BG60596B1

BG60596B1 - Method for improving the enzymic activity and synthesis productivity of organism

Info

Publication number: BG60596B1
Application number: BG89739A
Authority: BG
Inventors: Franz Fiedler; Meinhart H Zenk; Heidrun Gundlach; Alfred Weber; Mario Kennecke
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 1988-01-13
Filing date: 1989-09-13
Publication date: 1995-09-29
Also published as: CA1317247C; ES2051894T3; AU3215989A; IE890079L; HU208341B; NO893643D0; PT89427B; PT89427A; ATE103325T1; DD278357A5; DE3801023A1; EP0325933A1; ZA89304B; IL88953A0; FI97302B; BG89739A; NO893643L; HUT57270A; JPH02502881A; EP0354945B1

Description

(54) МЕТОД ЗА ПОВИШАВАНЕ ЕНЗИМНАТА АКТИВНОСТ И СИНТЕЗНАТА ПРОДУКТИВНОСТ НА ОРГАНИЗМИ

Изобретението се отнася до метод за повишаване ензимната активност и синтезната продуктивност на организми.

Известно е, че елициторите са микробна или растителни активни вещества, които при поставянето им в контакт с тъкани на повисши растения, повишават ензимните им активности и синтезните им продуктивности. Така акумулираните в тези растения съдържащи се вещества, се обозначават като фитоалексини, когато са противомикробни / Naturwissenschaften 68, 1981, 447 и следв.стр. Adv. Enzymol. 55, 1983, с.1 и следв. и Spektrum der Wissensehaft, 11, 1985, стр.85 и следв./.

Понастоящем са изолирани повече от 100 съединения от различни растения, които отговарят на фитоалексинова дефиниция. Те спадат към различни групи естествени вещества, като терпеноиди, производни на линоленовата киселина, ацетилени и полиацетилени, бибензили, стилбени, фенантрени и дихидрофенантрени, бензофурани и фенолбензофурани, фурокумарини, авеналумини, флавани, фенилбензофурани, бензоксазинони, алкалоиди, изофлавоноиди /Brooks and Watson, Nat. Prod. Reports, 2, 1985, 427/.

Техническото приложение на тази елициторна активност досега не е широко застъпено. Това се дължи на няколко причини: досега не е възможно, с малко изключения, да бъдат размножавани клетки на по-висши растения при икономически оправдани условия при дълбочинно култивиране. Приложението на елицитори при ферментациятя посредством микроорганизми по принцип изглежда безсмислено, тъй като съгласно съществуващото мнение на учените относно начина на действие на елициторите /Albersheim Р. und Darvill A.G., Spectrum der Wissenhaft, 11, 1985, 85/ би трябвало да се излиза от становището, че същите не влияят върху ензимната активност и процесите на обмяна на веществата в микроорганизмите.

Също така може да се отбележи, че съгласно съществуващото становище на учените бактериите могат да причинят образуването на фитоалексини у растенията само тогава, когато както например представителите на рода Erw inia, посредством определени ензими /пектинази/ освобождават от клетъчната стена на растението елицитори /олигогалактурониди/, които стимулират като ендогенни елицитори образуването на фитоалексин.

Сега е установено, че съединения и клетъчни препарати от микроорганизми, които понататък се наричат “елицитори”, по изненадващ начин наистина са в състояние да повишат в микроорганизмите ензимните активности и тяхната синтезна продуктивност. Освен това е установено, че съществуват също така и бактерии, които съдържат елицитори, които не са ензими или хранителни фактори.

Методът съгласно изобретението може по принцип да се провежда с помощта на изолирани или синтезирани елицитори, което по правило е много трудоемко. Достатъчно е да бъдат използвани инактивирани, съдържащи елицитори микроорганизми, или фрагменти от тези микроорганизми, като например фракции от клетъчната стена, клетъчни фрагменти от механично преработване или химическо, респ. ензимно лизиране на клетките или утаен с помощни вещества, като например етанол или ацетон, продукт с клетъчно съдържание. Инактивирани микроорганизми съгласно изобретението са клетки, които завинаги са изгубили жизнеспособността си.

Когато микроорганизмът отделя елицитори в култиралния бульон или след лизис или стерилизация образува водоразтворим, съдържащ елицитори продукт с клетъчно съдържание, може този съдържащ елицитори продукт да секретира микроорганизми, които могат да се използват за провеждане на метода съгласно изобретението. Всяка форма на съдържащия елицитори продукт от микроорганизми е подходяща за провеждане на метода съгласно изобретението.

Таблица 1

Микроорганизми, за които е известно, че притежават елицитори, са описаните в следващата таблица 1 гъбни щамове и дрожди:

Alternaria carthami

Botrytis cinerea (ATCC 48345) Ceratocystis fimbriata Ceratocystis ulmi Chondrostereum purpureum Cladosporium fulvum (ATCC 44961) Colletotrichum lindemuthianum (ATCC 52471) Fusarium solani

Fusarium solanifspmori (ATCC 44934) Ganoderma applanatum Glomerella cingulata

Helminthsporium carbonum (ATTC 52471) Monilinia fructicola

Nectria haematococca Phoma exigua Phytophthora cannabivora Phytophthora capsici (ATCC 52771) Phytophthora infectans (ATCC 44776) Phytophthora megasperma var glycinea Phytophthora infectans Phytophthora megasperma Phytophthora nicotians

