PT88077B

PT88077B - Anticorpos monoclonais e metodos para o diagnostico de infeccao por phytophthora

Info

Publication number: PT88077B
Application number: PT88077A
Authority: PT
Inventors: Frank Peter Petersen; Sally Ann Miller; James Harley Rittenburg
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1987-07-24
Filing date: 1988-07-22
Publication date: 1995-03-01
Also published as: DE3852914D1; JPS6471483A; ES2067485T3; BR8803673A; GR3015489T3; DK410888A; EP0302011A3; AU1974088A; DK410888D0; IL87194A0; ZW9888A1; CA1339582C; RU1836421C; IL87194A; EP0302011B1; JP2714619B2; KR890001587A; TNSN88077A1; MY104917A; AU612675B2

Description

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 88 077

REQUERENTE: CIBA-GEIGY AG.,suiça, industrial, com sede em Klybeckstrasse 141 4002 Basel, suiça.

EPÍGRAFE: ANTICORPOS MONOCLONAIS E MÉTODOS PARA 0

DIAGNOSTICO DE INFECÇÃO POR PHYTOPHTHORA

INVENTORES: Frank Petersen, Sally Miller e James Rittenburg.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América do Norte, em 24 de Julho de 1987, sob o n⁵. 77,616.

INP1 MOQ 113 RF 15732

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

Este invento proporciona um anticorpo monoclonal útil na detecção da infecção de plantas por PhytophtOra. São também divulgados um hibridoma produtor do anticorpo assim como materiais e Kits para fazer a detecção dos organismos.

E igualmente divulgado o método para a preparação do hibridoma que compreende o isolamento de uma

CIBA-GEIGY AG.,

ANTICORPOS MONOCLONAIS E MÉTODOS PARA 0 DIAGNOSTICO DE INFECÇAO POR PHiTOPHTHORA

célula imunocompetente, a fiEão da referida célula com uma linha de células tumorais e o isolamento do produto de fusão resultante. Por cultura do hibridoma obtem-se o anticorpo o qual reage com pelo menos uma estirpe de Phytophthora, mas não apresenta reacção substancial com as estirpes de Pyth i um.

Este invento relaciona-se com o campo do diagnóstico em patologia vegetal. Mais especificamente, o invento está relacionado com anticorpos monoclonais para a detecção imunológica de espécies de Phytophthora conhecidas como agentes etiológicos de uma variedade de doenças de plantas.

Os fungos como grupo são causadores de muitas doenças de plantas. Com fins de discussão os fungos podem ser classificados como pertencentes a uma das três classes taxonómicas principais: Ascomycetes,

Basidiomycetes ou Phycomycetes.

Ascomycetes

Os membros desta classe possuem uma estrutura reprodutora especializada (um asco) na qual se desenrola a meiose e a formação sexuada de esporos. Exemplos de doenças de plantas mais comuns em que os Ascomycetes foram identificados como agente etiológico incluem: mildios pulverulentos de cereais, frutos e muitas outras culturas; doença do ulmeiro holandês; cravagem das sementes; podridão castanha de pêssegos e ameixas; manchas negras das rosas assim como pedrado das maçãs.

Bas id iomycetes

Os membros desta classe são identificados pela presença de uma estrutura de formação sexuada de esporos conhecida como basidio. As formas patogénicas incluem mangras, ferrugens e espécies carnudas tais como cogumelos. São exemplos a ferrugem do trigo, borbulha do pinheiro branco, ferrugem da pinha do cedro e bolores causadores de doenças no milho, aveia, cevada, cebolas e trigo.

Phycomycetes

Os membros desta classe são considerados mais primitivos do que os membros dos Ascomycetes ou Basidiomycetes, a característica morfológica que os distingue consiste na ausência de micélios segmentados. Exemplos de doenças causadas por membros da classe incluem míldios inferiores da vinha e outros hospedeiros, podridão das raízes e necrose tardia da batateira e do tomateiro.

No contexto deste invento são particularmente importantes os membros do género Phytophthora dos Phycomycetes, (destruidor de plantas). 0 género foi baptizado em 187o por Anton de Bary para descrever o agente causador da necrose tardia da batateira Phytophthora infestans que resaltou na fome generalizada na Irlanda em meados do século XIX. Até ã data foram descritas mais quarenta e três espécies de Phytophthora, todas elas patogénicas para as plantas. Uma série destas espécies são ainda subdivididas em variedades, formas especiais e/ou raças. Existem várias monografias e livros excelentes que proporcionam informação acerca da taxonomia, biologia, ecologia e patologia das espécies neste género (Ver por exemplo Waterhouse, G.M., Mycolog i ca 1 Papers No. 1 22 ( 1970 ) e Erwin, D.C., Bartmicki-Garcia, S. e Tsao, P.H., (eds) Phytophthora Its Biology, Taxonomy, Ecology and Pathology ( 1983) Am. Phytopatho1ogica 1 Soc. St. Paul, MN).

Phytophthora pertence â família Pyth i a ceae sendo o outro membro Pyth i um. Se bem que Pyth i um seja um genero maior em termos de número de espécies, Phytophthora contem uma percentagem mais elevada de especies que causam doenças económicamente importantes. Algumas das especies mais importantes estão resumidas na Tabela 1:

Tabela 1:

Várias doenças em que as espécies de Phytophthora têm sido identificadas como agentes etiológicos

Espécies

P. cactorum

P. capsici

P. cinnamomi

P.	citrophthora
P.	colocas iae
P.	fragari ae
P.	i nfestans
P.	megasperma

Doença

Podridão da raiz e coroa da maciej_ ra

Podridão da raiz da pimenteira

Podridão da raiz de jarrá ; podr idão da raiz de avocado e inclinação de varias espécies lenhosas ornamental s

Podridão da raiz do limoeiro

Necrose da folha de inhame e podridão do rizoma de inhame

Mal vermelho do morangueiro

Necrose tardia da batateira e do tomate i ro

Podridão da raiz e coroa da macieira, cerejeira e outras espécies de frutos.

P. megasperma f. sp. gly c i nea_ Podridão da raiz

P. megasperma f. sp. med i cag i n i s P. palmivora P. paras itica

P. parasitica var. n i cot i anae

P. pna seo1i

P. syringae

Podridão da raiz

Inchaço da raiz do cacaueiro

Podridão da raiz do limoeiro

Hastes negras do tabaco Podridão da raiz do feijoeiro Podridão da macieira

diagnóstico de doenças causadas por Phytophthora spp.é muitas vezes ocultado pela ausência de sintomas óbvios e/ou distintos e por uma incapacidade em isolar o patogénio a partir do tecido infectado em meios nutritivos. Isto é particularmente importante no caso de doenças provocadas por Phytophthora que afectam a raiz da planta. A interferência de Pyth i um spp. não patogénico ou fracamente patogénico presente nas raizes torna difícil ou impossível isolar Phytophthora spp. que geralmente cresce mais lentamente em meios de cultura. Têm sido desenvolvidas técnicas que usam iscos para isolar Phytophthora spp a partir do solo e das raizes de plantas, mas estas técnicas são normalmente demoradas e também sujeitas a contaminação com Pyth i um. No caso da podridão da raiz e caule de soja provocadas por Phytophthora, mais particularmente por £. megasperma f. sp. glycineae, o patogénio pode ser apenas isolado a partir de raizes usando iscos e consequentemente a doença da raiz na ausência de sintomas óbvios no cause não é diagnosticado ou é mal diagnosticado. Um anticorpo monoclonal capaz de diferenciar Phytophthora spp de outros microorganismos, particularmente Pyth i um spp., em tecidos vegetais através de um imunoensaio simples de usar permitiria a detecção em plantas de Phytophthora escondida que baixa a produção.

