PT89427A

PT89427A - Processo para o aumento da actividade enzimatica e do poder de sintese de organismos

Info

Publication number: PT89427A
Application number: PT89427A
Authority: PT
Inventors: Franz Fiedler; Meinhart H Zenk; Heidrun Gundlach; Alfred Weber; Marion Kennecke
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 1988-01-13
Filing date: 1989-01-12
Publication date: 1990-02-08
Also published as: ES2051894T3; EP0354945A1; IL88953A0; AU3215989A; NO893643L; DE3801023A1; FI97302B; JPH02502881A; CN1034756A; DE58907274D1; ATE103325T1; BG89739A; EP0354945B1; FI97302C; DK442289A; HU208341B; PT89427B; IE890079L; IE66500B1; FI894304A0

Description

ί*\REQUERENTE: EPÍGRAFE:

DESCRIÇÃO DA PATENTE DE INVENÇÃO N.° 89 427

SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, com se de em Berlim e Bergkamen (endereço postal: 170-178 Mullerstrasse, Berlin 65), RepúbTi ca Federal Alemã. " PROCESSO PARA O AUMENTO DE ACTIVIDADE EN ZIMATICA E DO PODER DE SlNTESE DE ORGANIS MOS INVENTORES: Prof. Dr. Franz Fiedler, Prof. Dr. Mei - nhart H. Zenk Dipl.-Biol. Heidrun Gundlach, Dr. Alfred Weber e Dr. Marion Kennecke.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883. República Federal Alemã, em 13 de Janeiro de 1988, sob ο η*. P 38 01 023.2

I INP1. MOO 113 RF 10732

Memória descritiva referente à patente de invenção de SCHERING AK-TIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em Berlim e Bergkamen (endereço postal: 170-178 Mullerstrasse, Berlin 65), República Federal Alemã, (inventores: Prof. Dr. Franz Fiedler, Prof. Dr. Meinhart H. Zenk Dipl.-Biol. Hei-drun Gundlach, Dr. Alfred Weber e Dr. Marion Kennecke, residentes na Alemanha Ocidental), para: 11 PROCESSO PARA 0 AUMENTO DA ACTIVIDADE EN-ZIMÁTICA E DO PODER DE SÍNTESE DE ORGANISMOS”.

Memória descritiva A presente invenção refere—se a um processo para o aumento da actividade enzimática e do poder de síntese de organismos, o qual é caracterizado pelo facto de se porem em contacto os mesmos com microorganismos inactivados contendo elicia dores, com fragmentos dos mesmos ou com excreções de microorganismos contendo eliciadores, com a condição de, para o aumento da actividade enzimática e do poder de síntese de organismos nãc microbianos, se utilizarem bactérias inactivadas contendo elicia dores, fragmentos dos mesmos ou excreções de bactérias contendo eliciadore s.

Os eliciadores são, como se sabe, substâncias ac-tivas de origem microbiana ou vegetal que são postas em contac-

to com tecidos de plantas superiores e cuja actividade enzimáti-i ca e poder de síntese aumentam. As substâncias internas assim

I acumuladas nestas plantas, quando são anti-microbianas, são de- i signadas por fitoalexinas. j

Presentemente foram já isolados a partir de di- | versas espécies vegetais mais do que 100 compostos que satisfazem à definição de fitoalexinas. Pertencem a diversos grupos de substâncias naturais, tais como terpenoides, derivados de ácido linolenico, acetilenos e poliacetilenos, bibenzileno, estilbe-nos, fenantrenos e dihidrofenantrenos, benzofuranos e fenolbenzo furanos, furocumarinas, avenaluminas, flavanos, fenilbenzofura- | nos, benzoxazinonas, alcaloides, isoflavonoides (Brooks e Watson, Nat. Prod. Reports 2_t 1985t 427).

Esta acção dos aliciadores não teve uma aplicação técnica durante muito tempo. Este facto tem várias justifica ções: abstraindo de raras excepções, durante muito tempo não foi possível multiplicar células de plantas superiores em condições í |economicamente significativas, em culturas submersas. Os elicia-^lores incorporados na fermentação por meio de microorganismos pareciam a priori ser desprovidos de qualquer finalidade, visto que, de acordo com a doutrina predominante sobre o modo de acção dos eliciadores (Albersheim* Spectrum der Wissenhafcen, 11. 1985, 85) deveria depreender—se que estes não influenciam a acti^ vidade enzimática e o processo do metabolismo em microorganismos. έ de notar também que de acordo com a doutrina prevalecente, as bactérias só podem desencadear uma formação de ! [fitoalexinas em plantas libertando das paredes celulares da plantas eliciadores por meio de determinados enzimas que, como elicia iores endógenos, estimulara a formação de fitoalexinas.

Descobriu—se agora que os compostos e as preparações celulares que serão designados adiante como eliciadores, estão surpreendentemente em condições de aumentar a actividade enzimática e o poder de síntese em microorganismos. Descobriu-se ainda que existem também bactérias que contêm eliciadores que aão são enzimas nem factores nutritivos. i; É evidente para os especialistas que em regra é 2

bastante custoso isolar ou sintetizar os próprios eliciadores para utilizá-los então para influenciar o metabolismo de outros organismos. Basta todavia, em regra, utilizarem-se microorgan^s mos inactivados contendo eliciadores, ou fragmentos destes mi-croorganismos, como por exemplo fracções de paredes celulares, fragmentos de células desagregadas mecanicamente, ou células hi^ drolisadas química ou enzimaticamente, ou substâncias contidas nas células precipitadas por meio de substâncias auxiliares, co mo por exemplo etanol ou acetona.

