NO301544B1 - Analogifremgangsmåte for fremstilling av en insulinanalog - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av en insulinanalog som finner anvendelse i farmasøytiske preparater for behandling av diabetes.

Insulin er et hormon som har en nøkkelrolle ved regulering av vekst og metabolisme i vertebrater. Alvorlige metabolske forstyrrelser opptrer i fravær av insulin, noe som resulterer i svikt hos mange celler til å utnytte glukose og aminosyrer på normal måte. Den manglende evne til å metabolisere glukose fører hos mennesker til diabetes mellitus, en kompleks kronisk metabolsk mangel der det er en abnorm karbohydrat-, fett- og proteinmetabolisme. I sin mest outrerte kliniske form er diabetes mellituskarakterisert veden absolutt eller relativ mangel på insulin eller insulinaktivitet og er forbundet med glukosuri, ketonuri, vekststans og negativ nitrogenbalanse. Disse betingelser kan til slutt føre til dødsfall fra akutt metabolisk acidose forårsaket av ikke-begrenset oksydasjon av fettsyrer eller inanisjon som resulterer i mangel på tilstrekkelige lipidreserver som er nødvendige for å danne ketonstoffer. Inanisjon er definert som en tilstand som karakteriseres ved en markert svakhet, ekstremt vekttap og en reduksjon i metabolismen som stammer fra langvarig og alvorlig mangel på næring, jeg henviser til "Dorland's Illustrated Medical Dictionary", 25. utgave.

Oppdagelsen og rensingen av insulin i 1920-årene og dennes forbindelse med diabetes mellitus tilveiebragte midlet for å gripe inn i sykdommen. Det henvises her for eksempel til Bliss, "The Discovery of Insulin" (1983), University of Chicago Press, Chicago, 111. I dag er insulin-administrering til diabetes pasienter en primær terapeutisk metode for å kontrollere sykdommen.

Insulin er et ca. 6000 dalton polypeptid som består av to korte peptidkjeder kalt A og B og som er forbundet med hverandre med faste disulfidbroer. I så å si alle studerte insulin inneholder A-kjeden som er 21 aminosyrer lang, også en indre disulfidbro. B-kjeden har en lengde på 30 aminosyrer. På samme måte som mange eukaryotiske proteiner syntetiseres insulin i en forløper-form som post syntetisk bearbeides til det modnede to polypeptidkjedeaktive hormon.

Den umiddelbare forløper for insulin er proinsulin, et enkeltkjedet polypeptid bestående av A- og B-kjeden forbundet til et forbindende peptid på ca. 31 aminosyrer, kalt C-peptidet, ved nabopar av basiske rester. Rekkefølgen av de tre peptider i proinsulinmolekylet er NHg-B-kjede-Arg-Arg-C-peptid-Lys-Arg-A-kjede-COOH. Translasjonsproduktet av insulin mRNA er imidlertid preproinsulin som er proinsulin som på sin NB^-terminus inneholder et 24 aminosyre-sterkt hydrofobt signalpeptid som er karakteristisk for proteiner som enten er transportert gjennom eller innskudd i cellemembraner.

Preproinsulin syntetiseres i pankreatiske p-celler som er lokalisert innen Langerhanske øyer som er dispergert i pankreas. Fjerning av signalpeptidet skjer i det grove endoplasmiske retikulum og det resulterende fullt foldede oksyderte proinsulin transporteres til Golgi-apparaturen for pakking i sekresjonsgranuler. Det foldede proinsulin stabiliseres ved disulfidbindinger. Under modning av sekresjonsgranulene blir det foldede proinsulinmolekyl spaltet av spesifikke proteaser ved de parrede basiske rester og insulin og C-peptidet frigjøres.

Som diskutert ovenfor inkluderer en terapi mot diabetes mellitus administrering av kontrollerte mengder insulin til den diabetiske pasient. Således administrert insulin er hovedsakelig oppnådd fra animalske pankreaser, hovedsakelig kveg og svin. Kveg- og svineinsulin bevirker opprettholdelse av hormonell homeostase på samme måte som humaninsulin med omtrent den samme potens, men, fordi de er fremmede proteiner, kan de fremkalle en immunologisk respons som reduserer brukbarheten. I den senere tid er humaninsulin, oppnådd ved rekombinant DNA-teknikk, føyet til det terapeu tiske armamentarium. Bruken av humaninsulin, fremstilt ved rekombinant DNA eller ved andre teknikker, vil sannsynligvis ikke gi de ugunstige immunologiske problemer som ledsager bruken av animalske insuliner. Selv med tilgjengeligheten for naturlig humaninsulin er imidlertid administrering av hormonet til diabetikere ikke alltid tilstrekkelig til å gjenopprette normal metabolisme. Det er således et behov for alternative insuliner med bedre aktivitet eller andre midler for terapi mot diabetes.

US-SN 074 558 beskriver en superaktiv humaninsulinanalog [10-aspartinsyre-B] humaninsulin som har øket aktivitet i forhold til naturlig humaninsulin. Spesifikt ble [10-aspartinsyre-B]-humaninsulin bestemt å være 4 til 5 ganger mere potent enn naturlige insuliner. US-SN 273 957 og PCT/US88/02289 beskriver andre superaktive insulinanaloger, des-pentapeptid (B26-B30 )-[AspB1°, Tyr<B25->a-karboksamid]humaninsulin, (B26-B30)-[Glu^l-0, Tyr<B25->a-karboksamid]humaninsulin og videre insulinanaloger med formelen des(B26-B30 )-[XB1°,TyrB2<5->cx-kar bok sam id] human in sul in der X er en rest som er substituert i 10-posisjon på B-kjeden. Disse insulinanaloger har potenser et sted mellom 11 og 20 ganger den til naturlig humaninsulin. Alle de ovenfor beskrevne insulinanaloger involverer aminosyresubstitusj oner langs A- eller B-kjeden i naturlig humaninsulin, noe som øker potensen for forbindelsen eller endrer andre egenskaper i forbindelsen.

Ingen av dagens insulinavleveringsmåter for naturlige insulin- og kjente insulinanaloger kan nøyaktig efterligne insulinsekresjonene fra normal pankreas. Vanligvis trer insulin inn i den splankiniske venesirkulasjon og eksponerer derved leveren til høyere konsentrasjoner av insulin enn de til hvilken det perifere vev eksponeres. Med standard subkutane administreringsmåter for insulin kan plasma-glukosekonsentrasjonene normaliseres, men glukoseresirku-lering og produksjon og utnyttelse av proteiner og lipider behøver ikke bli det. I tillegg blir perifere vaskulære vev eksponert til høyere enn normale insulinkonsentrasjoner. Selv om langtidsvirkningene for disse metabolske abnormaliteter ennu ikke er definert, er det betydelige bevis på at perifere nyperinsulinemi kan være en signifikant risikofaktor for utvikling av aterosklerose.

