HU212722B - Method for producing monoclonal antibodies, and diagnostical process and test kit for phytophthora infection - Google Patents

Description

A találmány a növénykórtani diagnosztika területével kapcsolatos.

Közelebbről meghatározva a találmány eljárás a különböző növénybetegségek kiváltó tényezőjeként ismert Phytophthora-fafiák immunológiai kimutatására alkalmas monoklonális antitestek előállítására.

Gombák általában igen gyakran idéznek elő növényi betegségeket.

Leírásuk céljából a gombákat általában 3 nagy rendszertani osztályba sorolják, amelyek a következők: Ascomycetes, Basidiomycetes, és Phycomycetes.

Ascomycetes

E csoport tagjait az aszkusz, egy specializált szaporodási struktúra jelenléte jellemzi, amelyben úgy a meiózis (számfelező sejtosztódás), mint az ivaros spóraképzés végbemegy.

Az Ascomycetes osztály által okozott, általánosan ismert növényi betegségek közé tartozik például a gabona, gyümölcs és más kultúrnövények valódi lisztharmata; szilpusztulás („Dutch elm diseade’j; gabona anyarozs; csonthéjas gyümölcsök moníliás rothadása; rózsa levélfoltossága, valamint almavarasodás.

Basidiomycetes

E csoport tagjaira az ivaros spórák képződéséért felelős struktúra, az ún. bazidium jellemző.

Kórokozó formáik közé tartozik az üszöggomba, rozsdagomba, és húsos fajták, mint például a kalaposgombák.

Példaként megemlíthető a búzarozsda, az erdeifenyő hólyagos betegsége, az almarozsda, valamint az üszöggomba, amely a kukorica, zab, köles, hagymák és búza betegségét okozza.

Phycomycetes

A Phycomycetes osztályba olyan formák tartoznak, amelyek primitívebbnek tekintendők az Ascomycetes vagy a Basidiomycetes tagjainál.

Alapvető alaktani különbség, hogy a Phycomycetes micéliumában nincsenek harántfalak.

Ezen osztály tagjai által okozott jellemző növénybetegség a bornál és egyes haszonnövényeknél fellépő nem-valódi lisztharmat, valamint a burgonyánál és paradicsomnál kialakuló gyökér- és barnakorhadás.

Találmányunk szempontjából elsősorban a P/íVíOMncefer-nemzetséghez tartozó Phytophthora („növénypusztító) tagjai a legfontosabbak.

E nemzetség 1876-ban Anton de Bary-tól kapta a nevét, aki a 19. század közepén Írországból éhínséghez vezető betegség kórokozóját (Phytophthora infestans) kívánta leírni. Mostanáig már 43 további Phytophthora-fajtát tartanak számon, amelyek valamennyien növényi kórokozók. Közülük néhányat további változatokra, sajátos formákra és/vagy fajokra osztottak fel.

Sok kitűnő monográfia és könyv jelent meg, melyek útbaigazítást adnak e nemzetség keretében összefoglalt fajták taxonómiájára, biológiája, ökológiája és patológiája tekintetében [lásd például Waterhouse G.

M., Mycological Papers 122, (1970); Erwin D. C.,

Bartnicki-Garcia S. és Isao Ph. H. (szerk.) Phytophthora: Its Biology, Taxonomy, Ecology and Pathology (1983) Am. Phytopathological Soc., St. Paul, MN):

A Phytophthora-nemzetség a Pvf/itűccűe-családhoz tartozik, melynek másik tagja a PyrAÍMm-nemzetség.

Bár a Pyf/iítrm-nemzetség a leírt fajták számát tekintve a nagyobb nemzetségei képezi, mégis a Phytophthora-nemzelséghez nagyobb százalékban tartoznak betegséget okozó, gazdasági szempontból nagy jelentőségű fajták. A legjelentősebb fajták közül néhányat az 1. táblázat foglal össze:

/. táblázat

A Phytophthora-fajlák kóroktani szerepe különféle növénybetegségek kialakulásában megállapítást nyert.

Fajták	Betegség
P. cactorum	Gyökér- és egyéb korhadás almánál
P. capsici	Gyökérkorhadás borsnál
P. cinnamoni	Jarrah-féle gyökérrothadás, avokádórothadás, valamint különféle fajellegű dísznövényfajták betegségei
P. citrophora	Citrusgyümölcsök gyökérrothadása
P. colocasiae	Taro-féle levél- és gyökértörzs-rothadása
P. fragariae	Földieper rothadása
P. infestans	Burgonya rothadása, paradicsom bamakorhadása
P. megasperma	Gyökér- és egyéb rothadás almánál, cseresznyénél, és más gyümölcsfajtáknál
R megasperma f. sp. glycinea	Gyökérrothadás
P. megasperma f. sp. medicaginus	Gyökérrothadás
P. palmivora	Kakaó bamakorhadása
P. parasitica	Citrusgyümölcsök gyökérkorhadása
P. parasitica nicotianae	Dohány gyökérkorhadása
P. phaseoli	Bab gyökérkorhadása
P. syringae	Almarothadás

A Phytophthora spp. által okozott betegségek diagnosztizálását gyakran megnehezíti a könnyen felismerhető és/vagy egyértelmű tünetek hiánya. Ezenfelül gyakran nem lehet a kórokozót a fertőzött szövetből izolálni és táptalajokon tenyészteni.

Ez különösen jelentős Phytophthora-megbetegedéseknél, amelyek a növény gyökerét támadják meg. Itt elsősorban a nem kórokozó, vagy csak enyhén kórokozó Pythium spp. zavar, amely a gyökérben vagy a gyökéren található. Lehetetlenné teszi a Phytophthora spp. izolálását, mivel az utóbbiak táptalajokon általában sokkal lassabban növekednek a Pví/iiuw-fajtáknál.

HU 212 722 Β

Ezért a talajpróbáknál vagy növénygyökereknél „csalétek-technikát dolgoztak ki a Phytophthora spp. izolálására, amelyek azonban általában időigényesek és szennyeződésre hajlamosak.

Szójababnál a P. megasperma f. sp. glycinea által okozott gyökér- és szárrothadás esetében a kórokozó csak „csalogatással” izolálható a gyökerekből. Ebből következik, hogy amikor a száron nyilvánvaló tünetek nem jelentkeznek, a gyökérbetegségek gyakran nem ismerhetők fel, vagy téves diagnózis alapját képezik.

Olyan monoklonális antitest, amely egyszerű immunoassay alkalmazása útján képes a Phytophthora spp.-t más organizmusoktól, de különösen a Pythium spp.-tői megkülönböztetni, lehetővé tenné a termést csökkentő „rejtett Phytophthora fajták” felismerését a növényekben.

E feladatot most a találmány keretében meglepő módon oldottuk meg egy egyszerűen kivitelezhető immunoassay kidolgozása útján, amely az Önmagában ismert hibridóma/monoklonális antitest technológia alkalmazásával a fertőzött növényi szövetek PAytop/if/iora-megbetegedésének gyors kórismézésére használható.

Hibrid szomatikus sejtvonalak antitestforrásként való alkalmazása meghatározott antigénekkel szemben Köhler és Milstein munkáira vezethető vissza [Natúré 256, 495-497(1975)].

E hibrid sejtvonalak mindegyike olyan homogén immunoglobulint szintetizál, amely a nagyszámú lehetséges antitest közül - melyeket egy állat valamely antigénre válaszként in vivő szintetizálhat - csak egyetlenegyet reprezentál.

Mivel minden immunoglobulin-termelő kiónt csak egyetlen típusú antitest jellemez, meghonosodott a monoklonális antitest elnevezés.

A monoklonális antitesteknek számos előnyük van; nagy számban nyerhetők, előállításuk az antigén-reaktivitás tekintetében homogén és az idő múlásával sem változik. A hibridóma/monoklonális antitest-technológia azon a megfigyelésen alapul, hogy két szomatikus (testi) sejt egybeolvadásakor a képződő hibridsejtek mindkét szülőtípus jellegzetes ismérveivel rendelkeznek.

A monoklonális antitestképzés esetében a specifikus antitest szintézisére való képesség egy előzetesen immunizált donor-állatból nyert immunkompetens sejttől (általában lépsejt) származik, míg a tenyészetben való folyamatos sejtosztódást a másik fúziós partner, egy daganatsejtvonal (gyakran mieloma) biztosítja.

Kezdetben a fúziókat komplikálta, hogy a mielomasejtvonalak is szintetizálnak antitestet, úgyhogy a hibrid két típusú monoklonális antitestet képezett, egy mielomasejt-eredetűt, és egy másikat, amelyet az immunkompetens sejt genetikai információja határozott meg.

Ezért a későbbiekben olyan daganatsejteket használtak, amelyek maguk nem képesek monoklonális antitestek előállítására, például az SP2/O-Agl4 vagy X63-Ag8.653, ami nagy mértékben leegyszerűsítette a képződött fúziós termékek elemzését.

A találmány egy további technikai aspektusa a két típusú szülősejt eredményes fúziós történéseinek (hibrid sejtek) kiválogatására irányuló járható módszer kidolgozásából áll. Rutinszerűen mindkét szülőtípusból 1 millió vagy több sejt használatos a fúziós protokollban. Mivel a fúzió nem következik be 100% gyakorisággal, nehéz vállalkozásnak tűnik az a próbálkozás, hogy a fúziós termékeket elválasszák a nem fuzionált, vagy az egymással fuzionált szülősejtek nagy mennyiségétől.

