JP2714619B2 - フィトフソーラの免疫学的検出のためのモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ - Google Patents
フィトフソーラの免疫学的検出のためのモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は診断上の植物病理学の分野に関する。更に詳
細には、本発明は様々な植物の病気の原因であると知ら
れているフィトフソーラ（Phytophthora）種の免疫学的
検出のためのモノクローナル抗体に関する。
細には、本発明は様々な植物の病気の原因であると知ら
れているフィトフソーラ（Phytophthora）種の免疫学的
検出のためのモノクローナル抗体に関する。
群としての菌類は多くの植物の病気を引き起こす。議
論の目的のために、菌類は３つの主な分類上の類：子の
う菌類（Ascomycetes）、担子菌類（Basidiomycetes）
または藻菌類（Phycomycetes）の１つの属するものとし
て分類され得る。
論の目的のために、菌類は３つの主な分類上の類：子の
う菌類（Ascomycetes）、担子菌類（Basidiomycetes）
または藻菌類（Phycomycetes）の１つの属するものとし
て分類され得る。
子のう菌類 この類の菌は、還元分裂および有性の胞子形成が起こ
る分化した再生構造（子のう）を有する。子のう菌類が
病因として同定された多くの共通の植物の病気の例は、
穀類、果実および多くのその他の作物上のウドンコ病
（powdery mildews）、ニレ立ち枯れ（Dutch elm disea
se）、穀類の麦角病（ergot）、モモおよびプラムの灰
星病（brown rot）、バラのブラックスポット（black s
pot）並びにリンゴの黒星病（scab）を含む。
る分化した再生構造（子のう）を有する。子のう菌類が
病因として同定された多くの共通の植物の病気の例は、
穀類、果実および多くのその他の作物上のウドンコ病
（powdery mildews）、ニレ立ち枯れ（Dutch elm disea
se）、穀類の麦角病（ergot）、モモおよびプラムの灰
星病（brown rot）、バラのブラックスポット（black s
pot）並びにリンゴの黒星病（scab）を含む。
担子菌類 この類の菌は、担子器として知られる有性胞子形成構
造の存在により同定される。病原性の形態は黒穂病（sm
uts）、さび病（rusts）およびキノコのような肉質の種
類を含む。例はコムギサビ病（wheat rust）、ストロー
ブマツのこぶ症（blister）、シーダーアップルのサビ
病、およびトウモロコシ、オート麦、大麦、タマネギお
よび小麦に病気を引き起こす黒穂病である。
造の存在により同定される。病原性の形態は黒穂病（sm
uts）、さび病（rusts）およびキノコのような肉質の種
類を含む。例はコムギサビ病（wheat rust）、ストロー
ブマツのこぶ症（blister）、シーダーアップルのサビ
病、およびトウモロコシ、オート麦、大麦、タマネギお
よび小麦に病気を引き起こす黒穂病である。
藻菌類 この類の菌は、子のう菌類または担子菌類のいずれの
ものよりより原始的であると考えられており、それらの
区別される形態上の特徴は菌子体の隔膜がないことであ
る。この類の菌により引き起こされる病気の例は、ブド
ウおよびその他の宿主のべと病（downy mildews）、根
腐敗病（root rot）およびジャガイモおよびトマトの疫
病（late blight）を含む。
ものよりより原始的であると考えられており、それらの
区別される形態上の特徴は菌子体の隔膜がないことであ
る。この類の菌により引き起こされる病気の例は、ブド
ウおよびその他の宿主のべと病（downy mildews）、根
腐敗病（root rot）およびジャガイモおよびトマトの疫
病（late blight）を含む。
本発明に関連して、藻菌類の属フィトフソーラ（「植
物破壊者」）の菌は特に重要である。この属は、19世紀
なかばアイルランドに広範囲の飢きんを起こしたジャガ
イモの疫病の病原〔フィトフソーラ インフェスタンス
（Phytophthora infestans）〕を記載するためにアン
トンデ バリー（Anton de Bary）により1876年に命名
された。フィトフソーラの43の付加的な種が今日までに
記載されており、その全てが植物に対して病原性であ
る。多くのこれらの種は、さらに変種、特殊型（formae
specials）および／または品種に細分される。種々の
すぐれたモノグラフおよび本があり、これらはこの属に
おける種の分類学、生物学、生態学および病理学に関す
る情報を提供する。（例えば、Waterhouse.G.M.,Mycolo
gical Papers No.122（1970）およびErwin,D.C.,Bartni
ck−Gar−cia,S.and Tsao,P.H.（編）Phytophthora:Its
Biology,Taxonomy,Ecology and Pathology（1983）Am.
Phytopatholgical Soc.,St.Paul,MN）フィトフソーラは
ピチアセアエ科（Pythiaceae）に属し、それのその他の
仲間はピチウム（Pythium）である。ピチウムは種の数
という点ではより大きな属であるが、フィトフソーラ
は、経済的に重要な病気を引き起こす種を高比率で含
む。非常に重要な種のいくつかを第１表にまとめる。
物破壊者」）の菌は特に重要である。この属は、19世紀
なかばアイルランドに広範囲の飢きんを起こしたジャガ
イモの疫病の病原〔フィトフソーラ インフェスタンス
（Phytophthora infestans）〕を記載するためにアン
トンデ バリー（Anton de Bary）により1876年に命名
された。フィトフソーラの43の付加的な種が今日までに
記載されており、その全てが植物に対して病原性であ
る。多くのこれらの種は、さらに変種、特殊型（formae
specials）および／または品種に細分される。種々の
すぐれたモノグラフおよび本があり、これらはこの属に
おける種の分類学、生物学、生態学および病理学に関す
る情報を提供する。（例えば、Waterhouse.G.M.,Mycolo
gical Papers No.122（1970）およびErwin,D.C.,Bartni
ck−Gar−cia,S.and Tsao,P.H.（編）Phytophthora:Its
Biology,Taxonomy,Ecology and Pathology（1983）Am.
Phytopatholgical Soc.,St.Paul,MN）フィトフソーラは
ピチアセアエ科（Pythiaceae）に属し、それのその他の
仲間はピチウム（Pythium）である。ピチウムは種の数
という点ではより大きな属であるが、フィトフソーラ
は、経済的に重要な病気を引き起こす種を高比率で含
む。非常に重要な種のいくつかを第１表にまとめる。
第１表 フィトフソーラ種が病原として固定された種々の病気 種 病気 フィトフソーラ カクトラム（P.cactorum） リンゴの根および樹冠腐敗病 フィトフソーラ カプシシ（P.capsici） コショウの根腐敗病 フィトフソーラ シンナモミ（P.cinnamomi） ジャーラー（jarrah）の根腐敗病、アボカドの根腐
敗病および種々の木の観賞種の衰弱病 フィトフソーラ シトロフソーラ（P.citrophthora） カンキツ類の根腐敗病 フィトフソーラ コロカシアエ（P.colocasiae） タロイモの葉の胴枯れ病および地下茎の腐敗病 フィトフソーラ フラガリアエ（P.fragariae） イチゴのレッドステーレ（Red stele） フィトフソーラ インフェスタンス（P.infestans） ジャガイモ、トマトの疫病 フィトフソーラ メガスペルマ（P.megasperma） リンゴ、サクランボおよびその他の果実種の根およ
び樹冠腐敗病 フィトフソーラ メガスペルマ グリシネア特別型 根腐敗病（P.megasperma f.sp.glycinea） フィトフソーラ メガスペルマ メディカギニス特別型 根腐敗病（P.megasperma f.sp.medicaginis） フィトフソーラ パルミボラ（P.palmivora） カカオのルートポッド（root pod） フィトフソーラ パラサイティカ（P.parasitica） カンキツ類の根腐敗病 フィトフソーラ パラサイティカ ニコチアナエ特別型 タバコの黒枯病（black shank）（P.parasitica va
r.nicotianae） フィトフソーラ ファセオリ（P.phaseoli） マメの根腐敗病 フィトフソーラ シリンガエ（P.syringae） リンゴの果実腐敗病 〔発明が解決しようとする課題〕 フィトフソーラ種により引き起こされる病気の診断
は、明らかなおよび／または明瞭な症状の欠如により、
そして栄養培地上の罹病組織から病原を分離できないこ
とによりしばしば妨げられる。このことは、植物体の根
を冒すフィトフソーラの病気の場合に特に重要である。
根の中または上に存在する非病原性または弱病原性のピ
チウム種からの妨害は、そのような媒体上ではよりゆっ
くりと通常成長するフィトフソーラ種を分離することを
困難にまたは不可能にしている。ベイティング法（Bait
ing technique）は、土壌および植物の根からフィトフ
ソーラ種を分離するために開発されたが、しかしこれら
は多くの時間を必要とし、そしてピチウムの混入に晒さ
れもする。フィトフソーラ マガスペルマ グリシネア
特別型により引き起こされる大豆のフィトフソーラ根お
よび茎腐敗病の場合には、病原はベイティングにより根
から分離され得るだけであり、そして結果的にははっき
りした茎の症状の欠如した根の病気はしばしば診断され
ないが、または誤って診断される。簡単に利用し得る免
疫検定法（immunoassay）を介して植物組織において、
その他の微生物、特にピチウム種からフィトフソーラ種
を区別し得るモノクローナル抗体は、植物体において収
量を減らす「隠されたフィトフソーラ」の診断を可能に
するであろう。
敗病および種々の木の観賞種の衰弱病 フィトフソーラ シトロフソーラ（P.citrophthora） カンキツ類の根腐敗病 フィトフソーラ コロカシアエ（P.colocasiae） タロイモの葉の胴枯れ病および地下茎の腐敗病 フィトフソーラ フラガリアエ（P.fragariae） イチゴのレッドステーレ（Red stele） フィトフソーラ インフェスタンス（P.infestans） ジャガイモ、トマトの疫病 フィトフソーラ メガスペルマ（P.megasperma） リンゴ、サクランボおよびその他の果実種の根およ
び樹冠腐敗病 フィトフソーラ メガスペルマ グリシネア特別型 根腐敗病（P.megasperma f.sp.glycinea） フィトフソーラ メガスペルマ メディカギニス特別型 根腐敗病（P.megasperma f.sp.medicaginis） フィトフソーラ パルミボラ（P.palmivora） カカオのルートポッド（root pod） フィトフソーラ パラサイティカ（P.parasitica） カンキツ類の根腐敗病 フィトフソーラ パラサイティカ ニコチアナエ特別型 タバコの黒枯病（black shank）（P.parasitica va
r.nicotianae） フィトフソーラ ファセオリ（P.phaseoli） マメの根腐敗病 フィトフソーラ シリンガエ（P.syringae） リンゴの果実腐敗病 〔発明が解決しようとする課題〕 フィトフソーラ種により引き起こされる病気の診断
は、明らかなおよび／または明瞭な症状の欠如により、
そして栄養培地上の罹病組織から病原を分離できないこ
とによりしばしば妨げられる。このことは、植物体の根
を冒すフィトフソーラの病気の場合に特に重要である。
根の中または上に存在する非病原性または弱病原性のピ
チウム種からの妨害は、そのような媒体上ではよりゆっ
くりと通常成長するフィトフソーラ種を分離することを
困難にまたは不可能にしている。ベイティング法（Bait
ing technique）は、土壌および植物の根からフィトフ
ソーラ種を分離するために開発されたが、しかしこれら
は多くの時間を必要とし、そしてピチウムの混入に晒さ
れもする。フィトフソーラ マガスペルマ グリシネア
特別型により引き起こされる大豆のフィトフソーラ根お
よび茎腐敗病の場合には、病原はベイティングにより根
から分離され得るだけであり、そして結果的にははっき
りした茎の症状の欠如した根の病気はしばしば診断され
ないが、または誤って診断される。簡単に利用し得る免
疫検定法（immunoassay）を介して植物組織において、
その他の微生物、特にピチウム種からフィトフソーラ種
を区別し得るモノクローナル抗体は、植物体において収
量を減らす「隠されたフィトフソーラ」の診断を可能に
するであろう。
この目的は、おどろくべきことに本発明の範囲内で、
