HU208341B - Process for increasing the synthesis productivity of cell cultures of microorganisms and higher plants - Google Patents

Process for increasing the synthesis productivity of cell cultures of microorganisms and higher plants Download PDF

Info

Publication number
HU208341B
HU208341B HU89975A HU97589A HU208341B HU 208341 B HU208341 B HU 208341B HU 89975 A HU89975 A HU 89975A HU 97589 A HU97589 A HU 97589A HU 208341 B HU208341 B HU 208341B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
microorganisms
atcc
inactivated
bacteria
fragments
Prior art date
Application number
HU89975A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT57270A (en
Inventor
Franz Fiedler
Meinhart H Zenk
Heidrun Gundlach
Alfred Weber
Mario Kennecke
Original Assignee
Schering Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Schering Ag filed Critical Schering Ag
Publication of HUT57270A publication Critical patent/HUT57270A/hu
Publication of HU208341B publication Critical patent/HU208341B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Fertilizers (AREA)

Description

A találmány tárgya mikroorganizmusok és magasabbrendű növények sejttenyészetei szintézisteljesítményének a fokozására alkalmas eljárásra vonatkozik.
Az eljárásra az jellemző, hogy az organizmusokat inaktivált elicitortartalmú mikroorganizmusokkal, ezek töredékeivel vagy elicitortartalmú mikroorganizmusok exkrécióival érintkeztetjük, azzal a feltétellel, hogy a magasabbrendű növény-sejttenyészetek enzimaktivitásának és szintézisteljesítményének a fokozására az inaktivált elicitortartalmú baktériumokat, ezek töredékeit vagy elicitortartalmú baktériumok kivonatait alkalmazzuk.
Az elicitorok, mint ismeretes, olyan mikrobiális vagy növényi hatóanyagok, amelyek ha magasabbrendű növények szöveteivel kerülnek érintkezésbe, azok enzimaktivitását és szintézisteljesítményét fokozzák. Ezekben a növényekben ily módon felhalmozódott beltartalmi anyagokat, ha azok antimikrobiálisak, fitoalexinoknak nevezik (Naturwissenschaften 68, 1981,447; Av. Enzymol. 55, 1983, 1 és Spektrum dér Wissenschaft 11, 1985, 85).
Az Insect. Biochem. 16 (3), 539—45 (1986) cikke selyemhernyó-plazma enzimjeinek aktiválását ismerteti elicitorokkal. Ugyanakkor Fett és munkatársai neminaktivált mikroorganizmusok elicitorhatását írják le, lásdC. A. 99, 36088t (1983).
Jelenleg 100-nál több olyan vegyületet választottak már ki különböző növényfajtákból, amelyek megfelelnek a fitoalexin elnevezésnek. Ezeket különböző természetes anyagcsoportokhoz soroljuk. Ilyenek a terpenoidok, linolénsav-származékok, acetilének és poliacetilének, dibenzilek, sztilbének, fenantrének és dihidrofenantrének, benzofuránok és fenol-benzofuránok, furokumarinok, avenaluminok, fiavonok, fenil-benzofuránok, benzoxazinok, alkaloidok, izoflavonoidok (Brooks and Watson, Nat. Prod. Report 2, 1985,427).
Ez az elicitorhatás mind ez ideig nem került technikai alkalmazásra. Ennek több oka van: néhány kivételtől eltekintve eddig nem volt lehetséges magasabbrendű növények sejtjeinek a szaporítása alámerített (szubmerz) kultúrákban gazdaságos körülmények között. Elicitoroknak a fermentációnál a mikroorganizmusokkal együtt történő alkalmazása kezdettől fogva célszerűtlennek látszott, mivel az elicitorok hatásmechanizmusára vonatkozó uralkodó kitanítás szerint abból kellett kiindulni, hogy ezek az enzimaktivitást és az anyagcserefolyamatokat a mikroorganizmusokban nem befolyásolják (Albersheim P. und Darvill A. G. Spektrum dér Wissenschaft, 11, 1985, 85).
Figyelemre méltó az is, hogy az érvényes kitanítás szerint a baktériumok csak akkor tudnak kiváltani fitoalexinképződést növényeknél, ha azok, így például az erwinia fajták képviselői, meghatározott enzimek (pektinázok) segítségével növényi sejtfalból elicitorokat (oligogalakturonidokat) szabadítanak fel, amelyek elicitorokként a fitoalexinképződést stimulálják.
Munkánk során felismertük, hogy bizonyos vegyületek és mikroorganizmus-készítmények, amelyeket a következőkben elicitoroknak nevezünk, meglepő módon mégis fokozni képesek az enzimaktivitásokat és a szintézisteljesítményeket a mikroorganizmusokban.
Ezenkívül felismertük azt is, hogy léteznek olyan baktériumok, amelyek olyan elicitorokat tartalmaznak, amelyek nem enzimek vagy nutritív tényezők.
A találmány szerinti eljárás alapjában véve izolált vagy szintetizált elicitorokkal vitelezhető ki, ez azonban nagyon költséges. Elegendő, ha inaktivált elicitortartalmú mikroorganizmusokat alkalmazunk, vagy ezeknek a mikroorganizmusoknak a töredékeit, így például sejtfalfrakcióit, mechanikusan feltárt vagy kémiailag, illetve enzimesen lizinezett sejtek sejttöredékeit vagy segédanyagokat, így például etanollal vagy acetonnal kicsapott sejtbeltartalmi anyagokat használunk. Inaktivált mikroorganizmusok a találmány értelmében azok az anyagok, amelyek életképességüket tartósan elvesztik.
Abban az esetben, ha a mikroorganizmusok az elicitorokat a tenyészfolyadékban leadják vagy lizines kezelés vagy sterilizálás után vízoldható elicitortartalmú sejtbeltartalmi anyagokat képeznek, akkor a mikroorganizmusoknak ezeket az elicitor tartalmú kivonatait is felhasználjuk a találmány szerinti eljárás kivitelezésére. A mikroorganizmusok elicitortartalmú termékeinek minden formája alkalmas a találmány szerinti eljárás megvalósítására.
Azok a mikroorganizmusok, amelyekről ismert, hogy elicitorokkal rendelkeznek, többek között az 1. táblázatban felsorolt gombatörzsek és élesztők.
