HU210142B

HU210142B - Process for producing hepatospecific insulin-analogues and pharmaceutical compositions containing them

Info

Publication number: HU210142B
Application number: HU903398A
Authority: HU
Inventors: Panayotis G Katsoyannis
Original assignee: Sinai School Medicine
Priority date: 1989-04-20
Filing date: 1990-04-17
Publication date: 1995-02-28
Also published as: PT93832A; GR900100290A; ATE120762T1; HU903398D0; NO914085L; DE69018461T2; NO301544B1; DE69018461D1; GR1000908B; EP0469084A1; HUT59941A; NO914085D0; IL94163A; ZA902965B; WO1990012814A1; EP0469084B1; CA2014896A1; JPH04504858A; AU5541590A; AU631868B2

Description

A találmány új inzulinanalógok, valamint a vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására vonatkozik, melyek alkalmasak diabetes gyógyítására.

A találmány tárgya eljárás az A láncban 21 aminosavat, a B láncban 30 aminosavat tartalmazó olyan natív inzulinanalógok előállítására, melyekben az A lánc 14-es pozíciójában triptofán található.

A találmány szerinti eljárást úgy végezzük, hogy a megfelelő aminosavakat és peptid fragmenseket a megfelelő sorrendben, a peptidkémiában szokásosan alkalmazott eljárásokkal összekapcsoljuk, majd a kapott A láncot egy így kapott B lánccal vagy egy natív B lánccal diszulfid híddal összekapcsoljuk és a kapott vegyületet kromatográfiás úton a reakcióelegyből elkülönítjük.

Az inzulin egy olyan hormon, amely kulcsszerepet játszik a gerincesek növekedés- és anyagcsere-szabályozásában. Inzulin hiányában súlyos anyagcsere rendellenességek lépnek fel, amelyek abból adódnak, hogy sok sejt képtelen a glukózt és az aminosavakat normálisan hasznosítani. A glukózanyagcsere hiánya az emberi szervezetben diabetes mellhúst - komplex krónikus anyagcsere rendellenesség - kialakulásához vezet, amelyben a szénhidrát, zsír és fehérje metabolizmus rendellenes. A diabetes mellhús - teljesen egyértelmű klinikai formájában - az inzulin vagy az inzulin aktivitás abszolút vagy relatív hiányával jellemezhetjük, amelyhez glukosuria, ketonuria, növekedés megállás és negatív nitrogén mérleg társul. Ezek az állapotok akut anyagcserezavar okozta acidozis miatt végül is halálhoz vezethetnek. A halál beállta a zsírsavak korlátozatlan oxidálásából vagy inanicóból következik, amely a ketontestek létrehozásához szükséges elegendő lipid tartalék hiányából származik. Az inanicio olyan állapot, amelyet feltűnő gyengeség, rendkívüli súly veszteség, és a hosszantartó, súlyos táplálékelégtelenségből fakadó metabolizmus csökkenés jellemez. Dorland’s Illustrated Medical Dictionary, 25. kiadás,

Az 1920-as években az inzulin felfedezése és tisztítása, továbbá az inzulin és a diabetes mellhús kapcsolata eredményezte a betegség befolyásolásának lehetőségét. Lásd pl. Bliss, The Discovery oflnsulin (1983), University of Chicago Press, Chicago, 111. című referátumát. Ma az inzulint a diabeteszes betegeknek elsősorban gyógyászati céllal, a betegség kézbentartása érdekében adják. Az inzulin kb. 6000 dalion molekulatömegű polipeptid, amely két rövid peptid láncból, az A és B nevű láncból áll, amelyek invariáns diszulfid hidakkal kapcsolódnak egymáshoz. Majdnem az összes tanulmányozott inzulinban az Aláné, amely 21 aminosav hosszúságú, belső diszulfid hidat is tartalmaz. A B lánc 30 aminosav hoszszúságú. Mint sok eukariota protein, az inzulin is prekurzor formában képződik, amelyből poszt-szintetikus eljárással jutunk az érett két polipeptid lánccal rendelkező aktív hormonhoz.

Az inzulin közvetlen prekurzora a proinzulin, amely egy B és A láncból álló egyláncú polipeptid, amely a C nevű, kb. 31 aminosavat tartalmazó pepiidhez kapcsolódik, a mellette fekvő bázisos maradék párokkal. A három peptid sorrendje a proinzulin molekulában: NH₂-B lánc Arg-Arg-C-peptid-Lys-Arg-A lánc-COOH. Bár az inzulin mRNS átvivő anyaga a preproinzulin, amely egy olyan proinzulin, ami az NH₂terminusnál 24 aminosav hosszúságú hidrofób tulajdonságú peptid jellegű proteineket tartalmaz, amelyek vagy keresztüljutnak a sejtmembránokon vagy kötődnek azokhoz.

A preproinzulin a Langerhans szigetecskékben belül lévő pankreáz béta sejtekben szintedzálódik, amelyek teljesen szétszórva helyezkednek el a pankreázon. A jelzett peptidek eltávolítása az egyenetlen felületű endoplazmás retikulumban következik be olyan teljesen összecsavarodott oxidált proinzulin képződése révén, amely a Golgi készülékhez kerül, hogy ott szekréciós granulákba csomagolódjon. Az összecsavarodott proinzulint diszulfid kötések stabilizálják. A szekréciós granulák érési ideje alatt az összecsavarodott proinzulin molekulát specifikus proteázok hasítják a párbakapcsolt bázikus maradékoknál, hogy felszabadítsák az inzulint és a C-peptidet.

Amint a fentiekben azt kifejtettük, a diabetes mellitus terápia során ellenőrzött mennyiségű inzulint adagolunk a diabeteszes betegnek. Az így adagolt inzulint az esetek többségében állati eredetű hasnyálmirigyből nyerjük, nevezetesen szarvasmarha és sertés hasnyálmirigyből. A szarvasmarha és sertés inzulinnak az a funkciója, hogy fenntartsa a hormonális homeosztázist ugyanolyan úton, mint a humán inzulin, kb. ugyanazzal a hatásossággal, de mivel ezek idegen proteinek, kiválthatnak valamilyen immunológiai reakciót, ami felhasználhatóságukat csökkend. Jóval ritkábban adunk a gyógykezelés során rekombináns DNS technikával előállított humán inzulint. A rekombináns DNS vagy más technikával előállított humán inzulin használata során nem valószínű, hogy olyan kedvezőtlen immunológiai problémákkal kerülünk szembe, mint ami az állati inzulin alkalmazását kíséri. Sőt még ha hozzá is jutunk természetes humán inzulinhoz, akkor sem mindig elegendő csupán a hormon adagolása a diabeteszes betegeknek a normális metabolizmus helyreállításához. Ilyenképpen jobb hatással bíró alternatív inzulinokra vagy a terápia más eszközeire is szükség van a diabeteszes betegek gyógyításához.

A 4.992.418 számú USA-beli szabadalmi leírás szuperaktív humán inzulin-analógot ismertet, a [10-aszparaginsav-B] humán inzulint, amely felülmúlja a természetes humán inzulin aktivitását. Specifikusan a [10-aszparaginsav-B] inzulint 4-5-ször hatásosabbnak találták, mint a természetes inzulint. A 4.992.417 számú USA-beli szabadalmi leírás és a WO 89/00580 számon publikált nemzetközi szabadalmi bejelentés más szuperaktív inzulin-analógokat ismertet: a desz-pentapeptid (B26-h30)[Asp^BI0,Tyr^B25-a-karboxamid] dumán inzulint, és a desz(B26-B30)-[Glu^BIO,Tyr^B2S-a-karboxamid] humán inzulint, és a desz(B26-B30-[X^B1°,tyr^B25-a-karboxamid] humán inzulint - ahol X a B lánc 10. helyén lévő szubsztítuens. Ezek az inzulin-analógok kb. 11-20-szor hatékonyabbak, mint a természetes humán inzulin.

A Proc. Int. Insulin Symp. 1979. (kiadás: 1980-ban) (Chem. Abstr. 94, 47733x) ismertetéséből kitűnik,

HU 210 142 Β hogy az A lánc 14-es helyén lévő aminosav cseréje is befolyásolja az inzulin hatását.