Se o microorganismo liberta eliciadores na calda de cultura, ou se depois da hidrólise ou esterilização forma substâncias celulares solúveis em água contendo eliciadores, p£ de-se também então utilizar estas excreções do microorganismo contendo eliciadores para a realização do processo de acordo com a invenção.

Os microorganismos dos quais se sabe que possuem eliciadores são, entre outros, os fungos e leveduras que figuram no quadro X adiante: em alguns ensaios apropriados foram ensaiados preparados de paredes celulares, purificados proteoliticamente por meio de trijD sina, de estirpes de bactérias gram-positivas das espécies Ba-cillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Cellulomonas, Lactoba-cillus Pimelobacter, Rhodococcus e Staphylococcus e de microorganismos, esterilizados por fervura em água, destas mesmas espécies, e dos seus filtrados, quanto ao facto de possuírem ou não eliciadores. No quadro 2 adiante estão indicadas as estirpes das bactérias nas quais foi possível comprovar a presença de eliciadores . = 3 = !\

1

Quadro

Alternaria carthami

Botrytis cinerea (ATCC

Ceratocystis fimbriata Ceratocystis ulmi Chondrostereura purpureum

Cladosporium fulvum (ATCC 44961)

Colletotrichum lindemuthianum (ATCC 52471)

Fusarium solani

Fusarium solanifspmori (ATCC 44-934)

Ganoderma applanatum Glomerella cingulata

Helmithosporium carbonum (ATCC 24962)

Monilinia fructicola

Nectria haematococca Phoma exigua Phytophthora cannabivora

Phytophthora capsici (ATCC 52771)

Arch. Bioch. Biop. 229. 1984, 136

Physiol. Plant Pathol. 11« 1977, 287

Phylochemistry 2_2, 1984, 759

Phytochemistry 2_2., 1984, 383 J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 1984, 14341

Physiol. Plant Pathol. 16. 1980, 391

Eur. J. Biochem. 129. 1983, 593

Plant Physiol. j6» 1984, 833 Nat. Prod. Rep. 2, 1985, 439

Phytochemistry 22, 1983, 1039

Physiol. Plant. Pathol. 21. 1982, 171 Z. Naturforsch. Sect. C 38. 1983, 899 J. Am. Chem. Soc., 84. 1962, 1919

Phytochemistry 2j2, 1983, 2291

Phytochem. 21, 1982, I8l8 Z. Naturf. Sect. C. 22.* 1984, 217

Physiol. Plat. Pathol. 18. 1981, 379 .= 4 =

Quadro 2

Bacillus licheniformis ATCC 9945 Brevibacterium butanicum ATCC 21196 Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 140Ó7 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13655 Brevibacterium glutamingenes ATCC 13747 Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 Brevibacterium pumilus ATCC 706l Corynebacterium hydrocarboclastum ATCC 1559^ Corynebactarium nephridii ATCC 11425 Corynebacterium paurometabolum ATCC 8368 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium striatum ATCC 6940 Corynebacterium xerosis ATCC 373

Corynebacterium diphtheriae (estirpe Mass. 8/Behring Werke)

Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Corynebacterium glutamicum ATCC 1303^

Corynebacterium uratoxldans ATCC 21749 Lactobacillus casei subsp. rhamnosus ATCC 7469 Lactobacillus plantarum DSM 20174 Pimelobacter tumescens AJ l46o Rhodococcus fascians ATCC 12975

Rhodococcus fascians 1 - Isolado do Prof. Dr. Stolp, Univ. Bayreuth

Rhodococcus fascians 2 — Isolado do Prof. Dr. Stolp, Univ. Bayreuth = 6 =

ção de antibióticos ^-lactame de Streptomyces calvuligerus e a síntese de alcaloides de Claviceps paspali. Este aumento assim verificado do poder de síntese dos microorganismos não poderia ser conseguido apenas por meio de preparações de paredes célula res das bactérias enumeradas no quadro 2, pelo que é lícito esperar-se também que por meio de fungos e leveduras contendo com postos eliciadores, tais como os que estão indicados no quadro 1, seja igualmente possível conseguir-se um aumento das activi-dades enzimáticas e do poder de síntese de microorganismos.

Conseguiu-se também um significativo aumento da formação de alcaloides, com auxílio de preparações de paredes celulares dos microorganismos que figuram no quadro 2, em culturas celulares de plantas superiores como por exemplo Eschs-choltzia californica ou Rauvolfia serpentina.

Com auxílio destas preparações de paredes celulares conseguiu-se também aumentar nitidamente a capacidade de Bacillus lentus desidrogenar esteroides na posição 1,2, e a capacidade de Rhodoturula glutinis reduzir selectivamente 17-ce-toesteroides, e a capacidade de Penicillium raistrickii hidroxi-larem esteroides na posição 15o( · Apenas não teve êxito até ao presente o ensaio, com auxílio de preparações de paredes de celulares, da capacidade de Curvularia lunata para aumento da Ιΐβ--hidroxilação de esteroides.

Estes ensaios permitem alimentar a esperança de que seria possível também, com auxílio do processo de acordo com a invenção, estimular a formação de uma grande diversidade de outras substâncias de origem microbiana utilizáveis pelos tecidos e reforçar outras actividades enzimáticas dos microorganis mos que sejam tecnicamente úteis.