1. táblázat
Altemaria carthami Arch. Bioch. Biop. 229, 1984,136
Botrytis cinerea (ATCC 48 345) Physiol. Plánt Olathol. 77, 1977,287
Ceratocystís fimbriata Phylochemistry 23, 1984, 759
Ceratocystis ulmi Phytochemistry 23, 1984, 383
Chondrostereum purpureum J. Chem. Soc. Perkin Trans 1,1984,14 341
Cladosporium fulvum (ATCC 44 961) Physiol. Plánt Pathol, 16, 1980, 391
Colletotrichum lindemuthianum(ATCC 52 471) Eur. J. Biochem. 729, 1983, 593
Fusarium solani Plánt Physiol. 76, 1984.833
Fusarium solanifspmori (ATCC 44 934) Nat. Prod. Rep. 2, 1985,439
Ganoderma applanatum Phytochemistry 22, 1983, 1039
Glomerella cingulata Physiol. Plánt, Pathol. 27, 1982,171
Helminthsporium carbonum (ATCC 52 471) Z. Naturforsch. Sect. C 38, 1983, 899
Monilinia fructicola J. Am. Chem. Soc., 84, 1962,1919
Nectria haematococca Phytochemistry 22, 1983, 2291
Phoma exigua Phytochem. 27, 1982,1818
HU 208 341 Β
Phytophthora cannabivora Z. Naturf. Sec. C. 39, 1984, 217
Phytophthora caosici (ATCC 52 771) Physiol. Piát. Pathol. 18, 1981,379
Phytophthora infectans (ATCC 44 776) Phytochem. 23, 1984,537
Phytophthora megasperma var glycinea Arch. Bioch. Bioph. 229, 1984,136
Phytophthora infectans Phytoathol. 7, 27, 1956,237
Phytophthora megasperma J. Bioi. Chem. 259, 1984, 11 341
Phytophthora nicotiane Phytopathology 71, 1981, 864
Puccinia coronata Physiol. Plánt Pathol. 20, 1982,189
Pyricularia oryzae (ATCC 15 923) Agric. Ciol. Chem. 48, 1984,253
Saccharomyses cerevisiae Plánt Physiol. 62, 1978,107
Verticillium albo-atrum Nat. Prod. Rep. 2, 1985,429
Verticillium dahliae (ATCC 26 289) ATCC-Katalog. 16. Aufl. 1984
Saját kísérleteink során megvizsgáltuk Bacillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Cellulomonas, Lactobacillus, Pimelobacter, Rhodococcus és Staphylococcus nemzetségbe tartozó Gram-pozitív baktériumtörzsek tripszinnel fehérjebontás útján tisztított sejtfalkészítményeit, valamint az ilyen fajta hősterilizált mikroorganizmusokat és ezek szűrleteit arra nézve, hogy rendelkeznek-e elicitorokkal.
A következő 2. táblázatban megadjuk azokat a baktériumtörzseket, amelyekben elicitorok kimutathatók voltak.
2. táblázat
Bacillus licheniformis ATCC 9945
Bacillus pumilus ATCC 7061
Brevibacterium butanicum ATCC 21 196
Brevibacterium flavum ATCC 13 826, ATCC 14 067
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 655
Brevibacterium glutamingenes ATCC 13 747
Brevibacterium ammoniaganes ATCC 6872
Corynebacterium hydrocarboclastrum ATCC 15 592
Corynebacterium nephridii ATCC 11 425
Corynebacterium paurometabolum ATCC 8368
Corynebacterium lilium ATCC 15 990
Corynebacterium striatum ATCC 6940
Corynebacterium xerosis ATCC 373
Corynebacterium diphteroa (Törzs anyag. 9/Behring Werke)
Corynebacterium melassecola ATCC 17 965
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Corynebacterium uratoxidans ATCC 21 279 Lactobacillus casei subsp. rhamosus ATCC 7469 Lactobacillus plantarum DSM 20 174 Pimelobacter tumescens AJ 1460
Rhodococcus fascians ATCC 12 975
Rhodococcus fascians 1 - izolátum dr. Stolp prof.-tól, Egyetem Bayreuth
Rhodococcus fascians 2 - izolátum dr. Stolp prof.-tól, Egyetem Bayreuth.
A találmány keretében eddig a Gramp-pozitív eubaktériumok csak kevés fajtájának a baktériumtörzseit vizsgálták arra vonatkozóan, hogy rendelkeznek-e elicitorokkal. A gombatörzsek közül, ide számítva az élesztőket is, amennyire az előpublikációkból kivehető, többnyire csak olyanokat vizsgáltak elicitor-aktivitás jelenlétére vonatkozóan, amelyekről ismert, hogy fitopatogének. Ezért várható, hogy ezután még számos olyan mikroorganizmus található, így például a Mycobacterium, Nocardia, Nocardioid vagy a Pseudonocardia baktériumfajták, amelyek ugyancsak rendelkeznek elicitorokkal.
A mikroorganizmusok elicitor-aktivitásának a vizsgálatát problémamentesen végezhetjük a szokásos screening-kísérletekkel, amelyek ismertek a szakterületen.
így például kísérletsorozatokban azokat a mikroorganizmusokat, amelyeknek az enzimaktivitását vagy szintézisteljesítményét fokozni kívánjuk, alámentett (szubmerz) kultúrákban tenyésztjük, az egyes kultúrákhoz különböző fajta vagy alfajta inaktivált mikroorganizmusokat adunk hozzá és a fermentáció után analitikai úton meghatározzuk azt, hogy melyik kultúrákban ment végbe az enzimaktivitás vagy a szintézisteljesítmény növekedése. A mikroorganizmusok enzimaktivitásának a növekedését például arról ismerjük fel, hogy az alapanyagok fermentációs átalakulásánál az előállított termék képződésének a sebessége vagy a termékhozama megnő. Ennek megfelelően a mikroorganizmusok megnövekedett szintézisteljesítménye például a mikroorganizmusok beltartalmi anyagának a képződési sebességén és a kitermelés növekedésén látszik meg.
Ahogy az eddig végzett kísérletek mutatják, amelyeket a kiviteli példákban közelebbről is leírtunk, a találmány szerinti eljárás a mikroorganizmusok enzimaktivitásának vagy a szintézisteljesítményének a fokozására nagyon sokoldalúan látszik alkalmazhatónak. így a 2. táblázatban felsorolt mikroorganizmusok sejtfalkészítményeinek az adagolásával a Streptomyces lividans (Actinorhodin, Prodigiosin) színezékképződése, valamint a Streptomyces coelicolor, a Streptomyces griseoruber, a Streptomyces latericius, a Streptomyces purpurascens és a Streptomyces violaceus színképződése stimulálódik. Lehetővé válik továbbá a Streptomyces clavuligerus β-Iaktám-antibiotikumok képződésének és a Claviceps paspali alkaloidszintézisének a stimulál ása.
A mikroorganizmusok szintézisteljesítményének
HU 208 341 Β ilyenfajta fokozása nem csak a 2. táblázatban felsorolt baktériumok sejtfalkészítményének a segítségével érhető el, hanem várható az is, hogy elicitortartalmú gombákkal és élesztőkkel, amelyeket az 1. táblázatban adtunk meg, ugyancsak elérhetjük a mikroorganizmusok enzimaktivitásának és szintézisteljesítményének a fokozását.
A 2. táblázatban felsorolt mikroorganizmusok sejtfalkészítményeinek a segítségével az alkaloidképződés jelentős mértékű növekedését magasabbrendű növények, így az Eschscholtzia califomica vagy a Rauvolfia serpentina sejttenyészeteiben is elértük. Sikerült továbbá ezeknek a sejtfalkészítményeknek a segítségével a Bacillus lentus képességét fokozni olymértékben, hogy dehidrálja a szteroidokat az 1,2-helyzetben, és növelni a Rhodotorula glutinis képességét annyira, hogy szelektíven redukálja a 17-ketoszteroidokat, valamint olymértékben javítani a Penicillium raistrickii képességét, hogy hidroxilezze a szteroidokat a 15a-helyzetben. Mind ez ideig sikertelen maradt sajnos az a kísérlet, hogy ennek a sejtfalkészítménynek a segítségével annyira növeljük a Curvularia lunata azt a képességét, hogy fokozza szteroidok hidroxilezését a Ιΐβ-helyzetben.