A fent ismertetett inzulin-analógok mindegyike a természetes humán inzulin A vagy B lánca mentén aminosav-szubsztituenseket tartalmaz, amelyek növelik a vegyület hatásosságát vagy a vegyület egyéb sajátosságait változtatják meg.

A természetes inzulin és az ismert inzulin-analógok inzulin szállítási útjainak egyike sem szimulálja pontosan az inzulin szekréciót a normál hasnyálmirigyből.

Normális esetben az inzulin a zsigeri vénás körbe lép, ezáltal a májat magasabb inzulin koncentrációnak teszi ki, majd ugyanígy a perifériás szövetet is. Standard subcutan inzulin adagolással a plazma glukóz koncentrációt normalizálhatjuk, de a glukóz reciklizációt és a protein és lipid termelést és hasznosítást nem. Továbbá a perifériás érszövetek is a normálisnál magasabb inzulin koncentrációnak vannak kitéve. Bár ezeknek a metabolikus abnomalitásoknak hosszú távú hatásai még vizsgálatra szorulnak, számottevő bizonyítékok vannak arra, hogy a perifériás hiperinzulinémia szignifikáns kockázati faktor lehet az ateroszklerózis kialakulásában.

A máj specifikus inzulin-analógok, vagy azok, amelyek sokkal aktívabbak a májban, mint a zsírszövetekben, számos előnyt mutatnak a jelenleg rendelkezésre álló inzulin terápiával szemben. Ilyen analógok alkalmazásával lehetséges, hogy előnyösebb felszívódást érjünk el a májban a perifériás subcutan adagolás alatt, ezáltal jobban szimuláljuk a máj és a perifériás szövetek közti metabolikus mérleget. Bár belefogtunk ezekbe a kísérletekbe az inzulin intraperitoneális injektálásával szimulálva ezt a próbát, ennek a technikának azonban potenciális hátrányai vannak, nevezetesen az intraperitoneális hozzáférhetőség nehézsége és a peritonitis kockázata. A májspecifikus inzulinokkal is ugyanazt a hatást érhetjük el, mint az intraperitoneális inzulinnal, de a megnövekedett kockázati tényezők nélkül.

Találmányunkban új inzulin-analógokat szintetizáltunk, amelyeknél azt találtuk, hogy májspecifikusak. Ezek az inzulin-analógok egy aminosav-szubsztituenst tartalmaznak az A láncon. Nevezetesen triptofán maradékkal szubsztituáljuk az inzulin polipeptidet az A14 helyen, hogy előállítsuk a találmány szerinti májspecifikus inzulin-analógokat. Feltételezzük, hogy az A13, A15 és A16 helyeken kötődő triptofán vagy más terjedelmes hidrofób csoportok szintén májspecifikus inzulin-analógokhoz vezetnek.

A találmány diabétesz kezelésére alkalmas gyógyászati készítményekre is vonatkozik. A betegek kezelése során a találmány szerinti inzulin-analógok gyógyászatilag hatékony mennyiségét alkalmazzuk gyógyászatilag elfogadható hordozókkal összekeverve.

Továbbá a diabétesz kezelési módjára is vonatkozik, miszerint az inzulinterápiát igénylő diabeteszes betegeknek a találmány szerinti inzulin-analóg gyógyászatilag hatékony mennyiségét adagoljuk gyógyászatilag elfogadható hordozókkal összekeverve.

Az ábrák rövid ismertetése

Az 1. ábra egy kromatogram, amely a juh [Trp¹⁴] A lánc S-szulfonát Cellex-E oszlopról történő (200— 350 ml elfolyó) elúcióját mutatja be. Az első függőleges tengelyen a 280 nm-nél mért OD érték, a második függőleges tengelyen a konduktancia (mmho-ban) szerepel (---jelzésű görbe). A vízszintes tengely az eluens ml-eit tünteti fel.

A 2A ábra egy olyan kromatogram, amely a juh B-lánc S-szulfonát és a juh [Trp¹⁴] A lánc S-szulfonát keverék CM-cellulóz oszlopról történő elúcióját mutatja be a kezdeti kromatográfiás szétválásnál. A vízszintes tengelyen az idő (percben) szerepel; a függőleges tengely az OD értéket mutatja (280 nm).

A 2B ábra egy fordított fázisú HPLC kromatogram, amely a 2A ábrán (140-180 ml elfolyónál) mutatott csúcsban lévő anyagra újrakromatografálását mutatja be. A vízszintes tengelyen az eluens ml-eit, az első függőleges tengely az OD értéket (280 ml-nél mérve) tünteti fel; a második függőleges tengely a konduktanciát szemlélteti (mmho-ban) (— jelzésű görbe).

A 3. ábra a természetes inzulin és a [Trp¹⁴]-inzulin patkány zsírsejtekben kiváltott lipogenézis stimulációjának összehasonlítását mutatja (részletezve lásd 2. példa B részében). A vízszintes tengely a ng/ml HORMON értékeket szemlélteti, a függőleges tengelyen a %-os stimulánc értékek szerepelnek.

- · - -vei az inzulin tartalmú mintákat, = A = -vei az A|₄ trp analóg tartalmú mintát jelöljük. Az ED₅o inzulin = 0,33 ng/ml; az ED_S0 A₁₄ trp = 0,60 ng/ml.

A 4. ábra mutatja a FAO sejtekben végbemenő glukoneogenézis gátlást, ahol a glukóz szekréció gátlást az inzulin vagy [Trp¹⁴]-inzulin koncentráció függvényében ábrázoljuk (részletezve lásd a 2. példa C részében). A vízszintes tengelyen ng/ml Hormon értékek szerepelnek, a függőleges tengelyen a %-os gátlás van feltüntetve.

- - -vei az inzulin tartalmú mintát, = a = -vei az A,₄ trp analóg tartalmú mintát jelöljük. Az EDjo inzulin = 0,096 ng/ml; az ED₅o A₁₄ trp = 0,11 ng/ml.

A találmány szerinti eljárás előnyös megvalósítása során az (I) képletű

H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Leu-Cys-Ser

S

I s

I Leu-Trp-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH_

H-Phe-Val-Asn-GIn-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-AlaS s

Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-^!-Pro-Lys-Thr-OH ® inzulin-analógot, a [Trp^l4-A]-inzulint állítjuk elő.

HU 210 142 Β

Az inzulin-analóg kifejezés olyan proteinre vonatkozik, amelyben az A lánc és B lánc humán (és más fajta) inzulin szerkezettel bír, és mindegyik cisztein maradék ugyanabban a helyzetben foglal helyet, mint a természetes inzulinban. Ilyenképpen az inzulin-analógok megtartják természetes inzulinokra jellemző diszulfid hidas szerkezetet. A használható inzulin-analógok különbözhetnek ugyan a természetes inzulinoktól a molekula egyik vagy mindkét láncában egy vagy több aminosav addíciója, törlése, szubsztitúciója vagy módosítása tekintetében, de az inzulin hatásosságának legalább egy részét megtartják. Lásd pl. Katsoyannis, Treatment ofEarly Diabetes (1979), pp. 319-327, Plenum Publ. Corp.; Blondell, Adv. Prot. Chem. (1972), 26. kötet, 330-362. oldalak.

A találmány szerinti inzulin-analógoknál - amelyek a természetes inzulintól különböznek, mégpedig abban, hogy az A14 helyen lévő aminosav triptofánnal helyettesített - meglepő módon azt találtuk, hogy nagyobb hatásosságot mutatnak a májsejtekben, mint a zsírszövetekben.

Ezeknek az inzulin-analógoknak legjelentősebb sajátosságuk a májspecifikusság, amitől sokkal aktívabbak a májban, mint a zsírszövetben vagy a perifériás szövetben. A [Trp^l4-A]-inzulin pl. zsírszövetben a természetes inzulin hatásosságának 60%-át mutatja (lipogenézis meghatározás) míg a májban (glukogenézis gátlásban megadva) a természetes inzulin hatásosságának 90%-át mutatja. Megjegyezzük azonban, hogy míg a perifériás szövetekben az inzulin stimulálja a glukóz hasznosítást (pl. zsírszövetekben), addig a májban az inzulin gátolja a de novo glukóz szintézist (glukoneogenézis gátlás).