Estas substâncias microbianas próprias são por exemplo antibióticos como as penicilinas, cefalosporinas, ciclos porinas, actinomicinas, gramicidinas, neomicina, gentamicina, istatina, tetraciclina, nicomicina ou a licomicina, a eritromi-cina, o cloranfenicol, a griseofulvina ou o ácido fusidínico, etc, alcaloides da cravagem, como a ergocriptina, a ergotamina, . a ergosina, a ergocristina, a ergocornina, a agroclavina, a cano = 8 =

clavina, a festuclavina, o ácido paspálico ou os derivados de ácido lisergico, vitaminas como a vitamina B12, a riboflavina ou a β-carotina, enzimas como as amilases, glucoseisomerages, proteases, pectinases, lipases, penicilinacilases ou a lactase, nucleósidos como o ácido guanílico ou o ácido inosílico, ou por exemplo também aminoácidos como a cisteina, o ácido glutâmico, o triptofano ou a lisina.

Os microorganismos que devido à sua activida-de enzimática podem ser tecnicamente utilizados são por exemplo aqueles que causam transformações de esteroides como a lle< , 11β ou 15 *( -hidroxilação, a Δ^-deshidrogenação, a 17d( , 17 β --cetoreduções ou a degradação de cadeias laterais da esterinas, ou transformações em antibióticos, como a dissociação da penici. lina.

Na verdade, com auxílio do processo de acordo com a invenção foi possível descobrir-se novas substâncias próprias microbianas utilizáveis tecnicamente, como por exemplo no vos antibióticos, adicionando-se aos microorganismos ensaiados microorganismos inactivos contendo eliciadores. Esta descoberta não era pais de previsão fundamentada, visto que se sabe que inúmeras plantas superiores só produzem fitoalexinas em quantidade apreciável se forem infectadas com microorganismos contendo eliciadores. A realização do processo de acordo com a invenção, no que se refere à fermentação por meio de microorganis mos, não oferece qualquer problema aos especialistas. O microor ganismo cuja actividade enzimática ou cujo poder de síntese deve ser aumentado e cultivado em condições conhecidas; seguidamente adiciona-se à cultura os microorganismos inactivados contendo eliciadores, ou fragmentos dos mesmos, ou extractos celulares dos mesmos, ou excreções dos mesmos, e prossegue-se a fer mentação como habitualmente. A adição dos microorganismos inactivados, dos fragmentos ou extractos destes organismos ou das excreções de microorganismos contendo eliciadores, pode ser rea lizada logo no início da fermentação. 0 instante óptimo de adição e naturalmente dependente da natureza do microorganismo cul tivado, especialmente do andamento da sua fase exponencial de = 9 = crescimento, e tem de ser determinado em casos particulares. Assim, no caso de bactérias revelawse frequentemente muito conveniente realizar esta adição k a 30 horas depois do início da fermentação. No caso da adição de microorganismos inactivados ou de fragmentos dos mesmos, utiliza-se por metro cúbico da cal. da de fermentação habitualmente 1 a 1 000 g (de preferência 10 a 200 g) do microorganismo inactivado, ou 0,1 até 100 g (de pre ferencia 1 a 30 g) do fragmento deste organismo. No caso de se empregarem excreções de microorganismos contendo eliciadores é 3 então em regra suficiente utilizar por m do volume de fermenta ção 1 a 50 1 da solução de excreção. Se o processo de acordo com a invenção servir para elevar a actividade enzimática de um microorganismo que é empregue para transformação enzimática de substratos, começa-se a adição do substrato em regra O até 10 h depois de realizada a adição do microorganismo inactivado contendo eliciador ou dos seus fragmentos ou excreções.

As condições óptimas da fermentação são dita-I das pela natureza do microorganismo utilizado, das condições da ; fermentação, da natureza e quantidade do produto contendo elicdj. j dores, etc.j terão que ser determinados em casos particulares por ensaios prévios que são perfeitamente conhecidos de qualquer especialista.

Para a preparação do microorganismo inactivado contendo eliciadores estes são cultivados em condições correntes, seguidamente são separados por centrifugação ou filtração da calda de cultura, são eventualmente lavados e novamente isolados. Para inactivação dos microorganismos podem empregar-—se diversos processos.

Um método possível de inactivação consiste em fazer actuar sobre estes microorganismos venenos celulares tipi. cos, como óxido de etileno, formaldeído, ozono, compostos de mercúrio, dissolventes orgânicos tais como metanol, etanol ou acetona, ou exterminar os microorganismos por aquecimento a tem peraturas de 90 até l40° C por acção de diferenças extremas de pressão (desintegração) acção de campos eléctricos de alta fre-. quencia ou por radiação UV, radiação com raios gama ou a acção 10 =

de ultrassons. As condições nas quais pode ser realizada a inac tivação são perfeitamente conhecidas dos especialistas (K.H. Wallhauser, H. Schmidt: Sterilisation, Desinfektion, Konservie-rung, Chemotherapie, Edit. Georg Thieme, Estugarda (DE), 1967).

Os fragmentos de microorganismos contendo ©li. ciadores podem ser obtidos por exemplo por ólise dos microorganismos por acção de choque osmótico ou choque térmico, por autc> lise dos microorganismos, por tratamento das células com ultra^ sons ou por trituração dos microorganismos com esferas de vidro^ pó de vidro ou areia de quartzo e em seguida uma centrifugação diferencial (Hughes, D.E., Wimpenny, J.W.T. e Lloyd, D.: The disintegration of micro-organisms. In: Methods in Microbiology, Vol 13* (Norris, J.R. and Ribbons, D.W., eds.) pp. 1-54, Acade-mic Press, New York, Londres, 1971)· A partir destes fragmentos de células podem preparar-se por exemplo fracções de paredes celulares purificadas por tratamento com tripsina. As preparações de paredes celu lares já mencionadas e utilizadas nos exemplos de preparação adiante, foram preparadas de acordo com o processo descrito por Schleifer e Kandler (Arch. Mikrobiol. J2X, 1967, 335-305).

