、PvuIIで切断し、
アガロースゲル（0.8％）電気泳動、電気泳動溶出法に
よりBamHＩ-PvuII約4.05KbpのDNA断片を単離した。Bcl
Ｉ-PvuII約1.1KbpのDNA断片（BclＩ−SacＩ−SmaＩ・Sac
Ｉ・EcoRＩ−PvuII）とBamHＩ−PvuII約4.05KbpのDNA断
片を混合し、T4DNAリガーゼで連結後、E. coli DH1を形
質転換した。アンピシリン耐性の形質転換株株より、プ
ラスミドDNAを分離し、制限酵素により確認した。この
うちの一つをpBCG-DT1と命名した。

【００６５】(iv) G418耐性発現ユニットのpCEP97への
クローニング（第１−15図参照） pCEP97 （第１−15図参照）のDNA約10μgを30ユニット
のPvuIIで37℃１時間（最終量 200μl）作用させ、DNA
を部分切断した。フェノール抽出、エーテル抽出 を
し、ついでエタノール沈殿を行なった。次に、このDNA
をSalＩで完全切断し、アガロースゲル（0.8％）電気泳
動、電気泳動溶出法により、約6.0KbpのDNAを単離し
た。一方、(iii)で作成したpBCG-DT1のDNA約10μgを20
ユニットのSmaＩで37 ℃30分間(最終量 100μl）作用さ
せ、DNAを部分切断した。フェノール抽出、エーテル抽
出をし、ついでエタノール沈殿を行なった。次に、この
DNAをSalＩで完全切断し、アガロースゲル(0.8％)電気
泳動、電気泳動溶出法により、約2.7KbpのDNA断片を分
離した。次に、PvuII−PvuII−SalＩ約6.0KbpのDNA断片
とSalＩ−SmaＩ−SmaＩ約2.7KbpのDNA断片を混合し、T4
DNAリガーゼで連結後、E. coli DH1を形質転換した。ア
ンピシリン50μg／ml含有LB寒天プレート上で生育して
きたコロニーのうち、クロラムフェニコール35μg／ml
含有LB寒天プレート上で生育する形質転換株64株を得
た。これらより、プラスミドDNAを分離し、プラスミド
サイズ をアガロースゲル（0.8％）電気泳動で調べるこ
とにより、目的のものが13個存 在した。このうちの一
つをpCYG-E15（第１−15図参照）と命名し、制限酵素に
より確認した。

【００６６】(v) プロテアーゼ発現ユニットのpCYG-E15
へのクローニング（pCYG-EB2の構築）（第１−15図参
照） (iv)で作成したpCYG-E15のDNA約20μgを８ユニットのHi
ndIIIで37℃30分間(最終量 200μl)作用させ、DNAを部
分切断した。フェノール抽出、エーテル抽出をし、つい
でエタノール沈殿を行なった。次に、このDNAをEcoRＩ
で完全切断し、ア ガロースゲル(0.8％)電気泳動、電気
泳動溶出法により、約7.4KbpのDNA断片を単離した。一
方、pCYG-B2(第１−11図参照)をEcoRＩ、HindIIIで切断
後、アガロースゲル(0.8％)電気泳動、電気泳動溶出法
により、約1.5KbpのDNA断片を単離した。この後、HindI
II-HindIII-EcoRＩのDNA断片約7.4KbpとEcoRＩ-HindIII
のDNA断片約1.5Kbpを混合し、T4DNAリガーゼで連結後、
E. coli DH1を形質転換した。アンピシリン50μg／ml含
有LB寒天プレート上で生育してきたコロニーのうち、ク
ロラムフェニコール35μg／ml含有LB寒天プレート上で
生育しない形質転換株を得た。これらの株よりプラスミ
ドDNAを分離し、制限酵素で確認することにより目的 の
プラスミドをとった。このうちの一つをpCYG-EB2（第１
−15図参照）と命名した。

【００６７】実施例２ プロテアーゼ遺伝子の発現ユニットを有するプラスミド
pCYG-B2（第１−11図参照）のBamHＩ部位に、プラスミ
ドpLG90由来のHm^R遺伝子の５′−側を合成DNAで修飾し
たものを導入し、A. chrysogenumでHm^R を発現可能なプ
ラスミドpCYG-HB51を構築した（第２−１図参照）。こ
こで使用するプラスミドpLG90およびそれを構築する方
法も公知である［P. J. M. van den Elzen et al., Pla
nt Molecular Biology, 5 299-302 (1985)およびL. Gri
tz and J. Davies, Gene 25 179-188(1983)参照］。 (1) プラスミドpCYG-HB51の構築 (i) プラスミドpHMP-E5の構築：pLG90を制限酵素HphＩ
で切断後、制限酵素BamHＩで切断した。HphI-BamHＩ
（約1.03Kbp）を含むDNA断片をアガロースゲル（1.5
％）電気泳動、電気泳動溶出法（前記「Molecular Clon
ing」p150およびp164参照）により単離した。

【００６８】一方、pLG90のHm^RBamHＩDNA断片のATGコド
ンのすぐ上流にあるATGを欠失するために、第２−１図
に示した28merと33merのDNAを合成した。DNA合成は、Ap
plied Biosystems社のDNA合成機model 381Aを用い、こ
のオペレーターズ・マニュアルにしたがって行った。合
成DNAの精製は、Applied Biosystems社のオリゴヌクレ
オチド精製カートリッジ（OPCカートリッジ）を用い、
このマニュアルにしたがって行なった。各、合成DNA 10
μgを最終100μlTE緩衝液になるように混合し、95℃で1
0分間加熱した。次に徐々に室温にもどすことにより２
本のDNAをアニーリングさせた。

【００６９】 28 mer 5’-TTTTTCATAGCTGTTTCCTGTGGATCCG-3’ 33 mer 5’-AATTCGGATCCACAGGAAACAGCTATGAAAAAG-3’ 次に、このアニーリングした合成DNAと上記で得られたH
phＩ-BamHＩDNA断片（約1.03Kbp）とプラスミドpUC18
(宝酒造)のEcoRＩ-BamHＩ断片(2.7Kbp)からなる３種のD
NA溶液を混合し、T4DNAリガーゼにより連結したのち、
E. coli JM109(宝酒造)を形質転換した。アンピシリン5
0μg／mlを含むLB寒天プレートで生えてきたコロニーの
うち、150μg／mlハイグロマイシンＢおよび0.5mM IPTG
を含むLB寒天プレート上で生えられる形質転換株を取得
した。この形質転換株からプラスミドを分離し、pHMP-E
5（第2 - 1図参照）と命名し、制限酵素により確認し
た。pHMP-E5の合成DNA部分を含む塩基配列をジデオキシ
ヌクレオチド合成鎖停止法に従い決定したところ設計ど
うりであった。

