PT93832B - Processo para a preparacao de analogos de insulina hepatospecificos e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

MOUNT SINAI SCHOOL OF MEDICINE OF THE CITY UNIVERSITY

OF NEW YORK

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANÁLOGOS DE INSULINA HEPATOSPEClFICOS E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a novos análogos de insulina e à sua aplicação em composições farmacêuticas para o tratamento de diabetes.

A insulina é uma hormona que desempenha um papel fundamental na regulação do desenvolvimento e metabolismo dos vertebrados.

Na ausência de insulina ocorrem alterações metabólicas graves resultantes da insuficiência de muitas das células para utilizarem a glicose e os aminoácidos de um modo normal. A incapacidade para metabolisar a glucose conduz no homem â diabetes mellitus, uma doença metabólica crónica complexa em que existe um metabolismo anormal dos hidratos de carbono, gorduras e proteínas. Na sua forma clínica expressa mais completamente, a diabetes mellitus é caracterizada por uma deficiência absoluta ou relativa de insulina ou de actividade insulínica e está

-2£ associada com a glicosuria, cetonuria, paragem do crescimento e equilíbrio de azoto negativo. Estas situações podem conduzir por último à morte proveniente de acidose metabólica aguda causada pela oxidação incontrolada dos ácidos gordos ou inanição, que resulta da ausência de reservas lipídicas suficientes necessárias para formarem corpos cetónicos. A inanição é definida como uma doença caracterizada por debilidade acentuada, perda extrema de peso e uma diminuição no metabolismo resultante de uma insuficiência de alimentos prolongada e grave. Dorland¹s Illustrated Medicai Dictionary, 2 5 ê Edição.

A descoberta e a purificação da insulina nos anos de 1920 e a sua associação com a diabetes mellitus proporcionou os meios de intervenção na doença (consultar, por exemplo, Bliss, The Discovery of Insuline, Chicago, 111., Universidade de Chicago Press, 1983.

Presentemente, a administração de insulina aos doentes diabéticos é um meio terapêutico principal para o controlo da doença.

A insulina é um polipéptido com cerca de 6.000 dalton composto por duas cadeias peptídicas curtas, designadas A e B, que se ligam entre si por pontes de disulfureto fixas. Na maior parte dos estudos com insulina, a cadeia A, que tem 21 aminoácidos de comprimento, contêm também uma ponte de dissulfureto

-3.* interna. A cadeia B tem um comprimento de 30 aminoácidos. À semelhança de muitas proteínas eucarióticas, a insulina é sintetizada sob a forma de um precursor que é processado pós-síntese para a hormona activa madura com uma cadeia de dois polipéptidos. 0 precursor imediato da insulina é a pró-insulina, um polipéptido de uma só cadeia composto pelas cadeias A e B ligadas a um péptido de ligação de aproximadamente 31 aminoácidos, designado por péptido C, por pares adjacentes de resíduos básicos. A ordem dos três péptidos na cadeia da pró-insulina é cadeia NI^-B-Arg-Arg-péptido C-Lys-Arg-cadeia A-COOH. Contudo, o produto de tradução do mRNA insulínico é a pré-pró-insulina que é a pró-insulina que contém na sua extremidade NH2 um péptido de sinal altamente hidrófobo com 24 aminoácidos, característico de proteínas que são transportadas ou inseridas nas membranas celulares.

A pré-pró-insulina é sintetizada nas células beta do pâncreas localizadas nos ilhéus de Langerhans que estão dispersos pelo pâncreas. A eliminação do péptido de sinal ocorre no retículo endopiasmático rugoso com a resultante pró-insulina oxidada e totalmente dobrada que é transportada para o aparelho de Golgi para armazenagem em grânulos de secreção. A pró-insulina dobrada é estabilizada por partes dissulfureto. Durante a maturação dos grânulos de secreção, a molécula de pró-insulina dobrada é cindida por proteases específicas nos resíduos básicos emparelhados para libertar a insulina e o péptido C.

Como citados anteriormente, a terapêutica da diabetes mellitus inclui a administração de quantidades controladas de insulina nos doentes diabéticos. A insulina administrada assim tem, na sua maior parte, sido obtida a partir de pancreases animais, particularmente porcinas e bovinas. As insulinas porcina e bovina funcionam para manter a homeostase hormonal no mesmo sentido da insulina humana com uma potência aproximadamente igual mas, devido ãs suas proteínas estranhas, pode provocar uma resposta imunológica que diminui a sua utilidade. Mais recentemente, a insulina humana obtida por técnicas de recombinação de DNA, constitui mais um componente terapêutico. A utilização de insulina humana, produzida por recombinação do DNA ou por outras técnicas não é provável que provoque problemas imunológicos indesejáveis esperados na aplicação de insulinas animais Mesmo com a disponibilidade da insulina humana natural, contudo, a administração da hormona a diabéticos não tem sido sempre suficiente para estabelecer o metabolismo normal. Existe, portanto, necessidade de insulinas alternativas com melhor actividade ou outros meios de terapêutica para a diabetes. 0 pedido de patente de invenção norte-americana série N2. 074 558 descreve um análogo de insulina humana super-activo, a [10-ácido aspártico -B] insulina humana que apresenta uma actividade aumentada em relação ã insulina humana natural. Especificamente, a [10-ácido aspártico-B] insulina humana determinou-se ser 4 a 5 vezes mais potente que as insulinas naturais. 0 pedido de patente de invenção norte-americana série N2. 273 957 e o pedido de

patente de invenção internacional série N2. PCT/US 88/02289 * descrevem outros análogos de insulina super-activos, des-penta ni a tio c péptido (B26-B30)~[Asp , Tir - ô/-carboxamida]-insulina RIO R2 5 humana, (B26-B30)-[Glu , Tir - ©6-carboxamida]-insulina humana e ainda análogos de insulina de fórmula des (B26-B30)ΒΙΟ B25

-[ X , Tir - oC -carboxamida]-insulina humana, na qual X representa um resíduo substituído na posição 10 da cadeia B.

Estes análogos de insulina têm potências, da ordem de 11 a 20 vezes a potência da insulina humana natural. Todos os análogos de insulina citados anteriormente envolvem substituições de aminoácidos nas cadeias A ou B da insulina humana natural que aumentam a potência ou alteram outras propriedades do composto.

Nenhuma das vias de libertação de insulina correntes, da insulina natural e de análogos de insulina substituir exactamente a secreção de insulina pelo pâncreas normal. Habitualmente, a insulina entra na circulação venosa esplénica expondo, portanto, o fígado a concentrações de insulina mais altas do que as que contactam com o tecido periférico. Com a administração subcutânea convencional de insulina, podem ser normalizadas as concentrações plasmáticas de glucose mas não a reciclagem de glucose nem a produção e utilização de proteínas e lípidos. Além disso, os tecidos vasculares periféricos estão expostos a concentrações de insulina mais altas do que as normais. Embora os efeitos a longo prazo destas anormalidades metabólicas continuarem por definir, existe uma prova considerável de a hiperinsulinémia

-6* periférica poder constituir um factor de risco significativo para o desenvolvimento da aterosclerose.