Todavia, é também possível, por outro lado, a partir de constituintes celulares solúveis em água, preparar precipitados contendo eliciadores por precipitação, por exemplo, com etanol ou acetona (Kocourek, J. e Bailou, C.E., J. Bacteriol. 100, I969, 1175-1181).

As excreções de microorganismos contendo eliciadores são constituintes celulares desactivados obtidos a par tir das células por ólise, "leaky machen", extracção com gases liquefeitos a temperaturas super-críticas (por exemplo dióxido de carbono) ou esterilização, ou caídas de culturas solúveis em água ou obtidas por filtração ou centrifugação dos organismos. Se necessário podem ser purificados de novo, por exemplo por ex tracção de substâncias lipófilas, absorção de substâncias corantes, etc.

De acordo com a invenção as bactérias conten— . do eliciadores, os fragmentos das bactérias ou excreções de bac 11

terias contendo eliciadores, inactivadas, podem também ser utilizados para aumentar a actividade enzimática e o poder de síntese em tecidos, culturas de tecidos ou culturas celulares de organismos superiores, tais como plantas, animais ou o homem. Já foi referido que a utilização de produtos das bactérias contendo eliciadores e isentos,de enzimas podia ser praticada experimentalmente para aumentar a potência de sín tese de substâncias próprias de plantas superiores; esta circunstância poderia eventualmente ter interesse para a utilização de culturas de células de plantas na preparação de substâncias activas para medicamentos (M.H. Zenk em: Pharmazie heute, 103. 1982, volume 3» págs. 131-138)· Basicamente afigura-se tam bém provável que os produtos de bactérias contendo eliciadores possam também ter aplicação para aumentar o poder de síntese de substâncias próprias em culturas de tecidos ou células animais ou humanas, ou que pudessem servir por exemplo em terapia, por exemplo, no tratamento de les5es.

Os exemplos de realização seguintes servem pa ra uma melhor elucidação da invenção.

Exemplo 1

Estimulação da síntese de substâncias própria:) coradas (actinorrodina, prodigiosina) por Streptomyces lividans (ATCC 19 844) por meio de preparados de paredes celulares. 80 ml de um meio de cultura constituido por 103 g de sacarose 10 g de glucose 10,12 g de cloreto de magnésio hexahidratado 0,25 g de sulfato de potássio 0,1 g de ácidos de casamino (Difco Labs. Dedroit/USA) 800 ml de água destilada foram esterilizados (20 minutos, 120° C) e suplementados em con dições estéreis com as seguintes soluções recém-preparadas : 1 ml de solução a 0,5$ de dihidrogenofosfato de potássio 8 ml de solução a 3,68$ de cloreto de cálcio dihidratado • 1,5 ml de solução a 20$ de L—prolina 12

10 ml de solução a 5»73$ de tampão TES (pH 7»2) 0,2 ml de solução de elementos minoritários - contendo por litro kO mg de cloreto de zinco (li) 200 mg de cloreto de ferro (ill) hexahidratado 10 mg de cloreto de cobre (li) dihidratado 10 mg de cloreto de manganês (li) tetrahidratado 10 mg de tetraborato disódico dihidratado 10 mg de heptamolibdato de haxaaraónio tetrahidratado 0,5 ml de soda cáustica IN.

Colocam-se de cada vez 1,8 ml desta solução nutriente em condições estéreis, em cada uma das 2k câmaras de 3 ml de capacidade cada uma, de uma placa múltipla de poliestireno (Multidish, fir ma Mune, 6200 Wiesbaden 12). Para cada caso 2 mg de preparado de paredes celulares, a ensaiar quanto ao teor de eliciador, são esterilisados a 120° C durante 20 min, em água bidestilada, e as suspensões assim obtidas são colocadas nas câmaras. Duas destas câmaras não contem qualquer aditivo, servem apenas para controle. Em todas as câmaras os volumes são ajustados individualmente com água bidestilada estéril a exactamente 2 ml. Cada câmara é inoculada em condições idênticas com 5 pl de uma suspensão de esporos de Streptomyces lividans (ATCC 19844) em condições estéreis. A incubação dos preparados de ensaio é realiza da em condições aerébicas (mesa de agitação: 100 rotações por minuto) a 26° C.

Ao fim de 96 h centrifuga-se para se separarem as células que se lavam com soro fisiológico, secam-se em vácuo com cloreto de cálcio e obtêm—se assim os rendimentos em células indicados no quadro. Os sobrenadantes obtidos na centri fugação são ajustados ao valor de pH 7, são diluídos ate 4 ml com água e determinam—se os seus espectros de absorção entre 180 e 800 nm. As quantidades relativas das substâncias secundárias actinarrodina e prodigiosina dissolvidas, que foram sintetizadas, são determinadas aproximadamente tomando as médias pon deradas dos máximos de absorção dos espectros traçados automati camente.

No quadro 3 adiante apresentam-se os resultados obtidos nesta serie de ensaios. * 13 =

Rendimento em células secas (mg)

Quadro

Paredes de células de bactérias ensaiadas, de 3

Teor de corante unidades relati vas de absorção nulo (controle) 22 1 B. ammoniagenes (ATCC 6872) 25 38 B. glutamingenes (ATCC 137^7) 32 24 B. pumilus (ATCC 706l) 34 2 B. linens (ATCC 19391) 23 1 C. diphtheriae (Mass. 8) 24 34 C. melassecola (ATCC 17965) 26 3^ C. glutamicura (ATCC 13032) 43 50 C. lilium (ATCC 15990) 33 4o Ce. cellasea (ATCC 14359) 36 2 L. plantarum (DSM 20174) 32 31 S. aureus estirpe H 44 1 B = Brevibacterium C = Corynebacterium Ce= Cellulomonas L = Lactobacillus S = Staphylococcus = l4 =

Exemplo 2

Estimulação da síntese de substâncias próprias coradas (actino- rodina.prodigiosina) por Streptomyces lividans (ATCC 19844) por extractos de paredes celulares.

