JP4117542B2 - 皮膚糸状菌に対するモノクローナル抗体，該抗体を産生するハイブリドーマおよび該抗体の生産方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は皮膚糸状菌に対するモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマに関するもので、本抗体を用い皮膚糸状菌、特に白癬菌の新規な分離・検出手段を提供することができる。
【０００２】
【従来の技術】
水虫は白癬菌と総称される皮膚糸状菌の皮膚角化層における感染・増殖による疾患である。白癬菌は主にトリコフィトン属の総称である。例えばＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ（以下Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ（以下Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）の２種で外来水虫患者の約99％を占めているとの報告がある（例えば、非特許文献１参照。）。また現在日本で水虫の原因となる白癬菌の種類は約１０種類といわれており、Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ以外にもＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ（以下Ｍ．ｃａｎｉｓ）、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ（以下Ｅ．ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ）などトリコフィトン属以外の皮膚糸状菌も含まれている。またネコ、ハムスターなど愛玩動物を介したＭ．ｃａｎｉｓ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ感染より白癬になるケースも近年増えつつある。
【０００３】
水虫は感染部に、炎症と激しい掻痒感を引き起こす。皮膚科外来の約１０％が水虫の患者で占められている。菌の感染部は主に足の趾間であるが、陰部や体部などにも感染し、陰部白癬や体部白癬と呼ばれている。頻度は、足が全体の８０％を占める。
【０００４】
水虫の診断は、従来、１０乃至２０％水酸化カリウム溶液により患者皮膚より採取した角化層を溶解させ、顕微鏡下で菌糸を確認する方法により行われる。さらに同定する場合は適切な培地、例えばクロラムフェニコール加サブローブドウ糖寒天培地上で２〜３週間室温または３０℃で培養の後、形態観察を行う。
【０００５】
検査の分野では、抗体の抗原特異的に結合する性質を応用し多くの検査方法・検査手段・濃縮方法が考案・利用されている。例えば（１）ホルマリンなどで固定した組織切片に抗原特異抗体を作用させ、結合した該抗体を検出し組織中の抗原局在を調べる方法（免疫組織染色）（例えば、非特許文献２参照。）（２）血球やラテックス粒子に特異抗体を固定化し試料中の抗原存在有無を凝集有無により判別するもの（凝集法）や、（３）特異抗体を固定化した不溶性担体と抗原を含む液体試料とを一定時間反応させＢ／Ｆ分離し、さらに別の標識化抗体と一定時間反応させ形成した標識化抗体−抗原−固定化抗体複合体を検出するもの（サンドイッチイムノアッセイ）（例えば、非特許文献３参照。）（４）移動展開可能な多孔性担体上で標識化抗体と反応させた測定対象物―標識化抗体複合体を該多孔性担体移動展開層途中に設けられた固定化抗体層にて捕捉させ形成する標識化抗体−抗原−固定化抗体複合体を検出するもの（イムノクロマト法）（例えば、特許文献１参照。）（５）被検試料と特異抗体固定化粒子担体とを反応させて抗体と結合する菌を粒子担体上の一部位に濃縮捕捉するもの（例えば、特許文献２参照。）などが知られている。
【０００６】
またそれら分析に使用するカンジダやアスペルギルス、サッカロマイセスなど真菌に対する抗体も種々作製されている（例えば、特許文献３〜５など参照。）。またカンジダやアスペルギルスの真菌細胞壁上に発現している（１→３）−β−Ｄ−グルカンを特異的に認識する抗体も作製されている（例えば、特許文献６参照。）。
【０００７】
皮膚糸状菌に関するモノクローナル抗体が開示されている（例えば、非特許文献３参照。）。それによるとＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓアレルゲンＩを抗原としてモノクローナル抗体を作成し、阻害イムノアッセイや２種の異なるモノクローナル抗体を使ったサンドイッチイムノアッセイを検討し、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ（以下Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）のみならずＴ．ｒｕｂｒｕｍやＴ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓとの交差反応を認めたとの記載がある。また同様にＴ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ抽出物から精製されたＰｒｏｔｅｉｎＩＶを抗原としてモノクローナル抗体を作製し、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓのみならずＴ．ｒｕｂｒｕｍやＴ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓの培地ろ過物中に反応するｐｒｏｔｅｉｎＩＶ成分を認められたことが開示されているが、その他Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｉｘなどの皮膚テスト用抽出物中には認められなかったと開示されている（例えば、非特許文献４参照。）。
【０００８】
【特許文献１】
特開２０００−３５４２９号公報
【特許文献２】
米国特許第５６９５９４６号明細書
【特許文献３】
特開昭５９−１８６９２５号公報
【特許文献４】
特開５９−１８６９２６号公報
【特許文献５】
特開平０７−２５０６７６号公報
【特許文献６】
特再平０８−８０６８５８号公報
【非特許文献１】
日本医真菌学会疫学調査委員会，「１９９２年次皮膚真菌症疫学調査成績」，日本医真菌学会雑誌，１９９５年，第３６巻，ｐ．８７−９５
【非特許文献２】
福井三郎編，「モノクローナル抗体」（１９８６年３月１０日第１刷発行），講談社サイエンティフィック，ｐ．７８
【非特許文献３】
Ｄｅｕｅｌｌら，「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」，１９９１年，第１４７巻，ｐ．９６−１０１
【非特許文献４】
Ｗｏｏｄｆｏｌｋら，「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」，１９９６年，第１５６巻，ｐ．１６９５−１７０１
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
足の趾間の掻痒感と水泡形成などで患者自身の判断で水虫と判断して、市販の薬を使用することも多いと思われる。しかし、足の趾間にこのような掻痒感や炎症をきたす疾患は水虫だけではない。例えばアトピー性皮膚炎も水虫と似たような症状を引き起こす。重要な点はこのような疾患の治療は、水虫の治療とは全く異なっていることである。このため間違った自己診断に基づく治療により炎症がながびき、なかなか治らないケースも多い。
簡易に水虫かそれ以外の疾患かを区別できる方法が望まれるが白癬は上述のように皮膚科領域で非常に患者の多い病気にも関わらず、白癬原因菌の簡易検出によい方法はない。従来から行われている水酸化カリウム溶液により患者皮膚より採取した角化層を溶解させ、顕微鏡下で菌糸を確認する方法は顕微鏡と加熱用アルコールランプが備えた施設であれば検査できる方法であるが、熟練を必要とし、時として菌糸と塵との鑑別を見誤ると鏡検で菌を見逃すこともある。また培養検査法は見逃しの少ない方法であるが時間がかかるのが難点である。特異抗体を使わない水虫の検出法として特開２００１−１８７７５０に硫酸銅溶液を用い水虫菌感染部位検知方法が記載されているが、我々が検討した範囲では爪白癬では健常者と有意差は認められなかった。
白癬原因菌に特異的な抗体を前述の従来技術に適用すれば、目的とする簡易検出は比較的容易と考えられるが、未だ実用に至っていない。白癬原因菌は主にトリコフィトン属であるが他の属の菌種も含まれており、これら属を横断的に反応しうる抗体は知られていない。一方単純に検出の菌種を広げるた目的で菌特異性の異なる複数の抗体を混合使用すれば特異性面は解決できるが、抗体それぞれで保存安定至適条件や抗体保存安定性が異なることが多く、製造後の経時変化により特性変化する可能性があり実際に製品化を考えた場合好ましいとはいえない。よって本発明の課題は、皮膚糸状菌の検出に有用な、とりわけ白癬原因菌の異なる属に渡る特異性を有するモノクローナル抗体を提供することにある。
【００１０】
【問題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、トリコフィトンルブルムアレルゲンを抗原としてマウスを免疫し、脾臓細胞をマウスミエローマ細胞株と融合させてハイブリドーマを作製し、その中から免疫原に反応しかつ各種皮膚糸状菌に反応する抗体をスクリーニングしたところ、Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓのみならず、Ｍ．ｃａｎｉｓ、Ｅ．ｆｌｏｃｃｏｓｕｍにも反応性を有するモノクローナル抗体の存在を初めて見い出し、本発明に到達した。
【００１１】
即ち本発明は、以下の（１）から（４）に関する。
（１）以下に示す皮膚糸状菌のうち少なくとも３種以上と反応性を有することを特徴とするモノクローナル抗体。
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ
Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ
Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ
（２）上記（１）記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
（３）受託番号ＦＥＲＭ Ｐ-１９０５７として寄託されている上記（２）のハイブリドーマ。
（４）上記（３）記載のハイブリドーマを利用して抗体あるいは抗体断片を得ることを特徴とする抗体生産方法
【００１２】
本発明で記載した皮膚糸状菌は白癬の起因菌である。例えばＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇｌａｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｈｏｅｎｌｅｉｎｉｉ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｅｕｍ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｖａｎｂｒｅｕｓｅｇｈｅｍｉｉ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｓｉｍｉｉ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｂｅｎｈａｍｉａｅが挙げられる。
【００１３】
本発明で記載した皮膚糸状菌Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｍ．ｃａｎｉｓ、Ｅ．ｆｌｏｃｃｏｓｕｍは、患者や生活環境などから分離同定されたものでも、公的機関から入手したものでもよい。公的機関としてはたとえばアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）や独立行政法人製品評価技術基盤機構・生物遺伝資源センターが挙げられる。これら菌を増やすには適当な培地で培養する。培養に使用する培地は皮膚糸状菌で一般的に使用されているサブロー・ブドウ糖寒天培地を用いてもよいし、公的機関で公開されている該菌培養方法記載の培地に従ってもよい。培養温度は１０乃至４０℃好ましくは２０乃至３０℃であり、好気環境下静置して培養することが望ましい。菌の種類を同定は公知の分離同定方法、例えば カビの分離・培養と同定 宇田川俊一・室井哲夫／訳 １９８３年 医歯薬出版、真菌症遺伝子診断 槙村浩一／編 メジカルセンス １９９７年 などに記載された方法により分離同定することができる。
【００１４】
モノクローナル抗体作製に使用する免疫用抗原およびスクリーニング用抗原は、上記菌株を培養して得られた菌体で水性縣濁液を調製することにより得られる。縣濁に使用する液は特に限定しないがｐH5〜９の範囲の緩衝液が好ましい。縣濁前か縣濁後に、安定化剤として例えばグリセロールやフェノールなどを適量添加してもよい。縣濁は菌体を適当な試験管中で物理的に十分振とうさせて分散させてもよいが、ホモジナイザーを使った方法や超音波破砕やビーズ破砕など従来から知られる方法により菌体を強制破砕してもよい。得られた縣濁液はそのまま免疫に供してもよいし、適当なメッシュのフィルターでろ過、あるいは遠心分離により調製したものを使用してもよい。また同様の調製方法で得られた上記菌の水性縣濁液であれば市販品、例えばＴ．ｒｕｂｒｕｍアレルゲンやＴ．Ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓアレルゲンを抗原として利用してもよい。
【００１５】
本発明のモノクローナル抗体およびハイブリドーマは、公知のモノクローナル抗体作成法（単クローン抗体実験マニュアル 富田朔ニ・安東民衛／編 講談社サイエンティフィク １９８７年、免疫研究法ハンドブック 藤原大美・淀井淳司／編 中外医学社 １９９６年、組織培養の技術［第３版］応用編 日本組織培養学会／編 朝倉書店 １９９９年）に従い、例えば以下のような手順で作製することができる。
【００１６】
動物の免疫に使用する被免疫動物としては、公知のハイブリドーマ作製法に用いられる哺乳動物を使用することができる。具体的には、例えばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマなどである。ただし摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性などの観点からは、マウスおよびラットを被免疫動物とするのが好ましい。また、実際に使用するマウスおよびラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、例えば各系統Ａ，ＡＫＲ，ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、５７ＢＬ，Ｃ５７ＢＲ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴ−１、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、ＲＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、またラットの場合には、たとえば、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｑｕｅ、Ｄａｗｅｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃｈｅｒなどを用いることができる。このうち、後述のミエローマ細胞との融合適用性を勘案すれば、マウスではＢＡＬＢ／ｃ系統が、ラットではｌｏｗ系統が被免疫動物として特に望ましい。なお、これらマウスまたはラットの免疫時の週令は５〜１２週令が好ましい。
【００１７】
動物の免疫は、免疫原である上記菌縣濁液を動物の皮内、腹腔内またはに投与することによって行うことができる（生体内免疫）。投与スケジュールは被免疫動物の種類、個体差により異なるが、一般には、抗原投与回数２〜６回、投与間隔１〜２週間が好ましい。また抗原の投与量は動物の種類、個体差等により異なる。一般には１０―１００μｇ／匹・回程度といわれているが、投与量を変えて免疫を実施し血清中や血漿中抗体価の最も高い被免疫動物を選択することもできる。投与する際はアジュバントとよばれる免疫活性化物質と共に投与してもよい。たとえばアジュバントとして、フロイント完全アジュバンド、フロイント不完全アジュバント、ＣｐＧ ＤＮＡ，ムラミルジペプジド、リポポリサッカライドなどが挙げられる。また動物の免疫法として上述の方法の代わりに生体外免疫法と呼ばれる方法、具体的にはあらかじめ脾臓細胞またはリンパ細胞を無菌的に取りだした後、アジュバンド物質、免疫原とともに動物培養用培地中炭酸ガス存在下で２〜７日間培養することで実施してもよい。