Os análogos hepatospecificos de insulina, ou os que são mais activos no fígado do que no tecido adiposo, oferecem vantagens diversas em relação à terapêutica de insulina correntemente disponível. Utilizando-se estes análogos pode possibilitar-se a obtenção de absorção hepática preferencial durante a administração subcutânea periférica, simulando, assim, mais proximamente o equilíbrio metabólico entre o fígado e os tecidos periféricos.

Embora se tenham feito tentativas para simular este esquema com injecção intraperitonial de insulina, esta técnica tem as desvantagens potenciais da dificuldade do acesso intraperitonial e do risco de peritonite.

A insulina hepatospecifica alcança o mesmo efeito que a insulina intraperitonial sem estes riscos acrescidos.

SUMÁRIO da invenção

Foram agora sintetizados novos análogos de insulina que se descobriu serem hepatospecificos. .Estes análogos de insulina contêm substituições de um ou mais dos aminoácidos das cadeias A e B. Específicamente, são substituídos o triptofano ou outros

-7¢resíduos volumosos e hidrófobos nas posições A14 e A19 do polipéptido insulinico para produzir os análogos de insulina hepatospecíficos, de acordo com a presente invenção. Acredita-se que o triptofano ou outros resíduos hidrófobos volumosos inseridos nas posições A13, A15 e B16 conduzirão também a análogos de insulina hepatospecíficos.

A presente invenção também se refere a composições farmacêuticas para o tratamento da diabetes em doentes que necessitem desse tratamento, as quais contêm uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico de um análogo de insulina, de acordo com a presente invenção, conjuntamente com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Além disso, a presente invenção refere-se a um método de tratamento da diabetes que consiste na administração a um doente diabético necessitado de terapêutica insulina de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico de um análogo de insulina humana de acordo com a presente invenção, conjuntamente com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 representa um cromatograma que mostra a eluição de uma coluna Cellex-E (200 a 350 ml de efluente) de S-sulfonato 14 de [Trp ]-cadeia A impuro de carneiro.

-8A Figura 2A representa um cromatograma que mostra a eluição de uma mistura de S-suifonato de cadeia B de carneiro e <

de S-sulfonato de [Trp ]-cadeia A de carneiro no inicio da separação cromatográfica numa coluna de celulose-CM.

A Figura 2B representa um cromatograma de HPLC de fase inversa demonstrando a recromatografia do material do pico representado na Figura 2A (140-180 ml de efluente).

A Figura 3 consiste num gráfico que compara a estimulação da lipogénese nos adipocitos do rato pela insulina natural e por 14 [Trp -A]-insulina.

A Figura 4 é um gráfico em que se compara a inibição da gluconeogénese em células FAO nas quais a inibição da secreção de glucose é determinada como uma função de insulina natural ou 14 da [Trp -A]-insulina.

DESCRIÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um análogo de insulina com uma cadeia A constituída por aminoácidos AI até A21 e uma cadeia B contendo aminoácidos BI até B30 em que o aminoácido A14 está substituído por um resíduo de aminoácido escolhido no grupo constituído por triptofano, naftilalanina, ácido NJ^dansil-a,^diaminobutírico, leucina, valina, fenilalanina e outros amino-9c ácidos hídrófobos. A presente invenção também se refere a um análogo de insulina contendo uma cadeia A constituída pelos aminoácidos AI até A21 e uma cadeia B que contem aminoácidos BI até B30, em que o resto de aminoácido escolhido entre o grupo constituído por triptofano, naftilalanina, ácido Nfl*-dansil-a,jf-diaminobutírico, leucina, valina, fenilalanina e outros aminoácidos hídrófobos é substituída por um aminoácido escolhido no grupo constituído por o aminoácido A13, o aminoácido A14, o aminoácido A15 e o aminoácido A19, o aminoácido B16 e as suas associações. A presente invenção refere-se ainda a um análogo de insulina, [Trp^-A]-insulina de fórmula

S-S

H-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Leu-Cys-SerS

I

S

Leu-Trp-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH

H-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-LeuS !

s

Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OH

-LO¢A designação análogos da insulina refere-se a uma proteína que tem a estrutura básica de cadeia A e cadeia B da insulina humana (e de outras espécies) e contém todos os resíduos de semi-cisteína na mesma posição que apresenta a insulina natural. Assim, os análogos de insulina mantêm a disposição de pontes de dissulfureto das insulinas naturais. Os análogos de insulina utilizáveis podem diferir de insulinas naturais pela adição, eliminação, substituição ou modificação de um ou mais aminoãcidos numa ou em ambas as cadeias da molécula, mas devem manter, pelo menos, uma parte da potência da insulina. Vêr, por exemplo, Katsoyannis, Treatment of Early Diabetics, Plenum publ. Corp.; (1979) 319-327, Blondell, Adv.

Prot. Chem., 26 (1972) 330-362.

Os análogos de insulina da presente invenção que diferem da insulina natural por substituições do aminoácido de ocorrência natural por triptofano nas posições A14 e A19 verificou-se inesperadamente que possuem maior potência para as células hepáticas do que para o tecido adiposo. Também se considera que os análogos de insulina que diferem da insulina natural por substituição de naftilalanina, ácido Njf-dansil- ot -, jf -diaminobutirico, leucina, valina, fenilalanina e outros aminoãcidos hidrófobos pelos aminoãcidos de ocorrência natural nas posições A13, A15 e A16 e que podem também apresentar maior potência nas células hepáticas do que no tecido adiposo.

A propriedade mais importante destes análogos de insulina é a sua hepatospecificidade, sendo portanto, mais activos no fígado do que, no tecido adiposo ou no tecido periférico. Por 14 exemplo, no tecido adiposo a [Trp -A]-insulina apresenta uma actividade de cerca de 60Z da da insulina natural (ensaio de lipogénese) embora no fígado exiba uma actividade (em termos da inibição da gluconeogénese) de 90Z da da insulina natural. Deve notar-se que, embora, a insulina estimule a utilização da glucose no tecido periférico (isto é, no tecido adiposo) no fígado a insulina inibe a síntese da glucose de novo (inibição da gluconeogénese).

Pensa-se que a substituição do resíduo de aminoácido A14 na molécula de insulina com outros resíduos volumosos como a naftilalanina ou o ãcido N£-dansil- o( , Y -diaminobutírico ou outros resíduos de aminioácidos hidrófobos como, por exemplo, a leucina, valina ou fenilalanina também conduz também a insulinas hepatospecificas.

Também se podem fazer outras modificações nas porções da cadeia B, dos análogos da insulina mencionados anteriormente nas posições B10 e B25, de acordo com anteriores pedidos de patente de invenção norte-americana dos requerentes, séries N2s. 074 558 e 273 957, cujas descrições aqui se incluem como referência. Estas substituições adicionais geram insulinas super-activas que se pensa serem hepatospecificas.

Os análogos de insulina reivindicados podem produzir-se por uma variedade das técnicas conhecidas pelos especialistas na matéria. Por exemplo, as cadeias A e B componentes dos análogos de insulina podem ser sintetizadas por qualquer das técnicas de síntese peptídica conhecida, incluindo técnicas de síntese péptídicas de fase sólida e técnicas em solução por exemplo, condensação de fragmentos. Ver, por exemplo, Erickson e Merrifield, The Proteins, New York, Academic Press, 1976, vol. 2, capítulo 3; Black et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 80 (1983) 1556-1559 para descrição das técnicas de síntese péptidica.