Nas condições do exemplo 1, mas utilizando agora os filtrados estéreis dos preparados de paredes celulares (2 mg) esterilizados em água bidestilada durante 20 min. a 120° C, consegue-se uma estimulação quase igualmente tão intensa da formação de substâncias coradas por Streptomyces lividans I (ATCC 19844) como no caso da utilização de suspensões destas pa redes celulares esterilisadas.

Exemplo 3

Estimulação da síntese de substâncias próprias coradas (actino-rodina, prodigiosina) por Streptomyces lividans (ATCC 19844) por extractos de células.

Nas condições do exemplo 2, mas utilizando-se agora em cada caso 20 mg da massa celular, em vez de 2ng do pre parado de paredes celulares, obtém-se uma estimulação da formação de substâncias coradas aproximadamente com a mesma intensidade que no caso da utilização de suspensões de paredes celulares esterilizadas.

Exemplo 4

Estimulação da síntese de substâncias próprias coradas por Streptomyces coelicolor (ATCC 13405)·

Nas condições do exemplo 1 mas utilizando-se agora Streptomyces coelicolor (ATCC 13405) obtém-se igualmente com esta bactéria um aumento significativo da formação de substâncias coradas (provavelmente também actinorodina).

Exemplo 5

Estimulação da síntese de substâncias próprias coradas por Streptomyces griseoruber (ATCC 13738).

Nas condições do exemplo 1 mas utilizando-se 15 =

agora Streptomyces griseoruber (ATCC 13738) obtem-se igualmente com esta bactéria um aumento muito nítido da formação de substâncias coradas (provavelmente o antibiótico antraciclina).

Exemplo 6

Estimulação da síntese de substâncias próprias coradas por Streptomyces purpurascens (ATCC 25489)·

Nas condições do exemplo 1, mas utilizando-se agora Streptomyces purpurascens (ATCC 25489) obtém-se também com esta bactéria um aumento acentuado da formação de substancias coradas (provavelmente também o antibiótico antraciclina).

Exemplo 7

Estimulação da síntese de substâncias próprias coradas por Streptomyces latericius (ATCC 19913)·

Nas condições do exemplo 1 mas utilizando-se agora Streptomyces latericius (ATCC 19913) obtém-se igualmente com esta bactéria um aumento significativo da formação das subs tâncias coradas.

Exemplo 8

Estimulação da síntese de substâncias próprias coradas por Streptomyces violascens (ATCC 1373*0·

Nas condições do exemplo 1 mas utilizando-se agora Streptomyces violascens (ATCC 1373*+) obtém-se com esta bactéria um aumento igualmente significativo da formação de substâncias coradas.

Exemplo 9

Estimulação da formação de antibióticos de -lactame (cefalos-porinas, penicilina N) por Streptomyces clavuligerus (ATCC 27064). 5 g de ácido 3-(N-morfolino)-propanosulfónico (MOPS) 3,5 S de hidrogenofosfato dipotássico 0,6 g de sulfato de magnésio heptahidratado 2 g de L-aspargina 10 g de glicerina 1 g de extracto de levedura (óxido, Wesel, DE) l6 =

1 ml de uma solução de sais de elementos minoritários - contendo por litro 1 g de sulfato de ferro (li) heptahidratado 1 g de cloreto de manganês (li) tetrahidratado 1 g de cloreto de zinco heptahidratado 1 g de cloreto de cálcio são dissolvidos em água destilada e completa-se com esta até 1 litro, esterilizando-se em seguida (20 min; 120° C).

Fracções de 1,8 ml cada, desta solução nutritiva, são colocados em dondições estéreis em câmaras, de 3 ml de capacidade cada uma, de uma placa múltipla estéril de polies terino (Multidisch; firma Nunc, 62 Wiesbaden 12). Para cada caso colocam-se 2 mg do preparado de paredes celulares a ensaiar qianto à actividade de eliciadores, ou 2 mg das células a ensaiar, na forma de suspensões homogéneas esterilizadas em água bidestilada (20 ou 45 min, 120° C). Duas das câmaras que servem de controle não contêm qualquer aditivo. Em todas as câmaras ajusta-se em seguida o volume individualmente com água bidestilada, em condições estéreis, a precisamente 2 ml. Cada câmara é inoculada de forma idêntica com 5 ul de uma suspensão de esporos de Streptomyces clavuligerus (ATCC 2J 064). A incubação desta série de ensaios processa--se em condições aeróbicas (agitador de mesa; l60 rotações por minuto) a 26° C. Os tempos de incubação oscilam entre 24 e 48 horas. A formação do antibiótico é comprovada comparando-se com os controles por meio do teste de difusão em placa. Os organismos detectores, em suspensão em soft-agar nutriti vo, são Micrococcus luteus, ou Bacillus subtilis (l0^ células por ml). Sobre placas de filtro Standard (0,9 cm de diâmetro) aplicam-se em cada caso a partir das câmaras de ensaio 25 ul da calda de cultura centrifugada (48000 X g) . Depois de um tempo de difusão de 4 horas a 4° C incuba-se o bioteste durante 24 ho ras a 30° C.