【００７０】(ii) pCYG-HB51の構築：pHMP-E5をBamHＩ
で切断し、アガロースゲル(0.8％)電気泳動、電気泳動
溶出法により、約1.06KbpのDNAを単離した。一方、A. c
hrysogenumにおける発現ベクターpCYG-B2(第１−11図参
照)のDNAをBamHＩで切断した。両者のBamHＩDNA断片を
混合し、T4DNAリガーゼにより連結したのち、E. coli J
M109を形質転換した。アンピシリン50μg／mlを含むLB
寒天プレート上で生えてきたコロニーのうち、150μg／
mlハイグロマイシンＢを含むLB寒天プレート上で生えら
れる形質転換株を取 得した。A. chrysogenum ATCC1155
0株由来のプローテアーゼ遺伝子のプロモーターおよび
ターミネーターともにE. coli内でプロモーター活性が
存在するので、ATGコドンの前にSD配列(ribosome bindi
ng site seguence)があれば、E. coli内 でtranslation
をおこす。このために、Ap^RHm^R株には、Hm^R遺伝子が両
方向に入ったものが存在する。そこで、これらの株より
プラスミドDNAを単離し、EcoRＩで 切断し、アガロース
ゲル(0.8％)電気泳動により、Hm^R 遺伝子の方向を確認
した 。プロテアーゼ遺伝子のプロモーターの方向と合
っているプラスミドの１つをpCYG-HB51（第２−１図参
照）と命名した。このpCYG−HB51に挿入されているハイ
グロマイシンＢ耐性遺伝子の塩基配列とそれがコード
するアミノ酸配列を第２−２図に示す。

【００７１】実施例３ (1) プラスミドpDAO-EB101（Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
遺伝子の発現ベクター）およびプラスミドpVEB104（CC
アシラーゼ遺伝子の発現ベクター）の構築 アクレモニウム・クリソゲナムに属するセファロスポリ
ンＣ(CC)およびデアセチルセファロスポリンＣ(DCC)生
産菌で、7ACAおよび7ADCAを直接醗酵生産するために第
３−２図のようなルートを考えた。すなわち、(1) CC−
アシラーゼ遺伝子を含有する7ACAおよび7ADCA生産用ベ
クターでCCおよびDCC生産菌を形質転換する方法、(2)
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（DAO）遺伝子とCC−アシラ
ーゼ遺伝子とを含有する7ACAおよび7ADCA生産用ベクタ
ーでCCおよびDCC生産菌を形質転換する方法ならびに(3)
DAO遺伝子とGL-7ACAアシラーゼ遺伝子とを含有する7AC
Aおよび7ADCA生産用ベクターでCCおよびDCC生産菌を形
質転換する方法である。

【００７２】そのために、CCアシラーゼ遺伝子を含有す
る発現ベクターおよびDAO遺伝子を含有する発現ベクタ
ーを調製し、サッカロマイセス・セレビシアエ（S. cer
evisiae）で各酵素が発現することを確認した。この実
施例３での操作の模式図を図３−１に示した。

【００７３】(i) pDAO-EB101の構築：E. coli JM109（p
CFS315）（微工研条寄第1916号）よりDAO発現プラスミ
ドpCFS315（第３−５図参照）を常法により分離し、Bam
HＩで切断後、アガロースゲル（0.8％）電気泳動、電気
泳動溶出法により、1.24KbpのDNAを単離した。なお、プ
ラスミドpCFS315中に含有されるDAOのcDNA塩基配列を第
３−11図に示す。他方、A. chrysogenumにおける発現ユ
ニットを有するベクターpCYG-EB2（第1 - 15図参照）の
DNAをBamHＩで切断した。両者のBamHＩ DNA断片を混合
し、T4DNAリガーゼにより連結した後、E. coli DH1（AT
CC33849）を形質転換した。アンピシリン50μg／mlを含
むLB寒天プレート上で生えてくる形質転換体を取得し
た。これらの形質転換株よりプラスミドDNAを分離し、B
amHＩおよびEcoRＩ＋PvuIIでそれぞれ切断後、アガロー
スゲル（1.5％）電気泳動にかけた。BamHＩ切断で1.24K
bpのDNA断片およびEcoRＩ＋PvuIIで1.33KbpのDNA断片の
存在するプラスミドの１つをpDAO-EB101（第３−３図参
照）と命名した。

【００７４】(ii) pVEB104の構築：土壌よりCCアシラー
ゼ活性をもつPseudomonasdiminuta V22株を分離し、こ
の染色体DNAより、CCアシラーゼ活性を指標にして、E.
coliを宿主とし、アシラーゼ遺伝子をクローニングし
た。この遺伝子のＮ末側をPstＩで切り出し、Ｃ末側をB
al31で欠失させ、約３KbpにしたpCPV22P(第３−６図参
照)を構築した。pCPV22PのベクターとしてはKm^RのpHSG2
98［宝酒造、S. Takeshita et al., Gene 61（1987）63
-74］を用いている。

【００７５】pCPV22PのCCアシラーゼ遺伝子を出発材料
として、Ｎ末側をATG上流のMluＩ部位まで欠失させて、
pV22B1を構築した（第３−６図参照）。V22株CCアシラ
ーゼ遺伝子のATGコドンのすぐ上流のAatII部位付近に異
なるフレームのATGがあることがわかった。そこで、合
成DNAアダプターを用い、このATGを欠失させpV22BS-A11
(第３−８図参照)を構築した。ATGを欠失させたアシラ
ーゼ遺伝子をA. chrysogenumでの発現ベクターpCYG-EB2
にクローニングして、pVEB104（図３−４図参照）を構
築した。

【００７６】(ａ) pV22B1の構築とＮ末側の塩基配列の
決定：E. coli JM109（pCPV22P）株（微工研条寄第2704
号）よりpCPV22Pプラスミドを分離し、このDNA15μgに
30ユニットの制限酵素MluＩ（東洋紡）を37℃15分間作
用させ、DNAを部分切断した。フェノール抽出、エーテ
ル抽出をし、ついでエタ ノール沈殿を行なった。次
に、dNTPの存在下でクレナウ断片（Large Fragment E.
coli DNA polymerase Ｉ）（宝酒造）を作用させ切断点
をブラントエンド（平滑末端）に転換した後、フェノー
ル抽出、エーテル抽出、エタノール沈殿を行なった。そ
の後、EcoRＩで切断し、アガロースゲル（1.5％）電気
泳動、電気泳動 溶出法により、約1.1KbpのDNAを単離し
た。上記約1.1KbpのDNA断片とベクタープラスミドpUC19
（宝酒造）のSmaＩ-EcoRＩ DNA断片(2.7Kbp)を混合後、
T4DNAリガーゼにより連結することによりプラスミドpV2
2F2（第３−６図参照）を得た。