Alguns dos análogos de insulina reivindicados podem ainda preparar-se por associação de cadeia B de insulina humana ou de carneiro, isolada após redução ou sufitólise oxidante da insulina pancreática intacta ou recombinante com uma cadeia A modificada preparada por técnicas de síntese peptídica ou por métodos de recombinação de DNA.

Os métodos de DNA recombinantes para a preparação de cadeias A ou B de insulina contendo aminoácidos de ocorrência natural substituídos em qualquer posição incluem, mas não se limitam, a clonagem e expressão de um DNA sintetizado in vitro que codifica essas sequências de aminoácidos da cadeia A ou da cadeia B. Alternativamente, um organismo como, por exemplo, uma bactéria que exprime a cadeia A ou a cadeia B de insulina humana pode ser induzida a produzir uma cadeia modificada por qualquer

das técnicas in vitro de mutagénese de sítio dirigido. Vêr por exemplo Smith, Ann. Rev. Genet., 19 (1985) 423-463; Botstein et al. Science 229 (1985), 1193-1201.

De um modo geral, para preparar insulina com uma cadeia A modificada, cadeias B de insulina de carneiro, obtidas por qualquer das técnicas conhecidas, são associadas com as cadeias A modificadas preparadas por qualquer técnica apropriada. As cadeias A e B modificadas são, de preferência, as suas formas S-sulfonadas estabilizadas que podem, em seguida, ser recombinadas, mediante processos conhecidos para formarem análogos de insulina activa intactos. Técnicas de recombinação conhecidas são descritas nas patentes de invenção norte-americanas N2.

3420 810 por Katsoyannis e patente de invenção norte-americana N2. 4421 685 por Chance et al.. A patente de invenção norte-americana N2. 4421 685 proporciona um processo em um só passo para a formação de uma insulina que envolve uma cadeia A S-sulfo nada e uma cadeia B S-sulfonada, na presença de um agente de redução de tiol, como por exemplo o ditiotreitol ou a cisteína, em meio aquoso. As condições de recombinação incluem (1) um pH de cerca de 10,5, (2) uma concentração de proteína total de cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/ml e (3) um agente de redução de tiol numa concentração que produza cerca de 0,4 a 2,5 grupos SH por cada grupo -S-SO^ presente nos S-sulfonatos totais das cadeias A e B presentes na mistura. A formação de análogos de insulina ocorre pela manutenção da reacção a uma temperatura

compreendida entre cerca de 0° e 5°C num ambiente que proporcione uma fonte de oxigénio para permitir a formação de ligações S-S da de insulina.

Uma vez completada a reacção da recombinação, o análogo de insulina pode isolar-se e analisar-se para determinação da pureza e da actividade, mediante diversas técnicas conhecidas.

As técnicas utilizadas correntemente para purificação da insulina e dos análogos de insulina são técnicas cromatográficas como, por exemplo, a cromatografia liquida de alta resolução (HPLC), cromatografia de filtração por gel e cromatografia de permuta iónica. A pureza do produto pode determinar-se por diversas técnicas incluindo, entre outras, HPLC, gelelectroforese de poliacrilamida, análise de aminoácidos e sequênciação de aminoácidos.

Embora os análogos de insulina, em geral, mantenham a mesma actividade insulínica residual, a potência destes análogos é habitualmente apenas uma fracção da das insulinas naturais. A potência das insulinas humanas bovina e porcina, nos padrões da USP é cerca de 25 a 26 unidades internacionais por mg de proteína. Os ensaios padrão para medida da potência insulínica incluem, entre outros, (1) ensaios de radioreceptores de insulina, em que a potência relativa de uma insulina é definida como a relação entre a insulina e o análogo de insulina necessario para deslocar 50Z de I insulina específicamente ligada

aos receptores de insulina presentes nas membranas celulares, por exemplo, na fracção da membrana plasmática de fígado de rato, adipocitos isolados de rato ou hepatocitos isolados de rato; (2) ensaio de lipogénese, realizado, por exemplo, com adipocitos de rato em que a potência de insulina relativa é definida como a relação entre a insulina e o análogo de insulina necessária para - - 3 obter 50Z da conversão maxima de [3- H]-glucose em material orgânico -extraível, por exemplo lípidos; (3) ensaios de oxidação de glucose em células gordas isoladas em que a potência relativa do análogo de insulina se define como a relação entre a insulina e o análogo de insulina para se obter 50Z da conversão máxima de glucose-1-[l^C] em [^CC^] ; (4) radioimunoensaios de insulina que podem determinar a imunogeneicidade de análogos de insulina por avaliação da eficácia através da qual a insulina ou o 125 analogo da insulina compete com I-insulina na ligaçao a anticorpos anti-insulinas específicos; (5) inibição da glucogénese realizada em monocamadas confluentes de uma linha de células de hepatoma diferenciadas (FAO) em que a inibição da secreção de glucose no meio é determinada como uma função da concentração de insulina ou do análogo de insulina. A potência relativa do análogo definida como a relação entre a concentração de insulina e a concentração do análogo necessária para produzir metade da inibição máxima da produção de glucose; e (6) outros ensaios que avaliam a ligação de insulina ou de um análogo de insulina com células como, por exemplo, línfocitos de cultura que se sabe possuírem receptores de insulina específicos.

Os análogos de insulina da presente invenção podem ainda incluir-se em composições farmacêuticas para a administração a doentes diabéticos. As composições farmacêuticas contêm um análogo de insulina de acordo com a presente invenção numa quantidade terapêuticamente eficaz para promover a obtenção da homeostase hormonal no doente diabético conjuntamente com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Como com todas as preparações insulinicas, para o tratamento de diabetes, as quantidades terapêuticas apropriadas do composto activo, para a obtenção da homeostase hormonal nos doentes diabéticos, têm que ser determinadas. Factores a considerar incluem a gravidade da doença diabética, a via de administração da composição. Finalmente, o médico assistente que trata o doente diabético decide quanto à quantidade de composição farmacêutica e via de administração. As insulinas naturais são geralmente administradas a um doente numa dose terapêutica de modo a proporcionar cerca de 0,2 a cerca de 5 unidades de actividade de insulina humana por kg de massa corporal e por dia. Ver patente de invenção norte-americana N2. 4652 547.

As composições farmacêuticas que contêm uma quantidade terapêuticamente eficaz de um análogo de insulina de acordo com a presente invenção podem administrar-se por via parenteral a um doente diabético que necessite de tratamento insulínico. De preferência, a composição é administrada por via intra-muscular, sub-cutânea ou endovenosa. A composição pode ainda administrar-se

por nebulização nasal. Altemativamente, para um controle da homeostase a longo prazo, a composição pode incorporar-se numa bomba implantável para a administração ao doente. São conhecidos tecnicamente estes dispositivos implantáveis que proporcionam uma dose controlada do fármaco, ao doente, durante um longo período.

A composição contém, adicionalmente, um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico que não pode ser prejudicial ao doente. 0 veículo deve também ser isento de efeitos indesejáveis no componente activo da composição, isto é [Trp^-A]-insulina ou outro análogo de insulina. Veículos apropriados e outros aditivos para a preparação de composições farmacêuticas que contêm quantidades eficazes sob o ponto de vista terapêutico, dos análogos de insulina reivindicados como componente activo podem ver-se na patente de invenção norte-americana N2. 4 652 547 que proporciona composições que contêm insulina.