Nas culturas que foram cultivadas com adição . de células mortas de Brevibacterium flavum (ATCC 13826) ou de = 17 =

preparados de paredes celulares desta bactéria, ou de preparações de paredes celulares de Corynebacterium diphtheriae (estirpe Mass. 8) em comparação com os controles apresentavam uma formação superior de antibióticos β -lactame. (penicilina N, cefalosporinas) por Streptomyces clavuligerus.

Exemplo 10

Estimulação da formação de alcaloides (sanguinarina, quelirru-bina, mercappina e queleritrina) por culturas de Eschscholtzia califoraica.

Em 24 câmaras, de 1 ml de capacidade cada uma, de uma placa múltipla de poliestireno (firma Nunc, 6200 Wiesbaden 12) cultivam-se em cada uma culturas de tecidos de Eschscholtzia californica nas condições descritas como óptimas por J. Berlin et al (Z. Naturforsch., 38c, 1983» 3^6-352). Uma das câmaras permanece como câmara de controle sem qualquer adi_ tivo, uma das câmaras recebe 266 mg/l de um eliciador de levedura extraído por fervura e precipitado com etanol (preparado de acordo com Kocourek J. e Bailou, C.E., J. Bacteriol 100. 19Ú9» 1175-ll8l) e as restantes receberam cada uma 266 m &/ litro do preparado de paredes celulares das bactérias que estão indicadas no quadro 3· Seguidamente todas as culturas foram in cubadas durante J2. horas a 24° C e depois determinou-se fotorae tricamente o teor de alcaloides das culturas, considerando-se como 100$ o teor de alcaloide induzido pelo eliciador de levedura. O quadro 4 adiante apresenta os resultados obtidos nesta série de ensaios. 18 =

Quadro 4 <jo de actividade eliciador

Bactérias ensaiadas paredes celulares

Brevibacterium butanicum ATCC 21196 Brevibacteriura flavum ATCC 13826 Brevibacterium flavum ATCC ΐ4θ67 Brevibacterium glutamingenes ATCC 137 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13^55 Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 Corynebacterium hydrocarboclastum ATCC 15592 Corynebacterium nephridii ATCC 11425 Corynebacterium paurometabolum ATCC 8368 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium striatum ATCC 6940 Corynebacterium petrophilum ATCC 19080 Corynebacterium xerosis ATCC 373 Corynebacterium diphtheriase estirpe Mass. 8 Rhodococcus fasciens ATCC 12975 Rhodococcus fascians 1

Isolado do Prof. Dr. Stolp. Univ. Bayreuth Rhodococcus fascians 2

Isolado do Prof. Dr. Stolp. Univ. Bayreuth 19 l6 30 113 43 40 8 123 16 108 17 O 102 137 27 11 7

Exemplo 11

Estimulação da formação de alcaloides de indol (valésiacota-mina) em culturas de Rauvolfia serpentina. A cultura em suspensão de Rauvolfia serpenti na (Stttckigt, J. , A. Pfitzner and J. Firl : Plant Cell Rep. 1, 36-39 (I98I) é cultivada em meio (LS) de Linsmaier e Skoog (Physiol, Plantarum 18, 100-127 (1965) num extractor rotativo (lOO rotações por minuto) a 23° C e com exposição à luz (600 Lux), Para a eliciação inoculam-se 200 g de células/litro do meio LS. Como fragmentos de microorganismos contendo eliciado-res utilizam-se preparados de parede celular dos microorganismos enumerados no quadro 4, numa concentração de 130 mg/litro.

Depois de um período de incubação de 5 dias verifica-se uma duplicação da massa Celular tanto nas culturas que sofreram eliciação, como também nas de controle. As células são recolhidas e extraídas com metanol. A quantidade do alcaloide de indol valésiaco tamina é determinada por meio de uma separação de HPLC dos ex-tractos. Enquanto que as culturas de controle não tratadas con têm apenas 1,16 mg/litro do meio, o rendimento nas culturas eliciadas atinge um máximo de 58 mg/litro. Isto corresponde a um aumento de 50 vezes devido ao eliciador.

Exemplo 12

Estimulação da actividade de 17-cetoesteroi-de-reductase de Rhodotorula glutinis IF0 0389. a) um balão de Erlenmeyer de 2 litros de capacidade contendo 500 ml de um meio nutriente estéril composto por 5Ί> de glucose monohidrato 2% de " cornsteep liquor”, _ ajustada a pH 6,5 e inoculada com um fragmento de uma cultura em agar de Rhodotorula glutinis 160 0389 e promove—se a cultura durante 48 horas a 30° C com 190 rotações por minuto. b) um balão de Erlenmeyer de 500 ml de capacidade contendo 100 = 20 =

ml de um meio nutriente esteril composto por 1$ de "cornsteep liquor" 5$ de Nurupan (fabricante Nurupan GmbH, 4000 Dtlsseldorf 1; DE) 1$. de Metarin^^ (fabricante Lucas Meyer ; 2000 Hamburg 28;DE) _ajustado a pH 6,2 _ é inoculado com 10 ml da pré-cultura de Rhodotorula preparada no exemplo 13a e promove-se a cultura durante 7 horas a 30° C e a 180 rotações por minuto.