【００７７】アシラーゼＣ末側にBamHＩ部位がないの
で、pCPV22Pのアシラーゼ遺伝子の方向を逆にすること
でＣ末側にBamHＩ部位を導入することにした。pCPV22P
をPstＩで切断し、T4DNAリガーゼで再結合させた後、E.
coli JM109を形質転換した。50μg／mlアンピシリン、
100μg／ml X-galおよび0.5mM IPTGを含むLB寒天プレー
ト 上で生えてくる白い形質転換株(青いものはアシラー
ゼ遺伝子が挿入されていな いベクターpHSG298である)
を取得した。これらの形質転換株よりプラスミドDNA を
分離し、SalＩで切断後、アガロースゲル（0.8％）電気
泳動により、アシラーゼ遺伝子の方向が逆転したpV22R6
（第３−６図参照）を取得した。

【００７８】pV22F2をHindIII、EcoRＩにより切断し、H
indIII-EcoRＩ断片（約1.2Kbp）をアガロースゲル(0.8
％)電気泳動、電気泳動溶出法により単離した。一方、p
V22R6をEcoRＩ、BamHＩにより切断し、EcoRＩ-BamHＩ断
片（約1.4Kbp）をアガロースゲル（0.8％）電気泳動、
電気泳動溶出法により単離した。上記のHindIII-EcoRＩ
断片(約1.2Kbp)、EcoRＩ-BamHＩ断片(約1.4Kbp)、さら
にベクタープラスミドpHSG399［宝酒造、Cm^Rをマーカー
として有するプラスミド：E. coli JM109（pHSG399）は
30μg／mlクロラムフェニルコールを含むLB寒天プレー
トで生育する。］のHindIII-BamHＩ断片（2.2Kbp）の３
種類のDNA断片を混合後、T4DNAリガーゼで連結すること
によりプラスミドpV22B1（第３−６図参照）を得た。

【００７９】pV22B1をBamHＩ、EcoRＩにより切断し、Ba
mHＩ-EcoRＩ断片（約2.5Kbp）をアガロースゲル（0.8
％）電気泳動、電気泳動溶出法により単離した。このDN
A断片をM13mp18およびM13mp19のEcoRＩ-BamHＩ断片にク
ローニングし、pV22B1に挿入されているアシラ−ゼ遺伝
子のオ−プン・リ−ディング・フレ−ムのDNA塩基配列
を決定した第３−７図参照)。塩基配列の決定は、α−
³²P-dATPとSequenase[S. Tabor and C. C. Richardson,
J. Biol.Chem.,264(1989)6447参照]（United States B
iochemical Corporation,）を用い、サンガーらのジデ
オキシヌクレオチド合成鎖停止法［F. Sanger et al.,
Proc. Nat. Acad.Sci. USA 74(1977)5463参照］により
行なった。また、このV22株由来のアシラ−ゼとPseudomo
nas sp.SE83株由来の公知のアシラ−ゼ［A.Mastuda et.
al.,J.Bacteriol.,169(1987)5821]のアミノ酸配列を比
較すると、774アミノ酸中53アミノ酸が異なっていた。 (ｂ)pV22BS-A11の構築(ATG上流のATGの欠失） pV22B1をEcoRＩで切断後、アガロースゲル(0.8％)電気
泳動、電気泳動溶出法により、約3.3Kbpと約1.38KbpのD
NAを単離した。約1.38KbpのDNA断片は、pV22BDS1よりpV
22BS-A11を構築するときに使用する。約3.3KbpのDNA断
片を、T4DNAリガーゼで連結することによりプラスミドp
V22BD3（第３−８図参照）を得た。

【００８０】pV22BD3をAatII、BamHＩで切断後、アガロ
ースゲル(0.8％)電気泳動、電気泳動溶出法により、約
3.3KbpのDNAを単離した。一方、19merおよび11merの合
成DNAを常法により作成した。 19mer 5’-GATCC GGTACC AAG GACGT-3’ 11mer 5’-CCTTGGTACCG-3’ KpnＩ部位を、合成DNAの内に入れて、入ったクローンを
検出しやすくした。各合成DNA10μgを最終100μlTE緩衝
液になるように混合し、90℃で２分間加熱した。次に、
徐々に室温にもどすことにより２本のDNAをアニーリン
グさせた。上記AatII-BamHＩ（約3.3Kbp）のDNA断片と
アニーリングしたDNAを混合し、T4DNAリガーゼで連結す
ることによりプラスミドpV22BDS1（第３−８図参照）を
得た。このDNA には新たにKpnＩ部位が導入されている
ので合成DNAが入っているかどうかが容易にわかる。

【００８１】pV22BDS1をEcoRＩで切断後、上記EcoRＩ-E
coRＩ(約1.38Kbp)のDNAと混合し、T4DNAリガーゼで連結
した。この後E. coli DH1を形質転換し、30μg／mlクロ
ラムフェニコールを含有するLB寒天プレート上に生えて
くる形質転換株を取得した。これらの形質転換株よりプ
ラスミドDNAを分離し、PstＩで切断後、アガロースゲル
（0.8％）電気泳動により、約1.38KbpのEcoRＩ DNA断片
が入っていて、しかも目的の方向になっているpV22BS-A
11(第３−８図参照)を得た。pV22BS-A11をPst Ｉで切断
すると約2.5Kbpおよび2.2KbpのDNA断片が出てくること
により他のもの と容易に区別できる。pV22BS-A11のア
シラーゼ遺伝子部分（BamHＩ約2.5Kbp）の制限酵素地図
を第３−10図に示した。(ｃ) pV22BS-A11のアシラーゼ
遺伝子のA. chrysogenumでの遺伝発現ユニットへのクロ
ーニング:pV22BS-A11をBamHＩで切断後、アガロースゲ
ル（0.8％）電動泳動、電気泳動溶出法により、約2.5Kb
pのDNAを単離した。一方、A. chrysogenumにおける発現
ベクターpCYG-EB2(第1 - 15図参照)のDNAをBamHＩで切
断した。両者のBamHＩDNA断片を混合し、T4DNAリガーゼ
により連結した後、E. coli DH1を形質転換した。50μg
／mlアンピシリンを含むLB寒天プレート上で生えてくる
形質転換株を取得した。これらの形質転換株よりプラス
ミドDNAを分離し、BamHＩおよびEcoRＩで切 断後、アガ
ロースゲル（１％）電気泳動にかけた。BamHＩで約2.5K
bpおよびEcoRＩで約1.67Kbp（アシラーゼ遺伝子が逆方
向のものは約1.96kbp）のDNA断片の存 在するプラスミ
ドの１つをpVEB104（第３−４図参照）と命名した。 (iii) pDAO-EB101およびpVEB104の(S. cerevisiae)での
発現 A. chrysogenum ATCC11550株由来のプロテアーゼ遺伝子
の発現ユニット、F. solani M-0718株由来のＤ−アミノ
酸オキシダーゼc-DNAおよびP. diminuta V22株由来のア
シラーゼ遺伝子が、下等真核生物の一種であるS. cerev
isiae YNN27株[D.T.Stinchcomb et al., Proc, Natl, A
cad, Sci USA., 77(1980)4559］で機能し、酵素活性と
して見られるかどうかを調べた。