【００１８】
細胞融合に際して、生体内免疫の場合では上記の抗原投与スケジュールの最終免疫日から１〜５日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞またはリンパ細胞を無菌的に取り出す。これらの脾臓細胞またはリンパ細胞からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法に従って行うことができる。生体外免疫の場合は免疫原と共に培養した細胞を引き続き用いることができる。
【００１９】
細胞融合には上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続きが確立しているＨＧＰＲＴ（Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase）欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来のX63-Ag8(X63),NS1-Ag4/1(NS-1),P3X63-Ag8.U1(P3U1),X63-Ag8.653(X63.653),SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG),F0,S149/5XX0,BU.1等、ラット由来の210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等、ヒト由来のU266AR(SK0-007),GM1500・GTG-A12（GM1500）,UC729-6,LICR-LOW-Hmy2(Hmy2), 8226AR/NIP4-1(NP41)などである。
【００２０】
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコールなどの高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法などを用いることができる。
【００２１】
融合細胞と非融合細胞の選択は、例えば、公知のＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法により行うのが好ましい。この方法は、アミノプテリン存在下で生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いて融合細胞を得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞および融合細胞をＨＡＴ培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせた融合細胞のみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。ＨＡＴ培地や後述のクローニングなど細胞培養に使用する培地は、公知のものを使用すればよく、例えばＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ｅＲＤＦ、ＩＭＤＭなどが使用できる。同時に動物血清や増殖因子、コンディションドメディウム、抗生物質等、蛋白質などを添加してもよいが、限界希釈などでクローニングを行う場合はこれらを組み合わせて添加することが好ましい。動物血清であれば例えばウシ胎児血清を１乃至２０％添加してもよいし、増殖因子であれば例えばＩＬ−６、インシュリン、エタノールアミン、セレン、２メルカプトエタノール、ピルビン酸、非必須アミノ酸類を添加してもよいし、コンデションメディウムであれば例えば胸腺細胞培養後の培養上清５％乃至２０％を添加してもよいし、抗生物質であれば例えばゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリンを添加してもよいし、蛋白であれば例えばウシ血清アルブミン、カゼイン、トランスフェリンを添加してもよい。細胞を培養する温度は細胞が増殖する温度であればよいが例えば３７℃でおこなうことができる。培地中に炭酸水素ナトリウムを加える場合には炭酸ガス存在下例えば培地中のｐＨが中性となる炭酸ガス５％乃至１０％で培養するのが好ましい。
【００２２】
目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングは、公知の酵素免疫検定法（ＥＩＡ：Enzyme Immunoassay）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ：Radio Immunoassay）、蛍光抗体法、免疫染色法などにより行うことができる。
【００２３】
ＥＩＡやＲＩＡでスクリーニングを実施する場合、スクリーニングに使用する抗原は免疫原として使用した菌水性縣濁液あるいはアレルゲン溶液を使用することができる。固相への抗原の固定化は公知の方法に従い、例えばダルベッコのリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ（−））や０．０５Ｍ 炭酸緩衝液にて希釈した菌縣濁液を２〜４０℃の範囲で３０分ないし一晩固相と接触させてもよいし、グルタルアルデヒドやカルボジイミドといった架橋試薬を使用し共有結合的に固相表面の官能基と結合させてもよい。固相の材質は公知のものを使用することができ、例えばポリスチレン、ガラス、シリカ、セルロース、ポリビニル、ナイロン、ニトロセルロース、ＰＶＤＦなどが挙げられる。抗原を結合後、非特異的な蛋白吸着を抑える目的で他の蛋白・界面活性剤やポリマー・血清などの含む溶液を固相に接触させるブロッキング工程を実施することが好ましい。ブロッキングに使用する蛋白質として、例えば牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、オボアルブミンが挙げられ、０．１乃至１０％溶液を調製し使用することができる。ブロッキングに使用する界面活性剤やポリマーとして、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（TWEEN２０）、ポリビニルアルコールなどが挙げられ、０．０１乃至０．５％溶液を調製し使用することができる。ブロッキングに使用する血清として、例えば牛胎児血清、新生牛血清、ウマ血清、ヤギ血清、ウサギ血清、ラット血清、モルモット血清、ブタ血清、マウス血清が挙げられ、０．５％乃至１００％溶液を使用することができる。血清や蛋白をブロッキングに使用する場合は免疫動物とスクリーニングに使用する特異抗体検出用ニ次抗体の交差特異性を考慮して選択使用することが好ましく、たとえばマウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングする場合には牛血清アルブミン溶液などマウス由来でない蛋白含有溶液でブロッキングを実施し、ウシ抗体に交差反応性を示さないか、もしくはほとんど示さない２次抗体を使い検出することが好ましい。ブロッキングは例えば２℃乃至４０℃の範囲で行うことができる。時間は例えば３０分乃至１日間行うことができるが、ブロッキングに使用する溶液に適切な防腐剤、例えば０．０５％アジ化ナトリウムを添加しておき、ブロッキング後にそのまま保存することもできる。
【００２４】
蛍光抗体法や免疫染色法でスクリーニングに使用する標本は、あらかじめ菌を塗沫し、固定し、水洗後さらに必要に応じてブロッキングと洗浄を行ったスライドグラスを使用できる。また菌を塗布することなく培養菌塊をホリマリン固定パラフィン包埋し、公知の方法で組織標本切片を調製することもできる。
【００２５】
複数種の菌に対する反応性を有する抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは、確認したい各菌それぞれに反応する抗体産生の有無を検知して実施できる。
【００２６】
例えばＲＩＡやＥＩＡでスクリーニングを行うのであればＴ．ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｍ．ｃａｎｉｓ、Ｅ．ｆｌｏｃｃｏｓｕｍの各種菌抗原をそれぞれ単独で固相化した固相を用意し、適度に希釈した同一ハイブリドーマ培養上清試料を同固相と反応させ、Ｂ／Ｆ分離後さらに標識ニ次抗体を反応させ、さらにＢ／Ｆ分離後固相に残った標識二次抗体を検出し、各抗原間の反応性を比較し３種類以上の菌と反応性が確認できたものを候補として選抜してもよい。また例えばＴ．ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｍ．ｃａｎｉｓ、Ｅ．ｆｌｏｃｃｏｓｕｍのうち１種または２種以上の菌種抗原を固相化した抗原を用意し、適度に希釈した同一ハイブリドーマ培養上清試料を同固相と反応させ、Ｂ／Ｆ分離後さらに標識ニ次抗体を反応させ、さらにＢ／Ｆ分離後固相に残った標識二次抗体を検出し、反応性が確認できたものを第一スクリーニング候補として選抜し、その後選抜された集団の培養上清を試料としてＥＩＡ，ＲＩＡ，蛍光抗体法、免疫染色法などの方法でＴ．ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｍ．ｃａｎｉｓ、Ｅ．ｆｌｏｃｃｏｓｕｍとの反応性を検討し、二次スクリーニング選抜を行ってもよい。一次スクリーニングと二次スクリーニングは引き続き実施してもよいし、一次スクリーニングの後にクローニングを実施し、細胞として単一集団とした後に二次スクリーニングを実施してもよい。
【００２７】
また例えば免疫染色法にてスクリーニングを行うのであればＴ．ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｍ．ｃａｎｉｓ、Ｅ．ｆｌｏｃｃｏｓｕｍの各種菌をそれぞれ単独で固相化した標本を用意し、適度に希釈した同一ハイブリドーマ培養上清試料を同標本と一定時間反応させ、洗浄後さらに酵素標識ニ次抗体を反応させ、さらに洗浄後標本上に残った標識二次抗体の有無を色原体である酵素基質を標本上に接触させて標本上の染色性を各種菌に対する標本間で比較し３種類以上の菌で反応性が確認できたものを候補として選抜してもよい。
【００２８】
スクリーニングにより選択されたハイブリドーマ細胞は、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法などの公知の方法によりクローニングし、抗体産生に用いる。
【００２９】
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマ細胞は、液体窒素中または−８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。細胞凍結時の細胞濃度は１ｘ１０６／ｍｌ乃至１ｘ１０７／ｍｌの範囲が好ましく、凍結時安定化剤として培地に５乃至１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを添加してもよい。
【００３０】
本発明の抗体生産方法は上記の方法で作製したハイブリドーマ細胞を公知の方法で培養することによって所望のモノクローナル抗体を得ることができる。例えばマウスに免疫して作成したハイブリドーマであれば、あらかじめプリスタン等の鉱物油を投与したマウスの腹腔に該細胞を移植すると１乃至３週間でモノクローナル抗体を含んだ腹水が得られる。また例えばハイブリドーマを培地中で培養するとハイブリドーマからモノクローナル抗体が分泌され、該抗体を含んだ培養上清が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ腹水や培養上清は公知の抗体精製手法でより純度の高いモノクローナル抗体を得ることができる。
【００３１】
また本発明の抗体生産方法は上述のハイブリドーマで発現している抗体をコードする遺伝子あるいは遺伝子断片を公知の技術で取得し、公知の遺伝子組換え技術により発現ベクターを組み込んだ形質転換体を培養することにより所望のモノクローナル抗体を得ることができる。抗体生産により抗体が形質転換体内に蓄積される場合は公知の方法により形質転換体を回収し破砕することにより抗体を含んだ破砕液が得られる。抗体生産により形質転換体を培養した培地中に抗体が分泌される場合には形質転換体培養により該抗体を含んだ培養上清が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ破砕液や培養上清は公知の抗体精製方法でより純度の高いモノクローナル抗体を得ることができる。
また本発明の抗体生産方法は上述のハイブリドーマで発現している抗体をコードする遺伝子あるいは遺伝子断片を公知の技術で取得し、該抗体遺伝子あるいは遺伝子断片から結合活性を有する蛋白部分をコードするメッセンジャーRNAを公知の方法で合成し公知の無細胞蛋白合成方法により抗体生産することもできる。抗体生産により該抗体を含んだ蛋白合成反応液が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ蛋白合成反応液は公知の抗体精製方法でより純度の高いモノクローナル抗体を得ることができる。
【００３２】
抗体精製方法として例えば、硫安塩析、カラムクロマトが挙げられる。カラムクロマトに使用できる樹脂担体として例えば陰イオン交換樹脂やプロテインＡやプロテインＧ、ＰｒｏｔｅｉｎＬなどのアフィニティクロマト樹脂、ハイドロキシアパタイト樹脂、疎水クロマト樹脂などの抗体吸着性のあるものや、架橋デキストラン樹脂やアガロース樹脂など分子量で樹脂内移動度の異なることを利用したゲルろ過担体が挙げられる。これら精製操作を行う前にモノクローナル抗体のサブタイプを調べておき適切な精製手段を選択することが望ましい。精製後の抗体は透析などの方法でｐＨ中性の緩衝液にバッファー交換を行うことが好ましく、ｐＨ中性の緩衝液として例えば生理的食塩濃度のリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））や生理的食塩濃度のトリス緩衝液（ＴＢＳ）を用いることができる。本緩衝液のｐHは５．５〜８．５の間が好ましい。
【００３３】
このようにして得られたモノクローナル抗体は溶液状態や凍結状態で保存することができる。液状で保存する場合は防腐剤を添加したり、０．２２μｍメッシュの滅菌フィルターなどで無菌ろ過後滅菌容器中に保存することが好ましい。防腐剤として例えば０．０５％アジ化ナトリウムを添加することができる。容器の滅菌方法は公知の方法で実施すればよく、例えばγ線照射滅菌、ＵＶ照射滅菌、オートクレーブ滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌などが挙げられる。保存容器は保存中抗体と反応しない不活性な素材を使用したものが使用でき、例えば、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレンである。抗体の結合活性を損なわない方法であれば保存容器表面に吸着しないよう表面加工を行った容器を使用してもよい。液状での保存温度は凍結しない温度であればよいが、蛋白変性を抑えるためできるだけ低温であることが好ましく、より好ましくは２乃至１０℃である。また凍結を防止することのできる濃度で凍結防止剤を添加するとさらに低温で保存することもでき、例えば終濃度５０％のグリセロールを添加すると−２０℃でも凍結することなく液状で保存することができる。凍結状態で保存する場合は−２０℃以下、より好ましくは−３０℃以下で保存することが好ましい。保存時の抗体濃度は沈殿を生じない濃度で設定することができるが、好ましくは０．１乃至５ｍｇ／ｍｌである。また安定化剤として蛋白質、水溶性ポリマー高分子、界面活性剤、糖類、糖アルコールを添加することもできる。安定化蛋白質の例としてウシ血清アルブミンやゼラチンなどが挙げられ、保存中沈殿が生じない濃度で添加することができる。濃度範囲としてより好ましくは０．１乃至５ｍｇ／ｍｌである。
【００３４】
【実施例】
以下に実施例を示してこの発明を詳細かつ具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１：抗皮膚糸状菌モノクローナル抗体の作成