Como um exemplo, a síntese da [Trp^-A]-insulina foi obtida por inter-acção da cadeia B de carneiro S-sulfonada com formas 14

S-sulfonadas da cadeia [Trp -A] (XX, em seguida) de insulina de carneiro. Foram seguidos os processos descritos por Katsoyannis et al., Biochemistry, 6 (1967) 2635-2642 e Chance et al., Pept. Proc. Am. Pept. Symp. 7th, (1981) 721-728. A síntese do análogo de cadeia A implicou, como passo principal, a construção do heneicosapéptido protegido (XII, a seguir), contendo a sequência de aminoácidos completa da cadeia A respectiva. Para a construção do heneicosapéptido protegido aplicou-se a método-18-

Chem. Soc., 85 (1963) 2149-2154, e Merrifield et al., Biochemistry, 21 (1982) 5020-5031, ou a condensação ou a via de condensação de fragmentos. A síntese por esta última via envolve o acoplamento do pentapéptido C-terminal (sequência A17-A21) ao pentapéptido adjacente (sequência A12-A16) para se obter o decapéptido C-terminal (sequência A12-A21).

último composto foi acoplado ao tripéptido adjacente (sequência A9-A11) para se obter o tridecapéptido C-terminal (sequência A9-A21) que, por sua vez, foi acoplado ao tetrapéptido adjacente (sequência A5-A8) para se obter o heptadecapéptido C-terminal (sequência A5-A21). O passo de acoplamento final envolveu o acoplamento do heptadecapéptido C-terminal ao tetrapéptido N-terminal para se obter o heneicosapéptido protegido (XII ou XIX, a seguir).

Utilizam-se os grupos de bloqueio usuais para a protecção das funções secundárias dos diversos aminoácidos (isto é, Bzl para Ser, Glu, Asn e Tyr e PMB para Cys) com excepção da função indole de Trp que foi protegida com o grupo Mts, de acordo com Fujii et al., Chem. Pharm. Buli. (Japan) 32 (1984) 2660-2665. Fez-se a remoção dos grupos de bloqueio do heneicosapéptido protegido com ácido trifluorometano-sulfênico ΙΜ-tioanizol em ácido trifluoroacético contendo m-cresol e EDTA, de acordo com Yajima e Fujii, J. Am. Chem. Soc., 103 (1981) 5867-5871 e Fujii

et al., supra, utilizando-se a modificação descrita recentemente por Ogawa et al., J, Protein Chem., 3 (1984) 327-348 ou pelo processo de fluoreto de hidrogénio low/high de acordo com Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 105 (1983), 6442-6455 e sulfitólise dos produtos reduzidos resultantes que fornecem o análogo XX da cadeia S-sulfonado.

A presente invenção será melhor ilustrada pelos exemplos específicos seguintes que não se consideram como limitativos do seu âmbito em qualquer sentido.

EXEMPLO 1 » 14

Síntese de [Trp -A]-insulina de carneiro

A. Síntese da cadeia A

Boc-Gln-Leu-OMe (I)

A uma solução de H.Leu.OMe, adicionaram-se 11,3 g de ácido clorídrico em 50 ml de dimetilformamida juntamente com 9,1 ml de TEA seguidos de 17,6 g de Boc-Gln.ONp. Após 24 horas, filtrou-se a mistura e concentrou-se o filtrado até um pequeno volume, sob pressão reduzida, e diluiu-se com 500 ml de acetato de etiló e 100 ml de água. Lavou-se a fase orgânica com NH^OH IN, água, ácido clorídrico 0,5 N e água, secou-se e concentrou-se até à secura. Triturou-se com éter dietilico/éter de petróleo o resíduo solidificado e cristalizou-se em acetato de etilo/éter dietílico: peso : 13,7 g (rendimento 76,6Z), ponto de fusão : 126°C;

-20c [ 1^5-35,3° (_C = 1, metanol).

Anál. Cale, para : C, 54,7; H, 8,37; N, 11,3.

Determ : C, 55,0; H, 8,26; N, 11,3.

Z(OMe)-Trp(Mts)-Gln-Leu-OMe (II)

Uma solução do composto I, (3,73 g) em ácido trifluoroacético-anisole (8 ml - 2 ml) foi mantida à temperatura ambiente durante 1,5 hora e concentrada até à secura sob pressão reduzida. Triturou-se o resíduo com uma mistura de éter dietílico/éter do petróleo a 1:2, v/v e secou-se com hidróxido de potássio sob vazio. A solução deste produto em 20 ml de dimetilformamida contendo 2,8 ml de TEA foi arrefecida até 0°C e adicionada a 6,21 g de azida preparada a partir de Z(OMe)-Trp-(Mts)-NHN^ de acordo com Fujii et al. , supra, seguindo-se o método de Ogawa et al·., supra. Utilizam-se os seguintes reagentes nesta reacção :

ml de dimetilformamida 3,5 ml de ácido clorídrico 6,3 N em dimetilformamida, 1,5 ml de nitrato de tert-butilo e 3,1 ml de TEA. Após 40 horas à temperatura de 40°C diluiu-se a mistura com 600 ml de acetato de etilo e 100 ml de solução saturada de cloreto de sódio. Lavou-se a fase orgânica com ácido cítrico a 10Z e solução saturada de cloreto de sódio, secou-se e concentrou-se até à secura. Após trituração com éter dietílico, o resíduo solidificou e, em seguida, cristalizou em etanol : peso ·. 3,6 g (rendimento 45Z); ponto de fusão : 171°-173°C; [ ]^-41,4° (c = 1, DMF ). Anál. Cale, para ^C4]_^H5]_^N5°]_qS C, 61,1; H, 6,4;

Ν, 8,7. Determ : C, 61,0; Η, 6,5; N, 8,5.

Boc.Leu-Trp (Mts)-Gln-Leu.OMé (III)

Uma solução de 2,0 g do composto II numa mistura TFA-anisole-EDT (10 ml - 1 ml - 0,3 ml) foi conservada ã temperatura de 0°C durante 30 minutos e ã temperatura ambiente durante 30 minutos e em seguida processada de acordo com o método descrito na síntese dos compostos de fórmula geral II. Adicionou-se 1,7 g de Boc-Leu.ONP a uma solução do sal do péptido N -desprotegido resultante em dimetilformamida (35 ml) contendo 0,6 ml de TEA, arrefecida à temperatura de 0°C. Após 24 horas à temperatura ambiente diluiu-se a mistura com 600 ml de acetato de etilo, lavou-se sucessivamente com hidróxido de amónio IN, solução saturada de cloreto de sódio, ácido clorídrico 0,5 N e solução saturada de cloreto de sódio, secou-se e concentrou-se até um pequeno volume. Recolheu-se o produto precipitado e recristalizou-se em acetato de etilo : peso : 1,5 g (rendimento 71Z.)pònto de fusão : 188°-190°C; [o<]£⁵-20,6° (c - 1, DMF). Anál. Cale, para ^43^62^6θ10^ ^: C’ 60.4; H, 7,3; N, 9,8. Determ : C, 60,1; H, 7,5; N. 9,8.