Mint már említettük, a hibridómasejtek antitestet képező rövid életű (lép)sejtek, valamint hosszú életű mielomasejtek fúziója útján jönnek létre.

A kívánt eredmény egy antitestet képező hosszú életű sejtvonal. Mivel a lépsejtek tenyészetben rövid életűek, elvileg egyszerűen ki lehet várni, hogy az összes nem fuzionált, valamint az összes egymással fuzionált lépsejt kihaljon. Ekkor azonban még mindig megoldásra vár az a feladat, hogy az antitestet termelő hosszú életű sejteket az antitestet nem képező hosszú életű sejtektől elválasszuk.

Hibridsejtek szelektálására használatos rendszer az úgynevezett HAT-szelekciós rendszer.

E rendszer velejárója a hipoxantin-guanin-foszforiboziltranszferáz enzim (HGPRT) alkalmazása. Ez az enzim emlős sejtekben részét képezi a purinok „salvage” anyagcsereútjának.

E sejtek ezért a purinok de novo szintézisére is képesek.

Normál körülmények között bizonyos mértékig mindkét szintézisül („salvage” és de novo) egymással párhuzamosan megy végbe.

Ha azonban egy sejt nem tartalmaz HGPRT-t, a „salvage” út gátolt és a purinoknak nem-purin anyagból kell szintetizálódjanak.

A 8-azaguanin vegyület úgynevezett antimetabolit, amely a guaninhoz szerkezetileg nagyon hasonlít és így azt néhány normál reakciójában helyettesíteni tudja.

Az azaguanin beépül a DNS-be. ami a normális növekedési mód korlátozásához és végül sejthalálhoz vezet. Mivel az azaguaninnak a „salvage” út folyamán pótlódnia kell, a HGPRT-aktivitással nem rendelkező sejtek azaguanint nem képesek felhasználni és így annak jelenlétében növekedni.

Ugyanezen enzimmel, de ellenkező előjellel működő szelektív rendszert - minthogy ebben az esetben HGPRT-pozitív sejtek szelektálódnak - ír le Littlefield [Science 145, 709 (1964)]. HAT-rendszerként jelöli meg és hipoxantint, aminopterint és timidint tartalmaz (HAT-médium). Az aminopterin antimetabolit, amely gátolja a de novo purinszintézist, valamint a dezoxiuridilát timidiláttá történő metileződését.

A hipoxantin kisegítő purinként működhet olyan esetben, amikor az aminopterin blokkolja a de novo purinszintézist, ugyanakkor a timidin fölöslegessé teszi, hogy a dezoxiuridilát metileződjék.

Ezért aminopterin jelenlétében a HGPRT-pozitív sejtek szaporodnak, míg a HGPRT-negatív sejtek elpusztulnak.

A találmány keretében a szelektáláshoz használt hibrid rendszerben a mielomasejtek előnyösen rezisztensek azaguaninnal és érzékenyek aminopterinnel szemben, azaz HGPRT-negatívak. Ezzel szemben az antitestképző sejtek HGPRT-pozitívak.

HU 212 722 Β

A sejtek fúziója és azaguanin nélkül HAT-médiumban való tenyésztése által az egymással eredményesen fuzionált sejtek szelektálhatok, mivel a szaporodásért felelős mielomasejtek csak HGPRT-aktivitás jelenlétében tudnak növekedni és ezt az aktivitást a HGPRT-pozitív sejtvonalnak kell szolgáltatnia.

Az antitestképző HGPRT-pozitív sejtvonalak ebben a médiumban nem pusztulnak el. Túlélnek bizonyos ideig, azonban nem szaporodnak.

Ezáltal a sejtek HAT-médiumban történő fúziója útján olyan rendszerhez jutunk, amelyben a mielomasejtek és az antitestképző sejtek egy ideig ugyan növekedni tudnak, ami elegendő a hibrid sejtek létrejöttéhez, de amelyben csak a hibrid sejtek képesek túlélésre és szaporodásra.

Szelekció után minden hibridóma-klónt megvizsgálunk abból a szempontból, hogy képesek-e a specifikus antitest létrehozására.

A hidridóma/monoklonális antitest-technológia rendkívül eredményes. Erre utal az a tény, hogy az amerikai egyesült államokbeli szabadalmi hivatal osztályozási rendszerén belül egy saját alosztályt vezettek be monoklonális antitestek számára [935/100].

A monoklonális antitest-technológia területén folyó munkák illusztrálása céljából megemlíthetők a következő amerikai egyesült államokbeli szabadalmak: a 4 196 265 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, amely monoklonális antitestek vírusok elleni létrehozására irányul; a 4 404 279 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, amely eljárást közöl hibridóma tenyésztésére, valamint a hibridizálási gyakoriság fokozására; a 4 427 653 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, amely eljárást ad meg monoklonális antitestek előállítására, melynek során az antigén-preparátumot immunizálás előtt meghatározott monoklonális antitestek abszorbeálják.

A következőkben a teljesség igénye nélkül antigéneket sorolunk fel, amelyek ellen már előállítottak antitesteket:

Treponema pallidum (EPO 83 302 898.8), hepatitiszt antigén (EPO 83 103 858.3), anti-H.Y (EPO 83 301 214.9), lencsehámsejtek (83 301 176.0), karcinoembrionális antigén (PTC-WO 81 101 469), urokináz (EPO 83 100 190.4), herpesz (EPO 83 400 074.7), patkány hepatociták (82 306 409.2), Schisostoma mansoni (PCT-WO 83/01 837), Leishmania (PCT-WO 83/01 785), transzferrin receptor glikoprotein (EPO

305 658.5), reumatoid faktor (PCT WO 83/01 118), humán vesekarcióma sejtfelszíni antigénje (EPO

107 355.8), alfainterferon (PCT WO 81/02 899), Tsejl antigén (EPO 81 300 047.8), humán szuppresszor T-sejtek (EP-0 80 304 348.8).

Növénybetegségekkel kapcsolatban Hsu H. R. és munkatársai [ASM News 50/3, 91-101 (1984)] összesen 18 növényi vírust soroltak fel, melyek ellen monoklonális antitestet hoztak létre; e vírusok közé tartozik a „Carnation Etched Ring Vírus”, „Potato Leaf Roll Vírus, „Southern Beán Mosaik Vírus”, dohány-mozaik vírus. „Tomato Ring Spot Vírus”, valamint „Tulip Breaking Vírus.

Gombák ellen monoklonális antitestet eddig elsősorban humán betegségek diagnosztikai segédeszközeként hoztak létre.

így például a GB 2 138 444A és a GB 2 138 445A számú egyesült királyságbeli szabadalmi leírások Candida és Aspergillus fajtákkal reagáló monoklonális antitestekre vonatkoznak.

Találmányunk tárgya tehát egyrészt eljárás olyan monoklonális antitest előállítására, amely specifikusan a Phytophthora gombanemzetség tagjaival reagál.

A találmány szerinti eljárással előállított antitest előnyösen Phytophthora-fertőzések széleskörű kimutatására használható.

Poliklonális antiszérumokat már különböző Phytophthora-fajok ellen előállítottak, egyrészt taxonómiai kérdésfelvetések megválaszolására [Hallsall D. M., J. Gén. Microbiol. 94, 149-158 (1976)], másrészt a gazdaszervezet - parazita kölcsönhatások [Moesta P, Griesbach H. és Zeigler E., Eu. J. Cell Bioi. 31, 167169 (1983)], valamint a patogén ökológia [McDonald J. D„ Duniway J. M., Phytopathology 69, 436-441 (1979)] számos aspektusának a vizsgálata céljából.

Monoklonális antitesteket állítottak elő továbbá Ayers és munkatársai [in: Ametzen C., Ryan C. (szerk.), Molecular Strategies fór Crop Potection - VCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, New Sértés 48, (1986) New York: Alán Liss, Inc., 447. oldal; továbbá Goodell és munkatársai (1985)] [in: Key J. L„ Kosuge T. (szerk.); Cellular and Molecular Biology of Plánt Sterss, VCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology. New Series 22, New York: Alán Liss, Inc., 447. oldal] P. megasperma f.sp. glycinea micélium extracelluláris glikoproteinjei vagy tisztított sejtfalai ellen, összefüggésben egy eredménytelen kísérlettel, amely a szójababnövények rezisztenciaválaszának indukciójával kapcsolatos fajspecifikus komponensek definiálására irányult.

Hardham és munkatársai [Exp. Mycol. 9, 265-268 (1985)] monoklonális antitesteket hoztak létre P. cinnamoni glutáraldehid/paraformaldehid fixált zoospórái ellen. Eszerint már egy sor eltérő specificitású, különböző monoklonális antitestei állítottak elő, de egyiküket sem használták növényi betegségek kimutatásával kapcsolatban.

Bár más monoklonális antitestek is léteznek, ez ideig nem volt diagnosztikai próba a megbetegedett növények P/iyíop/ií/ioza-fertőzéseinek a kimutatására. Ez legalább részben annak a ténynek tulajdonítható, hogy nem minden monoklonális antitest alkalmas a leghasználatosabb assay-típusban, azaz a kettős antitest-assay-ben való felhasználásra.

Különböző okai vannak, amiért egy monoklonális antitest erre a speciális célra nem használható.