Surpreendentemente este objectivo foi conseguido dentro do âmbito deste invento através do desenvolvimento de um imunoensaio simples de usar para diagnóstico rápido de infecções por Phytophthora em tecidos vegetais doentes usando a tecnologia de hibridomas/anticorpos monoclonais.

uso de linhas celulares somáticas híbridas como fontes de anticorpo contra antigénios individuais de um modo geral data do trabalho de Kohler e Milstein (Nature 256:495-97, 1975). Os anticorpos produzidos são muito diferentes dos recuperados a partir do anti-soro de animais convencionalmente imunizados. Cada uma das 1inhas celulares híbridas sintetiza uma imunog 1 obu1ina homogénea que representa apenas um de uma míriade de tipos de anticorpos que um animal pode sintetizar como resposta a um antigénio in vivo. Uma vez que cada clone produtor de imunoglobulina é caracterizado por um único tipo de anticorpo que produz, foi adaptado o termo anticorpo monoclonal. As vantagens dos anticorpos monoclonais são numerosas; podem ser obtidos em grandes quantidades e a preparação é homogénea relativamente à reactividade com antigénio e permanece assim para sempre.

principio da tecnologia de hibridomas/monoclonais baseia-se na observação de que quando duas células somáticas são fundidas o híbrido resultante apresenta caracteristicas de ambos os tipos celulares parentais. No caso da produção de anticorpos monoclonais, a capacidade para sintetizar o anticorpo particular deriva de uma célula imunocompetente (geralmente uma célula do baço) retirada de um animal dador imunizado, enquanto que a capacidade de divisão continua em cultura celular é dada pelo outro parceiro da fusão, numa linha celular de tumor (muitas vezes um mieloma). As primeiras fusões foram complicadas pelo facto de a linha celular de mieloma também produzir um anticorpo monoclonal; assim o híbrido muitas vezes produzia dois tipos de anticorpo monoclonal, um originado no mieloma e o outro dirigido pela informação genética da célula imunocompetente. Subsequentemente, foram usadas linhas de células tumorais incapazes de produzir por elas próprias monoclonais, e.g. SP2/0-Agl4 ou X63-Ag8. .653, simplificando assim a análise dos produtos de fusão resultantes.

Uma outra consideração técnica envolve o protocolo de selecção de fusões com êxito (células híbridas) a partir dos dois tipos de células parentais. De rotina são usados um milhão ou mais de células de cada tipo no protocolo de fusão e uma vez que a fusão não ocorre com uma frequência de 100% o trabalho de tentar recuperar produtos de fusão a partir do alto fundo de células parentais não fundidas ou auto-fundidas pode ser tremendo. Como se mencionou, os hibridomas são formados pela fusão de células produtoras de anticorpos de vida curta (do baço) e de células de mieloma de vida longa. 0 resultado pretendido é uma linha celular de vida longa que produza anticorpos. Uma vez que as células do baço têm um período de vida finito em cultura, pode-se simplesmente esperar um período adequado durante o qual todas as células de baço não fundidas ou auto-fundidas morrem; no entanto, deve-se ainda recuperar a partir da população resultante as células produtoras de anticorpos de vida longa a partir das células não produtoras de anticorpos de vida longa. Um meio popular para selecção de células híbridas é o chamado sistema de selecção HAT. Este sistema envolve o uso da enzima hipoxantina-guanina-fosforibosi1-transferase (HGPRT). Esta enzima funciona na via alternativa das purinas nas células de mamíferos. Estas células são também capazes de sintetizar purinas de novo. Na maior parte das condições, ambas as vias operam povãvelmente até certo tgrau. Se uma célula não tiver HGPRT a via alternativa é bloqueada e as purinas devem ser produzidas a partir de materiais sem purinas.

composto 8-azaguanina é um antimetabolito que é capaz de mascarar-se da purina guanina e substitui-la nalgumas das suas reacções normais. A azaguanina é incorporada no DNA, interferindo com o padrão de crescimento normal e conduzindo â morte da célula.Uma vez que a azaguanina deve entrar na via alternativa qualquer célula que não possua actividade HGPRT não pode utilizar azaguanina e crescerá na sua presença.

Um sistema selectivo cpe opera na mesma enzima mas no sentido oposto por as células HGPRT positivas serem seleccionadas estâ descrito por J.W. Littlefield (Science, 145:709, 1964). E designado HAT e contem hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT). A aminopterina é um antimetabolito que evita a sintese de novo de purinas e a metilação de desoxiuridilato para formar timidilato.A hipoxantina pode servir como uma purina no caso da aminopterina bloquear a biossintese de novo de purinas enquanto que a timidina ultrapassa a necessidade de metilação do desoxiuridilato. Assim, na presença de aminopterina, qualquer célula com actividade HGPRT positiva proliferá enquanto que células com actividade HGPRT negativa morrerão.

No sistema híbrido usado para selecção de acordo com este invento, as células de mieloma são preferencia lmente resistentes à azaguanina e susceptiveis à aminopterina - ou seja, elas são HGPRT negativas. Assim, morrerão na presença de aminopterina. As células produtoras de anticorpos são HGPRT positivas. Fundindo as células e crescendo-as em meio HAT sem azaguanina (meio HT), as células fundidas com exito são seleccionadas porque as células de mielomas que constituem a linha pro1iferativa podem crescer apenas sempre que presente a actividade HGPRT e esta actividade deve ser fornecida pela linha celular HGPRT positiva. As linhas celulares HGPRT positivas produtoras de anticorpos não morrem neste meio. Viverão durante algum tempo mas não se replicarão.

Assim, fundindo as células num meio HAT, produzem-se sistemas em que as células de mieloma e as células produtoras de anticorpos podem crescer durante um tempo suficiente para produzir células híbridas mas em que apenas as células híbridas podem sobreviver e proligerar. Após selecção cada clone de hibridoma é então despistado relativamente à capacidade para produzir o anticorpo particular de interesse.

A tecnologia de hibridomas/anticorpos monoclonais tem sido tremendamente feliz, uma das indicações sendo a dedicação aos anticorpos monoclonais de toda uma sub-classe dentro do sistema de classificação dos United States Patent and Trademark Offices(935/100). São ilustrativas da actividade no campo da tecnologia de anticorpos monoclonais Patente U.S. No. 4.196.265 relacionada com métodos de produção de anticorpos monoclonais contra virus; Patente U.S. No. 4.404.279 relacionada com métodos de cultura de hibridomas e aumento de hibridação e Patente U.S.