Puccinia coronata

Pyricuiaria oryzae (ATCC 15923) Saccharomyces cerevisiae Verticillium albo-atrum

Verticillium dahliae (ATCC 26289)

Arch. Bioch.Biop. 229,1984,136 Physiol. Plant Pathol.Ill, 1977, 287 Phytochemistry 23, 1984.759 Phytochemistry 23.1984,383

J.Chem.Soc.Perkin Trans 1,1984,14341 Physiol. Plant Pathol. 16,1980, 391 Eur. J. Biochem. 129,1983,593 Plant Physiol. 76,1984,833 NatProd. Rep. 2, 1985, 439 Phytochemistry 22, 1983, 1039 Physiol.Plant.Pathol. 2L 1982,171 Z. Naturforsch. Sect. C 38, 1983, 899

J.Am.Chem. Soc.,84,1962,1919 Phytochemistry 22,1983, 2291 Phytochem. 21,1982,1818 Z.Naturf. Sect. C. 39, 1984,217 Physiol.PlatPathol. 18,1981,379 Phytochem.23,1984,537 Arch.Bioch. Bioph.229,1984,136 Phytpathol. Z, 27, 1956, 237 J. Biol. Chem. 259, 1984,11341 Phytopathology 71,1981, 864 Physiol. Plant Pathol. 20.1982,189 Agric. Biol. Chem. 48,1984, 253 Plant Physiol. 62,1978,107 NatProd. Rep. 2. 1985,429 ATCC-Katalog, ~6. Aufl. 1984

Съгласно изобретението са изследвани протеолитично пречистени посредством трипсин препарати от клетъчната стена от грамположителни бактериални щамове от родове Bacillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Cellulomonas, Lactobacillus, Pimelobacter,

Rhodococcus u Staphylococcus, както и във вода стерилизирани горещо на микроорганизми от тези родове и техните филтрати по отношение на това дали притежават елицитори. В табли40 ца 2 са описани бактериалните щамове, в които са доказани елицитори.

Таблица 2

Bacillus licheniformis ATCC 9945

Bacillus pumilus ATCC 7061

Brevibacterium butanicum ATCC 21196

Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067

Brevibacterium lactofermentum ATCC 13655

Brevibacterium glutamingenes ATCC 13747

Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872

Corynebacterium hydrocarboclastum ATCC 15592

Corynebacterium nephridii ATCC 11425

Corynebacterium paurometabolum ATCC 8368

Corynebacterium Illium ATCC 15990

Corynebacterium striatum ATCC 6940

Corynebacterium xerosis ATCC 373

Corynebacterium diphtheriae (Stamm Mass. 8/Behring Werke)

Corynebacterium melassecola ATCC 17965

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Corynebacterium uratoxidans ATCC 21749

Lactobacillus casei subsp. rhamnosus ATCC 7469

Lactobacillus plantarum DSM 20174

Pimelobacter tumescens AJ 1460

Rhodococcus fascians ATCC 12975

Rhodococcus fascians 1 - Isolat von Prof. Dr. Stolp, Univ.Bayreuth

Rhodococcus fascians 2- Isolat von Prof. Dr. Stolp, Univ.Bayreuth

Съгласно изобретението са изследвани бактериални щамове от малко родове на грамположителни еубактерии по отношение на това, дали притежават елицитори. Изследвани са също и гъбните щамове, включително и дрожди, доколкото може да се види от предварителните публикации в повечето случаи само такива, които притежават елициторни активности, за които е познато, че са фитопатогенни. Поради това може да се очаква, че допълнително още много микроорганизми, като например бактериите от рода Mycobacterium, Nocardia, Nocardioides или Pseudonocardia, също притежават елицитори.

Изпитването на микроорганизмите по отношение на елициторна активност може да бъде проведено безпроблемно с помощта на обичайни методи на скриниране, каквито са известни на специалистите.

Така може например в серийни опити да се култивират при дълбочинно култивиране микроорганизмите, чиято ензимна активност или синтезна продуктивност подлежи да бъде повишена, като към отделните култури се при30 бавят инактивирани микроорганизми от различни видове или подвидове, като след ферментацията аналитично да се определя в кои култури се е постигнало повишение на ензимните активности или на синтезната продуктивност. Повишаването на ензимната активност при микроорганизмите може да се познае например по това, че при ферментативното превръщане на субстратите се получава повишена скорост на образуването -или повишена продуктивност - на продуктите съгласно метода. Съответно може да бъде отбелязана повишена синтезна продуктивност на микроорганизмите например по завишената скорост на образуване на - или завишена продуктивност - ингредиентите на микроорганизма.

Както показват проведените досега опити, които са описани в примерите за изпълнение, методът съгласно изобретението за повишаване ензимната активност или на синтезната продуктивност на микроорганизмите може да бъде прилаган многостранно. Така чрез прибавяне на препарати от клетъчни сте ни към посочените в таблица 2 микроорганизми може да бъде стимулирано образуването на багрилни вещества в Streptomyces lividans (Actinorhodin, Prodigiosin), както и образуването на багрилно вещество в Streptomyces coelicolor, в Streptomyces griseoruber, в Streptomyces latericius, в Streptomyces purpurascens и в Streptomyces violaceus. Освен това е възможно и стимулирането на образуването на беталактамови антибиотици при Streptomyces clavuligerus и алкалоидната синтеза на Claviceps paspali.