A análise de aminoácido após hidrólise com MSA 4 M forneceu as relações : Glu^ q^Pq g·

-22¢Boc-ser(Bzl)-Leu-Trp(Mts)-Gln-Leu.OMe (IV)

Fez-se o desbloqueamento do composto III (4,46 g) com TFA-anilose-EDT (15 ml - 1,2 ml - 0,8 ml) e isolou-se o sal do péptido N*-desprotegido resultante do modo descrito na síntese dos compostos de fórmula geral III. Adicionaram-se 2,07 g de Boc-Ser(Bzl).OH ã temperatura de 0°C a uma solução deste material em 60 ml de dimetilformamida contendo 1,1 ml de TEA, seguida da adição de 1,65 g de N,N'-diciclohexilcarbodiimida e 1,08 g de hidroxibenzotriazol. Após 24 horas à temperatura ambiente retirou-se por filtração um produto secundário, a ureia, e diluiu-se o filtrado com 600 ml de acetato de etilo e 100 ml de solução saturada de cloreto de sódio. A fase orgânica foi lavada como habitualmente e secou-se e concentrou-se até um pequeno volume. Recolheu-se o produto precipitado repricipitou-se em acetato de etilo/éter dietílico : peso : 4,58 g (rendimento 85Z) ; ponto de fusão : 187°-188°C; [ 4 ]p⁵-21,6° (c = 1, DMF). Anãl. Cale, para ^C53^H73^N7°12^{G : C}’ 61.7; H, 7,1; N, 9,5. Determ : C, 61,4; H,

7,2; N, 9,3. A análise de aminoácidos após hidrólise com MSA 4 M deu as relações seguintes :

^Serl,0^Glul,0^Leu2,0^Trp0,7 *

Boc-Ser-(Bzl)-Leu-Trp(Mts)-Gln-Leu-NHNH2 (V)

Uma solução de 4,2 g do composto IV numa mistura de 35 ml de DMF e 10 ml de etanol contendo 1,0 ml de hidrato de hidrazina,

-23¢foi mantida à temperatura ambiente durante 24 horas e em seguida, dilui-se com 200 ml de etanol a 50Z em água. Recolheu-se o precipitado e reprecipitou-se com metanol-água : peso : 4,0 g (rendimento 94Z); ponto de fusão : 203°-205°C; [ o< ]^-6,l° (c = 1, DMSO). Anál. Cale, para C^H^NgO^S : C, 60,5; H, 7,1·,

N, 12,2. Determ : C, 60,9; H, 7,4; N, 12,0. Um hidrólisado de MSA 4 M forneceu as relações seguintes :

^Ser0,9^G1u1,0^Leu2,0^Trp0,7·

Boc-Tyr(Bzl)-Cys(PMB)-Asn.OBzl (VI)

Uma solução de 7,39 g de Boc-Cys-(PMB)-Asn-OBzl preparada de acordo com Ohta et al.., J. Protein Chem. Ί_ (1988), 55-65 em TFA-anisole (15 ml - 3 ml) conservou-se à temperatura de 0°C durante 30 minutos e à temperatura ambiente durante 1,5 horas e, em seguida, concentrou-se sob pressão reduzida. Triturou-se o resíduo com uma mistura de éter dietilico e éter do petróleo (1:1, v/v) e secou-se com hidróxido de potássio sob vazio. Adicionaram-se 7 g de Boc-Tyr(Bzl).ONp a uma solução deste material em 60 ml de dimetilformamida contendo 2,3 ml de TEA e arrefeceu-se até à temperatura de 0°C. Após 24 horas à temperatura ambiente diluiu-se a mistura com 600 ml de acetato de etilo e 100 ml de NH^OH 1 N. Lavou-se a fase orgânica com NH^OH 1 N, ácido clorídrico 0,5 N e água, secou-se e concentrou-se até um pequeno volume. Recolheu-se o produto precipitado e recristalizou-se em acetato de etilo : peso : 8,7 g (rendimento 842)j

-24¢* ponto de fusão : 174°-175°C; [ o( 1^-18,6° (c =1, DMF). Anál.

Cale, para ^43^5(^4096 : C, 64,6; H, 6,30; N, 7,0. Determ :

C, 64,0; H, 6,35; N, 7,0.

Boc-Asn-Tyr(Bzl)-Cys(FMB)-Asn-OBzl (VII)

Desbloquearam-se 8,2 g do composto de fórmula VI com TFA-anisol (22 ml - 2,2 ml) como descrito anteriormente. A trituração do resíduo com éter dietilico provocou a precipitação do sal do peptido N -desprotegido que se filtrou e secou com hidróxido de potássio sob vazio. Adicionaram-se 3,9 g de Boc-Asn-ONp a uma solução deste produto em 50 ml de dimetilformamida contendo 1,8 ml de TEA e arrefeceu-se até 0°C. Após 24 horas à temperatura ambiente, diluiu-se a mistura reaccional com 200 ml de metanol e filtrou-se o produto precipitado, lavou-se com hidróxido de amónio 1 N, ácido clorídrico 0,5 N e água, secou-se e reprecipitou-se com dimetilformamida/metanol : peso : 6 g (rendimento 64Z); ponto de fusão : 237°-238°C; [ ]^-37,4° (c = 1, DMF). Anál. Cale, para ^C47^H56^N6°n^{s :} C, 61,8; H, 6,18;

N, 9,2. Determ : C, 61,6; H, 6,30; N, 9,1.

Boc-Glu(OBzl) -Asn-Tyr(Bzl)-Cys(PMB)-Asn.QBzl (VIII)

O desbloqueamento de 5,5 g do composto de fórmula VII e isolamento do sal de peptido N -desprotegido realizou-se como descrito na síntese do composto de fórmula VII. Adicionaram-se

-253,3 g de Boc-Glu-(OBzl).ONp (preparado pelo método descrito por Srandrin et al., Helv. Chim. Acta, 46 (1963) 1637-1669) a uma solução deste produto em 50 ml de dimetilformamida contendo 0,85 ml de TEA à temperatura de 0¾. Processou-se a mistura reaccional como para a síntese do composto de fórmula VII: peso 5,6 g (rendimento 81Z); ponto de fusão : 206°-207°C; [0(1^-41,4° (c = 1, DMF). Anál. Cale, para ^C59^H69^N7°]_4^{S : c}> 62,6; H, 6,14;

N, 8,7. Determ : C, 62,3; H, 5,94; N, 8,5. As relações dos aminoácidos no hidrolisado de ácido clorídrico 6 N foi :

Asp^ gGlu^ Q^^rl 0’ Cys(PMB) não se determinou.