Hepatospesifikke insulinanaloger eller de som er mer aktive i leveren enn i adiposevevet, tilbyr flere fordeler i forhold til dagens tilgjengelige insulinterapi. Ved bruk av slike analoger kan det være mulig å oppnå preferensielt hepatisk opptak under perifer subkutan administrering for derved å efterligne i bedre grad den metabolske balanse mellom lever og perifere vev. Selv om forsøk på å efterligne dette mønster med intraperitoneal injeksjon av insulin har vært foretatt, har denne teknikk de potensielle mangler i og med vanskelig-heten for intraperitoneal aksess og risiko for peritonitt. Hepatospesifikk insulin gir den samme virkning som intraperi-tonealt insulin uten disse økede risiki.

Nye insulinanaloger er nu syntetisert og funnet å være hepatospesifikke. Disse insulinanaloger inneholder substi-tusjoner for en eller flere aminosyrer i A- og B-kjedene. Spesifikt er tryptofan eller andre voluminøse, hydrofobe rester, substituert i A14- og A19-posisjon i insulinpolypeptidet for å produsere de hepatospesifikke insulinanaloger ifølge oppfinnelsen. Det antas at tryptofan eller andre voluminøse hydrofobe rester som er innskutt i A13-, A15- og B16-posisjon også vil føre til hepatospesifikke insulin-analoger .

Oppfinnelsen finner anvendelse ved fremstilling av farma-søytiske preparater for behandling av diabetes hos pasienter som trenger slik behandling og omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en insulinanalog som beskrevet sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Oppfinnelsen skal illustreres nærmere under henvisning til de ledsagende tegninger der

Figur 1 er et kromatogram som viser eluering av rå saue-[Trp<14>]-A-kjede-S-sulfonat fra en Cellex-E-kolonne (200-350 ml avløp); Figur 2A er et kromatogram som viser eluering av en blanding av et saue-B-kjede-S-sulfonat og saue-[Trp<*4>]-A-kjede-S-sulfonat på den opprinnelige kromatografiske separering fra en CM-cellulosekolonne; Figur 2B er et reversfase-HPLC-kromatogram som viser rekromatografien av materialet i toppen vist i figur 2A (140-180 ml avløp); Figur 3 er et diagram som sammenligner stimuleringen av lipogenese i rotteadipocytter med naturlig insulin og [Trp<14->A]-insulin; og Figur 4 er et diagram som sammenligner inhiber ingen av glukoneogenese i FAO-celler hvori inhiberingen av glukosesekresjonen bestemmes som en funksjon av naturlig insulin eller [Trp<14->A]-insulin.

Oppfinnelsen angår således en analogifremgangsmåte for fremstilling av en insulinanalog med en a-kjede omfattende aminosyrene Al til og med A21 og en B-kjede omfattende aminosyrene Bl til og med B30, der A14-aminosyren er erstattet med en aminosyre valgt blant gruppen omfattende tryptofan, val in og naftylalanin, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at peptidet fremstilles ved fastfasesyntese hvor hver aminosyrerest, beskyttet med et en egnet beskyttelsesgruppe som selektivt kan fjernes, adderes ved sekvensielt til en voksende polypeptid-kjede under betingelse for dannelse av peptidbindinger mellom suksessivt fullførte aminosyrer.

Uttrykket insulinanalog henviser til et protein som har den prinsipielle A-kjede- og B-kjedestruktur til human- (og andre spesier av) insulin og inneholder alle halvcysteinrestene i samme posisjon som de er til stede i nativinsulin. Således bibeholder insulinanalogene disulfidbroarrangementet til naturlige insuliner. Brukbare insulinanaloger kan skille seg fra nativinsuliner ved addisjon, delesjon, substitusjon eller modifikasjon av en eller flere av aminosyrer i en eller begge kjeder i molekylet, men må bibeholde minst en andel av insulinpotensen. Det skal her henvises til Katsoyannis, "Treatment of Early Diabetics" (1979), sidene 319-327, Plenum Corp.; Blondell, "Adv. Prot. Chem.", (1972), vol. 26, sidene 330-362.

Insulinanalogene som fremstilles ifølge oppfinnelsen og som skiller seg fra naturlig insulin ved substitusjonene av tryptofan i stedet for den naturlige opptredende aminosyre i posisjonene A14 og A19 ble uventet funnet å ha høyere potens i hepatiske celler enn i adiposevev. Det antas også at insulinanalogene som skiller seg fra naturlig insulin ved substitusjon av naftylalanin, N^-dansyl-a ,'y-diaminosmørsyre , leucin, valin, fenylalanin og andre hydrofobe aminosyrer i stedet for de naturlige opptredende aminosyrer i posisjonene A13, A15 og B16 også kan ha høyere potens i hepatiske celler enn i adipost vev.

Den viktigste egenskap for disse insulinanaloger er deres hepatospesifisitet hvorved de er mer aktive i leveren enn i det adiposevev eller perifere vev. For eksempel viser [Trp<14->A]-insulin i adipose vev en aktivitet på ca. 60$ av den til naturlig insulin (lipogeneseprøve) mens den i leveren viser en aktivitet (uttrykt ved inhibering av glukoneogenese) på 90$ av den til naturlig insulin. Det skal påpekes at mens insulin stimulerer anvendelsen av glukose i det perifere vev (det vil si adiposevev) inhiberer insulin i leveren de novo-syntesen av glukose (inhibering av glukoneogenese).

Det antas at erstatning av A14-aminosyreresten i insulinmolekylet med andre voluminøse rester som naftylalanin eller N^-dansyl-a ."y-diaminosmørsyre eller andre hydrofobe aminosyrerester som leucin, valin eller fenylalanin, også fører til hepatospesifikke insulinanaloger.

Videre antas det også at enkle aminosyreinnskudd i A13-, A15-eller B16-posisjonene i insulinpolypeptidet eller dobbelt-innskudd av aminosyrer i A14-A15-, A13-A14-, A14-A19- og A14-B16-posisjoner i insulinmolekylet med tryptofan eller andre voluminøse rester som naftylalanin eller N^-dansyl-a ,"y-diaminosmørsyre eller andre hydrofobe aminosyrerester som leucin, valin, eller fenylalanin, også fører til hepato-spesif ikke insuliner. Ytterligere modifikasjoner av B-kjededelene av de ovenfor angitte insulinanaloger i B10- og B25-posisjoner kan gjennomføres i henhold til søkerens tidligere søknader, US-SN 074 558 og 273 957. Disse ytterligere substituenter gir superaktive insuliner som antas å være hepatospesifikke.