A fentiekben ismertetett inzulin-analógok előállíthatok bármely, szakember számára ismert technika szerint. Pl. az inzulin-analógok A és B láncainak alkotóit ismert peptid szintézis technikák bármelyikének alkalmazásával szintetizálhatjuk, végezhetjük pl. szilárd fázisú peptid szintézis technikával, és oldatban, pl. fragmens kondenzációval. Lásd pl. Erickson és Merrifield, The Proteins (1976), 2. kötet, 3. fejezet, Academic Press, New York; Blake és mts.-i Proc. Natl. Acad. Sci. (1983), 80. kötet, 1556-1559. oldalakon peptid szintézis technikákat ismertető cikkeit. Néhány igényelt inzulin-analógot előállíthatunk oly módon is, hogy humán vagy juh inzulin B láncot - amelyet az ép pankreáz vagy rekombináns inzulin redukálása vagy oxidatív szulfitolízíse után elkülönítünk - kombinálunk módosított A lánccal, amelyet peptid szintézis technikával vagy rekombináns DNS módszerrel állítunk elő.

Az inzulin A vagy B láncának - az A vagy B lánc bármelyik helyen a természetesen előforduló aminosavakkal helyettesített - előállítására szolgáló rekombináns DNS módszerek alatt értjük, anélkül, hogy ezeket az alábbiakra korlátoznánk, az in vitro szintetizált DNS klónozását és expresszióját, amely kódolja az A vagy B lánc aminosav szekvenciát. Vagy egy szervezetet, pl. bakrétiumot - amely humán inzulin A vagy B láncot állít elő - késztethetünk arra, hogy módosított láncot állítson elő valamilyen in vitro helyspecifikus mutagenézis következtében. Lásd pl. Smith, Ann. Rév. Genrt. (1985), 19. kötet, 423-463. oldalak; Botstein és mts.-i Science (1985), 229. kötet, 1193-1201. oldalak.

Általában azt az inzulin, amely módosított A láncot tartalmaz, úgy állíthatjuk elő, hogy ismert technikával nyert juh inzulin B láncokat egyesítünk alkalmas technikával előállított módosított A láncokkal. A B és a módosított A láncok előnyösen stabil S-szulfonált formában vannak, amelyeket ezután ismert eljárásokkal újra egyesíthetünk, hogy megkapjuk a teljes aktív inzulin-analógokat. Ismert rekombináns technikákra adnak kitanítást Katsoyannis USA-beli 3.420.810 sz. és Chance és mts.-i USA-beli 4.421.685 sz. szabadalmi leírásukban. A 4.421.685 sz. USA-beli szabadalmi leírás olyan egylépéses eljárást ismertet inzulin előállítására, amelyben az S-szulfonált A láncot és az S-szulfonált B láncot tiol redukáló anyag, mint pl. ditio-treitol vagy cisztein, jelenlétében, vizes közegben hozzák kapcsolatba. A rekombináció körülményei a következők: (1) kb. 10,5 pH érték, (2) kb. 0,1-50 mg/1 teljes protein koncentráció, és (3) tiol redukáló anyag olyan koncentrációban, hogy kb. 0,4-2,5 SH csoportot állít elő minden egyes S-SO₃ csoportra nézve, amely az elegybenlévő A és B lánc szulfonátokban jelen van. Az inzulin-analógok képződéséhez a reakció hőmérsékletét kb. 0-5 °C-on tartjuk olyan környezetben, amely elegendő oxigén forrást biztosít az inzulin S-S kötéseinek képződéséhez.

Amint a rekombinációs reakció végbemegy, az inzulin-analógot szakember számára ismert technikák segítségével izolálhatjuk és meghatározhatjuk tisztaságát és aktivitását. Az inzulin és inzulin-analógok tisztítására szokásosan alkalmazott technikák lehetnek pl. a nagynyomású folyadékkromatográfia (HPLC), a gélszűrés és az ioncserélő kromatográfia. A termék tisztaságát számos technikával meghatározhatjuk, többek közt HPLC-vel, poliakrilamid gélelektroforézissel, aminosavanalízissel és aminosavszekventálással.

Bár az inzulin-analógok általában megtartanak valamilyen maradék inzulin aktivitást, mégis az ilyen analógok a természetes inzulinok hatásosságának rendszerint csak a töredékét mutatják. A humán, marha és sertés inzulinok hatásossága USP standardban kifejezve kb. 25-26 NE (nemzetközi egység) per mg protein. Standard inzulin hatásosság mérési módszerként említhetjük pl. (1) az inzulin radioreceptor analíziseket, amelyben az inzulin relatív hatásosságát úgy határozzuk meg, hogy vesszük az inzulinnak az inzulin-analógra vonatkoztatott arányát, amellyel szemben az a követelmény, hogy a sejtmembránokon jelenlévő inzulin receptorokhoz specifikusan kötődő ¹²⁵I-inzulin legalább 50%-át helyettesítse, ez lehet pl. patkány máj plazma membrán frakció, izolált patkány zsírsejtek vagy izolált patkány májsejtek; (2) patkány zsírsejtekkel végrehajtott lipogenézis meghatározásokat, amelyekben az inzulin relatív hatásosságát úgy határozzuk meg, hogy vesszük az inzulinnak az inzulin-analógra vonatkoztatott arányát, a mellyel szemben az a követelmény, hogy a [3-³H] glukóz szerves extrahálható

HU 210 142 Β anyaggá (pl. lipiddé) történő átalakításában a maximális átalakítás 50%-os értékét elérje; (3) izolált zsírsejtekben végzett glukóz oxidációs analíziseket, amelyekben az inzulin-analóg relatív hatásosságát úgy határozzuk meg, hogy vesszük áz inzulinnak inzulin-analógra vonatkoztatott arányát, amellyel szemben az a követelmény, hogy a glukóz-l-[^l4C] [^l4CO₂]-vé történő átalakításában a maximális átalakítás 50%-os értékét elérje;

(4) inzulin radioimmuno analízist, amellyel az inzulinanalógok immunogenicitását határozhatjuk meg hatékonyság mérésével, mely szerint az inzulin vagy az inzulin-analóg verseng a ¹²⁵I-inzulinnal a specifikus anti-inzulin antitestekhez való kötődésben; (5) glukoneogenézis gátlást, amelyet jól elkülönített májtumor sejtvonal egybefolyó monorétegén végzünk, amelyben a közegbe irányuló glukóz szekréció gátlást az inzulin vagy inzulin-analógok függvényében határozzuk meg. Az analóg relatív hatásosságát az inzulinnak az analógra vonatkoztatott koncentráció arányával határozzuk meg, amellyel szemben az a követelmény, hogy a glukóz termelés gátlás maximumának 50%-át adja; (6) más meghatározásokat, amelyek mérik az inzulin vagy inzulin-analóg sejtekhez való kötődését, pl. limfocita tenyészetek, amelyekről ismeretes, hogy specifikus inzulin receptorokkal rendelkeznek.

A találmány további tárgyát képezi a fenti inzulinanalógokat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására szolgáló eljárás.

A találmány szerinti inzulin-analógokat diabeteszes betegeknek beadható gyógyászati készítményekké alakíthatjuk. A gyógyászati készítmények a találmány szerinti inzulin-analógot a gyógyászatban elfogadható hordozókkal összekeverve olyan mennyiségben tartalmazzák, hogy az a diabeteszes betegeknél a hormonális homeosztázis elérésének elősegítésében gyógyászatilag hatékony legyen. Mint minden diabétesz kezelésére szolgáló készítmény esetében, jelen esetben is szükséges az egyes betegeknél a hormonális homeosztázis eléréséhez elegendő terápiás mennyiség meghatározása. Figyelembe veendő faktorok még a diabeteszes beteg állapotának súlyossága és a készítmény beadásának módja, végül a diabeteszes beteg partikuláris orvosi kezelése során a gyógyászati készítmény mennyiségének és a beadás módjának mérlegelése. A természetes inzulinokat a betegnek olyan terápiás dózisban adjuk, hogy a humán inzulin aktivitásának kb. 0,02 kb. 5-szörösét nyújtsa testsúlykilogrammonként naponta. Lásd pl. a 4.652.547 számú USA-beli szabadalmi leírás.