ハイブリドーマ／モノクローナル法を用いて罹病植物組
織内のフィトフソーラ感染の迅速な診断のための簡単に
利用し得る免疫検定法を開発することにより解決される
ことができた。
ハイブリドーマ／モノクローナル法を用いて罹病植物組
織内のフィトフソーラ感染の迅速な診断のための簡単に
利用し得る免疫検定法を開発することにより解決される
ことができた。
個々の抗原に対する抗体の源として体細胞ハイブリッ
ド細胞系の使用は、コーラーおよびミルスタイン（Kohl
er and Milstein）の文献（nature256:495−97,1975）
に一般的に記載されている。産生された抗体は、慣用的
に免疫感作された動物の抗血清から回収されたものとは
全く異なっている。各々のハイブリッド細胞系は、ある
動物が生体内で抗原に感応して合成することができる無
数のタイプの抗体のうちのただ１種だけを発現する均一
な免疫グロブリンを合成する。各々の免疫グロブリン産
生クローンはそれが産生する単一のタイプの抗体により
特徴づけられるから、モノクローナル抗体（monoclonal
antibody）という語が採用された。モノクローナル抗
体の利点は無数である。即ち、それらは大量供給におい
て得られ、製造物は抗原反応性に関して均一であり、そ
して時を超えてその状態のままでいる。
ド細胞系の使用は、コーラーおよびミルスタイン（Kohl
er and Milstein）の文献（nature256:495−97,1975）
に一般的に記載されている。産生された抗体は、慣用的
に免疫感作された動物の抗血清から回収されたものとは
全く異なっている。各々のハイブリッド細胞系は、ある
動物が生体内で抗原に感応して合成することができる無
数のタイプの抗体のうちのただ１種だけを発現する均一
な免疫グロブリンを合成する。各々の免疫グロブリン産
生クローンはそれが産生する単一のタイプの抗体により
特徴づけられるから、モノクローナル抗体（monoclonal
antibody）という語が採用された。モノクローナル抗
体の利点は無数である。即ち、それらは大量供給におい
て得られ、製造物は抗原反応性に関して均一であり、そ
して時を超えてその状態のままでいる。
２つの体細胞が融合される時に生成したハイブリッド
は親細胞のタイプの両方の特徴を示すという観察に基づ
いてハイブリドーマ／モノクローナル法の原理が予言さ
れている。モノクローナル抗体産生の場合には、特定の
抗体を合成する能力は、免疫感作された供与動物から採
取された免疫担当細胞（immunocompetent cell）（通常
脾臓細胞）から誘導され、一方細胞培養液中で連続的に
分裂する能力はその他の融合相手、腫瘍細胞系（しばし
ばミエローマ）により与えられる。初期の融合は、ミエ
ローマ細胞系もまたモノクローナル抗体を産生するとい
う事実により複雑にされていた。この様にハイブリッド
はしばしば２タイプのモノクローナル抗体、一方はミエ
ローマ起源のものおよび他方は免疫担当細胞の遺伝情報
により導かられたものを産生する。その後、それら自身
のモノクローナルを産生できない腫瘍細胞系、例えばSP
210−Ag14またはX63−Ag8.653が使用され、それにより
生成した融合物の分析が単純になった。
は親細胞のタイプの両方の特徴を示すという観察に基づ
いてハイブリドーマ／モノクローナル法の原理が予言さ
れている。モノクローナル抗体産生の場合には、特定の
抗体を合成する能力は、免疫感作された供与動物から採
取された免疫担当細胞（immunocompetent cell）（通常
脾臓細胞）から誘導され、一方細胞培養液中で連続的に
分裂する能力はその他の融合相手、腫瘍細胞系（しばし
ばミエローマ）により与えられる。初期の融合は、ミエ
ローマ細胞系もまたモノクローナル抗体を産生するとい
う事実により複雑にされていた。この様にハイブリッド
はしばしば２タイプのモノクローナル抗体、一方はミエ
ローマ起源のものおよび他方は免疫担当細胞の遺伝情報
により導かられたものを産生する。その後、それら自身
のモノクローナルを産生できない腫瘍細胞系、例えばSP
210−Ag14またはX63−Ag8.653が使用され、それにより
生成した融合物の分析が単純になった。
もう１つの技術的な重要性は、２タイプの親細胞から
の成功した融合体（ハイブリッド細胞）を選択するため
の理論を含む。日常的に各タイプの100万またはそれ以
上の細胞が融合プロトコールにおいて使用され、そして
融合は100％の頻度では起こらないから、融合していな
いまたは自己融合した親の高いバックグラウンドから融
合物を回収しようとする仕事は非常に困難である。上記
したように、ハイブリドーマは、短寿命抗体産生（脾
臓）細胞と長寿命ミエローマ細胞との融合により形成さ
れる。所望の結果は抗体を産生する長寿命細胞系であ
る。脾臓細胞は培養液中で有限の寿命を有するから、全
ての非融合または自己融合脾臓細胞が死ぬまで適当な期
間単に待てば良いが、しかしながら、長寿命抗体非産生
細胞から長寿命抗体非産生細胞を生成した集団から依然
として回収しなければならない。ハイブリッド細胞の選
択のための一般的な手段はいわゆるHAT−選択システム
である。このシステムは酵素ヒポキサンチン−グアニン
−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）の使用
を含む。この酵素は、哺乳類細胞のプリン回収経路にお
いて機能する。これらの細胞は新たに（de novo）プリ
ンを合成することもできる。ほとんどの条件下で、両方
の経路はおそらくある程度作動する。細胞がHGPRTを欠
く場合、回収経路はブロックされ、そしてプリンは非プ
リン材料から製造されるに違いない。
の成功した融合体（ハイブリッド細胞）を選択するため
の理論を含む。日常的に各タイプの100万またはそれ以
上の細胞が融合プロトコールにおいて使用され、そして
融合は100％の頻度では起こらないから、融合していな
いまたは自己融合した親の高いバックグラウンドから融
合物を回収しようとする仕事は非常に困難である。上記
したように、ハイブリドーマは、短寿命抗体産生（脾
臓）細胞と長寿命ミエローマ細胞との融合により形成さ
れる。所望の結果は抗体を産生する長寿命細胞系であ
る。脾臓細胞は培養液中で有限の寿命を有するから、全
ての非融合または自己融合脾臓細胞が死ぬまで適当な期
間単に待てば良いが、しかしながら、長寿命抗体非産生
細胞から長寿命抗体非産生細胞を生成した集団から依然
として回収しなければならない。ハイブリッド細胞の選
択のための一般的な手段はいわゆるHAT−選択システム
である。このシステムは酵素ヒポキサンチン−グアニン
−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）の使用
を含む。この酵素は、哺乳類細胞のプリン回収経路にお
いて機能する。これらの細胞は新たに（de novo）プリ
ンを合成することもできる。ほとんどの条件下で、両方
の経路はおそらくある程度作動する。細胞がHGPRTを欠
く場合、回収経路はブロックされ、そしてプリンは非プ
リン材料から製造されるに違いない。
化学物質８−アザグアニンは、プリングアニンとして
擬装し得、そしてグアニンの正常な反応のいくつかにお
いてそれを置き換え得る非代謝産物である。アザグアニ
ンをDNA内に組込むと、正常な成長パターンは妨害さ
れ、そして細胞死を導く。アザグアニンは回収されるに
違いないから、HGPRT活性を欠く細胞はアザグアニンを
利用することができず、そしてその存在下で成長するで
あろう。
擬装し得、そしてグアニンの正常な反応のいくつかにお
いてそれを置き換え得る非代謝産物である。アザグアニ
ンをDNA内に組込むと、正常な成長パターンは妨害さ
れ、そして細胞死を導く。アザグアニンは回収されるに
違いないから、HGPRT活性を欠く細胞はアザグアニンを
利用することができず、そしてその存在下で成長するで
あろう。
同じ酵素で操作するが、しかしHGPRT陽性細胞が選択
されるという逆の考えで操作する選択的システムは、J.
M.Little field（Science.145:709,1964）により記載さ
れている。それはHATと呼ばれ、そしてヒポキサンチ
ン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する（HAT培
地）。アミノプテリンは新たなプリン合成およびチミジ
レートを形成するためのデオキシウリジレートのメチル
化を妨げる非代謝産物である。アミノプテリンが新たな
プリン生合成を阻害する一方、チミジンがデオキシウリ
ジレートのメチル化を必要としないという事実におい
て、ヒポキサンチンは回収し得るプリンとして働き得
る。このようにアミノプテリンの存在下で陽性のHGPRT
活性を有する細胞は増殖し、一方陰性のHGPRT活性を有
する細胞は死ぬであろう。
されるという逆の考えで操作する選択的システムは、J.
M.Little field（Science.145:709,1964）により記載さ
れている。それはHATと呼ばれ、そしてヒポキサンチ
ン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する（HAT培
地）。アミノプテリンは新たなプリン合成およびチミジ
レートを形成するためのデオキシウリジレートのメチル
化を妨げる非代謝産物である。アミノプテリンが新たな
プリン生合成を阻害する一方、チミジンがデオキシウリ
ジレートのメチル化を必要としないという事実におい
て、ヒポキサンチンは回収し得るプリンとして働き得
る。このようにアミノプテリンの存在下で陽性のHGPRT
活性を有する細胞は増殖し、一方陰性のHGPRT活性を有
する細胞は死ぬであろう。
本発明による選択のために使用されるハイブリッド系
において、ミエローマ細胞は好ましくはアザグアニンに
耐性であり、そしてアミノプテリンに感受性であり、即
ちそれらはHGPRT陰性である。このように、それらはア
ミノプテリンの存在下で死ぬであろう。抗体産生細胞は
HGPRT陽性である。細胞を融合し、そしてそれらをアザ
グアニンを含まないHAT培地（HT培地）中で成長させる
ことにより、増殖系を構成するミエローマ細胞はHGPRT
活性が存在する場合に成長し得るだけで、そしてこの活
性はHGPRT陽性細胞系により供給されなければならない
から、成功裡に融合した細胞は選択される。抗体産生HG
PRT陽性細胞系は、この培地中で殺されない。それらは
しばらく生存するがしかし増殖しないであろう。
において、ミエローマ細胞は好ましくはアザグアニンに
耐性であり、そしてアミノプテリンに感受性であり、即
ちそれらはHGPRT陰性である。このように、それらはア
ミノプテリンの存在下で死ぬであろう。抗体産生細胞は
HGPRT陽性である。細胞を融合し、そしてそれらをアザ
グアニンを含まないHAT培地（HT培地）中で成長させる
ことにより、増殖系を構成するミエローマ細胞はHGPRT
活性が存在する場合に成長し得るだけで、そしてこの活
性はHGPRT陽性細胞系により供給されなければならない
から、成功裡に融合した細胞は選択される。抗体産生HG
PRT陽性細胞系は、この培地中で殺されない。それらは
しばらく生存するがしかし増殖しないであろう。
このように、細胞をHAT培地中で融合することによ
り、ミエローマ細胞および抗体産生細胞はハイブリッド
細胞を産生するのに十分長く成長することができるが、
しかしハイブリッド細胞だけが生き残りそして増殖する
ことができる系がつくられる。選択の後、各々のハイブ
リドーマクローンを次に重要な特定の抗体を産生する能
力を求めてスクリーニングする。
り、ミエローマ細胞および抗体産生細胞はハイブリッド
細胞を産生するのに十分長く成長することができるが、
しかしハイブリッド細胞だけが生き残りそして増殖する
ことができる系がつくられる。選択の後、各々のハイブ
リドーマクローンを次に重要な特定の抗体を産生する能
力を求めてスクリーニングする。
ハイブリドーマ／モノクローナル抗体法は、夥しく成
功しており、米国特許商標庁の分離システム内でサブク
ラス全体をモノクローナル抗体（935/100）に対して与
えていることは一つの目安である。モノクローナル抗体
法の分野における活動の例は、ウイルスに対するモノク
ローナル抗体を産生する方法に関する米国特許第419626
5号、ハイブリドーマを培養する方法および雑種形成を
増加させる方法に関する米国特許第4404279号および免
疫感作に先立ち、抗原調製物がある種のモノクローナル
抗体で予備吸収されるモノクローナル抗体を作成する方
法に関する米国特許第4427653号である。決して完全な
リストではないけれどモノクローナル抗体は下記の抗原
に対して開発されている：トレポネマ パリダム〔Trep
onema pallidum（EPO−83302898.8）〕、ヘパティティ
ス抗原〔hepatitis antigens（EPO−83103858.3）〕、
アンチ−Ｈ−Ｙ〔anti−Ｈ−Y.（EPO−83301214.