Em seguida adiciona-se à cultura 10 mg de 3--hidroxi-1,3,5 (ΐθ), 7-estratetraeno-17-ona θ prolonga-se a fermentação por mais 210 horas. Depois extrai-se a cultura com metilisobutilcetona, concentram-se os extractos e purifica-se o produto bruto assim obtido por cromatografia através de uma coluna de sílica-gel. Obtêm—se deste modo 5» 9 mg de 1,3,5 (lO)J 7-estratetraeno-3,17-diol = 59$ do rendimento. c) nas condições do exemplo 13b fazem-se fermentar 10 mg de 3~ -hidroxi-1,3,5 (lO), 7-estratetraeno-17-ona com uma cultura de Rhodotorula glutinis, mas com a diferença de se adicionarem a esta cultura, imediatamente antes da adição do substrato, 5 ml de uma suspensão estéril de 50 mg de uma preparação de parede celular de Bacillus licheniformis (ATCC 99^5) em água. Depois do tratamento de cultura obtém-se 8 mg de 1,3,5 (lO), 7-©stra-tetraeno-3,17-diol = 58$ do rendimento teórico.

Exemplo 13

Estimulação da actividade de esteróide- Δ’--desidrase de Bacillus lentus (ATCC 13 805)· a) um balão de Erlenmeyer de 2 litros de capacidade contendo 500 ml de uma solução nutriente estéril composta por 0,5$ de "cornsteep liquor" 0,05$ de glueose monohidrato 0,1$ de extracto de levedura _ajustada a pH 7,0_ e inoculada com um pedaço de uma cultura de Bacillus lentus (ATCC 13 805) ® agita-se durante 48 horas a 30° C e a 190 rotações por minuto. = 21 =

b) um balão de Erlenmeyer de 500 ml de capacidade contendo 100 ml de uma solução nutriente estéril composta por 3,0$ de pó de soja 0,5$ de '» cornsteep liquor" 0,1$ de extracto de levedura 0,05$ de glucose monohidrato _ajustada a pH 7*3_ é inoculada com 10 ml de pré—cultura de Bacillus lentus e agita-· -se durante 7 horas a 30° C e a 180 rotações por minuto. Seguidamente adiciona-se a esta cultura uma solução esterilizada por filtração de 4o mg de 6¾ , 9 —difluor-11 p , 17 Λ -dihidroxi-l6c(- -metil-4-pergneno-3,20-diona em 4 ml de dimetilformamida e procede-se a incubação por mais 4l horas.

Em seguida extrai-se a cultura com metiliso-butilcetona, concentra—se o extracto em vácuo e purifica-se o resíduo por cromatografia através de uma coluna de sílica-gel. Obtém-se assim lé mg de 6((, 9 °(-difluor—11 β , 17C( -dihidroxi--l6 -metil-l,4-pergnadieno-3»20—diona ( - 40$ do rendimento teórico). c) nas condições do exemplo 13b fazem-se fer mentar 40 mg de 6 o( , 9o( -difluor-11 β , 17 0( -dihidroxi-ló o(-me-til-4-pregneno-3»20-diona com uma cultura de Bacillus lentus, mas com a diferença de se adicionar a esta cultura, imediatamen te antes da adição do substrato, de 5 ml de uma suspensão estéril de 50 mg da preparação de parede circular de Corynebacteriur diphtheriae (estirpe Mass* 8) em água. Depois do tratamento da cultura obtêm-se 21 mg de 6 o( f 9 -difluor-11 β , 17°( -dihidroxi--l6o(-metil-1,4-pergnadieno-3»20-diona ( = 52,5$ do rendimento teórico).

Exemplo l4

Estimulação da formação de alcaloides (amida de ácido lisérgico e amida do ácido isolisérgico) de Claviceps paspali (ATCC 13 895). a) um balão de Erlenmeyer de 500 ml de capacidade com 50 ml de . uma solução nutriente estéril contendo 4$ de sorbite (tecnicamente pura) 22

1$ de glucose monohidrato 2$ de ácido succínico 0,6$ de sulfato de amónio 0,5$ de extracto de levedura (Difco^^ da Difco Labs. Dedroit/ /usa) 0,1$ de dihidrogenofosfato de potássio, 0,03$ de sulfato de magnésio heptahidratado _ajustada com soda cáustica a pH 5»2_ é inoculada com uma cultura de Claviceps paspali (ATCC 13^95) congelada a -70° C e agita-se depois durante 5 dias a 24° C e a 2k0 rotações por minuto. b) um balão de Erlenmeyer de 500 ml com 50 ml de uma solução nutriente estéril composta por 8$ de sorbite (tecnicamente pura) 6$ de ácido succínico 0,9$ de sulfato de amónio 0,1$ de nitrato de cálcio tetrahidratado 0,05$ de hidrogenofosfato dipotássico 0,03$ de sulfato de magnésio heptahidratado 0,02$ de extracto de levedura (Difco'· ' da Difco Labs.,

Dedroit/USA) 0,0007$ de sulfato de ferro (li) heptahidratado 0,0006$ de sulfato de zinco heptahidratado _ajustada com soda cáustica a pH 5»^_ é inoculado com 5 ml da pré—cultura de Claviceps paspali e agita-se durante 250 horas a 24° C e a 240 rotações por minuto.

Seguidamente adiciona-se à cultura soda cáusi tica bastante para se alcançar pelo menos um valor de pH de 10, extrai—se com metilisobutilcetona, concentra—se o extracto em vácuo e purifica-se por cromatografia através de uma coluna de sílica-gel. 0btem-se assim 35 mg de uma mistura de amida de ácido lisérgico e amida de ácido isoligergico (rendimento 700 mg/litro de cultura). c) nas condições do exemplo 14b cultiva-se uma cultura de Claviceps paspali, mas com a diferença de se adicionar à cultura ’ depois de 72 horas, 5 ml de uma suspensão estéril de 25 mg da = 23 = fc. -π··*!

preparação de parede celular de Lactobacillus casei sub-especie Rhamnosus (ATCC 7469) em água. Depois do tratamento da cultura obtêm-se 45 mg de uma mistura de amida do ácido lisergico e ami da do ácido isoligérgico (rendimento 900 mg/litro de cultura).