A szóban forgó antigén pontos kimutatásához például a második antitestnek az antigén egy másik epitópjához (antigéndetermináns) kell kötődnie, mint az első antitestnek, vagy pedig az antitest egy multiplex epitóppal kell kötődjön.

Az antitest továbbá képes kell legyen olyan antigének kimutatására, amelyek Phytophthora-fertőzött növényi szövethez társulnak.

HU 212 722 B

Ebben az összefüggésben nem szokatlan, hogy az előállított antitestek olyan determinánsok ellen irányulnak, amelyek bár a tenyésztett organizmusokban fellelhetők, de nincsenek jelen a fertőzött szövetekben, vagy ott legalább is nem diagnosztizálhatok.

Végül lehetséges, hogy bizonyos antitestek hosszú időtartam körülményei között (például 24 óra) a laboratóriumban képesek Phytophthora kimutatására, de ezt a feladatot immunoassay keretében - ami mintegy 20 percen belül pontos pozitív vagy negatív eredményt ad - nem látják el. Ilyen szemszögből nézve a fentebb leírt monoklonális antitestek - amelyeknek diagnosztikai teszt-készletben való alkalmasságát megvizsgálták - egyike sem rendelkezik azokkal a jellemző tulajdonságokkal, amelyek szükségesek egy gyors és gazdaságos kettős antitest-immunoassay-ben való felhasználáshoz.

A fent említett minden probléma és nehézség egyszerű módon kiküszöbölhető találmányunk keretében, azaz egy találmány szerinti hibridóma által termelt monoklonális antitestet alkalmazva a Phytophthorafertőzések immunológiai kimutatására.

Közelebbről meghatározva a találmány egy monoklonális antitestet termelő hibridóma előállítására vonatkozik; a monoklonális antitest a Phytophthora-nemzetség legalább egy törzsével reagál, de lényegében nem lép reakcióba a Pví/ifum-nemzetség törzseivel.

Az antitest a Phytophthorá-l a megbetegedett szövetben is ki tudja mutatni kettős antitest-assay rendszert alkalmazva.

A találmány magában foglalja a fenti hibridóma mutánsait és variánsait is, amelyek még olyan monoklonális antitestet képeznek, amely a Phytophthoranemzetség legalább egy törzsével reagál, de lényegében nem lép reakcióba a PyZ/tÍMw-nemzetség törzseivel; e mutánsok és variánsok önmagában ismert eljárással nagyon egyszerűen előállíthatók a szóban forgó kiindulóanyagokból.

A „reagálás” illetve „reakció fogalma alatt ebben a konkrét összefüggésben, valamint az egész leírás folyamán és az igénypontokban az antitest azon képessége (vagy e képesség hiánya) értendő, hogy egy meghatározott antigénnel biner komplexet tud képezni, a szóban forgó esetben a Phytophthora-ncmz&ség antigénjeivel.

A találmány magában foglalja magát az ilyen módon létrehozott antitesttel a Phytophthora-ferlőzés kimutatására szolgáló eljárást és készletet („kit), reagensként a találmány szerinti monoklonális antitestet használva.

A találmány felöleli a fenti monoklonális antitest előállításának eljárásait is.

A találmány további tárgya a Phytophthora-anúgén kimutatására szolgáló eljárás Phytophthora-antigént tartalmazó próbában, amely az alábbiakkal jellemezhető:

(a) A próbát egy első monoklonális vagy poliklonális anti-Phytophthora antitesttel hozzuk össze;

(b) az így keletkezett biner komplexet egy második monoklonális vagy poliklonális anti-Phytophthora antitesttel reagáltatjuk, amely amennyiben (c) pont szerinti harmadik antitest nincs jelen, egy analitikailag kimutatható reagenssel kapcsolódik;

(c) kívánt esetben egy harmadik anti-immunoglobulin antitestet adunk hozzá, mely egy analitikusan kimutatható reagenssel kapcsolódik; és (d) az így keletkezett tercier vagy kvaterner komplex jelenlétét a második vagy kívánt esetben harmadik antitesthez kötődő reagens kimutatásával határozzuk meg;

és az eljárásban első vagy második antitest közül legalább egyikének egy, a találmány szerint előállított monoklonális antitestet alkalmazunk.

Az analitikai úton kimutatható reagens előnyösen egy második antitesttel van konjugálva; azonban adott esetben egy harmadik, anti-immunoglobulin-antitesttel is konjugálható.

Végül a találmány tárgyát egy teszt-készlet is képezi, növények Phytophthora-fertőzéseinek immunológiai diagnosztizálásához, amely a következő alkotórészeket tartalmazza:

(a) egy szilárd hordozót, amely egy első monoklonális vagy poliklonális anti-Phytopthora antitestet tartalmaz megkötve;

(b) egy második monoklonális vagy poliklonális antiPhytophthora antitestet, amely amennyiben nincs jelen (c) pont szerinti antitest, egy analitikailag kimutatható reagenssel kapcsolódik;

(c) kívánt esetben egy harmadik, anti-immunoglobulin antitestet, amely egy analitikailag kimutatható reagenssel kapcsolódik;

(d) a második, illetve kívánt esetben a harmadik antitesttel kapcsolódó reagens kimutatására szolgáló rendszert;

ahol az (a) és (b) pont szerinti antitestek közül legalább az egyik egy, a találmány szerinti eljárással előállított antitest.

A találmány tárgya eljárás Phyrophrhora f. sp. glycinea elleni monoklonális antitestek előállítására, eljárás hibridóma-sejtvonalak előállítására, amelyek képesek a fenti antitestek létrehozására, valamint tesztkészletek, amelyekben a monoklonális antitestek növényi szövetekben a Phytophthora-ferlőzések kimutatására használhatók.

A fentiekből kitűnik, hogy bár a Phytophthora elleni monoklonális antitestek már ismertek voltak, eddig mégsem létezett eljárás, amely lehetővé tette volna az ilyen antitestek diagnosztikai teszt-készletben való felhasználását a Phytophthora in situ, azaz a beteg növényi szövetben való kimutatására.

A nehézség oka részben az a tény, hogy nem minden rendelkezésre álló antitest képes specifikusan különbséget tenni a Phytophthora és a Pythium között. Ezért sok olyan antitest van, amely ha rendelkezik is a szükséges specificilással, mégsem alkalmas teszt-készletben való alkalmazásra.

A találmány keretében előnyben részesített teszt eljárásnál egy kettős antitest rendszert közvetlenül alkalmazunk a feltételezetten beteg növényi szöveten.

Az előnyösen szilárd hordozóval együtt jelenlevő Phytophthora-specifikus antitestet felvisszük a növé5

HU 212 722 Β nyi szövetre; utána hozzáadunk egy második, jelzett antitestet, hogy ki tudjuk mutatni a Phytophthora antigén-antitest komplex létrejöttét. Meglepő módon az derült ki. hogy a tesztelt és már leírt Phytophthora antitestek egyike sem alkalmas a Phytophthora ilyen jellegű próbában való pontos kimutatásra.

Ezzel szemben a találmány szerinti antitest már ismert antitestekkel szemben alkalmas arra, hogy kettős antitest rendszert használva kimutassa a Phytophtora-t a megbetegedett szövetekben.

A találmány szerinti monoklonális antitestek az immunoglobulinok viszonylag ritka alosztályához, az IgG2b alosztályhoz tartoznak. Az említett alosztályhoz tartozó antitestek aránylag egyszerűen izolálhatok és tisztíthatók, minthogy oldatokból kis ionerősségnél kiválnak.

Alkalmas antitest alatt a találmány keretében olyan antitest értendő, amely a Phytophthora-nemzetségen belül széles reaktivitást spektrummal rendelkezik és a Phytophthora-nemzetség legalább egy törzsével, de előnyösen legalább 15 törzsével képes reagálni anélkül, hogy jelentősebb mértékben reakcióba lépne a Pyr/riuni-nemzetség törzseivel (lásd a 3. táblázatot).

Az összes említett kívánalomnak eleget tevő, előnyös monoklonális antitestet termeli egy hibridóma, amelyet HB 9353 (PH 4830) kódszámon deponáltunk az „American Type Culture Collection”-ben (ATCC) (Rockville. Maryland). A PH 4830 olyan előnyös antitest, amely diagnosztikai készletben lehetőséget ad egy meglévő Phytophthora-ferlőzés in situ kimutatására.

A találmány magában foglalja a fentebb leírt antitest alkalmazását olyan rendszerben, amely a megbetegedett szövetek Phytophthora-fertőzéseinek kimutatására használható. Eszerint egy kórokozót feltehetően tartalmazó növényszöveti próbát érintkezésbe hozunk egy első antitesttel, amely specifikusan a kimutatandó organizmus antigéndeterminánsával reagál. A fenti antitest előnyösen szilárd hordozóhoz van kötve, például mikrotiterlemez falain immobilizált antitestről van szó.

Az antitest monoklonális antitest lehet, de egy Phytophthorá-val reagáló poliklonális szérum alkotórészét is képezheti.

Az át nem alakult anyagot mosás útján eltávolítva a megmaradt biner komplexet (antigén-antitest komplex) a kimutatandó antigénnel reagáló monoklonális vagy poliklonális antigénnel hozzuk érintkezésbe.