De krevede insulinanaloger kan fremstilles ved et antall teknikker som er kjente for fagmannen. For eksempel kan komponent A- og B-kjedene i insulinanalogene syntetiseres ved en hvilken som helst av de kjente peptidsynteseteknikker inkludert fastfase-peptidsynteseteknikker og oppløsnings-teknikker, for eksempel fragmentkondensasjon. Det skal her henvises til Erickson og Merrifield, "The Proteins", (1976), vol. 2, kapitel 3, Academic Press, New York; Blake et al., "Proe. Nati. Acad. Sei." (1983), vol. 80, sidene 1556-1559 for en diskusjon av peptidsynteseteknikkene. Noen av de krevede insulinanaloger kan også fremstilles ved å kombinere human- eller saue-B-kjede, isolert efter reduksjon eller oksydativ sulfittolyse av intakt pankreatisk eller rekombinant insulin, med en modifisert A-kjede fremstilt ved peptidsynteseteknikker eller det rekombinante DNA-metoder. Rekombinante DNA-metoder for fremstilling av insulin A- eller B-kjeder med erstattede naturlig forekommende aminosyrer i en hvilken som helst posisjon inkluderer, men er ikke begrenset til, kloning og ekspresjon av en in vitro-syntetisert DNA som koder for en slik A- eller B-kjedeaminosyresekvens. Alternativt kan en organisme som en bakterie og som uttrykker humaninsulin A- eller -B-kjede induseres til å produsere en modifisert kjede ved en hvilken som helst teknikk av in vitro-seterettet mutagenese. Det skal her henvises for eksempel til Smith, "Ann. Rev. Genet.", (1985), vol. 19, sidene 423-463; Botstein et al., "Science" (1985), vol. 229, sidene 1193-1201.

For generelt å fremstille insulin med en modifisert A-kjede blir saueinsulin B-kjeder, oppnådd ved en hvilken som helst kjent teknikk, kombinert med de modifiserte A-kjeder fremstilt ved en hvilken som helst hensiktsmessig teknikk, fl-og modifiserte A-kjeder er fortrinnsvis i sin stabiliserte S-sulfonerte former som så kan rekombineres ved kjente prosedyrer for å danne de intakte aktive insulinanaloger. Kjente rekombinasjonsteknikker er beskrevet i US 3 420 810 og 4 421 685. US 4 421 685 gir en enkelttrinnsmetode for å tildanne et insulin som medfører å føre sammen en S-sulfonert A-kjede og S-sulfonert B-kjede i nærvær av et tiolreduksjonsmiddel som ditiotreitol eller cystein, i et vandig medium. Betingelsene for rekombinering inkluderer (1) en pH-verdi på ca. 10,5 (2) en total proteinkonsentrasjon på ca. 0,1 til 50 mg/ml og (3) et tiolreduksjonsmiddel i en konsentrasjon som gir ca. 0,4 til 2,5 SH-grupper pr. hver -S-SC^-gruppe som er til stede i de totale A- og B-kjede-S-sulfonater som er til stede i blandingen. Dannelsen av insulinanalogene skjer ved å opprettholde reaksjonsblandingen ved en temperatur på ca. 0-5°C i en omgivelse som tilveiebringer en kilde for oksygen for å tillate dannelse av insulin S-S-bindingene.

Med en gang rekombinasjonsreaksjonen er ferdig, kan insulinanalogen isoleres og analyseres med henblikk på renhet og aktivitet ved et antall i og for seg kjente teknikker. Vanligvis benyttede teknikker for rensing av insulin og insulinanaloger er kromatografiske teknikker som høyydelses-væskekromatografi (HPLC), gelfiltrering og ionebyttings-kromatografi. Renheten i produktet kan bestemmes ved et antall teknikker inkludert inter alia HPLC, polyakrylamid-gelelektroforese, aminosyreanalyse og aminosyresekvensering.

Selv om insulinanaloger generelt opprettholder en viss insulinaktivitet er potensen for slike analoger vanligvis kun en brøkdel av den til naturlige insuliner. Potensen for human-, kveg- og svineinsuliner i USP-standarder er ca. 25-26 IU (internasjonale enheter) pr. mg protein. Standardanalyser for måling av insulinpotensen inkluderer inter alia (1) insulinradioreseptoranalyser, der den relative potens for et insulin defineres som det forhold mellom insulin og insulinanalog som er nødvendig for å fortrenge 50$ av I-insulin spesifikt bundet til insulinreseptorer som er til stede på cellemembraner, for eksempel en rotteleverplasmamembran-fraksjon, isolerte rotteadipocytter eller isolerte rottehepatocytter; (2) lipogeneseanalyser, gjennomført for eksempel med rotteadipocytter hvori den relative insulinpotens , er definert som det forhold mellom insulin og insulinanalog som er nødvendig for å oppnå 50$ av den maksimale omdanning av [3-%]-glukose til organisk ekstraherbart materiale (for eksempel lipider); (3) glukose-oksydasjonsanalyse i isolerte fettceller hvori den relative potens for insulinanalogen er definert som det forhold mellom insulin og insulinanalog som er nødvendig for å oppnå 50% av den maksimale omdanning av glukose-1-[<14>C] til [-^CC^] ; (4) insulinradioimmunoanalyser som kan bestemme immunogenisiteten for insulinanaloger ved å måle effektiviteten med hvilken insulin eller en insulinanalog konkurrerer med I-insulin med henblikk på binding til spesifikke anti-insulin anti-stoffer; (5) inhibering av glukoneogenese som utføres på konfluente monosjikt av en godt differensiert hepatoma-cellelinje (FAO) hvori inhibering av glukosesekresjonen til mediet bestemmes som en funksjon av konsentrasjonen av insulin eller insulinanalog. Den relative potens for analogen er definert som forholdet mellom konsentrasjonen av insulin og analog som er nødvendig for å gi halvmaksimal inhibering av glukoseproduksjonen; og (6) andre analyser som måler bindingen av insulin eller en insulinanalog til celler som dyrkede lymfocytter, kjent å ha spesifikke insulinreseptorer.

Insulinanalogene som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan også formuleres til farmasøytiske preparater for administrering til diabetes-pasienter. De farmasøytisk preparater omfatter en insulinanalog som beskrevet i en mengde som er terapeutisk effektiv med henblikk på å fremme oppnåelse av hormonell homeostase hos den diabetiske pasient sammen med en farmasøy-tisk akseptabel bærer. Som med alle insulinpreparater for behandling av diabetes må adekvate terapeutiske mengder av den aktive forbindelse for å oppnå hormonell homeostase hos individuelle pasienter, bestemmes. Faktorer som må tas med i betraktning omfatter alvorligheten av den diabetiske tilstand og administreringsmåten for preparatet. Til slutt er den spesielle lege som behandler pasienten som må avgjøre mengden farmasøytisk preparat og administreringsmåte. Naturlige insuliner blir generelt gitt til en pasient i terapeutiske doser for å tilveiebringe ca. 0,02 til 5 enheter human-insulinaktivitet pr, kg kroppsvekt pr. dag. Det skal vises til US-PS 4 652 547.

Farmasøytiske preparater inneholdende en terapeutisk effektiv mengde av en insulinanalog som beskrevet kan administreres parenteralt til en diabetes-pasient som trenger insulin-behandling. Fortrinnsvis blir preparatet administrert intramuskulært, subkutant eller intravenøst. Preparatet kan også administreres til pasienten ved nasalspray. Alternativt og for langvarig kontrollerte homeostase kan preparatet innarbeides i en implanterbar pumpe for administrering til pasienten. Slike implanterbare innretninger som gir en kontrollert dosering av et medikament til en pasient over et langt tidsrom er i og for seg kjent. Preparatene inneholder i tillegg en farmasøytisk akseptabel bærer som ikke må være skadelig for pasienten. Bæreren må heller ikke ha noen ugunstig virkning på preparatets aktive komponent, det vil si [Trp^<4->A]-insulin eller en annen insulinanalog. Egnede bærere og andre additiver for farmasøytiske preparater som inneholder terapeutisk effektive mengder av de krevede insulin-analoger som aktiv komponent kan finnes i US-PS 4 652 547 som tilveiebringer insulinholdige preparater.