No. 4.427.653 relacionada com um método para fazer anticorpos monoclonais em que a preparação de antigénio é pré-adsorvida com certos anticorpos monoclonais antes da imunização. Não pretendendo ser uma lista exaustiva, foram produzidos anticorpos monoclonais contra os seguintes antigénios: Treponema pallidum (EP0-83302898.8 ), antigénios da hepatite (EPO-83103858.3), anti-H-Y (EP0-83301214.9 ), células epiteliais da lente (83301176.0), antigénio carcinoembrionário (PTC W081 101469 ), urocinase (EPO-83100190.4 ), herpes (EPO-8340007.4.7), hepatõcitos de rato (82306409.2), Schistosoma mansoni (PCT W083/01837) Leishmania (PCT-W083/01785), g1icoproteina do receptor da transferina (EP0-82305658.5), factor reumatoide (PCT W083/01 1 18) , antigé nios de superfície de cancro renal humano (EP0-83107355.8) , interferão alfa (PCT W081/02899), antigénio das células T(EP0-81300047.8) células T supressoras humanas (EPO-80304348. .8).

Relativamente a doenças de plantas, Hsu, H.T., et a 1 (ASM News 50(3):99-10 1, 1984) enumera 18 espécies de virus de plantas contra os quais foram produzidos anticorpos monoclonais; estão incluídos os virus das coroas circular do cravo encarnado; virus do encarqui 1 hamento da folha da batateira, virus do mosaico do feijoeiro do Sul, virus do mosaico do tabaco, virus das manchas circulares do tomateiro e virus da fractura da tulipa.

Os anticorpos monoclonais contra ftm gos foram produzidos inicialmente como instrumento de diagnóstico de doenças humanas. Por exemplo, os Pedidos de Patente U.K. Nos. GB2138444A e GB2138445A estão relacionados com anticorpos monoclonais reactivos com Candida e Aspergi11us respectivamente.

Divulga-se aqui um anticorpo monoclonal especificamente reactivo com membros do géneto Phytophtora e métodos para a sua produção. 0 anticorpo é particularmente util para detecção de uma gama larga de infecções causadas por Phytophthora.

Tem-se produzido anti-soro policlonal contra várias espécies de Phytophthora de modo a resolver-se questões taxonómicas β.M. Halsall (1976), J. Gen. Microbiol. 94:149-158/ e para estudar numerosos aspectos de interacções hospedeiro-parasita ZP. Moestra, H. Grisebach e E. Zeigler (1983), Eur. J. Cell Biol. 31:167-169/ e ecologia de patogénios Z.J.D. MacDonald e J.M. Dun iway ( 1979) Phytopathology 69:436-441/. Foram produzidos anticorpos monoclonais por Ayers, et a 1 /.Em: Arnetzen, C. e Ryan, C. (eds), Molecular Strategies for Crop Protection-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, New Series,

Vol. 48 (1986) New York: Alan Liss, Inc., p447; também Goodell, et a 1. ( 1985) Em:Key, J.L., Kosuge, T.(eds);

Cellular and Molecular Biology of Plant Stress, UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, New Series,

Vol. 22, New York; Alan Liss, Inc., p447/ contra glicoproteinas extrace1u1 ares ou paredes celulares purificadas de micélio de £. megasperma f. sp. gIyc i nea numa tentativa infrutífera para definir componentes específicos de raças envolvidos na indução da resposta de resistência em plantas de soja hospedeiras. Hardham, et aI., (Exp. Mycol 9:265-268, 1985) induziram anticorpos monoclonais contra zoósporos fixados com g 1 utara 1 deido/paraforma1 deido ou zoosporos enquistados de P. cinnamomi . Foram produzidos anticorpos monoclonais com

vários graus de especificidade. Nenhum destes foram usados no contexto de detecção de doenças em plantas.

Apesar da existência de outros anticorpos monoclonais, não existe nesta altura um teste de diagnóstico para a detecção de infecções por Phytophthora em plantas doentes. Isto pode ser devido, pelo menos em parte, ao facto de nem todos os anticorpos monoclonais serem adequados à utilização no tipo mais vulgar de ensaio, i.e., o ensaio de anticorpos duplos. Existem vãrias razões para que um anticorpo possa não ser adequado a este fim particular. Por exemplo, para detectar com precisão o antigénio de interesse, o segundo anticorpo deve ligar-se a um epitopo diferente do primeiro anticorpo ou o anticorpo deve ser dirigido contra um epitopo múltiplo. Também, o anticorpo deve ser capaz de detectar antigénioe que estejam associados a tecido vegetal infectado com Phytophthora; não é invulgar produzir anticorpos contra determinantes que estão presentes em organismos em cultura, mas que não estão presentes ou não são diagnosticados, em tecido vegetal infectado. Finalmente, certos anticorpos podem ser capazes de detectar Phytophthora em condições de laboratorio a longo termo (eg. 24 horas), mas não funcionam adequadamente no tipo de imunoensaio comercialmente praticável, i.e., um que origine uma resposta positiva ou negativa dentro de cerca de 20 minutos. Neste aspecto, nenhum dos anticorpos monoclonais préviamente descritos que têm sido testados para uso em Kits de testes de diagnostico provaram possuir as caracteristicas necessárias ao uso num imunoensaio de anticorpos duplos rápido e económ i co.

Surpreendentemente, todos os problemas e dificuldades atras referidos podem ser ultrapass_a dos dentro do âmbito do presente invento através de meios simples, i.e. usando anticorpos monoclonais que são produzidos por um hibridoma de acordo com este invento, para a detecção imunológica de infecções por Phytophthora.

-13Em particular o presente invento está relacionado com um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que reagirá com pelo menos uma estirpe de Phytophthora mas que apresenta prãticamente nenhuma reacção com estirpe do género Pythium e também um método para a produção do referido hibridoma. 0 anticorpo também ê capaz de detectar Phytophthora em tecido doente usando um sistema de ensaio de anticorpos duplos. Também estão incluídos no presente invento mutantes e variantes do referido hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que reagirá com pelo menos uma estirpe de Phytophthora mas que não apresenta práticamente reacção com estirpes do género Pythium e que podem fácilmente ser produzidos a partir do presente material de partida por método conhecido.

Conforme usado no presente contexto, na especificação e reivindicações, os termos reacção com ou reacção referem-se à capacidade do anticorpo (ou sua ausência) para formar um complexo binário com um antigénio particular, neste caso com antigénios do género Phytophthora.

presente invento também está relacionado com o anticorpo assim produzido e um método e Kit para a detecção da infecção por Phytophthora usando o presente anticorpo monoclonal como reagente.

Também estão incluídos no presente invento métodos para a produção dos referidos anticorpos monoclonais.

Numa outra realização o invento proporciona um método para detecção da presença do antigénio de Phytophthora numa amostra contendo o mesmo, caracterizado

-14a) formação de um complexo binário entre o referido antigénio e um anticorpo monoclonal ou policlonal capaz de reagir com o referido antigénio;

b) formação de um complexo terciário pelo contacto do complexo binário com um segundo anticorpo monoclonal ou policlonal ;

c) detecção da presença do referido complexo terciário pela observação de um sinal detectável produzido por um reagente analiticamente detectável, reagente este que pode ser conjugado com um terceiro anticorpo, em que pelo menos um dos referidos anticorpos é um anticorpo de acordo com o presente invento.

De preferência, o reagente analiticamente detectável é conjugado com o segundo anticorpo mas pode alternativamente ser conjugado com um terceiro anticorpo anti-imunog1obu1ina.