9）〕、レンズ上皮組織細胞（83301176.0）、ガン胎児
性抗原（PTC W081101469）、ウロキナーゼ（EPO−8310
0190.4）、ヘルペス（EPO−83400074.7）、ラット肝細
胞（82306409.2）、シストソーマ マンソニ〔Schistos
oma mansoni（PCT W083/01837）〕、レイシュ マニア
〔Leishmania（PCT−W083/01785）〕、トランスフェリ
ンレセプターグリコプロテイン（EPO−82305658.5）、
リウマトイド因子（PCT W083/01118）、ヒト腎臓ガン
の細胞表面抗原（EPO−83107355.8）、アルファインタ
ーフェロン（PCT W081/02899）、Ｔ細胞抗原（EPO−81
300047.8）、ヒトサプレッサーＴ細胞（EPO−80304348.
8）。
功しており、米国特許商標庁の分離システム内でサブク
ラス全体をモノクローナル抗体（935/100）に対して与
えていることは一つの目安である。モノクローナル抗体
法の分野における活動の例は、ウイルスに対するモノク
ローナル抗体を産生する方法に関する米国特許第419626
5号、ハイブリドーマを培養する方法および雑種形成を
増加させる方法に関する米国特許第4404279号および免
疫感作に先立ち、抗原調製物がある種のモノクローナル
抗体で予備吸収されるモノクローナル抗体を作成する方
法に関する米国特許第4427653号である。決して完全な
リストではないけれどモノクローナル抗体は下記の抗原
に対して開発されている：トレポネマ パリダム〔Trep
onema pallidum（EPO−83302898.8）〕、ヘパティティ
ス抗原〔hepatitis antigens（EPO−83103858.3）〕、
アンチ−Ｈ−Ｙ〔anti−Ｈ−Y.（EPO−83301214.
9）〕、レンズ上皮組織細胞（83301176.0）、ガン胎児
性抗原（PTC W081101469）、ウロキナーゼ（EPO−8310
0190.4）、ヘルペス（EPO−83400074.7）、ラット肝細
胞（82306409.2）、シストソーマ マンソニ〔Schistos
oma mansoni（PCT W083/01837）〕、レイシュ マニア
〔Leishmania（PCT−W083/01785）〕、トランスフェリ
ンレセプターグリコプロテイン（EPO−82305658.5）、
リウマトイド因子（PCT W083/01118）、ヒト腎臓ガン
の細胞表面抗原（EPO−83107355.8）、アルファインタ
ーフェロン（PCT W081/02899）、Ｔ細胞抗原（EPO−81
300047.8）、ヒトサプレッサーＴ細胞（EPO−80304348.
8）。
植物の病気に関して、Hsu,H.T.,et al.（ASM News 50
（３）:99−101,1984）は、モノクローナル抗体が開発
された18の植物ウイルス種を挙げており、カーネーショ
ンエッチリングウイルス（carnation etched ring viru
s）、ジャガイモ葉ロールウイルス（potato leaf roll
virus）、インゲン南部モザイクウイルス（southern be
an mosaic virus）、タバコモザイクウイルス（tobacco
mosaic virus）、トマトリングスポットウイルス（tom
ato ringspot virus）およびチューリップブレーキング
ウイルス（tulip breaking virus）が含まれる。
（３）:99−101,1984）は、モノクローナル抗体が開発
された18の植物ウイルス種を挙げており、カーネーショ
ンエッチリングウイルス（carnation etched ring viru
s）、ジャガイモ葉ロールウイルス（potato leaf roll
virus）、インゲン南部モザイクウイルス（southern be
an mosaic virus）、タバコモザイクウイルス（tobacco
mosaic virus）、トマトリングスポットウイルス（tom
ato ringspot virus）およびチューリップブレーキング
ウイルス（tulip breaking virus）が含まれる。
菌類の生物に対するモノクローナル抗体は、ヒトの病
気の診断のための道具として主に開発されてきた。例え
ば英国特許出願第2138444A号および同第2138445A号は、
夫々カンジタ（Candida）およびアスペルギラス（Asper
gillus）と反応性であるモノクローナル抗体に関する。
気の診断のための道具として主に開発されてきた。例え
ば英国特許出願第2138444A号および同第2138445A号は、
夫々カンジタ（Candida）およびアスペルギラス（Asper
gillus）と反応性であるモノクローナル抗体に関する。
フィトフソーラ属の菌類と特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体およびその産生のための方法が、本明細書で
開示されている。この抗体はフィトフソーラ感染の広い
範囲の検出に特に有用である。
ーナル抗体およびその産生のための方法が、本明細書で
開示されている。この抗体はフィトフソーラ感染の広い
範囲の検出に特に有用である。
ポリクローナル抗血清はフィトフソーラ種のウイルス
に対して産生されたが、これは分類学上の疑問を解決す
るためであり〔D.M.Halsall（1976）,J.Gen.Microbiol.
94:149−158〕、宿主寄生虫相互作用の種々の面を研究
するためであり〔P.Moesta.H.Grisebach and E.Zeigler
（1983）Eu.J.Cell Boil.31:167−169〕、そして病原の
生態学を研究するためである〔J.D.Mac Donald and J.
M.Duniway（1979）,Phytopathology69:436−441〕。
に対して産生されたが、これは分類学上の疑問を解決す
るためであり〔D.M.Halsall（1976）,J.Gen.Microbiol.
94:149−158〕、宿主寄生虫相互作用の種々の面を研究
するためであり〔P.Moesta.H.Grisebach and E.Zeigler
（1983）Eu.J.Cell Boil.31:167−169〕、そして病原の
生態学を研究するためである〔J.D.Mac Donald and J.
M.Duniway（1979）,Phytopathology69:436−441〕。
モノクローナル抗体はAyer等〔Arnetzen,C.and Ryan,
C.（編）Molecular Strategies for Crop Protection−
UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology.N
ew Series,Vol.48（1986）ニューヨーク:Alan Liss社、
第447頁;Goodell,等（1985）:Key.J.L.,Kosuge,T.
（編）;Cellular and Molecular Biology of Plant Str
ess,UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biolog
y,New Series,Vol.22,ニューヨーク:Alan Liss社、P.44
7〕により、宿主の大豆植物体における耐性応答の誘導
に関係する種特異性成分を明らかにする不成功の試みに
おけるフィトフソーラ メガスペルマ グリシネア特別
型（P.megasperma f.sp.glycinea）の菌糸体の細胞外グ
リコプロテインまたは精製細胞壁に対して産生された。
Hardham等（Exp.Mycol.9:265−268,1985）はモノクロー
ナル抗体をフィトフソーラ シンナモミ（P.cinnamom
i.）のグルタルアルデヒド／パラホルムアルデヒド固定
精胞子または被のうされた精胞子にまで高めた。様々な
程度の特異性を有するモノクローナル抗体が産生され
た。これらのうちで植物における病気の検出に関連して
用いられたものはなかった。
C.（編）Molecular Strategies for Crop Protection−
UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology.N
ew Series,Vol.48（1986）ニューヨーク:Alan Liss社、
第447頁;Goodell,等（1985）:Key.J.L.,Kosuge,T.
（編）;Cellular and Molecular Biology of Plant Str
ess,UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biolog
y,New Series,Vol.22,ニューヨーク:Alan Liss社、P.44
7〕により、宿主の大豆植物体における耐性応答の誘導
に関係する種特異性成分を明らかにする不成功の試みに
おけるフィトフソーラ メガスペルマ グリシネア特別
型（P.megasperma f.sp.glycinea）の菌糸体の細胞外グ
リコプロテインまたは精製細胞壁に対して産生された。
Hardham等（Exp.Mycol.9:265−268,1985）はモノクロー
ナル抗体をフィトフソーラ シンナモミ（P.cinnamom
i.）のグルタルアルデヒド／パラホルムアルデヒド固定
精胞子または被のうされた精胞子にまで高めた。様々な
程度の特異性を有するモノクローナル抗体が産生され
た。これらのうちで植物における病気の検出に関連して
用いられたものはなかった。
その他のモノクローナル抗体の存在にもかかわらず、
現在まで罹病した植物におけるフィトフソーラ感染の検
出ための診断試験は存在していない。このことは少なく
とも部分的には、全てのモノクローナル抗体が検定の最
も普通のタイプ、即ち二抗体検定（duble antibody ass
ay）における使用に適するものではないことに起因する
であろう。抗体がこの特定の目的のために適当でない様
々な理由がある。例えば、関与する抗原を正確に検出す
るために、第二の抗体を第一の抗体とは異なるエピトー
プ（epitope）に結合させなければならないか、または
この第二の抗体は多重エピトープに対して検出されなけ
ればならない。また、抗体はフィトフソーラ感染植物組
織に関連する抗原を検出することができなければならな
い。培養された生物に存在するが、しかし感染植物組織
に存在しないか、または診断されない抗原決定基に対す
る抗体を産生することは珍しいことではない。最後に、
ある種の抗体は長期（例えば24時間）の実験室条件下で
フィトフソーラを検出し得るかも知れないが、しかし市
販されていて実現可能な免疫検定法のタイプ、即ち約20
分以内に正確な陽性または陰性の応答を行うであろう方
法において十分検出することはできない。このような状
態で、診断用試験キットの用途のためにスクリーニング
されたモノクローナル抗体が迅速で経済的な二抗体検定
法における使用に必要な特徴を有することが証明された
という記載は全くない。
現在まで罹病した植物におけるフィトフソーラ感染の検
出ための診断試験は存在していない。このことは少なく
とも部分的には、全てのモノクローナル抗体が検定の最
も普通のタイプ、即ち二抗体検定（duble antibody ass
ay）における使用に適するものではないことに起因する
であろう。抗体がこの特定の目的のために適当でない様
々な理由がある。例えば、関与する抗原を正確に検出す
るために、第二の抗体を第一の抗体とは異なるエピトー
プ（epitope）に結合させなければならないか、または
この第二の抗体は多重エピトープに対して検出されなけ
ればならない。また、抗体はフィトフソーラ感染植物組
織に関連する抗原を検出することができなければならな
い。培養された生物に存在するが、しかし感染植物組織
に存在しないか、または診断されない抗原決定基に対す
る抗体を産生することは珍しいことではない。最後に、
ある種の抗体は長期（例えば24時間）の実験室条件下で
フィトフソーラを検出し得るかも知れないが、しかし市
販されていて実現可能な免疫検定法のタイプ、即ち約20
分以内に正確な陽性または陰性の応答を行うであろう方
法において十分検出することはできない。このような状
態で、診断用試験キットの用途のためにスクリーニング
されたモノクローナル抗体が迅速で経済的な二抗体検定
法における使用に必要な特徴を有することが証明された
という記載は全くない。
驚くべきことに、上記の問題点および障害が本発明の