Som et eksempel ble syntese av [Trp^<4->A]-insulin oppnådd ved interaksjon av S-sulfonert saue-B-kjede med S-sulfonerte former av [Trp<14>]-A-kjede (XX, nedenfor) av saueinsulinet. Prosedyren som beskrevet av Katsoyannis et al., "Biochemistry", 5:2635-2642 (1967) samt Chance et al., "Pept. Proe. Am. Pept. Symp. 7th", 721-728 (1981) ble fulgt. Syntesen av A-kjedeanalogen involverte som nøkkeltrinn konstruksjon av det beskyttede heneiocosapeptid (XII nedenfor) inneholdende hele aminosyresekvensen til den respektive A-kjede. For konstruksjon av det beskyttede heneicosapeptid benyttet man enten fastfase-metodologi i henhold til Merrifield et al., "J. Am. Chem. Soc.", 85, 2149-2154 (1963) og Merrifield et al., "Biochemistry", 21, 5020-5031 (1982) eller fragmentkondensasjonsmetoden. Syntesen ved den sistnevnte metode involverte kobling av det C-terminale pentapeptid (sekvensA17-A21) med det ved siden av liggende pentapeptid (sekvens A12-A1^)) for å gi det C-terminale decapeptid (sekvens A<12->A<21>). Den sistnevnte forbindelse ble koblet med nabotripeptidet (sekvens A^-A<11>) for derved å gi C-terminal-tridecapeptidet (sekvens A^-A<21>), som i sin tur ble koblet med nabotetrapeptidet (sekvens A^-A<8>) for derved å gi det C-terminale heptadecapeptid (sekvens A<5->A<21>). Det siste koblingstrinn involverte kobling av det C-terminale heptadecapeptid med det N-terminale tetrapeptid for å oppnå det beskyttede heneicosapeptid (XII eller XIX, nedenfor). De vanlige blokkerende grupper ble benyttet for beskyttelse av de sekundære funksjoner for de forskjellige aminosyrer (for eksempel Bzl for Ser, Glu, Asn og Tyr og PMB for Cys) bortsett fra indolfunksjonen av Trp som ble beskyttet med Mts-gruppen i henhold til Fujii et al., "Chem. Pharm. Bull."

(Japan), 32, 2660-2665 (1984). Fjerning av de blokkerende grupper fra det beskyttede heneicosapeptid enten med IM trifluormetansulfonsyre-tioanisol i TFA inneholdende m-kresol og EDT i henhold til Yaj ima og Fujii, "J. Am. Chem. Soc.", 103. 5867-5871 (1981) og Fujii et al., supra, ved bruk av den modifikasjon som er beskrevet i den senere tid av Ogawa et al., "J. Protein Chem.", 3, 327-348 (1984) eller ved lav/høy-hydrogenfluoridprosedyren ifølge Tam et al., "J. Am. Chem. Soc", 105, 6442-6455 (1983) og sulfittolyse av de resulterende reduserte produkter, ga den S-sulfonerte kjedeanalog XX.

Oppfinnelsen skal illustreres ytterligere ved de følgende spesifikke eksempler.

Eksempel 1

Syntese av saue- fTrpl-4— Al- insulin

A. Syntese av A- kjede

Boc- Gln- Leu- OMe ( I)

Til en oppløsning av E• Leu• OMe ble det satt 11,3 g HC1 i 50 ml DMF sammen med 9,1 ml TEA fulgt av 17,6 g Boc-Gln'0Np. Efter 24 timer ble blandingen filtrert og filtratet konsentrert til et lite volum under redusert trykk og så fortynnet med 500 ml AcOEt og 100 ml vann. Det organiske sjikt ble vasket med IN NH4OH, vann, 0.5N HC1 og vann, tørket og konsentrert til tørr tilstand. Resten ble stiv ved triturering med eter-petroleter og ble omkrystallisert fra etylacetat:eter: Vekt: 13,7 g (76,6*);

Smeltepunkt: 126°C;

[a]§<5>= -35,3° (c 1, metanol);

Analyse for C^H<s>iN<g>Ofc:

Beregnet: C 54,7; H 8,37; N 11,3

Funnet: C 55,0; H 8,26; N 11,3

Z( OMe)- Trp( Mts)- Gln- Leu- QMe ( II)

En oppløsning av forbindelse I (3,73 g) i TFA - anisol (8 ml - 2 ml) ble lagret ved romtemperatur i VA - time og konsentrert til tørr tilstand under redusert trykk. Resten ble triturert med eter:petroleter 1:2 på volumbasis og tørket over KOH i vakuum. En oppløsning av dette materialet i 20 ml DMF inneholdende 2,8 ml TEA ble avkjølt til 0°C og satt til 6,21 g av azidet fremstilt fra Z(OMe)-Trp-(Mts)-NHNE2i henhold til Fujii et al. supra, fulgt av metoden ifølge Ogawa et al. supra. De følgende reagenser ble benyttet i denne reaksjon: DMF (20 ml), 6,3N HC1 i DMF (3,5 ml), tert-butylnitrat (1,5 ml) og TEA (3,1 ml). Efter 40 timer ved 4°C ble blandingen fortynnet med 600 ml AcOEt og 100 ml mettet NaCl. Det organiske sjikt ble vasket med

10 #-ig sitronsyre og mettet NaCl, tørket og konsentrert til tørr tilstand. Efter triturering med eter størknet resten og den ble så krystallisert fra etanol: Vekt: 3,6 g (45*);

Smeltepunkt: 171-173°C;

[a]g<5>= 41,4° (c 1, DMF);

Analyse for C^B^^O-loS :

Beregnet: C 61,1; E6,4; N8,7

Funnet: C 61,0; H6,5; N8,5

Boc- Leu- Trp( Mts)- Gln- Leu- OMe ( III )

En oppløsning av forbindelse II (2,0 g) i en blanding av TFA - anisol - EDT (10 ml - 1 ml - 0,3 ml) ble lagret ved 0°C i 30 minutter og ved romtemperatur i 30 minutter og så bearbeidet som beskrevet i syntesen av forbindelse II. 1,7 g Boc-Leu'0Np ble satt til en oppløsning av det resulterende Na<->avbeskyttede peptidsalt i 35 ml DMF inne holdende 0,6 ml TEA, avkjølt til 0°C. Efter 24 timer ved romtemperatur ble blandingen fortynnet med 600 ml AcOEt, vasket suksessivt med IN NH4OE, mettet NaCl, 0,5N HC1 og mettet NaCl, tørket og konsentrert til et lite volum. Det precipiterte produkt ble samlet og omkrystallisert fra AcOEt: Vekt: 1,51 g (71*);

Smeltepunkt: 188-190°C;

[a]<g5>= -20,6°(c 1, DMF);

Analyse for C^^ E( 32^ d°10S:

Beregnet: C 60,4; E 7,3; N 9,8

Funnet: C 60,1 E 7,5; N 9,8.