Az immobilizált biner komplexet a második monoklonális antitesttel érintkezésbe hozva egy tercier komplex jön létre (antitest-antigén-antitest). A tercier komplex kialakításában résztvevő antitestek közül legalább az egyik egy találmány szerinti antitest. A szekunder komplexhez nem kötött szekunder antitestek mosással való eltávolítása után a képződött tercier komplex egy sor analitikai technikával mutatható ki. A második antitest például közvetlenül valamely analitikai úton meghatározható reagenssel jelölhető meg, úgyhogy azután a képződött tercier komplex egy a reagens által képezett szignál útján mutatható ki.

Alternatív módon olyan immunoassay-rendszer is alkalmazható, amelyben a tercier komplexet jelzett antiimmunoglobulinnal reagáltatjuk, és a reakciótermék specifikusan kimutatható szignálja alapján ismerhető fel.

Jelző anyagként (marker) előnyösen enzimet alkalmazunk. Azonban biotin, valamely radioizotóp, fluorofor vagy más tetszőleges, erre a célra alkalmas és szokásosan használt reagens is használható.

A kimutatás megkönnyítése céljából a különböző reakciók előnyösen készlet (kit) formájában állnak rendelkezésre.

A kit jellemzően kompartimentált hordozót tartalmaz, ahol szoros térbeli kapcsolatban van elrendezve

1. egy szilárd hordozó, amelyhez olyan első monoklonális vagy poliklonális antitest kötődik, amely Phytophthora antigénnel biner komplexet tud kialakítani; és

2. a biner komplexet kimutató rendszer, amely egy második monoklonális vagy poliklonális antitestből, valamint adott esetben egy harmadik antitestből áll, és az első vagy a második egy találmány szerinti monoklonális antitest.

Amint a fentiekből kitűnik, vagy az első, vagy a második antitestről lehet szó.

A második antitest maga lehet jelölve, vagy pedig a biner kimutatható rendszer tartalmaz egy harmadik jelzett anti-immunoglobulin antitestet, amely egy első antitestből, az antigénből és egy második antitestből álló tercier komplex kimutatására használható.

Ha enzimatikus immunoassay-t alkalmazunk, úgy az enzim számára szubsztrátról is gondoskodunk.

A találmány szerinti antitestek diagnosztikai tesztkitben való specifikus alkalmazhatóságát igazolja például a kettős antitest-immunoassay-teszt, amelyet a következőkben példaként fogunk bemutatni.

A következő kiviteli példák az eddigi általános leírás közelebbi megvilágítására, valamint a találmány jobb megértésének elősegítésére szolgálnak, anélkül, hogy a találmány tárgyát bármilyen módon korlátoznánk.

Nem korlátozó kiviteli példák

1. példa

Eljárás gomba-fehérjék kivonására

Gombákat 50 ml PDB-ben [Potato Dextrose Hohlmédium Hohl H. R., Phytopathol. Z. 84, 18-33 (1975)] 250 ml-es palackokban [általában 2 liter Phytophthoramegasperma f. sp. glycinea, Kaun és Erwin (Pmg) használatos] tenyésztünk.

hét múlva a gombatenyészeteket elválasztjuk a médiumtól és PBS-ben (foszfát-pufferes sóoldat; pH 7,4) mossuk.

Ezután a gombatenyészeteket DYNO-malom (KDL típusú szövetaprító, W. A. Bachhofen AG Maschinenfabrik, Bázel, Svájc) 300 ml-es kamrájába visszük át, amely 0,5 mm átmérőjű ólommentes üveggolyókat (IMPANDEX, Maywood, New Jersey, USA) tartalmaz.

A próbakamra hűtőköpenyét hideg csapvízzel 8 ’Cra előre lehűtjük. A kivonatot 5 percig 3000 fordulat/perc sebességgel ülepítjük és a próbakamra tartal6

HU 212 722 Β mát 500 ml-es polisztirol-csövekbe átvive percenkénti 17 000 fordulattal centrifugáljuk (34,540 g) Sorvall RC-5B hűthető centrifugában, SS-34 rotort használva.

A felülúszót végül szétosztjuk és további felhasználásig -20 ’C-on mélyhűtjük.

A próbák összfehérje-tartalma 0,5-2 mg/ml tartományba esik.

2. példa

Monoklonális antitesteket termelő hibridómák előállítása

A használt eljárás Köhler és Milstein (1975) és Hammerling (1977) eljárásának módosítása.

A kísérleti állatok 4—5 hetes BALB/cJ egerek, amelyek a Bar Harbor-i (ME 04 609) Jackson laboratóriumból származnak.

Az első injekció 0,2 ml Pmg gombamicéliumot tartalmaz (Phytophthora megasperma f. sp. glycinea, PBSpufferrel extrahálva és 0,2 ml komplett Freund-adjuvánsban emulgeálva). Az injekciót ip. úton adjuk be.

A 11 hónap múlva adott második injekció szintén 0,2 ml Pmg gonbamicéliumot tartalmaz (Phytophthora megasperma f. sp. glycinea PBS-pufferrel extrahálva és 0.2 ml nem-komplett Freund-adjuvánsban emulgeálva) és ugyancsak ip. úton alkalmazzuk.

A kezelt állatok farkából 50 μΐ egérszérumot nyerünk, amelyet pozitív Pmg aktivitásra vonatkozóan megvizsgálunk.

2. / példa

Immunkompetens lépsejtek izolálása

Az utolsó injekció után 7 nap múlva az állatot nyakszirteltörés útján megöljük.

A lépet eltávolítjuk és 20 ml „Dulbecco’s Modified Eagles' Medium”-ba (DMEM) (Tissue Culture Standards Comittee, In Vitro 6/2, 63 (1970); Dulbecco R., Freeman G., Virology 8, 396 (1959)] helyezzük.

A lépet 80 mesh (0,177 m) lyukbőségű steril szitára helyezzük, felaprózzuk, DMEM-mel leöblítjük, és egy 10 ml-es egyszer használatos fecskendő steril dugatytyújával enyhén nyomkodjuk.

A lépsejtextrakció folyamán a szitát állandóan DMEM-mel öblítjük.

Az összes öblítővizet 50 ml-es egyszer használatos centrifugacsőbe pipettázzuk és percenkénti 1200 fordulattal centrifugáljuk (szobahőmérsékleten).

A felülúszót elöntjük és a sejt-pelletet 10 ml vörösvérsejt-1 izáló oldattal (0,83% NH₄C1; 0,01 M KHCO₃, 0,1 mM EDTA) 90 másodpercig szobahőmérsékleten mossuk.

A lízist 40 ml DMEM-mel való hígítás útján leállítjuk.

A próbát 3 percig állni hagyjuk, majd a felülúszót 50 ml-es centrifugacsövekbe pipettázzuk.

Centrifugálás után a pelletet 50 ml DMEM-mel mossuk és újra centrifugáljuk.

A lépsejtek kis mintáját sejtszámolás és életképesség megállapítás céljából félretesszük. A lépsejtek teljes száma 7xl0⁷ sejt/5 ml.

Mielomasejteket (SP2-Agl4, beszerezve az Americal Type Culture Collection-ból) tenyészetből 50 ml-es egyszer használatos polipropiléncsövekbe (Falcon) viszünk át (7xl0⁶ sejt). A fúzióra szánt mielomasejteket centrifugáljuk (1200 fordulat/perc, 10 perc, szobahőmérséklet).

Centrifugálás után a felülúszót tiszta főzőpohárba öntjük; a sejteket DMEM-mel mossuk és ismét centrifugáljuk.

A mosott mieloma-pelletet tartalmazó csőhöz hozzáadjuk a lépsejteket.

A mieloma- és lépsejteket azután egy 10 ml-es pipetta és egy automatapipetta segítségével reszuszpendáljuk és 10 percig 1200 fordulat/perc sebességgel szobahőmérsékleten centrifugáljuk. A felülúszót elöntjük.

2.2 példa

Sejtfúzió

A PEG 1500 fúziós médiumot (Β. M. Bioproducts; katalógusszám 783-641) 37 ’C-ra előmelegítjük. A fúziós médium 1 ml-ét cseppenként hozzáadjuk a reszuszpendált mieloma- és lépsejteket tartalmazó csőhöz.

A fúziós reakció utolsó 7 percében a PEG-et fokozatosan felhígítjuk DMEM-mel.

A hígítás végén a cső tartalmának teljes térfogata mintegy 30 ml.

A fúzió egész időtartama alatt a csövet enyhén mozgatjuk, hogy tartalma kellően keveredjék.

A csöveket azután centrifugáljuk (1200 fordulat/perc, 10 perc, szobahőmérséklet) és a felülúszót eltávolítjuk.

Előmelegített HAT-médiumot (33 ml) adunk a csőhöz és a sejteket 10 ml-es pipettával felszuszpendáljuk.

A sejteket összesen 7 darab 96 lyukú mikrotiterlemezen („Gibco-ware cell culture cluster dish”) osztjuk szét. A mikrotiterlemez minden mélyedésébe 150 μΐ fuzionált mieloma/lépanyagot mérünk be. A külső mélyedéseket ezután megtöltjük HAT-médiummal. Amikrotiterlemezeket vízköpennyel körülvett CO₂ (7%) inkubátorban 37 ’C-on inkubáljuk. A sejtekhez azután 4 naponként friss HAT-médiumot adunk, melynek összetétele:

HAT-médium	Összetétel
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles’
Médium)	766 ml
L-glutamát Penicillin/Streptomycin	10 ml
(10 000 E/l 00 ml HAT)	10 ml
Aminopterin (2x1 O~5 M oldat) Hipoxantin/timidin:	4 ml
In NaOH timidin	38,8 mg
hipoxantin 100 ml steril vízben	136,1 mg
Hyclone fötális borjúszérum kát. Ψ A-l 11-L	200 ml
A hibridóma-plakkok 7-10 megjelenni.	nap múlva kezdenek
3. példa Hibrídóma-screenelés
A gomba-kórokozók ellen antitesteket képező hibridómákat Phytophthora megasperma f. sp. glycinea elő-
készített gombaanyagának	(fehérjekoncentráció

HU 212 722 Β gg/ml PBS puffer) segítségével ELISA-tesztben (lásd Roitt és munkatársai, Immunology, Mosby C. V., 1985) azonosítjuk.