A gyógyászati készítményt, amely a találmány szerinti inzulin-analóg gyógyászatilag hatékony mennyiségét tartalmazza, adagolhatjuk parenterálisan az inzulinos kezelésre szoruló diabeteszes betegnek. A készítményt előnyösen intramusculárisan, subcutan vagy intravénásán adjuk. A készítményt orrspray formában is adagolhatjuk a betegnek, vagy pl. hosszú időn keresztül kontrollált homeosztázis esetén a beadáshoz a készítményt egy implantálható pumpában helyezhetjük el. Ilyen implantálható készülékek - amelyek a gyógyszer kontrollált dózisban adagolják a betegnek hosszú időn keresztül - a szakterületen ismertek. A készítmény továbbá olyan gyógyászatilag elfogadható hordozókat is tartalmaz, amelyek nem lehetnek ártalmasak a beteg egészségére. Továbbá nem szabad, hogy a hordozó a készítmény hatékony komponensével, pl. a [Trp^l4-A]inzulinnal vagy más inzulin-analóggal ellentétes hatást mutasson. Hatóanyagként az igényelt inzulin-analógok gyógyászatilag hatékony mennyiségét tartalmazó gyógyászati készítményekhez alkalmas hordozókat és egyéb adalékokat ismertetnek a 4.652.547 számú USA-beli szabadalmi leírásban.

Példaként említjük a [Trp¹⁴-A]-inzulin szintézisét, amelyet az S-szulfonált juh B lánc és a juh inzulin[Trp¹⁴-A] A lánc (továbbiakban (XX) képletű peptid S-szulfonált formájának kölcsönhatásával valósítottunk meg. Az eljárást Katsoyannis és mts.-i írták le Biochemistry, 6: 2635-2642 (1976) cikkükben, és ezt követően Chance és mts.-i ismertették [Pepi. Proc. Am. Pept. Symp. 7th, 721-728 (1981)]. Kulcslépésnek tekintjük az A lánc analóg szintézisét, a védett henejkoza-peptid [továbbiakban (XII) képletű peptid] felépítését, amely az illető A lánc teljes aminosav szekvenciáját tartalmazza. A védett henejkoza-peptid felépítéséhez vagy szilárd fázisú metodikát, Merrifield és mts.-i J. Am. Chem. Soc., 85. 2149-2154 (1963) és Merrifield és mts.-i Biochemistry, 21, 5020-5031 (1982) szerint, vagy a fragmens kondenzációs utat alkalmaztuk. Az utóbbi szintézisút magában foglalja a C-terminális pentapeptid (A¹⁷-A²¹ szekvencia) kapcsolását a mellette pentapeptiddel (A^l2-A¹⁶ szekvencia), így C-terminális dekapeptidhez (A^l2-A²¹ szekvencia) jutunk. Az utóbbi vegyület kapcsolódik a szomszédos tripeptiddel (A⁹A¹¹ szekvencia), így C-termínális tridekapeptidhez jutunk (A⁹-A²¹ szekvencia), amely viszont kapcsolódik a szomszédos tetrapeptiddel (A⁵-A⁸ szekvencia), így a C-terminális heptadekapeptidhez (A⁹-A²¹ szekvencia) jutunk. Az utolsó kapcsolási lépés foglalja magában a C-terminális heptadekapeptid kapcsolódását az N-terminális tetrapeptiddel, így jutunk a védett henejkozapeptidhez [továbbiakban (XII) képletű peptid]. A különböző aminosavak szekunder funkciós csoportjainak (pl. Bzl a Ser, Glu, Asn-nél és Tyr és PMB a Cys-nél) megvédéséhez a szokásos blokkoló csoportokat használtuk, kivéve a Trp indol csoportját, amelyet a Fujii és mts.-i által ismertetett Mts csoporttal védtünk [Chem. Pharm. Bull. (Japan) 32, 2660-2665 (1984)]. A blokkoló csoportok eltávolítását a védett henejkoza-peptidról vagy 1 mol/1 trifluormetán-szulfonsav - tioanizol trimetil-formamidos oldatával, amely még m-krezolt és EDT-t is tartalmaz Yajima és Fujii szerint, J. Am. Chem. Soc., 103, 5867-5871 (1981) és Fujii és mts.-i fent idézett módszere szerint, felhasználva azokat a módosításokat, amelyeket Ogawa és mts.-i az utóbbi időben ismertettek, (J. Protein Chem., 3, 327-348 (1984) vagy a kis/nagy koncentrációjú hidrogén-fluoridos eljárással Tóm és mts.-i szerint, J. Am. Chem. Soc., 105, 6442-6455 (1983), valamint a keletkező redukált termékek szulfitolízisével, amely a (XX) képletű peptid S-szulfonált láncanalóghoz vezet, végezzük.

A találmány további részleteit a következő példá5

HU 210 142 Β kon keresztül mutatjuk be anélkül, hog a találmány tárgyát bármilyen szempontból ezekre korlátoznánk.

A példákban alkalmazott jelöléseket és rövidítéseket az alábbian ismertetjük.

A vegyületnevekben *-gal jelöltük a C-terminális védőcsoportok kapcsolódását.

Rövidítések:

OMe - metoxicsoport,

ONp - p-nitro-fenoxi-csoport,

DMF - dimentil-formamid,

TEA - trietil-amin,

MtS - metilén-szulfonil-csoport,

TEA - trifluor-ecetsav,

EDT - 1,2-etánditiol,

MSA - metánszulfonsav,

PMB - p-metoxi-benzil-csoport.

I. példa

Juh [Trp^l4-A]-inzulin szintézis

A. A lánc szintézise

Boc-Gln-Leu*OMe (I)

H.Leu.OMe oldatához hozzáadunk 11,3 g sósavat tartalmazó 50 ml dimetil-formamidot 9,1 ml trietilaminnal együtt, ezt követően 17,6 g Boc-Gln*ONp-t. 24 óra múlva az elegyet leszűrjük és a szűrletet csökkentett nyomáson kis térfogatig betöményítjük, és 500 ml etil-acetáttal és 100 ml vízzel hígítjuk. A szerves fázist 1 mol/1 ammónium-hidroxid oldattal, vízzel, 0,5 mol/1 sósavval és vízzel mossuk, szárítjuk és szárazra töményítjük. A maradékot éterrel - petroléterrel morzsolva tömörítjük, és etil-acetát-éter elegyből kristályosítjuk. így 13,7 g (76,6%) cím szerinti vegyületet kapjuk; op: 126 °C; [a]_b = -35,3° (c = 1, metanol). Analízis C|₇H₃₁N₃O₆ összegképlet alapján: számított: C% 54,7; H% 8,37; N% 11,3; talált: C% 55,0; H% 8,26; N% 11,3.

Z(OMe)-Trp(Mts)-Gln-Leu*OMe (II)

Az (I) képletű vegyület (3,73 g) TFA-anizolIal készített oldatát 1,5 órán át szobahőmérsékleten tartjuk és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot éter - petroléter (1:2, v/v) eleggyel eldörzsöljük és kálium-hidroxid fölött vákuumban szántjuk. Ennek az anyagnak 20 ml dimetil-formamiddal készített oldatát, amely 2,8 ml trietil-amint tartalmaz, 0 °C-ra hűtjük, és ezt hozzáadjuk ahhoz az azidhoz, amelyet Z(OMe)Trp-(Mts)-NHNH₂-ből készítettünk Fujii és mts.-i fenti módszere szerint, majd Ogawa és mts.-i fenti módszerét alkalmazzuk. Ebben a reakcióban az alábbi reagenseket alkalmaztuk: dimetil-formamid (20 ml), 6,3 mol/1 sósav dimetil-formamidban (3,5 ml) terc-butil-nitrát (1,5 ml) és trietil-amin (3,1 ml). Az elegyet 40 órán át 4 °C-on tartjuk, majd etil-acetáttal (600 ml) és telített nátrium-klorid oldattal (100 ml) hígítjuk. A szerves fázist 10%-os citromsavval és telített nátrium-klorid oldattal mossuk, szárítjuk és szárazra pároljuk. Éterrel elmorzsoljuk, a maradékot szárítjuk és etanolból kristályosítjuk: így 3,6 g (45% cím szerinti vegyületet kapunk; op: 171-173 °C; [a]g = -41,4° (c = 1, DMF). Analízis a C4|H₅₁N₅OioS összegképlet alapján: számított: C% 61,1; H% 6,4; N% 8,7; talált: C% 61,0; H% 6,5; N% 8,5.