Numa execução final o invento proporciona um Kit para o diagnóstico imunológico da infecção de plantas por Phytophthora compreendendo um recipiente compartimentado para receber nele bem encaixados:

a) um suporte sólido tendo fixado um primeiro anticorpo monoclonal ou policlonal capaz de formar um complexo binário com o antigénio de Phytophthora; e

b) um meio para detectar o complexo binário compreendendo um segundo anticorpo capaz de formar um complexo terciário por reacção com o referido complexo binário; em que pelo menos um dos referidos anticorpos é um anticorpo de acordo com o presente invento.

Este invento relaciona-se com métodos para a produção de anticorpos monoclonais contra Phitophthora megasperma f. sp. glyc i nea, os anticorpos monoclonais per se, a linha celular de hibridoma capaz de produzir os.referidos anticorpos, o método para produção da referida linha celular de hibridoma e métodos e Kits empregando os anticorpos monoclonais para diagnosticar a infecção por Phytophthora em tecido vegeta 1.

Se bem que da dimensão acima seja claro que são conhecidos anticorpos monoclonais contra Pfytophthora, não ê conhecido que anteriormente tais anticorpos tenham sido usados num Kit de teste para diagnóstico para a detecção de Phytophthora i n s itu, i.e., no tecido vegetal com a doença. Parte do problema surge por nem todos os anticorpos disponíveis terem a especificidade necessária para Phytophthora sobre Pythium. Ainda, mesmo com os anticorpos que possuem a especificidade necessária, nem todos são úteis num Kit de teste para diagnóstico. 0 teste preferido é um em que um sistema de anticorpos duplos é aplicado directamente ao tecido presumivelmente doente.

anticorpo especifico de Phytophthora, de preferencia num suporte sólido, é aplicado ao tecido vegetal e adiciona-se então um segundo anticorpo marcado para identificar a presença do complexo antigénio de Phytophthora-anticorpo. Surpreen^ dentemente, nenhum dos anticorpos contra Phytophthora préviamente conhecidos quando testados detectaram com precisão Phytophthora neste tipo de ensaio. No entanto o presente anticorpo é, ao contrário dos outros anticorpos, capaz de detectar Phytophthora em tecidos doentes quando se usa um sistema de anticorpos duplos.

Os anticorpos monoclonais úteis no presente invento pertencem a umasdoc 1 asse relativamente rara de iminog 1 obu1inas, nomeadamente IgG2b. Os anticorpos desta subclasse são particularmente fáceis de Isolar e purificar,

uma vez que precipitam da solução a força iónica baixa. Um anticorpo adequado de acordo com o presente invento tem uma gama larga de reactividade dentro do género Phytophthora e é capaz de reagir com pelo menos uma estirpe, de preferencia pelo menos 5 estirpes e ainda mais preferencialmente, pelo menos 15 estirpes de Phytophthora, substancialmente sem qualquer reactividade com estirpes de Pythium (Ver Tabela 3).

Um anticorpo monoclonal que satisfaz todos os requesitos citados é produzido por um hibridoma depositado na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland e tem o número de acesso HB9353 (PH 4830).PH 4830 é o anticorpo preferido para usar num Kit de diagnóstico para testar in situ a presença da infecção por Phytophthora.

Este invento inclui o uso dos anticorpos monoclonais descritos acima num sistema para detecção da infecção por Phytophthora em tecidos doentes. Assim, uma amostra de material vegetal suspeito de possuir o organismo ê posta em contacto com o primeiro anticorpo especificamente reactivo com um determinante ant i gén ϊω do organismo a ser detectado. De preferencia, o anticorpo é imobilizado num suporte sólido como sejam as paredes de uma placa de m i crot i tu 1 ação.

anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou um componente de soro policlonal que reagirá com uma Pfytophthora. Após remoção do material que não reagiu por lavagem, o complexo binário resultante (complexo antigénio-anticorpo) é posto em contacto com um anticorpo monoclonal ou policlonal especificamente reactivo com o antigénio a ser detectado. Pondo em contacto o complexo binário imobilizado com o segundo anticorpo monoclonal forma-se um complexo terciário (anticorpo-antigénio-anticorpo ). Pelo menos um dos anticorpos empregues na formação do complexo terciário deve ser um anticorpo de acordo com o presente invento.

-17Após lavagem para remover qualquer segundo anticorpo que não se tenha ligado ao complexo binário, o complexo terciário pode ser detectado por uma variedade de técnicas analiticas. 0 segundo anticorpo pode ser marcado directamente com um reagente analiticamente detectável e o complexo terciário indicado por detecção de um sinal prodi£ zido. Como alternativa pode ser empregue um sistema de imunoensaio através do qual o complexo terciário reage com uma anti-imunog1obu1ina marcada e o produto de reacção é subsequentemente detectado pelo seu sinal detectável. A marca empregue é de preferencia uma enzima mas pode alternativamente ser blotina, um isótopo radioactivo, um fluoroforo ou qualquer outro dos reagentes conhecidos normalmente usados para estes fins.

Com a finalidade de facilitar a detecção, as várias reacções podem ser proporcionadas na forma de um Kit.

Kit compreenderá tipicamente um recipiente compartimentado para receber em contacto estreito:

(1) um suporte sólido tendo fixado um primeiro anticorpo monoclonal ou policlonal capaz de formar um complexo binário com um antigénio de Phytophthora; e (2) um meio para detecção do complexo binário compreendendo um segundo anticorpo monoclonal ou policlonal assim como facultativamente um terceiro anticorpo, em que um dos referidos anticorpos ê o monoclonal do presente Invento. Como se compreenderá fácilmente da discussão precedente qualquer um dos dois anticorpos primeiro ou segundo, pode ser o presente mo- . η o c 1 o n a 1..'

segundo anticorpo pode ele proprio ser marcado ou o meio de detecção do binário pode compreender um terceiro anticorpo anti-imunog1obu1ina que é marcado e pode ser usado para detectar o complexo terciário formado pelo primeiro anticorpo-antigenio-segundo anticorpo. No caso de um imunoensaio com enzima, um substrato para a enzima será também incluído.

Para ilustrar a descrição geral e para uma melhor compreensão do presente invento, será feita referencia a Exemplos específicos, que não pretendem ser de natureza limitante.

Exemplos não limitaites

Exemp1 o 1: Método de extracção das proteínas fúngicas

Os fungos foram cultivados em 50 ml de PDB (meio de Hohl com dextrose de batataPotato Dextrose Hohl's médium, Hohl H.R. 1975 Phytopatho1. Z. 84:18-33 ) em frascos de 250 ml,£2 litros de Phytophthora megasperma f. sp. glycinea, Kaun e Erwin (Pm g) foram geral mente empregues/. Após uma semana as culturas de fungos foram colhidas do meio, lavadas duas vezes com PBS(Tampão salino de fosfatos; pH 7,4). As culturas de fungos foram transferidas para uma câmara de 300 ml de um DYNO-MILL tipo KDL (W.A. Bachhofen AG Maschinenfabrik, Basel, Switzerland) contendo 240 ml de esferas de vidro sem chumbo com 0,5 mm de diâmetro (IMPANDEX, Maywood, New Jersey, USA). A manta de arrefecimento da câmara foi arrefecida até 8°C com água fria de torneira. 0 extracto foi triturado a 3000 RPM duran te 5 minutos após o que o conteúdo da câmara foi transferido para tubos de 50 ml em polistireno e centrifugado a 17000 RPM (34 540 g) numa centrifuga. Sorvall RC-5B refrigerada usando um rotor SS-34. 0 sobrenadante fúngico foi dividido

em amostras pequenas e congelado a -20°C até ser usado. 0 conteúdo de proteína total das aiostras era da gama de 0,5 mg/ /m1 -2 mg/ml.