Az ELISA-tesztre pozitív reakciót adó mélyedéseket korlátozott mértékben felhígítjuk úgy, hogy hibridómasejtek tiszta törzseit tudjuk tenyészteni.

A korlátozott hígításé eljárás periodikusan hígított hibridómaszuszpenziók tenyésztéséből áll.

Minden hígítási fokozat egy 96 lyukú tenyésztőlemez 6-12 mélyedésében történik. Ezek a gombafehérjékkel szembeni specifikus antitest aktivitását ismételten meghatározzuk.

A pozitív mélyedések tartalmát azután tömeges tenyésztés céljából 20 ml-es tenyésztő palackokba viszszük át.

3.1 példa

ELlSA-glutáraldehid teszt gl glutáraldehid puffért töltünk a tenyésztőlemez minden mélyedésébe (Costar, enzim-immunoassay lemezek. Bio Rád, Richmond, Calif., USA) és 3 óráig 55 °C-on inkubáljuk.

A lemezeket lehűtjük szobahőmérsékletre és a felülúszó puffért elöntjük. A lemezeket desztillált vízzel 4-szer mossuk. PBS-sel (pH 7,2) hígított 200 μΐ antigént (antigénkoncentráció 10 μΙ/ml) adunk az egyes mélyedésekhez és 24 óráig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A felülúszó oldatot elöntjük és a lemezt

8-szor PBS-sel mossuk. Ezután 200 μΙ (mono)etanolamin-oldatot adunk minden mélyedéshez és további 24 óráig 4 °C-on inkubáljuk.

A felülúszó oldatot elöntjük és a lemezt 8-szor PBS-sel mossuk. A felülúszó 100 μΙ-ét (antitesttartalmú exszudátum, amelyet a hibridómasejtek adnak le a közegbe) adjuk hozzá minden mélyedéshez és 2 óráig 33 °C-on magas levegő-páratartalomnál inkubáljuk.

A felülúszó oldatot elöntjük és a lemezt 8-szor PBS-sel mossuk.

Ezután minden mélyedéshez kecskéből nyert 100 μΐ biotinizált KPL anti-egér IGg-t vagy IgM-et (Kirkegaard and Perry Laboratories Inc., Maryland, USA) [hígítás 1:2500 1 % borjúszérum-albuminban (BSA); PBS hígító] adunk. Ezeket 37 °C-on magas levegő-nedvességtartalomnál 0,5 óráig inkubáljuk majd az oldatot leöntjük és a lemezt 8-szor PBS-sel mossuk.

Peroxidáz enzimhez konjugált 100 μΐ KPL Streptavidint (peroxidáz-konjugát; Kirkegaard and Perry Laboratories Inc., Maryland, USA) adunk minden mélyedéshez és 37 °C-on magas levegő-nedvességtartalomnál 0,5 óráig inkubáljuk.

A felülúszó oldatot elöntjük és a lemezt 8-szor PBS-sel mossuk. A lemez minden mélyedéséhez 200 μ! OPD szubsztrátot (o-fenilén-diamin vagy 1,2fenilén-diamin vagy, peroxidáz szubsztrát) adunk és ezeket szobahőmérsékleten 0,5 óráig inkubáljuk.

Végül a vörös tartományban 405 nm-nél meghatározzuk az elnyelőképességet.

3.11 példa

Szükséges oldatok

1. Glutáraldehid puffer: 0,1% glutáraldehid 0,1 M karbonátpufferben. A karbonátpuffer (pH 9,0) összetétele: 1,59 g Na₂CO₃ és 2,93 g NaHCO₃ 1 liter desztillált vízben.

2. PBS: 8,0 g NaCl, 0,2 g KH₂PO₄, 1,15 g vízmentes Na₂HPO₄, 0,2 g KCI 1 liter desztillált vízben (pH 7,4).

3. (Mono)etanol-amin-oldat: 1 mg/ml oldat (1 g/liter desztillált víz).

4. Konjugát (KPL): hígítás 1:2500; 1% BSA-PBS hígító.

5. Nátrium-citrát puffer: 7,1 g Na₂HPO₄ (kétbázisú oldat) 500 ml desztillált vízben; 9,6 g citromsav 500 ml desztillált vízben. A kétbázisú oldathoz annyi citromsavoldatot adunk, hogy pH-ja 4,5 legyen.

6. OPD szubsztrát: 8,0 mg OPD és 20,0 mg hugysav peroxid 20 ml nátrium-citrát pufferben (pH 4,5).

3. 12 példa

A túlélő PH 4830 sejtvonal (ATCC HB9353) screenelési adatai

A különböző antigének sorát tartalmazó és glutáraldehiddel preparált lemezeken a következő próbát hajtjuk végre. A screeneléshez használt konjugát (KPL) kecskéből származó anti-egér-IgG-biotin-Streptavidinperoxidázból áll. A 0,2-nél kisebb abszorpció-értékeket negatív reakció jeleként tekintjük.

2. táblázat

Rövidítés	Phytophthora-íaj	Abszorpció
Ph5	Phytophthora	0,73
Phe2	P. cilrophlhora	0,44
Phe 11	P. citricola	0,59
Phe ml	P cambivora	0,43
Phcnl	P. cinnamoni	0,20
Phe pl	P. capsici	0,71
Phcr-3	P. cryptogea	0,55
Phd-1	P. dreschsleri	0,41
Phe-1	P. erythroseptica	0,51
Phn-1	P. nicotianae	0,37
Php-3	P. parasitica	0,47
Pmeg-19	P. megasperma	0,59
Pmgr4-1	P. megasperma f. sp. glycinea	0,41
Pmgr2-1	P. megasperma f. sp. glycinea	0,60
Pmm-2	P. megasperma í. sp. medicaginis	0,79
Ppn-14	P. parasitica var. nicotianae	0,38
Pmeg-2	P. megasperma	0,34
Ppn-14	P. parasitica nicotianae	0,41

HU 212 722 Β

Rövidítés	Phytophthora-faj	Abszorpció
Pmeg-2	P. megasperma	0,46

Rövidítés	Pythium-faj	Abszorpció
Pa-1	Pythium-aphani- dermatum	0,05
Pa4	P. aphanidermatum	0,01
Pál	P. aphanidermatum	0,01
Pa6	P. aphanidermatum	0,10
Pál 5	P. aphanidermatum	0,04
Pál	P. aphanidermatum	0,07
Pgl	P. gramicola	0,05
Pcl	P. coloratum	0,06
Pml	P. mamillatum	0,04
Pi4	P. irregulare	0,02
Pvl	P. vexans	0,16
Pdl	P. dissotochum	0,02
Pval	P. vanterpoolii	0,01
Pt2	P. lorülosum	0,10
Pt5	P. lorulosum	0,01
Pul	P. ultimun	0,06
Pmyl	P. myriotylum	0,00
Psvl	P. sylvaticum	0,06
Pil	P. irregulare	0,02
Pusl	P. ultimum var. spórán giiforum	0,03
Prl	P. rostratum	0,02
Psl	P. saliingosperum	0,05

Rövidítés	Más gombafajok	Abszorpció
Rs-16a	Rhizoctonia solani	0.02
Sh-1	Sclerotinia homoeocarpa	0,01
Rc-1	Rhizoclonia cerealis	0,01

PBS foszfát-pufferes sóoldat

3.13 példa

Ajfinitási próba

A következő eljárásokat hajtjuk végre a képződött monoklonális antitestek affinitásának meghatározása céljából.

A tesztelni kívánt antitestet olyan mértékben hígítjuk fel, hogy antitest-titrálásnál az O. D. érték (optikai denzitás) mintegy 1,5 legyen.

A hígító oldat összetétele a következő:

Antitest hígítópuffer: pH 7,2.

Alkotórész Koncentráció

Na₂HPO₄ 2,19 g/1

NaH₂PO₄ 0,56 g/1

NaCl 8,76 g/1

Thimerosal 0,1 g/1

BSA („Bovine Serum Albumin”) 1,0 g/1 ml használatra kész, hígított standard oldatot mérünk szét adagoló automatapipettával a mélyedésekbe. A mélyedések tartalmát rázás közben, szobahőmérsékleten 10 percig inkubáljuk. Végül a mélyedéseket 5-ször mossuk a következő összetételű mosóoldattal:

Alkotórész Koncentráció

Trisz 2,43 g/1

NaCl 8,76 g/1

Thimerosal 0,1 g/1 tween 80 5,0 g/1

HCl (In) kb. 14,3 ml/1 (HCl-t pH 7,8 eléréséig adunk az oldathoz)

A használt konjugátum egy 1:500 Dakopatts” (Dakopatts A/S; Dánia) anti-egér-tormaperoxidáz konjugátum; ennek 100 μΐ-ét mérjük be mindegyik mélyedésbe és rázás közben 10 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A mélyedéseket ismét mossuk, majd minden mélyedéshez 10 μΐ szubsztrátot adunk.