Aminosyreanalyse efter 4M MSA-hydrolyse ga forholdet: Glul,0LeU2,0T<rp>0,8'

Boc- Ser( Bzl)- Leu- Trp( Mts)- Gln- Leu- OMe ( IV)

Deblokkering av forbindelse III (4,46 g) med TFA - anisol

- EDT (15 ml - 1,2 ml- 0,8 ml) og isolasjon av det resulterende Na<->debeskyttede peptidsalt ble gjennomført som beskrevet ved syntesen av forbindelse III. 2,07 g Boc-Ser(Bzl)'0E ble ved 0°C satt til en oppløsning av dette materialet i 60 ml DMF inneholdende 1,1 ml TEA, fulgt av tilsetning av 1,65 g N,N'-dicykloheksylkarbodiimid og 1,08 g 1-hydroksybenzotriazol. Efter 24 timer ved romtemperatur ble urea-biproduktet filtrert av og filtratet fortynnet med 600 ml AcOEt og mettet med 100 ml NaCl. Det organiske sjikt ble vasket som vanlig, tørket og konsentrert til et lite volum. Det precipiterte produkt ble samlet og reprecipitert fra etylacetat:eter: Vekt: 4,58 g (85*);

Smeltepunkt: 187-188°C;

[a]<g5>= -21,6°(c 1, DMF);

Analyse for C53<H>73<N>7O12S<:>

Beregnet: C 61,7; H7,l; N9,5

Funnet: C 61,4; H7.2; N9.3

Aminosyreanalyse efter 4M MSA-hydrolyse ga forholdet: Serl,0G1VoLeU2,0<Trp>O,7-Boc- Ser( Bzl)- Leu- Trp( Mts)- Gln- Leu- NHNHo ( V)

En oppløsning av forbindelse IV (4,2 g) i en blanding av 35 ml DMF og 10 ml etanol inneholdende 1,0 hydrazinhydrat ble lagret ved romtemperatur i 24 timer og så fortynnet med 200 ml 50 *-ig vandig etanol. Det precipiterte produkt ble samlet opp og reprecipitert fra metanol:vann: Vekt: 4,0 g (94*);

Smeltepunkt: 203-205°C;

[a]<g5>= -6,1°(cl, DMSO);

Analyse for C52<H>73<N>9O-QS:

Beregnet: C 60,5; H 7,1; N 12,2

Funnet: C 60,9; H7.4; N 12,0

Et 4M MSA-hydrolysat ga forholdet: SerO,9G1Ul,0LeU2,0T<r>Po,7'

Boc- Tvr( Bzl)- Cvs( PMB)- Asn- OBzl ( VI)

En oppløsning av 7,39 g Boc-Cys-(PMB)-Asn*OBzl fremstilt i henhold til Ohta et al., "J. Protein Chem.", 7, 55-65

(1988) i TFA i anisol (15 ml - 3 ml) ble lagret ved 0°C i 30 minutter og ved romtemperatur i V6. time og så konsentrert under redusert trykk. Resten ble triturert med eter:petroleter 1:1 på volumbasis og tørket KOH i vakuum. 7 g Boc-Tyr (Bzl) • ONp ble satt til en oppløsning av dette materialet i 60 ml DMF inneholdende 2,3 ml TEA og avkjølt til 0°C. Efter 24 timer ved romtemperatur ble blandingen fortynnet med 600 ml AcOEt og 100 ml IN NH40H. Den organiske fase ble vasket (IN NH4OH, 0.5N EC1 og vann), tørket og konsentrert til et lite volum. Det precipiterte produkt ble samlet og omkrystallisert fra AcOEt: Vekt: 8,7 g (84*);

Smeltepunkt: 174-175°C;

[a]g<5>= -18,6° (c 1, DMF);

Analyse for C43<H>5Q<N>4O9S:

Beregnet: C 64,6; H 6,30; N7,0

Funnet: C 64,0; H 6,35; N7,0

Boc- Asn- Tvr( Bzl )- Cvs( PMB)- Asn- QBzl ( VII)

8,2 g av forbindelse VI ble deblokkert med TFA - anisol (22 ml - 2,2 ml) som beskrevet ovenfor. Triturering av resten med eter forårsaket precipitering av det Na-debeskyttede peptidsalt som ble filtrert av og tørket over KOE under vakuum. 3,9 g Boc-Asn-ONp ble satt til en oppløsning av dette produkt i 50 ml DMF inneholdende 1,8 ml TEA og avkjølt til 0°C. Efter 24 timer ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen fortynnet med 200 ml metanol og det precipiterte produkt ble filtrert av, vasket (IN NE4OH, 0,5N EC1 og vann), tørket og reprecipitert fra DMF:metanol: Vekt: 6 g (64*);

Smeltepunkt: 237-238°C;

[a]g<5>= -37,4° (c 1, DMF);

Analyse for C47E56N5011S:

Beregnet: C 61,8; H 6,18; N 9,2

Funnet: C 61,6; H 6,30; N9,l

Boc- Glu( 0Bzl)- Asn- Tyr( Bzl)- Cvs( PMB)- Asn- OBzl ( VIII)

Deblokkering av 5,5 g forbindelse VII og isolering av det Na<->debeskyttede peptidsalt ble gjennomført som beskrevet ved syntese av forbindelse VII. 3,3 g Boc-Glu-(OBzl) •ONp (fremstilt i henhold til Sandrin et al., "Eelv. Chim. Acta", 46: 1637-1669 (1963)) ble satt til en oppløsning av dette produkt i 50 ml DMF inneholdende 0,85 ml TEA ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble behandlet som ved syntese av forbindelse VII: Vekt: 5,6 g (81*);

Smeltepunkt: 206-207°C;

[a]<g5>= -41,4°(c 1, DMF);

Analyse for C5g<H>^g<N>7<0>14S<:>

Beregnet: C 62,6; H 6,14; N8,7

Funnet: C 62,3; H 5,94; N8,5

Aminosyreforhold i et 6N HCl-hydrolysat: Asp.^ gGlui oTyrl 0' Cvs(pMB) ble ikke bestemt.