【００８２】pDAO-EB101およびpVEB104 DNAのS. cerevi
siaeYNN27への形質転換は、公開特許公報昭61-209593
［磯貝ら、公開昭和61年（1986）９月17日］の実施例２
−IIIと同様にして行なった。S.cerevisiaeYNN27のプロ
トプラストと各DNA10μl（約５μg）を混合後、20％PEG
4000を含む緩衝液を添加し形質転換した。この後約300
μg／mlの抗生物質G418で選択することにより、それぞ
れ約１×10⁴個の形質転換株 を得た。

【００８３】それぞれの形質転換株をウラシル10μg／m
l、トリプトファン40μg／mlおよびG418 300μg／ml含
有YEPD培地（10ｇ／ｌ酵母エキス、20ｇ／ｌペプトン、
20ｇ／ｌグルコース）（５ml）に接種し、30℃で３日間
培養した。この後、細胞を遠心分離により集めた。集め
た細胞をCCNaまたはGL-7ACAと反応させ、反応混合物よ
り 遠心分離により細胞を除いた上澄を、高速液体クロ
マトグラフィー［カラム：Inertsil ODS-2(ガスクロ工
業)、移動相：6.6mMリン酸緩衝液（pH7.3）と３％メタ
ノールからなる溶液、検出：254nm］に供して生成物を
定量した。

【００８４】pDAO-EB101の形質転換株の場合は、５mg／
mlCCNa、0.1Ｍリン酸緩衝液（pH7.5）、および14mMNaN₃
からなる反応液500μlとトルエン５μlを遠心菌体に加
え、37℃で３時間振盪して反応させた。NaN₃ はカタラ
ーゼを阻害して、CCNaがDAOによりケト-AD-7ACAで停止
せずGL-7ACAへ変換させるために添加した。これによ
り、GL-7ACAが840μg／ml生成した。この時、コントロ
ールとして、DAO遺伝子の入っていないpCYG-EB2の形質
転換株では、GL-7ACAが生成されないことを確認してい
る 。これによりA. chrysogenum ATCC11550由来のプロ
テアーゼ遺伝子の発現ユニットがS.cerevisiae YNN27内
で機能し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼが生成されること
がわかった。また、F. solani M-0718由来のDAO c-DNA
がS. cerevisiaeYNN27でも発現することがわかった。

【００８５】pVEB104の形質転換株の場合は、２mg／mlG
L-7ACA、0.1Ｍ Tris-HCl緩衝液（pH8.0）からなる反応
液500μlとトルエン５μlを遠心菌体に加え、30℃で３
時間振盪して反応させた。これにより、7ACAが15μg／m
l生成した。コントロールのアシラーゼ遺伝子の入って
いないpCYG-EB2の形質転換株では7ACAが生成されない。
P. diminuta V22株由来のアシラーゼ遺伝子も、弱いな
がらもS.cerevisiae YNN27株で発現することがわかっ
た。

【００８６】実施例４ (1) プラスミドpHBV1（7ACAおよび7ADCA生産用ベクタ
ー）、プラスミドpHDV11(7ACAおよび7ADCA生産用ベクタ
ー)およびプラスミドpHBD3（GL-7ACAおよびGL-7ADCA生
産用ベクター）の各プラスミドの構築 CCおよびDCC生産菌であるアクレモニウム・クリソゲナ
ム(A. chrysogenum) BC2116株微工研条寄第2707号へのD
NA導入は、G418耐性を選択マーカーにしたのでは、選択
が困難なので、ハイグロマイシンＢ耐性を用いることに
した。CCアシラーゼ遺伝子とHm^R をもつ7ACAおよび7ADC
A生産プラスミド pHBV1（第４−１図参照）、Ｄ−アミ
ノ酸オキシダーゼ遺伝子、CCアシラーゼ(ケト-AD-7ACA
アシラーゼおよびGL-7ACAアシラーゼとしても利用でき
る)遺伝子とHm^Rをもつ7ACAおよび7ADCA生産用プラスミ
ドpHDV11（第４−２図参照）、およびＤ−アミノ酸オキ
シダーゼ遺伝子とHm^RをもつGL-7ACAおよびGL-7ADCA生産
プラスミドpHBD3（第４−３図参照）を構築した。 (i) pHBV1の構築（第４−１図参照）

【００８７】約15μgのpCYG-HB51を10ユニットのEcoRＩ
で37℃15分間（最終量 100μl）作用 させ、DNAを部分
切断した。フェノール抽出、エーテル抽出をし、ついで
エタノ ール沈殿を行なった。次に、このDNAをSmaＩで
完全切断を行ない、アガロースゲル（0.8％）で電気泳
動、電気泳動溶出法により、約3.1KbpのDNA断片を単離
した。一方、pVEB104をSacＩ、PvuIIで切断後、アガロ
ースゲル(0.8％)電気泳動、電気泳動溶出法により、約
5.7KbpのDNA断片を単離した。上記のEcoRＩ-SmaＩ断片
(約3.1Kbp)、PvuII-SacＩ DNA断片（約5.7Kbp）、さら
にベクタープラスミドpHSG298(宝酒造)のEcoRＩ-SacＩ
DNA断片（2.7Kbp）の３種類のDNA断片を混合後、T4DNA
リガーゼで連結した。この混合物をE. coli JM109へ、
D. Hanahanの形質転換法［D. Hanahan, J. Mol. Biol.
163 (1983)557-580］で形質転換し、カナマイ シン20μ
g／ml、0.5mM IPTGおよびX-gal 100μg／mlを含有するL
B寒天プレート上 で生えてくる白い形質転換株を得た。
これらの形質転換株より、ハイグロマイシン150μg／ml
含有LB寒天プレートで生育し、アンピシリン50μg／ml
含有LB寒天プ レートで生育しない株を取得した。次にK
m^RHm^RAp^Sの株よりプラスミドDNAを分離し、制限酵素で
切断することにより目的のものであるかどうかを確かめ
た。このうちの一つをpHBV1（第４−１図参照）と命名
した。