Boc-Ser(bzl)-Leu-Trp(Mts)-Gln-Leu-Glu(OBzl)-Asn-Tyr(Bzl)-Cys(PMB)-Asn.Obzl (IX) desbloqueamento de 2,3 g do composto de fórmula VIII e isolamento do sal de peptido N -desprotegido realizou-se do modo descrito para a síntese do composto de fórmula VII. Adicionaram-se 2,98 g da azida preparada a partir do composto de fórmula V. De acordo com Ogawa et al., supra), a uma solução deste produto em 35 ml de dimetilformamida contendo 0,42 ml de TEA e arrefeceu-se até ã temperatura de 0°C. Os reagentes utilizados nesta reacção foram os seguintes : DMF (20 ml), HC1 6,3 N em dimetilformamida (0,92 ml), 0,42 ml de nitrito de tert-butilo e 0,98 ml de TEA. Após 48 horas ã temperatura de 4°C, diluiu-se a mistura reaccional com 20 ml de acetato de etilo e 100 ml de ácido cítrico a 5Z, separou-se por filtração o produto precipi-26-

tado, lavou-se com água e metanol e reprecipitou-se com dimetilformamida/metano : peso : 1,55 g (rendimento 38Z), ponto de fusão : 245°-246°C; [β<]£⁵-15,7° (c =1, DMSO). Anal. Cale, para ^106^131^14θ23^2’2^20 : C, 61,5; H, 6,6; N, 9,5. Determ :

C, 61,4; H, 6,5; N, 9,7. A relação dos aminoácidos no hidrolisado de ãcido clorídrico 6 N foi :

Asp2 ₉G1u₂ qL^eu2 ^Tyr^ o^- ^rp ^e Cys(PMB) não se determinaram.

Boc-Gly-Val-Cys (PMB) -Ser (Bzl) -Leu-Trp(Mts) -Gln-Leu-Glu(OBzl·) -Asn-Tyr(Bzl)-Cys(PMB)-Asn.OBzl (X)

Uma solução do composto de fórmula IX, (0,95 g) em TFA-anizol-EDT (5 ml - 0,11 ml - 0,08 ml) foi conservada à temperatura de 0°C durante 30 minutos e â temperatura ambiente durante 1,5 hora. Eliminou-se o excesso de TFA por evaporação sob pressão reduzida e triturou-se o resíduo com éter dietílico.

precipitado formado foi filtrado e seco com hidróxido de potássio sob vazio. Adicionou-se 0,82 g da azida preparada a partir de Boc-Gly-Val-Sys(PMB)-NHNH₂, de acordo com o método de Ogawa et al., supra, a essa solução do produto em 25 ml de dimetilformamida contendo 0,09 ml de TEA. Os reagentes utilizados nesta reacção foram os seguintes . 10 ml de DMF, 0,51 ml de HC1

6,3 N em dimetilformamida, 0,24 ml de nitrito de tert-butilo e 0,49 ml de TEA. Após 48 horas ã temperatura de 4°C diluiu-se a mistura reaccional com 20 ml de acetato de etilo e 60 ml de ácido

cítrico a 5Z e o produto precipitado recolheu-se e reprecipitou-se de dimetilformamida/metanol : peso : 0,93 g (rendimento 82Z); ponto de fusão : 267°-268°C; [β(]ρ⁵-17,4° (c » 1, DMSO).

Anil. Cale, para .31^0 : C, 60,4; H, 6,6; N,

9,7. Determ; C, 60,3; H, 6,4; N, 9,9. As relações de aminoácidos no hidrolisado de ácido clorídrico 6 N foram :

Asp^ çSerg gGlu^ 0^G^l 0^^a^l 0^^eu2 l^^^r0 9‘ ^^{ao se} determinaram Trp nem Cys (PMB).

Boc-Gln-Cys (PMB) -Cys (PMB) -Ala-Gly-Val-Cys (PMB) -Ser (Bzl) -Leu-Trp(Mts)-Gln-Leu-Glu(OBzl) -Asn-Tyr(Bzl)-Cys(PMB) -Asn-OBzl (XI) desbloqueio de 0,82 g do composto de fórmula X com TFA-anisol-EDT (5 ml - 0,5 ml - 0,1 ml) e o isolamento do sal de peptido N -desprotegido realizou-se como descrito anteriormente. Adicionaram-se l,06gdaazida preparada a partir de Boc-Gln-Cys (PMB) -Cys (PMB) -Ala-NHNI^ de acordo com Ogawa et al. , supra, a uma solução deste produto em 40 ml de dimetilformamida contendo 0,1 ml de TEA. Os reagentes utilizados nesta reacção foram os seguintes : 20 ml de DMF, 0,43 ml de ãcido clorídrico,

6,3 N em dimetilformamida, 0,1 ml de nitrito de tert-butilo e 0,42 ml de TEA. Após 48 horas à temperatura de 4°C diluiu-se a mistura reaccional com 200 ml de metanol e precipitou-se o derivado heptadecapeptídico que se recolheu e precipitou de dimetilformamida-metanol : peso : 0,85 mg; ponto de fusão :

-28> 270°C. [ 0<]ξ⁵-21,4° (c

1, DMSO). As relações dos aminoácidos no hidrolisado de ácido clorídrico 6 N são as seguintes :

^AsP2,0^Ser0,9^Glu3,l^Glyl,0^Alal,2^Val0,9^Leul, 9^0,7- ^{Na0 se} determinaram Trp nem Cys(PMB).

Z-Gly-Ile-Val-Glu(OBu^t) -Gln-Cys(PMB) -Cys (PMB)-Ala-Gly-Val-Cys(PMB)-Ser(Bzl) -Leu-Trp (Mts)-Gln-Leu-Glu(QBzl)-Asn-Tyr( Bzl·)-Cys (PMB)-AsnOBzl (XII) desbloqueio do composto de fórmula XI, (0,6 g), com TFA-anisol-EDT (6 ml - 0,6 ml - 0,1 ml) e isolamento do produto resultante realizou-se de acordo com o método descrito anteriormente. Adicionaram-se 0,49 g da azida preparada a partir de Z-Gly-Ile-Val-GluCOBU¹·)-NHNH2, de acordo com o método descrito por Katsoyannis et al., J. Am. Chem. Soc., 88 (1966) 5622-5625 a esta solução deste material em 40 ml de dimetilformamida contendo 0,06 ml de TEA. Os reagentes utilizados para esta reacção foram os seguintes : 20 ml de DMF, 0,25 ml de HC1 6,3 N em DMF, 0,11 ml de nitrito de tert-butilo e 0,3 ml de TEA. Após 48 horas à temperatura de 4°C, diluiu-se a mistura reaccional com 200 ml de metanol e recolheu-se o heneicosapéptido protegido precipitado e reprecipitou-se com DMF/metanol : peso : 0,53 g (rendimento 76Z) ; ponto de fusão : > 270°C. A análise de aminoácidos após hidrólise com HC1 6 N deu as relações molares seguintes :

^As?2,0^Ser0,9^G1u4,0^Gly2,l^Alal.0^Vall,5^Ile0,6^Leul,8^Tyr0.7' ^{Nao se} determinaram Trp nem Cys(PMB).

-29ç

B.