Подобно завишаване на синтезната продуктивност на микроорганизмите ще може да се постигне не само посредством клетъчните препарати от таблица 2 - посочените в нея бактерии, а също така и чрез съдържащите елицитори гъби и дрожди, които са посочени в таблица 1, ще може да се постигне повишение на ензимните активности и на синтезната продуктивност при микроорганизмите.

Освен това с помощта на препарати от клетъчни стени съгласно изброените в таблица 2 микроорганизми от клетъчни култури на по-висши растения, като Eschscholtzia califomiса или Rauvolfia serpentina, може да се постигне значимо завишение на образуване на алкалоиди.

Също така успешно е постигнато с помощта на тези препарати от клетъчни стени да бъде завишена способността на Bacillus lentus, да дехидрира стероидите в 1,2-позиция, и способността на Rhodotorula glutinis, да редуцира селективно 17-кетостероидите, както и способността на Penicillium raistrickii да хидроксилира стероидите в 15а позиция. Безуспешен остава досега само опитът да бъде завишена с помощта на тези препарати от клетъчни стени способността на Curvularia lunata за 11- β -хидроксилиране на стероиди.

Тези опити дават основание, да се смята че ще бъде възможно с помощта на метода съгласно изобретението да се завиши още и образуването на многобройни други полезни за промишлеността микробиални компоненти и да се завишат и други ензимни активности на микроорганизмите, които са технически полезни.

Подобни микробиални компоненти са например антибиотици, като пеницилините, цефалоспорини, циклоспорини, актиномицини, грамицидини, неомицини, гентамицини, ниста тини, тетрациклини. никомицини илилинкомицинът, аритромицинът, хлорамфенико.тьт, гризеофулвинът или фузидиновата киселина, както и алкалоидите на моравото рогче, като ергокриптин, ерготаминът, ергозинът, ергокристинът, агроклавин, каноклавин, фестуклавин, паспалиновата киселина или производните на лизерговата киселина, витамини като например витамин В_|2, рибофлавин или бетакаротинът, ензими като амилазите, глюкозоизомерази, протеази, пектинази, целулази, липази, пеницилинацилази, хитиназа или лактаза, нуклеозиди като например гуаниловата киселина или инозиловата киселина, а също така и аминокиселини като цистеинът, глутаминовата киселина, триптофанът или лизинът.

По принцип трябва да е възможно при генетично изменените микроорганизми да се повиши ендогенното или екзогенно образуване на протеин. Такива използваеми протеини са не само споменатите ензими и антибиотици, а също така например и интерферон, инсулин и TNF.

Ензими, които поради ензимната им активност се прилагат при технически условия, са например описани в следните публикации: W. Charney and Н. Herzog: Microbial Transformations of Steroids; Academic Press, New York etc. 1967.

K. Kieslich: Microbial Transformations of Non-steroidal Cyclic Compounds; Georg Thieme Publ. Stuttgart (DE), 1976 und

K. Kieslich: Biotransformations; in HJ.Rehm und G. Reed (Herausgeber): Biotechnology; Weinheim (DE) etc. Vol 6a, 1984.

Подобни микроорганизми са и такива, които причиняват стероидни трансформации, като 11-а- или ll-β или 15-а хидроксилиране, Δ'-дехидриране, 17α, 17β-кеторедуциране или разграждането на страничната верига на стерини или трансформации на антибиотици, като отцепване на пеницилин.

С помощта на метода съгласно изобретението може да се открият нови технически оползотворими компоненти като например нови антибиотици, като към изпитваните микроорганизми се прибавят инактивни, съдържащи елицитори, микроорганизми. Основание за подобно приложение дава обстоятелството, че е известно, че многобройни по-висши растения образуват фитоалексин само тогава в заслужаващо отбелязване количество, когато са за5 разени със съдържащи елицитори микроорганизми.

Определянето, кои съдържащи елицитори микроорганизми повишават ензимната активност или синтезната продуктивност на определен микроорганизъм, се извършва с помощта на общоприети методи, които са добре познати на специалистите.

Провеждането на метода съгласно изобретението не е проблем за специалиста, доколкото се касае до ферментация с помощта на микроорганизми. Микроорганизмът, чиято ензимна активност или синтезна продуктивност подлежи на повишение, се култивира при познатите условия; тогава към културите се прибавят инактивираните, съдържащи елицитори микроорганизми, фрагменти на същите, клетъчни екстракти от същите или екскреции от същите, след което ферментацията продължава по обичайния начин. Прибавянето на инактивирани микроорганизми, на фрагменти или екстракти от тези организми или на екскреции от съдържащи елицитори микроорганизми може да се извърши още в началото на ферментацията. Оптималното време за прибавянето им е съобразно с природата в зависимост от вида на култивирания организъм, по-специално от протичането на експоненциалната фаза на растеж и трябва за всеки отделен случай да бъде проучено. Така при бактериите например е целесъобразно това прибавяне да се извърши 4 до 30 h след започване на ферментацията. При добавяне на инактивирани микроорганизми или фрагменти от същите се използва на кубически метър ферментационен бульон обикновено 1 до 1000 g /предимно 10 до 200 g/ от инактивирания микроорганизъм или 0,1 до 100 g /предимно 1 до 30 g/ от фрагмента на този организъм. Ако се използват екскреции от съдържащи елицитори микроорганизми, то по правило е достатъчно да се приложи на кубически метър ферментационен обем 1 до 50 1 от екскреционния разтвор. Ако методът съгласно изобретението се използва за повишаване ензимната активност на един микроорганизъм, който се прилага за ензимно превръщане на субстрати, се започва с прибавянето на субстрата по правило 0 до 10 h след приключване добавянето на съдържащия елицитори инактивиран микроорганизъм, или на неговите фрагменти или екскреции.