Boc- Ser ( Bzl )- Leu- Trp( Mts )- Gln- Leu- Glu( OBzl )- Asn- Tvr( Bzl )-Cvs( PMB)- Asn- OBzl ( IX

Deblokkeringen av 2,3 g forbindelse VIII og isolasjon av det Na<->debeskyttede peptidsalt ble gjennomført som beskrevet ved syntese av forbindelse VII. 2,98 g av azidet, fremstilt fra forbindelse V (i henhold til Ogawa et al., supra) ble satt til en oppløsning av dette produkt i 35 ml DMF inneholdende 0,42 ml TEA og avkjølt til 0°C. Reagensene som ble benyttet for denne reaksjon var som følger: DMF (20 ml), 6,3N HC1 i DMF (0,92 ml), tert-butylnitritt (0,42 ml) og TEA (0,98 ml). Efter 48 timer ved 4°C ble reaksj onsblandingen fortynnet med 20 ml AcOEt og 100 ml 5 *-ig sitronsyre og det precipiterte produkt ble filtrert av, vasket med vann og metanol og reprecipitert fra DMF:metanol: Vekt: 1,55 g (38*);

Smeltepunkt: 245-246°C;

[a]g515,7°(c 1, DMSO);

Analyse for C106E131<N>14°23<S>2'2H2°:

Beregnet: C 61,5; H6,6; N 9,5

Funnet: C 61,4; H6,5; N9,7

Aminosyreforhold i et 6N HCl-hydrolysat:

Å<SP>2,0Ser0,9G1U2,lLeu2,lTyrl,0-

Trp og Cys(PMB) ble ikke bestemt.

Boc- Glv- Val- Cvs( PMB )- Ser( Bzl )- Leu- Trp( Mts)- Gln- Leu-Glu( 0Bzl)- Asn- Tvr( Bzl)- Cvs( PMB)- Asn• OBzl ( X)

En oppløsning av 0,95 g forbindelse IX i TFA - anisol-EDT (5 ml - 0,11 ml - 0,08 ml) ble lagret ved 0°C i 30 minutter og ved romtemperatur i 1,5 timer. Overskytende TFA ble fjernet ved fordamping under redusert trykk og resten triturert med eter. Det dannede precipitat ble filtrert av og tørket over KOH under vakuum. 0,82 g av azidet, fremstilt fra Boc-Gly-Val-Cys(PMB)-NHNH2i henhold til Ogawa et al., supra, ble satt til en oppløsning av dette produkt i 25 ml DMF inneholdende 0,09 ml TEA. Reagensens som ble benyttet for denne reaksjon var som følger: DMF (10 ml), 6,3N HC1 i DMF (0,51 ml), tert-butylnitritt (0,24 ml) og TEA (0,49 ml). Efter 48 timer ved 4°C ble reaksj onsblandingen fortynnet med 20 ml AcOEt og 60 ml 5 *-ig sitronsyre og det precipiterte produkt ble samlet og reprecipitert fra DMF:metanol: Vekt: 0,93 g (82*);

Smeltepunkt: 267-268°C;

[a]<g5>= -17,4°(c 1, DMSO);

Analyse for Ci24Ei56N17°27s3* '•

Beregnet: C 60,4; H6,6; N9,7

Funnet: C 60,3; H6,4; N 9,9

Aminosyreforhold i et 6N HCl-hydrolysat: ÅSPl, 9Ser0 , 9G1U2 , 0^1 , 0Vall, 0LeU2 , 1^0 , 9 ■

Trp og Cys(PMB) ble ikke bestemt.

Boc- Gln- Cys( PMB )- Cys( PMB )- Ala- Glv- Val- Cys( PMB)- Ser( Bzl )-Leu- Trp( Mts )- Gln- Leu- Glu( OBzl)- Asn- Tvr( Bzl)- Cvs( PMB)-Asn- OBzl ( XI)

Deblokkeringen av 0,82 g av forbindelse X med TFA - anisol

- EDT (5 ml - 0,5 ml - 0,1 ml) og isolasjon av det Na-debeskyttede peptidsalt ble gjennomført som beskrevet ovenfor. 1,06 g av azidet, fremstilt fra Boc-Gln-Cys(PMB)-Cys(PMBj-Ala-NHNHg i henhold til Ogawa et al., supra, ble satt til en oppløsning av dette produkt i 40 ml DMF inneholdende 0,1 ml TEA. Reagensene som ble benyttet for denne reaksjon var som følger: DMF (20 ml), 6,3N EC1 i DMF (0,43 ml), tert-butylnitritt (0,21 ml) og TEA (0,42 ml). Efter 48 timer ved 4"C ble reaksjonsblandingen fortynnet med 200 ml etanol og det precipiterte heptadecapeptid-derivat ble samlet og reprecipitert fra DMF:metanol: Vekt: 0,85 g;

Smeltepunkt: >270°C;

[oc]g<5>21,4° (c 1, DMS0);

Aminosyreforhold i et 6N HCl-hydrolysat var som følger: Asp2 , 0Ser0 , 9G1U3 , l6^!, 0Alal, 2Val0 , 9LeUl, 9^0 ,7 ' Trp og Cys(PMB) ble ikke bestemt.

Z- Glv- Ile- Val- Glu( OBu^)- Gln- Cvs( PMB)- Cvs( PMB)- Ala- Glv- Val-Cvs ( PMB)- Ser( Bzl )- Leu- Trp( Mts)- Gln- Leu- Glu( OBzl)- Asn-Tvr( Bzl)- Cvs( PMB)- Asn- OBzl ( XII)

Deblokkeringen av 0,6 g av forbindelse XI med TFA - anisol

- EDT (6 ml - 0,6 ml - 0,1 ml) og isolasjonen av det resulterende produkt ble gjennomført som beskrevet ovenfor. 0,49 g av azidet fremstilt fra Z-Gly-Ile-Val-Glu(0Bu<t>)-NHNH2(fremstilt i henhold til Katsoyannis et al., "J. Am. Chem. Soc", 88:5622-5625 (1966) ble satt til en oppløsning av dette materialet i 40 ml DMF inneholdende 0,06 ml TEA. Reagensene som ble benyttet for denne reaksjon var som følger: DMF (20 ml), 6.3N HC1 i DMF

(0,25 ml), tert-butylnitritt (0,11 ml) og TEA (0,3 ml). Efter 48 timer ved 4°C ble reaksjonsblandingen fortynnet med 200 ml metanol og det utfelte beskyttede heneicosapeptid ble samlet og reprecipitert fra DMF:metanol: Vekt: 0,53 g (76*);

Smeltepunkt: >270°C;

Aminosyreanalyse efter 6N HC1-hydrolyse ga følgende molforhold: Asp2 , 0Ser0 , 9G1U4 , 0G1y2 , lAlal, 0Vall, 5Ile0 , 6LeUl ,8^0 ,7 ' Trp og Cys(PMB) ble ikke bestemt.