Síntese da cadeia A [Trp¹⁴]

S-sulfopada (XX)

Tratou-se o heneicosapéptido protegido XII (200 mg) com ácido trifluorometano-sulfónico 1 M em 4,3 ml de TFA contendo 0,66 ml de tioanisol, 0,59 ml de m-cresol e 9,47 ml de EDT à temperatura de 0°C durante 2 horas. Em seguida, arrefeceu-se esta solução até à temperatura de -10°C, e adicionou-se, gota a gota, e sob agitação forte 25 ml de cloridrato de guanidina 8 M contendo 5 ml de hidróxido de amónio concentrado. Durante este procedimento, a temperatura da mistura foi mantida a baixo de 5° C. A mistura resultante pH cerca de 5, extraiu-se 3 vezes com 50 ml de éter diétílico, de cada vez, e corrigiu-se o pH da fase aquosa com hidróxido de amónio para 8,9, adicionou-se 1,2 g de sulfito de sódio e 0,6 g de tetrationato de sódio. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 3,5 horas e, em seguida, introduziu-se num tubo de membrana Spectrapor N2. 3 e dializou-se contra água destilada com quatro mudanças de 4 litros, de cada vez, à temperatura de 4°C durante 24 horas. A liofilisação do dializado deu um análogo de cadeia S-sulfonada impuro que se dissolveu em 6 ml de hidrogenocarbonato de amónio 0,015 M e se cromatografou numa culuna Sephadex G-15 (4,2 x 45 cm), equilibrada e eluída com hidrogenocarbonato de amónio 0,015 M. 0 efluente correspondente ao pico principal, controlado com um espectrofótometro ISCO, liofilizou-se e obteve-se a cadeia A de [Trp¹^*] de insulina de carneiro S-sulfonada sob a forma de um pó branco : peso : 130,5 mg. Para a purificação de 71,3 mg deste

material dissolveu-se em tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 7,0; 3 ml) e aplicou-se numa coluna Cellex-E de 1,2 x 43 cm, equilibrada com o mesmo tampão. A eluição da coluna realizou-se com tampão Tris-HCl (pH 7,0) e um gradiente linear de NaCl como descrito anteriormente por Chu et al., Biochemistry, 26 (1987) 6966-6971. 0 cromatograma obtido no espectrofotómetro ISCO e num condutimetro (Radiometer, Copenhagen), representa-se na figura 1. 0 efluente correspondente ao pico principal (230-360 ml) recolheu-se e dialisou-se como anteriormente e, em seguida, liofilizou-se : peso : 35,4 mg.

A análise de aminoácidos do análogo de cadeia sintética realizou-se em dois hidrolisados ácidos; num utilizou-se HC1 6 N e no outro MSA 4 M (para determinação de Trp) como descrito no método de Simpson et al., J. Biol. Cbem., 251 (1976) 1936-1940.

A composição de aminoácidos, expressa em relações molares, estava de acordo com os valores teoricamente esperados. A digestão do análogo de cadeia sintética com aminopeptidase M e a análise de aminoácidos do digesto deu as relações molares esperadas. 0 material sintético foi completamente digerido pela enzima indicando que a pureza estereo-quimica dos aminoácidos componentes foi preservada durante o processo de síntese.

-31c

C. Síntese e isolamento de [Trp^-A3-insulina de carneiro

Realizou-se a síntese de [Trp^-A]-insulina de carneiro 14 por interacçao da cadeia A [Trp ] de carneiro S-sulfonada (XX) com a cadeia B de carneiro S-sulfonada, (que é igual à de bovino) na presença de ditiotreitol seguindo-se o método de Chance et al., supra. Uma solução de 10 mg de cadeia B S-sulfonada de carneiro, preparada como descrito por Katsoyannis et al., Biochemistry, 6 (1967) 2635-2642, 20 mg de cadeia A Trp^ S-sulfonada e 6,83 mg de ditiotreitol em tampão de glicina 0,1 M (pH 10,5; 6 ml) foi agitada à temperatura de 4°C durante 24 horas e, em seguida, processada como descrito anteriormente por Katsoyannis et al., Biochemistry, (j (1967) 2656-2668. Realizou-se o isolamento e purificação do análogo de insulina na mistura de associação por cromatografia numa coluna de celulose CM (0,9 x x 24 cm) com tampão de acetato (Na⁺, 0,024 M, pH 3,3) e um gradiente de cloreto de sódio exponencial como descrito por Katsoyannis et al., supra. 0 diagrama de eluição, obtido com um espectrofotómetro ISCO e um condutímetro (Radiometer, Copenhaga) apresenta-se na figura 2A. Isolou-se 1,3 mg de [Trp^-A]-insulina a partir do efluente (145-175 ml) via picrato sob a forma de cloridrato, de acordo com o método de Katsoyannis et al., supra.

A purificação final deste material realizou-se por HPLC de fase inversa numa coluna Vydac'*-/ 218 TP de 0,45 x 25 cm ligada com um sistema de cromatografia líquida LKB. Realizou-se a cromatograf ia com um caudal de 0,5 ml/minuto com um gradiente linear de

10-50Ζ de 2-propanol em TFA a O,1Z durante 60 minutos (figura 2B) . A liofilização do efluente, proveniente do pico principal permitiu a obtenção de [Trp -A]-insulina de carneiro de grande pureza.

A análise de aminoácidos do material sintético, após hidrólise com HC1 6 N, deu uma composição expressa em relações molares em bom acordo com os valores esperados teoricamente.

EXEMPLO 2

- - 14

Analise da potência de [Trp -A]-insulina e propriedades de ligação

Neste exemplo, os materiais utilizados e os métodos de análise seguidos foram os descritos por Kitagawa et al.,

Biochemistry, 23 (1984) 1405-1413. A [I]-insulina para os 3 estudos de ligaçao ao receptor e a [3- H]-glucose para a lipogénese foram obtidas em DuPont NEN Research Products. Os filtros de membrana de acetato de celulose com uma dimensão dos póros de 0,2 y*m, eram produtos Sartorius. Os filtros de fibra de vidro, tipo GFC, eram Whatman. A colagenase, Tipo II impuro foi obtida na Worthington.

Soluscint-0 eram produtos da National Diagnostics. A insulina

-33ς cristalina de bovino era proveniente da Sigma e a albumina de soro de bovino isenta de ácidos gordos foi obtida na Boehringer - Mannheim Biochimicals.

A. Ensaio de ligação ao receptor insulinico

A capacidade da [Trp -A]-insulina para inibir a ligaçao específica de I-insulina aos receptores de insulina examinou-se numa fracção de fígado de rato enriquecida em membranas plasmáticas adipocitos isolados de rato e hepatocitos isolados de rato. Os dois primeiros processos realizaram-se de acordo com Burke et al., Biochemistry 19 (1980), 4547-4556.

De uma forma resumida, as incubações em triplicado de 0,2 ml contendo ^5j_£_nsu].£_na> 3 _x ]_q 10 insulina não marcada ou [Trp^-A]-insulina prepararam-se de acordo com o exemplo 1 e as membranas plasmáticas (20-40 de proteína) em fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,4) contendo albumina de soro de bovino, fracção V a 0,6Z. Após incubação durante 45 minutos à temperatura de 24°C, diluiram-se as misturas com 2,0 ml de fosfato de sódio 0,1 M arrefecido com gelo, (pH 7,4) contendo albumina de soro de bovino da fracção V A 0,lZ e filtraram-se imediatamente através de filtros de acetato de celulose. Lavaram-se os filtros duas vezes com tampão arrefecido com gelo, secaram-se e, em seguida, contou-se a radioactividade com um contador de cintilação utilizando-se Filtron-X. A potência relativa obteve-se de

-34* acordo com a relação da concentração da insulina não marcada - 14 com a concentração da [Trp -A].insulina necessária para inibir em 50Z a ligação específica de I-insulina a uma preparação de receptores. Neste ensaio a [Trp^-A]-insulina exibiu uma potência de cerca de 60Z da da hormona natural.