Exemplo 15

Estimulação da actividade de 15 -hidroxila-se de Penicillium raistrickii (ATCC 10 490 ). a) Um balão de Erlenmeyer de 2 litros de capacidade contendo 500 ml de um meio nutriente estéril composto por 3$ de glucose monohidrato 1$ de "cornsteep liquor" 0,2$ de nitrato de sódio 0,05$ de sulfato de magnésio heptahidratado 0,05$ de cloreto de potássio 0,002$ de sulfato de ferro (ii) hexahidratado 0,1$ de dihidrogenofosfato de potássio 0,2$ de hidrogenofosfato dipotássico _ ajustada ao pH 6,0_ I , j e inoculada com uma raspagem de uma cultura em agar de Penicillium raistrickii (ATCC IO490) e agita-se durante 48 horas a 30° C e a 180 rotações por minuto. b) Um balão de Ermenmeyer de 500 ml contendo 100 ml de meio nutriente estéril composto por 1$ de "cornsteep liquor" 3$ de glucose monohidrato 0,1$ de dihidrogenofosfato de potássio 0,2$ de hidrogenofosfato dipotássico 0,05$ de sulfato de magnésio heptahidratado - ajustada a pH 6,0 - é inoculada com IO ml da pré—cultura de Penicillium preparada de acordo com a).

Adicionam—se depois à cultura 300 mg de 13- -etil-4—goneno-3,17-diona e fermenta-se durante 120 horas a 30° . C e a l80 rotações por minuto.

Seguidamente extrai-se a cultura com metilisc • ' = 24 =

Claims

butilcetona, concentra-se o extracto e purifica-se o produto bruto obtido por cromatografia através de uma coluna de sílica--gel. Obtêm-se assim l80 mg de 13-etil-15 o( -hidroxi-4-goneno--3»17-diona. c) Nas condições de b) promove—se a fermentação de 300 mg de 18-meti1-norandrostenodiona com uma cultura de Penicillium raistrickii, mas com a diferença de se adicionar a esta cultura, imediatamente antes da adição do substrato, 5 ml de uma sus pensão estéril. Estes 5 ml da suspensão contêm 50 mg de uma pre paração de parede celular de Corynebacterium diphtheriae (estir pe Mass. 8) em água. Depois do tratamento da cultura obtêm-se 210 mg de 13-etil-15& -hidroxi-4-goneno-3,17-diona. REIVINDICAÇÕES - 1§ _ Processo para o aumento da actividade enzima tica e do poder de síntese de organismos, caracterizado pelo facto de se porem em contactos os mesmos com microorganismos inactivados contendo eliciadores, com fragmentos dos mesmos, ou com excreções de microorganismos contendo eliciadores, com a condição de, para o aumento da actividade enzimática e do poder de síntese de organismos não microbianos, se utilizarem bactérias inactivadas contendo eliciadores, fragmentos das mesmas ou excreções de bactérias contendo eliciadores.
- 2? - Processo para o aumento da actividade enzima tica e do poder de síntese de microorganismos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se porem em contac to os mesmos com microorganismos inactivados contendo eliciadores, com fragmentos dos mesmos ou com excreções de microorgani^ mos contendo eliciadores. = 25
= 3- Processo para o aumento do poder de síntese de microorganismos de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de, para a formação de substâncias coradas, para a formação de alcaloides ou para a formação de antibióticos, se porem em contactos bactérias, fungos e leveduras apropriados com bactérias, fungos e leveduras inactivados contendo elicia-dores, com os seus fragmentos ou com excreçães destes microor-ganismo s.
- 4? - Processo para o aumento de actividade enzimática de microorganismos de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do pelo facto de, para a transformação de esteróides, se porem em contacto bactérias, fungos ou leveduras apropriados com bactérias, fungos ou leveduras inactivos contendo eliciadores, com fragmentos dos mesmos ou com excreçães destes microorganismos.
- 5* - Processo para o aumento do poder de síntese de organismos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se porem em contacto culturas celulares de plantas superiores aptas para a síntese de substâncias coradas, para a síntese de alcaloides ou para a síntese de fitoalexina, com bac térias inactivadas contendo eliciadores, com fragmentos das mes mas ou com excreçães destas bactérias.
- 6* - Processo para o aumento da actividade enzimática e do poder de síntese de organismos de acordo com as reivindica çães 1 a 5» caracterizado pelo facto de se porem em contacto os mesmos com microorganismos esterilizados por fervura, contendo eliciadores, ou com filtrados dos mesmos. A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi depositado na República Federal Alemã, em 13 de Janeiro de 1988, sob o número de série P 38 01 023.2. Lisboa, 12 de Janeiro de 1989. • AGENTE OFICIAI DA PROPRIEDADE .NDL'S7Pi«i

I

"PROCESSO PARA O AUMENTO DA ACTIVIDADE ENZIMÁTICA E DO PODER DE SÍNTESE DE ORGANISMOS" A invenção refere-se ao processo para o aumento da actividade enzimática e do poder de síntese de organismos, compreendendo porém se em contacto os mesmos com microorganis-mos inactivados contendo eliciadores, com fragmentos dos mesmos, ou com excreções de microorganismos contendo eliciadores, com a condição de, para o aumento da actividade enzimática e do poder de síntese de organismos não microbianos, se utilizarem bactérias inactivadas contendo eliciadores, fragmentos das mesmas ou excreções de bactérias contendo eliciadores.