Boc-Leu-Trp(Mts)-Gln-Leu*OMe (III)

A (II) képletű vegyület (2,0 g) TFA - anizol - EDT (10 ml - 1 ml - 0,3 ml) eleggyel készített oldatát 30 percig 0 °C-on és 30 percig szobahőmérsékleten tartjuk, és azután úgy járunk el, mint a (Π) képletű vegyület szintézisében. A képződő N“-nem védett peptid só trietil-amint (0,6 ml) tartalmazó dimetil-formamidos (35 ml) 0 °C-ra hűtött oldatához hozzáadunk 1,7 g Boc-Leu*ONp-t. 24 óra múlva az elegyet szobahőmérsékleten 600 ml etil-acetáttal hígítjuk, majd egymás után 1 mol/1 ammónium-hidroxiddal, telített nátriumklorid oldattal, 0,5 mol/1 sósavval és telített nátriumklorid oldattal mossuk, szárítjuk és kis térfogatra koncentráljuk. A kicsapódott terméket gyűjtjük és etil-acetátból átkristályosítjuk. így 1,51 g (71%) cím szerinti vegyületet kapunk; op: 188-190 °C; [a]_b = -20,6° (c = 1, DMF). Analízis a C₄₃H₆₂N₆Oi₀S összegképlet alapján: számított: C% 60,4; H% 7,3; N% 9,8; talált: C% 60,1; H% 7,5; N% 9,8. Aminosav analízis 4 mólos MSA-s hidrolízis után az alábbi arányokat mutatta: Gl^ui,oL^eu2,oTrpo,8·

Boc-Ser(Bzl)Leu-Trp(Mts)-Gln-Leu *0Me (IV)

A (III) képletű vegyület (4,46 g) deblokkolását TFA

- anizol - EDT (15 ml - 1,2 ml - 0,8 ml) eleggyel és a képződő N“-nem védett peptid só elkülönítését a (ΙΠ) képletű vegyület szintézisében leírtak szerint végezzük. Ennek az anyagnak trietil-amint (1,1 ml) tartalmazó dimetilfomamidos (60 ml) oldatához 0 °C-on hozzáadunk 2,07 g Boc-Ser(Bzl)*OH-ot, és ezután hozzáadunk még 1,65 g Ν,Ν’-diciklohexil-karbodiimidet és 1,08 g 1-hidroxibenzo-triazolt. 24 órán át szobahőmérsékleten tároljuk, majd a karbamid mellékterméket kiszűrjük, a szűrletet 600 ml etil-acetáttal hígítjuk és 100 ml nátrium-kloriddal telítjük. A szerves fázist szokásosan mossuk, szárítjuk és kis térfogatra koncentráljuk. A kicsapódó terméket gyűjtjük, és etil-acetát - éter elegyből átkristályosítjuk. így 4,58 g (85% cím szerinti vegyületet kapunk: op: 187-188 °C;[a]ő = -21,6° (c = 1, DMF). Analízis a C₅₃H₇₃N₇O₁₂S összegképlet alapján: számított: C% 61,7; H% 7,1; N% 9,5, talált: C% 61,4; H% 7,2; N% 9,3. Aminosav analízis 4 mólos MSA-s hidrolízis után az alábbi arányokat mutatta: Ser_Ii0Glu,_i0Leu_2ioTrpo,₇.

Boc-Ser(Bzl)-Leu-Trp(Mts)-Gln-Leu-NHNH₂ (V)

A (IV) képletű vegyület (4,2 g) hidrazin-hidrátot (1,0 ml) tartalmazó dimentilformamid (35 ml) és etanol (10 ml eleggyel készített oldatát szobahőmérsékleten 24 órán át állni hagyjuk és azután 200 ml 50%-os vizes etanollal hígítjuk. A kicsapódó terméket gyűjtjük, és metanol-víz elegyből átkristályosítjuk. így 4,00 mg (94%) cím szerinti vegyületet kapunk; op: 203-205 °C; [a]p = 6,1° (c = 1, DMSO). Analízis a: C₅₂H₇₃N₉0nS

HU 210 142 Β összegképlet alapján: számított: C% 60,5; H% 7,1; N% 12,2; talált: C% 60,9; H% 7.4; N% 12,0. 4 mólos MSA-val kapott hidrolizátum az alábbi arányokat mutatja: Ser₀₉GÍUi₀Leu₂₀Trpo,7.

Boc-Tyr(Bzl)-Cys(PMB)-Asn*OBzl (VI)

7,39 g Boc-Cys(PMB)-Asn*OBzl - amelyet Otha és mts.-i, J. Protein Chem., 7, 55-65 (1988) szerint készítünk - TFA-anizol (15 ml - 3 ml) eleggyel készített oldatát állni hagyjuk 0 ’C-ori 30 percig és szobahőmérsékleten 1,5 óráig, majd csökkentett nyomáson koncentráljuk. A maradékot éter és petróleum-éter eleggyel (1:1 v/v) eldörzsöljük és kálium-hidroxid felett vákuumban szárítjuk. Ennek az anyagnak trietilamint (2,3 ml) tartalmazó dimetil-formamidos (60 ml) 0 ’C-ra hűtött oldatához hozzáadunk 7 g BocTyr(Bzl)*ONp-t. Az elegyet 24 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd 600 ml etil-acetáttal és 100 ml mol/1 ammónium-hidroxiddal hígítjuk. A szerves fázist (1 mol/1 ammónium-hidroxiddal, 0,5 mol/1 sósavval és vízzel) mossuk, szárítjuk és kis térfogatra koncentráljuk. A kicsapódott terméket gyűjtjük és etil-acetátból átkristályosítjuk. így 8,7 g (85%) cím szerinti vegyületet kapunk; op: 174-175 ’C; [α]β =-18,6’(c = 1, DMF). Analízis a C₄₃H₅₀N₄O₉S összegképlet alapján: számított: C% 64,6; H% 6,30; N% 7,0; talált: C% 64,0; H% 6,35; N% 7,0.

Boc-Asn-Tyr(Bzl)-Cys(PMB)-Asn*OBzl (VII)

8,2 g (VI) képletű vegyületet aktiváljuk TFA- anizollal (22 ml - 2,2 ml) a fentiek szerint. A maradék éteres eldörzsölésével kapjuk az N“-nem védett peptid só csapadékot, amelyet szűrünk és kálium-hidroxid felett vákuumban szárítunk. Ennek az anyagnak trietil-amint (1,8 ml) tartalmazó dimetil-formamidos (50 ml) 0 ’C-ra hűtött oldatához hozzáadunk 3,9 g Boc-Asn*ONp-t. A reakcióelegyet 24 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd 200 ml metanollal hígítjuk és a kicsapódott terméket kiszűrjük, (1 mol/1 ammónium-hidroxiddal, 0,5 mol/1 sósavval és vízzel) mossuk, szárítjuk és dimetil-formamid-metanolból átkristályosítjuk. így 6 g (64%) cím szerinti vegyületet kapunk; op: 237-238 ’C; [a]§ = -37,4’ (c = 1, DMF). Analízis a C₄₇H₅₆N₆O₁₁S összegképlet alapján: számított: C% 61,8; H% 6,18; N% 9,2; talált: C% 61,6; H% 6,30; N% 9,1.