Ezek a kísérletek feljogosítanak arra a reményre, hogy a találmány szerinti eljárás segítségével lehetőség nyílik arra, hogy stimuláljuk számos más iparszerűen használható mikrobiális beltartalmi anyag képződését is és elősegítsük olyan mikroorganizmusok enzimaktivitásának további fokozását, amelyek technikailag használhatók.
Ilyen mikrobiális beltartalmi anyagok például az antibiotikumok, így a penicillinek, cefalosporinok, ciklosporinok, aktinomicinek, gramicidinek, neomicinek, gentamicinek, nisztatinok, tetraciklinek, nikomicinek vagy a Iinkomicin, az eritromicin, a kloramfenikol, a griseofulvin vagy a fuzidinsav és mások; az anyarozsalkaloidok, így az ergokriptin, az ergotamin, az ergozin, az ergokrisztin, az ergokomin, az agroklavin, a kanoklavin, a fesztuklavin, a paszpalinsav vagy a lizergsav-származékok, a vitaminok, így a B12 vitamin, a riboflavin vagy a β-karotin, az enzimek, így az amilázok, a glukóz-izomerázok, a proteázok, a pektinázok, a cellulázok, a lipázok, a penicillin-acilázok, a kitinázok vagy a laktázok, a nukleozidok, így a guanilsav vagy az inozilsav vagy például az aminosavak is, így a tisztein, a glutaminsav, a triptofán vagy a lizin.
Alapjában véve lehetségesnek kellene lenni genetikusán megváltoztatott mikroorganizmusoknál az endogén vagy exogén proteinképződés fokozásának. Ilyen hasznosítható proteinek nem csupán a már említett enzimek és antibiotikumok, hanem például az interferon, inzulin, eritropotetin és a TNF (tumomekrózisfaktor).
Azok a mikroorganizmusok, amelyek enzimaktivitásuk miatt technikailag alkalmazásra kerülnek, például a következő irodalmakban vannak leírva:
W. Chamey and H. Herzog: Microbial Transformations of Steroids; Academic Press, New York etc. 1967; K. Kieslich: Microbial Transformations of Non-steroidal Cyclic Compounds; Georg Thieme Publ. Stuttgart (DE), 1976; és K. Kieslich: Biotransformations; in H. J. Rehm und G. Reed (kiadók): Biotechnology; Weinheim (DE) etc. Vol. 6a, 1984.
Ilyen mikroorganizmusok többek között azok, amelyek a szteroidtranszformációkat, így a 11α-, 11βvagy 15a-hidroxilezést, a A’-dehidrálást, a 17α, 17βketoredukciót, vagy a szterinek oldallánclebomlását vagy az antibiotikum-transzformációkat, így a penicillinhasadást okozzák.
Nem valószínűtlen, hogy a találmány szerinti eljárással sikerülne új, technikailag értékesíthető mikrobiális beltartalmi anyagokat, így például új antibiotikumokat találni, miközben a vizsgálandó mikroorganizmusokhoz inaktív elicitortartalmú mikroorganizmusokat adunk hozzá. Ez a remény azért nem megalapozatlan, mert ismeretes, hogy számos magasabbrendű növényfitoalexin csak akkor képződik említésreméltó mennyiségben, ha azokat elicitort tartalmazó mikroorganizmusokkal megfertőzzük.
Annak a meghatározását, hogy melyik elicitortartalmú mikroorganizmus fokozza valamely meghatározott mikroorganizmus szintézisteljesítményét, a szakember számára ismert hagyományos módszerekkel végezzük.
A találmány szerinti eljárás kivitelezése, amennyiben ez a mikroorganizmusokkal történő fermentációt illeti, a szakember számára nem okoz problémát. Azt a mikroorganizmust, amelynek szintézisteljesítményét növelni akarjuk, ismert körülmények között tenyésztjük, ezután a tenyészethez hozzáadjuk az inaktivált elicitortartalmú mikroorganizmusokat, ezek töredékeit, sejtkivonatait vagy ugyanezek exkrécióit és a fermentációt szokásos módon tovább folytatjuk. Az inaktivált mikroorganizmusokat, ezek töredékeit vagy ezeknek az organizmusoknak a kivonatait vagy elicitortartalmú mikroorganizmusok kivonatait már a fermentáció kezdetén bevihetjük a tenyészetbe. A legjobb hozzáadási idő természetszerűen függ a tenyésztendő mikroorganizmusok fajtájától, különösen azok exponenciális növekedési fázisától és egyes esetekben azt meg kell határozni. így például célszerűnek bizonyult, hogy ezt a hozzáadást 4-30 órával a fermentáció kezdete után végezzük. Inaktivált mikroorganizmusok vagy töredékeik hozzáadásánál egy köbméter fermentlére 11000 g, előnyösen 10-200 g, inaktivált mikroorganizmust vagy 0,1-100 g, előnyösen 1-30 g, mikroorganizmusok exkrécióit alkalmazzuk, akkor rendszerint elegendő, ha egy köbméter fermentlére 1-50 liter exkréció-oldatot használunk. Ha a találmány szerint olyan mikroorganizmus enzimaktivitását kívánjuk fokozni, amely valamely szubsztrát enzimes átalakítására szolgál, a szubsztrát hozzáadását rendszerint 0-10 órával az elicitortartalmú inaktivált mikroorganizmusnak vagy töredékeinek vagy kivonatának hozzáadása után végezzük.
A legjobb fermentációs körülmények az alkalmazott mikroorganizmus fajtájától, az alkalmazott tápközegtől, a fermentációs időtől, az elicitortartalmú anyag fajtájától és mennyiségétől, valamint hasonló ténye4
HU 208 341 Β zőktől függenek. A körülményeket egyes esetekben előkísérletekkel kell meghatározni, amelyek a szakember számára ismertek.
Az inaktív elicitortartalmú mikroorganizmusok előállítására ezeket a szokásos körülmények között tenyésztjük, utána centrifiigálással vagy szűréssel elválasztjuk a táptalajtól, kívánt esetben mossuk és mégegyszer elkülönítjük. A mikoorganizmusok inaktiválására különböző eljárásokat alkalmazhatunk.
Lehetséges inaktiváló módszer például, hogy ezeket a mikroorganizmusokat jellegzetes sejtmérgek, így etilénoxid, formaldehid, ózon, higanyvegyületek, szerves oldószerek, például metanol, etanol vagy aceton, hatásának tesszük ki, vagy 90-140 “C-on való melegítéssel, rendkívül nagy nyomáskülönbségek hatásával (dezintegrálás), nagyfrekvenciás elektromos mezők hatásával vagy UV-besugárzással, γ-sugarakkal történő besugárzással vagy ultrahanggal való kezelés útján elpusztítjuk a mikroorganizmusokat. Azok a körülmények, amelyek között az inaktiválást végezzük, a szakemberek által ismertek, de le vannak írva a következő irodalomban is: K. H. Wallháuser, H. Schmidt: Sterilisation, Desinfektion, Konservierung, Chemotherapie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (DE), 1967.