Exemplo 2: Produção de anticorpos monoclonais

Este processo ê uma modificação do desenvolvido por Kohler e Milstein (1975) e Hammerling (1977).

Os animais empregues são ratinhos BALB/cJ fêmeas com 4-5 semanas de idade comprados à Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME 04609. A primeira injecção consis^ te em 0,2 ml de micélios do fungo Pmg (Phytophthora megaspgrna f. sp. g 1 ycinea extraído em tampão PBS emulsionado em 0,2 ml de adjuvante completo de Freund), administrado por injecção IP. A segunda injecção dada 1 mês mais tarde, também consiste em 0,2 ml de micélios do fungo Pmg (Phytophthora megasperma f. sp. glyc i nea extraído em tampão PBS emulsionado com 0,2 ml de adjuvante incompleto de Freund) administrado por injecção IP. Os animais tratados são sangrados pela veia da cauda para se obter 50 μ 1 de soro de ratinho; este soro ê testado para actividade positiva contra Pmg.

Exemplo 3: Isolamento de células de baço imunocompetentes

Sete dias após a última injecção, o animal é sacrificado por deslocamento cervical. 0 baço é removido e colocado em 20 ml de Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Tissue Culture Standards Committee, Iη Vitro; V o 1 6(2):63,1970; Dulbecco R e Freeman 6, Viro1ogy,8:396 , 1959). 0 baço é colocado num écran estéril de 80 mesh; corta-se então o baço, faz-se perfusão com DMEM e depois suavemente massajado com um êmbolo de uma seringa de plástico

-20rejeitãvel de 10 cc. Durante todo o processo de extracção de células do baço o écran ê continuamente lavado com DMEM.

conteúdo ê pipeta do para um tubo de centrífuga de 50 ml rejeitãvel e centrifugado a 12000 RPM durante 10 minutos (centrifugação feita à temperatura ambiente). 0 sobrenadante é decantado e o sedimento de células lavado com 10 ml de solução de lise de glóbulos vermelhos (0,83% NH^Cl ; 0,01M KHCOg-, 0,1 mM EDTA) durante 90 segundos à temperatura ambiente. A reacção de lise ê parada por diluição com 40 ml de DMEM. Deixa-se a amostra em repouso durante 3 minutos e pipeta-se o sobrenadante para tubos de centrífuga de 50 ml. Após centrifugação o sedimento é lavado com 50 ml de DMEM e centrifugado novamente. 0 sedimento final é ressuspenso em 5 ml de DMEM. Uiq pequena amostra das células de baço é retirada para contagem e para testar a viabilidade celular.

número total de células do baço é 7xl0⁷ células em 5 ml.

Células de mieloma (SP2-0-Agl4 adquiridas à American Type Culture Collection) são transferidas (7χ10θ células) da cultura para um tubo estéril de 50 ml em polipropileno rejeitãvel (Falcon). As células de mieloma para a fusão são centrifugadas (1200 RPM durante 10 minutos à temperatura ambiente). Após centrifugação o sofcrenacfante é rejeitado para uma proveta de vidro limpa, as células lavadas com DMEM e centrifugadas de novo. Ao tubo contendo o sedimento de células de mieloma lavadas, adiciona-se as células de baço. As células de mieloma e baço são suavemente ressuspensas com o auxilio de uma pipeta de 10 ml e pipetador automático e centrifugadas durante 10 minutos a 1200 RPM à temperatura ambiente. Após centrifugação o sobrenadante é decantado.

Exemplo 4: Fusão celular meio de fusão, PEG 1500 (B.M. Bloproducts; cat 783-541) é pré-aquecido a 37°C. Um ml do meio de fusão é adicionado gota a gota ao tubo conteido as células de mieloma e baço ressuspensas. Os 7 minutos finais da reacção de fusão são para se fazer a diluição gradual do PEG com DMEM. No final da diluição, o volume final no tubo atinge 30 ml. Durante todo o período de fusão o tubo ê suavemente agitado para assegurar uma mistura adequada do material. 0 tubo é então centrifugado (12000 RPM durante 10 minutos à temperatura ambiente) e o sobrenadante removido Adiciona-se ao tubo meio HAT (33 ml) pré-aquecido e o conteu do celular é ressuspenso usando uma pipeta de 10 ml.

As células são então semeadas em sete placas de microtitu 1 ação de 95 poços (placa de cultura de tecidos Gibcoware). A cada poço adiciona-se 150 pl do material fundido Mieloma/Baço. Os poços de fora da placa de microtitu 1 ação são então cheios com meio HAT. As placas de microtitu 1 ação são colocadas numa incubadora com camisa de água e 7% de CO2, temperatura 37°C.

De 4 em 4 dias as células são alimentadas com meio HAT tendo a seguinte composição:

-22Meio HAT

Compos i ção

DMEM (meio de Eagle modificado por Dulbecco

L-g1utamato

Penici1ina/Estreptomicina( 10 000 unidades/ 100 ml HAT) c

Aminopterina (solução 2x10 M)

Hipoxantina/Timidina:

IN NaOH-Timidina 38,8 mg

H i poxant i na 136,1 mg em 100 ml de âgua estéril

Soro fetal bovino Hyclone cat #A-111-L

766 ml ml ml ml ml

200 ml

As placas de hibridomas começam a aparecer passados 7 a 10 dias.

Exemplo 5: Despiste de hibridomas

Os h ibridomas produtores de anticorpos contra agentes patogénicos fúngicos são identificados usando material fúngico preparado de Phytophthora megasperma f. sp. g 1 ycinea (concentração proteica 15 /jg/ml em tampão PBS, ver abaixo) num formato ELISA (Ver, e.g. Roitt, et a I . , Immunology, C.V. Mosby, 1985). Os poços que dão respostas positivas nos testes de ELISA são sujeitos a diluição limite de modo a que devam crescer estirpes puras de células de hibridoma. 0 método de diluição limite envolve cultura de suspensões de hibridomas diluídas seriadamente. Cada série de diluições é feita em 6-12 poços de uma placa de cultura

de 96 poços. Estes poços são então testados novamente para actividade de anticorpos específicos contra proteínas fúngicas. Os poços positivos são então transferidos para frascos de cultura de 20 ml para cultura em massa.