（１）皮膚糸状菌の培養：財団法人発酵研究所より分与された皮膚糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ（ＩＦＯ番号９１８５、３２４０９）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ（ＩＦＯ番号６２０２、３２４１０）、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ（ＩＦＯ番号３２４６３）、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ（ＩＦＯ番号３２４６１）は所定の方法でアンプルから復元し、サブローデキストロース寒天スラント（ベクトンディキンソン社）に接種し、室温で１週間培養した。
（２）抗原溶液の調製：Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍアレルゲン（２００００ＰＮＵ／ｍｌ：１ＰＮＵ(ＰＲＯＴＥＩＮ ＮＩＴＲＯＧＥＮ ＵＮＩＴ)は１．０ｘ１０-6ｇのリンタングステン酸沈殿物を生ずるタンパク性窒素を示す。ＧＲＥＥＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ社）をリン酸緩衝生理食塩水（以下 ＰＢＳ（−））にて希釈し、１００００ＰＮＵ／ｍｌ抗原液（以下抗原液Ｈ）とと１０００ＰＮＵ／ｍｌ抗原液（以下抗原液Ｌ）を2種調製した。
（３）マウスの免疫：フロインド完全アジュバンド５００μＬに上記２種の抗原液それぞれで５００μＬを混合・エマルジョンとし、各エマルジョンを２００μＬ／匹でＢＡＬＢ／ｃＡ ♀５週令２匹づつ計４匹腹腔に注射した。（この日を０日目とする。）１４日目、２１日目、２８日目に上述と同様に各抗原液４００μＬとフロイント不完全アジュバンド４００μＬを混合・エマルジョンとし、そのうちの１００μＬをマウス腹腔に注射した。
（４）マウス血清の取得：３２日目に生存していたマウス（抗原液Ｈで調製したエマルジョンを腹腔注射したマウス個体１匹（Ｈ−＃１）、抗原液Ｌから調製したエマルジョンを腹腔注射したマウス個体２匹（Ｌ−＃１、Ｌ−＃２））から尾より血液を採取した。血液は室温３０分放置後、凝固した血餅を３０００ＲＰＭ１０分の遠心操作により分離し、血清を取得した。
（５）ＥＬＩＳＡによる血清抗体価の確認：採取した血清はＰＢＳ（−）で１０００倍希釈から１２８０００倍希釈まで希釈を行い、試料として用いた。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍアレルゲンをＰＢＳ（−）で２００ＰＮＵ／ｍｌとなるよう希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（＃９０１８ コーニング社）の各ウエルにに５０μＬづつ分注、室温１時間放置し、プレートに抗原を固相化した。ウエル内の液体を除去後、次いで蒸留水で４倍に希釈したブロックエース（雪印乳業）を３００μＬづつ各ウェルに分注し、室温１時間放置し、ブロッキングを行った。ウエル内の液体を除去し、次いで０．０５％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０含有ＰＢＳ（以下 洗浄液）３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、試料を５０μＬづつウェルに分注し固相抗原と１時間室温で反応させた。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、蒸留水で１０倍に希釈したブロックエースで２０００倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン ウサギ抗体（ＤＡＫＯ社）を５０μＬづつウェルに分注し室温１時間反応させた。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、３，３‘−５，５’−テトラメチルベンジジン（以下ＴＭＢ）を含む西洋わさびペルオキシダーゼ基質液ＴＭＢ＋（ＤＡＫＯ社）を各ウエル５０μＬづつ分注し、室温遮光下反応させた。反応１０分後１Ｎ硫酸を各ウエル５０μＬづつ分注し、酵素反応を止め、主波長４５０ｎｍ副波長６５０ｎｍで各ウエルの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定を行った。対照として抗原を固相化していないプレートでも、ブロッキング以下同様の操作を実施した。測定した吸光度を表１に示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】
２０００ＰＮＵ−１０００ＰＮＵ／回注射した個体Ｈ−＃１でＬ−＃１，Ｌ−＃２に比して著しく高い抗体価が見とめられ、マウス個体Ｈ−＃１を使って細胞融合することとした。４１日目、５５日目、５６日目、５７日目にＰＢＳ（−）で２倍希釈したＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍアレルゲン１００μＬを腹腔内に注射し、細胞融合に備えた。
（６）細胞融合：骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬）で３７℃５％炭酸ガス濃度下で培養、継代した。５８日目に個体Ｈ−＃１から無菌的に脾臓を摘出し、ｅ−ＲＤＦ培地中で臓器をよく洗浄した。２０ｍｌのｅ−ＲＤＦ培地を入れた１０ｃｍφシャーレ中に脾臓を入れ，クリーンベンチ内で滅菌ピンセットで脾臓に端を固定したまま２２ゲージ注射針先端で切りこみを入れ、さらにしごくように脾臓から脾臓細胞を無菌的に押しだし、さらにピペット操作により細胞塊をよくほぐした。セルストレイナーを上部に装着した５０ｍｌ遠心管に細胞縣濁液を移し、引き続いて２００ｘｇ １０分遠心分離を行い、上清を廃棄した。２０ｍｌ ｅ−ＲＤＦ培地を添加しピペット操作により沈降した細胞を縣濁させ、さらにもう１回遠心分離、上清廃棄、培地での細胞縣濁を実施した。血球計算盤にて細胞数をカウントしたところ、１．１ｘ１０8個であった。得られた脾臓細胞の１／１０量にあたる１．１ｘ１０7個の骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４を添加するため、ｅ−ＲＤＦ培地で細胞を洗浄した。すなわち１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬）で培養した７ｘ１０5／ｍｌのＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞培養液２０ｍｌを１５０ｘｇ ５分遠心分離により細胞のみを分離し、上清を廃棄し、ｅ−ＲＤＦ培地２０ｍｌを加え、ピペット操作で細胞を縣濁し、さらに遠心分離、上清廃棄、培地での細胞縣濁の操作を２回繰り返し、最終的にｅ−ＲＤＦ培地に縣濁されたＳｐ２／０−Ａｇ１４を得た。１．１ｘ１０7個のＳｐ２／０−Ａｇ１４を脾臓細胞の入った５０ｍｌの遠心管に添加しピペット操作でよく混合した後、２００ｘｇ １０分遠心分離を行った。上清廃棄後チューブごとタッピングして細胞塊をほぐした後、３７℃環境下で５０％ポリエチレングリコール１５００液（ロシュ社）を１ｍｌ添加し細胞と混合、次いでｅ−ＲＤＦ培地を１ｍｌ、３ｍｌ、１０ｍｌの順に添加した。１５０ｘｇ ５分遠心分離後、そのまま３７℃で５分間放置し、その後上清を廃棄した。パスツールピペットを使って選択培養培地（１００ｘＨＡＴサプリメント（ＧＩＢＣＯ社）１／１００容とＣｏｎｄｉｍｅｄＨ１（ロシュ社）１／１０容、牛胎児血清１／１０容を含むｅ−ＲＤＦ培地）１９２ｍｌに細胞全量を縣濁し、ふたつき９６穴浮遊細胞培養用プレート（住友ベークライト社製）１０枚に２００μＬづつ各ウェルに無菌的に分注した。３７℃５％炭酸ガス条件下で９日間ＨＡＴ選択培養を行った。
（７）抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング：選択培養後の各ウェル培養上清５０μＬをＰＢＳ（−）２００μＬで希釈し、試料として用いた。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍアレルゲンをＰＢＳ（−）で２００ＰＮＵ／ｍｌとなるよう希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（＃９０１８ コーニング社）の各ウエルにに５０μＬづつ分注、室温１時間放置し、プレートに抗原を固相化した。またＴｒｉｃｈｉｐｈｙｔｏｎｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓアレルゲン（２００００ＰＮＵ／ｍｌ ：ＧＲＥＥＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ社）についてもＰＢＳ（−）で２００ＰＮＵ／ｍｌとなるよう希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（＃９０１８ コーニング社）の各ウエルにに５０μＬづつ分注、室温１時間放置し、プレートに抗原を固相化した。ウェル内の液体を除去後、次いで蒸留水で４倍に希釈したブロックエース（雪印乳業）を３００μＬづつ各ウェルに分注し、室温１時間放置し、ブロッキングを行った。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、試料を５０μＬづつウェルに分注し固相抗原と１時間室温で反応させた。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液 ３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、蒸留水で１０倍に希釈したブロックエースで２０００倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン ウサギ抗体（ＤＡＫＯ社）を５０μＬづつウェルに分注し室温１時間反応させた。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液 ３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、ＴＭＢを含む西洋わさびペルオキシダーゼ基質液ＴＭＢ＋（ＤＡＫＯ社）を各ウエル５０μＬづつ分注し、室温遮光下反応させた。反応１０分後１Ｎ硫酸を各ウエル５０μＬづつ分注し、酵素反応を止め、主波長４５０ｎｍ副波長６５０ｎｍで各ウエルの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定を行った。対照として抗原を固相化していないプレートでも、ブロッキング以下同様の操作を実施した。９６０ウェルの培養上清希釈液を測定し、５ウェルで抗原固相との反応性が認められた。
表２にＥＬＩＳＡでの吸光度を示す。
【００３７】
【表２】
【００３８】
ウェル番号００１１、００１４でＴ．ｒｕｂｒｕｍ抗原、Ｔ．Ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ抗原ともに反応性が認められた。１次スクリーニングとして本２ウェルを選抜し、引き続きクローニングを実施した。
ハイブリドーマのクローニング：限界希釈法によりクローニングを実施した。すなわちスクリーニングで選抜した各選択培養ウェルの細胞を１００個となるよう無菌的にサンプリングし、それぞれクローニング培地（ＣｏｎｄｉｍｅｄＨ１（ロシュ社）１／１０容、牛胎児血清１／１０容を含むｅ−ＲＤＦ培地）２０ｍｌに対し、最終５個／ｍｌになるよう縣濁し、ふたつき９６穴浮遊細胞培養用プレート（住友ベークライト社製）各１枚９６ウェルに２００μＬづつ無菌的に分注した。３７℃５％炭酸ガス条件下で１０日間培養を行った。各ウェルのクローニング培養後上清５０μＬをサンプリングし、ＰＢＳ（−）２００μＬで希釈しＥＬＩＳＡ試料とし、１次スクリーニングと同様にＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍアレルゲン、Ｔｒｉｃｈｉｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓアレルゲン、固相抗原なしの３種の固相を用い、ＥＬＩＳＡを実施し、Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ抗原、Ｔ．Ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ抗原ともに反応性が認められた培養上清をサンプリングしたウェルから各１ウェル選抜し１次クローニング後のハイブリドーマ細胞を得た。ひきつづき同様の方法を繰り返し、二次クローニング、三次クローニングを実施し、最終的に抗体産生ハイブリドーマ００１１，００１４を得た。なお、本発明のハイブリドーマ００１４は独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ P−１９０５７として寄託されている。
（８）得られたハイブリドーマは１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地中で３７℃５％炭酸ガス濃度下で培養、継代し、得られた細胞は最終１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドと１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を添加したｅ−ＲＤＦ培地１ｍｌに５ｘ１０6個を無菌的に縣濁し、２ｍｌセラムチューブ（住友ベークライト）中で、氷中５分、−２０℃５０分、−８０℃１２時間保存し、最後に液体窒素中で保存した。
（９）各ハイブリドーマ培養上清の調製：液体窒素中で凍結保存されていたハイブリドーマ００１１、００１４の入ったチューブは−８０℃１時間保存後、３７℃の温湯中ですばやく融解させた。それぞれ１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地１０ｍｌの入った遠心管中に全量入れ、ピペット操作で細胞縣濁した。１５０ｘｇ ５分遠心し、上清を廃棄後、５ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地にピペット操作で細胞を浮遊させ、底面積２５ｃｍ2浮遊細胞培養用フラスコにそれぞれ播種した。３７℃５％炭酸ガス濃度下で培養し２継代した後、培地１５ｍｌで細胞浮遊させ底面積７５ｃｍ2浮遊細胞培養用フラスコで７日間培養を行い抗体を培地中に十分分泌させた。培養により得られた細胞培養液を５０ｍｌ遠心管に移し７００ｘｇ １０分遠心分離し、ハイブリドーマ培養上清を得た。５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム水溶液を各培養上清の１／１００容添加し、０．２２μｍフィルターでろ過後、γ線滅菌されたポリプロピレン製チューブに分注し、−２０℃で凍結保存した。
（１０）モノクローナル抗体のサブタイピング：市販のイムノクロマト法を使ったサブタイピング試薬（イソストリップ：ロシュ社）を使い、ＰＢＳ（−）で１０倍希釈した培養上清希釈液１５０μＬを試料として分析した。ハイブリドーマ００１１の培養上清に含まれるモノクローナル抗体のサブタイプはＩｇＭ κ、ハイブリドーマ００１４の培養上清に含まれるモノクローナル抗体のサブタイプはＩｇＧ1 κであった。
（１１）二次スクリーニングに使用する皮膚糸状菌ホルマリン標本・塗沫標本の調製：皮膚糸状菌ホルマリン標本は以下のように調製した。サブローデキストロース寒天スラント上に増生した各種皮膚糸状菌の菌塊をそれぞれ培地と一緒に中性緩衝１０％ホルマリン溶液で1日固定後、アルコール７０％、８０％、９０％、１００％、１００％、１００％、１００%アルコール槽へ各２時間ずつ浸漬して脱水し、次にキシレン槽３槽に各２時間で浸漬し透徹を行った。次いでパラフィン槽４槽各２時間浸漬しパラフィンを浸透させ、さらに溶解したパラフィンをいれた包埋皿に菌と培地の塊を入れてパラフィンの固化を待ち、パラフィンブロックを作製した。次いで４μｍに薄切して、スライドグラス上に皮膚糸状菌ホルマリン固定パラフィン標本を作成した。塗沫標本は以下のように調製した。滅菌生理的食塩水で少し濡らした清潔な綿棒でサブローデキストロース寒天スラント上に増生した各種皮膚糸状菌を擦り取るように採取し、スライドグラスに押しつけ、搾り出すように綿による摩擦面を転がす要領で塗沫し、すぐに９５％エタノール液中で３０分固定することにより作成した。