Оптималните условия за ферментация за висят от вида на прилагания микроорганизъм, от използваната хранителна среда, от времето на ферментация, от вида и количеството на съдържащия елицитори материал и др.п. Те трябва за всеки единичен случай да бъдат проучени в предварителни опити, каквито са познати на всеки специалист.

За получаването на инактивираните, съдържащи елицитори микроорганизми, същите се култивират при обичайните условия, след което чрез центрофугиране или филтриране се отделят от културалния бульон, по желание се промиват и повторно се изолират. За инактивиране на микроорганизмите могат да бъдат прилагани различни методи.

Възможните методи за инактивиране се състоят в следното-върху тези организми да се въздейства с типични клетъчни отрови, като етиленови оксиди, формалдехид, озон, живачни съединения, органични разтворители, като метанол, етанол или ацетон или пък микроорганизмите да се инактивират чрез загряване от 90 до 140°С посредством въздействие на крайни разлики в налягането /дезинтеграция/, чрез въздействие на високофреквентни електрически полета или чрез УВ-облъчване, облъчване с гама-лъчи или въздействие с ултразвук. Условията, при които може да бъде проведено инактивирането, са добре известни на всеки специалист /K.H.Wallhauser, H.Schmidt: Sterilisation, Desinfektion, Konservierung, Chemotherapie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart /DE, 1967/.

Фрагменти от съдържащи елицитори микроорганизми могат например да се получат чрез лизиране на микроорганизмите посредством въздействие на осмотичен шок или температурен шок, чрез автолиза на микроорганизмите, чрез обработка на клетките с ултразвук или чрез стриване на микроорганизмите със стъклени перли, стъклен прах или кварцов пясък и последващо диференцирано центрофугиране /Hughes, D.E.Wimpenny, J.W.T. and Lloyd, D: The disintegration of micro-organisms. In: Methods in Microbiology, vol 13 (Norris, J.R.and Ribbons. D.W., eds) /pp.154, Academic Press, New York, London 1971/.

От тези клетъчни фрагменти могат например да се изготвят чрез обработка с трипсин пречистени фракции от клетъчни стени. Споменатите вече и използваните в следващите по-долу примерни изпълнения са изгот вени по описаните от Schleifer u Kandler методи /Arch. Microbiol. 57, 1967, 335-365/.

От друга страна също така е възможно получаването на съдържащи елицитори преципитати от водоразтворими клетъчни съставки чрез утаяване например с етанол или ацетон /Kocourek, J.and Ballou, С.Е., J. Bacteriol, 100, 1969, 1175-1181/.

Екскрекции на съдържащи елицитори микроелементи са активно отделени чрез лизиране, екстрахиране с надкритични втечнени газове /напр.въглероден диоксид/ или гореща стерилизация на клетки в съдържащи вода клетъчни съставки, водоразтворими или получени чрез филтриране или центрофугиране на съдържащия организмите културален бульон. Същите могат при нужда да бъдат пречистени по-нататък, например чрез екстрахиране на липофилни вещества, адсорбция на силно багрещи вещества и пр.

Приложението на свободните от ензими, съдържащи елицитори продукти от бактерии за повишаване продуктивността на синтезиране на ингредиенти от по-висши растения е доказано експериментално. Това може да бъде от полза евентуално за приложението на растителни клетъчни култури за изготвяне на активни лекарствени вещества /M.H.Zenk в: Pharmazie heute, 103, 1982, vol 3, 131-138/. По принцип може съдържащият елицитори продукт от бактерии да служи и за повишаване продуктивността на синтезата на ингредиенти в култури от животински или човешки тъкани или клетки, или би могло да намери приложение в терапията - като например при лечение на рани.

Примери за изпълнение на изобретението

Следващите примери поясняват изобретението.

Пример 1. Стимулиране на синтезата на багрилни компоненти /актинородин, продигиозин/ при Streptomyces lividans /ATCC 19844/ чрез препарати от клетъчната стена.

ml от хранителна среда, състояща се от: 103 g захароза, 10g глюкоза, 10,12 g магнезиев хлорид хексахидрат, 0,25 g калиев сулфат, 0,1 g casaminoacids /Difco Labs, Detroit, USA/ и

800 ml дестилирана вода, се стерилизират /20 min, 120°С/ и се добавя към следните прясно приготвени разтвори: 1 ml 0,5 %-ен разтвор на калиев дихидрогенфосфат, 8 ml 3,68 %-ен разтвор на калциев хлориддихидрат, 1,5 ml 20 %-ен разтвор на L-пролин, 10 ml 5,73 %-ен TES-буферен разтвор /рН 7,2/, 0,2 ml разтвор от микроелементи, съдържащ на литър 40 mg цинк /П/-хлорид, 200 mg железен /111/-хлоридхексахидрат, 10 mg меден /П/-хлориддихидрат, 10 mg манганов /П/-хлоридтетрахидрат, 10 mg дихидрат на динатриев тетраборат, 10 mg тетрахидрат на хексаамониев хептамолибдат, 0,5 ml ΙΝ-натриев хидроксид.