範囲内で簡単な方法、即ちフィトフソーラ感染の免疫学
的検出のために本発明に係るハイブリドーマにより産生
されるモノクローナル抗体を使用することにより克服す
ることができた。
範囲内で簡単な方法、即ちフィトフソーラ感染の免疫学
的検出のために本発明に係るハイブリドーマにより産生
されるモノクローナル抗体を使用することにより克服す
ることができた。
特に本発明はフィトフソーラの少なくとも１種の株と
反応するがしかしピチウムの株との反応を実質的に示さ
ないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関
し、そして該ハイブリドーマを産生する方法にも関す
る。
反応するがしかしピチウムの株との反応を実質的に示さ
ないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関
し、そして該ハイブリドーマを産生する方法にも関す
る。
抗体は二抗体検定法を用いて罹病組織中のフィトフソ
ーラを検出することもできる。また、フィトフソーラの
少なくとも１種の株と反応するがしかしピチウムの株と
の反応を実質的に示さないモノクローナル抗体を産生す
る前記ハイブリドーマの突然変異体および変種も本発明
は含む、この突然変異体および変種は公知の方法により
本発明の出発材料から容易に産生され得る。
ーラを検出することもできる。また、フィトフソーラの
少なくとも１種の株と反応するがしかしピチウムの株と
の反応を実質的に示さないモノクローナル抗体を産生す
る前記ハイブリドーマの突然変異体および変種も本発明
は含む、この突然変異体および変種は公知の方法により
本発明の出発材料から容易に産生され得る。
本明細書において使用されているように、発明の詳細
な説明および特許請求の範囲において、「と反応する」
または「反応」という表現は、特定の抗原、この場合に
はフィトフソーラ属の抗原と二元錯体を形成する抗体の
能力（またはそれらの欠如）を云う。
な説明および特許請求の範囲において、「と反応する」
または「反応」という表現は、特定の抗原、この場合に
はフィトフソーラ属の抗原と二元錯体を形成する抗体の
能力（またはそれらの欠如）を云う。
本発明はまた、そのように産生された抗体並びに本発
明のモノクローナル抗体を試薬として用いるフィトフソ
ーラ感染の検出のための方法およびキットにも関する。
明のモノクローナル抗体を試薬として用いるフィトフソ
ーラ感染の検出のための方法およびキットにも関する。
本発明はまた前記モノクローナル抗体を産生するため
の方法も含む。
の方法も含む。
さらに実施態様において、本発明は、 ａ） 試料中の抗原と、該抗原と反応し得るモノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体との二元錯体（bina
ry complex）を形成し、 ｂ） 該二元錯体を、第二のモノクローナル抗体または
ポリクローナル抗体と接触させることにより三元錯体
（tertiary complex）を形成し、 ｃ） 所望により第三の抗体に結合させても良い分析的
に検出可能な試薬により産生される検出可能な信号を観
察することにより前記三元錯体の存在を検出する、 ことからなり、 但し、前記抗体の少なくとも１種が本発明に係る抗体
であることを特徴とするフィトフソーラ抗原を含有する
試料中のフィトフソーラ抗原の存在を検出する方法を提
供するものである。
ナル抗体またはポリクローナル抗体との二元錯体（bina
ry complex）を形成し、 ｂ） 該二元錯体を、第二のモノクローナル抗体または
ポリクローナル抗体と接触させることにより三元錯体
（tertiary complex）を形成し、 ｃ） 所望により第三の抗体に結合させても良い分析的
に検出可能な試薬により産生される検出可能な信号を観
察することにより前記三元錯体の存在を検出する、 ことからなり、 但し、前記抗体の少なくとも１種が本発明に係る抗体
であることを特徴とするフィトフソーラ抗原を含有する
試料中のフィトフソーラ抗原の存在を検出する方法を提
供するものである。
好ましくは、分析的検出可能な試薬は第二の抗体に結
合させるが、しかしその代りに第三の抗免疫グロブリン
抗体に結合させても良い。
合させるが、しかしその代りに第三の抗免疫グロブリン
抗体に結合させても良い。
最後の実施態様において、本発明は、 ａ） フィトフソーラと抗原と二元錯体を形成し得る第
一のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を固
定している固体支持体、および ｂ） 前記二元錯体との反応により三元錯体を形成し得
る第二の抗体からなる二元錯体検出手段、 をその中に密閉して収めるために区画に分けられたキャ
ーリヤーからなり、 但し前記抗体の少なくとも１種は本発明に係る抗体で
あることを特徴とする植物におけるフィトフソーラ感染
の免疫学的診断のためのキットを提供する。
一のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を固
定している固体支持体、および ｂ） 前記二元錯体との反応により三元錯体を形成し得
る第二の抗体からなる二元錯体検出手段、 をその中に密閉して収めるために区画に分けられたキャ
ーリヤーからなり、 但し前記抗体の少なくとも１種は本発明に係る抗体で
あることを特徴とする植物におけるフィトフソーラ感染
の免疫学的診断のためのキットを提供する。
本発明は、フィトフソーラ メガスペルマ グリシネ
ア特別型（Phytopthora megasperma f.sp.glycinea）に
対するモノクローナル抗体の製造方法、モノクローナル
抗体それ自体、該抗体を産生し得るハイブリドーマ細胞
系、該ハイブリドーマ細胞系の製造方法並びに植物組織
内のフィトフソーラ感染を診断するために前記モノクロ
ーナル抗体を使用する方法およびキットに関する。
ア特別型（Phytopthora megasperma f.sp.glycinea）に
対するモノクローナル抗体の製造方法、モノクローナル
抗体それ自体、該抗体を産生し得るハイブリドーマ細胞
系、該ハイブリドーマ細胞系の製造方法並びに植物組織
内のフィトフソーラ感染を診断するために前記モノクロ
ーナル抗体を使用する方法およびキットに関する。
上の記載から、フィトフソーラに対するモノクローナ
ル抗体が公知であることは明らかであるけれども、フィ
トフソーラをその場で（in sutu）、即ち罹病した植物
組織内で検出するための診断試験キットにおいて前記の
抗体を使用することはこれまで知られていなかった。問
題点の一部は、利用できる抗体の全てがピチウム（Pyth
ium）よりフィトフソーラに必要な特異性を有するとは
限らないということに起因している。さらに必要な特異
性を有する抗体でさえも、全てが診断用試験キットに使
用しうるとは限らない。好ましい試験は、二抗体系がお
そらく罹病した組織に直接適用されるものである。フィ
トフソーラ特異性抗体、好ましくは固体支持体上にある
該抗体は、植物組織に適用され、そして次いで第二の標
識抗体がフィトフソーラ抗原−抗体錯体の存在を同定す
るために添加される。驚くべきことに、試験された従来
の公知のフィトフソーラ抗体はこのタイプの検定法にお
いてフィトフソーラを正確に検出することに全く成功し
なかった。しかしながら本発明の抗体はその他の公知の
抗体とは異なり、二抗体系を用いた場合に罹病組織にフ
ィトフソーラを検出することができる。
ル抗体が公知であることは明らかであるけれども、フィ
トフソーラをその場で（in sutu）、即ち罹病した植物
組織内で検出するための診断試験キットにおいて前記の
抗体を使用することはこれまで知られていなかった。問
題点の一部は、利用できる抗体の全てがピチウム（Pyth
ium）よりフィトフソーラに必要な特異性を有するとは
限らないということに起因している。さらに必要な特異
性を有する抗体でさえも、全てが診断用試験キットに使
用しうるとは限らない。好ましい試験は、二抗体系がお
そらく罹病した組織に直接適用されるものである。フィ
トフソーラ特異性抗体、好ましくは固体支持体上にある
該抗体は、植物組織に適用され、そして次いで第二の標
識抗体がフィトフソーラ抗原−抗体錯体の存在を同定す
るために添加される。驚くべきことに、試験された従来
の公知のフィトフソーラ抗体はこのタイプの検定法にお
いてフィトフソーラを正確に検出することに全く成功し
なかった。しかしながら本発明の抗体はその他の公知の
抗体とは異なり、二抗体系を用いた場合に罹病組織にフ
ィトフソーラを検出することができる。
本発明において有用であるモノクローナル抗体は免疫
グロブリンの比較的まれなサブクラス、IgG2bと命名さ
れるサブクラスに属する。このサブクラスの抗体は、そ
れらが低いイオン強度で溶液から沈澱するので、分離お
よび精製することが特に容易である。本発明に係る適当
な抗体は、フィトフソーラ属内で広範囲の反応性を有
し、そしてフィトフソーラの少なくとも１株、好ましく
は少なくとも５株、そして最も好ましくは少なくとも15
株と、ピチウムの株と実質的に反応せずに反応し得る
（第３表参照）。
グロブリンの比較的まれなサブクラス、IgG2bと命名さ
れるサブクラスに属する。このサブクラスの抗体は、そ
れらが低いイオン強度で溶液から沈澱するので、分離お
よび精製することが特に容易である。本発明に係る適当
な抗体は、フィトフソーラ属内で広範囲の反応性を有
し、そしてフィトフソーラの少なくとも１株、好ましく
は少なくとも５株、そして最も好ましくは少なくとも15
株と、ピチウムの株と実質的に反応せずに反応し得る
（第３表参照）。
上記の要求の全てを満足させる好ましいモノクローナ
ル抗体は、マリーランド、ロックビルにあるアメリカ
タイプ カルチャー コレクションに寄託したハイブリ
ドーマにより産生され、そして承認番号HB9353（pH483
0）を有する。pH4830はフィトフソーラ感染の存在のそ
の場での試験のための診断用キットにおいて使用のため
の好ましい抗体である。
ル抗体は、マリーランド、ロックビルにあるアメリカ
タイプ カルチャー コレクションに寄託したハイブリ
ドーマにより産生され、そして承認番号HB9353（pH483
0）を有する。pH4830はフィトフソーラ感染の存在のそ
の場での試験のための診断用キットにおいて使用のため
の好ましい抗体である。
本発明は、罹病組織にフィトフソーラ感染を検出する
ためのシステムにおいて上記のモノクローナル抗体の使
用を意図する。従って、生物が生息していると疑われて
いる植物材料の試料を、検出されるべき生物の抗原決定
基と特異的に反応する第一の抗体と接触させる。好まし
くは抗体は固体支持体例えば微量滴定板（microtiter p
late）の壁（wall）上に固定される。抗体はフィトフソ
ーラと反応するであろうモノクローナル抗体であって
も、またはポリクローナル血清の成分であっても良い。
洗浄することにより未反応の物質を除去した後、生成し
た二元錯体（抗原−抗体錯体）を、検出されるべき抗原
に対して特異的に反応性であるモノクローナル抗体また
はポリクローナル抗体と接触させる。固定化二元錯体を
第二のモノクローナル抗体と接触させることにより、三
元錯体（抗体−抗原−抗体）が形成される。三元錯体の
形成に使用される抗体の少なくとも１種は本発明に係る
抗体でなければならない。二元錯体に結合しなかった第
二の抗体を除去するために洗浄後、三元錯体を様々な分
析法により検出し得る。第二の抗体は分析的に検出可能
な試薬で直接標識され得、そして三元錯体はそれにより
生じる信号を検出することにより示される。その代わ
り、免疫検定法は、三元錯体を標識された抗免疫グロブ
リンと反応させ、そしてその反応生成物を引き続いてそ
の検出可能な信号により検出することにより行っても良
い。使用される標識は好ましくは酵素であるが、しかし
その代りにビオチン、放射性同位体、フルオロホア（fl
uorophore）、またはこれらの目的のために慣用の公知
の試薬からなるその他のものであっても良い。
ためのシステムにおいて上記のモノクローナル抗体の使
用を意図する。従って、生物が生息していると疑われて
いる植物材料の試料を、検出されるべき生物の抗原決定
基と特異的に反応する第一の抗体と接触させる。好まし
くは抗体は固体支持体例えば微量滴定板（microtiter p
late）の壁（wall）上に固定される。抗体はフィトフソ
ーラと反応するであろうモノクローナル抗体であって
も、またはポリクローナル血清の成分であっても良い。
洗浄することにより未反応の物質を除去した後、生成し