Elicitortartalmú mikroorganizmusok töredékeit például úgy kaphatjuk, hogy a mikroorganizmusokat lizin hatásának, továbbá ozmózisok sokk vagy hőmérsékletsokk hatásának tesszük ki, a mikroorganizmusokat autolizáljuk, a sejteket ultrahanggal kezeljük vagy a mikroorganizmusokat szétdörzsöljük üveggolyókkal, üvegporral vagy kvarchomokkal és utána szétválasztjuk centrifugálással. Ilyen módszerek vannak leírva a következő irodalomban: Hughes, D. E., Wimpenny, J. W. T. és Lloyd, D.: The disintegration of microorganisms. In: Methods in Microbiology, Vol. 113, (Norris, J. R. and Ribbons, D. W., eds.) pp. 1-54., Academic Press, New York, London, 1971).
Ezekből a sejttöredékekből például tripszines kezeléssel tisztított sejtfalfrakciókat állíthatunk elő. A már említett és az ezután következő kiviteli példákban említésre kerülő és alkalmazott sejtfalfrakciókat Schleifer és Kandler által leírt módszerrel állítjuk elő (Arch. Mikrobiol. 57, 1967,335-365.).
Másrészt lehetőség van arra is, hogy vízoldható sejtalkotórészekből kicsapással, például etanollal vagy acetonnal való kicsapás útján elicitortartalmú csapadékokat állítsunk elő (Kocourek, J. and Ballou, C. E., J. Bacteriol. 100, 1969, 1175-1181.). Kivonatuk exkrécióknak nevezzük elicitortartalmú mikroorganizmusuk által elválasztott, lizines kezelés, „leaky készítés”, extrahálás kritikus feletti cseppfolyósított gázokkal (például széndioxiddal) vagy sejteknek vízben történő hőstabilizálása útján kapott sejtalkotóanyagait, vízoldható anyagokat vagy az organizmusok szűrése vagy centrifugálása útján kapott tápfolyadékokat. Ezeket szükség szerint tovább tisztíthatjuk például liofil anyagok extrahálásával, erősen színező anyagok adszorbeálásával és hasonló módon.
Említettük már, hogy baktériumok enzimmentes elicitortartalmú anyagának az alkalmazása a teljesítmény fokozására magasabbrendű növények beltartalmi anyagainak a szintézisére kísérletileg bizonyítható. Ez esetleg jelentős lehet gyógyszerhatóanyagok előállítására szolgáló növényi sejttenyészetek alkalmazásánál (Μ. H. Zenk: Pharmazie heute, 103, 1982, Bánd 3, 131-138.). Alapjában véve elképzelhető az is, hogy baktériumok elicitortartalmú anyaga a teljesítmény fokozását segítheti állati vagy emberi szövetek vagy sejtek tenyészeteiben a beltartalmi anyagok szintézisénél, vagy a gyógyászatban találhat alkalmazásra, így például a sebkezelésnél.
A következő kiviteli példák a találmány szerinti eljárás közelebbi bemutatására szolgálnak.
1. példa
Színezett beltartalmi anyagok (Actinorhodin, Prodigiosin) szintézisének a stimulálása Streptomyces lividans (ATCC 19 844)-nél sejtfalkészítmények útján ml tápközeg, amelynek összetétele a következő:
103 g szacharóz, g glükóz,
10,12 g magnézium-klorid-hexahidrát,
0,25 g kálium-szulfát,
0,1 g Cas aminosavak (Difco labs, Detrois/USA)
800 ml desztillált víz
Ezeket az alkotóanyagokat sterilizáljuk (20 percig 120 ’C-on) és a következő frissen készített oldatokkal sterilen kiegészítjük.
ml 0,5%-os kálium-hidrogén-foszfát-oldat ml 3,68%-os kalcium-klorid-dihidrát-oldat
1,5 ml 20%-os L-prolin-oldat ml 5,73%-os TES-puffer-oldat (pH = 7,2)
0,2 ml nyomelem-oldat, amely literenként a következő alkotókat tartalmazza a megadott mennyiségben:
mg cink(ü)-klorid,
200 mg vas(III)-klorid-hexahidrát, mg réz(II)-klorid-dihidrát, mg mangán(II)-klorid-tetrahidrát, mg hexaammónium-heptamolibdát-tettahidrát.
0,5 ml 1 normál nátrium-hidroxid-oldat.
Ebből a tápoldatból 1,8-1,8 ml mennyiségeket beviszünk egy polisztirol-multicsésze 24 darab, egyenként 3 ml térfogatú, kamrájába. Az elicitortartalomra vizsgálandó sejtfalkészítmény 2-2 mg-ját kétszer desztillált vízben 20 percig 120 °C-on sterilizáljuk és a kapott szuszpenziókat a kamrákhoz hozzáadjuk. A kamrák közül 2 darab nem tartalmaz semmiféle adalékot és kontrollként szolgál. Mindegyik kamrában a térfogatot egységesen 2 ml-re állítjuk be sterilen kétszer desztillált vízzel. Mindegyik kamrát azonosan beoltjuk Streptomyces lividans (ATCC 19 844) 5 μΐ-nyi spóraszuszpenziójával steril körülmények között. A kísérleti anyag inkubálását aerob körülmények között 26 °C-on végezzük (Tablar-rázógépen 100 fordulat/perc sebesség mellett).
A sejteket 96 óra múlva lecentrifugáljuk, fiziológiás konyhasó-oldattal mossuk, vákuumban kalcium-klorid felett szárítjuk és így a táblázatban felsorolt sejtkitermelést kapjuk. A centrifugálásnál kapott maradéko5
HU 208 341 B kát 7-es pH-ra állítjuk be, vízzel 4 ml-re hígítjuk és meghatározzuk az abszorpciós spektrumukat 180 és 800 nm-nél. A szintetizált oldott szekunder anyagoknak, az Actinorhodinnak és a Prodigiosinnak a viszonylagos mennyiségét közelítőleg az automatikusan feljegyzett spektrumok abszorpciós csúcsainak a mérése útján állapítjuk meg.
A következő 3. táblázat az ebben a kísérletsorozatban kapott eredményeket foglalja össze.