5.1. Protocolo de despiste Processo de ELISA-GLUTARALDEIDO pl de tampão glutaraldeido ê colocado em cada um dos poços (Costar, placas de imunoensaio com enzima, Bio Rad, Richmond, Calf., USA) e incubado 3 horas a 55°C. A placa é arrefecida até à temperatura ambiente e o tampão residual rejeitado. As placas são lavadas 4 vezes com água desionizada. Distribui-se por cada poço 200 pl de antigénio diluido em PBS, pH 7,2 (concentração de antigénio 10 pg/ml) e incuba-se durante 24 horas a 4°C. Rejeita-se a suspensão residual e lava-se a placa 8 vezes com PBS. 200pl da solução de (mono)etanolamina é então distribuído por cada poço e incubado durante 20 horas a 4°C. A solução residual é rejeitada e a placa é lavada 8 vezes com PBS. Em cada poço coloca-se 100 pl da mostra de sobrenadanete (exudado de anticorpo secretado pelas células de hibridoma) e incuba-se durante 2 horas a 33°C com humidade. Rejeita-se a solução residual e lava-se a placa 8 vezes com PBS. Adiciona-se então a cada placa 100 pl de IgG ou IgM biotinilados de cabra anti-ratinho KPL (Kirkegaard and Perry Laboratories Inc., Maryland, USA (diluido 1:2500 em 1% de Albumina do Soro Bovina) (BSA)-di1uente PBS). As placas são incubadas a 37°C com humidade durante 0,5 hora , a solução é rejeitada e a placa lavada 8 vezes com PBS. Adiciona-se a cada poço 100 ul de estreptavidina KPL (Conjugado com peroxidase; Kirkegaard and Perry Laboratories Inc., Maryland, USA) conjugado com a enzima peroxidase e incuba-se a 37°C com humidade durante 0,5 hora. A solução é rejeitada e a placa lavada 8 vezes com PBS. Em cada poço coloca-se 200 pl de subs-24trato OPD. As placas são incubadas durante 1/2 hora à temperatura ambiente e a absorvância lida a 405 nm.

5.2 Soluções necessárias

1. Tampão glutaraldeido: 0,1% g1utara1 deido em tampão carbonato O,1M. 0 tampão carbonato, pH 9,0, consiste em:

1,59 g Na₂C0₃ e 2,93 g de NaHC0₃ por litro de água DI.

2. PBS: 8,0g NaCl, 0,2 g KH₂P0_4> 1,15 g Na₂HP0₄ anidro, e 2 g KC1, por litro de ãgua DI, pH 7,4.

3. Solução de (Mono)etanolamina:solução a 1 mg/ml (1 g/litro de água DI).

4. Conjugado(KPL):Di1uido 1:2500; 1% BSA(Albumina do Soro Bovina ) .Diluente PBS.

5. Tampão Citrato de Sõdio:7,l g Na₂HP0₄(solução dibásica)em 500 ml de água desionizada;9,6 g de ácido cítrico em

500 ml de água desionizada.Adicionar a solução de acido cítrico à solução dibásica até se atingir pH 4,5.

6. Substrato OPD: 8,0 mg de OPD e 20,0 mg de peróxido de ureia em 20 ml de tampão fosfato de sódio (pH 4,5).

5.3 Resultados do despiste dos sobrenadantes da linha celular PH4830 (ATCCHB9353) teste que se segue foi feito em placas preparadas com glutaraldeido contendo um painel de antigénios diferentes. No despiste usou-se o conjugado KPL de cabra anti-IgG de ratinho com biotina estreptavidina peroxidase. Uma absorção inferior a acerca de 0,2 é considerado como não sendo reacção.

-25Tabela 2 abreviatura

Phvtophtora species

Absorção

Ph5 Pbytophthora 0,73

Phc2	P.	citrophthora	0,44
Phcll	P.	citricola	0,59
Phcml	P.	cambivora	0,43
Phcnl	P.	cinnamomi	0,20
Phcpl	P.	capsici	0,71
Phcr-3	P.	cryptogea	0,55
Phd-1	P.	dreschsleri	0,41
Phe-1	P.	erythrosepti ca	0,51
Phn-1	P.	nicotianae	0,37
Php-3	P.	parasitica	0,47
Pmeg-19	P.	megasperma	0.59
Pmgr4-1	P.	megasperma f.sp. glvcinea	0.41
Pmgr2-1	P.	megasperma f.sp. glvcinea	0.60
Pmm-2	P.	megasperma f.sp. medicaginis	0.79
Ppn-I4	P.	parasitica var. nicotianae	0.38
Pmeg-2	P.	megasperma	0.34
Ppn-14	P.	parasitica nicotianae	0.41
Pmeg-2	P.	megasperma	0.46

Exemplo 6: Teste da avidez processo que se segue foi executado para determinar a avidez dos anticorpos monoclonais produzidos.

anticorpo a ser testado é diluído pera uma diluição calculada para dar uma leitura de D.O. de 1,5 num processo de titulação de anticorpo. A solução diluente tem a seguinte composição:

Tampão diluente do anticorpo: pH 7,2

Componente

Quantidade

Na₂HP0₄	2,10 g/1
NaH₂P0₄	0,56 g/1
NaCl	8,76 g/1
T imerosa1	0,1 g/1
BSA(Albumina do soro bovina)	1,0 g/1

A cada micropoço adicionou-se 50 ml do antigénio padrão diluído e 50 ml do anticorpo prediluido é então adicionado a cada poço com uma pipeta de repetição. Os poços são incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente com agitação. Os poços são então lavados cinco vees com uma solução de lavagem tendo a seguinte composição:

Componente	Quantidade
Tris	2,42 g/1
NaCl	8,76 g/1
Timerosa1	0,10 g/1
Tween 80	5,00 g/1
HC1 (l,0N)	aprox. 14,3 ml/1
usar HC1 para	dar pH final de 7,8.

conjugado empregue é um conjugado anti-IgG de ratinho-peroxidase de rábano silvestre Dakopatts (Dakopatts A/S, Dinamarca); este é adicionado em quantidades de 100 pl a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante cerca de 10 minutos, com agitação. Os poços são novamente lavados e em seguida adicionado 100 ju 1 de substrato a cada poço. 0 substrato possui uma solução stock de 15 mg/ml de 2,2¹-Az 1nobis(ácido 3-eti lbenztiazo1ino-su1fónico ) (sal diamónio) (ABTS) diluida a 1:25 em tampão citrato-peroxidase tendo a seguinte composição:

Componente

Quantidade

Acido cítrico h^O ajustar o pH a 4,0 com 1,0 N NaOH e depois levar o volume a 100 ml com F^O antes da adição de H₂0₂H₂0₂ (30%)

2,3 g/85 ml /jl/100 ml

Após adição do substrato os poços são novamente incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente com agitação. Adiciona-se então uma solução de paragem (50 (j 1 de fluoreto de sódio a 1,5%) a cada poço e

mistura-se durante 10 segundos. A absorvância é então lida a 405 nm-415 nm. A curva de dose-resposta ê desenhada em gráfico seml-log e extrapolada para determinar a concentração de antigénio que provoca 50% de redução da côr máxima observada. Este valor ê registado como uma medida relativa da avidez.

Este processo foi efectuado com os anticorpos produzidos de acordo com o presente invento. Como exemplo de uma avidez calculada dos presentes anticorpos, o anticorpo No. 4830 tem uma avidez de cerca de

4,3 jjg/ml de antigénio a 50% da D0 máxima de antigénio zero.

Exemplo 7: Processo de subclonagem

Os poços que deram respostas positivas nos testes de ELISA sofreram diluição limite de modo a cultivarem-se estirpes puras de células de hibridoma. 0 método da diluição limite envolve a cultura de suspensões diluídas seriadamente de hibridomas. Cada série de diluições foi realizada em 6-12 poços de uma placa de cultura de 96 poços. Estas placas foram então novamente testadas quanto à actividade especifica contra proteínas fúngicas.