【００８８】(ii) pHDV11の構築（第４−２図参照） pDAO-EB101をClaＩで切断し、アガロースゲル（0.8％）
電気泳動、電気泳動溶出法により、約7.5KbpのDNA断片
を単離した。さらにpHBV1をClaＩ（１ケ所のみ）で切断
し、約7.5KbpのClaＩ断片と混合後、T4DNAリガーゼで連
結した。この混合物をE. coli JM109へ形質転換し、ア
ンピシリン50μg／ml含有LB寒天プレートで生えてくる
形質転換株を得た。これらの形質転換株より、ハイグロ
マイシン150μg／ml含有LB寒天プレートで生育し、カナ
マイシン30μg／ml含有LB寒天プレー トで生育しない株
を取得した。次にAp^RHm^RKm^Sの株より、プラスミドDNAを
分離し、BamHＩの切断パターンより、目的のものである
かどうかの確認と遺伝子の挿入方向の決定を行なった。
このうちの一つをpHDV11（第４−２図参照）と命名し
た。

【００８９】(iii) pHBD3の構築（第４−３図参照） 約15μgのpCYG-HB51を10ユニットのEcoRＩで37℃15分間
(最終量 100μl)作用さ せ、DNAを部分切断した。フェ
ノール抽出、エーテル抽出をし、ついでエタノー ル沈
殿を行なった。次に、このDNAをClaＩで完全切断後、ア
ガロースゲル(0.8％)電気泳動、電気泳動溶出法によ
り、約4.3KbpのDNA断片を分離した（約4.28Kbp と約4.4
4Kbpの混合物であるが、必要な約4.28KbpのDNA断片の入
ったものをHm ^RAp^Sで取得可能である）。一方、約20μg
のpDAO-EB101を50ユニットのPstＩで、37℃５分間（最
終量 : 200μl）作用させ、DNAを部 分切断した。フェ
ノール抽出、エーテル抽出を し、ついでエタノール沈
殿を行なった。次に、このDNAをClaＩで 切断後、アガ
ロースゲル(0.8％)電気泳動、電気泳動溶出法により、
約6KbpのDNA断片を分離した。このDNA断片には、

【００９０】

【化４】 の３種が含まれていて、Ap^S で形質転換株を選択すれ
ば、最後の

【００９１】

【化５】 は除くことができる。上記の約4.3Kbp DNA断片混合物、
約6Kbp DNA断片混合物、さらにベクタープラスミドpHSG
298の

【００９２】

【化６】 の３種類を混合後、T4DNAリガーゼで連結した。この混
合物をE. coliJM109へD.Hanahanの形質転換法で形質転
換し、カナマイシン20μg／ml、0.5mM IPTGおよびX-gal
100μg／mlを含有するLB寒天プレート上で生えてくる
白い形質転換株を得た。これらの形質転換株のうち800
株をハイグロマイシン150μg／ml含有LB寒天プレートと
アンピシリン50μg／ml含有LB寒天プレートで生育を確
認し、Km^RHm^RAp^Sの 形質転換株19株を得た。これらの株
より、プラスミドDNAを分離し、制限酵素で 切断するこ
とにより目的のものであるかどうかを確かめた。このう
ちの一つをpHBD3（第４−３図参照）と命名した。

【００９３】実施例５ (1) プラスミドpHBV1、pHDV11およびpHBD3のA.chrysoge
num BC2116株への導入と培養 A. chrysogenumでの7ACAおよび7ADCA生産用ベクターpHB
V1とpHDV11、ならびにGL-7ACAおよびGL-7ADCA生産用ベ
クターpHBD3を、A. chrysogenum BC2116株へ形質転換し
た。これにより得られたハイグロマイシンＢ耐性株を、
CC生産培地（ハイグロマイシンＢ無添加）で培養するこ
とにより7ACAまたはGL-7ACAを培地中に生産できること
がわかった。

【００９４】(i) A. chrysogenum BC2116株への形質転
換： (a) 細胞培養のための均一な接種物の調製：液体窒素中
でのA. chrysogenum BC2116株の保存品を37℃で解凍し
て得た、１アンプルの細胞懸濁液（20％グリセロール）
を10枚のB3寒天プレートに接種した。接種に先立ち、表
面水分が観察されなくなるまで、培地を乾燥させた。接
種した寒天プレートを30℃で６日間インキュベートし
た。各寒天プレート表面を覆っている胞子を含む菌糸体
増殖物を、寒天が入らないように、かき取り、20％グリ
セロール３mlに懸濁した。この懸濁液を５アンプルに分
注し、液体窒素細胞保管庫の中で凍結させ、保存した
（10枚のB3寒天プレートより50本できる）。

【００９５】(b) プロトプラストの調製のための細胞増
殖 250ml容量の振盪フラスコに入れたYSP培地50mlに、凍結
したアンプル１本の細胞懸濁液（A.chrysogenum BC211
6）を37℃で解凍後、全量接種し、30℃で４日間振盪培
養した。この前培養物5mlを新鮮YPS培地50mlに移し、前
述のように30℃で24時間培養した。

【００９６】(c) プロトプラストの調整 24時間培養物(200ml)の菌体を遠心分離(3,000rpm ５分
間)により集め、滅菌水（200ml）で遠心により２回洗浄
後、10mM DTT含有10mM Tris-HCl（pH7.5）になるように
懸濁(80ml)した。この懸濁液を30℃で１時間穏やかに振
盪した。次いで、菌体を遠心分離（3,000rpm ５分間）
し、1Ｍ KCl緩衝液（pH5.8）100mlで遠心により２回洗
浄後、20mlになるように1Ｍ KCl緩衝液（pH5.8）で懸濁
した。この懸濁液20mlに、Novozyme234（NovoBiolabs）
16.3mg／mlを含有する1Ｍ KCl緩衝液（pH5.8）30mlを加
え、30℃で30分間穏やかに振盪した。この操作の終了時
に、プロトプラスト懸濁液を使い捨て遠心管に入れ、２
−３秒間撹拌処理した後、1Ｍ KP緩衝液（pH7.5）50ml
を加え希釈し、遠心分離（750rpm、２分間）した。遠心
分離により沈殿したプロトプラストを1Ｍ KCl緩衝液（p
H7.5）50mlに再懸濁し、遠心(1,500rpm５分間)して収穫
することで洗浄した。この洗浄行程を２回繰り返した。
洗浄したプロトプラストを最終量約５mlになるように0.
8Ｍ NaP緩衝液で懸濁した。

【００９７】(d) 形質転換 形質転換に用いる各プラスミドDNA溶液60μl(約20μgDN
A)に、1Ｍ KP緩衝液（pH7.5）240μlを加え混合後、プ
ロトプラスト懸濁液400μl加え混合した。この混合 物
を氷中で30分間静置後、40％PEG、10.8％シュクロース
および50mM CaCl₂を含 有する10mM Tris-HCl(pH7.5)４m
lを加え混合後、室温に15分間静置した。この後、この
混合物に0.8Ｍ NaP緩衝液10mlを加え混合後、1,000rpm
で５分間遠心分離 した。この沈殿を0.8Ｍ NaP緩衝液1.
2mlに懸濁した。