3. táblázat
Vizsgált baktériumsejtfalak Sejt szárazanyag (mg) Színezéktartalom viszonylagos abszorpciósegységek
nincs (kontroll) 22 1
B. ammoniagenes (ATCC 6872) 25 38
B. glutamingenes (ATCC 13 747) 32 24
Ba. pumilus (ATCC 7061) 34 2
B. linens (ATCC 19 391) 23 1
C. diphteriae (Mass. 8) 24 34
C. melassecola (ATCC 17 965) 26 34
C. glutamicum (ATCC 13 032) 43 50
C. lilium (ATCC 15 990) 33 40
Ce. cellasea (ATCC 14 359) 36 2
L. plantarum (DSM 20 174) 32 31
S. aureus H törzs 44 1
B = Brevibacterium
Ba = Bacillus
C = Corynebacterium
Ce = Cellulomonas
L = Lactobacillus
S = Staphylococcus
2. példa
Színezett beltartalmi anyagok (Actinorhodin, Prodigiosin) szintézisének stimulálása Streptomyces lividans (ATCC19 844)-nél sejtfalkivonatok útján Az 1. példa körülményei között, de kétszer desztillált vízben 20 percig 120 °C-on sterilizált 2 mg sejtfalkészítmények alkalmazása mellett, a színezékképződés majdnem azonos erősségű stimulálását érjük el Streptomyces lividans (ATCC 19 844)-nél, mint e sterilizált sejtfalak szuszpenzióinak a felhasználása esetén.
3. példa
Színezett beltartalmi anyagok (Actinorhodin, Prodigiosin) szintézisének stimulálása Streptomyces lividans (ATCC 19 844)-nél sejtkivonatok útján A 2. példa körülményei között, de 20-20 mg sejtmassza alkalmazása mellett 2 mg sejtfalkészítmény helyett, a színképződés körülbelül azonos erősségű stimulálását éljük el, mint sterilizált sejtfalak szuszpenzióinak az alkalmazása esetén.
4. példa
Színezett beltartalmi anyagok szintézisének a stimulálása Streptomyces coelicolorA3(2), illetve (ATCC 13 405)-nél
Az 1. példa körülményei között dolgozunk, de Streptomyces coelicolor A3(2) alkalmazása esetén a színezékképződés (valószínűleg ugyancsak Actinorhodin) látható stimulálását érjük el ennél a baktériumnál.
5. példa
Színezett beltartalmi anyagok szintézisének a stimulálása Streptomyces griseoruber (DSM 40 275)nél
Az 1. példa körülményei között, ámde Streptomyces griseoruber (DSM 40 275) alkalmazása esetén ennél a baktériumnál a színezékképződés ugyancsak nagyon világosan látható növekedését érjük el (valószínűleg Anthracyclin-antibiotikumok).
6. példa
Színezett beltartalmi anyagok szintézisének a stimulálása Streptomyces purpurascens (DSM 40310)-nél
Az 1. példa körülményei között, ámde Streptomyces purpurascens (DSM 40 310) alkalmazása esetén ennél a baktériumnál a színezékképződés (valószínűleg ugyancsak Anthracyclin-antibiotikumok) ugyancsak erős növekedését érjük el.
7. példa
Színezett beltartalmi anyagok szintézisének a stimulálása Streptomyces latericius (DSM 40163)nál
Az 1. példa körülményei között, de Streptomyces latericius (DSM 40 163) alkalmazása esetén ennél a baktériumnál a színezékképződés ugyancsak jelentékeny növekedését érjük el.
8. példa
Színezett beltartalmi anyagok szintézisének a stimulálása Streptomyces violaceus (DSM 40 082)nél
Az 1. példa körülményei között, de Streptomyces violaceus (DSM 40 082) alkalmazása esetén ennél a baktériumnál a színezékképződés ugyancsak jelentős növekedését érjük el.
9. példa $-laktám-antibiotikumok (cefalosporin, penicillin
N) képződésének a stimulálása Streptomyces clavuligerus (ATCC 27 064)-nál 5 g 3-(N-morfolino)-propán-szulfonsav (MOPS),
3,5 g dikálium-hidrogén-foszfát,
0,6 g magnézium-szulfát-hemihidrát, g L-aszparagin, g glicerin, g élesztőkivonat (Oxid, Wesel, DE),
HU 208 341 Β ml nyomelemsók oldata, amely literenként a következő anyagokat tartalmazza a megadott mennyiségben:
g vas(II)-szulfát-heptahidrát, g mangán(II)-klorid-tetrahidrát, g cink-klorid-heptahidrát, g kalcium-klorid, alkotóanyagokat desztillált vízzel 1 literrel feltöltünk és 20 percig 120 °C-on sterilizáljuk az elegyet.
Ebből a tápoldatból 1,8-1,8 ml mennyiségeket beviszünk egy polisztirol-multicsésze 3 ml térfogatú kamráiba. Az elicitortartalomra vizsgálandó sejtfalkészítmény 2-2 mg-ját vagy a vizsgálandó sejtek 10 mgját kétszer desztillált vízben 20, illetve 45 percig 120 °C-on sterilizáljuk és a homogén szuszpenziókhoz hozzáadjuk. Két kamra, amely kontrollként szolgál, nem tartalmaz adalékot. Mindegyik kamrában a térfogatot 2 ml-re állítjuk be sterilen kétszer desztillált vízzel. Mindegyik kamrát azonosan beoltjuk Streptomyces clavuligerus (ATCC 27 064) 5 μΐ-nyi spóraszuszpenziójával.
A kísérleti anyag inkubálását aerob körülmények között 26 °C-on végezzük (Tablar-rázógépen 160 fordulat/perc sebesség mellett). Az inkubálás 24-48 óra hosszat tart.
Az antibiotikumképződést a kontrollokkal összehasonlítva lemezdiffüziós teszt segítségével vizsgáljuk. A Soft-tápagarban szuszpendált detektororganizmusokként Micrococcus luteust, illetve Bacillus substilist (106 sejt milliliterenként) használunk. A szabványos szűrőlapocskákra (0,9 cm átmérő) minden esetben 2525 μΐ centrifugált (48 OOOxg) tápoldatot viszünk rá a kísérleti kamrákból, majd 4 órás 4 °C-on történő diffúzió után az anyagot 24 óra hosszat 30 ’C-on inkubáljuk.
Azoknál a tenyészeteknél, amelyeket Brevibacterium flavum ATCC 13 826, vagy e baktérium sejtfajkészítményeinek, illetve Corynebacterium diphteriae (8. törzs) jelölt sejtjeinek a hozzáadása mellett tenyésztettünk, egyértelműen megnagyobbodott gátlóudvarok képződtek a kontrollokkal összehasonlítva és megnövekedett a Streptomyces clavuligerus által előidézett β-laktám-antibiotikumok (Penicillin N, cefalosporin) képződése.
10. példa
Alkaloidok (Saguinarin, Chelirubin, Marcarpin és
Chelerythrin) képződésének stimulálása Eschscholtzia califomica kultúráknál Polisztirol-multicsésze 24 darab 1 ml-es kamrájában J. Berlin et al. által (Z. Naturforsch., 38c, 1983, 346-352.) optimálisnak leírt körülmények között Eschscholtzia califomica sejtkultúráit tenyésztjük. Egy a kamrák közül nem kapott hozzátétet és kontrollként szolgál, egy kamra 266 mg/1 forrón extrahált és etanollal kicsapott élesztőelicitort kapott, amelyet Kocourek J. és Ballou, C. E., módszer szerint állítottunk elő (J. Bacteriol 100, 1969, 1175-1181.), a többiek pedig azoknak a baktériumoknak a sejtfalkészítményét kapták 266-266 mg/1 mennyiségben, amelyeket a 3. táblázatban felsorolunk. Ezután a tenyészeteket 72 óra hosszat 24 ’C-on inkubáljuk és ezt követően a tenyészetek alkaloidtartalmát fotometriásan meghatározzuk.