A szubsztrátot egy 2,2'-azino-bisz/3-etil-benztiazolinszulfonsav (diammóniumsó) (ABTS) törzsoldat tartalmazza 15 mg/ml koncentrációban; a szubsztrátoldatot 1:25 arányban hígítjuk a következő összetételű citrát-peroxidáz pufferrel:

Citrát-peroxidáz puffer: pH 4,0.

Összetétel Koncentráció

Citromsav H₂O 2,3 g/85 ml

Ph beállítás 4,0-re In NAOH-oldattal.

Feltöltés vízzel 100 ml térfogatra a H₂O₂ hozzáadása előtt H₂O₂ (30%) 50 ml/100 ml A szubsztrát hozzáadása után a lemezeket ismét 10 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten, rázás közben. Leállító oldatot (50 ml 10% NaF) adunk ezután minden mélyedéshez és 10 másodpercig rázzuk.

Végül 405 és 415 nM között meghatározzuk az abszorpcióképességet.

Dózis/hatás görbét készítünk szemilogaritmusos diagram segítségével, és extrapolálással meghatározzuk azt az antigénkoncentrációi, amely 50%-kal csökkenti a maximális színképződést. Ezt az értéket az affinitás relatív mértékének tekintjük.

Az eljárást a találmány szerint előállított antitesttel hajtjuk végre. A találmány szerinti antitestek számított affinitására példaként megemlítjük a 4830 számú antitestet, melynek affinitása körülbelül 4,3 μΰ/ιτιΐ antigén, az antigén nélküli maximális O. D. érték 50%-ánál.

3.2 példa

Szubklónozó eljárások

Az ELISA-tesztben pozitív választ adó mélyedéseket korlátozott mértékben felhígítjuk úgy, hogy a hibridómasejtek tiszta törzseit tenyésszük.

A korlátozott hígító eljárás magában foglalja a periodikusan hígított hibridóma-szuszpenziók tenyésztését.

HU 212 722 Β

Minden hígítási sort 96 lyukat tartalmazó tenyésztőlemez 6-12 mélyedésébe mérünk szét. E mélyedések gombafehérjékkel szembeni specifikus antitest-aktivitását ismét meghatározzuk. A pozitív mélyedések tartalmát azután tömeges tenyésztés céljából 20 ml-es tenyésztőedényekbe visszük át.

Monoklonális antitestek előállítására intraperitonálisan bejuttatott hibridóma-sejtekkel immunizált BALB/cJ egereket használunk fel. Az így kezelt egerek aszcitesz folyadékát 10-14 nap közötti intervallum után összegyűjtjük és a monoklonális antitestek további feldolgozására előkészítjük. Az antitesteket tartalmazó aszcitesz folyadék előállítási módjának közelebbi részleteire vonatkozik az 5.1 példa.

3.3 példa

Kettős antite st-immunoassay-teszt

A 3.2 példa szerinti egerek aszcitesz folyadékának antigénnel érzékennyé tett mikrotitráló lemezzel („mikroweir modullal) szembeni aktivitását vizsgáljuk antitest-screenelő eljárás segítségével.

10^-4 nagyságrendű hígítások a mérési tartományon kívül eső abszorpció-értékeket adnak (>2,0), ezzel szemben

10“⁵ hígításokkal 0,5 O, D. értékeket kapunk 415 nM-nél.

Az antitesteket az aszcitesz folyadékból protein A affinitáskromatográfia segítségével a következőképpen tisztítjuk:

Kromatográfia paraméterek:

1. Gél - Pharmacia CL4B Protein A (6,0 ml)

2. Trisz/HCI egyensúlyi/kötési puffer, pH 8,6

3. Acetát eluens puffer. pH 4,3

4. Glicin/HCl regeneráló puffer, pH 2,3

5. Szivattyúsebesség 12 (kb. 1 ml/min)

6. Terhelés 2,5 ml nem tisztított aszcitesz folyadékkal

7. Papír haladási sebessége 5 mm/min

8. Teljes kitérés 0,2 O. D.

Az aszcitesz folyadékot protein A oszlopra visszük fel és az IGg-frakciót pH 4,3-nál eluáljuk.

A tisztított antitest aktivitását egyszerű antitestscrennelő eljárással határozzuk meg:

A tisztított monoklonális antitestet tormaperoxidázzal konjugáljuk az enzim szénhidrátcsoportjait perjodáttal oxidálva; a képződött aktív aldehidcsoportok az antitest aminocsoportjaival kapcsolódnak össze.

Az antitest-enzim konjugátumot antigénnel szenzitizált mikrotitráló lemezeken teszteljük.

2,1 pg IgG/ml és 0,21 IgG/ml koncentrációjú konjugátumokkal túlságosan nagy abszorpció-értékeket kapunk (2,0+). Ezzel szemben 0,021 pg IgG/ml koncentrációjú komjugátumokat használva az abszorpcióérték 0,369.

Az enzimmel konjugált antitestet kettős „szendvics” ELISA antitest assay-ben alkalmazzuk a mikrotitráló lemezeken, amelyeket előzőleg affinitáskromatográfiával tisztított poliklonális birka-antitestekkel szenzitizáltunk.

Az assay-nek e módját előnyösen ismeretlen minták antigénkoncentrációjának meghatározásához használjuk. Ezen assay-hez két antitest szükséges, melyek az antigének nem-átfedő epitópjainál kapcsolódnak. Vagy két, az antigént egy specifikusan teljesen meghatározott helyen felismerő monoklonális antitest használható fel, vagy pedig poliklonális antitesteket használhatunk, amelyeket előnyösen affinitás-kromatográfiával megtisztítottunk.

Az egyik antitestet megtisztítjuk és szilárd fázison, például mikrotitráló lemezen megkötjük. Ezután az antigént egy tesztoldathoz adjuk. A szabad fehérjét mosással távolítjuk el és adjuk hozzá a megjelölt második antitestet. Egyszer vagy többször megismételt mosási művelet után meghatározzuk a megjelölt antitestek mennyiségét, melyek a szilárd mátrixban vannak megkötve. A felhasználásra a következő eljárás-lépések következnek:

(1) Először egy poliklonális antitestet juhok immunizálásával nyerünk; az immunizáláshoz ugyanazt az antigénkészítményt használjuk, amelyet a monoklonális antitestek előállításához is alkalmazhatunk.

A kezdő dózis 4 ml adjuvánsban emulgeált 4 ml antigénből áll. Ezt a középső háti rész egyik oldala mentén, valamint a lágyékokba fecskendezzük be.

napos nyugalmi periódus után 2 ml antigénből és 2 ml adjuvánsból álló második dózist fecskendezünk be az első injekció beadási helyével ellentétes háti részbe.

A kezdő adagolás után 7-10 nap múlva vért veszünk és az egész ciklust (injekció és vérvétel) megismételjük.

A tisztítatlan poliklonális szérum általában keresztreakciót ad Pythium-ma], screenelhető azonban a célorganizmusoktól eltérő más szervezetekkel szemben és antigén-affinitás-kromatográfiával tisztítható.

(2) Az (1) eljárási lépésből származó, jelöletlen poliklonális antitestet a mikrotitráló lemez valamennyi mélyedésének fenekén megkötjük mélyedésenként 500 ML antitest-oldat hozzáadásával (20 pg/ml PBS-ben). A maximális kötés kéréséhez az antitestek mélyedésenként! legalább 1 pg koncentrációja szükséges.

(3) Szobahőmérsékleten 2 órás inkubációs idő letelte után nedves atmoszférában lemossuk a lemezt a PBS-sel.

(4) A lemezen szabadon maradt helyeket azután blokkoló pufferrel való inkubációval telítjük. Ezért a mélyedéseket 3%-os BSA/PBS oldattal töltjük fel, mely 0,02% nátriumoxidot is tartalmaz. Ezen üledéket két órán át szobahőmérsékleten nedves atmoszférában inkubáljuk.

(5) Ezután a lemezeket PBS-sel kétszer lemossuk.

(6) Ezt követően 50 pl antigén oldatot teszünk minden egyes mélyedésbe. Az esetleg szükséges hígítást 3%-os BSA/PBS oldatban nedves atmoszférában 0,02%-os nátriumoxiddal végezzük el.

(7) A lemezeket ezután ismét (4x) lemossuk, mielőtt a megjelölt monoklonális antitesteket a felülúszóhoz hozzáadnánk. Az esetleg szükséges hígítást 3%-os BSA/BPS oldatban nedves atmoszférában 0,02%-os nátriumoxiddal végezzük el.

(8) Egy két órás vagy annál hosszabb, nedves atmoszférában mért inkubációs idő letelte után a lemezeket újra lemossuk PBS-sel.

(9) Ezt követően megtörténhet a megkötött, megjelölt antitest mennyiségi meghatározása.