【００９８】(e) 抗生物質ハイグロマイシンＢ耐性形質
転換株の選択：形質転換懸濁液0.2mlをBRM寒天培地（48
℃）５mlと混合し、BRM寒天培地プレート（25ml）上に
注いだ。20℃で20時間培養後10mg／mlハイグロマイシン
Ｂ［Calbiochem Corporation, ナカライテスク（株）輸
入販売］を最終濃度25μg／mlおよび50μg／mlになるよ
うにスプレッターで広げた（各濃度プレート３枚）。30
℃で２〜３週間培養後、出てきたコロニーをハイグロマ
イシンＢ50μg／ml含有のPDA-YE寒天プレート上に移し
た。さらに、30℃で７日間培養することによりハイグロ
マイシンＢ耐性の形質転換体を取得した。不稔性形質転
換体は、このような継代培養に際して、ハイグロマイシ
ンＢ存在下の新鮮培地では増殖することができないの
で、安定な形質転換体と不稔性形質転換体とを容易に区
別することができる。この形質転換体を再度ハイグロマ
イシンＢ40μg／ml含有のPDA-YE寒天プレート上に、全
面に広げて継代した（30℃５〜７日間）。

【００９９】通常、以上のような方法で、約20μgのDNA
より１〜３個のハイグロマイシンＢ耐性の形質転換株が
取得できた。この時(c)の項の最終的なプロトプラスト
懸濁液のBRM寒天培地プレート上での再生コロニー数
は、約２×10⁸個/ml(30℃ ２週間培養後)であった。

【０１００】(ii) ハイグロマイシンＢ耐性A. chrysoge
num BC2116株の7ACAおよびGL-7ACAの生産 (i)に示した方法により、pCYG-HB51（Hm^Rのみ）、pHBV1
(7ACAおよび7ADCA生産用ベクター)、pHDV11(7ACAおよび
7ADCA生産用ベクター)またはpHBD3（GL-7ACAおよびGL-7
ADCA生産用ベクター）の各DNAでA. chrysogenum BC2116
株を形質転換することにより、ハイグロマイシンＢ耐性
の形質転換株を取得した（表１参照）。これらの形質転
換株を250ml容量の振盪フラスコに入れたCS1培地50mlに
接種した。30℃で４日間培養後、この前培養物１mlを、
250ml容量の振盪フラスコに入れた本培養培地20mlに移
し、25℃で６日間および７日間振盪培養（振幅：３イン
チ、250rpm）した。この本培養物をろ紙(東洋ろ紙No.2)
で、ろ過し、ろ液をHPLC（高速液体クロマトグラフィ
ー）にて定量した。HPLCの条件を次に示した。

【０１０１】カラム：Cosmosil 5C₁₈ (4.6×150mm)(ナ
カライテスク製)カラムのすぐ後にInertsil ODS-2(5×1
50mm)(ガスクロ工業製)カラムをつけて、２本連結

【０１０２】上記HPLC条件により定量すると表１の結果
がえられた。この時の7ACA、GL-7ACAおよびCCNaの位置
(保持時間)は、それぞれ17.7分、24.3分および18.9分で
あった（培養ろ液を0.5Ｍクエン酸緩衝液（pH4.0）で10
倍希釈後、10μlをHPLCに打って定量した）。この結果
より、ハイグロマイシンＢ耐性のみのプラスミドpCYG-H
B51の形質転換株は、7ACAもGL-7ACAも生産しなかった
が、7ACAおよび7ADCA生産用 ベクターpHBV1の形質転換
株は、7ACAを約50μg／ml、また、GL-7ACAおよびGL-7AD
CA生産用ベクターpHBD3の形質転換株は、GL-7ACAを約13
0μg／ml生産した。さら に、Ｄ−アミノ酸オキシダー
ゼとアシラーゼの両遺伝子をもつ7ACAおよび7ADCA 生産
用ベクターpHDV11の形質転換株は、7ACAを約150μg／ml
生産したが、GL-7ACAやケト-AD-7ACAは生産しなかっ
た。ただし、GL-7ACA生産株でもケト-AD-7ACAは 生産し
なかった。これは、ケト-AD-7ACAが不安定なために分解
したものと考えられる。

【０１０３】

【表１】

【０１０４】生産された7ACAを再確認するために、別の
HPLC条件でも定量したが、同様な結果が得られた。この
時のHPLCの条件を下に示した。 カラム：Cica-Merck ハイバー高速液クロカラム(４×250mm) LiChrospher 100 RP-18(e)(5μｍ)(関東化学製) カラム温度：室温 移動相：0.94ｇ/ｌ １−ヘキサンスルホン酸ナトリウム(東京化成) 1.32ｇ/ｌ 18−クラウン−６（ナカライテスク） 21ｇ/ｌ クエン酸 2.47ｇ/ｌ クエン酸三ナトリウム（二水和物） 10％ アセトニトリル 流量：１ml/min. UV検出：254nm

【０１０５】(iii) ハイグロマイシン耐性形質転換株の
サザン雑種形成法（SouthernHybridization）による解
析 ハイグロマイシンＢ耐性形質転換株（A. chrysogenum H
m144, Hm172, Hm155,Hm146, Hm154, Hm156, Hm161, Hm1
78, Hm165, Hm164, Hm168 および Hm179）をハイグロマ
イシンＢ12.5μg／ml含有YPS培地（50ml）で30℃５〜７
日間振盪培養した。これらの培養菌体を遠心分離により
集菌後、-20℃に保存した。液体窒素で乳鉢を氷冷しな
がら菌体を破砕後、10mM EDTA含有50mM Tris-HCl（pH7.
5）緩衝液約５mlおよび20％SDS 0.35mlを加え混合し、6
5℃で20分間加温した。この後、フェノール抽出２回と
エタノール沈殿をし、沈殿物を上記10mM EDTA含有緩衝
液2.5mlに溶解後、RNase A（リボヌクレアーゼ）を４μ
g/mlになるように加え37 ℃で１時間保温した。つい
で、Protease K(プロテアーゼＫ)を100μg/mlになるよ
うに加え37℃で２時間保温後、フェノール抽出、エタノ
ール沈殿を行ない沈殿物を約300μlのTE緩衝液に溶解し
た。これらのDNA溶液をTE緩衝液に対して透析した。

【０１０６】これらのDNAを、制限酵素BamHＩおよびEco
RＩで切断し、アガロースゲル（0.8％）電気泳動した
後、電気泳動ゲルからサザン（Southern）法［Molecula
r Cloning（1982）382〜386, Cold Spring Harbor Labo
ratory］により、ニトロセルロースフィルターにDNAを
転写した。pCPV22P DNA(第３−６図参照、ベクターpHSG
298にP.diminuta V22株由来の約3Kbpのアシラーゼ遺伝
子が入っている)を制限酵素PstＩで切断後、Mixed Prim
er Labeling System(Clontech製、東洋紡輸入販売)（方
法はこのキットのマニュアルに従う）により³²Pでラベ
ルした。このラベルDNAと上記DNA結合ニトロセルロース
フィルターのサザン雑種形成［Advanced Bacterial Gen
etics (1980)174-177, Cold Spring Harbor Laborator
y］を行なった。