（１２）免疫染色によるモノクローナル抗体の二次スクリーニング：皮膚糸状菌のホルマリン固定パラフィン標本はあらかじめ脱パラフィン操作を実施し、免疫染色を実施した。０．３％過酸化水素加メタノールに３０分浸漬し、水洗した後に１０％（ｖ／ｖ）正常ウサギ血清を添加したＰＢＳを切片上に滴下し、室温で３０分置いた。ＰＢＳで洗浄後、ハイブリドーマ培養上清００１１、００１４はＰＢＳで５０倍希釈し、室温湿室内で1時間反応させた。ＰＢＳ洗浄後、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋（ダコ社）を標本上に滴下し、室温湿室内で1時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、０．０２％（ｗ／ｖ）３，３‘−ジアミノベンジジン（以下 ＤＡＢ）と０．００３％（ｗ／ｖ）過酸化水素を含むＰＢＳ中でときどき鏡検しながらおよそ５分発色させた。水洗後、エタノールにて脱水、キシレン透徹を順に実施し、嫌水性封入剤（ビオライト）を用いて封入を行った。鏡検は１０ｘ２０倍と１０ｘ４０倍で観察し、茶褐色か黄褐色に染色された部位が確認できた場合を陽性、わずかに染まったものを弱陽性、染色を確認できなかった場合を陰性と判定した。表３、表４に判定結果を示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】
【表４】
【００４１】
００１１、００１４いずれのハイブリドーマ培養上清も検討した全てのホルマリンおよび塗沫標本ともに弱陽性・陽性であり、これらハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体はＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍの菌種すべてに反応性を有することが判った。
【００４２】
実施例２：モノクローナル抗体と過ヨウ素酸処理したＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎｒｕｂｒｕｍアレルゲンおよびＴｒｉｃｈｉｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓアレルゲンとの結合性
上記実施例１（６）「抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング」で用いたものと同じＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍアレルゲン吸着ＥＩＡ用プレートまたはＴｒｉｃｈｉｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓアレルゲン吸着ＥＩＡ用プレートのウェルに、０．０５Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を５０μｌ加え、４℃で一晩反応させ、抗原に含まれる糖を酸化した。ＰＢＳで洗浄し、蒸留水で４倍希釈したブロックエースを加え室温で１時間ブロッキングを行ったのち、前記実施例１（６）「抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング」に述べた方法と同様にして各モノクローナル抗体含有培養上清の結合性を調べた（図１、図２）。その結果、抗原を過ヨウ素酸処理するとモノクローナル抗体００１１は、抗原を過ヨウ酸処理しても結合性が低下することは無かったが、モノクローナル抗体 ００１４は結合性を失った。
【００４３】
実施例３：モノクローナル抗体とタンパク質分解酵素処理したＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍアレルゲンおよびＴｒｉｃｈｉｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓアレルゲンとの結合性
前記実施例１（６）「抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング」に述べた方法と同じＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍアレルゲンまたはＴｒｉｃｈｉｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓアレルゲンのウェルに１００μｇ／ｍｌのＰｒｏｎａｓｅ（カルビオケム社、７１０００ＰＵＫ／ｇ、ＰＢＳで希釈）を５０μｌ加え、３７℃で２時間反応させ、抗原のタンパク質を分解した。ＰＢＳで洗浄し、蒸留水で４倍希釈したブロックエースを加え室温で１時間ブロッキングを行ったのち、前記実施例１（６）「抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング」に述べた方法に述べた方法と同様にして、各モノクローナル抗体含有培養上清の結合性を調べた（図３、図４）。その結果、モノクローナル抗体００１１、００１４ともに抗原のＰｒｏｎａｓｅ処理によっても結合性に変化はなかった。
【００４４】
実施例４：サンドイッチＥＩＡ法による菌検出
（１）菌試料の調製：皮膚糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ （Ｔ．ｒ．と略記 ＩＦＯ番号９１８５、３２４０９）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ（Ｔ．ｍ．と略記ＩＦＯ番号６２０２、３２４１０）、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ（Ｍ．ｃ．と略記ＩＦＯ番号３２４６３）、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ（Ｅ．ｆ．と略記 ＩＦＯ番号３２４６１）、Ｃａｎｄｉｄａ Ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｃ．ａ．と略記 ＡＴＣＣ番号９００２８）所定の方法でアンプルから復元し、サブローデキストロース寒天スラント（ベクトンディキンソン社）に接種し、室温で１週間培養した。またＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃ．と略記 ＩＦＯ番号１３５００）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（Ｓ．ｆ．と略記 ＩＦＯ番号１２９６８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂ．ｓ．と略記 ＩＦＯ番号３０２６）は所定の方法でＬ−乾燥アンプルより復元し、ＬＢ寒天培地シャーレ（ポリペプトン１０ｇ酵母エキス５ｇ塩化ナトリウム１０ｇ寒天末１５ｇを１Ｌの精製水にて溶解後高圧滅菌し、１０ｃｍφ滅菌シャーレに無菌的に分注しゲル化させたもの）上で３０℃１日間培養した。
得られた菌はそれぞれ滅菌された１０μＬディスポーザブルループで一掻き分採取し、蒸留水で１０倍希釈したブロックエース（雪印乳業）５ｍｌに十分縣濁し、さらに本菌縣濁液をそれぞれ５、２５、１２５、６２５倍希釈したものをＥＩＡ試料として用いた。またＴ．ｒｕｂｒｕｍアレルゲンを１００ＰＮＵ／ｍｌになるよう同様に希釈した５、２５、１２５、６２５倍希釈した試料も併せて用いた。
（２）００１４培養上清の調製：液体窒素中で凍結保存されていたハイブリドーマ００１４の入ったチューブは−８０℃１時間保存後、３７℃の温湯中ですばやく融解させた。それぞれ１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地１０ｍｌの入った遠心管中に全量入れ、ピペット操作で細胞縣濁した。１５０ｘｇ ５分遠心し、上清を廃棄後、５ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地にピペット操作で細胞を浮遊させ、底面積２５ｃｍ2浮遊細胞培養用フラスコにそれぞれ播種し３７℃５％炭酸ガス濃度下で培養した。２継代同培地で培養後、Ｌ―グルタミン１．１７ｇ／Ｌを含むＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社）に培地を代えて馴化を行い、さらに３継代同培地で培養した。その後培地１５ｍｌで細胞浮遊させ底面積７５ｃｍ2浮遊細胞培養用フラスコに継代培養し、次いで培地４５ｍｌで細胞浮遊させ底面積２２５ｃｍ2浮遊細胞培養用フラスコに継代培養し、最終培地２００ｍｌで細胞浮遊させ底面積２２５ｃｍ2浮遊細胞培養用フラスコ４個で７日間培養を行い抗体を培地中に十分分泌させた。培養により得られた細胞培養液を５０ｍｌ遠心管４本に移し７００ｘｇ １０分遠心分離し、ハイブリドーマ培養上清２００ｍｌを得た。
（３）００１４精製抗体の調製：得られた培養上清はＮａＣｌ ３５ｇと１Ｍ ホウ酸緩衝液 ｐＨ９を１０ｍｌ加えて溶解混合し、０．８μｍのフィルターろ過を行った。あらかじめ３Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９：以下 結合緩衝液）で平衡化されたｒＰｒｏｔｅｉｎＡセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（アマシャムバイオシステムズ社製）をカラムに１ｍｌ充填し、培養上清全量を流速１ｍｌ／分でカラムに通液した。次いで５ｍｌの結合緩衝液でカラム洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３）を同流速で通液してカラムより抗体を溶出させ、抗体を含む溶出液２ｍｌを得た。ただちに１Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ９） ０．４ｍｌを加え、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ １Ｌに対して透析を実施した。ＯＤ２８０ｎｍの吸収により蛋白量を算出した結果、得られた００１４精製抗体は７．２ｍｇであった。
（４）精製抗体の電気泳動分析：５％ＳＤＳおよび２５％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む０．１５６Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）１０容に２−メルカプトエタノール１容０．１％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルー水溶液を１容加えてサンプル電気泳動用緩衝液とした。精製抗体１μｌに精製水９μＬとサンプル電気泳動用緩衝液１０μＬ加え、９５℃で５分処理した後、１０−２０％のポリアクリルアミドグラジエンドゲル中で電気泳動した。電気泳動後のゲルはクマジー染色を行ってゲル中の蛋白を可視化した。その結果、抗体の重鎖と軽鎖に相当するバンドのみが観察され、不純物に起因する他のバンドは含んでいないことが分かった。
（５）ビオチン化００１４抗体の調製：２．８ｍｇ／ｍｌの抗体液０．５ｍｌに１Ｍ 炭酸水素ナトリウム溶液５０μＬを加え混合後、次いで蒸留水にて６．７ｍｇ／１００μＬ濃度に溶解したＢｉｏｔｉｎ−ＸＸ−Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（同仁化学）を１．５μＬ添加し、緩やかに攪拌しながら室温で４時間反応させた。あらかじめＰＢＳにて平衡化しておいたＮＡＰ−５カラム（アマシャムバイオサイエンス社）に全量載せ、ＰＢＳ１ｍｌで試料を溶出させ、ビオチン化００１４抗体１．２ｍｇを得た。
（６）サンドイッチＥＩＡによる菌縣濁試料の測定：００１４精製抗体は５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１０μｇ／ｍｌになるよう希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（＃９０１８ コーニング社）の各ウエルにに５０μＬづつ分注、室温１時間放置し、プレートに抗体を固相化した。ウエル内の液体を除去後、次いで蒸留水で４倍に希釈したブロックエース（雪印乳業）を３００μＬづつ各ウェルに分注し、室温１時間放置し、ブロッキングを行った。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液 ３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、試料を５０μＬづつウェルに分注し固相抗体と１時間室温で反応させた。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液 ３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、蒸留水で１０倍に希釈したブロックエースで１μｇ／ｍｌ濃度に希釈したビオチン化００１４抗体を５０μＬづつウェルに分注し室温１時間反応させた。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液 ３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、蒸留水で１０倍に希釈したブロックエースで５０００倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＫＰＬ社）を５０μＬづつウェルに分注し室温１時間反応させた。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液 ３００μＬ分注・廃棄を４回繰り返して各ウエルを洗浄後、３，３‘−５，５’−テトラメチルベンジジン（以下ＴＭＢ）を含む西洋わさびペルオキシダーゼ基質液ＴＭＢ＋（ＤＡＫＯ社）を各ウエル５０μＬづつ分注し、室温遮光下反応させた。反応１０分後１Ｎ硫酸を各ウエル５０μＬづつ分注し、酵素反応を止め、主波長４５０ｎｍ副波長６５０ｎｍで各ウエルの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定を行った。結果を表５、表６に示す。
【００４５】
【表５】
【００４６】
【表６】
【００４７】
皮膚糸状菌とＴ．ｒ．アレルゲンを測定試料としたとき希釈系列でレスポンスが認められたが、他の菌では認められなかった。つまりＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓのみならず、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍで共通する抗原は本発明抗体を結合した担体上に捕捉可能であった。また、本発明抗体を使ったイムノアッセイでＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓのみならず、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍで共通している抗原の検出が可能であった。
【００４８】
実施例５：爪白癬患者爪での免疫染色
爪白癬患者から採取された爪はホルマリン固定後、定法に従いパラフィン包埋し、３μｍ薄切後スライドグラス上に爪白癬パラフイン標本を作製した。免疫染色は実施例１（１１）記載の方法で、ハイブリドーマ培養上清の代わりに実施例４（３）で調製した００１４精製抗体を０．１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（−）で１００μｇ／ｍｌとなるよう調製した抗体液をＰＢＳで５、１０、２５、５０、１００、２００、５００、１０００倍希釈して用いて実施し、菌の染色像とそれ以外のバックグランドとの対比を行った。結果は表７に示す。染色性が認められないものは（−）、わずかに着色が認められるものは（±）、着色が認められるものは染色強度に応じ（＋） ＜ （＋＋） ＜ （＋＋＋）と３段階で表記した。抗体濃度１乃至２０μｇ／ｍｌでバックグランドと菌を識別することが可能であった。
【００４９】
【表７】
【００５０】
【発明の効果】
本発明記載のモノクローナル抗体は皮膚糸状菌、とりわけ白癬原因菌の異なる属に渡る特異性を有している。本特性は白癬菌の分離・検出に有用で、白癬の診断・鑑別を迅速・簡易・高感度することが可能と考える。
【図面の簡単な説明】
【図１】００１１モノクローナル抗体含有培養上清を、ＮａＩＯ４処理抗原固相化プレートおよび処理なし抗原固相化プレートと作用させたときの反応性を調べたものである。
【図２】００１４モノクローナル抗体含有培養上清を、ＮａＩＯ４処理抗原固相化プレートおよび処理なし抗原固相化プレートと作用させたときの反応性を調べたものである。
【図３】００１１モノクローナル抗体含有培養上清を、プロナーゼ処理抗原固相化プレートおよび処理なし抗原固相化プレートと作用させたときの反応性を調べたものである。
【図４】００１１モノクローナル抗体含有培養上清を、プロナーゼ処理抗原固相化プレートおよび処理なし抗原固相化プレートと作用させたときの反応性を調べたものである。
【産業上の利用分野】