Os poços positivos são então transferidos para frascos de cultura de 20 ml para cultura em massa.

7.1 Caracterização do clone PH4830 clone PH4830 secreta anticorpos da subclasse IgG2b contra Ptytophthora megasperma f. sp. glycinea .

7.2 Depósito das estirpes úteis na realização do invento

Fez-se um depósito de uma cultura biologicamente pura do hibridoma que se segue na American Type Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland em 12 de Março de 1987, o número de acesso indicado foi atribuído após testes de viabilidade satisfatórios e pagas aa taxas necessárias. 0 acesso à referida cultura estará disponível durante a pendência do pedido de patente a todo aquele determinado pelo Comissário encarregado disso de acordo com 37 C.F.R. 1.14 e 35U.S.C. 122. Todas as restrições à disponibilidade da referida cultura ao público serão irrevogávelmente removidas quando do pagamento de uma patente baseada no pedido e a referida cultura permanecerá permanentemente disponível durante um período de pelo menos 5 anos após o mais recente pedido de fornecimento de uma amostra e de qualquer modo durante um período de pelo menos 30 anos após a data do depósito. Se a cultura se tornar não viável ou for inadvertidamente destruída será substituída por uma ou mais culturas viáveis da mesma descrição taxonómica.

Hibridoma ATCC N^g

Ratinho Ba 1bc/mie1 orna SP2 HB9353

PH4830

Exemplo 8: Detecção de fungos patogénicos e Kits para talfim

Este invento inclui o uso dos anticorpos monoclonais descritos atrás num sistema de detecção de infecção por Phytophthora em tecidos doentes. Assim, uma . amostra do material vegetal suspeito de ser portador do organismo é posta em contacto com um primeiro anticorpo especificamente reactivo com um determinante antigénim do or-30-

ganismo a ser detectado. De preferencia, o anticorpo ê imobilizado num suporte sólido como seja as paredes de uma placa de microtitulação. 0 anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou um componente de um soro policlonal que reagirá com uma Phytophthora. Após remoção do material que não reagiu por lavagem, p complexo binário resultante (complexo antigénio-anticorpo) foi posto em contacto com um anticorpo monoclonal ou policlonal especificamente reactivo com o antigénio a ser detectado. Pondo em contacto o complexo binário imobilizado com o segundo anticorpo monoclonal, forma-se um complexo terciário (anticorpo-antigénio-anticorpo). Pelo menos um dos anticorpos empregues na formação do complexo terciário deve ser um anticorpo de acordo com o presente invento.Após lavagem para remover qualquer anticorpo que não se tenha ligado ao complexo binário, o complexo terciário pode ser detectado por uma variedade de técnicas analiticas. 0 segundo anticorpo pode ser marcado directamente com um reagente analiticamente detectável e o complexo terciário indicado pela detecção de um sinal assim produzido. Como alternativa, pode ser empregue um sistema de imunoensaio em que o complexo terciário reage com uma anti-imunog1obu1ina marcada e o produto de reacção é subsequentemente detectado pelo seu sinal detectável. A marca empregue é de preferencia uma enzima mas pode ser alternativamente biotina, um isotopo radioactivo, um fluoroforo ou qualquer outro dos reagentes conhecidos normalmente usados para estes fins.

Kit compreenderá tipicamente um recipiente compartimentado para receber em contacto estreito:.

(1) um suporte sólido tendo fixado um primeiro anticorpo monoclonal ou policlonal capaz de formar um complexo binário com um antigénio de Phytophthora; e

(2) um meio para detecção do complexo binário compreendendo um segundo anticorpo monoclonal ou policlonal assim como facultativamente um terceiro anticorpo, em que um dos referidos anticorpos é o monoclonal do presente invento.Como será fácilmente compreendido da discussão precedente, tanto o primeiro como o segundo anticorpo podem ser o presente mono c1ona1.

segundo anticorpo pode ele proprio ser marcado ou o meio de detecção do binário pode compreender um terceiro anticorpo anti-imunoglobulina que é marcado e que pode ser usado para detectar o complexo terciário formado pelo primeiro anticorpo-antigénio-segundo anticorpo. No caso de um imunoensaio com enzima, será também incluído um substrato da enzima.

Um exemplo especifico da incorporação dos presentes anticorpos num formato ELISA é efectuado como se segue, para avaliar se é adequado ao uso num Kit de teste para diagnóstico.

Líquidos de ascites de ratinhos foram testados quanto à actividade em módulos de micropoços tendo antigénio, usando o processo de despiste com um único anti-4 corpo. As diluições de 10 deram leituras fora da escala (> 2,0)e as diluições de 10 deram leituras de aproximadamente 0,5 O.D. a 415 nm.

anticorpo é purificado a partir do liquido de ascites usando cromatografia de afinidade com proteína A como se segue:

Condições da cromatografia:

1. Gel-Pharmacia C14B proteina A (6,0 ml)

2. Tris/HCl pH 8,6 tampão de equi1ibrio/1igação

3. Tampão de eluição acetato pH 4,3

4. Tampão de regeneração Glicina/HCl pH 2,3

5. Velocidade da bomba 12 (aprox. 1 ml/min.).

6. Aplicação de 2,5 ml de ascites brutas

7. Velocidade de descida 5 mm/min.

8. 0,2 na escala total de O.D.

fluido de ascites é passado através de uma coluna de proteina A e a fracção de IgG é eluida da coluna a pH 4,3. A actividade do anticorpo purificado é medida usando o processo de despiste aom um único anticorpo anticorpo monoclonal é conjugado com peroxidase de rábano silvestre usando oxidação com perio dato dos grupos de açúcar da enzima para formar grupos aldeído activos que são acoplados aos grupos amino do anticorpo. 0 conjugado enzima-anticorpo é testado em multipòços com antigénio.

Mediram-se leituras fora da escala de absorvência (2,0 +) para conjugados em concentrações de 2,1 /jg IgG/ml e 0,21 /jg IgG/ml. Mediu-se uma leitura de absorvância de 0,369 para o conjugado numa concentração de 0,021 yug IgG/ml.

anticorpo conjugado com enzima é usado conjuntamente com multipoços antendo anticorpo policlonal de carneiro purificado por afinidade num ensaio de ELISA com sanduíche de duplos anticorpos. 0 policlonal empregue é produzido por imunização de carneiros com a

mesma preparação de antigénio usada na produção de anticorpos monoclonais. A imunização inicial é com 4 ml de antigénio emulsionado com 4 ml de adjuvante injectado ao longo de um lado da parte anterior das costas e também nos flancos. Após um período de descanso de 30 dias, administra-se mais 2 ml de antigénio com 2 ml de adjuvante no sitio oposto. da costa onde foi feita a primeira injecção. Colhe-se sangue 7-10 dias após a administração e depois repete-se o ciclo (injecção e colheita de sangue).0 soro policlonal bruto normalmente dã reacção cruzada com Pyth ium, mas é seleccionado por despiste contra outros organismos não alvos e purificado por cromatografia de afinidade com antigénio.