A vizsgálat szerint az élesztőelicitor által indukált alkaloidtartalom 100%.
A 4. táblázatban ennek a kísérletsorozatnak az eredményeit foglaljuk össze.
4. táblázat
Vizsgált baktériumsejtfalak Alkaloidterme- lés-növekedés (Elicitoraktivi- tás)%
Brevibacterium butanicum ATCC 21196 19
Brevibacterium flavum ATCC 13 826 16
Brevibacterium flavum ATCC 14 067 30
Brevibacterium glutamingenes ATCC 137 113
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13 655 43
Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 40
Corynebacterium hydrocarboclastum ATCC 15 592 8
Corynebacterium nephridii ATCC 11 425 123
Corynebacterium paurometabolum ATCC 8368 16
Corynebacterium lilium ATCC 15 990 108
Corynebacterium striatum ATCC 6940 17
Corynebacterium petrophilum ATCC 19 080 0
Corynebacterium xerosis ATCC 373 102
Corynebacterium dipgtheriae 8. törzs 137
Rhodococcus fasciens ATCC 12 975 27
Rhodococcus fascians 1 11
Dr. Stolp prof. izolátuma Univ. Bayreuth
Rhodococcus fascians 2 7
Dr. Stolp prof. izolátuma, Univ. Bayreuth
11. példa
Indo-alkaloidok képződésének (Vallesiacotamin) stimulálása Rauvolfia serpentina kultúrákban Rauvolfia serpentina szuszpenziókultúrát (Stöckigt,
J., A. Pfitzner and J. Firl: Plánt Cell Rep. 1, 36-39, 1981) Linsmaier és Skoog (LS)-közegben (Physiol. Plantarum 18, 100-127, 1965) rotációs rázógépeken (100 ford/perc) 23 ’C-on és tartós fény (600 Lux) mellett tenyésztünk. Elicitálásként 200 g friss sejtsúly/1 LS-közeg anyagot oltunk be. Mikroorganizmusok elicitortartalmú töredékeiként a 4. táblázatban felsorolt baktériumok sejtfalkészítményeit alkalmazzuk 130 mg/1 közeg mennyiségben.
napos inkubálás után mind az elicitáló kultúrákban, mind a kontroliokban megkétszerezzük a sejttömeget. A sejteket learatjuk és metanollal extraháljuk.
A Vallesiacotamin indolalkaloida mennyiségét a kivonat HPLC-vizsgálata útján határozzuk meg. Míg a kezeletlen kontrollkultúrák csak 1,16 mg/1 közeget tar7
HU 208 341 Β talmaznak, addig az elicitált kultúrák legfeljebb 58 mg/l-t. Ez 50-szeres növekedésnek felel meg, amelyet az elicitor okozott.
72. példa
A 17-ketoszteroid-reduktáz-aktivitás stimulálása
Rhodotorula glutinis kultúrában
a) Egy 2 literes Erlenmeyer-lombikban lévő 500 ml steril tápközeget, amely
5% glukóz-monohidrátot,
2% comsteep liquor-t tartalmaz és a pH-ja 6,5, Rhodotorula glutinis IFO 0389 ferdetenyészetéből vett anyaggal beoltunk és 40 óra hosszat tenyésztünk 30 °C-on 190 ford/perc mellett.
b) Egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban lévő 100 ml steril tápközeget, amely
1% Comsteep liquor-t,
5% Nurupan-t (Nurupan GmbH, Düsseldorf) és
1% Metarin-t (Lucas Meyer, Hamburg) tartalmaz és a pH-ja 6,2, 10 ml 12a. példa szerint előállított Rhodotorula előtenyészettel beoltunk és 7 óra hosszat tenyésztünk 30 ’C-on 180 ford/perc mellett.
Ezután 10 mg 3-hidroxi-l,3,5(10),7-ösztra-tetraén17-ont adunk a tenyészethez és további 210 óra hosszat fermentáljuk. Ezt követően a tenyészetet metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, a kivonatot betöményítjük, a kapott nyersterméket kromatográfiásan tisztítjuk szilikagél oszlopon. Ilymódon 5,9 mg l,3,5(10),7-ösztra-tetraén-3,17a-diolt kapunk, amely az elméleti hozam 59%-ának felel meg.
c) a 12b. példa körülményei között 10 mg 3-hidroxi-l-3,5(10),7-ösztra-tetraén-17-ont Rhodotorula glutinis kultúrával fermentálunk azzal az eltéréssel, hogy ehhez a kultúrához közvetlenül az anyag hozzáadása előtt Bacillus licheniformis (ATCC 9945) 50 mg sejtfalkészítmény vízzel készített steril szuszpenziójából 5 ml-nyi mennyiséget adunk. A tenyészet feldolgozása után 6,8 mg 1,3,5(10),7-ösztra-tetraén-33,17-diolt kapunk, amely az elméleti hozam 68%-ának felel meg.
13. példa
Bacillus lentus (ATCC 13 805) szteroid-Aj-dehidráz-aktivitásának a stimulálása
a) Egy 2 literes Erlenmeyer lombikban lévő 500 ml steril tápközeget, amely
0,5% Comsteep liquor-t,
0,05% glukóz-monohidrátot és
0,1% élesztőkivonatot tartalmaz és a pH-ját 7,0-re állítottuk be, Bacillus lentus (ATCC 13 805) szuszpenziójával beoltunk és 48 óra hosszat tenyésztünk 30 ’C-on 190/perc mellett történő rázás közben.
b) Egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban 100 ml steril tápoldatot, amely
3,0% szójaport,
0,5% Comsteep liquor-t,
0,1% élesztőkivonatot és
0,05% glukóz-monohidrátot tartalmaz és a pH-ját 7,3-ra állítottuk be, 10 ml Bacillus lentus előtenyészetével beoltunk és 30 ’C-on 180 ford/perc mellett rázunk. Ezután a tenyészethez 40 mg 6a,9a-difluor-llp,17a-dihidroxi-16a-metil-4pregnén-3,20-dion 4 ml dimetil-formamiddal készített sterilen szűrt oldatát adjuk és további 41 óra hosszat inkubáljuk.
Ezután a tenyészetet metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, a kivonatot vákuumban betöményítjük és a maradékot kromatográfiásan tisztítjuk szilikagél oszlopon. Ilymódon 16 mg 6 a,9a-difluor-lip,17a-dihidroxi-16a-metil-l,4-pregnadién-3,20-diont kapunk, amely az elméleti hozam 40%-a.
c) A 13b. példa körülményei között 40 mg 6a, 9a-difluor-11 β, 17a-dihidroxi-16a-metil-4-pregnén3,20-diont egy Bacillus lentus kultúrával fermentálunk azzal az eltéréssel, hogy ehhez a kultúrához közvetlenül az anyag hozzáadása előtt Coiynebacterium diphtheriae (8. törzs) 50 mg sejtfalkészítmény vízzel készített steril szuszpenziójából 5 ml-nyi mennyiséget adunk. A tenyészet feldolgozása után 21 mg 6a,9a-difluor-11 β, 17a-dihidroxi-16a-metil-1,4-pregnadién-3, 20-diont kapunk, amely az elméleti hozam 52,5%-a.