本発明は皮膚糸状菌に対するモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマに関するもので、本抗体を用い皮膚糸状菌、特に白癬菌の新規な分離・検出手段を提供することができる。
【０００２】
【従来の技術】
水虫は白癬菌と総称される皮膚糸状菌の皮膚角化層における感染・増殖による疾患である。白癬菌は主にトリコフィトン属の総称である。例えばＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ（以下Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ（以下Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）の２種で外来水虫患者の約99％を占めているとの報告がある（例えば、非特許文献１参照。）。また現在日本で水虫の原因となる白癬菌の種類は約１０種類といわれており、Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ以外にもＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ（以下Ｍ．ｃａｎｉｓ）、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ（以下Ｅ．ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ）などトリコフィトン属以外の皮膚糸状菌も含まれている。またネコ、ハムスターなど愛玩動物を介したＭ．ｃａｎｉｓ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ感染より白癬になるケースも近年増えつつある。
【０００３】
水虫は感染部に、炎症と激しい掻痒感を引き起こす。皮膚科外来の約１０％が水虫の患者で占められている。菌の感染部は主に足の趾間であるが、陰部や体部などにも感染し、陰部白癬や体部白癬と呼ばれている。頻度は、足が全体の８０％を占める。
【０００４】
水虫の診断は、従来、１０乃至２０％水酸化カリウム溶液により患者皮膚より採取した角化層を溶解させ、顕微鏡下で菌糸を確認する方法により行われる。さらに同定する場合は適切な培地、例えばクロラムフェニコール加サブローブドウ糖寒天培地上で２〜３週間室温または３０℃で培養の後、形態観察を行う。
【０００５】
検査の分野では、抗体の抗原特異的に結合する性質を応用し多くの検査方法・検査手段・濃縮方法が考案・利用されている。例えば（１）ホルマリンなどで固定した組織切片に抗原特異抗体を作用させ、結合した該抗体を検出し組織中の抗原局在を調べる方法（免疫組織染色）（例えば、非特許文献２参照。）（２）血球やラテックス粒子に特異抗体を固定化し試料中の抗原存在有無を凝集有無により判別するもの（凝集法）や、（３）特異抗体を固定化した不溶性担体と抗原を含む液体試料とを一定時間反応させＢ／Ｆ分離し、さらに別の標識化抗体と一定時間反応させ形成した標識化抗体−抗原−固定化抗体複合体を検出するもの（サンドイッチイムノアッセイ）（例えば、非特許文献３参照。）（４）移動展開可能な多孔性担体上で標識化抗体と反応させた測定対象物―標識化抗体複合体を該多孔性担体移動展開層途中に設けられた固定化抗体層にて捕捉させ形成する標識化抗体−抗原−固定化抗体複合体を検出するもの（イムノクロマト法）（例えば、特許文献１参照。）（５）被検試料と特異抗体固定化粒子担体とを反応させて抗体と結合する菌を粒子担体上の一部位に濃縮捕捉するもの（例えば、特許文献２参照。）などが知られている。
【０００６】
またそれら分析に使用するカンジダやアスペルギルス、サッカロマイセスなど真菌に対する抗体も種々作製されている（例えば、特許文献３〜５など参照。）。またカンジダやアスペルギルスの真菌細胞壁上に発現している（１→３）−β−Ｄ−グルカンを特異的に認識する抗体も作製されている（例えば、特許文献６参照。）。
【０００７】
皮膚糸状菌に関するモノクローナル抗体が開示されている（例えば、非特許文献３参照。）。それによるとＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓアレルゲンＩを抗原としてモノクローナル抗体を作成し、阻害イムノアッセイや２種の異なるモノクローナル抗体を使ったサンドイッチイムノアッセイを検討し、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ（以下Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）のみならずＴ．ｒｕｂｒｕｍやＴ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓとの交差反応を認めたとの記載がある。また同様にＴ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓ抽出物から精製されたＰｒｏｔｅｉｎＩＶを抗原としてモノクローナル抗体を作製し、Ｔ．ｔｏｎｓｕｒａｎｓのみならずＴ．ｒｕｂｒｕｍやＴ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓの培地ろ過物中に反応するｐｒｏｔｅｉｎＩＶ成分を認められたことが開示されているが、その他Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｍｉｘなどの皮膚テスト用抽出物中には認められなかったと開示されている（例えば、非特許文献４参照。）。
【０００８】
【特許文献１】
特開２０００−３５４２９号公報
【特許文献２】
米国特許第５６９５９４６号明細書
【特許文献３】
特開昭５９−１８６９２５号公報
【特許文献４】
特開５９−１８６９２６号公報
【特許文献５】
特開平０７−２５０６７６号公報
【特許文献６】
特再平０８−８０６８５８号公報
【非特許文献１】
日本医真菌学会疫学調査委員会，「１９９２年次皮膚真菌症疫学調査成績」，日本医真菌学会雑誌，１９９５年，第３６巻，ｐ．８７−９５
【非特許文献２】
福井三郎編，「モノクローナル抗体」（１９８６年３月１０日第１刷発行），講談社サイエンティフィック，ｐ．７８
【非特許文献３】
Ｄｅｕｅｌｌら，「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」，１９９１年，第１４７巻，ｐ．９６−１０１
【非特許文献４】
Ｗｏｏｄｆｏｌｋら，「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」，１９９６年，第１５６巻，ｐ．１６９５−１７０１
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
足の趾間の掻痒感と水泡形成などで患者自身の判断で水虫と判断して、市販の薬を使用することも多いと思われる。しかし、足の趾間にこのような掻痒感や炎症をきたす疾患は水虫だけではない。例えばアトピー性皮膚炎も水虫と似たような症状を引き起こす。重要な点はこのような疾患の治療は、水虫の治療とは全く異なっていることである。このため間違った自己診断に基づく治療により炎症がながびき、なかなか治らないケースも多い。
簡易に水虫かそれ以外の疾患かを区別できる方法が望まれるが白癬は上述のように皮膚科領域で非常に患者の多い病気にも関わらず、白癬原因菌の簡易検出によい方法はない。従来から行われている水酸化カリウム溶液により患者皮膚より採取した角化層を溶解させ、顕微鏡下で菌糸を確認する方法は顕微鏡と加熱用アルコールランプが備えた施設であれば検査できる方法であるが、熟練を必要とし、時として菌糸と塵との鑑別を見誤ると鏡検で菌を見逃すこともある。また培養検査法は見逃しの少ない方法であるが時間がかかるのが難点である。特異抗体を使わない水虫の検出法として特開２００１−１８７７５０に硫酸銅溶液を用い水虫菌感染部位検知方法が記載されているが、我々が検討した範囲では爪白癬では健常者と有意差は認められなかった。
白癬原因菌に特異的な抗体を前述の従来技術に適用すれば、目的とする簡易検出は比較的容易と考えられるが、未だ実用に至っていない。白癬原因菌は主にトリコフィトン属であるが他の属の菌種も含まれており、これら属を横断的に反応しうる抗体は知られていない。一方単純に検出の菌種を広げるた目的で菌特異性の異なる複数の抗体を混合使用すれば特異性面は解決できるが、抗体それぞれで保存安定至適条件や抗体保存安定性が異なることが多く、製造後の経時変化により特性変化する可能性があり実際に製品化を考えた場合好ましいとはいえない。よって本発明の課題は、皮膚糸状菌の検出に有用な、とりわけ白癬原因菌の異なる属に渡る特異性を有するモノクローナル抗体を提供することにある。
【００１０】
【問題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、トリコフィトンルブルムアレルゲンを抗原としてマウスを免疫し、脾臓細胞をマウスミエローマ細胞株と融合させてハイブリドーマを作製し、その中から免疫原に反応しかつ各種皮膚糸状菌に反応する抗体をスクリーニングしたところ、Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓのみならず、Ｍ．ｃａｎｉｓ、Ｅ．ｆｌｏｃｃｏｓｕｍにも反応性を有するモノクローナル抗体の存在を初めて見い出し、本発明に到達した。
【００１１】
即ち本発明は、以下の（１）から（４）に関する。
（１）以下に示す皮膚糸状菌のうち少なくとも３種以上と反応性を有することを特徴とするモノクローナル抗体。
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ
Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ
Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ
Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ
（２）上記（１）記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
（３）受託番号ＦＥＲＭ Ｐ-１９０５７として寄託されている上記（２）のハイブリドーマ。
（４）上記（３）記載のハイブリドーマを利用して抗体あるいは抗体断片を得ることを特徴とする抗体生産方法
【００１２】
本発明で記載した皮膚糸状菌は白癬の起因菌である。例えばＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇｌａｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｈｏｅｎｌｅｉｎｉｉ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｅｕｍ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｖａｎｂｒｅｕｓｅｇｈｅｍｉｉ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｓｉｍｉｉ、Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ ｂｅｎｈａｍｉａｅが挙げられる。
【００１３】
本発明で記載した皮膚糸状菌Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｍ．ｃａｎｉｓ、Ｅ．ｆｌｏｃｃｏｓｕｍは、患者や生活環境などから分離同定されたものでも、公的機関から入手したものでもよい。公的機関としてはたとえばアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）や独立行政法人製品評価技術基盤機構・生物遺伝資源センターが挙げられる。これら菌を増やすには適当な培地で培養する。培養に使用する培地は皮膚糸状菌で一般的に使用されているサブロー・ブドウ糖寒天培地を用いてもよいし、公的機関で公開されている該菌培養方法記載の培地に従ってもよい。培養温度は１０乃至４０℃好ましくは２０乃至３０℃であり、好気環境下静置して培養することが望ましい。菌の種類を同定は公知の分離同定方法、例えば カビの分離・培養と同定 宇田川俊一・室井哲夫／訳 １９８３年 医歯薬出版、真菌症遺伝子診断 槙村浩一／編 メジカルセンス １９９７年 などに記載された方法により分離同定することができる。
【００１４】
モノクローナル抗体作製に使用する免疫用抗原およびスクリーニング用抗原は、上記菌株を培養して得られた菌体で水性縣濁液を調製することにより得られる。縣濁に使用する液は特に限定しないがｐH5〜９の範囲の緩衝液が好ましい。縣濁前か縣濁後に、安定化剤として例えばグリセロールやフェノールなどを適量添加してもよい。縣濁は菌体を適当な試験管中で物理的に十分振とうさせて分散させてもよいが、ホモジナイザーを使った方法や超音波破砕やビーズ破砕など従来から知られる方法により菌体を強制破砕してもよい。得られた縣濁液はそのまま免疫に供してもよいし、適当なメッシュのフィルターでろ過、あるいは遠心分離により調製したものを使用してもよい。また同様の調製方法で得られた上記菌の水性縣濁液であれば市販品、例えばＴ．ｒｕｂｒｕｍアレルゲンやＴ．Ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓアレルゲンを抗原として利用してもよい。
【００１５】
本発明のモノクローナル抗体およびハイブリドーマは、公知のモノクローナル抗体作成法（単クローン抗体実験マニュアル 富田朔ニ・安東民衛／編 講談社サイエンティフィク １９８７年、免疫研究法ハンドブック 藤原大美・淀井淳司／編 中外医学社 １９９６年、組織培養の技術［第３版］応用編 日本組織培養学会／編 朝倉書店 １９９９年）に従い、例えば以下のような手順で作製することができる。
【００１６】
動物の免疫に使用する被免疫動物としては、公知のハイブリドーマ作製法に用いられる哺乳動物を使用することができる。具体的には、例えばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマなどである。ただし摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性などの観点からは、マウスおよびラットを被免疫動物とするのが好ましい。また、実際に使用するマウスおよびラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、例えば各系統Ａ，ＡＫＲ，ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、５７ＢＬ，Ｃ５７ＢＲ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴ−１、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、ＲＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、またラットの場合には、たとえば、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｑｕｅ、Ｄａｗｅｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃｈｅｒなどを用いることができる。このうち、後述のミエローマ細胞との融合適用性を勘案すれば、マウスではＢＡＬＢ／ｃ系統が、ラットではｌｏｗ系統が被免疫動物として特に望ましい。なお、これらマウスまたはラットの免疫時の週令は５〜１２週令が好ましい。
【００１７】
動物の免疫は、免疫原である上記菌縣濁液を動物の皮内、腹腔内またはに投与することによって行うことができる（生体内免疫）。投与スケジュールは被免疫動物の種類、個体差により異なるが、一般には、抗原投与回数２〜６回、投与間隔１〜２週間が好ましい。また抗原の投与量は動物の種類、個体差等により異なる。一般には１０―１００μｇ／匹・回程度といわれているが、投与量を変えて免疫を実施し血清中や血漿中抗体価の最も高い被免疫動物を選択することもできる。投与する際はアジュバントとよばれる免疫活性化物質と共に投与してもよい。たとえばアジュバントとして、フロイント完全アジュバンド、フロイント不完全アジュバント、ＣｐＧ ＤＮＡ，ムラミルジペプジド、リポポリサッカライドなどが挙げられる。また動物の免疫法として上述の方法の代わりに生体外免疫法と呼ばれる方法、具体的にはあらかじめ脾臓細胞またはリンパ細胞を無菌的に取りだした後、アジュバンド物質、免疫原とともに動物培養用培地中炭酸ガス存在下で２〜７日間培養することで実施してもよい。