Em adição para testar os anticorpos do presente invento, usou-se o processo anterior para testar uma variedade de anticorpos monoclonais anteriormente descritos na literatura (e.g. Ayers, supra). Os testes foram efectuados em amostras incluindo soja infectada com Phytophthora e saudável e culturas puras fervidas e não fervidas do agente patogénico. De todos os anticorpos conhecidos testados nenhum foi capaz de dar uma reacção positiva com o tecido doente num período de tempo curto (i.e., 20-30 minutos no máximo),indicando assim serem pouco adequados para usar num Kit de teste para diagnóstico.Os resultados do ensaio com o anticorpo 4830 estão apresentados na Tabela 3:

Tabela 3

Amostras de campo de plantas de soja, ambas com e sem sintomas de podridão da raiz e caule provocada por Phytophthora, foram extraídas e testadas no imunoensaio de anticorpos duplos utilizando o anticorpo monoclonal 4830 conjugado com peroxidase. Mostra-se em baixo um sumário dos resultados:

-34Amostra caules com sistemas

127 4 132 £146 raízes com sintomas

I 127 # 132 H 146 caule sem sintomas

4161 4 149 4158 raiz sem sintomas

4161 4 149 4158

Resultado do imunoensaio(OD 415 nm)

0,33

0,21

2,00

0,19

0,75

2,00

0,02

000

008

000

Claims

REIVINDICAÇOES

1®. - Hibridoma caracterizado por produzir um anticorpo monoclonal que reage com pelo menos uma estirpe de Phytophthora mas que não apresenta reacção substancial com as estirpes de Pyth ium, sendo o referido anticorpo capaz de detectar Phytophthora em tecidos doentes num imunoensaio com dois anticorpos.
2®. - Hibridoma de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo monoclonal reagir com pelo menos 15 estirpes de Phytophthora.
3®. - Hibridoma de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo monoclonal pertencer à subclasse I<£2b.
4®. - Hibridoma de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o anticorpo monoclonal pertencer à subclasse IgG2b.
5®. - Hibridoma caracterizado por apresentar as caracteristicas identificadoras de ATCC HB 9353.

5®. - Mutantes e variantes do hibridoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por ainda apresentarem as propriedades caracteristicas do material de partida.
7®. - Anticorpo monoclonal cara£ terizado por reagir com pelo menos uma estirpe de Phytophthcra e por não apresentar reacção substancial com estirpes de Pythium, sendo o referido anticorpo capaz de detectar

Phytophthora, em tecido doente num imunoensaio com dois an-36- ticorpos.
8^a. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o anticorpo reagir com pelo menos 15 estirpes de Phytophthora.
9^a. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por pertencer â subclasse IgG2b.
10^a. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por pertencer à subclas se IgG2b. ;
11^a. - Anticorpo monoclonal caracterizado por ser produzido por um hibridoma ou seus mutantes e variantes de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
12^a. - Anticorpo monoclonal caracterizado por ser produzido pelo hibridoma de acordo com a reivindicação 5.

de um hibridoma de acordo com do por compreebder:

a) o isolamento de uma célula animal dador Imunizado,
13^a. - Método para produção a reivindicação 1, caracteriza imunocompetente retirada de um

b) a fusão da referida célula de células tumorais que tem a tinuamente em cultura, e imunocompetente com uma linha capacidade de se dividir conc) o isolamento do produto de fusão resultante.
14^a. - Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a referida célula imunocompetente ser uma célula de baço.
15^a. - Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a referida linha de células tumorais ser uma linha celular de mieloma incapaz de produzir os seus proprios anticorpos monoclonais.
16^a. - Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a referida linha CElular de mieloma ser SP2/o-Agl4 ou X63-Ag8.653.
17^a. - Método de acordo com a reivindicação 13 caracterizado por o referido produto de fusão ser linha celular de hibridoma ratinho Balbc/mieloma SP2 = PH 4830, que tem as caracteristicas identificadoras de ATCC HB 9353.
18^a. - Método para produção de um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender cultura i n v i tro ou i n vivo de um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que reage com pelo menos uma estirpe de Phytophthora mas que não apresenta reacção substancial com estirpes de Pyth i um, sendo o referido anticorpo capaz de detectar Phytophthora em tecidos doentes num imunoensaio com dois anticorpos.
19^a. - Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por um hibridoma de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 5 ser cultivado em massa.
20^a. - Método para detecção da presença do antigénio de Phytophthora numa amostra contendo o mesmo caracterizado por:

a) se formar um complexo binário entre o antigénio na amostra e um primeiro anticorpo monoclonal ou policlonal capaz de reagir com o antigénio;

b) se formar um complexo terciário através do contacto do complexo binário com um segundo anticorpo monoclonal ou policlonal capaz de reagir com o antigénio; e

c) se detectar a presença do complexo terciário pela observação de um sinal detectável produzido por um reagente analiticamente detectável, reagente este que facultativamente pode ser conjugado com um terceiro anticorpo;

em que pelo menos um dos anticorpos é um anticorpo monodonal que reage com pelo menos uma estirpe de Phytophthora mas que não apresenta reacção substancial com as estirpes de Pythium, sendo o referido anticorpo monoclonal capaz de detectar Phytophthora no tecido doente num imunoensaio com dois anticorpos.
21⁵. - Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o reagente detectável ser conjugado com o segundo anticorpo.
22^. - Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o reagente detectável ser conjugado com um terceiro anticorpo anti-imunog1obu1ina que é posto em contacto com o complexo terciário.
23- . - Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o reagente ser um enzima, um isotópo radioactivo, um fluoróforo ou biotina.
24- . - Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o reagente ser um enzi- . ma, um isotópo radioactivo, um fluoróforo ou biotina.
25-.

Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por um dos anticorpos ser imobilizado num suporte solido.
26^s. - Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por um dos anticorpos ser produzido por ATCC HB 9353, ou seus clones ou subclones.
27^ã. - Equipamento (Kit) para o diagnóstico imunológico da infecção por Phytophthora numa planta caracterizada por compreender um veiculo compartimentado para receber dentro e em estreito contacto:

a) um suporte solido a que está fixado um primeiro anticorpo monoclonal ou policlonal capaz de reagir com Phytophthora; e

b) meios para detecção de um complexo binário compreendendo um segundo anticorpo monoclonal ou policlonal assim como facuj_ tativamente um terceiro anticorpo; em que pelo menos um dos anticorpos é um anticorpo monoclonal que reage com pelo menos uma estirpe de Phytophthora, mas que não apresenta reacção substancial com estirpes de Pyth ium, sendo o referido anticorpo monoclonal capaz de detectar Phytophthora em tecidos doentes num imunoensaio com dois anticorpos.
28^â. - Equipamento de acordo com a reivindicação 27 caracterizado pelo menos um dos anticorpos ser capaz de reagir com pelo menos 15 estirpes de Phytophthora.
29-. - Equipamento de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por o segundo anticorpo ser conjugado com um reagente analiticamente detectável seleccionado do grupo constituído por uma enzima, num radioisótopo, um fluoróforo ou biotina.
30^â. - Equipamento de acordo

-40com a reivindicação 27, caracterizado por compreender um terceiro anticorpo anti-imunog1obu1ina conjugado com um reagente analiticamente detectável seleccionado do grupo constituído por uma enzima, um isotopo radioactivo, um fluoróforo ou biotina.
31³. - Equipamento de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo menos um dos anticorpos ser um anticorpo monoclonal produzido por ATCC HB 9353, ou seus clones ou subclones.

Lisboa, 22 de Julho de 1988