た二元錯体（抗原−抗体錯体）を、検出されるべき抗原
に対して特異的に反応性であるモノクローナル抗体また
はポリクローナル抗体と接触させる。固定化二元錯体を
第二のモノクローナル抗体と接触させることにより、三
元錯体（抗体−抗原−抗体）が形成される。三元錯体の
形成に使用される抗体の少なくとも１種は本発明に係る
抗体でなければならない。二元錯体に結合しなかった第
二の抗体を除去するために洗浄後、三元錯体を様々な分
析法により検出し得る。第二の抗体は分析的に検出可能
な試薬で直接標識され得、そして三元錯体はそれにより
生じる信号を検出することにより示される。その代わ
り、免疫検定法は、三元錯体を標識された抗免疫グロブ
リンと反応させ、そしてその反応生成物を引き続いてそ
の検出可能な信号により検出することにより行っても良
い。使用される標識は好ましくは酵素であるが、しかし
その代りにビオチン、放射性同位体、フルオロホア（fl
uorophore）、またはこれらの目的のために慣用の公知
の試薬からなるその他のものであっても良い。
検出を促進するために、種々の反応はキットの形態で
供給されても良い。
供給されても良い。
そのキットは典型的には、 （１） フィトフソーラと二元錯体を形成し得る第一の
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を固定し
ている固体支持体、および （２） 第二のモノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体並びに所望により第三の抗体からなる二元錯体検
出手段、 をその中に密閉して収めるために区画に分けられたキャ
ーリヤーからなり、 但し、上記抗体の少なくとも１種は本発明に係る抗体
である。これまでの記載から容易に理解されるように、
第一または第二の抗体のいずれが、本発明のモノクロー
ナル抗体であっても良い。
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を固定し
ている固体支持体、および （２） 第二のモノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体並びに所望により第三の抗体からなる二元錯体検
出手段、 をその中に密閉して収めるために区画に分けられたキャ
ーリヤーからなり、 但し、上記抗体の少なくとも１種は本発明に係る抗体
である。これまでの記載から容易に理解されるように、
第一または第二の抗体のいずれが、本発明のモノクロー
ナル抗体であっても良い。
第二の抗体はそれ自体標識されても良く、または二元
の検出手段は標識され、そして第一の抗体−抗原−第二
の抗体により形成された三元錯体を検出するために使用
し得る第三の抗免疫グロブリン抗体から成っていても良
い。酵素免疫検定法の場合、酵素のための基質もまた含
まれるであろう。
の検出手段は標識され、そして第一の抗体−抗原−第二
の抗体により形成された三元錯体を検出するために使用
し得る第三の抗免疫グロブリン抗体から成っていても良
い。酵素免疫検定法の場合、酵素のための基質もまた含
まれるであろう。
より一般的な記載を説明するために、そして本発明を
よりよく理解するために、特定の実施例に言及し、そし
てこれらは限定する性質のものではない。
よりよく理解するために、特定の実施例に言及し、そし
てこれらは限定する性質のものではない。
実施例1:菌類のタンパク室の抽出方法 250mlフラスコ内で、PDB〔ジャガイモ デキストロー
ス ホールの培地（Potato Dextrose Hohl′s medium
〈Hohl,H.R.1975 Phytopathol.Z.84:18−33.〉）〕50ml
中で菌類を培養した〔フィトフソーラ メガスぺルマ
グリシネア特別型、カウン（Kaun）およびエルウィン
（Erwin）２（P mg）を一般的に用いた〕。１週間
後、菌類の培養体を培地から集め、PBS（燐酸塩緩衝化
食塩水、pH7.4）中で２度洗浄する。菌類の培養体を、
0.5mm/鉛を含まないガラスビーズ〔米国、ニュージャー
ジー、メイウッドのインパンデックス（IMPANDEX）〕24
0mlを含有するDYNO−MILLタイプKDL組織グラインダー
（スイス国、バーゼルのW.A.Bachhofen AG Maschinenfa
brik）の300mlのバッチチャンバー内に移した。バッチ
チャンバーのジャケットを冷却水道水で８℃まで予備冷
却する。抽出物を3000RPMで５分間粉砕し、その後バッ
チチャンバーの内容物を（50ml）ポリスチレンチューブ
に移し、そしてソルバール（Sorvall）RC−5B冷却遠心
分離機中、SS−34ローターを用いて17000RPM（3450g）
で遠心分離した。菌類の上清を分別し、そして使用まで
−20℃で凍結した。試料の総タンパク含量は0.5mg/ml−
2mg/mlだった。
ス ホールの培地（Potato Dextrose Hohl′s medium
〈Hohl,H.R.1975 Phytopathol.Z.84:18−33.〉）〕50ml
中で菌類を培養した〔フィトフソーラ メガスぺルマ
グリシネア特別型、カウン（Kaun）およびエルウィン
（Erwin）２（P mg）を一般的に用いた〕。１週間
後、菌類の培養体を培地から集め、PBS（燐酸塩緩衝化
食塩水、pH7.4）中で２度洗浄する。菌類の培養体を、
0.5mm/鉛を含まないガラスビーズ〔米国、ニュージャー
ジー、メイウッドのインパンデックス（IMPANDEX）〕24
0mlを含有するDYNO−MILLタイプKDL組織グラインダー
（スイス国、バーゼルのW.A.Bachhofen AG Maschinenfa
brik）の300mlのバッチチャンバー内に移した。バッチ
チャンバーのジャケットを冷却水道水で８℃まで予備冷
却する。抽出物を3000RPMで５分間粉砕し、その後バッ
チチャンバーの内容物を（50ml）ポリスチレンチューブ
に移し、そしてソルバール（Sorvall）RC−5B冷却遠心
分離機中、SS−34ローターを用いて17000RPM（3450g）
で遠心分離した。菌類の上清を分別し、そして使用まで
−20℃で凍結した。試料の総タンパク含量は0.5mg/ml−
2mg/mlだった。
実施例2:モノクローナル抗体の製造 この操作はコーラー（Kohler）およびミルスタイン
（Milstein）（1975年）並びにハンメルリンク（Hammer
ling）（1977年）により開発されたものの変形である。
（Milstein）（1975年）並びにハンメルリンク（Hammer
ling）（1977年）により開発されたものの変形である。
試験動物は、ME04609、バーハーバーのジャクリン
ラボラトリー（Jackson Laboratory）から購入した４な
いし５週令のメスのBALB/cJマウスである。最初の注入
はIP注入により与えられ、菌類マイセリア（mycelia）P
mg（フロイントの完全アジュバント0.2ml中に懸濁され
たPBS緩衝液中の抽出されたフィトフソーラ メガスペ
ルマ グリシネア特別型）0.2mlからなる。11ケ月後に
行われた第２回目の注入は、IP注入により行われ、これ
も菌類マイセリアP mg（フロイントの不完全アジュバン
ト0.2mlで懸濁されたPBS緩衝液中の抽出されたフィトフ
ソーラ メガスペルマ グリシネア特別型）0.2mlから
なる。処理動物の尾採血はマウスの血清50μを得るた
めに用いられる。この血清はP mgに対して陽性の活性を
試験する。
ラボラトリー（Jackson Laboratory）から購入した４な
いし５週令のメスのBALB/cJマウスである。最初の注入
はIP注入により与えられ、菌類マイセリア（mycelia）P
mg（フロイントの完全アジュバント0.2ml中に懸濁され
たPBS緩衝液中の抽出されたフィトフソーラ メガスペ
ルマ グリシネア特別型）0.2mlからなる。11ケ月後に
行われた第２回目の注入は、IP注入により行われ、これ
も菌類マイセリアP mg（フロイントの不完全アジュバン
ト0.2mlで懸濁されたPBS緩衝液中の抽出されたフィトフ
ソーラ メガスペルマ グリシネア特別型）0.2mlから
なる。処理動物の尾採血はマウスの血清50μを得るた
めに用いられる。この血清はP mgに対して陽性の活性を
試験する。
実施例3:免疫担当脾臓細胞の分離 最後の注入の７日後、動物を頚部脱臼により殺す。脾
臓を除去し、そしてダルベッコの変形イーグルス培地
（Dulbecco′s Modified Eagles′ Medium）（DMEM）
（Tissue Culture Standards Committee,In Vitro；vo
l.6（２）:63,1970;Dulbecco R and Freeman G,Virol
ogy,8:396,1959）20ml中に置く。脾臓を80メッシュの滅
菌スクリーン上に置き、次いで該脾臓を切断し、DMEMを
潅流させ、そして次いで10c.c.の使い捨てのプラスチッ
クシリンジからの滅菌プランジャーでゆっくりとマッサ
ージする。脾臓細胞抽出の全工程の間、スクリーンをDM
EMでたえまなくすすぐ。内容物を50mlの使い捨ての遠心
管内にピペットで移し、そして1200RPMで10分間で回転
して落とす（遠心分離は室温で行った）。上清をデカン
トし、そして細胞ペレットを90秒間室温で赤血球溶血溶
液（0.83％NH4Cl;0.01M KHCO3;0.1mM EDTA）10mlで洗浄
する。溶血反応をDMEM40mlで希釈することにより停止さ
せる。試料を３分間放置し、そして上清を50mlの遠心管
にピペットで移す。遠心分離後、ペレットをDMEM50mlで
洗浄し、そして再び遠心分離する。最終的なペレットを
DMEM5mlで再懸濁する。脾臓細胞の少量の試料を細胞の
生存を数えるためにおよびチェックするために保持す
る。脾臓細胞の総数は5ml中に７×107細胞である。
臓を除去し、そしてダルベッコの変形イーグルス培地
（Dulbecco′s Modified Eagles′ Medium）（DMEM）
（Tissue Culture Standards Committee,In Vitro；vo
l.6（２）:63,1970;Dulbecco R and Freeman G,Virol
ogy,8:396,1959）20ml中に置く。脾臓を80メッシュの滅
菌スクリーン上に置き、次いで該脾臓を切断し、DMEMを
潅流させ、そして次いで10c.c.の使い捨てのプラスチッ
クシリンジからの滅菌プランジャーでゆっくりとマッサ
ージする。脾臓細胞抽出の全工程の間、スクリーンをDM
EMでたえまなくすすぐ。内容物を50mlの使い捨ての遠心
管内にピペットで移し、そして1200RPMで10分間で回転
して落とす（遠心分離は室温で行った）。上清をデカン
トし、そして細胞ペレットを90秒間室温で赤血球溶血溶
液（0.83％NH4Cl;0.01M KHCO3;0.1mM EDTA）10mlで洗浄
する。溶血反応をDMEM40mlで希釈することにより停止さ
せる。試料を３分間放置し、そして上清を50mlの遠心管
にピペットで移す。遠心分離後、ペレットをDMEM50mlで
洗浄し、そして再び遠心分離する。最終的なペレットを
DMEM5mlで再懸濁する。脾臓細胞の少量の試料を細胞の
生存を数えるためにおよびチェックするために保持す
る。脾臓細胞の総数は5ml中に７×107細胞である。
ミエローマ細胞（アメリカン タイプ カルチャー
コレクションから得られたSP2−０−Ag14を培養液から5
0mlの滅菌した使い捨てのポリプロピレン〔ファルコン
（Falcon）〕チューブに移す。融合のためのミエローマ
細胞を遠心分離する（1200RPM、室温で10分間）。遠心
分離後、上清を清浄なガラスビーカ内に除き、細胞をDM
EMで洗浄し、そして再び遠心分離する。洗浄したミエロ
ーマペレットを含むチューブに対して、脾臓細胞を添加
する。ミエローマおよび脾臓細胞を10mlのピペットおよ
び自動ピペッターを用いてゆっくりと再懸濁し、そして
室温で1200RPM10分間遠心分離する。遠心分離に引き続
き上清をデカントする。
コレクションから得られたSP2−０−Ag14を培養液から5
0mlの滅菌した使い捨てのポリプロピレン〔ファルコン
（Falcon）〕チューブに移す。融合のためのミエローマ
細胞を遠心分離する（1200RPM、室温で10分間）。遠心
分離後、上清を清浄なガラスビーカ内に除き、細胞をDM
EMで洗浄し、そして再び遠心分離する。洗浄したミエロ
ーマペレットを含むチューブに対して、脾臓細胞を添加