B. Ensaio de lipogenese

Estes ensaios avaliam a capacidades do análogo de insulina era comparaçao com a insulina de bovino, para converter [3- H]-glucose em lipidos.

Prepararam-se os adipocitos por incubação de almofadas de gordura epididimais eperirenais provenientes de ratos machos com pesos compreendidos entre 200 e 300 g, com 1,0 mg/ml de colagénase durante 60 minutos à temperatura de 37°C, seguida de filtração através de uma gaze e, depois através de seda de malha fina. Lavaram-se as células duas vezes por flotação numa centrífuga clínica antes da suspensão para utilização. 0 meio de incubação era constituído por bicarbonato de Krebsringer contendo metade do cálcio recomendado, glucose 0,5 wM e albumina de soro de bovino isenta de ácidos gordos a 3Z utilizando como fase gasosa uma mistura de 95Z de oxigénio e 5Z de anidrido carbónico. As incubações de lipogenese em triplicado continha 1,0 ml de suspensão de adipocitos (20-40 mg em peso de células secas) e 14 insulina de bovino ou [Trp -A]-insulina preparada de acordo com

o método descrito no exemplo 1. Pré-incubaram-se as células durante 45 minutos ã temperatura de 37°C antes da adição da [3- H]-glucose. Continuou-se a incubaçao durante 60 minutos e interrompeu-se por adição de 0,2 ml de ácido sulfúrico 5 N e

0,2 ml de óleo de milho para auxiliar a extracção de lípidos.

Estrairam-se as amostras com 10 ml de Solucint-0® durante 30 minutos ã temperatura ambiente antes da contagem da radioactividade num contador de cintilação. Nestas condiçoes, a [3- H]-glucose não foi extraída pela fase ac^nica que continha o flúor de cintilação e ficou essencialmente por contar. Definiu-se a estimulação da lipogénese de 0 e 100Z como a radioactividade que se observa na ausência e na presença, respectivamente, de

9,1 x IO'¹⁰ M de insulina (5,5 ng/ml). A potência relativa obteve-se como a relação entre as concentrações de insulina e 14 de [Trp -A]-insulina necessárias para produzirem 50Z da estimulação máxima de lipogénese.

_ o

A figura 3 representa a estimulação de [3- H]-glucose em material orgânico extratual (por exemplo, lípidos) em adipocitos isolados de rato por [Trp -A]-insulina ( - A = ) preparada de acordo com o exemplo 1 e insulina de bovino ( - φ - ). A estimulação, expressa em percentagem do máximo, foi representada em função da concentração do agonista. Os pontos dados representam a média das determinações em triplicado nos ensaios representativos realizados quatro vezes.

-36¢Para ambas as insulinas, observou-se um mesmo máximo de estimulação de lipogénese e metade da estimulação máxima foi produzida por cerca de duas vezes a concentração de agonista.

A potência da insulina sintética na lipogénese (aproximadamente 60Z comparada com a hormona natural) reflecte, portanto, o seu comportamento nos ensaios de ligação aos receptores que utilizam os adipocitos.

C. Ensaio de inibição da gluconeogénese

Este ensaio realizou-se em monocamadas confluentes de uma linha de células de hepatoma bem diferenciada (Lauris et al., Endocrinology 118 : (1986) 2519-2524) onde a produção da glucose foi controlada com um conjunto de glucose oxidase comercial [Sigma Kit N2. 510-A, Sigma Technical Bulletin 510 (1983)]. A inibição da secreção da glucose no meio determinou-se em função da concentração de insulina ou do análogo de insulina e a potência relativa do análogo foi definida como a relação entre a concentração de insulina e a concentração do análogo requerida para produzir a inibição semi-máxima de produção de glucose. A cultura de células e a produção de glucose realizou-se de acordo com o método descrito por lavris et al., supra.

A figura 4 mostra a inibição da gluconeogénese em células FAO, expressa sob a forma de percentagem do máximo, e é apresentada como função da concentração de insulina ( - · - ) e da

-37c

- 14 λ '* concentração da [Trp -A]-insulina ( » A - ). Para ambas as insulinas observou-se a mesma inibição máxima da glucogenese e a inibição semi-máxima foi produzida aproximadamente pela mesma concentração de agonista. A potência da insulina sintética para inibir a gluconeogénese foi calculada como cerca de 90Z da relativa à hormona natural.

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES

   1.- Processo para a preparação de análogos de insulina constituídos por uma cadeia A com aminoácidos nas posições AI e A21 e uma cadeia B com aminoácidos nas posições BI a B30, caracterizado pelo facto de se substituir o aminoácido da posição A14 por um res to de aminoácido escolhido entre um grupo triptofano, naftilalanina, ácido -dansil-a, ^-diaminobutírico, leucina, valina, fenilalanina ou outros aminoácidos hidrofõbicos utilizando uma qualquer das técnicas convencionais da química dos péptidos.
2. 2.- Processo para a preparação de análogos de insulina cons- tituídos por uma cadeia A com aminoácidos nas posições Al a A21 e uma cadeia B com aminoácidos nas posições Bl a B30, caracterizado pelo facto de se substituir os aminoácidos posicionados na cadeia A em A13, A14, A15, A19 ou B19 ou as suas associações por triptofano utilizando uma qualquer das técnicas convencionais da química dos peptidos.
3. 3. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se utilizar como aminoácido na posição B10 o ácido aspãrtico.
4. 4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se substituírem os aminoácidos em posição B25 a B30 por tirosina (NHj)·
5. 5. - Processo para a preparação de análogos de insulina de fórmula

   I—Í-^ss-1

   I I I ! S-Cly-rlt-^al-Ciu-CXn-Cys-Cya-Thr-Ser-Ceu-Çys-SerI

   S [ t,<u-Tr?-<;in-C«u-<;iu-Asn-Tyí-Cys-A3n-QH

   3-?Me-7al-Asn-Ci.'.-Si3-l.eu-Cy3-Cly-S«r-Sís-Í,eu-i7<l-Clu-Ala-L<«S

   I

   Tyr-Leu-iZal-Cys-Gly-Clu-Krç-Cly-She-Pha-Tyr-Tljr-Fro-lys-TÍir-OB caracterizado pelo facto de se utilizar uma qualquer das técnicas convencionais da química dos peptidos.
6. 6.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas para administração por via intramuscular, subcutânea, endovenosa, inalatória ou por meio de uma bomba inserida como um implante, apropriadas para o tratamento da diabetes, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade efectiva de um análogo de insulina preparado pelo processo de acordo com as reivindicações 1 a 5, como ingrediente activo, com um veículo aceitável em farmácia.

   Lisboa, 20 de Abril de 1990

   O Acífú ca FrcpricdcJs líioustiol

   RESUMO

   PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANÁLOGOS DE INSULINA HEPATOSPEClFICOS E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE

   OS CONTÊM

   Descreve-se un processo para a preparação de novos análogos de insulina que consiste em substituir nas cadeias A e B um ou mais aminoácidos posicionados em A13, A14, A15, A19 ou B16 por triptofano ou outros restos hidrofõbicos utilizando uma qualquer das técnicas convencionais da química dos peptidos.

   Estes análogos de insulina são hepatospecíficos.