B. Syntese av S- sulfonert [ Trp14]- A- kjede ( XX)

200 mg av det beskyttede heneicosapeptid XII ble behandlet med 4,3 ml IM trifluormetansulfonsyre i TFA inneholdende 0,66 ml tioanisol, 0,59 ml m-kresol og 0,47 ml EDT ved 0"C i 2 timer. Denne oppløsning ble så avkjølt til —10°C og 25 ml 8M guanidinhydroklorid inneholdende 5 ml konsentrert NH4OH ble tilsatt dråpevis og under heftig omrøring. Under denne prosess ble blandingens temperatur holdt under 5°C. Den resulterende blanding med pH-verdi ca. 5, ble ekstrahert med 3 x 50 ml eter og til det vandig sjikt, justert til pH lik 8,9 med NH40H, ble det satt 1,2 g natriumsulfitt og 0,6 g natriumtetrationat. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3V£ time, derefter anbragt i et Spectrapor-membranrør nr. 3 og dialysert mot fire endringer av destillert vann på 4 1 hver ved 4°C i 24 timer. Lyofilisering av dialysatet ga den urene S-sulfonerte kjedeanalog som ble oppløst i 6 ml 0,015M NE4HCO3og kromatografert på en Sephadex G-15-kolonne på 4,2 cm x 45 cm, ekvilibrert og eluert med 0,015M NH4HCO3. Avløpet tilsvarende hovedtoppen, overvåket med et ISCO-spektrofotometer, ble lyofilisert og saueinsulin [Trp<14>]-A-kjede-S-sulfonatet ble oppnådd som et hvitt pulver i en mengde av 130,5 mg. For rensing av dette materialet ble 71,3 mg oppløst i 0,1M Tris-HCl-buf f er (pH 7,0; 3 ml) og påført på en Cellex-E-kolonne (1,2 cm x 43 cm) som var

ekvilibrert med den samme buffer. Eluering av kolonnen ble gjennomført med Tris-HCl-buffer (pH 7,0) og en lineær NaCl-gradient som beskrevet tidligere av Chu et al, "Biochemistry", 26, 6966-6971 (1987). Det kromatografiske mønster, overvåket med et ISCO-spektrofotometer og et konduktivitetsmeter (Radiometer, København), er vist i figur 1. Avløpet tilsvarende hovedtoppen på 230-360 ml ble samlet, dialysert som ovenfor og lyofilisert og ga 35,4 mg.

Aminosyreanalyse av den syntetiske kjedeanalog ble gjennomført i to syrehydrolysater, et ved bruk av 6N EC1 og et annet ved bruk av 4M MSA (for Trp-bestemmelse) som i metoden ifølge Simpson et al., "J. Biol. Chem.", 251. 1936-1940 (1976). Aminosyresammensetningen, uttrykt i molare forhold, var i overensstemmelse med de teoretisk ventede verdier. Fermentering av den syntetiske kjedeanalog med aminopeptidase M og aminosyreanalyse av fermentet ga de ventede molare forhold. Det syntetiske materialet ble helt fermentert av enzymet, noe som indikerer at den stereokjemiske renhet for bestanddels-aminosyrene ble bevart under de syntetiske prosesser.

C. Syntese og isolering av saue-[ Trp14- A]- insulin Syntesen av saue-[Trp<14->A]-insulin ble gjennomført ved interaksjon av den S-sulfonerte [Trp<14>]-saue-A-kjede (XX) med den S-sulfonerte saue (som er den samme som kveg) B-kjede i nærvær av ditiotreitol fulgt av metoden til Chance et al., supra. En oppløsning av 10 mg saue-B-kj ede-S-sulfonat (fremstilt som beskrevet av Katsoyannis et al., "Biochemistry", 6, 2635-2642 (1967)), 20 mg [Trp<14>]-A-kjede-S-sulfonat og 6,83 mg ditiotreitol i 0,1M glycin-buffer (pE 10,5, 6 ml) ble omrørt ved 4°C i 24 timer og så bearbeidet som beskrevet tidligere av Katsoyannis et al., "Biochemistry, 6, 2656-2668 (1967). Isolasjon og rensing av insulinanalogen fra kombinasjonsblandingen ble gjennomført ved kromatografi på en CM-cellulosekolonne

(0,9 cm x 24 cm) med en acetatbuffer (Na<+>, 0.024M, pH 3,3) og en eksponensiell NaCl-gradient som beskrevet av Katsoyannis et al., supra. Det oppnådde elueringsmønster, overvåket med et ISCO-spektrofotometer og et konduktivitetsmeter (Radiometer, København), vist i figur 2A. 1,3 mg [Trp<14->A]-insulin ble isolert fra avløpet (145-175 ml) via pikrat som hydrokloridet i henhold til Katsoyannis et al., supra. Sluttrensing av dette materialet ble gjennom-ført ved reversfase-HPLC på en Vydac® 218 TP-kolonne (0,45 cm x 25 cm) forbundet med et LKB-væskekromatografi-system. Kromatografien ble gjennomført ved en strømnings-hastighet på 0,5 ml/minutt med en 10-50* lineær gradient av 2-propanol i 0,1* TFA i løpet av 60 minutter (figur 2B). Lyofilisering av avløpet under hovedtoppen ga saue-[Trp<14->A]-insulin i sterkt renset form.

Aminosyreanalyse av det syntetiske materialet ga efter 6N HCl-hydrolyse en sammensetning som, uttrykt i molare forhold, er i god overensstemmelse med de teoretisk ventede verdier.

Eksempel 2

Analyse av [ Trp14- A]- insulinpotens og bindingsegenskaper.

I dette eksempel er de materialer som ble benyttet i analytiske prosedyrer de som er funnet i Kitagawa et al., "Biochemistry", 23: 1405-1413 (1984).<125->I-insulin for reseptorbindingsstudier og [3-<3>H]-glukose for lipogenese ble oppnådd fra DuPont NEN Research Products. Celluloseacetat-membranfilteret, porestørrelse 0,2 um, var Sartorius-produkter. Glassfiberfiltere av typen GFC var fra Whatman. Collagenase, type II crude, ble oppnådd fra Worthington. Scintillasjonsfluidene Filtron-X®, Hydrofluor® og Soluscint-0®, var produkter fra National Diagnostics. Krystallinsk kveginsulin var fra Sigma og fettsyrefritt kvegserumalbumin fra Boehringer - Mannheim Biochemicals.

A. Insulinreseptorbindingsanalyse

Evnen til [Trp<14->A]-Insulin til å inhibere den spesifikke binding av<12>^I-insulin til insulinreseptorer ble undersøkt i en fraksjon av rottelever, anriket på plasmamembraner, isolerte rotteadipocytter og isolerte rottehepatocytter. De første to prosedyrer skjedde i henhold til Burke et al., "Biochemistry", 19: 4547:4556

(1980).

Kort sagt inneholdt triplikat 0,2 ml inkuberinger<125>I-insulin, 3 x lO"10]^, ikke-merket insulin eller [Trp<14->A]-insulin fremstilt som i eksempel 1 og plasmamembraner (20-40 ug protein) i 0,1M natriumfosfat, pH 7,4, inneholdende

0,6* fraksjon V kvegserumalbumin. Efter inkubering i 45 minutter ved 24"C ble blandingene fortynnet med 2,0 ml iskold 0,1M natriumfosfat, pH 7,4, inneholdende 0,1* fraksjon V kvegserumalbumin og umiddelbart filtrert gjennom celluloseacetatfiltere. Filtrene ble vasket to ganger med iskold buffer, tørket og derefter ble radioaktiviteten tellet i en scintillasjonsteller ved bruk av Filtron-X®. Den relative potens ble oppnådd som det konsentrasjonsforhold mellom ikke-merket insulin og [Trp<14->A]-insulin som var nødvendig for å inhibere 50* av den spesifikke binding av<125>I-insulin til reseptor-preparatet. I denne analyse viste [Trp<14->A]-insulin en potens på ca. 60* av den til det naturlige hormon.