Boc-Glu(OBzl)-Asn-Tyr(Bzl)-Cys(PMB)-Asn*OBzl (VIII)

A (VII) képletű vegyület (5,5 g) aktiválását és az N“nem védett peptid só elkülönítését a (VII) képletű vegyület szintézisét ismertető példában leírtak szerint végezzük. Ennek az anyagnak trietil-amint (0,85 ml) tartalmazó dimetil-formamidos (50 ml) 0 ’C-os oldatához hozzáadunk 3,3 g Boc-Glu-(OBzl)*-ONp-t [amelyet Sandrin és mts.-i, Helv. Chim. Acta, 46: 1637-1699 (1963) módszere szerint állítunk elő]. A reakcióelegyet a (VII) képletű vegyület szintézisében ismertetett módszer szerint dolgozzuk fel. így 5,6 g (81%) cím szerinti vegyületet kapunk: op: 206-207 ’C; [<x]g = -4 1,4’ (c = 1, DMF). Analízis a C₅₉H₆₉N₇O_i4S összegképlet alapján: számított:

C% 62,6; H% 6,14; N% 8,7; talált: C% 62,3; H% 5,94; N% 8,5.6 mol/1 sósav oldattal kapott hidrolizátumban az aminosav részarányok: Asp, gGlU) ₀Tyr, ₀. ACys(PMB)-t nem határoztuk meg.

Boc-Ser(Bzl)-Leu-Trp(Mts)-Gln-Leu-Glu(OBzl)Asn-Tyr(Bzl)-Cys-(PMB)-Asn*OBzl (IX)

A (VIII) képletű vegyület (2,3 g) aktiválását és az N“nem védett peptid só elkülönítését a VII vegyület szintézisét ismertető példában leírtak szerint végezzük. Ennek az anyagnak trietil-amint (0,42 ml) tartalmazó dimetilformamidos (35 ml) 0 ’C-os oldatához hozzáadunk 2,98 g azidot, amelyet az V vegyületből állítottunk elő (Ogawa és mts.-i módszere szerint). A reakcióelegyet 48 órán át 4 ’C-on tartjuk, majd etil-acetáttal (20 ml) és 5%-os citromsavval (100 ml) hígítjuk, majd a kicsapódott terméket kiszűijük, vízzel és metanollal mossuk és dimetilformamid-metanol elegyből átkristályosítjuk. így 1,55 g (38%) cím szerinti vegyületet kapunk; op: 245-246 ’C; [oí]d = -15,7’ (c = 1, DMSO). Analízis a C₁₀₆H₁₃lN|₄O₂₃S₂.2H₂O összegképlet alapján: számított: C% 61,5; H% 6,6; N% 9,5; talált: C% 61,4; H% 6,5; N% 9,7. 6 mol/1 sósav oldattal kapott hidrolizátumban az aminosav részarányok: Asp₂₀Ser₀₉Glu₂ ,Leu₂ ,Tyr, ₀. A Trp-t és a Cys(PMB)-t nem határoztuk meg.

Bos-Gly-Val-Cys(PMB)-Ser(Bzl)-Leu-Trp(Mts)Gln-Leu-Glu(OBzl)-Asn-Tyr-(Bzl)-Cys(TMB)Asn*OBzl(X)

A (IX) képletű (0,95 g) TFA-anizol-EDT-vel (5 ml 0,1 ml - 0,08 ml) készített oldatát 30 percig 0 ’C-on és 1,5 órán át szobahőmérsékleten tartjuk. A TFA fölösleget csökkentett nyomáson lepároljuk és a maradékot éterrel eldörzsöljük. A keletkezett csapadékot szüljük és káliumhidroxid fölött vákuumban szárítjuk. Ennek az anyagnak trietil-amint (0,09 ml) tartalmazó dimetil-formamidos (25 ml) oldatához hozzáadunk 0,82 g azidot, amelyet Boc-Gly-Val-Cys(MBM)-NHNH₂-ból készítettünk Ogawa és mts.-ί fentiekben idézett módszere szerint. A reakcióban az alábbi reagenseket alkalmazzuk: dimetil-formamid (10 ml), 6,3 mol/1 sósav dimetil-formamidban (0,51 ml) terc-butil-nitrit (0,24 ml) és trietil-amin (0,49 ml). Az elegyet 40 órán át 4 ’C-on tartjuk, majd etilacetáttal (20 ml) és 5%-os citromsavval (60 ml) hígítjuk. A kicsapódott terméket gyűjtjük és dimetil-formamidetanol elegyből átkristályosítjuk. így 0,93 g (82%) cím szerinti vegyületet kapunk, op: 267-268 ’C; [α]ρ = 17,4’ (c = 1, DMSO). Analízis a C_I24H_I56N_I7O₂₇S₃.3H₂O összegképlet alapján: számított: C% 60,4; H% 6,6; N% 9,7; talált: C% 60,3; H% 6,4; N% 9,9. A 6 mol/1 sósavas hidrolizátumban az aminosav részarányok: Asp] ₉Ser₀₉Glu₂₀Glyi ₀Val₁₀Leu_2iITyr₀₉. A Trp-t és a Cys(PMB)-t nem határoztuk meg.

Boc-Gln-Cys(PMB)-Cys(PMB)-Ala-Gly-ValCys(PMB)Ser(Bzl)-Leu-Trp(Mts)-Gln-LeuGlu(OBzl)-Asn-Tyr(Bzl)-Cys(PMB)-Asn *OBzl (XI)

A (X) képletű vegyület (0,82 g) aktiválását TFAanizol-EDT-vel (5 ml - 0,5 ml - 0,1 ml) és az N^a-nem védett peptid só elkülönítését a fentiek szerint végez7

HU 210 142 Β zük. Ennek az anyagnak trietil-amint (0,1 ml) tartalmazó dimetil-formamidos (40 ml) oldatához hozzáadunk 1,06 g azidot, amelyet Boc-Gln-Cys(PMB)Cys(PMB)-Ala-NHNH₂-ból állítottunk elő Ogawa és mts.-i fentiekben idézett módszere szerint. A reakcióban az alábbi reagenseket alkalmazzuk: dimetil-formamid (20 ml), 6,3 mol/1 sósav dimetil-formamidban (0,43 ml) terc-butil-nitrit (0,21 ml) és trietil-amin (0,42 ml). A reakcióelegyet 48 órán át 4 °C-on tartjuk, majd 200 ml metnollal hígítjuk és a kicsapódott heptakeda-peptid származékot gyűjtjük és dimetil-formamid-metanol elegyből átkristályosítjuk. így 0,85 g cím szerinti vegyületet kapunk; op: 270 °C; [a]ő = -21,4° (c = 1, DMSO). A 6 mol/1 sósav oldattal kapott hidrolizátumban az aminos részarányok a következők: Asp_{2 0}GSer_{0 9}Glu₃j Gly j qAIa_{t 2}VaI_{0 9}Leu | ,₉Tyr_{0 7}. A Trp-t és a Cys(PMB)-t nem határoztuk meg.

Z-Gly-lle-Val-Glu(OBut)-Gln-Cys(PMB)-Cys (PMB)-Ala-Gly-Val-Cys(PMB)-Ser(Bzl)-Leu-Trp(Mts) -Gln-Leu-Glu( OBzl)-Asn-Tyr( Bzl)-Cys-( PMB)-Asn* OBzl(XII)

A (XI) képletű vegyület (0,6 g) aktiválását TFAanizol-EDT-vel (6 ml - 0,6 ml - 0,1 ml) és a keletkező termék elkülönítését a fentiek szerint végezzük. Ennek az anyagnak trietil-amint (0,06 ml) tartalmazó dimetilformamidos (40 ml) oldatához hozzáadunk 0,49 g azidot, amelyet Z-Gly-Ile-Val-Glu(OBu')-NHNH₂-ből állítottunk elő [Katsonyannis és mts.-i, J. Am. Chem. Soc., 88: 5622-5625 (1966) módszere szerint], A reakcióban az alábbi reagenseket alkalmazzuk: dimetil-formamid (20 ml), 6,3 mol/1 sósav dimetil-formamidban (0,25 ml) terc-butil-nitrit (0,11 ml) és trietil-amin (0,3 ml). A reakcióelegyet 48 órán át 4 °C-on tartjuk, majd 200 ml metanollal hígítjuk és a kicsapódott védett henejkoza-peptidet gyűjtjük és dimetil-formamid-metanol elegyből átkristályosítjuk. így 0,53 g cím szerinti vegyületet kapunk; (76%) op: 270 ’C. Az aminosav analízis 6 mol/1 sósav oldattal végzett hidrolízis után a következő mólarányokat mutatja:

Asp₂,oSer_O9Glu4QGly₂ [Alaj QVali sIleQgLeU] ₈Tyro₇. A Trp-t és a Cys(PMB)-t nem határoztuk meg.