HU 212 722 Β

a) A voltaképpeni analízis előtt először 0,1 mg 3',3',5',5'-tetrametil-benzidint (TBM) oldunk fel 0,1 ml dimetil-szulfoxidban. Azután ehhez az oldathoz

9,9 ml 0,1 mólos nátriumacetát-oldatot (pH 6) adunk. Ezen oldat szűrése után 0,01 %-os koncentráció eléréséig hidrogénperoxidot adunk hozzá.

b) Ezután minden mélyedésbe 50 μΐ szubsztrátoldatot teszünk és a teljes üledéket 10-30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. Pozitív próbák világoskék színben jelennek meg.

c) Ezután 50 μΐ 1 mólos kénsavoldatot teszünk minden mélyedésbe. Pozitív próbák most élénk sárgák.

d) Végül az adszorbeáló képességet 450 nm-nél állapítjuk meg.

A találmány szerinti antitestek vizsgálatán kívül a leírt eljárás egy sor, az irodalomban már korábban leírt monoklonális antitest tesztelésére használható (például Ayers, lásd fent). E teszteket Phytophthorá-\a\ megfertőzött és egészséges szójababokon, valamint a kórokozó lefőzött és le nem főzött tiszta tenyészetein hajtjuk végre.

A legfeljebb 20-30 perces rövid időtartam alatt vizsgált ismert antitestek egyike sem adott pozitív reakciót a beteg szövettel és ezért alkalmatlannak bizonyultak diagnosztikai teszt-kitben való felhasználásra.

Azokat a hibridóma-sejtvonalakat választjuk ki, amelyek a fenti teszttel pozitív reakciót adnak. Ilyen a 4830jelű.

A 4830 jelzésű antitesttel végzett próbák eredményeit a 3. táblázat tartalmazza.

Táblázat

Phytophthora-okozta gyökér- és szárkorhadás jeleit mutató, valamint egészséges, szabadban növő szójababnövények mintáit extraháljuk és kettős antitest-immunoassay-ben teszteljük antitest 4830-peroxidáz konjugátumot használva. Az eredmények összefoglalását tartalmazza a következő összeállítás:

Tüneteket mutató szárak	Adszorpció
= 127	0,33
= 132	0,21
= 146	2,00
Tüneteket mutató gyökerek	Adszorpció
= 127	0,19
= 132	0,75
= 146	2,00
Tüneteket nem mutató szárak	Adszorpció
= 161	0,002
= 149	0,000
= 158	0,000
Tüneteket nem mutató gyökerek	Adszorpció
= 161	0,008
= 149	0,000
= 158	0,000

4. példa

A PH 4830 számú klón jellemzése

A PH 4830 klón az IgG2b alosztály antitestjeit választja ki Phytophthora megasperma f. sp. glycinea ellen.

4.1 példa

Deponálás

A következő hibridóma-sejtvonal biológiailag tiszta kultúrájának letétele 1987. március 12-én történt az „American Type Culture Collection”-be (12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland). Az adott nyilvántartási számot az életképességi próba eredményes elvégzése után véglegesítették, és a szükséges illeték lerovása megtörtént.

A szabadalmi oltalom megadása során a deponált tenyészetek csak azon személyek számára hozzáférhetők, akik a PTO elnökének döntése szerint a 37 C. F. R. § 1.14 és 35 U. S. C. § 122 alapján arra illetékesek.

A fenti tenyészetek hozzáférhetőségére vonatkozó minden korlátozást végérvényesen visszavonják e bejelentésen alapuló szabadalom megadásakor és a tenyészet ezután tartósan rendelkezésre áll, éspedig egy próba kiadása iránti legutolsó kérelemtől számítva 5 éves időtartamig, minden esetben azonban a deponálás dátumától számított 30 éves időtartamig.

Ha a minta elvesztette életképességét, vagy tévedés folytán tönkrement, úgy azonos taxonómiai leírású életképes kultúrával helyettesíthető.

Hibridóma ATCC szám

Balbe egér/SP2 mieloma * PH4830 HB9353

5. példa

Monoklonális antitestek előállítása

5.Í példa

Monoklonális antitestek in vivő előállítása

6-8 hetes, B ALB/cJ nőstény egereket 0,5 ml intraperitonális Pristan injekcióval előkészítünk az ezt követő, hibridómasejl injekcióra. Két héttel később az állatoknak 0,5x10⁶ hibridómasejtet tartalmazó injekciót adunk, mely sejtek 0,5 ml DMEM közegben (Dulbecco Modified Eagles Médium) vannak szuszpendálva. Kielégítő mennyiségű aszcitesz-folyadék termeléséhez az állatoknak általában 10-14 napra van szükségük. Ezt követően az állatokat elkábítjuk és megpungáljuk. Az állatok rendszerint kétszer pungálhatók és minthogy egy punkcióval ilyen módon kb. 3 ml aszcitesz-folyadék nyerhető, összességében állatonként 5-6 ml aszcitesz-folyadékot kapunk.

Az így nyert aszcitesz-folyadékból a celluláris alkotórészeket centrifugálással eltávolítjuk és a többi részt további feldolgozásig -70 ”C-ra mélyfagyasztjuk.

A feldolgozás előnyösen a következőkben részletesen leírt protein A affinitás-kromatográfiával történik.

Az átlagos antitest kitermelés kb. 3 mg/antitest/aszcitesz-folyadék ml.

5.2 példa

Monoklonális antitestek in Vitro előállítása

A hibridómasejtek in vitro előállításához a következő összetétellel rendelkező közeget használjuk:

HU 212 722 Β

/. oldat
Fetális borjúszérum	10,0 ml
L-glutamin	1,0 ml
Penicillin/Streptomycin	1,0 ml
H/T közeg	1,0 ml
A H/T közeg összetétele:
Timidin	38,8 mg
Hipoxantin	136,1 mg
Pirogénmentes víz (1 n NaOH-val
pH 8,0-re beállítva)	100,0 ml
A H/T közeget 0,2 mm-es Nalgene szűrőn átbocsát-

va sterilizáljuk.

A fent leírt összetételű I. oldatot kereskedelmi forgalomból beszerezhető DMEM közeggel 100 ml-re feltöltjük és 0,2 mm-es szűrőn (Nalgene) sterilizáljuk.

A „Nalgene” szűrőt az FaNALGENE-nél (Európa, Inc, Bedrijvencentrum Zaventum, Leuvensesteenweg 613, 1930 Zaventum Zuid 7, Belgium) lehet beszerezni.

Ebből a közegből 125 ml-t 750 ml-es Falcon szövettenyésztő edénybe töltünk. Ehhez 10xl0⁸ hibridómasejtet adunk, és oldalára fektetve inkubáljuk, hogy a hibridóma sejtek növekedéséhez lehetőleg nagy felület álljon rendelkezésre. Az inkubálást inkubátorban, 6% CO₂-vel, 37 °C hőmérsékleten végezzük. Engedjük a sejteket növekedni a közeg elszegényedéséig, ami általában 10-14 nap után következik be. Ezután a közeget és sejteket összegyűjtjük, 10 percig 12 000 fordulatszámmal centrifugáljuk. A felülúszót összegyűjtjük és az antitestek feldolgozásáig -70 °C hőmérsékleten tartjuk.

A feldolgozás előnyösen a már leírt protein A affinitás-kromatográfia segítségével történik (lásd 3.3 példa). Az átlagos antitest kitermelés kb. 16 pg antitest/feldolgozott anyag ml.

6. példa

Teszt-készlet és eljárás Phytophthora-fertőzés kimutatására

6.1 Teszt-készlet

A növényi szövetekben Phytophthora-fertőzés kimutatására szolgáló teszt-készlet a következő komponensekből áll.

a) Egy ún. detektor, amely műanyagból áll, így például polivinilklorid vagy polisztirol lehet, és három, egymástól jól elhatárolt mezőt tartalmaz, melyek egy abszorpcióra képes anyagra (szűrőpapír) vannak felvive és különböző tulajdonságokkal rendelkeznek.

Az első mező (teszt-terület) poliklonális antitesttel van rétegezve, melyet juhok immunizálásával nyertünk, míg ugyanazokat az antigénkészítményeket alkalmazzuk. mint amelyeket már a monoklonális antitest előállítására vonatkozó 2. előállítási példában leírtunk.

A második mező (negatív kontroll) semmiféle réteggel nincs ellátva.

A harmadik mező (pozitív kontroll) 4830 monoklonális antitest/peroxidáz konjugátummal van rétegezve.

b) Műanyag zacskók a növényi kísérleti anyagok összegyűjtésére.

c) Teszt-karikák, amelyekre a növényi kísérleti anyagot rádörzsöljük.

d) Különböző teszt-oldatok, melyek külön-külön üvegekben vannak.

1. üveg: extrakciós oldat mely PBS-pufferből áll, pH 7.4.

2. üveg: kimutatásra szolgáló oldat, 4830 monoklonális antitest/peroxidáz konjugátum.

3. üveg: öblítőoldat, mely PBS-pufferoIdatból áll.

4. üveg: OPD-szubsztrátot tartalmazó színezőoldat, mely 8,0 mg OPD-t (orto-fenildiamin) és 20 mg karbamidperoxid 20 ml nátrium-citrát-pufferben (pH 4,5) készített oldatát tartalmazza.