По 1,8 ml от тази хранителна среда се поставят при стерилни условия в 24 ямки с вместимост съответно по 3 ml на полистиролово блюдо /Multidish, Fa. Nunc, 6200 Wiesbaden 12/. По 2 mg от изпитваните за съдържание на елицитори препарати от клетъчната стена се дестилират в двойно дестилирана вода 20 min при 120°С и получените суспензии се прибавят към ямките. В две от ямките не се прибавят тези добавки, като същите служат за контрола. Във всички ямки обемът се регулира еднакво с двойно дестилираната вода, стерилно, до 2 ml. Всяка ямка се заразява идентично с 5 ml от суспензия на Streptomyces lividans /ATCC 19844/ при стерилни условия. Инкубацията на заложените опити се извършва аеробно / Клатачна машина на Tablar, 100 оборота в минута/ при 26°С.

След 96 h клетките се центрофугират, промиват се с физиологичен разтвор на готварска сол, изсушават се над калциев хлорид във вакуум и по този начин се получава посоченият в таблицата добив на клетки. Получените при центрофугирането горни слоеве се нагласят до pH-стойност 7, разреждат се до 4 ml с вода и се определят абсорбционните им спектри между 180 и 800 nm. Относителните количества на синтезираните разтворени вторични вещества актинородин и продигиозин се определят приблизително чрез премерване на абсорбционния връх на автоматично зарегистрираните спектри.

В следващата таблица 3 са показани получените в тази опитна поредица резултати.

Таблица 3

Изпитвани клетъчни стени на бактерии от	Добив на сухи клетки /mg/	Съдържание на багрила-относит.абсорбционни единици
ohne (Kontrolle)	22	1
В. ammoniagenes (ATCC 6872)	25	38
В. glutamingenes (ATCC 13747)	32	24
Ba. pumilus (ATCC 7061)	34	2
B. linens (ATCC 19391)	23	1
C. diphtheriae (Mass. 8)	24	34
C. melassecola (ATCC 17965)	26	34
C. glutamicum (ATCC 13032)	43	50
C. lilium (ATCC 15990)	33	40
Ce. cellasea (ATCC 14359)	36	2
L plantarum (DSM 20174)	32	31
S. aureus Stamm H	44	1
B = Brevibacterium Ba= Bacillus C = Corynebacterium Ce= Cellulomonas L = Lactobacillus S = Staphylococcus

Пример 2. Стимулиране синтезата на багрилни компоненти /актинородин, продигиозин/ при Streptomyces lividans /ATCC 19844/ чрез екстракти от клетъчни стени.

При условията, посочени в пример 1, но при употреба на стерилни филтрати от стерилизирани в двойно дестилирана вода 20 min при 120°С-2 mg препарати от клетъчни стени, се постига почти еднакво силно стимулиране на образуването на багрилни вещества при Streptomyces lividans /ATCC 19844/, както при използването на суспензии от тези стерилизирани клетъчни стени.

Пример 3. Стимулиране на синтезата на багрилни компоненти /актинородин, продигиозин/ при Streptomyces lividans /ATCC 19844/ чрез клетъчни екстракти.

При условията, на пример 2, но при употреба на по 20 mg клетъчна маса вместо 2 mg препарати от клетъчна стена се постига почти същата стимулация на образуването на багрилни вещества, както при употреба на суспензии от стерилизирани клетъчни стени.

Пример 4. Стимулиране на синтеза на багрилни компоненти при Streptomyces coelicolor АЗ/2/, респ. /АТСС 13 405/.

При условията на пример 1, но при употреба на Streptomyces coelicolor АЗ/2/ се постига значителна стимулация на образуването на багрилни вещества /вероятно също така актинородин/ при тези бактерии.

Пример 5. Стимулиране на синтеза на багрилни компоненти при Streptomyces griseoruber /DSM 40275/.

При условията на пример 1, но при употреба на Streptomyces griseoruber /DSM 40275/ се постига също така значително повишение на образуването на багрилни вещества /вероятно антрациклин-антибиотика/.

Пример 6. Стимулиране на синтеза на багрилни компоненти при Streptomyces purpurascens /DSM 40310/.

При условията на пример 1, но при употреба на Streptomyces purpurascens /DSM 40310/ се постига също така силно повишение на образуването на багрилни вещества / вероятно антрациклин-антибиотика/.

Пример 7. Стимулиране на синтеза на багрилни компоненти при Streptomyces latericius /DSM 40163/.

При условията на пример 1, но при употреба на Streptomyces latericius /DSM 40163/ се постига също така значително повишение на образуването на багрилно вещество.

Пример 8. Стимулиране на синтеза на багрилни компоненти при Streptomyces violaceus /DSM 40082/.

При условията на пример 1, но при употреба на Streptomyces violaceus /DSM 40082/ се постига също така значително повишение на образуването на багрилно вещество.

Пример 9. Стимулиране образуването на бета-лактамни антибиотици /цефалоспорини, пеницилин N/ чрез Streptomyces clavuligerus / ATCC 27064/.

g 3-/1Ч-морфолино/-пропансулфонова киселина /MOPS/, 3,5 g дикалиев хидрогенфосфат, 0,6 g хептахидрат на магнезиев сулфат, g L-аспарагин, 10 g глицерин, 1 g екстракт от дрожди /Oxid, Wesen, DE/, 1 ml разтвор на соли на микроелементи - съдържащи на литър 1 g железен /II/ сулфат хептахидрат, 1 g манганов /П/-хлорид тетрахидрат, 1 g цинкхлорид хептахидрат, 1 g калциев хлорид, се доливат с вода до 1 1 и се стерилизират /20 min, 120°С/.