B. S-Szulfonált [Trp¹⁴]-A lánc (XX) szintézise

A (ΧΠ) képletű védett henejkoza-peptidet (200 mg) 0 ’C-on két órán át 1 mol/1 trifluor-metán-szulfonsavval kezeljük TFA-ban (4,3 ml), amely tio-anizolt (0,66 ml), m-krezolt (0,59 ml) és EDT-t (0,47 ml) tartalmaz. Ezután az oldatot -10 ’C-ra hűtjük, és erős keverés mellett cseppenként hozzáadunk koncentrált ammónium-hidroxidot (5 ml) tartalmazó 8 m guanidinhidrokloridot (25 ml). Az eljárás időtartama alatt az elegy hőmérsékletét 5 ’C alatt tartjuk. A keletkező elegyet (pH = 5) éterrel háromszor extraháljuk (3 x 50 ml) és a vizes fázishoz - amelynek a pH-ját ammónium-hidroxiddal 8,9-re állítottuk - hozzáadunk 1,2 g nátrium-szulfitot és 0,6 g nátrium-tetrationátot. Az elegyet szobahőmérsékleten 3,5 órán át keverjük, majd 3. sz. Spectrapor membrán csőbe helyezzük és 4 ’C-on 24 órán át négy váltás desztillált vízzel (mindegyik 4 1) dializáljuk. A dializátum liofilizálása során nyerjük a nyers S-szulfonált lánc analógot, melyet 6 ml 0,015 mol/1 ammónium-hidrogén-karbonátban oldunk és Sephadex G-15 oszlopon (4,2 x 45 cm) kromatografálunk, az oszlopot 0,015 mol/1 ammónium-hidrogénkar’bonáttal egyensúlyba hozzuk és eluáljuk. Az elfolyó anyag, amely megfelel a fő csúcsnak, és amit ISCO sprektrofotométerrel ellenőriztünk, liofilizált volt és a juh inzulin [Trp¹⁴] A lánc S-szulfonátot kaptuk fehér por formában: m: 130,5 mg. Tisztítás céljából a kapott anyago (71,3 mg) feloldjuk 0,1 mol/1 Tris-HCL pufferben, (pH = 7,0; 3 ml) és Cellex-E oszlopra (1,2 x4,3 cm) helyezzük, melyet ugyanazzal a pufferrel hozunk egyensúlyba. Az oszlopt Tris-HCL pufferrel (pH = 7,0) és lineáris nátrium-klorid árammal eluáljuk, amint ezt Chu és mts.-i, Biochemistry, 26, 696-6971 (1987) cikkükben korábban ismertették. A kromatográfiás görbét, amelyet ISCO spektrofotométerrel és konduktométerrel (Radiometer, Copenhagen) vettünk fel, az 1. ábra mutatja. A fő csúcsnak megfelelő kifolyó anyagot gyűjtjük, a fentiek szerint dializáljuk és liofilizáljuk: m: 35,4 mg.

A szintetikus lánc analóg aminosav analízisét két sav hidrolizátumban végeztük; egyiknél 6 mol/1 sósavat és a másiknál 4 mol/1 MSA-t alkalmaztunk (Trp meghatározáshoz) Simpson és mts.-i, J. Bioi. Chem., 251, 1936-1940 (1976) módszere szerint. Az aminosav készítmény - mólarányban kifejezve - megegyezett az elméletileg várt értékkel. Elvégeztük a szintetikus lánc analóg digerálását aminopeptidáz M-mel és a digerátum aminosav analízisét, s az eredmények szintén a várt mólarányokat mutatták. A szintetikus anyagot teljes mértékben roncsoltuk egy olyan enzimmel, amely jelezte, hogy az aminosav alkotórészek sztereokémiái tisztaságukat a szintetikus eljárás ideje alatt megtartották.

C. Juh [Trp¹⁴-A)-inzulin szintézise és izolálása

A Juh [Trp¹⁴-A]-inzulin szintézisét a (XX) képletű S-szulfonált [Trp^l4-A] juh A lánc és az S-szulfonált juh (amely ugyanaz, mint a szarvasmarha) B lánc reagáltatásával végezzük ditiotreitol jelenlétében Chance és mts.-i fentiekben idézett módszere szerint. A juh B lánc S-szulfonát (10 mg) oldatot (amelyet Katsoyannis és mts.-i, Biochemistry, 6, 2635-2642 (1976) cikkében ismertetett módszer szerint állítottunk elő), [Trp^l4-A]A lánc S-szulfonátot (20 mg) és ditiotreitol (6,83 mg) 0,1 mol/1 glicin pufferrel (pH = 10,5, 6 ml) készített oldatát 4 ’C-on 24 órán át keverjük majd az előzőekben ismertetett Katsoyannis és mts.-i, Biochemistry, 6, 2635-2642 (1976) módszere szerint járunk el. A keletkezett elegyből az inzulin-analóg elkülönítését és tisztítását kromatográfiával végezzük CM-cellulóz oszlopon (0,9 x 24 cm) acetát pufferrel (Na⁺, 0,024 m, pH = 3,3) és exponenciális nátrium-klorid árammal Katsoyannis és mts.-i fentiekben idézett módszere szerint. A kromatográfiás görbét, amelyet ISCO spektrofotométerrel és konduktométerrel (Radiometer, Copenhagen) vettünk fel, a 2A ábra mutatja. 1,3 mg [Trp¹⁴A]-inzulint pikráton át hidrogén-klorid sóként elkülönítünk a kifolyó anyagból (145-175 ml) Katsoyannis

HU 210 142 Β és mts.-i fentiekben idézett módszere szerint. Az anyag végző tisztítását fordított fázisú HPLC-vei végezzük Vydac 218 TP oszlopon (0,45 x 25 cm), amely hozzá van kapcsolva egy LKB folyadékkromatográfiás rendszerhez. A kromatografálást 0,5 ml/min áramlási sebesség mellett végezzük 0,1% TFA-ban oldott 10-50% 2-propanol lineáris áramával 60 percig (2B.ábra). A fő csúcs alatt elfolyó anyag liofilizálásával a juh [Trp¹⁴A]-inzulint nagy tisztasággal nyerjük.

mol/1 sósav oldattal végzett hidrolízis után a szintetikus anyag aminosav analízise az elméletileg várt értékekkel jól megegyező összetételt adott (mól-arányban kifejezve).

2. példa

A [Trp¹⁴-A]-inzulin hatóképessége és kötő sajátosságai

Ebben a példában azokat az anyagokat használtuk fel és azokat az analitikai eljárásokat követtük, amelyek Kitagawa és mts.-i, Biochemistry, 23: 1405-1413 (1984) című folyóiratban találhatók meg. A ^l25I-inzulint a receptor kötési vizsgálatokhoz és a [3-³H]glukózt a lipogenézishez a DuPont NEN kutatási termékeiből kaptuk. A 0,2 /pm pórusméretű cellulóz-acetát membrán szűrők a Sartorius termékei voltak. A GFC típusú üvegszálas szűrők Whatman-tól voltak. A II típusú nyers Kollagenázt Worthington-tól kaptuk. A FiltronX, Hidrofluor és Soluscint-0 szcintillációs folyadékok a National Diagnostics termékei voltak. A kristályos szarvasmarha inzulin a Sigmá-tól, és a szarvasmarha szérum albumintól mentes zsírsav a Boehringer-Mannheim Biochemicals-tól voltak.