5. üveg: stop-oldat, enzim-inhibitor tartalommal.

e) Leírás, mely a vizsgálat lefolytatásához szükséges részletes instrukciókat tartalmazza.

f) Nedvesség és UV védő csomagolás, mely a környezeti okokból eredő károsodástól, így esőtől és intenzív napsugártól megvédi a készletet.

ad a) A poliklonális antitest előállításához 4 ml antigént (Phytophthora-Mycel, előállítás a 2. példa szerint) 4 ml Freund-féle komplett reagensben emulgeálunk. Ezt az emulziót azután juhok középső hát-részébe és oldalába injekciózzuk. 3 napos nyugalmi periódus után egy második, 2 ml-es antigén-dózist 2 ml Freundféle inkomplelt adjuvánsban emulgeálunk. Az injekciót ebben az esetben az első injekcióval ellentétes hátrészoldalba adjuk. 7-10 nappal a kezdeti adagolás után vért veszünk és a teljes ciklust (injekció és vérvétel) megismételjük. A poliklonális szérumot affinitás-kromatográfiával tisztítjuk.

ad c) A Phythothora-fertőzésre vizsgált növényi anyagot először aprítjuk és eldörzsöljük. Ehhez az összegyűjtött növényi anyagot 1-2 cm nagyságú darabokra felvagdossuk és a teszt-karikákra fektetjük. Ott azután egy melléfektetett csiszolópapírral eldörzsöljük.

ad d) A második tesztoldatként használt 4830 antitest/peroxidáz-konjugátot perjodát alkalmazásával, konjugálási reakcióban állítjuk elő. Az enzim szénhidrátcsoportjának perjodát-oxidációjával aktivált aldehid csoportok alakulnak ki, melyek az antitest aminocsopotjaihoz kötődnek.

6.2 példa

A vizsgálat elvégzéséhez szolgáló utasítás

1. lépés

Először is a Phytophthora-fertőzésre vizsgálandó kísérleti anyagot össze kell gyűjteni. Előnyösen a növény különböző részeiből veszünk mintákat, így például levélből és gyökérből, továbbá a törzs (szár) elágazásaiból, ahol a Phytophthora-fertőzés gyakran előfordul.

2. lépés

A vett mintákat 1-2 cm nagyságú darabokká aprítjuk, és felvisszük őket a teszt készletben lévő próbakarikákra, ahol finomra eldörzsöljük ezeket a darabkákat a melléjük helyezett csiszolópapímal.

3. lépés

Az eldörzsölt növényi anyagot tartalmazó próbakarikákat az 1. üvegben lévő extrakciós oldathoz adjuk.

HU 212 722 Β

4. lépés

Az 1. üvegben lévő extrakciós oldat 6 cseppjét oly módon juttatjuk a detektorra, hogy mindhárom kontrollmezőt egyenletesen használjuk.

A következő lépés előtt meg kell bizonyosodni arról, hogy az összes folyadék abszorbeálódott.

5. lépés

A 2. sz. tesztoldat 3 cseppjét ugyanolyan módon alkalmazzuk, mint ahogyan a 4. lépésben az 1. sz. oldatra azt leírtuk.

6. lépés

A detektor tesztmezőjét a további oldatokkal (3., 4. és 5. sz. oldat, mindegyikből 3-3 csepp) egymás után kezeljük, a leírt módon.

7. lépés

A detektort közvetlenül a 6. lépés befejezte után leolvassuk.

Pozitív tesztnél a tulajdonképpeni tesztmezőnek el kell színeződnie. az elszíneződés mértéke a jelenlévő patogének előfordulási gyakoriságától függ.

A negatív kontroll tesztmezeje színtelen marad, míg a pozitív kontroll mindig intenzív elszíneződést mutat.

Claims (18)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás hibridóma sejtvonal előállítására, mely olyan monoklonális antitestet termel, mely legalább egy Phytophthora törzzsel reagál, ugyanakkor Pythium törzsekkel reakciót nem mutat és megbetegedett szövetben két antitestet tartalmazó immunoassay-ben Phytophthora kimutatására képes, azzal jellemezve, hogy (a) egy megfelelő donor-állatot Phytophthora antigénnel immunizálunk;

   (b) az (a) szerint immunizált donor-állatból immunkompetens sejteket izolálunk és ezeket folyamatos sejtosztódásra képes daganatsejtvonallal fuzionáljuk;

   (c) a képződött fúziós termékeket a nem fuzionált alkotórészektől izoláljuk;

   (d) az így nyert fúziós termékekből immun screen segítségével különböző Phytophthora és Pythium antigének alkalmazásával olyan hibridómákat tartalmazó próbákat választunk ki, melyek legalább egy Phytophthora törzzsel reagálnak, ugyanakkor a Pythium törzsekkel reakciót nem mutatnak;

   (e) a pozitívan reagáló próbákból kiindulva tiszta hibridóma sejtklónt állítunk elő; és ff) a tiszta hibridóma sejtklónokból előállított monoklonális antitesteket kettős antitestet-immunoassay tesztnek vetjük alá és kiválasztjuk a pozitívan reagáló antitestet termelő kiónokat.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy daganatsejtvonalként monoklonális antitesteket nem termelő mielomasejtvonalakat alkalmazunk.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy SP2-O-Ag 14 jelzésű mielomasejtvonalat alkalmazunk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hibridóma sejtvonalként az ATCC HB9353 meghatározó jellemzőivel rendelkező, Balbe egér/SP2 mieloma #PH483O hibridóma sejtvonalat állítjuk elő.
5. 5. Eljárás monoklonális antitest előállítására, mely legalább egy Phytophthora törzzsel reagál, ugyanakkor Pythium törzsekkel reakciót nem mutat és megbetegedett szövetben két antitestet tartalmazó immunoassayban Phytophthora kimutatására képes, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerint előállított hibridómát.

   (a) in vitro egy tenyészközegben tenyésztünk és a termelődött monoklonális antitesteket a felülúszóból izoláljuk; vagy (b) in vivő tenyésztjük, amikor is az 1. igénypont szerinti hibridómát először egy megfelelő gazdába intraperitoneálisan beinjekciózzuk, és a hibridóma sejtek által termelt monoklonális antitesteket közvetlenül a gazda aszcitesz folyadékból izoláljuk.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hibridómaként az ATCC HB9353 meghatározott jellemzőivel rendelkező Balbe egér/SP2 mieloma #PH4830 hibridómát alkalmazzuk.
7. 7. Eljárás Phytophthora jelenlétének kimutatására, Phytophthora antigént tartalmazó próbában, azzal jellemezve, hogy (a) a próbát egy első monoklonális vagy poliklonális anti-Phytophthora antitesttel hozzuk össze;

   (b) az így keletkezett biner komplexet egy második monoklonális vagy poliklonális anti-Phytophthora antitesttel reagáltatjuk, amely amennyiben (c) pont szerinti harmadik antitest nincs jelen, egy analitikailag kimutatható reagenssel kapcsolódik;

   (c) kívánt esetben egy harmadik anti-immunoglobulin antitestet adunk hozzá, mely egy analitikusan kimutatható reagenssel kapcsolódik; és (d) az így keletkezett tercier vagy kvaterner komplex jelenlétét a második vagy kívánt esetben harmadik antitesthez kötődő reagens kimutatásával határozzuk meg;

   és az eljárásban az első vagy a második antitest legalább egyikeként egy, az 5. igénypont szerint előállított monoklonális antitestet alkalmazunk.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második antitestként egy analitikailag kimutatható reagenssel kapcsolódó antitestet alkalmazunk.
9. 9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy harmadik, antiimunoglobulin antitestként egy analitikailag kimutatható reagenssel kapcsolódó antitestet alkalmazunk.
10. 10. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy analitikailag kimutatható reagensként enzimet alkalmazunk.
11. 11. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy reagensként enzimet vagy biotint alkalmazunk.
12. 12. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első antitestként szilárd hordozón immobilizált antitestet alkalmazunk.

    HU 212 722 Β
13. 13. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első vagy második antitestként az ATCC HB9353 vagy ATCC HB9353 kiónjai vagy szubklónjai által termelt monoklonális antitestet alkalmazunk. 5
14. 14. Teszt-készlet növények Phytophthora-ferlőzéseinek immunológiai diagnosztizálásához, azzal jellemezve, hogy a következő alkotórészeket tartalmazza:

    (a) egy szilárd hordozót, mely egy első monoklonális vagy poliklonális anti-Phytophthora antitestet tartalmaz megkötve;

    (b) egy második monoklonális vagy poliklonális antiPhytophthora antitestet, amely amennyiben nincs jelen (c) pont szerinti antitest, egy analitikailag kimutatható reagenssel kapcsolódik;

    (c) kívánt esetben egy harmadik, anti-immunoglobulin antitestet, amely egy analitikailag kimutatható reagenssel kapcsolódik;

    (d) a második, illetve kívánt esetben a harmadik anti10 testtel kapcsolódó reagens kimutatására szolgáló rendszert;

    ahol az (a) és (b) pont szerinti antitestek közül legalább az egyik egy, a találmány szerinti eljárással előállított antitest.
15. 15. A 14. igénypont szerinti teszt-készlet, azzal jellemezve, hogy a második antitest egy analitikailag kimutatható enzimhez kötődik.
16. 16. A 14. igénypont szerinti teszt-készlet, azzal jellemezve, hogy a harmadik, anti-immunoglobulin antitest egy analitikailag kimutatható reagenshez kötődik.
17. 17. A 14. igénypont szerinti teszt-készlet, azzal jellemezve, hogy az anti-immunoglobulin antitest enzimhez vagy biotinhez kötődik.
18. 18. A 14. igénypont szerinti teszt-készlet, azzal jellemezve, hogy az első vagy második antitestek legalább egyikeként ATCC HB9353 vagy ATCC HB9353 kiónok vagy szubklónok által termelt monoklonális antitestet alkalmazunk.