【００１８】
細胞融合に際して、生体内免疫の場合では上記の抗原投与スケジュールの最終免疫日から１〜５日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞またはリンパ細胞を無菌的に取り出す。これらの脾臓細胞またはリンパ細胞からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法に従って行うことができる。生体外免疫の場合は免疫原と共に培養した細胞を引き続き用いることができる。
【００１９】
細胞融合には上記の抗体産生細胞とミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続きが確立しているＨＧＰＲＴ（Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase）欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由来のX63-Ag8(X63),NS1-Ag4/1(NS-1),P3X63-Ag8.U1(P3U1),X63-Ag8.653(X63.653),SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG),F0,S149/5XX0,BU.1等、ラット由来の210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等、ヒト由来のU266AR(SK0-007),GM1500・GTG-A12（GM1500）,UC729-6,LICR-LOW-Hmy2(Hmy2), 8226AR/NIP4-1(NP41)などである。
【００２０】
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件で適宜実施することができる。そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコールなどの高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法などを用いることができる。
【００２１】
融合細胞と非融合細胞の選択は、例えば、公知のＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法により行うのが好ましい。この方法は、アミノプテリン存在下で生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いて融合細胞を得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞および融合細胞をＨＡＴ培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせた融合細胞のみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。ＨＡＴ培地や後述のクローニングなど細胞培養に使用する培地は、公知のものを使用すればよく、例えばＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ｅＲＤＦ、ＩＭＤＭなどが使用できる。同時に動物血清や増殖因子、コンディションドメディウム、抗生物質等、蛋白質などを添加してもよいが、限界希釈などでクローニングを行う場合はこれらを組み合わせて添加することが好ましい。動物血清であれば例えばウシ胎児血清を１乃至２０％添加してもよいし、増殖因子であれば例えばＩＬ−６、インシュリン、エタノールアミン、セレン、２メルカプトエタノール、ピルビン酸、非必須アミノ酸類を添加してもよいし、コンデションメディウムであれば例えば胸腺細胞培養後の培養上清５％乃至２０％を添加してもよいし、抗生物質であれば例えばゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリンを添加してもよいし、蛋白であれば例えばウシ血清アルブミン、カゼイン、トランスフェリンを添加してもよい。細胞を培養する温度は細胞が増殖する温度であればよいが例えば３７℃でおこなうことができる。培地中に炭酸水素ナトリウムを加える場合には炭酸ガス存在下例えば培地中のｐＨが中性となる炭酸ガス５％乃至１０％で培養するのが好ましい。
【００２２】
目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングは、公知の酵素免疫検定法（ＥＩＡ：Enzyme Immunoassay）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ：Radio Immunoassay）、蛍光抗体法、免疫染色法などにより行うことができる。
【００２３】
ＥＩＡやＲＩＡでスクリーニングを実施する場合、スクリーニングに使用する抗原は免疫原として使用した菌水性縣濁液あるいはアレルゲン溶液を使用することができる。固相への抗原の固定化は公知の方法に従い、例えばダルベッコのリン酸生理緩衝液（ＰＢＳ（−））や０．０５Ｍ 炭酸緩衝液にて希釈した菌縣濁液を２〜４０℃の範囲で３０分ないし一晩固相と接触させてもよいし、グルタルアルデヒドやカルボジイミドといった架橋試薬を使用し共有結合的に固相表面の官能基と結合させてもよい。固相の材質は公知のものを使用することができ、例えばポリスチレン、ガラス、シリカ、セルロース、ポリビニル、ナイロン、ニトロセルロース、ＰＶＤＦなどが挙げられる。抗原を結合後、非特異的な蛋白吸着を抑える目的で他の蛋白・界面活性剤やポリマー・血清などの含む溶液を固相に接触させるブロッキング工程を実施することが好ましい。ブロッキングに使用する蛋白質として、例えば牛血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、オボアルブミンが挙げられ、０．１乃至１０％溶液を調製し使用することができる。ブロッキングに使用する界面活性剤やポリマーとして、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（TWEEN２０）、ポリビニルアルコールなどが挙げられ、０．０１乃至０．５％溶液を調製し使用することができる。ブロッキングに使用する血清として、例えば牛胎児血清、新生牛血清、ウマ血清、ヤギ血清、ウサギ血清、ラット血清、モルモット血清、ブタ血清、マウス血清が挙げられ、０．５％乃至１００％溶液を使用することができる。血清や蛋白をブロッキングに使用する場合は免疫動物とスクリーニングに使用する特異抗体検出用ニ次抗体の交差特異性を考慮して選択使用することが好ましく、たとえばマウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングする場合には牛血清アルブミン溶液などマウス由来でない蛋白含有溶液でブロッキングを実施し、ウシ抗体に交差反応性を示さないか、もしくはほとんど示さない２次抗体を使い検出することが好ましい。ブロッキングは例えば２℃乃至４０℃の範囲で行うことができる。時間は例えば３０分乃至１日間行うことができるが、ブロッキングに使用する溶液に適切な防腐剤、例えば０．０５％アジ化ナトリウムを添加しておき、ブロッキング後にそのまま保存することもできる。
【００２４】
蛍光抗体法や免疫染色法でスクリーニングに使用する標本は、あらかじめ菌を塗沫し、固定し、水洗後さらに必要に応じてブロッキングと洗浄を行ったスライドグラスを使用できる。また菌を塗布することなく培養菌塊をホリマリン固定パラフィン包埋し、公知の方法で組織標本切片を調製することもできる。
【００２５】
複数種の菌に対する反応性を有する抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングは、確認したい各菌それぞれに反応する抗体産生の有無を検知して実施できる。
【００２６】
例えばＲＩＡやＥＩＡでスクリーニングを行うのであればＴ．ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｍ．ｃａｎｉｓ、Ｅ．ｆｌｏｃｃｏｓｕｍの各種菌抗原をそれぞれ単独で固相化した固相を用意し、適度に希釈した同一ハイブリドーマ培養上清試料を同固相と反応させ、Ｂ／Ｆ分離後さらに標識ニ次抗体を反応させ、さらにＢ／Ｆ分離後固相に残った標識二次抗体を検出し、各抗原間の反応性を比較し３種類以上の菌と反応性が確認できたものを候補として選抜してもよい。また例えばＴ．ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｍ．ｃａｎｉｓ、Ｅ．ｆｌｏｃｃｏｓｕｍのうち１種または２種以上の菌種抗原を固相化した抗原を用意し、適度に希釈した同一ハイブリドーマ培養上清試料を同固相と反応させ、Ｂ／Ｆ分離後さらに標識ニ次抗体を反応させ、さらにＢ／Ｆ分離後固相に残った標識二次抗体を検出し、反応性が確認できたものを第一スクリーニング候補として選抜し、その後選抜された集団の培養上清を試料としてＥＩＡ，ＲＩＡ，蛍光抗体法、免疫染色法などの方法でＴ．ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｍ．ｃａｎｉｓ、Ｅ．ｆｌｏｃｃｏｓｕｍとの反応性を検討し、二次スクリーニング選抜を行ってもよい。一次スクリーニングと二次スクリーニングは引き続き実施してもよいし、一次スクリーニングの後にクローニングを実施し、細胞として単一集団とした後に二次スクリーニングを実施してもよい。
【００２７】
また例えば免疫染色法にてスクリーニングを行うのであればＴ．ｒｕｂｒｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｍ．ｃａｎｉｓ、Ｅ．ｆｌｏｃｃｏｓｕｍの各種菌をそれぞれ単独で固相化した標本を用意し、適度に希釈した同一ハイブリドーマ培養上清試料を同標本と一定時間反応させ、洗浄後さらに酵素標識ニ次抗体を反応させ、さらに洗浄後標本上に残った標識二次抗体の有無を色原体である酵素基質を標本上に接触させて標本上の染色性を各種菌に対する標本間で比較し３種類以上の菌で反応性が確認できたものを候補として選抜してもよい。
【００２８】
スクリーニングにより選択されたハイブリドーマ細胞は、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法などの公知の方法によりクローニングし、抗体産生に用いる。
【００２９】
以上の通りの方法によって得たハイブリドーマ細胞は、液体窒素中または−８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。細胞凍結時の細胞濃度は１ｘ１０６／ｍｌ乃至１ｘ１０７／ｍｌの範囲が好ましく、凍結時安定化剤として培地に５乃至１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドを添加してもよい。
【００３０】
本発明の抗体生産方法は上記の方法で作製したハイブリドーマ細胞を公知の方法で培養することによって所望のモノクローナル抗体を得ることができる。例えばマウスに免疫して作成したハイブリドーマであれば、あらかじめプリスタン等の鉱物油を投与したマウスの腹腔に該細胞を移植すると１乃至３週間でモノクローナル抗体を含んだ腹水が得られる。また例えばハイブリドーマを培地中で培養するとハイブリドーマからモノクローナル抗体が分泌され、該抗体を含んだ培養上清が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ腹水や培養上清は公知の抗体精製手法でより純度の高いモノクローナル抗体を得ることができる。
【００３１】
また本発明の抗体生産方法は上述のハイブリドーマで発現している抗体をコードする遺伝子あるいは遺伝子断片を公知の技術で取得し、公知の遺伝子組換え技術により発現ベクターを組み込んだ形質転換体を培養することにより所望のモノクローナル抗体を得ることができる。抗体生産により抗体が形質転換体内に蓄積される場合は公知の方法により形質転換体を回収し破砕することにより抗体を含んだ破砕液が得られる。抗体生産により形質転換体を培養した培地中に抗体が分泌される場合には形質転換体培養により該抗体を含んだ培養上清が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ破砕液や培養上清は公知の抗体精製方法でより純度の高いモノクローナル抗体を得ることができる。
また本発明の抗体生産方法は上述のハイブリドーマで発現している抗体をコードする遺伝子あるいは遺伝子断片を公知の技術で取得し、該抗体遺伝子あるいは遺伝子断片から結合活性を有する蛋白部分をコードするメッセンジャーRNAを公知の方法で合成し公知の無細胞蛋白合成方法により抗体生産することもできる。抗体生産により該抗体を含んだ蛋白合成反応液が得られる。必要に応じて該抗体を含んだ蛋白合成反応液は公知の抗体精製方法でより純度の高いモノクローナル抗体を得ることができる。
【００３２】
抗体精製方法として例えば、硫安塩析、カラムクロマトが挙げられる。カラムクロマトに使用できる樹脂担体として例えば陰イオン交換樹脂やプロテインＡやプロテインＧ、ＰｒｏｔｅｉｎＬなどのアフィニティクロマト樹脂、ハイドロキシアパタイト樹脂、疎水クロマト樹脂などの抗体吸着性のあるものや、架橋デキストラン樹脂やアガロース樹脂など分子量で樹脂内移動度の異なることを利用したゲルろ過担体が挙げられる。これら精製操作を行う前にモノクローナル抗体のサブタイプを調べておき適切な精製手段を選択することが望ましい。精製後の抗体は透析などの方法でｐＨ中性の緩衝液にバッファー交換を行うことが好ましく、ｐＨ中性の緩衝液として例えば生理的食塩濃度のリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））や生理的食塩濃度のトリス緩衝液（ＴＢＳ）を用いることができる。本緩衝液のｐHは５．５〜８．５の間が好ましい。
【００３３】
このようにして得られたモノクローナル抗体は溶液状態や凍結状態で保存することができる。液状で保存する場合は防腐剤を添加したり、０．２２μｍメッシュの滅菌フィルターなどで無菌ろ過後滅菌容器中に保存することが好ましい。防腐剤として例えば０．０５％アジ化ナトリウムを添加することができる。容器の滅菌方法は公知の方法で実施すればよく、例えばγ線照射滅菌、ＵＶ照射滅菌、オートクレーブ滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌などが挙げられる。保存容器は保存中抗体と反応しない不活性な素材を使用したものが使用でき、例えば、ガラス、ポリエチレン、ポリプロピレンである。抗体の結合活性を損なわない方法であれば保存容器表面に吸着しないよう表面加工を行った容器を使用してもよい。液状での保存温度は凍結しない温度であればよいが、蛋白変性を抑えるためできるだけ低温であることが好ましく、より好ましくは２乃至１０℃である。また凍結を防止することのできる濃度で凍結防止剤を添加するとさらに低温で保存することもでき、例えば終濃度５０％のグリセロールを添加すると−２０℃でも凍結することなく液状で保存することができる。凍結状態で保存する場合は−２０℃以下、より好ましくは−３０℃以下で保存することが好ましい。保存時の抗体濃度は沈殿を生じない濃度で設定することができるが、好ましくは０．１乃至５ｍｇ／ｍｌである。また安定化剤として蛋白質、水溶性ポリマー高分子、界面活性剤、糖類、糖アルコールを添加することもできる。安定化蛋白質の例としてウシ血清アルブミンやゼラチンなどが挙げられ、保存中沈殿が生じない濃度で添加することができる。濃度範囲としてより好ましくは０．１乃至５ｍｇ／ｍｌである。
【００３４】
【実施例】
以下に実施例を示してこの発明を詳細かつ具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１：抗皮膚糸状菌モノクローナル抗体の作成
（１）皮膚糸状菌の培養：財団法人発酵研究所より分与された皮膚糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ（ＩＦＯ番号９１８５、３２４０９）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ（ＩＦＯ番号６２０２、３２４１０）、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ（ＩＦＯ番号３２４６３）、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ（ＩＦＯ番号３２４６１）は所定の方法でアンプルから復元し、サブローデキストロース寒天スラント（ベクトンディキンソン社）に接種し、室温で１週間培養した。