B. Lipogeneseanalyse

Disse analyser målte evnen for insulinanalogen, sammenlignet med kveginsulin, til å konvertere [3-<3>H]-glukose til lipider.

Adipocytter ble fremstilt ved inkubering av epididymale og perirenale fettputer, oppnådd fra hannrotter med kroppsvekt 200-300 g med 1,0 mg/ml collagenase i 60 minutter ved 37° C, fulgt av filtrering gjennom gassbind og så gjennom finmasket silke. Cellene ble vasket to ganger ved flottering i en klinisk sentrifuge før suspensjon for bruk. Inkuberingsmediet var Krebs-ringer-bikarbonat Inneholdende halvparten av det anbefalte kalsium, 0,5 mM glukose og 3* fettsyrefri kvegserumalbumin med 95* C>2 - 5* CO2som gassfase. Triplikatlipogenese-inkuberinger inneholdt 1,0 ml adipocyttsuspensjon (20-40 mg tørrvekt-celler) og kveginsulin eller [Trp<14->A]-insulin, fremstilt som i eksempel 1. Cellene ble preinkubert i 45 minutter ved 37°C før tilsetning av [3-<3>H]-glukose. Inkuberingen ble fortsatt i 60 minutter og stanset ved tilsetning av 0,2 ml 5N E2SO4og 0,2 ml maisolje for å understøtte ekstraheringen av lipider. Prøver ble ekstrahert med 10 ml Soluscint-0® og 30 minutter ved romtemperatur før telling av radioaktiviteten i en scintillasjonsteller. Under disse betingelser ble [3-<3>H]-glukose ikke ekstrahert inn i den organiske fase inneholdende scintillasjonsfluor og var i det vesentlige ikke tellet. 0 og 100* stimulering av lipogenesen var definert som radioaktivitet observert i fravær henholdsvis nærvær av 9,1 x 10~<10>M insulin (5,5 ng/ml). Den relative potens ble oppnådd som det konsentrasjonsforhold mellom insulin og [Trp<14->A]-insulin som var nødvendig for å fremstille 50* av den maksimale stimulering av lipogenese.

Figur 3 viser stimuleringen av [3-<3>H]-glukose i organisk ekstraherbart materiale (det vil si lipider) i isolerte rotteadipocytter med [Trp<14->A]-insulin (=A=) som fremstilt i eksempel 1 og kveginsulin (-0-). Stimuleringen, uttrykt som prosent av maksimum, ble plottet som en funksjon av agonistkonsentrasjonen. Datapunktene representerer de midlere triplikatbestemmelser i representative analyser gjennomført fire ganger.

For begge insuliner ble den samme maksimale stimulering av lipogenese observert og halvmaksimal stimulering ble tilveiebragt ved ca. to ganger konsentrasjonen av agonisten. Potensen av det syntetiske insulin i lipogenese

(ca. 60* sammenlignet med det naturlige hormon) reflek-serte således dens oppførsel i reseptorbindingsanalyser ved bruk av adipocytter.

C. Analyse på inhibering av glukoneogenese

Denne analyse ble gjennomført på konfluente monosjikt av en godt differensiert hepatoma cellelinje (Lauris et al., "Endocrinology", 118: 2519-2524 (1986)) hvori glukoseproduksjonen ble overvåket med et kommersielt glukose-oksydasesett (Sigma kit no. 510-A, Sigma Technical Bulletin 510, 1983). Inhibering av glukosesekresjon til mediet ble bestemt som en funksjon av konsentrasjonen av insulin eller insulinanalog og den relative potens av analogen ble definert som det forhold mellom konsentrasjonen av insulin og analog som var nødvendig for å gi halvmaksimal inhibering av glukoseproduksjonen. Celle-kulturen og glukoseproduksjonen ble gjennomført som beskrevet av Lauris et al., supra.

Figur 4 viser inhiberingen av glukoneogenese i FAO-celler, uttrykt som prosent av maksimum, og er vist som en funksjon av insulin- (-o-) og [Trp<14->A]-insulin- (=A=) konsentrasjonen. For begge insuliner ble de samme maksimale inhiberinger av glukoneogenese observert og halvmaksimal inhibering ble tilveiebragt ved omtrent den samme konsentrasjon av agonist. Potensene for det syntetiske insulin med henblikk på inhibering av glukoneogenese er beregnet til å være ca. 90* relativt det naturlige hormon.

D. Undersøkelser på relativ potens

Insulinanaloger med substituerte aminosyrer ble fremstilt ved å syntetisere de S-sulfonerte formene av A- og B-kjeden. Den sulfonerte A-kjede ble syntetisert ved bruk av en velkjent teknikk ved fastfase-peptid-syntese (se for eksempel Erickson og Merryfield i "The Proteins", 1976, vol. 2, kapittel 1, Academic Press, New York; samt Barany and Marryfield i "The Peptides", 1988, Vol. 2, kapittel 3, Academic Press, New York). De sulfonerte former av A- og B-kjeden hie kombinert og insulinanalogen isolert i henhold til den metode som er beskrevet i beskrivelsen.

De oppnådde insulin-analoger ble prøvet på deres hepatiske potens og lipogene potens i henhold til de metoder som er beskrevet i beskrivelsens eksempel 2(A) og (B).

Resultatene av disse prøver er oppsummert i tabell 1.

Claims (5)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av en insulinanalog med en a-kjede omfattende aminosyrene Al til og med A21 og en B-kjede omfattende aminosyrene Bl til og med B30 , der A14-aminosyren er erstattet med en aminosyre valgt blant gruppen omfattende tryptofan, valin og naftylalanin,karakterisert vedat peptidet fremstilles ved fastfasesyntese hvor hver aminosyrerest, beskyttet med et en egnet beskyttelsesgruppe som selektivt kan fjernes, adderes sekvensielt til en voksende polypeptid-kjede under betingelse for dannelse av peptidbindinger mellom suksessivt ti Uførte aminosyrer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 der Al4-aminosyren erstattes med tryptofan,karakterisert vedat man går ut fra de tilsvarende utgangsmaterialer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 der A14-aminosyrene erstattes med valin,karakterisert vedat man går ut fra de tilsvarende utgangsmaterialer.

4 . Fremgangsmåte ifølge krav 1 der A14-posisjonen erstattes med naftylalanin,karakterisert vedat man går ut fra de tilsvarende utgangsmaterialer.

5 . Fremgangsmåte for fremstilling av en insulinanalog med en A-kjede omfattende aminosyrene Al til og med A21 og en B-kjede omfattende aminosyren Bl til og med B30 ved bruk av kjemisk syntese der aminosyrene i A13-posisjon, A14-posisjon eller kombinasjoner derav, erstattes med tryptofan,karakterisert vedat man går ut fra de tilsvarende utgangsmaterialer.