По 1,8 ml от този хранителен разтвор се поставят при стерилни условия в ямки с обем ml на стерилно полистиролово блюдо /Multidish; Fa Nunc, 62 Wiesbaden 12/. Прибавят се по 2 mg от изпитваните за елициторна активност препарати на клетъчни стени или 10 mg от изпитваните клетки във вид на стерилизирани в двойно дестилирана вода / 20, респ. 45 min при 120°С/ хомогенна суспензия. В две от ямките, които служат за контрола, не се поставят добавки. Във всички ямки след това обемът се нагласява еднакво с двойно дестилирана вода стерилно на 2 ml. Всяка ямка се инокулира идентично с 5 ml от суспензия със спори от Streptomyces clavuligerus /АТСС 27064/.

Инкубацията на опитната поредица се провежда при аеробни условия /Клатачна ма шина на Tablar, 160 оборота в минута/ при 26°С. Инкубационното време е 24-48 h.

Образуването на антибиотик се изпитва в сравнение с контролите с помощта на пластинков дифузионен тест. Суспендираните в софт-хранителен агар детекторни организми са Micrococcus luteus, респ.Bacillus subtilis /10⁶клетки на ml/. Върху стандартни филтрови пластинки /0,9 cm диаметър/ се прилагат съответно по 25 ml центрофугиран /48.000 х g/ културален бульон от опитните камери. След дифузионно време от 4 h при 4°С биотестът се инкубира за 24 h при 30°С.

При културите, които са инокулирани при прибавяне на умъртвени Brevibacterium flavum АТСС 13826, или от препарати от клетъчни стени на тази бактерия, респ. от препарати от клетъчни стени на Corynebacterium diphtheriae/ щам Mass.8/, показват недвусмислено увеличени инхибирани площи, в сравнение с контролите, увеличено образуване на бета-лактамния антибиотик /пеницилин N, цефалоспорини/ чрез Streptomyces clavuligerus.

Пример 10. Стимулиране образуването на алкалоиди /сангвинарин, маркапин и хелеритрин/ чрез Eschscholtzia californica.

В 24 1-милиметрови ямки на полистиролово блюдо /Fa.Nunc, 6200 Wiesbaden 12/ се инокулират, при описаните от J.Berlin et al./Z.Naturforsch., 38 с, 1983, 346-352/ като оптимални, условия съответно тъканни култури от Eschscholtzia californica. Една от ямките се оставя без прибавка и служи като контрола, в една от камерите се поставят 266 ml/1 екстрахиран на горещо и утаен с етанол дрождев елицитор /получен по Kocourek J.and Ballou, С.Е., J.Bacteriol. 100, 1969, 1175-1181/, в останалите се поставят по 266 mg/1 препарати от клетъчни стени на бактериите, които са посочени в таблица 3. След това културите се инкубират в продължение на 72 h при 24°С и тогава се определя съдържанието на алкалоиди в културите фотометрично, при което индуцираното от дрождевия елицитор алкалоидни съдържание се определя като 100 %.

В следващата таблица 4 са показани получените в тази поредица от опити резултати.

Таблица 4

Изпитвани бактериални клетъчни стени	Елициторна активност в %
Brevibacterium butanicum ATCC 21196	19
Brevibacterium flavum ATCC 13826	16
Brevibacterium flavum ATCC 14067	30
Brevibacterium glutamingenes ATCC 137	113
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13655	43
Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872	40
Corynebacterium hydrocarboclasturn ATCC 15592	8
Corynebacterium nephridii ATCC 11425	123
Corynebacterium paurometabolum ATCC 8368	16
Corynebacterium lilium ATCC 15990	108
Corynebacterium striatum ATCC 6940	17
Corynebacterium petrophilum ATCC 19080	0
Corynebacterium xerosis ATCC 373	102
Corynebacterium diphtheriae Stamm Mass. 8	137
Rhodococcus fascians ATCC 12975	27
Rhodococcus fascians 1	11
Isolat von Prof. Dr. Stolp,Univ.Bayreuth
Rhodococcus fascians 2	7

Пример 11. Стимулиране образуването на индолови алкалоиди /валезиакотамин/ в култури от Rauvolfia serpentina.

Суспензия на култура от Rauvolfia serpentina /Stockigt, J., A.Pfitzner and J.Firl, Plant Cell Rep.l, 36-39 /1981/ се култивира в среда Linsmaier u Skoog /LS/-cpefla /Physiol. Plantarum 18, 100-127 /1965/ в ротационни клатачни апарати /100 оборота в минута/ при 23°С и постоянна светлина /600 1х/. За образуването на елицитори се инокулират 200 g клетъчно прясно тегло /на литър LS-среда. Като съдържащи елицитори фрагменти от микроорганизми се използват препарати от клетъчни стени на посочените в таблица 4 бактерии в концентрация от 130 mg/ί среда.

След инкубационно време от 5 дни както в елициторните култури, така и в контролите, клетъчната маса се е удвоила. Клетките се събират и се екстрахират с метанол.

Количеството на индоловия алкалоид валезиакотамин се определя при HPLC-разделяне на екстрактите. Докато нетретираните контролни култури съдържат само 1,16 mg/1 среда, добивът на елицитираните култури е максимално 58 mg/ί. Това отговаря на 50 пъти повишение посредством елициторите.