する。ミエローマおよび脾臓細胞を10mlのピペットおよ
び自動ピペッターを用いてゆっくりと再懸濁し、そして
室温で1200RPM10分間遠心分離する。遠心分離に引き続
き上清をデカントする。
実施例4:細胞融合 融合培地PEG 1500（B.M.Bioproducts;カタログ番号7
83−641）を37℃まで予め温める。融合培地1mlを、再懸
濁したミエローマおよび脾臓細胞を含むチューブに滴下
して添加する。融合反応の最後の７分間は、PEGをDMEM
で少しずつ希釈する。希釈の終了時にチューブの最終容
量は30mlに到達する。全体の融合期間の間、材料の適当
な混合を確実にするためにチューブを軽くたたく。チュ
ーブを次に遠心分離し（室温で1200RPM10分間）、そし
て上清を除去する。予め温めたHAT培地（33ml）をチュ
ーブに添加し、そして細胞の含有物を10mlのピペットを
用いて再懸濁する。
83−641）を37℃まで予め温める。融合培地1mlを、再懸
濁したミエローマおよび脾臓細胞を含むチューブに滴下
して添加する。融合反応の最後の７分間は、PEGをDMEM
で少しずつ希釈する。希釈の終了時にチューブの最終容
量は30mlに到達する。全体の融合期間の間、材料の適当
な混合を確実にするためにチューブを軽くたたく。チュ
ーブを次に遠心分離し（室温で1200RPM10分間）、そし
て上清を除去する。予め温めたHAT培地（33ml）をチュ
ーブに添加し、そして細胞の含有物を10mlのピペットを
用いて再懸濁する。
細胞を７個の96ウェル（well）微量滴定板〔ギブコウ
エアー セル カルチャー クラスター ディッシュ
（Gibcoware cell culture cluster dish）〕内にプレ
ーティングする。各ウェルに融合したミエローマ／脾臓
材料150μを添加する。微量滴定板の外側のウェル
に、次にHAT培地を満たす。微量滴定板を、ジャケット
に水の入った７％のCO2インキュベーター、温度37℃内
に置く。
エアー セル カルチャー クラスター ディッシュ
（Gibcoware cell culture cluster dish）〕内にプレ
ーティングする。各ウェルに融合したミエローマ／脾臓
材料150μを添加する。微量滴定板の外側のウェル
に、次にHAT培地を満たす。微量滴定板を、ジャケット
に水の入った７％のCO2インキュベーター、温度37℃内
に置く。
細胞を下記の組成のHAT培地で４日毎に調べる。
HAT培地 組成 DMEM（ダルベッコの変形イーグルス培地） 766ml Ｌグルタミン酸塩 10ml ペニシリン／ストレプトマイシン （10000単位/100mlHAT） 10ml アミノプテリン（２×10-5溶液） 4ml ヒポキサンチン／チミジン 10ml HAT培地 組成 IN NaOHチミジン 38.8mg ヒポキサンチン 136.1mg （滅菌水100ml中） ハイクローン ウシ胎児血清 200ml （Hyclone Fetal Bovine Serum カタログ番号Ａ−111−Ｌ） ハイブリドーマのプラークは７ないし10日後に現われ
始める。
始める。
実施例5:ハイブリドーマのスクリーニング 菌類の病原に対する抗体を産生するこれらのハイブリ
ドーマは、エリザフォーマット〔（ELISA format）（例
えばRoitt,et al.Immunology,C.V.Mosby,1985参照）〕
内の調製された菌類の材料フィトフソーラ メガスペル
マ グリシネア特別型（PBS緩衝液中タンパク濃度15μg
/ml、下記参照）を用いることにより同定される。エリ
ザ試験に対して陽性応答を与えるこれらのウエルは、ハ
イブリドーマ細胞の純粋な株が成長し得るように、限界
希釈を行う。限界希釈法は、ハインブリドーマの順次に
希釈した懸濁液を培養することを含む。各希釈系列は96
ウェル培養プレートの６ないし12ウェルに並べられる。
これらのウェルを次の菌類のタンパク質に対する特異的
な抗体活性を再試験する。陽性のウェルを次に大量培養
のために20mlの培養フラスコに移す。
ドーマは、エリザフォーマット〔（ELISA format）（例
えばRoitt,et al.Immunology,C.V.Mosby,1985参照）〕
内の調製された菌類の材料フィトフソーラ メガスペル
マ グリシネア特別型（PBS緩衝液中タンパク濃度15μg
/ml、下記参照）を用いることにより同定される。エリ
ザ試験に対して陽性応答を与えるこれらのウエルは、ハ
イブリドーマ細胞の純粋な株が成長し得るように、限界
希釈を行う。限界希釈法は、ハインブリドーマの順次に
希釈した懸濁液を培養することを含む。各希釈系列は96
ウェル培養プレートの６ないし12ウェルに並べられる。
これらのウェルを次の菌類のタンパク質に対する特異的
な抗体活性を再試験する。陽性のウェルを次に大量培養
のために20mlの培養フラスコに移す。
5.1 スクリーニングプロトコール（protocol） エリザ−グルタルアルデヒド法 グルタルアルデヒド緩衝液20μを各ウェル〔米国、
カリフォルニア、リッチモンドのバイオラド（Bio Ra
d）社のコースター、エンザイム イムノアッセイ プ
レート（Costar,Enzyme immunoassay plates）に入れ、
そして55℃で３時間培養する。プレートを室温まで冷や
し、そして残っている緩衝液を捨てる。プレートを脱イ
オン水で４度洗浄する。PBS中に希釈した抗原200μ、
pH7.2（抗原濃度10μg/ml）を各ウェル内に分け入れ、
そして４℃で24時間培養する。残っている懸濁液を捨
て、そしてプレートをPBSで８度洗浄する。（モノ）エ
タノールアミン溶液200μを各ウェルに分け入れ、そ
して４℃で20時間培養する。残っている溶液を捨て、そ
してPBSで８度洗浄する。上清試料（ハイブリドーマ細
胞により分泌された抗体浸出物）100μを各ウェルに
入れ、そして湿気を与え33℃で２時間培養する。残って
いる溶液を捨て、そしてプレートをPBSで８度洗浄す
る。KPL ビオチニル化ヤギ抗マウスIgGまたはIgM〔米
国、マリーランドのキルケガードアンドペリー ラボラ
トリーズ社（Kirkegaard and Perry Laboratories In
c.）〕（１％ウシ血清アルブミン（BSA）−希釈剤PBS中
に1:2500に希釈）100μを次に各ウェル内に添加す
る。これらを湿気を与え37℃で0.5時間培養し、溶液を
捨て、そしてプレートをPBSで８度洗浄する。パーオキ
シダーゼ酵素と抱合させたKPLストレプトアビジン（str
eptavidine）（パーオキシダーゼ抱合体；上記のキルケ
ガードアンドペリーラボラトリーズ社）100μを各ウ
ェルに添加し、そして湿気を与え37℃で0.5時間培養す
る。溶液を捨て、そしてプレートをPBSで８度洗浄す
る。OPD基質200μを各ウェル内に入れる。これは室温
で1/2時間培養し、そして吸光度は405nmで読みとる。
カリフォルニア、リッチモンドのバイオラド（Bio Ra
d）社のコースター、エンザイム イムノアッセイ プ
レート（Costar,Enzyme immunoassay plates）に入れ、
そして55℃で３時間培養する。プレートを室温まで冷や
し、そして残っている緩衝液を捨てる。プレートを脱イ
オン水で４度洗浄する。PBS中に希釈した抗原200μ、
pH7.2（抗原濃度10μg/ml）を各ウェル内に分け入れ、
そして４℃で24時間培養する。残っている懸濁液を捨
て、そしてプレートをPBSで８度洗浄する。（モノ）エ
タノールアミン溶液200μを各ウェルに分け入れ、そ
して４℃で20時間培養する。残っている溶液を捨て、そ
してPBSで８度洗浄する。上清試料（ハイブリドーマ細
胞により分泌された抗体浸出物）100μを各ウェルに
入れ、そして湿気を与え33℃で２時間培養する。残って
いる溶液を捨て、そしてプレートをPBSで８度洗浄す
る。KPL ビオチニル化ヤギ抗マウスIgGまたはIgM〔米
国、マリーランドのキルケガードアンドペリー ラボラ
トリーズ社（Kirkegaard and Perry Laboratories In
c.）〕（１％ウシ血清アルブミン（BSA）−希釈剤PBS中
に1:2500に希釈）100μを次に各ウェル内に添加す
る。これらを湿気を与え37℃で0.5時間培養し、溶液を
捨て、そしてプレートをPBSで８度洗浄する。パーオキ
シダーゼ酵素と抱合させたKPLストレプトアビジン（str
eptavidine）（パーオキシダーゼ抱合体；上記のキルケ
ガードアンドペリーラボラトリーズ社）100μを各ウ
ェルに添加し、そして湿気を与え37℃で0.5時間培養す
る。溶液を捨て、そしてプレートをPBSで８度洗浄す
る。OPD基質200μを各ウェル内に入れる。これは室温
で1/2時間培養し、そして吸光度は405nmで読みとる。
5.2 必要な溶液 1. グルタルアルデヒド緩衝液:0.1M炭酸塩緩衝液中の
0.1％グルタルアルデヒド。この炭酸塩緩衝液、pH9.0
は、DI水１当たりNa2CO31.59gおよびNaHCO32.93gから
なる。
0.1％グルタルアルデヒド。この炭酸塩緩衝液、pH9.0
は、DI水１当たりNa2CO31.59gおよびNaHCO32.93gから
なる。
2. PBS:DI水１当たりNaCl8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO
4無水物1.15g、KCl0.2g、pH7.4。
4無水物1.15g、KCl0.2g、pH7.4。
3. （モノ）エタノールアミン水溶液;1mg/ml水溶液（D
I水の1g/）。
I水の1g/）。
4. 抱合体（KPL）:1:2500に希釈;1％BSA（ウシ血清ア
ルブミン）−希釈剤PBS。
ルブミン）−希釈剤PBS。
5. クエン酸ナトリウム緩衝液：脱イオン水500ml中のN
a2HPO47.1g（二塩基性水溶液；脱イオン水500ml中のク
エン酸9.6g。クエン酸水溶液を二塩基性水溶液中にpHが
4.5になるまで加える。
a2HPO47.1g（二塩基性水溶液；脱イオン水500ml中のク
エン酸9.6g。クエン酸水溶液を二塩基性水溶液中にpHが
4.5になるまで加える。
6. OPD基質：クエン酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）20ml
中のOPD8mgおよび過酸化尿素20.0mg。
中のOPD8mgおよび過酸化尿素20.0mg。
5.3 細胞系PH4830（ATCC HB9353）の上清のスクリー
ニング結果 下記の試験は、異なる抗原のパネル（panel）を含む
グルタルアルデヒド調製プレート上で行なわれた。KPL
ヤギ抗−マウスIgG ビオチンストレプトアビジンパー
オキシダーゼが、スクリーニングにおいて使用された抱
合体だった。約0.2より低い吸収は実質的に反応してい
ないと見なされる。
ニング結果 下記の試験は、異なる抗原のパネル（panel）を含む
グルタルアルデヒド調製プレート上で行なわれた。KPL
ヤギ抗−マウスIgG ビオチンストレプトアビジンパー
オキシダーゼが、スクリーニングにおいて使用された抱
合体だった。約0.2より低い吸収は実質的に反応してい
ないと見なされる。
実施例6:結合活性試験 下記の操作は製造したモノクローナル抗体の結合活性
を測定するために行われた。
を測定するために行われた。
試験すべき抗体を、抗体滴定操作において合計1.5O.D
示度となるように見積まれた希釈まで希釈する。希釈溶
液は下記の組成を有する： 抗体希釈緩衝液:pH7.2 成分 量 Na2HPO4 2.19g/1 NaH2PO4 0.56g/1 NaCl 8.76g/1 チメザロール 0.1 g/1 BSA（ウシ血清アルブミン） 1.0 g/1 予め希釈した抗原標準液50mlを各マイクロウェルに添
加し、そして予め希釈した抗体50mlを次いで反復ピペッ
ト（repetition pipet）で各ウェルに添加する。ウェル
を振盪しながら室温で10分間培養する。ウェルを次いで
下記の組成の洗浄溶液で５度洗浄する。
示度となるように見積まれた希釈まで希釈する。希釈溶
液は下記の組成を有する： 抗体希釈緩衝液:pH7.2 成分 量 Na2HPO4 2.19g/1 NaH2PO4 0.56g/1 NaCl 8.76g/1 チメザロール 0.1 g/1 BSA（ウシ血清アルブミン） 1.0 g/1 予め希釈した抗原標準液50mlを各マイクロウェルに添
加し、そして予め希釈した抗体50mlを次いで反復ピペッ
ト（repetition pipet）で各ウェルに添加する。ウェル
を振盪しながら室温で10分間培養する。ウェルを次いで