14. példa
Alkaloidok (lizergsavamid és izolizergsavamid) képződésének a stimulálása Claviceps paspali (ATCC 13 895) kultúrában
a) Egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban lévő 50 ml steril tápoldatot, amely
4% szorbitot (technikailag tiszta),
1% glukóz-monohidrátot,
2% borostyánkősavat,
0,6% ammónium-szulfátot,
0,5% élesztőkivonatot (Difco, Detroit/USA),
0,1% kálium-dihidrogénfoszfátot és
0,03% magnézium-szulfát-heptahidrátot tartalmaz és pH-ját nátrium-hidroxiddal 5,2-re állítottuk be, Claviceps paspali (ATCC 13 895) -70 ’C-ra lehűtött tenyészetével beoltunk és 5 napon át 24 ’C-on és 240 ford/perc mellett rázunk.
b) egy 500 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő steril tápoldatot, amely
8% szorbitot (technikai tisztaságú),
6% borostyánkősavat,
0,9% ammónium-szulfátot,
0,1% kalciumtitrát-tetrahidrátot,
0,05% dikálium-hidrogénfoszfátot,
0,03% magnézium-szulfát-heptahidrátot,
0,02% élesztőkivonatot (Difco, Detroit/USA),
0,0007% vas(II)-szulfát-heptahidrátot és
0,0006% cinkszulfát-heptahidrátot tartalmaz és a pH-ját nátrium-hidroxiddal 5,2-re állítottuk be, a Claviceps paspali 5 ml-nyi előtenyészetével beoltunk és 250 óra hosszat 24 ’C-on 240 ford/perc mellett rázunk.
Ezután a tenyészethez annyi nátrium-hidroxidot adunk, hogy legalább 10 pH-értéket elérjen, utána metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, a kivonatot vákuum8
HU 208 341 Β bán betöményítjük és a maradékot kromatográfiásan tisztítjuk kovasavgél-oszlopon.
Ilymódon 35 mg elegyet kapunk, amely lizergsavamidból és izolizergsavamidból áll. Kitermelés 700 mg/liter tenyészet.
c) A 14b. példában leírt körülmények között Claviceps paspali kultúrát tenyésztünk azzal az eltéréssel, hogy ehhez a kultúrához 72 óra elteltével 25 mg Lactobacillus casei subsp. rhamosus (ATCC 7469) sejtfalkészítmény 5 ml vízzel készített steril szuszpenzióját adjuk hozzá. A tenyészet feldolgozása után 45 mg elegyet kapunk, amely lizergsavamidból és izolizergsavamidból áll. Kitermelés 900 mg/liter tenyészet.
75. példa
15ot.-hidroxiláz-aktivitás stimulálása Penicillium raistrickii (ATCC 10 490) kultúrában
a) Egy 2 literes Erlenmeyer-lombikban lévő 500 ml steril tápoldatot, amely
3% glukóz-monohidrátot,
1% Comsteep liquor-t,
0,2% nátrium-nitrátot,
0,05% magnézium-szulfát- heptahidrátot,
0,05% kálium-kloridot,
0,002% vas(II)-szulfát-hexahidrátot,
0,1% kálium-dihidrogénfoszfátot és
0,2% dikálium-hidrogénfoszfátot tartalmaz, és amelynek a pH-ját 6,0-ra állítottuk be,
Penicillium raistrickii (ATCC 10490) ferdetenyészetéből származó kenettel beoltunk és 48 óra hosszat 30 °C-on 180 ford/perc mellett tenyésztünk.
b) Egy 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban lévő 100 ml steril tápoldatot, amely
1% Comsteep liquor-t,
3% glukóz-monohidrátot,
0,1% kálium-dihidrogénfoszfátot,
0,2% dikálium-hidrogénfoszfátot és
0,05% magnézium-szulfát- heptahidrátot tartalmaz és pH-ját 6,0-ra állítottuk be, beiltunk ml a) pont szerint előállított Penicillium előtenyészettel.
Ezután a tenyészethez hozzáadunk 300 mg 13-etilgona-4-én-3,17-diont és 120 óra hosszat 30 °C-on 180 ford/perc mellett fermentáljuk az elegyet.
Ezt követően a tenyészetet metil-izobutil-ketonnal extraháljuk, a kivonatot betöményítjük és a kapott nyers terméket kromatográfiásan tisztítjuk kovasavgél oszlopon. Ilymódon 180 mg 13-etil-15a-hidroxi-gona4-én,3,17-diont kapunk.
c) A b) pont szerinti körülmények között 300 mg 13-etil-gona-4-én-3,17-diont Penicillium raistrickii kultúrával fermentálunk azzal az eltéréssel, hogy ehhez a kultárához közvetlenül az anyag hozzáadása előtt Corynebacterium diphteriae (8. törzs) 50 mg sejtfalkészítmény vízzel készített steril szuszpenziójából 5 ml-nyi mennyiséget adunk. A tenyészet feldolgozása után 210 mg 13-etil-15a-hidroxi-gona-4én-3,17-diont kapunk.

Claims (6)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás mikroorganizmusok és magasabbrendű növények sejttenyészetei szintézisteljesítményének a fokozására, azzal jellemezve, hogy az organizmusokat inaktivált elicitortartalmú mikroorganizmusokkal, ezek töredékeivel vagy elicitortartalmú mikroorganizmusok kivonataival hozzuk érintkezésbe, azzal a feltétellel, hogy a magasabbrendű növények sejttenyészetei szintézisteljesítményének a fokozására inaktivált elicitortartalmú baktériumokat, ezek töredékeit vagy elicitortartalmú baktériumok kivonatait alkalmazzuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás mikroorganizmusok szintézisteljesítményének fokozására, azzal jellemezve, hogy ezeket inaktivált elicitortartalmú mikroorganizmusokkal, azok töredékeivel vagy e mikroorganizmusok elicitortartalmú kivonataival érintkeztetjük.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás színezék- vagy alkaloid- vagy antibiotikum-termelő baktériumok vagy gombák szintézisteljesítményének a fokozására, azzal jellemezve, hogy ezeket inaktivált elicitortartalmú baktériumokkal, gombákkal, előnyösen élesztőkkel, ezek töredékeivel vagy e mikroorganizmusok kivonataival érintkeztetjük.
  4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás szteroidátalakításra képes baktériumok vagy gombák enzimaktivitásának fokozására, azzal jellemezve, hogy a baktériumokat vagy gombákat inaktivált elicitortartalmú baktériumokkal, ezek töredékeivel vagy kivonataival érintkeztetjük.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás színezéket vagy alkaloidot vagy fitoalexint szintetizáló magasabbrendű növények sejttenyészetei szintézisteljesítményének fokozására, azzal jellemezve, hogy a magasabbrendű növények sejttenyészeteit inaktivált elicitortartalmú baktériumokkal vagy ezek töredékeivel vagy kivonataival érintkeztetjük.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy inaktivált mikroorganizmusként hősterilizált elicitortartalmú mikroorganizmusokat használunk.