Пример 12. Стимулиране активността на 17-кетостероид-редуктазата на Rhodotorula glutinis 1FO 0389.

а/ 2-литрова ерленмайерова колба, съдържаща 500 ml стерилна хранителна среда, съдържаща 5 % глюкозо-монохидрат, 2 % царевичен екстракт, нагласена до pH 6,5, се посява на щрих върху полегат агар от култура на Rhodotorula glutinis IFO 0389 и се отглежда h при 30°C със 190 оборота в минута.

б/ 500 - милилитрова ерленмайерова колба със 100 ml стерилна хранителна среда, съдържаща 1 % царевичен екстракт, 5 % Nurupan R /производител Nurupan GmbH, 4000 Dusseldorf 1 DE/, нагласена при pH 6,2, се инокулира с 10 ml от получената съгласно пример 12а Rhodotorula-посевна култура и се отглежда Ί h при 30°С и 180 оборота в минута.

След това към културата се прибавят 10 mg 3-хидрокси-1,3,5/ 10/,7-естратетраен-17-он и се оставя още 210 h да ферментира. След това културата се екстрахира с метилизобутилкетон, екстрактът се сгъстява и полученият суров продукт се пречиства чрез хроматография на колона от силикагел. По този начин се получават 5,9 mg 1,3,5/10/,7-естратетраен-3,17алфа-диол, което е 59 % от теоретичното.

с/ При условията на пример 126 ферментират 10 mg 3-хидрокси-1,3,5/10/,7-естратетраен-17-он с култура от Rhodotorula glutinis, но с тази разлика, че към тази култура непосредствено преди прибавянето на субстрата, се добавят 5 ml стерилна суспензия от 50 mg препарати от клетъчни стени от Bacillus licheniformis /АТСС 9945/ във вода. След обработването на културата се получават 6,8 mg 1,3,5/10/,7-естратетраен-3,17-диол=68 % от теоретичното.

Пример 13. Стимулиране активността на стероид-Δ '-дехидраза от Bacillus lentus /АТСС 13805/.

а/ Двулитрова ерленмайерова колба с 500 ml стерилен хранителен разтвор, съдържащ 0,5 % царевичен екстракт, 0,05 % монохидрат на глюкоза, 0,1 % екстракт от дрожди, нагласен до pH 7,0, се инокулира с измит чрез декантиране Bacillus lentus /АТСС 13805/ и разклащан в продължение на 48 h при 30°С със 190 оборота в минута.

б/ 500 милилитрова ерленмайерова колба със 100 ml стерилен хранителен разтвор, съдържащ 3 % соя на прах, 0,5 % царевичен екстракт, 0,1 % дрождев екстракт, 0,05 % монохидрит на глюкозата, нагласен до pH 7,3, се инокулира с 10 ml от Bacillus lentus-предварителна култура и се разклаща в продължение на 7 h при 30®С със 180 оборота в минута. Тогава към културата се прибавя стерилно-филтриран разтвор от 40 mg 6α, 9а-дифлуор-11Р,18а-дихидрокси-16-а-метил-4-прегнен-3,20-дион в 4 ml диметилформамид и инкубирането продъл жава още 41 h.

След това културата се екстрахира с метилизобутилкетон, сгъстява се екстрактът във вакуум и остатъкът се пречиства чрез хроматография на колона от силикагел. Така се получават 16 mg 6α, 9а-дифлуор-11β, 17а-дихидрокси-16а-метил,1,4-прегнадиен-3,20-дион /=40 % от теоретичното/.

с/ При условията на пример 136 ферментират 40 mg 6α, 9а-дифлуор-11β, 17а-дихидрокси-16а-метил-4-прегнен-3, 20-дион с култура от Bacillus lentus, но с тази разлика, че тази култура непосредствено преди прибавянето на субстрата към нея се прибавят във вода 5 ml стерилна суспензия от 50 mg препарат от клетъчни стени на Corynebacterium diphtheriae /щам Mass.8/. След отработването на културата се получават 21 mg 6α, 9а-дифлуор-11β, 17а-дихидрокси-16а-метил-1,4-прегнадиен3,20-дион /=52,5 % от теоретичното/.

Пример 14. Стимулиране образуването на алкалоиди /амид на лизерговата киселина и амид на изолизерговата киселина/ от Claviceps paspali /АТСС 13895/.

а/ 500 милилитрова ерленмайерова колба с 50 ml стерилен хранителен разтвор, съдържащ 4 % сорбит /технически чист/, 1 % глюкозо-монохидрат, 2 % янтарна киселина, 0,6 % амониев сулфат, 0,5 % дрождев екстракт /Difco® на Difco Labs. Detroit, USA/, 0,1 % калиев дихидрогенфосфат, 0,03 % магнезиевсулфат хептахидрат, нагласени с натриев хидроксид до pH 5,2, се инокулира с дълбокозамразена до -70°С култура от Claviceps paspali /АТСС 13895/ и се разклаща в продължение на 5 дни при 24°С и 240 оборота в минута.