（２）抗原溶液の調製：Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍアレルゲン（２００００ＰＮＵ／ｍｌ：１ＰＮＵ(ＰＲＯＴＥＩＮ ＮＩＴＲＯＧＥＮ ＵＮＩＴ)は１．０ｘ１０-6ｇのリンタングステン酸沈殿物を生ずるタンパク性窒素を示す。ＧＲＥＥＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ社）をリン酸緩衝生理食塩水（以下 ＰＢＳ（−））にて希釈し、１００００ＰＮＵ／ｍｌ抗原液（以下抗原液Ｈ）とと１０００ＰＮＵ／ｍｌ抗原液（以下抗原液Ｌ）を2種調製した。
（３）マウスの免疫：フロインド完全アジュバンド５００μＬに上記２種の抗原液それぞれで５００μＬを混合・エマルジョンとし、各エマルジョンを２００μＬ／匹でＢＡＬＢ／ｃＡ ♀５週令２匹づつ計４匹腹腔に注射した。（この日を０日目とする。）１４日目、２１日目、２８日目に上述と同様に各抗原液４００μＬとフロイント不完全アジュバンド４００μＬを混合・エマルジョンとし、そのうちの１００μＬをマウス腹腔に注射した。
（４）マウス血清の取得：３２日目に生存していたマウス（抗原液Ｈで調製したエマルジョンを腹腔注射したマウス個体１匹（Ｈ−＃１）、抗原液Ｌから調製したエマルジョンを腹腔注射したマウス個体２匹（Ｌ−＃１、Ｌ−＃２））から尾より血液を採取した。血液は室温３０分放置後、凝固した血餅を３０００ＲＰＭ１０分の遠心操作により分離し、血清を取得した。
（５）ＥＬＩＳＡによる血清抗体価の確認：採取した血清はＰＢＳ（−）で１０００倍希釈から１２８０００倍希釈まで希釈を行い、試料として用いた。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍアレルゲンをＰＢＳ（−）で２００ＰＮＵ／ｍｌとなるよう希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（＃９０１８ コーニング社）の各ウエルにに５０μＬづつ分注、室温１時間放置し、プレートに抗原を固相化した。ウエル内の液体を除去後、次いで蒸留水で４倍に希釈したブロックエース（雪印乳業）を３００μＬづつ各ウェルに分注し、室温１時間放置し、ブロッキングを行った。ウエル内の液体を除去し、次いで０．０５％（ｗ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０含有ＰＢＳ（以下 洗浄液）３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、試料を５０μＬづつウェルに分注し固相抗原と１時間室温で反応させた。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、蒸留水で１０倍に希釈したブロックエースで２０００倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン ウサギ抗体（ＤＡＫＯ社）を５０μＬづつウェルに分注し室温１時間反応させた。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、３，３‘−５，５’−テトラメチルベンジジン（以下ＴＭＢ）を含む西洋わさびペルオキシダーゼ基質液ＴＭＢ＋（ＤＡＫＯ社）を各ウエル５０μＬづつ分注し、室温遮光下反応させた。反応１０分後１Ｎ硫酸を各ウエル５０μＬづつ分注し、酵素反応を止め、主波長４５０ｎｍ副波長６５０ｎｍで各ウエルの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定を行った。対照として抗原を固相化していないプレートでも、ブロッキング以下同様の操作を実施した。測定した吸光度を表１に示す。
【００３５】
【表１】
２０００ＰＮＵ−１０００ＰＮＵ／回注射した個体Ｈ−＃１でＬ−＃１，Ｌ−＃２に比して著しく高い抗体価が見とめられ、マウス個体Ｈ−＃１を使って細胞融合することとした。４１日目、５５日目、５６日目、５７日目にＰＢＳ（−）で２倍希釈したＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍアレルゲン１００μＬを腹腔内に注射し、細胞融合に備えた。
（６）細胞融合：骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４を１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬）で３７℃５％炭酸ガス濃度下で培養、継代した。５８日目に個体Ｈ−＃１から無菌的に脾臓を摘出し、ｅ−ＲＤＦ培地中で臓器をよく洗浄した。２０ｍｌのｅ−ＲＤＦ培地を入れた１０ｃｍφシャーレ中に脾臓を入れ，クリーンベンチ内で滅菌ピンセットで脾臓に端を固定したまま２２ゲージ注射針先端で切りこみを入れ、さらにしごくように脾臓から脾臓細胞を無菌的に押しだし、さらにピペット操作により細胞塊をよくほぐした。セルストレイナーを上部に装着した５０ｍｌ遠心管に細胞縣濁液を移し、引き続いて２００ｘｇ １０分遠心分離を行い、上清を廃棄した。２０ｍｌ ｅ−ＲＤＦ培地を添加しピペット操作により沈降した細胞を縣濁させ、さらにもう１回遠心分離、上清廃棄、培地での細胞縣濁を実施した。血球計算盤にて細胞数をカウントしたところ、１．１ｘ１０8個であった。得られた脾臓細胞の１／１０量にあたる１．１ｘ１０7個の骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４を添加するため、ｅ−ＲＤＦ培地で細胞を洗浄した。すなわち１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬）で培養した７ｘ１０5／ｍｌのＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞培養液２０ｍｌを１５０ｘｇ ５分遠心分離により細胞のみを分離し、上清を廃棄し、ｅ−ＲＤＦ培地２０ｍｌを加え、ピペット操作で細胞を縣濁し、さらに遠心分離、上清廃棄、培地での細胞縣濁の操作を２回繰り返し、最終的にｅ−ＲＤＦ培地に縣濁されたＳｐ２／０−Ａｇ１４を得た。１．１ｘ１０7個のＳｐ２／０−Ａｇ１４を脾臓細胞の入った５０ｍｌの遠心管に添加しピペット操作でよく混合した後、２００ｘｇ １０分遠心分離を行った。上清廃棄後チューブごとタッピングして細胞塊をほぐした後、３７℃環境下で５０％ポリエチレングリコール１５００液（ロシュ社）を１ｍｌ添加し細胞と混合、次いでｅ−ＲＤＦ培地を１ｍｌ、３ｍｌ、１０ｍｌの順に添加した。１５０ｘｇ ５分遠心分離後、そのまま３７℃で５分間放置し、その後上清を廃棄した。パスツールピペットを使って選択培養培地（１００ｘＨＡＴサプリメント（ＧＩＢＣＯ社）１／１００容とＣｏｎｄｉｍｅｄＨ１（ロシュ社）１／１０容、牛胎児血清１／１０容を含むｅ−ＲＤＦ培地）１９２ｍｌに細胞全量を縣濁し、ふたつき９６穴浮遊細胞培養用プレート（住友ベークライト社製）１０枚に２００μＬづつ各ウェルに無菌的に分注した。３７℃５％炭酸ガス条件下で９日間ＨＡＴ選択培養を行った。
（７）抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング：選択培養後の各ウェル培養上清５０μＬをＰＢＳ（−）２００μＬで希釈し、試料として用いた。Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍアレルゲンをＰＢＳ（−）で２００ＰＮＵ／ｍｌとなるよう希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（＃９０１８ コーニング社）の各ウエルにに５０μＬづつ分注、室温１時間放置し、プレートに抗原を固相化した。またＴｒｉｃｈｉｐｈｙｔｏｎｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓアレルゲン（２００００ＰＮＵ／ｍｌ ：ＧＲＥＥＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ社）についてもＰＢＳ（−）で２００ＰＮＵ／ｍｌとなるよう希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（＃９０１８ コーニング社）の各ウエルにに５０μＬづつ分注、室温１時間放置し、プレートに抗原を固相化した。ウェル内の液体を除去後、次いで蒸留水で４倍に希釈したブロックエース（雪印乳業）を３００μＬづつ各ウェルに分注し、室温１時間放置し、ブロッキングを行った。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、試料を５０μＬづつウェルに分注し固相抗原と１時間室温で反応させた。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液 ３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、蒸留水で１０倍に希釈したブロックエースで２０００倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン ウサギ抗体（ＤＡＫＯ社）を５０μＬづつウェルに分注し室温１時間反応させた。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液 ３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、ＴＭＢを含む西洋わさびペルオキシダーゼ基質液ＴＭＢ＋（ＤＡＫＯ社）を各ウエル５０μＬづつ分注し、室温遮光下反応させた。反応１０分後１Ｎ硫酸を各ウエル５０μＬづつ分注し、酵素反応を止め、主波長４５０ｎｍ副波長６５０ｎｍで各ウエルの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定を行った。対照として抗原を固相化していないプレートでも、ブロッキング以下同様の操作を実施した。９６０ウェルの培養上清希釈液を測定し、５ウェルで抗原固相との反応性が認められた。
表２にＥＬＩＳＡでの吸光度を示す。
【００３７】
【表２】
ウェル番号００１１、００１４でＴ．ｒｕｂｒｕｍ抗原、Ｔ．Ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ抗原ともに反応性が認められた。１次スクリーニングとして本２ウェルを選抜し、引き続きクローニングを実施した。
ハイブリドーマのクローニング：限界希釈法によりクローニングを実施した。すなわちスクリーニングで選抜した各選択培養ウェルの細胞を１００個となるよう無菌的にサンプリングし、それぞれクローニング培地（ＣｏｎｄｉｍｅｄＨ１（ロシュ社）１／１０容、牛胎児血清１／１０容を含むｅ−ＲＤＦ培地）２０ｍｌに対し、最終５個／ｍｌになるよう縣濁し、ふたつき９６穴浮遊細胞培養用プレート（住友ベークライト社製）各１枚９６ウェルに２００μＬづつ無菌的に分注した。３７℃５％炭酸ガス条件下で１０日間培養を行った。各ウェルのクローニング培養後上清５０μＬをサンプリングし、ＰＢＳ（−）２００μＬで希釈しＥＬＩＳＡ試料とし、１次スクリーニングと同様にＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍアレルゲン、Ｔｒｉｃｈｉｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓアレルゲン、固相抗原なしの３種の固相を用い、ＥＬＩＳＡを実施し、Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ抗原、Ｔ．Ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ抗原ともに反応性が認められた培養上清をサンプリングしたウェルから各１ウェル選抜し１次クローニング後のハイブリドーマ細胞を得た。ひきつづき同様の方法を繰り返し、二次クローニング、三次クローニングを実施し、最終的に抗体産生ハイブリドーマ００１１，００１４を得た。なお、本発明のハイブリドーマ００１４は独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにＦＥＲＭ P−１９０５７として寄託されている。
（８）得られたハイブリドーマは１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地中で３７℃５％炭酸ガス濃度下で培養、継代し、得られた細胞は最終１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシドと１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を添加したｅ−ＲＤＦ培地１ｍｌに５ｘ１０6個を無菌的に縣濁し、２ｍｌセラムチューブ（住友ベークライト）中で、氷中５分、−２０℃５０分、−８０℃１２時間保存し、最後に液体窒素中で保存した。
（９）各ハイブリドーマ培養上清の調製：液体窒素中で凍結保存されていたハイブリドーマ００１１、００１４の入ったチューブは−８０℃１時間保存後、３７℃の温湯中ですばやく融解させた。それぞれ１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地１０ｍｌの入った遠心管中に全量入れ、ピペット操作で細胞縣濁した。１５０ｘｇ ５分遠心し、上清を廃棄後、５ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地にピペット操作で細胞を浮遊させ、底面積２５ｃｍ2浮遊細胞培養用フラスコにそれぞれ播種した。３７℃５％炭酸ガス濃度下で培養し２継代した後、培地１５ｍｌで細胞浮遊させ底面積７５ｃｍ2浮遊細胞培養用フラスコで７日間培養を行い抗体を培地中に十分分泌させた。培養により得られた細胞培養液を５０ｍｌ遠心管に移し７００ｘｇ １０分遠心分離し、ハイブリドーマ培養上清を得た。５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム水溶液を各培養上清の１／１００容添加し、０．２２μｍフィルターでろ過後、γ線滅菌されたポリプロピレン製チューブに分注し、−２０℃で凍結保存した。
（１０）モノクローナル抗体のサブタイピング：市販のイムノクロマト法を使ったサブタイピング試薬（イソストリップ：ロシュ社）を使い、ＰＢＳ（−）で１０倍希釈した培養上清希釈液１５０μＬを試料として分析した。ハイブリドーマ００１１の培養上清に含まれるモノクローナル抗体のサブタイプはＩｇＭ κ、ハイブリドーマ００１４の培養上清に含まれるモノクローナル抗体のサブタイプはＩｇＧ1 κであった。
（１１）二次スクリーニングに使用する皮膚糸状菌ホルマリン標本・塗沫標本の調製：皮膚糸状菌ホルマリン標本は以下のように調製した。サブローデキストロース寒天スラント上に増生した各種皮膚糸状菌の菌塊をそれぞれ培地と一緒に中性緩衝１０％ホルマリン溶液で1日固定後、アルコール７０％、８０％、９０％、１００％、１００％、１００％、１００%アルコール槽へ各２時間ずつ浸漬して脱水し、次にキシレン槽３槽に各２時間で浸漬し透徹を行った。次いでパラフィン槽４槽各２時間浸漬しパラフィンを浸透させ、さらに溶解したパラフィンをいれた包埋皿に菌と培地の塊を入れてパラフィンの固化を待ち、パラフィンブロックを作製した。次いで４μｍに薄切して、スライドグラス上に皮膚糸状菌ホルマリン固定パラフィン標本を作成した。塗沫標本は以下のように調製した。滅菌生理的食塩水で少し濡らした清潔な綿棒でサブローデキストロース寒天スラント上に増生した各種皮膚糸状菌を擦り取るように採取し、スライドグラスに押しつけ、搾り出すように綿による摩擦面を転がす要領で塗沫し、すぐに９５％エタノール液中で３０分固定することにより作成した。
（１２）免疫染色によるモノクローナル抗体の二次スクリーニング：皮膚糸状菌のホルマリン固定パラフィン標本はあらかじめ脱パラフィン操作を実施し、免疫染色を実施した。０．３％過酸化水素加メタノールに３０分浸漬し、水洗した後に１０％（ｖ／ｖ）正常ウサギ血清を添加したＰＢＳを切片上に滴下し、室温で３０分置いた。ＰＢＳで洗浄後、ハイブリドーマ培養上清００１１、００１４はＰＢＳで５０倍希釈し、室温湿室内で1時間反応させた。ＰＢＳ洗浄後、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋（ダコ社）を標本上に滴下し、室温湿室内で1時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、０．０２％（ｗ／ｖ）３，３‘−ジアミノベンジジン（以下 ＤＡＢ）と０．００３％（ｗ／ｖ）過酸化水素を含むＰＢＳ中でときどき鏡検しながらおよそ５分発色させた。水洗後、エタノールにて脱水、キシレン透徹を順に実施し、嫌水性封入剤（ビオライト）を用いて封入を行った。鏡検は１０ｘ２０倍と１０ｘ４０倍で観察し、茶褐色か黄褐色に染色された部位が確認できた場合を陽性、わずかに染まったものを弱陽性、染色を確認できなかった場合を陰性と判定した。表３、表４に判定結果を示す。