下記の組成の洗浄溶液で５度洗浄する。
成分 量 トリス 2.42g/1 NaCl 8.76g/1 チメロザール 0.10g/1 ツイーン80 5.00g/1 HCl（1.ON） 約14.3ml/1 HClを用いて最終pH7.8とする 使用した抱合体は、1:500ダコパッツ（Dakopatts）
〔（ダコパッツA/S,デンマーク）抗マウスIgG西洋ワサ
ビ パーオキシダーゼ抱合体であり；これを各ウェルに
100μの量で添加し、そして室温で約10分間振盪しな
がら培養する。ウェルを再び洗浄し、そして基質100μ
を各ウェルに添加する。基質は下記の組成を有するク
エン酸塩−パーオキシダーゼ緩衝液中に1:25に希釈され
た15mg/ml2,2′−アジノビス（３−エチルベンズチアゾ
リン スルホン酸）（ジアンモニウム塩）（ABTS）スト
ックを有する。
〔（ダコパッツA/S,デンマーク）抗マウスIgG西洋ワサ
ビ パーオキシダーゼ抱合体であり；これを各ウェルに
100μの量で添加し、そして室温で約10分間振盪しな
がら培養する。ウェルを再び洗浄し、そして基質100μ
を各ウェルに添加する。基質は下記の組成を有するク
エン酸塩−パーオキシダーゼ緩衝液中に1:25に希釈され
た15mg/ml2,2′−アジノビス（３−エチルベンズチアゾ
リン スルホン酸）（ジアンモニウム塩）（ABTS）スト
ックを有する。
クエン酸塩−パーオキシダーゼ緩衝液:pH4.0 成分 量 クエン酸H2O 2.5g/85ml 1.0N NaOHでpH4.0に調整 そしてH2O2添加前にH2Oで 容量を100mlとする H2O2（30％） 50μ/100ml 基質の添加後、ウェルを振盪しながら室温で10分間再
び培養する。停止溶液（1.5％弗化ナトリウム50ml）を
各ウェルに次に添加し、そして10秒間混合する。吸光度
を次に405nm−415nmの間で読みとる。投与量−応答曲線
をセミロググラフ上にプロットし、そして最高の発色の
50％減少を引き起こす抗原濃度を決定するために外挿す
る。この値を結合活性の相対値として記録する。
び培養する。停止溶液（1.5％弗化ナトリウム50ml）を
各ウェルに次に添加し、そして10秒間混合する。吸光度
を次に405nm−415nmの間で読みとる。投与量−応答曲線
をセミロググラフ上にプロットし、そして最高の発色の
50％減少を引き起こす抗原濃度を決定するために外挿す
る。この値を結合活性の相対値として記録する。
この操作を本発明に従って製造した抗体で行なった。
本発明の計算された結合活性の例として、抗体番号第48
30はゼロ抗原の50％最高ODで約4.3μg/mlの結合活性を
有する。
本発明の計算された結合活性の例として、抗体番号第48
30はゼロ抗原の50％最高ODで約4.3μg/mlの結合活性を
有する。
実施例7:サブクローニング法 ハイブリドーマ細胞の純粋な株を成長させるように、
エリザ試験に陽性の応答を与えるこれらのウェルは限界
希釈を行う。限界希釈法はハイブリドーマの連続的に希
釈された懸濁液を培養することを含む。各希釈系列を96
ウェル培養プレートの６ないし12ウェルに並べた。これ
らのウェルを次に、菌類のタンパク質に対する特異的抗
体活性を再試験した。陽性のウェルを次いで大量培養の
ために20ml培養フラスコに移した。
エリザ試験に陽性の応答を与えるこれらのウェルは限界
希釈を行う。限界希釈法はハイブリドーマの連続的に希
釈された懸濁液を培養することを含む。各希釈系列を96
ウェル培養プレートの６ないし12ウェルに並べた。これ
らのウェルを次に、菌類のタンパク質に対する特異的抗
体活性を再試験した。陽性のウェルを次いで大量培養の
ために20ml培養フラスコに移した。
7.1 クローン＃PH4830の特徴づけ クローン＃PH4830はフィトフソーラ メガスペルマ
グリシネア特別型に対するIgG2bサブクラスの抗体を分
泌する。
グリシネア特別型に対するIgG2bサブクラスの抗体を分
泌する。
7.2 本発明を実施するにあたり有用な株の寄託 下記のハイブリドーマの生物学的に純粋な培養体の寄
託は、マリーランド ロックビル 12301パークロウン
ドライブ アメリカン タイプ カルチャー コレク
オンに、1987年３月12日に行われ、示される承認暗号は
生存試験の成功の後に割当てられ、そして必要な費用を
払った。前記培養体の利用は、37C.F.R.§1.14および35
U.S.C.§122の下にそれに権利を与えられているコンミ
ッショナーにより決定された人に対して本特許出願が継
続している間可能である。公衆に対する前記培養体の利
用性に関する全ての制限は、出願に基づく特許の認定に
関して、取消されずに取り除かれ、そして前記培養体
は、試料の供与の最も新しい要求の後、少なくとも５年
の期間、およびあらゆる場合において寄託の日の後少な
くとも30年の期間永続的に利用可能に存続するであろ
う。
託は、マリーランド ロックビル 12301パークロウン
ドライブ アメリカン タイプ カルチャー コレク
オンに、1987年３月12日に行われ、示される承認暗号は
生存試験の成功の後に割当てられ、そして必要な費用を
払った。前記培養体の利用は、37C.F.R.§1.14および35
U.S.C.§122の下にそれに権利を与えられているコンミ
ッショナーにより決定された人に対して本特許出願が継
続している間可能である。公衆に対する前記培養体の利
用性に関する全ての制限は、出願に基づく特許の認定に
関して、取消されずに取り除かれ、そして前記培養体
は、試料の供与の最も新しい要求の後、少なくとも５年
の期間、およびあらゆる場合において寄託の日の後少な
くとも30年の期間永続的に利用可能に存続するであろ
う。
培養体が生育しなくなるか、または不注意にも破壊さ
れた場合には、同一の分類学上の種類の生育可能な培養
体に置き代えられるであろう。
れた場合には、同一の分類学上の種類の生育可能な培養
体に置き代えられるであろう。
ハイブリドーマ ATCC番号 Balbcマウス/SP2 ミエローマ ＃PH4830 HB9353 実施例8:菌類の病原体の検出およびそのためのキット 本発明は罹病組織におけるフィトフソーラ感染の検出
のためのシステムにおける上記のモノクローナル抗体の
使用を意図する。従って、生物が生息していると疑われ
る植物材料の試料は、検出されるべき生物の抗原決定基
と特異的に反応性の第一の抗体と接触させる。好ましく
は、抗体は固体の支持体、例えば微量滴定板の壁に固定
化される。抗体はフィトフソーラと反応するであろうモ
ノクローナル抗体であっても、ポリクローナル血清の成
分であっても良い。洗浄により未反応の物質を除去した
後、生成した二元錯体（抗原−抗体錯体）を、検出され
るべき抗原に対して特異的に反応性であるモノクローナ
ル抗体またはポリクローナル抗体と接触させる。固定化
二元錯体を第二のモノクローナル抗体と接触させること
により、三元錯体（抗体−抗原−抗体）が形成される。
三元錯体の形成に使用される抗体の少なくとも１種は本
発明に係る抗体でなければならない。二元錯体に結合し
なかった第二の抗体を除去するために洗浄後、三元錯体
を様々な分析法により検出し得る。第二の抗体は分析的
に検出可能な試薬で直接標識され得、そして三元錯体は
それにより生じる信号を検出することにより示される。
その代わり、免疫検定法は、三元錯体を標識された抗免
疫グロブリンと反応させ、そしてその反応生成物を引き
続いてその検出可能な信号により検出することにより行
っても良い。使用される標識は好ましくは酵素である
が、しかしその代りにビオチン、放射性同位体、フルオ
ロホア、またはこれらの目的のために慣用の公知の試薬
からなるその他のものであっても良い。
のためのシステムにおける上記のモノクローナル抗体の
使用を意図する。従って、生物が生息していると疑われ
る植物材料の試料は、検出されるべき生物の抗原決定基
と特異的に反応性の第一の抗体と接触させる。好ましく
は、抗体は固体の支持体、例えば微量滴定板の壁に固定
化される。抗体はフィトフソーラと反応するであろうモ
ノクローナル抗体であっても、ポリクローナル血清の成
分であっても良い。洗浄により未反応の物質を除去した
後、生成した二元錯体（抗原−抗体錯体）を、検出され
るべき抗原に対して特異的に反応性であるモノクローナ
ル抗体またはポリクローナル抗体と接触させる。固定化
二元錯体を第二のモノクローナル抗体と接触させること
により、三元錯体（抗体−抗原−抗体）が形成される。
三元錯体の形成に使用される抗体の少なくとも１種は本
発明に係る抗体でなければならない。二元錯体に結合し
なかった第二の抗体を除去するために洗浄後、三元錯体
を様々な分析法により検出し得る。第二の抗体は分析的
に検出可能な試薬で直接標識され得、そして三元錯体は
それにより生じる信号を検出することにより示される。
その代わり、免疫検定法は、三元錯体を標識された抗免
疫グロブリンと反応させ、そしてその反応生成物を引き
続いてその検出可能な信号により検出することにより行
っても良い。使用される標識は好ましくは酵素である
が、しかしその代りにビオチン、放射性同位体、フルオ
ロホア、またはこれらの目的のために慣用の公知の試薬
からなるその他のものであっても良い。
検出を促進するために、種々の反応はキットの形態で
供給されても良い。
供給されても良い。
そのキットは典型的には、 （１） フィトフソーラと二元錯体を形成し得る第一の
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を固定し
ている固体支持体、および （２） 第二のモノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体並びに所望により第三の抗体からなる二元錯体検
出手段、 をその中に密閉して収めるために区画に分けられたキャ
ーリヤーからなり、 但し、上記抗体の少なくとも１種は本発明に係る抗体
である。これまでの記載から容易に理解されるように、
第一または第二の抗体のいずれが、本発明のモノクロー
ナル抗体であっても良い。
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を固定し
ている固体支持体、および （２） 第二のモノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体並びに所望により第三の抗体からなる二元錯体検
出手段、 をその中に密閉して収めるために区画に分けられたキャ
ーリヤーからなり、 但し、上記抗体の少なくとも１種は本発明に係る抗体
である。これまでの記載から容易に理解されるように、
第一または第二の抗体のいずれが、本発明のモノクロー
ナル抗体であっても良い。
第二の抗体はそれ自体標識されても良く、または二元
の検出手段は標識され、そして第一の抗体−抗原−第二
の抗体により形成された三元錯体を検出するために使用
し得る第三の抗免疫グロブリン抗体から成っていても良
い。酵素免疫検出法の場合、酵素のための基質もまた含
まれるであろう。
の検出手段は標識され、そして第一の抗体−抗原−第二
の抗体により形成された三元錯体を検出するために使用
し得る第三の抗免疫グロブリン抗体から成っていても良
い。酵素免疫検出法の場合、酵素のための基質もまた含
まれるであろう。
診断用試験キットにおける使用のための適性を評価す
るために、エリザフォーマットにおける本発明の抗体の
含有の特定の例を以下に示す。
るために、エリザフォーマットにおける本発明の抗体の
含有の特定の例を以下に示す。
マウスからの腹水液状物は、単一抗体スクリーニング
法を用いてマイクロウェルモジュール（microwell modu
le）を感作させた抗原に関して活性を試験した。10-4の
希釈は規準外の示度（2.0）を与え、そして10-5の希
釈は415nmで約0.5O.D.の示度を与えた。
法を用いてマイクロウェルモジュール（microwell modu
le）を感作させた抗原に関して活性を試験した。10-4の
希釈は規準外の示度（2.0）を与え、そして10-5の希
釈は415nmで約0.5O.D.の示度を与えた。
抗体はこの腹水液状物から、以下に示すプロティンＡ
アフィニティ クロマトグラフィーを用いて分離され
る。
アフィニティ クロマトグラフィーを用いて分離され
る。
クロマトグラフィーの条件： 1. ゲルーファルマシア（Pharmacia）CL4Bプロティン
Ａ（6.0ml）Ａ 2. トリス/HCl平衡／結合緩衝液pH8.6 3. 酢酸塩溶出緩衝液pH4.3 4. グリシン/HCl再生緩衝液pH2.3 5. ポンプ速度12（約1ml/分） 6. 供給した粗精腹水2.5ml 7. チャート速度5mm/分 8. O.Dのフルスケール0.2 腹水液状物はプロティンＡカラムに通され、そしてIg