A. Az inzulin receptoron való kötődésének meghatározása

A [Trp¹⁴-A]-inzulinnak a ^l25I-inzulin inzulinreceptorokhoz való specifikus kötődésére gyakorolt gátló hatását vizsgáljuk plazma membránnal dúsított patkány máj frakcióban, izolált patkány zsírsejtekben és izolált patkány májsejtekben. Az első két eljárást Bürke és mts.-i, Biochemistry 19: 4547-4556 (1980) szerint végezzük.

Röviden: háromszoros 0,2 ml-es inkubálás ^,25I-inzulinnal, 3 χ 10 ^ιθ mol/1, az 1. példa szerint készített jelöletlen inzulinnal vagy [Trp^l4-A]-inzulinnal, és 0,1 mol/1 nátrium-foszfátban lévő plazma membránnal (20-40 pg protein), pH = 7,4, amely 0,6% szarvasmarha szérum albumin V frakciót tartalmaz. 45 perces, 24 °C-os inkubálás után az elegyeket 2,0 ml jégbehűtött nátrium-foszfáttal hígítjuk, pH = 7,4, amely 0,1% szarvasmarha szérum albumin V frakciót tartalmaz, és cellulóz-acetát szűrőn azonnal szüljük. A szűrleteket jégbehűtött pufferrel kétszer mossuk, szárítjuk, majd radioaktivitást mérünk szcintillációs számlálóban Filtron-X felhasználásával. A relatív hatóképességet úgy kapjuk meg, hogy a jelöletlen inzulin és a [Trp^l4-A]-inzulin azon koncentrációinak a hányadosát vesszük, amelyek 50%-kal csökkentik a ¹²⁵I-inzulinnak a receptor készülékhez történő kapcsolódását. Ebben a vizsgálatban a [Trp^l4-A]-inzulin hatóképessége a természetes hormonénak kb. 60%-a.

B. Lipogenézis meghatározás

Ebben a vizsgálatban az inzulin-analógok [3'³H]glukóznak zsírrá alakítási képességét vizsgáltuk a szarvasmarhainzulinhoz hasonlítva.

200-300 g tömegű hím patkányok epididimális és perirenális zsírpárnáiból vett zsírsejteket inkubáljuk 1,0 mg/ml kollegenázzal 60 percig, 37 °C-on, majd gézen keresztül, ezután finom szövésű selymen keresztül szűrjük. A sejteket flotációs eljárással klinikai centrifugában kétszer mossuk, mielőtt szuszpendáláshoz felhasználjuk. Az inkubációs közeg Krebs-Ringer bikarbónáiból áll, amely az ajánlott kalcium mennyiség felét, 0,5 mmol glukózt, és szarvasmarha szérum albumintól mentes 3%-os zsírsavat tartalmaz, gázfázisként 95% O₂-5% CO₂-dal. A háromszoros lipogenézis inkubálás 1,0 ml zsírsejt szuszpenzióból (20-40 mg száraz sejt tömeg) és szarvasmarha inzulinból vagy [Trp¹⁴-A]inzulinból áll, amelyeket az 1. példa szerint állítottunk elő. A sejteket 45 percig preinkubáljuk 37 °C-on, mielőtt a [3-³H]-glukózt hozzáadjuk. Az inkubálást 60 percig folytatjuk, és 0,2 ml 5 mol/1 sósav és 0,2 ml kukoricaolaj hozzáadásával állítjuk le, hogy elősegítsük a lipid extrakciót. A mintákat 10 ml Soluscint-Oval extraháljuk 30 percig szobahőmérsékleten mielőtt a radioaktivitást detektáljuk szcintillációs számlálóval. Ezen körülmények között a [3-³H]-glukózt nem extraháljuk abba a szerves fázisba, amely a szcintillációs fluort tartalmazza, és így lényegében számolatlan marad. A 0 és 100%-os lipogenézis stimulálást kb. 9,1 x IO'¹⁰ mól inzulin (5,5 ng/ml) jelenlétében és hiányában mért radioaktivitásként határoztuk meg. A relatív hatóképességet úgy határozzuk meg, hogy vesszük a jelöletlen inzulin és a [Trp¹⁴-A]-inzulin azon koncentrációinak arányát, melyek a lipogenézist maximálisan 50%-kal stimulálják.

A 3. ábra mutatja a [3-³H]-glukóz stimulálást szervesen extrahálható anyaggá (pl. lipiddé) izolált patkány zsírsejtekben az 1. példa szerint előállított [Trp¹⁴-A]inzulin (= A =) és szarvasmarha inzulinnal (- · -). A százalékban kifejeztt maximális stimulációt az agonista koncentráció függvényében ábrázoljuk. Az adatpontok a háromszoros meghatározás jellemző mérési pontjait mutatják, amelyeket négy mérésből átlagoltunk. Mindkét inzulinnál ugyanazt a maximális stimuláció értéket észleltük és a maximális stimuláció felét kb. kétszeres agonista koncentrációnál kaptuk: inzulin esetén 0,33 ng/ml, míg a [Trp¹⁴-A]-inzulinnál 0,60 ng/ml volt az ED_5o érték. A szintetikus inzulin lipogenézisben való hatásossága (a természetes hormonéval összehasonlítva kb. 60%) ilyenképpen tükrözi annak viselkedését azokban a receptor kötődési meghatározásokban, amelyekben zsírsejteket alkalmaztunk.

G. Glukoneogenézis gátlás meghatározása

Ezt a mérést jól elkülönített májtumor sejtvonal egybefolyó monorétegén végeztük [Lauris és mts.-i Endocrinology 118: 2519-2524 (1986)], ahol a glukóz

HU 210 142 Β termelést mértük a kereskedelemben kapható glukózoxidáz készülékkel (Sigma kit no. 510-A, Sigma Technical Bulletin 510, 1983). A közegbe irányuló glukóz szekréció gátlást az inzulin vagy inzulin-analóg függvényében határoztuk meg, és az analóg relatív hatásosságát az inzulin és az inzulin-analóg azon koncentrációinak arányával határoztuk meg, amelyeknél a glukóz termelés a maximális érték felére csökken. A sejtkultúra és a glukóz előállítását Lauris és mts.-i fentiekben idézett módszerével végeztük.

A 4. ábra mutatja be a FAO sejtekben végbemenő glukoneogenézis gátlást a maximális érték %-ában kifejezve, az inzulin (- · -) és a [Trp^l4-A]-inzulin (= a = ) koncentráció függvényében.

Mindkét inzulinnál ugyanazt a maximális glukoneogenézis gátlás értéket észleltük és a maximális gátlás 50%-os értékét kb. ugyanolyan agonista koncentrációnál kaptuk: inzulin esetén 0,096 ng/ml, míg a [Trp^l4-A]-inzulinnál 0,11 ng/ml volt az ED₅₀ érték. A szintetikus inzulin glukoneogenézis gátlásban való hatásossága a természetes hormonéhoz viszonyítva kb. 90%.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás az A láncban 21 aminosavat, a B láncban 30 aminosavat tartalmazó olyan új natív inzulinanalógok előállítására, melyekben az A lánc 14-es pozíciójában triptofán található, azzal jellemezve, hogy a megfelelő aminosavakat és peptid fragmenseket a megfelelő sorrendben, a peptidkémiában szokásosan alkalmazott eljárásokkal összekapcsoljuk, majd a kapott A láncot egy így kapott B lánccal vagy egy natív B lánccal diszufid híddal összekapcsolják és a kapott vegyületet kromatográfiás úton a reakcióelegyből elkülönítjük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a diszulfid híd kialakítására szulfonált Aés B láncot egy tiol redukálószer jelenlétében kapcsoljuk össze.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott B lánc természetes eredetű.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott B lánc juh inzulinból származik.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás az (I) képletű

----‘-SS-,

H-GIy-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Leu-Cys-Ser

S

I s

| Leu-Trp-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH_____

H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glü-AlaS

S

Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OH ® inzulin-analóg előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő aminosavakat és peptid fragmenseket alkalmazzuk.
6. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-5. igénypontok bármelyike szerint előállított inzulin-analógot a gyógyászati készítmények előállításánál szokásosan alkalmazott hordozó és/vagy vivőanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.