【００３９】
【表３】
【表４】
００１１、００１４いずれのハイブリドーマ培養上清も検討した全てのホルマリンおよび塗沫標本ともに弱陽性・陽性であり、これらハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体はＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍの菌種すべてに反応性を有することが判った。
【００４２】
実施例２：モノクローナル抗体と過ヨウ素酸処理したＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎｒｕｂｒｕｍアレルゲンおよびＴｒｉｃｈｉｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓアレルゲンとの結合性
上記実施例１（６）「抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング」で用いたものと同じＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍアレルゲン吸着ＥＩＡ用プレートまたはＴｒｉｃｈｉｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓアレルゲン吸着ＥＩＡ用プレートのウェルに、０．０５Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を５０μｌ加え、４℃で一晩反応させ、抗原に含まれる糖を酸化した。ＰＢＳで洗浄し、蒸留水で４倍希釈したブロックエースを加え室温で１時間ブロッキングを行ったのち、前記実施例１（６）「抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング」に述べた方法と同様にして各モノクローナル抗体含有培養上清の結合性を調べた（図１、図２）。その結果、抗原を過ヨウ素酸処理するとモノクローナル抗体００１１は、抗原を過ヨウ酸処理しても結合性が低下することは無かったが、モノクローナル抗体 ００１４は結合性を失った。
【００４３】
実施例３：モノクローナル抗体とタンパク質分解酵素処理したＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍアレルゲンおよびＴｒｉｃｈｉｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓアレルゲンとの結合性
前記実施例１（６）「抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング」に述べた方法と同じＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍアレルゲンまたはＴｒｉｃｈｉｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓアレルゲンのウェルに１００μｇ／ｍｌのＰｒｏｎａｓｅ（カルビオケム社、７１０００ＰＵＫ／ｇ、ＰＢＳで希釈）を５０μｌ加え、３７℃で２時間反応させ、抗原のタンパク質を分解した。ＰＢＳで洗浄し、蒸留水で４倍希釈したブロックエースを加え室温で１時間ブロッキングを行ったのち、前記実施例１（６）「抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡによる一次スクリーニング」に述べた方法に述べた方法と同様にして、各モノクローナル抗体含有培養上清の結合性を調べた（図３、図４）。その結果、モノクローナル抗体００１１、００１４ともに抗原のＰｒｏｎａｓｅ処理によっても結合性に変化はなかった。
【００４４】
実施例４：サンドイッチＥＩＡ法による菌検出
（１）菌試料の調製：皮膚糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ （Ｔ．ｒ．と略記 ＩＦＯ番号９１８５、３２４０９）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ（Ｔ．ｍ．と略記ＩＦＯ番号６２０２、３２４１０）、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ（Ｍ．ｃ．と略記ＩＦＯ番号３２４６３）、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ（Ｅ．ｆ．と略記 ＩＦＯ番号３２４６１）、Ｃａｎｄｉｄａ Ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｃ．ａ．と略記 ＡＴＣＣ番号９００２８）所定の方法でアンプルから復元し、サブローデキストロース寒天スラント（ベクトンディキンソン社）に接種し、室温で１週間培養した。またＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃ．と略記 ＩＦＯ番号１３５００）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（Ｓ．ｆ．と略記 ＩＦＯ番号１２９６８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂ．ｓ．と略記 ＩＦＯ番号３０２６）は所定の方法でＬ−乾燥アンプルより復元し、ＬＢ寒天培地シャーレ（ポリペプトン１０ｇ酵母エキス５ｇ塩化ナトリウム１０ｇ寒天末１５ｇを１Ｌの精製水にて溶解後高圧滅菌し、１０ｃｍφ滅菌シャーレに無菌的に分注しゲル化させたもの）上で３０℃１日間培養した。
得られた菌はそれぞれ滅菌された１０μＬディスポーザブルループで一掻き分採取し、蒸留水で１０倍希釈したブロックエース（雪印乳業）５ｍｌに十分縣濁し、さらに本菌縣濁液をそれぞれ５、２５、１２５、６２５倍希釈したものをＥＩＡ試料として用いた。またＴ．ｒｕｂｒｕｍアレルゲンを１００ＰＮＵ／ｍｌになるよう同様に希釈した５、２５、１２５、６２５倍希釈した試料も併せて用いた。
（２）００１４培養上清の調製：液体窒素中で凍結保存されていたハイブリドーマ００１４の入ったチューブは−８０℃１時間保存後、３７℃の温湯中ですばやく融解させた。それぞれ１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地１０ｍｌの入った遠心管中に全量入れ、ピペット操作で細胞縣濁した。１５０ｘｇ ５分遠心し、上清を廃棄後、５ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むｅ−ＲＤＦ培地にピペット操作で細胞を浮遊させ、底面積２５ｃｍ2浮遊細胞培養用フラスコにそれぞれ播種し３７℃５％炭酸ガス濃度下で培養した。２継代同培地で培養後、Ｌ―グルタミン１．１７ｇ／Ｌを含むＣＤ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社）に培地を代えて馴化を行い、さらに３継代同培地で培養した。その後培地１５ｍｌで細胞浮遊させ底面積７５ｃｍ2浮遊細胞培養用フラスコに継代培養し、次いで培地４５ｍｌで細胞浮遊させ底面積２２５ｃｍ2浮遊細胞培養用フラスコに継代培養し、最終培地２００ｍｌで細胞浮遊させ底面積２２５ｃｍ2浮遊細胞培養用フラスコ４個で７日間培養を行い抗体を培地中に十分分泌させた。培養により得られた細胞培養液を５０ｍｌ遠心管４本に移し７００ｘｇ １０分遠心分離し、ハイブリドーマ培養上清２００ｍｌを得た。
（３）００１４精製抗体の調製：得られた培養上清はＮａＣｌ ３５ｇと１Ｍ ホウ酸緩衝液 ｐＨ９を１０ｍｌ加えて溶解混合し、０．８μｍのフィルターろ過を行った。あらかじめ３Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９：以下 結合緩衝液）で平衡化されたｒＰｒｏｔｅｉｎＡセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（アマシャムバイオシステムズ社製）をカラムに１ｍｌ充填し、培養上清全量を流速１ｍｌ／分でカラムに通液した。次いで５ｍｌの結合緩衝液でカラム洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３）を同流速で通液してカラムより抗体を溶出させ、抗体を含む溶出液２ｍｌを得た。ただちに１Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ９） ０．４ｍｌを加え、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ １Ｌに対して透析を実施した。ＯＤ２８０ｎｍの吸収により蛋白量を算出した結果、得られた００１４精製抗体は７．２ｍｇであった。
（４）精製抗体の電気泳動分析：５％ＳＤＳおよび２５％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む０．１５６Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）１０容に２−メルカプトエタノール１容０．１％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルー水溶液を１容加えてサンプル電気泳動用緩衝液とした。精製抗体１μｌに精製水９μＬとサンプル電気泳動用緩衝液１０μＬ加え、９５℃で５分処理した後、１０−２０％のポリアクリルアミドグラジエンドゲル中で電気泳動した。電気泳動後のゲルはクマジー染色を行ってゲル中の蛋白を可視化した。その結果、抗体の重鎖と軽鎖に相当するバンドのみが観察され、不純物に起因する他のバンドは含んでいないことが分かった。
（５）ビオチン化００１４抗体の調製：２．８ｍｇ／ｍｌの抗体液０．５ｍｌに１Ｍ 炭酸水素ナトリウム溶液５０μＬを加え混合後、次いで蒸留水にて６．７ｍｇ／１００μＬ濃度に溶解したＢｉｏｔｉｎ−ＸＸ−Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ（同仁化学）を１．５μＬ添加し、緩やかに攪拌しながら室温で４時間反応させた。あらかじめＰＢＳにて平衡化しておいたＮＡＰ−５カラム（アマシャムバイオサイエンス社）に全量載せ、ＰＢＳ１ｍｌで試料を溶出させ、ビオチン化００１４抗体１．２ｍｇを得た。
（６）サンドイッチＥＩＡによる菌縣濁試料の測定：００１４精製抗体は５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１０μｇ／ｍｌになるよう希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（＃９０１８ コーニング社）の各ウエルにに５０μＬづつ分注、室温１時間放置し、プレートに抗体を固相化した。ウエル内の液体を除去後、次いで蒸留水で４倍に希釈したブロックエース（雪印乳業）を３００μＬづつ各ウェルに分注し、室温１時間放置し、ブロッキングを行った。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液 ３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、試料を５０μＬづつウェルに分注し固相抗体と１時間室温で反応させた。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液 ３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、蒸留水で１０倍に希釈したブロックエースで１μｇ／ｍｌ濃度に希釈したビオチン化００１４抗体を５０μＬづつウェルに分注し室温１時間反応させた。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液 ３００μＬ分注・廃棄を３回繰り返して各ウエルを洗浄後、蒸留水で１０倍に希釈したブロックエースで５０００倍に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＫＰＬ社）を５０μＬづつウェルに分注し室温１時間反応させた。ウエル内の液体を除去し、次いで洗浄液 ３００μＬ分注・廃棄を４回繰り返して各ウエルを洗浄後、３，３‘−５，５’−テトラメチルベンジジン（以下ＴＭＢ）を含む西洋わさびペルオキシダーゼ基質液ＴＭＢ＋（ＤＡＫＯ社）を各ウエル５０μＬづつ分注し、室温遮光下反応させた。反応１０分後１Ｎ硫酸を各ウエル５０μＬづつ分注し、酵素反応を止め、主波長４５０ｎｍ副波長６５０ｎｍで各ウエルの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定を行った。結果を表５、表６に示す。
【００４５】
【表５】
【表６】
皮膚糸状菌とＴ．ｒ．アレルゲンを測定試料としたとき希釈系列でレスポンスが認められたが、他の菌では認められなかった。つまりＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓのみならず、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍで共通する抗原は本発明抗体を結合した担体上に捕捉可能であった。また、本発明抗体を使ったイムノアッセイでＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓのみならず、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍで共通している抗原の検出が可能であった。
【００４８】
実施例５：爪白癬患者爪での免疫染色
爪白癬患者から採取された爪はホルマリン固定後、定法に従いパラフィン包埋し、３μｍ薄切後スライドグラス上に爪白癬パラフイン標本を作製した。免疫染色は実施例１（１１）記載の方法で、ハイブリドーマ培養上清の代わりに実施例４（３）で調製した００１４精製抗体を０．１％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン、０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（−）で１００μｇ／ｍｌとなるよう調製した抗体液をＰＢＳで５、１０、２５、５０、１００、２００、５００、１０００倍希釈して用いて実施し、菌の染色像とそれ以外のバックグランドとの対比を行った。結果は表７に示す。染色性が認められないものは（−）、わずかに着色が認められるものは（±）、着色が認められるものは染色強度に応じ（＋） ＜ （＋＋） ＜ （＋＋＋）と３段階で表記した。抗体濃度１乃至２０μｇ／ｍｌでバックグランドと菌を識別することが可能であった。
【００４９】
【表７】
【発明の効果】
本発明記載のモノクローナル抗体は皮膚糸状菌、とりわけ白癬原因菌の異なる属に渡る特異性を有している。本特性は白癬菌の分離・検出に有用で、白癬の診断・鑑別を迅速・簡易・高感度することが可能と考える。
【図面の簡単な説明】
【図１】００１１モノクローナル抗体含有培養上清を、ＮａＩＯ４処理抗原固相化プレートおよび処理なし抗原固相化プレートと作用させたときの反応性を調べたものである。
【図２】００１４モノクローナル抗体含有培養上清を、ＮａＩＯ４処理抗原固相化プレートおよび処理なし抗原固相化プレートと作用させたときの反応性を調べたものである。
【図３】００１１モノクローナル抗体含有培養上清を、プロナーゼ処理抗原固相化プレートおよび処理なし抗原固相化プレートと作用させたときの反応性を調べたものである。
【図４】００１１モノクローナル抗体含有培養上清を、プロナーゼ処理抗原固相化プレートおよび処理なし抗原固相化プレートと作用させたときの反応性を調べたものである。
Claims (3)
- 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９０５７として寄託されているハイブリドーマ
- 請求項１に記載のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
- 請求項１に記載のハイブリドーマを培養して得られる培養上清を精製して抗体を得る工程を含む抗体生産方法
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