【０１０７】A. chrysogenum BC2116のDNAには、pCPV22
Pとの雑種形成が全く認められなかったが、ハイグロマ
イシンＢ耐性形質転換株12株のDNAには、明確な雑種形
成が認められた。しかも、アシラーゼ遺伝子をもってい
るA. chrysogenum Hm172, Hm155,Hm146, Hm154, Hm156,
Hm161, Hm178 および Hm 165株のBamHＩ切断DNAより
は、約2.5Kbpのアシラーゼ遺伝子に相当する雑種形成バ
ンドが認められた。これらのことより、ハイグロマイシ
ンＢ耐性形質転換株には目的のDNAが導入されているこ
とがわかった。また、このサザン雑種形成の結果より、
導入したDNAがプラスミド状ではなく染色体DNAに組込ま
れていることも判明した。

【０１０８】実施例６ 7ACA生産菌アクレモニウム・クリソゲナムHm178株を実
施例５と同様に培養して得られた培養物（1000ml）を80
00rpm、５分間遠心分離し、得られた上澄液を１N HCl
（約10ml）でpH5.0とし、生じた沈殿を吸引ろ過でろ過
することによりろ液600ml（7ACA含量：136μg／ml）を
得た。これを、ダイヤイオンHP−20（三菱化製社製）(6
00ml)を充てんしたカラムクロマトグラフィーに付し、
酸性水(pH3.5)、水(pH7.0)それぞれ600mlで洗浄後、30
％イソプロピルアルコール水で溶出した。7ACAを含む溶
出液1200mlを合わせ30℃で減圧濃縮し、濃縮液（60ml）
をYMC逆 相カラム（ODS A60 200／60メッシュ、山村化
学研究所製、１ｌ）に付し、水で 展開することによ
り、画分360ml〜1960mlに合わせて7ACA（39.8mg）が溶
出され た。7ACAを含む溶出液1600mlを合わせ、30℃で1
14mlまで減圧濃縮した。この濃 縮液には、CCが7ACAに
対して大過剰に含まれているで、CCを分解するために、
この濃縮液114 mlにDAO（特願平第1-266795号明細書参
照。182ユニット／ml）5.4ml、カタラーゼC-10（Sigma,
10mg／ml）２mlおよび1Mリン酸緩衝液（pH7.3)13mlを
加え、25℃で１時間振とうした。反応液を１N HClでpH
1.5とした後、等量の酢酸エチルで洗浄、水層127ml（7A
CA21.6mg）を得た。これを30℃で50mlまで減圧 濃縮し
た。

【０１０９】これを25mlずつ２回に分けあらかじめ、２
％メタノール、6.6mMリン酸緩衝液（pH7.3）で平衡化し
ておいたYMC逆相カラムを使用する高速液体クロマトグ
ラフィー（ODS packed column, R-354 S-15/30μｍ, 50
×300mm×２本、UV検出；254nm、山村化学研究所製）に
付した後、平衡化したのと同じ溶媒系で流速100ml／min
にて展開し、分取した。7ACAを含む画分を合わせ（600m
l）、１N HClでpH5.0と した。これをダイヤイオンHP−
20（60ml）を充てんしたカラムクロマトグラフィーに付
し、水1200mlで展開することにより、画分600〜1600ml
に7ACAが溶出され た。7ACAを含む画分を合わせ、30℃
で減圧下濃縮乾固することにより7ACAの白色粉末5.36mg
を得た。このものの ¹H NMRスペクトラム、IRスペクト
ラムは標品の それとよく一致した。

【０１１０】実施例７ 実施例５に記載の方法と同様にして、pCYG-HB51（Hm^Rの
み）、pHBV1(7ACAおよび7ADCA生産用ベクター)、pHDV11
(7ACAおよび7ADCA生産用ベクター)またはpHBD3（GL-7AC
AおよびGL-7ADCA生産用ベクター）の各DNAでA. chrysog
enum BC2116株を形質転換することにより、ハイグロマ
イシンＢ耐性の形質転換株を取得した（表２参照）。こ
れらの形質転換株を250ml容量の振盪フラスコに入れたC
S1培地50mlに接種した。30℃で４日間培養後、この前培
養物１mlを、250ml容量の振盪フラスコ各１０本にそれ
ぞれ入れた本培養培地20mlに移し、25℃で３、４、５、
６および７日間振盪培養（振幅：３インチ、250rpm）
後、この本培養物各２本づつをろ紙(東洋ろ紙No.2)で、
ろ過し、ろ液100μｌを900μｌの0.1Mリン酸緩衝液(pH
6.0)に加え希釈後、下記HPLC（高速液体クロマトグラフ
ィー）にて定量した。HPLCの条件を次に示す。

【０１１１】 カラム：Cosmosil 5C₁₈ (4.6×150mm)（ナカライテスク製）カラムのすぐ後に Inertsil ODS-2(5×150mm)(ガスクロ工業製)カラムをつけて、２本連結 カラム温度：40℃ 移動相：2.2 mM 水酸化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム 2.82g/ｌ(NH₄)₂HPO₄（リン酸でpH7.3に修正） 5.63% メタノ−ル 流量：１ml／min UV検出：254nm

【０１１２】上記HPLC条件により定量すると表２の結果
がえられた。この時のDCC、7ADCAおよびGL-7ADCAの位置
(保持時間)は、それぞれ5.5分、6.1分および26.9分であ
った。この結果より、ハイグロマイシンＢ耐性のみのプ
ラスミドpCYG-HB51の形質転換株は、7ADCAもGL-7ADCAも
生産しなかったが、7ACAおよび7ADCA生産用ベクターpHB
V1の形質転換株は、7ADCAを約24μg／ml、また、GL-7AC
AおよびGL-7ADCA生産用ベクターpHBD3の形質転換株は、
GL-7ACAを約375μg／ml生産した。さらに、Ｄ− アミノ
酸オキシダーゼとアシラーゼの両遺伝子をもつ7ACAおよ
び7ADCA生産用ベ クターpHDV11の形質転換株は、7ADCA
を約177μg／ml生産したことが明らかとなり、さらに、
上記HPLC分析において、７−アミノ−３−メチル−３−
セフェム−４−カルボン酸も生産していることが明らか
となった（保持時間：10分の位置に少量のピ−クが認め
られた）。

【０１１３】

【表２】

【０１１４】下記微生物を工業技術院微生物工業技術研
究所に1989年12月25日に寄託した。 Escherichia coli JM109(pCPV22P) FERM BP-2704 Escherichia coli JM109(pHBV1) FERM BP-2703 Escherichia coli JM109(pHDV11) FERM BP-2706 Escherichia coli JM109(pHBD3) FERM BP-2705 Acremonium chrysogenum BC2116 FERM BP-2707