G画分をpH4.3でカラムから溶出させる。精製された抗体
の活性は単一抗体スクリーニング法を用いて測定され
る。
Ａ（6.0ml）Ａ 2. トリス/HCl平衡／結合緩衝液pH8.6 3. 酢酸塩溶出緩衝液pH4.3 4. グリシン/HCl再生緩衝液pH2.3 5. ポンプ速度12（約1ml/分） 6. 供給した粗精腹水2.5ml 7. チャート速度5mm/分 8. O.Dのフルスケール0.2 腹水液状物はプロティンＡカラムに通され、そしてIg
G画分をpH4.3でカラムから溶出させる。精製された抗体
の活性は単一抗体スクリーニング法を用いて測定され
る。
精製モノクローナル抗体を酵素炭水化物基の段階的酸
化を用いて西洋サビパーオキシダーゼに抱合し、抗体の
アミノ基に連結する活性アルデヒド基を形成する。抗体
−酵素抱合体は抗原感作マルチウェル上で試験する。
化を用いて西洋サビパーオキシダーゼに抱合し、抗体の
アミノ基に連結する活性アルデヒド基を形成する。抗体
−酵素抱合体は抗原感作マルチウェル上で試験する。
規準外の吸光度の示度（2.0＋）は2.1μgIgG/mlおよ
び0.21μgIgG/mlの濃度で使用される抱合体に対して測
定された。0.369の吸光度の示度は0.021μgIgG/mlの濃
度で行った抱合体に対して測定された。
び0.21μgIgG/mlの濃度で使用される抱合体に対して測
定された。0.369の吸光度の示度は0.021μgIgG/mlの濃
度で行った抱合体に対して測定された。
酵素抱合抗体は二抗体サンドイッチエリザ検定法にお
いてアフィニティ精製したヒツジポリクローナル抗体で
感作されたマルチウェルと共に使用される。使用される
ポリクロナールは、モノクローナル抗体の製造に使用さ
れたものと同じ抗原調製物でヒツジの免疫感作により製
造される。初期のプライム（prime）は、背中の頂部の
一側面に沿って、そしてわき腹内にも注入したアジュバ
ント4mlに乳化させた抗原4mlである。30日の休止期間の
後に、抗原2mlとアジュバント2mlの追加分をプライムと
は背中の逆の側内に注入する。採血をプライムから７な
いし10日に行い、そして次いで全体のサイクル（注入お
よび採血）を繰り返す。粗製ポリクローナル血清はビチ
ウムとは一般に交叉反応するが、しかしその他の非標的
生物に対するスクリーニングにより選択され、そして抗
原アフィニティクロマトグラフィーにより精製される。
いてアフィニティ精製したヒツジポリクローナル抗体で
感作されたマルチウェルと共に使用される。使用される
ポリクロナールは、モノクローナル抗体の製造に使用さ
れたものと同じ抗原調製物でヒツジの免疫感作により製
造される。初期のプライム（prime）は、背中の頂部の
一側面に沿って、そしてわき腹内にも注入したアジュバ
ント4mlに乳化させた抗原4mlである。30日の休止期間の
後に、抗原2mlとアジュバント2mlの追加分をプライムと
は背中の逆の側内に注入する。採血をプライムから７な
いし10日に行い、そして次いで全体のサイクル（注入お
よび採血）を繰り返す。粗製ポリクローナル血清はビチ
ウムとは一般に交叉反応するが、しかしその他の非標的
生物に対するスクリーニングにより選択され、そして抗
原アフィニティクロマトグラフィーにより精製される。
本発明の抗体を試験することに加えて、前記の操作
は、文献（例えばAyers,同上）に前に記載された多くの
モノクローナル抗体を試験するために使用された。試験
はフィトフソーラに感染したおよび健康な大豆、および
病原体の煮沸したおよび煮沸していない純粋な培養体を
含む試料に関して行われた。試験した全ての公知の抗体
のうちで、短期間（即ち、最高20−30分）で罹病組織と
陽性の反応を与え得、そしてこのように診断用試験キッ
トにおける使用に不適性を示すものは何も無かった。抗
体4830との検定の結果を第３表に示す。
は、文献（例えばAyers,同上）に前に記載された多くの
モノクローナル抗体を試験するために使用された。試験
はフィトフソーラに感染したおよび健康な大豆、および
病原体の煮沸したおよび煮沸していない純粋な培養体を
含む試料に関して行われた。試験した全ての公知の抗体
のうちで、短期間（即ち、最高20−30分）で罹病組織と
陽性の反応を与え得、そしてこのように診断用試験キッ
トにおける使用に不適性を示すものは何も無かった。抗
体4830との検定の結果を第３表に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｒ // Ａ６１Ｋ 39/395 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジェームス リッテンバーグ アメリカ合衆国，ペンシルバニア 18944，パーカジー，イー．ロック ロ ード 2360
Claims (25)
- 【請求項１】二抗体免疫検定法において罹病組織中のフ
ィトフソーラを検出でき、フィトフソーラの少なくとも
１種の株と反応するが、しかしピチウムの株との反応を
実質的に示さないモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ。 - 【請求項２】モノクローナル抗体がフィトフソーラの少
なくとも15種の株と反応する請求項１記載のハイブリド
ーマ。 - 【請求項３】モノクローナル抗体がIgG2bサブクラスに
属する請求項１または２のいずれか１項に記載のハイブ
リドーマ。 - 【請求項４】ATCC HB9353の識別特徴を有する請求項１
ないし３のいずれか１項に記載のハイブリドーマ。 - 【請求項５】請求項１ないし４のいずれか１項に記載の
ハイブリドーマの突然変異体および変種であって、二抗
体免疫検定法において罹病組織中のフィトフソーラを検
出でき、フィトフソーラの少なくとも１種の株と反応す
るが、しかしピチウムの株との反応を実質的に示さない
モノクローナル抗体を産生する上記突然変異体および変
種。 - 【請求項６】二抗体免疫検定法において罹病組織中のフ
ィトフソーラを検出でき、フィトフソーラの少なくとも
１種の株と反応するが、しかしピチウムの株との反応を
実質的に示さないモノクローナル抗体。 - 【請求項７】抗体がフィトフソーラの少なくとも15種の
株と反応する請求項６記載の抗体。 - 【請求項８】IgG2bサブクラスに属する請求項６または
７のいずれか１項に記載の抗体。 - 【請求項９】請求項１ないし５のいずれか１項に記載の
ハイブリドーマまたはその突然変異体および変種により
産生されたモノクローナル抗体。 - 【請求項１０】請求項４記載のハイブリドーマにより産
生されたモノクローナル抗体。 - 【請求項１１】ａ）免疫感作された供与動物から採取し
た免疫担当細胞を分離し、 ｂ）該免疫担当細胞を、細胞培養液中で連続的に分裂す
る能力を有する腫瘍細胞系と融合させ、そして ｃ）生成した融合物を分離する、 ことからなる請求項１記載のハイブリドーマを産生する
方法。 - 【請求項１２】前記免疫担当細胞が脾臓細胞である請求
項11記載の方法。 - 【請求項１３】前記腫瘍細胞系がそれら自身のモノクロ
ーナル抗体を産生することができないミエローマ細胞系
である請求項11記載の方法。 - 【請求項１４】前記融合物が、ATCC HB9353の識別特徴
を有する、ハイブリドーマ細胞系Ba1bcマウス/SP2ミエ
ローマ＝PH4830である請求項11記載の方法。 - 【請求項１５】二抗体免疫検定法において罹病組織中の
フィトフソーラを検出でき、フィトフソーラの少なくと
も１種の株と反応するが、しかしピチウムの株との反応
を実質的に示さないモノクローナル抗体を産生する請求
項１ないし５のいずれか１項に記載のハイブリドーマの
試験管内または生体内大量培養からなる請求項６ないし
10のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生す
る方法。 - 【請求項１６】ａ）試料中の抗原と、該抗原と反応し得
る第一のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体
との二元錯体を形成し、 ｂ）該二元錯体を、前記抗原と反応し得る第二のモノク
ローナル抗体またはポリクローナル抗体と接触させるこ
とにより三元錯体を形成し、そして ｃ）所望により第三の抗体に結合させても良い分析的に
検出可能な試薬により産生される検出可能な信号を観察
することにより前記三元錯体の存在を検出することから
なり、 但し、前記抗体の少なくとも１種が、二抗体免疫検定法
において罹病組織中のフィトフソーラを検出でき、フィ
トフソーラの少なくとも１種の株と反応するが、しかし
ピチウムの株との反応を実質的に示さないモノクローナ
ル抗体であることを特徴とするフィトフソーラ抗原を含
有する試料中のフィトフソーラ抗原の存在を検出する方
法。 - 【請求項１７】検出可能な試薬を、（ａ）第二の抗体に
結合するか、または（ｂ）三元錯体と接触させる第三の
抗免疫グロブリン抗体に結合する請求項16記載の方法。 - 【請求項１８】試薬が酵素、放射性同位体、フルオロホ
アまたはビオチンである請求項17記載の方法。 - 【請求項１９】抗体の１種が固体の支持体上に固定され
ている請求項16記載の方法。 - 【請求項２０】抗体の１種がATCC HB9353またはそれら
のクローンもしくはサブクローンにより産生される請求
項16記載の方法。 - 【請求項２１】ａ）フィトフソーラと反応し得る第一の
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を固定し
ている固体支持体、および ｂ）第二のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗
体並びに所望により第三の抗体からなる二元錯体検出手
段、 をその中に密閉して収めるために区画に分けられたキャ
リヤーからなり、 但し、前記抗体の少なくとも１種が二抗体免疫検定法に
おいて罹病組織中のフィトフソーラを検出でき、フィト
フソーラの少なくとも１種の株と反応するが、しかしピ
チウムの株との反応を実質的に示さないモノクローナル
抗体であることを特徴とする植物におけるフィトフソー
ラ感染の免疫学的診断のためのキット。 - 【請求項２２】抗体の少なくとも１種がフィトフソーラ
の少なくとも15種の株と反応し得る請求項21記載のキッ
ト。 - 【請求項２３】第二の抗体が酵素、放射性同位体、フル
オロホアおよびビオチンからなる群から選択される分析
的に検出可能な試薬に結合されている請求項21記載のキ
ット。 - 【請求項２４】キットが酵素、放射性同位体、フルオロ
ホアおよびビオチンからなる群から選択される分析的に
検出可能な試薬に結合した第三の抗免疫グロブリン抗体
からなる請求項21記載のキット。 - 【請求項２５】抗体の少なくとも１種がATCC HB9353ま
たはそれらのクローンもしくはサブクローンにより産生
されたモノクローナル抗体である請求項21記載のキッ
ト。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7761687A | 1987-07-24 | 1987-07-24 | |
| US77616 | 1987-07-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP2714619B2 true JP2714619B2 (ja) | 1998-02-16 |
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ID=22139121
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63185339A Expired - Lifetime JP2714619B2 (ja) | 1987-07-24 | 1988-07-25 | フィトフソーラの免疫学的検出のためのモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ |
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| KR20050087613A (ko) * | 2004-02-27 | 2005-08-31 | 디아이케이(주) | 금속제 용기의 형성방법 및 제조공정 |
-
1988
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