б/ 500 милилитрова ерленмайерова колба с 50 ml стерилен хранителен разтвор, съдържащ 8 % сорбит /технически чист/, 6 % янтарна киселина, 0,9 % амониев сулфат, 0,1 % калиево-нитратен тетрахидрат, 0,05 % дикалиев хидрогенфосфат, 0,03 % магнезиевсулфат хептахидрат, 0,02 % дрождев екстракт /Difco * на Difco Labs, Detroit, USA/,0,0007 % хептохидрат на железен /П/-сулфат, 0,0006 % хептахидрат на цинков сулфат, нагласен с натриев хидроксид до pH 5,2, се инокулира с 5 ml предкултура от Claviceps paspali и се разклаща в продължение на 250 h при 24°С при 240 оборота в минута.

След това към културата се прибавя толкова натриев хидроксид докато се получи ми11 нимум pH-стойност 10, екстрахира се с метилизобутилкетон, сгъстяват се екстрактите под вакуум и се пречистват чрез хроматографията на колона от кизелгел.

Получават се по този начин смес от амид на лизерговата киселина и амид на изолизерговата киселина /добив 700 mg/1 култура/.

с/ При условията на пример 14б се инокулира култура от Claviceps paspali, но е тази разлика, че към културата се прибавят след 72 h, 5 ml стерилна суспензия от 25 mg препарат от клетъчни стени от Lactobacillus casei subsp. rhamnosus /ATCC 7469/ във вода. След обработка на културата се получават 45 mg смес от амид на лизерговата киселина и амид на изолизерговата киселина /добив 900 mg/1 култура/.

Пример 16. Стимулиране активността на 15а-хидроксилаза на Penicillium raistrickii /ATCC 10490/.

Двулитрова ерленмайерова колба с 500 ml стерилна хранителна среда, съдържаща 3 % монохидрат на глюкоза, 1 % царевичен екстракт, 0,2 % натриев нитрат, 0,05 % магнезиевсулфат хептахидрат, 0,05 % калиев хлорид, 0,002 % хексахидрат на железен /П/-сулфат, 0,1 % калиев дихидрогенфосфат, 0,2 % дикалиев хидрогенфосфат, нагласени до pH 6,0, се посява на щрих върху полегат агар от култура на Penicillium raistrickii /ATCC 10490/ и се култивира в продължение на 48 h при 30°С със 180 оборота в минута.

б/ 500 милилитрова ерленмайерова колба със 100 ml стерилна хранителна среда, съдържаща 1 % царевичен екстракт, 3 % монохидрит на глюкоза, 0,1 % калиев дихидрогенфосфат, 0,2 % дикалиев хидрогенфосфат, 0,05 % магнезиевсулфат хептахидрат, нагласен до pH 6,0, се инокулира с 10 ml е приготвената съгласно а/ пеницилинова предкултура.

След това към културата се прибавят 300 mg 13-етил-4-гонен-3,17-дион и ферментира 120 h при 30°С със 180 оборота в минута.

После културата се екстрахира с метилизобутилкетон, сгъстява се екстрактът и полученият суров продукт се пречиства чрез хроматография на колона от силикагел. Получават се по този начин 100 mg 1 З-етил-15а-хидрокси-4-гонен-3,17-дион.

с/ При условията на пример б/ ферментират 300 mg 13-етил-4-гонен-3,17-дион с култура от Penicillum raistrickii, но с тази разлика, че към тази култура се прибавят непосредст вено преди прибавянето на субстрата 5 ml от стерилна суспензия, която съдържа 50 mg от препарат на клетъчни стени от Corynebacterium diphtheriae /щам Mass.8/ във вода. След обработването на културата се получават 210 mg 1 З-етил-15а-хидрокси-4-гонен-3,17-дион.

Claims

Патентни претенции

1. Метод за повишаване ензимните активности и синтезната продуктивност на организми, характеризиращ се с това, че същите се поставят в контакт с инактивирани, съдържащи елицитори, микроорганизми, фрагменти от същите или екстракти от съдържащи елицитори микроорганизми, при условие, че за повишаване ензимната активност и синтезната продуктивност се използват немикробиални организми на инактивирани, съдържащи елицитори, бактерии, фрагменти от същите или екскреции от съдържащи елицитори бактерии.
2. Метод за повишаване ензимните активности и синтезната продуктивност на микроорганизми съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че същите се поставят в контакт с инактивирани съдържащи елицитори микроорганизми, фрагменти от същите или екскреции от съдържащи елицитори микроорганизми.
3. Метод за повишаване синтезната продуктивност на микроорганизми съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че способни да образуват багрилно вещество, алкалоиди или антибио-тици, бактерии, гъби или дрожди се поставят в контакт с инактивирани, съдържащи ели-цитори, бактерии, гъби или дрожди, фрагменти от същите или екскреции от тези микро-организми.
4. Метод за повишаване ензимната активност на микроорганизми съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че способни да трансформират стероидите бактерии, гъби или дрожди се поставят в контакт с инактивирани, съдържащи елицитори, бактерии, гъби или дрожди, фрагменти от същите или екскреции от тези микроорганизми.
5. Метод за повишаване синтезната продуктивност на организми съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че клетъчни култури от способни за синтез на багрилни вещества, алкалоиди или фитоалексини по-висши расте12 алкалоиди или фитоалексини по-висши растения сс поставят в контакт с инактивирани, съдържащи елицитори, бактерии, фрагменти от същите или екскреции от тези бактерии.
6. Метод за повишаване ензимните активности и синтезната продуктивност на мик роорганизми съгласно претенция 1 до 5, характеризиращ се с това, че същите се поставят в контакт със стерилизирани на горещо във вода, съдържащи елицитори, микрооргани5 зми, или с филтрати от същите.