【図面の簡単な説明】

【図１】 第１−１図は実施例１の操作の概略図を示
す。

【図２】 第１−２図はアルカリプロテアーゼのcDNAお
よび染色体DNAの制限酵素切断地図を示す。 λgt-Protease 2：λgt11のインサート部分のみ表示 λ-G-Protease 1413およびλ-G-Protease-0112：λgtWE
S・λBへのインサート部分のみ表示 pGPR3-EH1およびpGPR2-EH1：pBR322へのインサート部分
のみ表示

【図３】 第１−３図はアルカリプロテアーゼのcDNAお
よび染色体DNAの制限酵素切断地図を示す。

【図４】 第１−４（１）図はアルカリプロテアーゼの
染色体DNAの塩基配列を示す。MはGまたはCを意味する。

【図５】 第１−４（２）図はアルカリプロテアーゼの
染色体DNAの塩基配列を示す。MはGまたはCを意味する。

【図６】 第１−４（３）図はアルカリプロテアーゼの
染色体DNAの塩基配列を示す。MはGまたはCを意味する。

【図７】 第１−５（１）図はアルカリプロテアーゼの
cDNAの塩基配列を示す。

【図８】 第１−５（２）図はアルカリプロテアーゼの
cDNAの塩基配列を示す。

【図９】 第１−６（１）図はアルカリプロテアーゼの
cDNA（λgt-Protease2）のλgt11β−ガラクトシダーゼ
遺伝子との融合部分の塩基配列とコードされるアミノ酸
配列を示す。

【図１０】 第１−６（２）図はアルカリプロテアーゼ
のcDNA（λgt-Protease2）のλgt11β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子との融合部分の塩基配列とコードされるアミノ
酸配列を示す。

【図１１】 第１−７図はアルカリプロテアーゼのcDNA
（λgt-Protease2）のオープン・リーディング・フレー
ムの塩基配列およびそれがコ−ドするアミノ酸配列を示
す。

【図１２】 第１−８図はアルカリプロテアーゼの染色
体遺伝子と合成リンカー付加部位を示す。

【図１３】 第１−９図はアルカリプロテアーゼの染色
体DNAのプロモーター付近 の塩基配列（EcoRＩおよびBa
mHＩで修飾済）を示す。

【図１４】 第１−10図はアルカリプロテアーゼの染色
体DNAのターミネーター付近の塩基配列（BamHＩおよびH
indIIIで修飾済）を示す。

【図１５】 第１−11図はプラスミドpCYG-B2の構築を
示す。

【図１６】 第１−12図はイソペニシリンＮ合成酵素染
色体DNAと制限酵素切断部位の修飾を示す。

【図１７】 第１−13図はイソペニシリンＮ合成酵素染
色体DNAのプロモーター付近の塩基配列を示す。

【図１８】 第１−14図はイソペニシリンＮ合成酵素染
色体DNAのターミネーター付近の制限酵素切断地図を示
す。制限酵素BglII、PvuII、SalＩ、SacIIおよびXhoＩの
切断部位は存在しなかった。

【図１９】 第１−15図はプラスミドpCYG-EB2の構築を
示す。

【図２０】 第１−１６図はイソペニシリンＮ合成酵素
染色体DNAのタ−ミネ−タ−付近の塩基配列を示す。

【図２１】 第２−１図はプラスミドpYG-HB51の構築を
示す。

【図２２】 第２−２（１）図はハイグロマイシンＢ耐
性遺伝子の塩基配列とコードするアミノ酸配列を示す。

【図２３】 第２−２（２）図はハイグロマイシンＢ耐
性遺伝子の塩基配列とコードするアミノ酸配列を示す。

【図２４】 第３−１図は実施例３の操作の模式図を示
す。

【図２５】 第３−２図は酵素によるセファロスポリン
ＣおよびデアセチルセファロスポリンＣから7ACAおよび
7ADCAの変換ルートを示す。

【図２６】 第３−３図はプラスミドpDAO-EB101の制限
酵素切断地図を示す。

【図２７】 第３−４図はプラスミドpVEB104の制限酵
素切断地図を示す。

【図２８】 第３−５図はプラスミドpCFS315の制限酵
素切断地図を示す。

【図２９】 第３−６図はプラスミドpV22B1の構築を示
す。

【図３０】 第３−７（１）図はシュードモナス・ディ
ミニュータV22株のセファロス ポリンＣアシラーゼ遺伝
子のオ−プン・リ−ディング・フレ−ムの塩基配列およ
びコードするアミノ酸配列を示す。

【図３１】 第３−７（２）図はシュードモナス・ディ
ミニュータV22株のセファロス ポリンＣアシラーゼ遺伝
子のオ−プン・リ−ディング・フレ−ムの塩基配列およ
びコードするアミノ酸配列を示す。

【図３２】 第３−８図はプラスミドpV22BS-A11の構築
を示す。

【図３３】 第３−９図はプラスミドpV22B1のアシラー
ゼATGコドン上流の修飾を示す。

【図３４】 第３−10図はプラスミドpV22BS-A11のセフ
ァロスポリンＣアシラーゼ遺伝子付近の制限酵素切断地
図を示し、図中αおよびβはセファロスポリンＣアシラ
ーゼの推定αサブユニット、β−サブユニットをそれぞ
れ示す。

【図３５】 第３−11（１）図はプラスミドpCFS315に
含有されるDAO遺伝子のコード領域の塩基配列およびコ
ードするアミノ酸配列を示す。

【図３６】 第３−11（２）図はプラスミドpCFS315に
含有されるDAO遺伝子のコード領域の塩基配列およびコ
ードするアミノ酸配列を示す。

【図３７】 第４−１図は7ACA生産用ベクターpHBV1の
構築を示す。

【図３８】 第４−２図は7ACA生産用ベクターpHDV11の
構築を示す。

【図３９】 第４−３図はGL-7ACA生産用ベクターpHBD3
の構築を示す。

フロントページの続き (72)発明者 高乗 仁 つくば市梅園２−17−６

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アクレモニウム・クリソゲナムのアルカ
   リプロテアーゼ遺伝子のプロモーター活性部分を有する
   DNA断片。
2. 【請求項２】 第３−７図に示すアミノ酸配列１〜773
   で示されるセファロスポリンＣアシラーゼ。
3. 【請求項３】 第３−７図に示すアミノ酸配列１〜773
   で示されるセファロス ポリンＣアシラーゼをコードす
   る遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項３の遺伝子を含有するベクター。
5. 【請求項５】 第１−７図に示すアミノ酸配列１〜285
   で示されるアルカリプ ロテアーゼをコードする遺伝
   子。
6. 【請求項６】 請求項５の遺伝子を含有するベクター。