HU89975A 1988-01-13 1989-01-11 Process for increasing the synthesis productivity of cell cultures of microorganisms and higher plants HU208341B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3801023A DE3801023A1 (de) 1988-01-13 1988-01-13 Verfahren zur steigerung von enzym-aktivitaeten und der syntheseleistung von organismen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT57270A HUT57270A (en) 1991-11-28
HU208341B true HU208341B (en) 1993-09-28

Family

ID=6345349

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU89975A HU208341B (en) 1988-01-13 1989-01-11 Process for increasing the synthesis productivity of cell cultures of microorganisms and higher plants

Country Status (19)

Country Link
EP (2) EP0354945B1 (hu)
JP (1) JPH02502881A (hu)
CN (1) CN1034756A (hu)
AT (1) ATE103325T1 (hu)
AU (2) AU3215989A (hu)
BG (1) BG60596B1 (hu)
CA (1) CA1317247C (hu)
DD (1) DD278357A5 (hu)
DE (2) DE3801023A1 (hu)
DK (1) DK442289D0 (hu)
ES (1) ES2051894T3 (hu)
FI (1) FI97302C (hu)
HU (1) HU208341B (hu)
IE (1) IE66500B1 (hu)
IL (1) IL88953A (hu)
NO (1) NO893643D0 (hu)
PT (1) PT89427B (hu)
WO (1) WO1989006687A1 (hu)
ZA (1) ZA89304B (hu)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7264951B1 (en) 1992-02-20 2007-09-04 Phyton, Inc. Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of Taxus species
PT954596E (pt) 1996-05-24 2006-05-31 Phyton Inc Producao melhorada de taxanos atraves de culturas de celulas da especie taxus
GB9611089D0 (en) * 1996-05-28 1996-07-31 Sandoz Ltd Organic compounds
US10749991B2 (en) 2017-05-31 2020-08-18 Regents Of The University Of Minnesota Emulation-based cross-technology communication
CN107746849B (zh) * 2017-09-29 2022-01-18 天津科技大学 一种甾体羟化酶基因的高效筛选方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1259938A (en) * 1985-12-05 1989-09-26 Friedrich Constabel Repeated elicitor treatment, a method for semicontinuous metabolite production by plant cells cultured in vitro

Also Published As

Publication number Publication date
ZA89304B (en) 1989-10-25
DE3801023A1 (de) 1989-07-27
PT89427B (pt) 1993-09-30
EP0325933B1 (de) 1994-03-09
DD278357A5 (de) 1990-05-02
DK442289A (da) 1989-09-07
CN1034756A (zh) 1989-08-16
CA1317247C (en) 1993-05-04
NO893643L (no) 1989-09-12
AU3215989A (en) 1989-08-11
DE58907274D1 (de) 1994-04-28
FI97302B (fi) 1996-08-15
FI97302C (fi) 1996-11-25
EP0354945A1 (de) 1990-02-21
WO1989006687A1 (en) 1989-07-27
JPH02502881A (ja) 1990-09-13
ATE103325T1 (de) 1994-04-15
DK442289D0 (da) 1989-09-07
IE66500B1 (en) 1996-01-10
IE890079L (en) 1989-07-13
IL88953A0 (en) 1989-08-15
EP0325933A1 (de) 1989-08-02
EP0354945B1 (de) 1994-03-23
PT89427A (pt) 1990-02-08
ES2051894T3 (es) 1994-07-01
IL88953A (en) 1995-03-30
BG60596B1 (en) 1995-09-29
HUT57270A (en) 1991-11-28
AU2818392A (en) 1993-01-14
NO893643D0 (no) 1989-09-12
FI894304A0 (fi) 1989-09-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ahmad et al. Indole acetic acid production by the indigenous isolates of Azotobacter and fluorescent Pseudomonas in the presence and absence of tryptophan
Barazani et al. Is IAA the major root growth factor secreted from plant-growth-mediating bacteria?
Halverson et al. Effect of lectin on nodulation by wild-type Bradyrhizobium japonicum and a nodulation-defective mutant
Cutler et al. Monorden from a novel source, Neocosmospora tenuicristata: Stereochemistry and plant growth regulatory properties
Domenech et al. Bacillus spp. and Pisolithus tinctorius effects on Quercus ilex ssp. ballota: a study on tree growth, rhizosphere community structure and mycorrhizal infection
Becker et al. Effects of mycorrhizal-associated streptomycetes on growth of Laccaria bicolor, Cenococcum geophilum, and Armillaria species and on gene expression in Laccaria bicolor
Matsubara et al. Occurrence of two different enzymes in the silkworm, Bombyx mori, to reduce folate and sepiapterin
HU208341B (en) Process for increasing the synthesis productivity of cell cultures of microorganisms and higher plants
El-sersy et al. Antagonistic effect of marine Nocardia brasiliensis against the fish pathogen Vibrio damsela: Application of Plackett
DK145701B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af ergotalkaloider
JP6327416B2 (ja) ジャガイモそうか病抑制剤
Keim et al. Fungistasis of sclerotia of Sclerotium oryzae
Skotnicki et al. Bacterial and bacteroid properties of mutants of Rhizobium trifolii strain T1 uncoupled in oxidative phosphorylation
Kingsley et al. Production of antibiotic from actinomycete from unexplored region of Kolli Hills, Tamilnadu and antibacterial activity against UTI pathogens
JP2524964B2 (ja) 抗菌性物質２，４−ジアセチルフロログルシノ―ルの製造法
JP2808196B2 (ja) 新規物質ｃｌ１９０ｙ１及びその製造法並びにそれを有効成分とする抗酸化剤
Ali et al. Potential of endophytic bacteria isolated from Vitex negundo L. to produce auxin.
JPH0625277A (ja) 新規テストステロン−５α−レダクターゼ阻害物質ＳＮＡ−４６０６産生菌、新規テストステロン−５α−レダクターゼ阻害物質ＳＮＡ−４６０６及びその製造法
KR100401008B1 (ko) 항진균성 및 항암성이 있는 신규한 화합물 ｙｍ410,그의 제조방법 및 용도
JPH0117678B2 (hu)
Palanivel et al. 12. STUDY ON ANTIMICROBIAL METABOLITE PRODUCED BY SOIL BACTERIA ISOLATED FROM LESS EXPLORED ECOSYSTEM BY P. PALANIVEL, L. ASHOKKUMAR, R. PRABAKARAN AND R. BALAGURUNATHAN
JPS61289005A (ja) 植物病原菌胞子発芽抑制剤
JPH03240495A (ja) 新規生理活性物質サイクロオクタチン、その製造法およびその用途
JPH0383947A (ja) 新規なｑ―５４８６―ａ物質及びその製造法
Beltká et al. The Formation of Growth Substances by Rhizobium Species

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee