FI97302C - Menetelmä organismien entsyymiaktiivisuuksien ja synteesisuorituksen lisäämiseksi - Google Patents
Menetelmä organismien entsyymiaktiivisuuksien ja synteesisuorituksen lisäämiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI97302C FI97302C FI894304A FI894304A FI97302C FI 97302 C FI97302 C FI 97302C FI 894304 A FI894304 A FI 894304A FI 894304 A FI894304 A FI 894304A FI 97302 C FI97302 C FI 97302C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- microorganisms
- atcc
- bacteria
- synthesis
- inactivated
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Fertilizers (AREA)
Description
97302
Menetelmä organismien entsyymiaktiivisuuksien ja synteesi-suorituksen lisäämiseksi
Keksintö koskee menetelmää organismien entsyymi-5 aktiivisuuksien ja synteeslsuorltuksen lisäämiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että kyseiset organismit saatetaan kosketuksiin inaktivoitujen elisitoripitoisten mikro-organismien, näiden kappaleiden tai elisitoripitoisten mikro-organismien eritteiden kanssa, millä erityisesti 10 tarkoitetaan, että inaktivoituja elisitoripitoisia bakteereja, niiden kappaleita tai elisitoripitoisten bakteerien eritteitä käytetään ei-mikrobiorganismien entsyymi-aktiivisuuksien ja synteeslsuorltuksen lisäämiseksi.
Elisitorit ovat tunnetusti mikrobi- tai kasvivai-15 kuttaja-aineita, jotka saatettuina kosketuksiin korkeampien kasvien kudosten kanssa lisäävät niiden entsyymi-aktiivisuuksia ja synteesisuoritusta. Näihin kasveihin siten kertyneitä sisällysaineita nimitetään, kun ne ovat mikrobienvastaisia, fytoaleksiineiksi (Naturwissenschaften 20 68, 1981, alk. 447, Adv. Enzymol. 55, 1983, alk. 1) ja
Spektrum der Wissenschaft 11, 1985, alk. 85).
Tähän mennessä on erilaisista kasvilajeista eristetty yli 100 yhdistettä, jotka täyttävät fytoaleksiini-määritelmän. Ne kuuluvat erilaisiin luonnonaineryhmiin, 25 kuten terpenoideihin, linoleenihappojohdannaisiin, ase- tyleeneihin ja polyasetyleeneihin, bibentsyyleihin, stil-beeneihin, fenantreeneihin ja dihydroferantreeneihin, bentsofuraaneihin ja fenolibentsofuraaneihin, furokumarii-neihin, avenalumiineihin, flavaaneihin, fenyylibentsofu-30 raaneihin, bentsoksatsioneihin, alkaloideihin, isoflavo- noideihin (Brooks ja Watson, Nat. Prod. Reports 1, 1985, 427).
Toistaiseksi ei tätä elisitorivaikutusta ole käytetty teknisesti. Tähän on useita syitä: Muutamia poik-35 keuksia lukuunottamatta ei toistaiseksi ole mahdollista 2 97302 lisätä korkeampien kasvien soluja taloudellisesti puolustettavissa olevalla tavalla uposviljelmissä. A priori näytti tarkoituksettomalta käyttää elisitoreja mikro-organismien avulla suoritettavassa fermentaatiossa, koska 5 elisitorien vaikutustapaa koskevan vallitsevan opillisen käsityksen mukaan (Albersheim P. ja Darvill A.G. Spektrum der Wissenschaft, 11, 1985, 85) täytyi lähteä siitä, että nämä eivät vaikuta mikro-organismeissa entsyymiaktiivisuutena eivätkä aineenvaihduntatapahtumiin.
10 On myös huomionarvoista, että vallitsevan opilli sen käsityksen mukaan bakteerit kykenevät panemaan kasveilla alulle fytoaleksiininmuodostusta ainoastaan siten, että ne, kuten esimerkiksi suvun Erwinia edustajat, vapauttavat määrättyjen entsyymien (pektinaasit) avulla kas-15 vien solunseinämästä elisitoreja (oligogalakturonideja), jotka stimuloivat endogeenisinä elisitoreina fytoaleksiininmuodostusta .
Nyt on havaittu, että mikro-organismeista saadut yhdisteet ja soluvalmisteet, joita seuraavassa nimitetään 20 elisitoreiksi, yllättäen sittenkin kykenevät lisäämään mikro-organismeissa entsyymiaktiivisuuksia ja niiden syn-teesisuoritusta. Lisäksi on havaittu, että on myös bakteereja, jotka sisältävät elisitoreja, jotka eivät ole entsyymejä tai ravintotekijöitä.
25 Keksinnön mukainen menetelmä voidaan periaatteessa . · suorittaa eristettyjen tai syntetisoitujen elisitorien avulla, mutta tämä on tavallisesti aivan liian vaivalloista ja kustannuksia vaativaa. Riittää, että käytetään inaktivoitu ja elisitoripitoisia mikro-organismeja tai näiden 30 mikro-organismien kappaleita, kuten esimerkiksi solun- seinämäfraktioita, mekaanisesti rikottujen tai kemiallisesti tai entsymaattisesti hajotettujen solujen solunkap-paleita tai apuaineiden, kuten esimerkiksi etanolin tai asetonin, avulla saostettuja solunsisällysaineita. In-35 aktivoiduilla mikro-organismeilla tarkoitetaan keksinnössä 97302 3 sellaisia, jotka ovat pysyvästi menettäneet elinkykyisyytensä .
Jos mikro-organismi luovuttaa elisitoreja kasvu-liuokseen tai siitä muodostuu lyysin tai sterilisoinnin 5 jälkeen vesiliukoisia elisitoripitoisia solunsisällysai-neita, niin voidaan myös käyttää näitä mikro-organismien elisitoripitoisia eritteitä keksinnön mukaisen menetelmän suorittamiseen. Mikä tahansa mikro-organismien elisitori-pitoinen tuotemuoto soveltuu keksinnön mukaisen menetelmän 10 suorittamiseen.
Mikro-organismeja, joista tiedetään, että ne omaavat elisitoreja, ovat muun muassa seuraavassa taulukossa 1 luetellut sienikannat ja hiivat: TAULUKKO 1 15 Alternaria carthami Arch. Bioch.Viop.229, 1984,136
Botrytis cinerera Physiol. Plant Pathol.11, 1977 (ATCC 48345) 287
Ceratocystis fimbriata Phylochemistry 23, 1984,759
Ceratocystis ulmi Phytochemistry 23, 1984,383 20 Chondrostereum purpureum J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 1984, 14341
Cladosporium fulvum Physiol.Plant Pathol. 16, (ATCC 44961) 1980, 391
Colletotrichum linde- Eur.J.Biochem. 129, 1983,593 25 muthianum (ATCC 52471)
Fusarium solani Plant Physiol. 76, 1984,833
Fusarium solanifspmori Nat.Prod.Rep. 2, 1985,439 (ATCC 44934)
Ganoderma applanatum Phytochemistry 22, 1983,1039 30 Glomerella cingulata Physiol.PIant.Pathol. 21, 1982, 171
Helminthsporium carbonum Z. Naturforsch. Sect. C 36, (ATCC 52471) 1983, 899
Monilinia fructicola J.Am.Chem.Soc., 84, 1962,1919 35 Nectria haematococca Phytochemistry 22, 1983,2291 4 97302
Phoma exigua Phytochem. 21, 1982, 1818
Phytophthora cannabivora Z.Naturf.Sect.C. 39, 1984,217
Phytophthora capsici Physiol. Plat. Pathol. 18, 1981, (ATCC 52771) 379 5 Phytophthora infectans Phytochem. 23, 1984, 537 (ATCC 44776)
Phytophthora megasperma Arch.Bioch.Bioph. 229, 1984 var glycinea 136
Phytophthora infectans Phytpathol. Z, 27, 1956,237 10 Phytophthora megasperma J.Biol.Chem. 259, 1984,11341
Phytophthora nicotiane Phytopathology 71, 1981, 864
Puccinia coronata Physiol.Plant Pathol. 20, 1982, 189
Pyricularia oryzae Agric.Biol.Chem. 48, 1984, 15 (ATCC 15923) 253
Saccharomyces cerevisiae Plant Physiol. 62, 1978, 107 Verticillium albo-atrum Nat.Prod.Rep.2, 1985, 429
Verticillium dahliae ATCC-Katalog, 16. Aufl. 1984 (ATCC 26289) 20
Omissa kokeissa tutkittiin sukujen Bacillus, Cory-nebacterium, Brevibacterium, Cellulomonas, Lactobacillus, Pimelobacter. Phodococcus ja Staphylococcus gram-positii-visten bakteerikantojen proteolyyttisesti trypsiinin avul-25 la puhdistetuista solunseinämävalmisteista ja näiden sukujen vedessä lämpösteriloiduista mikro-organismeista ja niiden seoksista, omaavatko ne elisitoreja. Seuraavassa taulukossa 2 on esitetty ne bakteerikannat, joissa voitiin todeta elisitoreja.
30 TAULUKKO 2
Bacillus licheniformis ATCC 9945 Bacillus pumilus ATCC 7061 Brevibacterium butanicum ATCC 21196 Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067 35 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13655 97302 5
Brevibacterium glutamingenes ATCC 13747 Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 Corynebacterium hydrocarboclastum ATCC 15592 Corynebacterium nephridii ATCC 11425 5 Corynebacterium paurometabolum ATCC 8368 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium striatum ATCC 6940 Corynebacterium xerosis ATCC 373
Corynebacterium diphtheriae (Stamm Mass. 8/Behring Werke) 10 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Corynebacterium uratoxidans ATCC 21749 Lactobacillus easel subsp. rhamnosus ATCC 7469 Lactobacillus plantarum DSM 20174 15 Pimelobacter tumescens AJ 1460 Rhodococcus fascians ATCC 12975
Rhodococcus fascians 1 - Prof. Dr. Stolpin, Univ. Bayreuth, isolaatti
Rhodococcus fascians 2 - Prof. Dr. Stolpin, Univ. Bay-20 reuth, isolaatti Tämän keksinnön puitteissa on tähän mennessä tutkittu vain harvojen gram-positiivisten eubakteerien sukujen bakteerikannoista, omaavatko ne elisitoreja. Myös sie-nikannoista, mukaan lukien hiivat, tutkittiin - sikäli 25 kuin voidaan päätellä esijulkaisuista enimmäkseen vain sellaisia elisitoriaktiivisuuksien esiintymisen suhteen, joiden tiedetään olevan kasvitautia aiheuttavia. Sen vuoksi on odotettavissa, että lisäksi voidaan vielä löytää lukuisia mikro-organismeja, kuten esimerkiksi sukujen My-30 cobacterium, Nocardia, Nocardioides tai Pseudonocardia bakteereja, jotka samoin omaavat elisitoreja.
Mikro-organismien tutkiminen elisitoriaktiivisuuden suhteen voidaan suorittaa ilman ongelmia tavanomaisten seulonta (screening) -kokeiden avulla, jollaiset ovat alan 35 asiantuntijalle tuttuja.
6 97302
Siten voidaan esimerkiksi sarjakokeissa mikro-organismeja, joiden entsyymiaktiivisuutta tai synteesisuoritusta on tarkoitus lisätä, viljellä uppoviljelmissä, lisätä yksittäisiin viljelmiin eri lajien tai alalajien in-5 aktivoituja mikro-organismeja ja seuranneen fermentaation jälkeen selvittää analyyttisesti, missä viljelmissä saavutetaan entsyymiaktiivisuuksien tai synteesisuorituksen lisäys. Mikro-organismien entsyymiaktiivisuuksien suureneminen tunnistetaan esimerkiksi siitä, että substraattien 10 muuttamisessa käymisen avulla saavutetaan menetelmän tuotteen suurentunut muodostumisnopeus - tai suurentunut saanto. Vastaavasti voidaan mikro-organismien lisääntynyt syn-teesisuoritus tunnistaa esimerkiksi mikro-organismin si-sällysaineen suurentuneesta muodostumisnopeudesta - tai 15 suurentuneesta saannosta.
Kuten tähän mennessä suoritetut kokeet, joita kuvataan suoritusesimerkeissä lähemmin, osoittavat, näyttää keksinnön mukainen menetelmä olevan hyvin monipuolisesti käyttökelpoinen mikro-organismien entsyymi-aktiivisuuksien 20 tai synteesisuorituksen lisäämiseksi. Niinpä voitiin lisäämällä taulukossa 2 esitettyjen mikro-organismien solun-seinämävalmisteita stimuloida lajin Streptomyces lividans väriaineenmuodostusta (aktinorodiini, prodigiosiin) samoin kuin lajien Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseo-25 ruber, Streptomyces latericius, Streptomyces purpurascens ja Streptomyces violaceus väriaineenmuodostusta. Lisäksi oli mahdollista stimuloida lajin Streptomyces clavuligerus β-laktaami-antibioottien muodostusta ja lajin Claviceps paspali alkaloidisynteesiä.
30 Sellaista mikro-organismien synteesisuorituksen lisääntymistä ei voida ainoastaan saavuttaa taulukossa 2 esitettyjen bakteerien solunseinämävalmisteiden avulla, vaan voidaan odottaa, että myös elisitoripitoisten sienien ja hiivojen avulla, jollaisia on esitetty taulukossa 1, 35 voidaan saavuttaa mikro-organismien entsyymiaktiivisuuk-
M
97302 7 sien ja synteesisuorituksen lisääntyminen.
Lisäksi onnistuttiin taulukossa 2 esitettyjen mikro-organismien solunseinämävalmisteiden avulla saavuttamaan korkeampien kasvien, kuten lajien Eschscholtzia cali-5 fornica tai Rauvolfia serpentina, soluviljelmissä alkaloidien muodostuksen merkitsevä lisääntyminen.
Sen lisäksi onnistuttiin näiden solunseinämävalmis-teiden avulla lisäämään lajin Bacillus lentus kykyä poistaa steroideista vettä 1,2-asemasta ja lajin Rhodotorula 10 glutinis kykyä pelkistää 17-ketosteroideja selektiivisesti ja lajin Penicillium raistrickii kykyä hydroksyloida steroideja 15a-asemassa. Toistaiseksi jäi tuloksettomaksi ainoastaan yritys lisätä näiden solunseinämävalmisteiden avulla lajin Curvularia lunata kykyä Ιΐβ-hydroksyloida 15 steroideja.
Näiden kokeiden perusteella vaikuttaa oikeutetulta toivoa, että keksinnön mukaisen menetelmän avulla tulee olemaan mahdollista stimuloida myös lukuisten muiden ammattikäytössä hyödyllisten mikrobisisällysaineiden muodos-20 tusta ja lisätä muita mikro-organismien entsyymiaktiivisuuksia, jotka ovat teknisesti hyödyllisiä.
Sellaisia mikrobien sisällysaineita ovat esimerkiksi antibiootit, kuten penisilliinit, kefalosporiinit, syklosporiinit, aktinomysiinit, gramisidiinit, neomysii-25 nit, gentamysiinit, nystatiinit, tetrasykliinit, nikomy- siinit tai linkomysiini, erytromysiini, kloramfenikoli, griseofulviini tai fusidiinihappo ym., torajyväalkaloidit, kuten ergokryptiinit, ergotamiini, ergosiini, ergokristii-ni, ergokorniini, agroklaviini, kanoklaviini, festukla-30 viini, paspaliinihappo tai lysergiinihappojohdannaiset, vitamiinit, kuten vitamiini B 12, riboflaviini tai β-karo-tiini, entsyymit, kuten amylaasit, glukoosi-isomeraasit, proteaasit, pektinaasit, sellulaasit, lipaasit, penisil-liiniasylaasit, kitinääsi tai laktaasi, nukleosidit, kuten 35 guanyylihappo tai inosyylihappo, tai esimerkiksi myös ami- 8 97302 nohapot, kuten kysteiini, glutamiinihappo, tryptofaani tai lysiini.
Periaatteessa pitäisi olla myös mahdollista lisätä geneettisesti muutetuilla mikro-organismeilla endogeenistä 5 tai eksogeenistä proteiininmuodostusta. Sellaisia hyödyllisiä proteiineja eivät ole ainoastaan jo mainitut entsyymit ja antibiootit, vaan myös esimerkiksi interferoni, insuliini, erytropoietiini ja TNF.
Mikro-organismeja, joita käytetään teknisesti nii-10 den entsyymiaktiivisuuksien vuoksi, on kuvattu esimerkiksi seuraavissa julkaisuissa: W. Charney ja H. Herzog: Microbial Transformations of Steroids; Academic Press, New York etc. 1967, K. Kieslich: Microbial Transformations of Nonsteroidal Cyclis Compounds; Georg Thieme Pubi. Stuttgart 15 (DE), 1976 ja K. Kieslich: Biotransformations; teoksessa H.J. Rehm ja G. Reed (julkaisijat): Biotechnology; Wein-heim (DE) etc. Vol 6a, 1984. Tällaisia mikro-organismeja ovat muun muassa sellaiset, jotka aikaansaavat steroidien muunnoksia, kuten 11a-, tai 11β- tai 15a-hydroksylointia, 20 a1-vedenpoistoa, 17a-, 17p-ketopelkistyksiä, tai sterii-nien sivuketjun hajoitusta tai antibioottien muutoksia, kuten penisilliinin hajottamista.
Ei ole epätodennäköistä, että keksinnön mukaisen menetelmän avulla voitaisiin onnistua löytämään uusia tek-25 nisesti käyttökelpoisia mikrobien sisällysaineita, kuten esimerkiksi antibiootteja, lisäämällä testattaville mikro-organismeille inaktiivisia elisitoripitoisia mikro-organismeja. Tämä toive ei ole perusteeton, koska on tunnettua, että lukuisat korkeammat kasvit muodostavat fytoalek-30 siineja mainittavina määrinä vain silloin, kun ne ovat infektoituja elisitoripitoisilla mikro-organismeilla.
Sen määrittäminen, mikä elisitoripitoinen mikro-organismi lisää määrätyn mikro-organismin entsyymiaktiivisuuksia tai synteesisuoritusta, tapahtuu alan asiantun-35 tijalle tuttujen tavanomaisten menetelmien avulla.
97302 9
Keksinnön mukaisen menetelmän suorittaminen on, sikäli kuin on kysymys mikro-organismien avulla suoritettavasta fermentaatiosta, alan asiantuntijalle ongelmatonta. Mikro-organismia, jonka entsyymiaktiivisuutta tai jon-5 ka synteesisuoritusta on tarkoitus lisätä, kasvatetaan tunnetuissa olosuhteissa; sitten lisätään viljelmään inaktivoitu ja elisitoripitoisia mikro-organismeja, niiden kappaleita, niiden solu-uutteita tai niiden eritteitä ja jatketaan fermentaatiota tavanomaisesti. Inaktivoitujen 10 mikro-organismien, näiden organismien kappaleiden tai uutteiden tai elisitoripitoisten mikro-organismien eritteiden lisääminen voi tapahtua jo fermentaation alussa. Optimaalinen lisäämishetki on luonnollisesti riippuvainen kasvatettavan mikro-organismin lajista, erityisesti sen ekspo-15 nentiaalisen kasvuvaiheen kulusta, ja se täytyy yksittäistapauksessa ottaa selville. Niinpä esimerkiksi bakteereilla osoittautuu usein tarkoituksenmukaiseksi suorittaa tämä lisäys 4-30 tuntia fermentaation aloituksen jälkeen. Lisättäessä inaktivoituja mikro-organismeja tai niiden kap-20 paleita käytetään kuutiometriä fermentaatioliuosta kohden yleensä 1-1000 g (mieluimmin 10-200 g) inaktivoitua mikro-organismia tai 0,1-100 g (mieluimmin 1-30 g) tämän organismin kappaletta. Kun käytetään elisitoripitoisten mikro-organismien eritteitä, tavallisesti on riittävää käyttää 25 kuutiometriä fermentaatiotilavuutta kohden 1-50 1 erite-liuosta. Kun keksinnön mukaista menetelmää sovelletaan sellaisen mikro-organismin, jota käytetään substraattien entsymaattiseen muuttamiseen, entsyymiaktiivisuuden lisäämiseen, aloitetaan substraatin lisääminen tavallisesti 0-30 10 tuntia elisitoripitoisen inaktivoidun mikro-organismin tai sen kappaleiden tai eritteiden lisäämisen suorittamisen jälkeen.
Optimaaliset fermentaatio-olosuhteet riippuvat käytetyn mikro-organismin lajista, käytetystä ravintoliuok-35 sesta, fermentaatioajasta, elisitoripitoisen materiaalin 97302 10 laadusta ja määrästä jne; ne täytyy yksittäistapauksessa selvittää eslkokeilla, jollaiset ovat asiantuntijalle tuttuja.
Inaktivoitujen elisitoripitoisten mikro-organismien 5 valmistamiseksi näitä kasvatetaan tavanomaisissa olosuhteissa, erotetaan sitten sentrifugoimalla tai suodattamalla kasvuliuoksesta, haluttaessa pestään ja eristetään vielä kerran. Mikro-organismien inaktivoimiseen voidaan käyttää erilaisia menetelmiä.
10 Mahdolliset inaktivointimenetelmät perustuvat sii hen, että näihin mikro-organismeihin annetaan vaikuttaa tyypillisten solumyrkkyjen, kuten etyleenioksidin, formaldehydin, otsonin, elohopeayhdisteiden, orgaanisten liuottimien, kuten metanolin, etanolin tai asetonin, tai mikro-15 organismit tapetaan kuumentamalla 90-140°C:een, äärimmäisten paine-erojen vaikutuksen (desintegrointi), taajajak-soisten sähkökenttien vaikutuksen tai UV-sädetyksen /-säteillä sädetyksen tai ultraääniaaltojen vaikutuksen avulla. Olosuhteet, joissa inaktivointi voidaan suorittaa, 20 ovat alan asiantuntijalle tunnettuja. (K.H. Wallhäuser, H. Schmidt: Sterilisation, Desinfektion, Konservierung,
Chemotherapie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (DE), 1967).
Näistä solunkappaleista voidaan esimerkiksi tryp-siinikäsittelyn avulla aikaansaada puhdistettuja solun-25 seinämäfraktioita. Jo mainitut ja seuraavissa suoritus-esimerkeissä käytetyt solunseinämäfraktiot on valmistettu käyttäen menetelmää, jonka ovat kuvanneet Schleifer ja Kandler (Arch. Mikrobiol. 57, 1967, 335-365).
Mutta toisaalta on myös mahdollista valmistaa vesi-30 liukoisista solunaineosista esimerkiksi etanolilla tai * asetonilla saostamalla elisitoripitoisia saostumia (Kocou- rek, J. ja Ballou, C.E., J. Bacteriol. 100, 1969, 1175-1181).
Elisitoripitoisten mikro-organismien eritteet ovat 35 joko aktiivisesti luovutettuja, aiheutetun lyysin avulla,
Il ' Hill Iti» l,l« « ' 97302 11 "vuotavaksi tekemällä" kriittisillä nesteytetyillä kaasuilla (esim. hiilidioksidi) uuttamalla tai solut vedessä lämpösteriloimalla saatuja solunaineosia, vesiliukoisia tai organismit poissuodattamalla tai poissentrifugoimalla 5 saatuja kasvuliuoksia. Näitä voidaan tarvittaessa puhdistaa edelleen, esimerkiksi lipofiilisten aineiden uuttamisen, vahvasti värjäävien aineiden adsorption jne. avulla.
On jo mainittu, että on voitu kokeellisesti osoittaa mahdolliseksi bakteereista saadun entsyymittömän eli-10 sitoripitoisen materiaalin käyttö korkeampien kasvien si-sällysaineiden synteesin lisäämiseen; tällä voisi mahdollisesti olla merkitystä kasvisoluviljelmien käytölle lääkeaineiden valmistukseen (M.H. Zenk julkaisussa Pharmazie heute, 103, 1982, Band 3, 131-138). Periaatteesa näyttää 15 myös mahdolliselta, että bakteereista saatua elisitoripi-toista materiaalia voitaisiin käyttää myös sisällysainei-den synteesin lisäämiseen eläin- tai ihmiskudosten tai -solujen viljelmissä tai hoidossa - esimerkiksi haavojen käsittelyssä.
20 Seuraavien suoritusesimerkkien tarkoitus on selven tää keksintöä lähemmin.
Esimerkki 1
Lajin Streptomyces lividans (ATCC 19844) värillisten sisällysaineiden (aktinorodiini, prodigiosiini) syn-25 teesin stimulointi solunseinämävalmisteiden avulla.
80 ml ravintoliuosta, jonka muodostavat 103 g sakkaroosia 10 g glukoosia 10,12 g magnesiumkloridiheksahydraattia 30 0,24 g kaliumsulfaattia 0,1 g casaminohappoja (Difco Labs, Detroit/USA) 800 ml tislattua vettä sterilisoidaan (20 minuuttia, 120°C) ja joukkoon lisätään steriilisti seuraavat juuri valmistetut liuokset.
35 1 ml 0,5 % kaliumdivetyfosfaattiliuosta 12 97302 8 ml 3,68 % kalsiumklorididihydraattiliuosta 1,5 ml 20 % L-proliiniliuosta 10 ml 5,73 % TES-puskuriliuosta (pH 7,2) 0,2 ml hivenalneliuosta - joka sisältää litraa 5 kohden 40 mg sinkki(II)kloridia 200 mg rauta(III)kloridiheksahydraattia 10 mg kupari(II)klorididihydraattia 10 mg mangaani(II)kloriditetrahydraattia 10 10 mg dinatriumtetraboraattidihydraattia 10 mg heksa-ammoniumheptamolybdaattitetra-hydraattia 0,5 ml 1 N natronlipeää
Lisätään steriilisti kulloinkin 1,8 ml tätä ravin-15 toliuosta polystyreeni-monisyvennyksisen maljan (Multi-dish, Fa. Nunc, 6200 Wiesbaden 12) 24:ään kulloinkin 3 ml käsittävään lokeroon. Kulloinkin 2 mg elisitoripitoisuuden suhteen testattavia solunseinämävalmisteita sterilisoidaan vedessä, joka on tislattu kahteen kertaan, 20 minuutin 20 ajan 120°C:ssa ja saadut suspensiot lisätään lokeroihin. 2 lokeroa ei saa lisäyksiä, ne toimivat kontrolleina. Kaikissa lokeroissa säädetään tilavuus yhtäläisesti kaksi kertaa tislatulla vedellä steriilisti 2 ml:ksi. Jokaiseen lokeroon istutetan steriilisti identtisesti 5 μΐ lajin 25 Streptomyces lividans (ATCC 19844) itiösuspensiota. Koesarjaa inkuboidaan aerobisesti (Tablar-ravistuslaite; 100 kierrosta minuutissa) 26°C:ssa.
96 tunnin jälkeen solut sentrifuloidaan erilleen, pestään fysiologisella keittosuolaliuoksella, kuivataan 30 tyhjössä kalsiumkloridin avulla ja näin saadaan taulukossa esitetyt solusaannot. Sentrifugoinnissa saadut supernatan-tit säädetään pH-arvoon 7, laimennetaan vedellä 4 ml:ksi ja niiden absorptiospektrit määritetään välillä 180-800 nm. Syntetisoitujen liuenneiden sivuaineiden aktinorodiini 35 ja prodigiosiini suhteelliset määrät määritetään likimää- < « i liiti h tm 97302 13 rälsesti punnitsemalla automaattisesti piirtyneiden spektrien absorptiohuiput.
Seuraavassa taulukossa 3 on esitetty tässä koesarjassa saavutetut tulokset.
5 TAULUKKO 3
Testatut bakteerisolunseinämät Kuivasolu- Väriainepitolia j ilta saanto suus suht. ab- (mg) sorptioyksik- köjä 10 - ei mitään (kontrolli) 22 1 B. ammoniagenes (ATCC 6872) 25 38 B. glutamingenes (ATCC 13747) 32 24
Ba. pumilus (ATCC 7061) 34 2 15 B. linens (ATCC 19391) 23 1 C. diphtheriae (Mass. 8) 24 34 C. melassecola (ATCC 17965) 26 34 C. glutamicum (ATCC 13032) 43 50 C. lilium (ATCC 15990) 33 40 20 Ce. cellasea (ATCC 14359) 36 2 L. plantarum (DSM 20174) 32 31 S. aureus kanta H 44 1 B = Brevibacterium . 25 Ba = Bacillus k · C - Corynebacterium Ce s Cellulomonas L = Lactobacillus S = Staphylococcus 30 Esimerkki 2
Lajin Streptomyces lividans (ATCC 19844) värillisten sisällysaineiden (aktinorodiini, prodigiosiini) synteesin stimulointi solunseinämäuutteiden avulla.
Esimerkin 1 olosuhteissa, mutta käyttäen vedessä, 35 joka on tislattu kahteen kertaan, 20 minuutin ajan 97302 14 120°C:ssa sterilisoitujen 2 mg:n solunseinämävalmisteiden steriilisuodoksia, aikaansaadaan lajilla Streptomyces li-vidans (ATCC 19844) miltei yhtä vahva väriaineen muodostuksen stimuloituminen kuin käytettäessä näiden sterili-5 soitujen solunseinämien suspensioita.
Esimerkki 3
Lajin Streptomyces lividans (ATCC 19844) värillisten sisällysaineiden (aktinorodiini, prodigiosiini) synteesin stimulointi solu-uutteiden avulla.
10 Esimerkin 2 olosuhteissa, mutta käyttäen kulloinkin 20 mg solumassaa 2 mg:n solunseinämävalmistetta asemesta aikaansaadaan suunnilleen yhtä voimakas väriaineenmuodos-tuksen stimuloituminen kuin käytettäessä sterilisoitujen solunseinämien suspensioita.
15 Esimerkki 4
Lajin Streptomyces coelicolor A3(2) eli (ATCC
13 405) värillisten sisällysaineiden synteesin stimulointi.
Esimerkin 1 olosuhteissa, mutta käyttäen lajia 20 Streptomyces coelicolor A3(2) aikaansaadaan tällä bakteerilla selvä väriaineenmuodostuksen (todennäköisesti samoin aktinorodiini) stimuloituminen.
Esimerkki 5
Lajin Streptomyces griseoruber (DSM 40275) väril-. 25 listen sisällysaineiden synteesin stimulointi.
Esimerkin 1 olosuhteissa, mutta käyttäen lajia
Streptomyces griseoruber (DSM 40275) aikaansaadaan tällä bakteerilla samoin hyvin selvä väriaineenmuodostuksen (luultavasti andtrasykliiniantibiootteja) lisääntyminen.
30 Esimerkki 6 ·, Lajin Streptomyces purpurascens (DSM 40 310) väril listen sisällysaineiden synteesin stimulointi.
Esimerkin 1 olosuhteissa, mutta käyttäen lajia
Streptomyces purpurascens (DSM 40 310) aikaansaadaan tällä 35 bakteerilla samoin voimakas väriaineenmuodostuksen (luul- 97302 15 tavasti samoin antrasykliiniantibiootteja) lisääntyminen.
Esimerkki 7
Lajin Streptomyces latericius (DSM 40 163) värillisten sisällysaineiden synteesin stimulointi.
5 Esimerkin 1 olosuhteissa, mutta käyttäen lajia
Streptomyces latericius (DSM 40 163) aikaansaadaan tällä bakteerilla samoin väriaineenmuodostuksen merkityksellinen lisääntyminen.
Esimerkki 8 10 Lajin Streptomyces violaceus (DSM 40 082) värillis ten sisällysaineiden synteesin stimulointi.
Esimerkin 1 olosuhteissa, mutta käyttäen lajia Streptomyces violaceus (DSM 40 082) aikaansaadaan tällä bakteerilla samoin väriaineenmuodostuksen merkityksellinen 15 lisääntyminen.
Esimerkki 9 β-laktaamiantibioottien (kefalosporiineja, penisilliini N) muodostuksen stimulointi lajilla Streptomyces clavuligerus (ATCC 27064).
20 5 g 3-(N-morfolino)-propaanisulfonihappoa (MOPS) 3,5 g dikaliumvetyfosfaattia 0,6 g magnesiumsulfaattiheptahydraattia 2 g L-asparagiinia 10 g glyserolia . 25 1 g hiivauutetta (Oxid, Wesel, DE) 1 ml hivenainesuolaliuosta - joka sisältää litraa kohden 1 g rauta(IIJsulfaattiheptahydraattia 1 g mangaani(II)kloriditetrahydraattia 1 g sinkkikloridiheptahydraattia 30 1 g kalsiumkloridia täytetään tislatulla vedellä 1 litraksi ja sterilisoidaan (20 minuuttia; 120°C).
Lisätään steriilisti kulloinkin 1,8 ml tätä ravintoliuosta steriilin polystyreeni- monisyvennyksisen maljan 35 (Multidish; Fa. Nunc, 62 Wiesbaden 12) 3 ml käsittäviin 97302 16 lokeroihin. Lisätään kulloinkin 2 mg elisitoriaktiivisuu-den suhteen testattavia solunseinämävalmisteita tai 10 mg testattavia soluja, joka on tislattu kahteen kertaan, vedessä, sterilisoituina (20 tai 45 minuuttia 120°C:ssa) 5 homogeenisina suspensioina. Kaksi lokeroa, jotka toimivat kontrolleina, eivät saa lisäyksiä. Kaikissa lokeroissa säädetään sitten tilavuus yhtäläisesti steriilisti kahteen kertaan tislatulla vedellä 2 ml:ksi. Jokaiseen lokeroon istutetaan identtisesti 5 μΐ lajin Streptomyces glavuli-10 gerus (ATCC 27064) itiösuspensiota.
Koesarjan inkubointi suoritetaan aerobisissa olosuhteissa (Tablar-ravistuslaite; 160 kierrosta minuutissa) 26°C:ssa. Inkubaatioaika on 24-28 tuntia.
Antibiootinmuodostusta tutkitaan kontrolleihin ver-15 raten levydiffuusiokokeen avulla. Pehmeään ravintoagariin suspendoidut detektoriorganismit ovat lajia Micrococcus luteus tai Bacillus subtilis (106 solua ml:a kohden). Pienille standardisuodatuslaatoille (halkaisija 0,9 cm) lisätään kulloinkin 25 μΐ sentrifugoitua (48 000 x g) koe-20 lokeroista saatua kasvuliuosta. Neljän tunnin diffuusio-ajan 4°C:ssa jälkeen biotestiä inkuboidaan 24 tunnin ajan 30° C:ssa.
Niillä viljelmillä, joita oli kasvatettu lisäten lajin Brevibacterium flavum ATCC 13826 tapettuja soluja 25 tai tämän bakteerin solunseinämävalmisteita tai lajin Co-rynebacterium diphtheriae (kanta Mass. 8) solunseinämävalmisteita, osoittivat kontrolleihin verrattuna selvästi suurentuneet estovyöhykkeet lisääntynyttä β-laktaamianti-bioottien (penisilliini N, kefalosporiineja) muodostusta 30 lajilla Streptomyces clavuligerus.
Esimerkki 10
Lajin Eschscholtzia californica viljelmien alkaloidien (sanguinariini, kelirubiini, markarpiini ja keleryt-riini) muodostuksen stimulointi.
35 Polystyreeni- monisyvennyksisen maljan (Fa. Nunc.
97302 17 6200 Wiesbaden 12) 24:ssä 1 ml:n lokerossa kasvatetaan kulloinkin olosuhteissa, jotka J. Berlin et ai. (Z. Natur-forsch., 38c, 1983, 346-352) ovat kuvanneet optimaaliksi, lajin Eschscholtzia californica solukkoviljelmiä. Yksi 5 lokero jää ilman muuta lisäystä kontrolliksi, yhteen lokeroon lisätään 266 mg/1 kuumassa uutettua ja etanolin avulla saosstettua hiivaelisitoria (valmistettu Kocoure-kin, J. ja Balloun. C.E. mukaan, J. Bacteriol. 100, 1969, 1175-1181), muut saavat kukin 266 mg/1 solunseinämävalmis-10 tetta, joka on peräisin taulukossa 3 esitetyiltä bakteereilta. Sitten viljelmiä inkuboidaan 72 tunnin ajan 24°C:ssa ja sen jälkeen määritetään viljelmien alkaloidi-pitoisuus fotometrisesti, jolloin hiivaelisitorin aiheuttama alkaloidipitoisuus arvioidaan 100 %:ksi.
15 Seuraavassa taulukossa 4 on esitetty tässä koesar jassa saavutetut tulokset.
TAULUKKO 4
Testatut bakteerisolunseinämät % elisitori- aktiivisuutta 20 -
Brevibacterium butanicum ATCC 21196 19
Brevibacterium flavum ATCC 13826 16
Brevibacterium flavum ATCC 14067 30
Brevibacterium glutamingenes ATCC 137 113 25 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13655 43
Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 40
Corynebacterium hydrocarboclastum ATCC 15592 8
Corynebacterium nephridii ATCC 11425 123
Corynebacterium paurometabolum ATCC 8368 16 30 Corynebacterium lilium ATCC 15990 108 ’ - Corynebacterium striatum ATCC 6940 17
Corynebacterium petrophilum ATCC 19080 0
Corynebacterium xerosis ATCC 373 102
Corynebacterium diphtheriae kanta Mass. 8 137 35 Rhodococcus fasciens ATCC 12975 27 97302 18
Prodococcus fascians 1 11
Prof. Sr. Stolpln, Univ. Bayreuth, isolaatti Rhodococcus fascians 2 7
Prof. Dr. Stolpln, Univ. Bayreuth, isolaatti 5 -
Esimerkki 11
Indolialkaloidien (vallesiakotamiini) muodostuksen stimulointi lajin Rauvolfia serpentina viljelmissä.
Lajin Rauvolfia serpentina suspensioviljelmää (Stö-10 ckigt, J.m, A. Pfitzner ja J. Firl: Plant Cell Rep. 1, 36-39 (1981) viljellään Linsmaierin ja Skoogin (LS) -elatus-aineessa (Physiol. Plantarum 18, 100-127 (1965) rotaatio-ravistuslaitteissa (100 kierrosta minuutissa) 23°C:ssa ja kestovalossa (600 luksia). Elisitorikäsittelyä varten is-15 tutetaan 200 g tuoreiden solujen painoa/1 LS-elatusainet-ta. Mikro-organismien elisitoripitoisina kappaleina käytetään taulukossa 4 esitettyjen bakteerien solunseinämäval-misteita konsentraationa 130 mg/1 viljelyainetta.
Viisi päivää kestäneen inkubaation jälkeen on sekä 20 elisitorikäsitellyissä viljelmissä että myös kontrolleissa solumassa kaksinkertaistunut. Solut kootaan talteen ja niitä uutetaan metanolilla.
Indolialkaloidin vallesiakotamiinimäärä määritetään uutteiden HPLC-erottelun avulla. Käsittelemättömät kon-25 trolliviljelmät sisältävät vain 1,16 mg/1 kasvuliuosta, . · kun sen sijaan elisitorikäsittelyn saaneissa viljelmissä saanto on suurimmillaan 58 mg/1. Tämä vastaa 50-kertaista lisäystä elisitorin vaikutuksesta.
Esimerkki 12 30 Lajin Rhodotorula glutinis IFO 0389 17-ketosteroi- direduktaasiaktiivisuuden stimulointi.
a) 2 litran erlenmeyerkolvissa olevaan 500 ml:aan steriiliä elatusainetta, joka sisältää 5 % glukoosimonohydraattia 35 2 % maissinliotusliuosta 97302 19 - säädettynä pH:hon 6,5 -
Istutetaan näyte lajin Rhodotorula glutinis IFO 0389 vino-agarviljelmästä ja kasvatetaan 40 tunnin ajan 30°C:ssa käyttäen 190 kierrosta minuutissa.
5 b) 500 ml:n erlenmeyerkolvissa olevaan 100 ml:aan steriiliä elatusainetta, joka sisältää 1 % maissinliotusliuosta 5 % Nurupania R (valmistaja Nurupan GmbH, 4000 Dus-seldorf 1; DE) 10 1 % Metarinia" (valmistaja Lucas Meyer; 2000-Ham- burg 28; DE) - säädettynä pH:hon 6,2 - istutetaan 10 ml esimerkin 12a mukaan valmistettua Rhodo-torula-esiviljelmää ja kasvatetaan 7 tunnin ajan 30°C:ssa 15 ja käyttäen 180 kierrosta minuutissa.
Sen jälkeen viljelmään lisätään 10 mg 3-hydroksi-1,3,5(10),7-estratetraen-17-onia ja fermentoidaan vielä 210 tunnin ajan. Sitten viljelmää uutetaan metyyli-isobu-tyyliketonilla, uute konsentroidaan ja saatu raaka tuote 20 puhdistetaan kromatografian avulla käyttäen silikageeli-pylvästä. Näin saadaan 5,9 mg l,3,5(10),7-estratetraeeni-3,17a-diolia - 59 % teoreettisesta määrästä.
c) Esimerkin 12b olosuhteissa fermentoidaan 10 mg 3-hydroksi-l,3,5(l0),7-estratetraeeni-17-onia lajin Rhodo-25 torula glutinis viljelmän avulla, kuitenkin sillä erotuksella, että tähän viljelmään lisätään juuri ennen substraatin lisäämistä 5 ml steriiliä suspensiota, jossa on 50 mg lajin Bacillus licheniformis (ATCC 9945) solunseinä-mävalmistetta vedessä. Viljelmän jälkikäsittelyn jälkeen 30 saadaan 6,8 mg 1,3,5( 10),7,estratetraeeni-3,17-diolia = 68 % teoreettisesta määrästä.
Esimerkki 13
Lajin Bacillus lentus (ATCC 13805) steroidi -/£ -de-hydraasiaktiivisuuden stimulointi 35 a) 2 litran erlenmeyerkolvissa olevaan 500 ml:aan 97302 20 steriiliä elatusainetta, joka sisältää 0,5 % maissinliotusliuosta 0,05 % glukoosiraonohydraattia 0,1 % hiivauutetta 5 - säädettynä pH:hon 7,0 - istutetaan lajia Bacillus lentus (ATCC 13 805) huuhdonta-liuoksen avulla ja ravistetaan 48 tunnin ajan 30°C:ssa käyttäen 190 kierrosta minuutissa.
b) 500 ml:n erlenmeyerkolvissa olevaan 100 ml:aan 10 steriiliä elatusainetta, joka sisältää 3,0 % soijajauhetta 0,5 % maissinliotusliuosta 0,1 % hiivauutetta 0,05 % glukoosimonohydraattia 15 - säädettynä pH:n 7,3 - istutetaan 10 ml Bacillus lentus -esiviljelmää ja ravistetaan 7 tunnin ajan 30°C:ssa käyttäen 180 kierrosta minuutissa. Sitten viljelmään lisätään steriilisuodatettu liuos, jossa on 40mg 6a,9a-difluori-118,17a-dihydroksi-20 16a-metyyli-4-pregneeni-3,20-dionia 4m l:ssa dimetyylifor-mamidia, ja inkuboidaan vielä 41 tunnin ajan.
Sitten viljelmää uutetaan metyyli-isobutyyliketo-nilla, uute konsentroidaan tyhjössä ja jäännös puhdistetaan suorittamalla kromatografia käyttäen silikageelipyl-25 västä. Näin saadaan 16 mg 6a,9a-difluori-ΙΙβ,17a-dihydrok- . * si-16a-metyyli-l,4-pregnadieeni-3,20-dionia (= 40 % teoreettisesta määrästä).
c) Esimerkin 13b olosuhteissa termentoidaan 40 mg 6a, 9a-dif luori-ΙΙβ, 17a-dihydroksi-l6a-metyyli-4-pregneeni- 30 3,20-dionia lajin Bacillus lentus viljelmän avulla, kui- • tenkin sillä erotuksella, että tähän viljelmään lisätään juuri ennen substraatin lisäämistä 5 ml steriiliä suspensiota, jossa on 50 mg lajin Corynebacterium diphtheriae (kanta Mass 8) solunseinämävalmistetta vedessä. Viljelmän 35 jälkikäsittelyn jälkeen saadaan 21 mg 6a,9a-difluori-ΙΙβ, - 97302 21 17a-dihydroksi-16a-metyyli-l,4-pregnadieeni-3,20-dionia (- 52,5 % teoreettisesta määrästä).
< Esimerkki 14
Lajin Claviceps paspali (ATCC 13895) alkaloidien-5 muodostuksen (lysergiinihappoamidi ja isolysergiinihappo-amidi) stimulointi.
a) 500 ml:n erlenmeyerkolvissa olevaan 50 ml:aan steriiliä elastusainetta, joka sisältää 4 % sorbilttia (teknisesti puhdasta) 10 1 % glukoosimonohydraattia 2 % meripihkahappoa 0,6 % ammoniumsulfaattia 0,5 % hiivauutetta (Difco(R>, Difco Labs, Detroit/ USA) 15 0,1 % kaliumdivetyfosfaattia 0,03 % magnesiumsulfaattiheptahydraattia - säädettynä natronlipeän avulla pH:hon 5,2 -istutetaan lajin Claviceps paspali (ATCC 13895) -70°C syväjäädytettyä viljelmää ja ravistetaan 5 päivän ajan 20 24°C:ssa käyttäen 240 kierrosta minuutissa.
b) 500 ml:n erlenmeyerkolvissa olevaan 50 ml:aan steriiliä elatusainetta, joka sisältää 8 % sorbiittia (teknisesti puhdasta) 6 % meripihkahappoa 25 0,9 % ammoniumsulfaattia 0,1 % kalsiumnitraattitetrahydraattia 0,05 % dikaliumvetyfosfaattia 0,03 % magnesiumsulfaattiheptahydraattia 0,02 % hiivauutetta (Difco(R), Difco Labs, Detroit/ 30 USA) 0,0007 % rauta(II)sulfaattiheptahydraattia 0,0006 % sinkkisulfaattiheptahydraattia - säädettynä natronlipeän avulla pH:hon 5,2 -istutetaan 5 ml lajin Claviceps paspali esiviljelmää ja 35 ravistetaan 250 tunnin ajan 24°C:ssa käyttäen 240 kierros- 97302 22 ta minuutissa.
Sitten lisätään viljelmään niin paljon natronli-peää, että saavutetaan vähintään pH-arvo 10, uutetaan metyyli- isobutyyli-ketoni 11a, konsentroidaan uutteet tyhjös-5 sä ja puhdistetaan ne suorittamalla kromatografia käyttäen silikageelipylvästä.
Näin saadaan 35 mg lysergiinihappoamidin ja isoly-sergiinihappoamidin seosta (saanto 700 mg/1 viljelmää).
c) Kasvatetaan esimerkin 14b olosuhteissa lajin 10 Claviceps paspali viljelmää, kuitenkin sillä erotuksella, että viljelmään lisätään 72 tunnin kuluttua 5 ml steriiliä suspensiota, jossa on 25 mg lajin Lactobacillus easel alalaji rhamnosus (ATCC 7469) solunseinämävalmistetta vedessä. Viljelmän jälkikäsittelyn jälkeen saadaan 45 mg lyser-15 giinihappoamidin ja isolysergiinihappoamidin seosta (saanto 900 mg/1 viljelmää).
Esimerkki 15
Lajin Penicillium raistrickii (ATCC 10490) 15a-hyd-roksylaasiaktiivisuuden stimulointi.
20 a) 2 litran erlenmeyerkolvlssa olevaan 500 ml:aan steriiliä elastusainetta, joka sisältää 3 % glukoosimonohydraattia 1 % maissinliotusliuosta 0,2 % natriumnitraattia 25 0,05 % magnesiumsulfaattiheptahydraattia 0,05 % kaliumkloridia 0,002 % rauta(II)sulfaattiheksahydraattia 0,1 % kaliumdivetyfosfaattia 0,2 % dikaliumvetyfosfaattia 30 - säädettynä pHthon 6,0 -
* istutetaan näyte lajin Penicillium raistrickii (ATCC
10490) vinoagarviljelmästä ja kasvatetaan 48 tunnin ajan 30°C:ssa käyttäen 180 kierrosta minuutissa.
b) 500 ml:n erlenmeyerkolvlssa olevaan 100 ml:aan 35 steriiliä elatusainetta, joka sisältää 97302 23 1 % maissinliotusliuosta 3 % glukoosimonohydraattia 0,1 % kallumdlvetyfosfaattla 0,2 % dikaliumvetyfosfaattia 5 0,05 % magnesiumsulfaattiheptahydraattia - säädettynä pH:hon 6,0 - lstuteaan 10 ml kohdan a) mukaisesti valmistettuna Peni-cillium-esiviljelmää.
Sen jälkeen viljelmään lisätään 300 mg 13-etyyli-10 4-goneeni-3,17-dionia ja fermentoidaan 120 tunnin ajan 30°C:ssa käyttäen 180 kierrosta minuutissa.
Sitten viljelmää uutetaan metyyli-isobutyyliketo-nilla, uute konsentroidaan ja saatu raakatuote puhdistetaan kromatografian avulla käyttäen silikageelipylvästä.
15 Näin saadaan 180 mg 13-etyyli-15a-hydroksi-4-goneeni-3,17-dionia.
c) Kohdan b) olosuhteissa fermentoidaan 300 mg 13-etyyli-4-goneeni-3,17-dionia lajin Penicillium raistrickii viljelmän avulla. Kuitenkin sillä erotuksella, että tähän 20 viljelmään lisätään juuri ennen substraatin lisäämistä 5 ml steriiliä suspensiota, jossa on 50 mg lajin Corynebac-terium diphtheriae (kanta Mass. 8) solunseinämävalmistetta vedessä. Viljelmän jälkikäsittelyn jälkeen saadaan 210 mg 13-etyyli-15a-hydroksi-4-goneeni-3,17-dionia.
25
Claims (6)
1. Menetelmä mikro-organismien ja korkeampien kasvien entsyymiaktiivisuuksien ja synteesitoiminnan lisäämi- 5 seksi, tunnettu siitä, että nämä saatetaan kosketukseen inaktivoitujen elisitoripitoisten mikro-organismien, näiden fragmenttien tai elisitoripitoisten mikro-organismien eritteiden kanssa, sillä edellytyksellä, että korkeampien kasvien entsyymiaktiivisuuksien ja synteesi-10 toiminnan lisäämiseksi käytetään inaktivoituja elisitori-pitoisia bakteereja, niiden fragmentteja tai elisitoripitoisten bakteerien eritteitä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä mikro-organismien entsyymiaktiivisuuksien ja synteesitoiminnan 15 lisäämiseksi, tunnettu siitä, että mikro-organismit saatetaan kosketukseen inaktivoitujen elisitoripitoisten mikro-organismien, näiden fragmenttien tai elisitoripitoisten mikro-organismien eritteiden kanssa.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä mikro-20 organismien synteesitoiminnan lisäämiseksi, tunnet- t u siitä, että väriainemuodostukseen, alkaloidimuodos-tukseen tai antibioottimuodostukseen kykeneviä bakteereja, sieniä ja hiivoja saatetaan kosketukseen inaktivoitujen elisitoripitoisten bakteerien, sienten tai hiivojen, näi-!! 25 den fragmenttien tai näiden mikro-organismien eritteiden kanssa.
4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä mikro-organismien entsyymiaktiivisuuksien lisäämiseksi, tunnettu siitä, että steroidien muuntamiseen kykeneviä 30 bakteereja, sieniä tai hiivoja saatetaan kosketukseen inaktivoitujen elisitoripitoisten bakteerien, sienten tai hiivojen, näiden fragmenttien tai näiden mikro-organismien eritteiden kanssa. 25 97302
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä korkeampien kasvien synteesitoiminnan lisäämiseksi, tunnettu siitä, että väriäinesynteesiin, alkaloidisyn-teesiin tai fytoaleksiinisynteesiin kykenevien korkeampien 5 kasvien soluviljelmiä saatetaan kosketukseen inaktivoitu-jen elisitoripitoisten bakteerien, näiden fragmenttien tai näiden bakteerien eritteiden kanssa.
6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen menetelmä mikro-organismien ja korkeampien kasvien entsyy- 10 miaktiivisuuksien ja synteesitoiminnan lisäämiseksi, tunnettu siitä, että nämä saatetaan kosketukseen vedessä lämpösterilisoitujen elisitoripitoisten mikro-organismien tai näiden suodosten kanssa. 97302 26
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3801023 | 1988-01-13 | ||
| DE3801023A DE3801023A1 (de) | 1988-01-13 | 1988-01-13 | Verfahren zur steigerung von enzym-aktivitaeten und der syntheseleistung von organismen |
| PCT/EP1989/000015 WO1989006687A1 (en) | 1988-01-13 | 1989-01-11 | Process for activating enzymes and promoting synthesis in organisms |
| EP8900015 | 1989-01-11 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI894304A0 FI894304A0 (fi) | 1989-09-12 |
| FI97302B FI97302B (fi) | 1996-08-15 |
| FI97302C true FI97302C (fi) | 1996-11-25 |
Family
ID=6345349
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI894304A FI97302C (fi) | 1988-01-13 | 1989-09-12 | Menetelmä organismien entsyymiaktiivisuuksien ja synteesisuorituksen lisäämiseksi |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0354945B1 (fi) |
| JP (1) | JPH02502881A (fi) |
| CN (1) | CN1034756A (fi) |
| AT (1) | ATE103325T1 (fi) |
| AU (2) | AU3215989A (fi) |
| BG (1) | BG60596B1 (fi) |
| CA (1) | CA1317247C (fi) |
| DD (1) | DD278357A5 (fi) |
| DE (2) | DE3801023A1 (fi) |
| DK (1) | DK442289A (fi) |
| ES (1) | ES2051894T3 (fi) |
| FI (1) | FI97302C (fi) |
| HU (1) | HU208341B (fi) |
| IE (1) | IE66500B1 (fi) |
| IL (1) | IL88953A (fi) |
| NO (1) | NO893643L (fi) |
| PT (1) | PT89427B (fi) |
| WO (1) | WO1989006687A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA89304B (fi) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7264951B1 (en) | 1992-02-20 | 2007-09-04 | Phyton, Inc. | Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of Taxus species |
| KR20090005241A (ko) | 1996-05-24 | 2009-01-12 | 디에프비 바이오테크 인코포레이티드 | 탁수스종의 세포 배양에 의한 탁산의 생산 증진 방법 |
| GB9611089D0 (en) * | 1996-05-28 | 1996-07-31 | Sandoz Ltd | Organic compounds |
| US10749991B2 (en) | 2017-05-31 | 2020-08-18 | Regents Of The University Of Minnesota | Emulation-based cross-technology communication |
| CN107746849B (zh) * | 2017-09-29 | 2022-01-18 | 天津科技大学 | 一种甾体羟化酶基因的高效筛选方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1259938A (en) * | 1985-12-05 | 1989-09-26 | Friedrich Constabel | Repeated elicitor treatment, a method for semicontinuous metabolite production by plant cells cultured in vitro |
-
1988
- 1988-01-13 DE DE3801023A patent/DE3801023A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-01-11 ES ES89100337T patent/ES2051894T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-11 HU HU89975A patent/HU208341B/hu not_active IP Right Cessation
- 1989-01-11 EP EP89901715A patent/EP0354945B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-11 DE DE89901715T patent/DE58907274D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-11 AU AU32159/89A patent/AU3215989A/en not_active Abandoned
- 1989-01-11 AT AT89901715T patent/ATE103325T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-01-11 EP EP89100337A patent/EP0325933B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-01-11 WO PCT/EP1989/000015 patent/WO1989006687A1/de active IP Right Grant
- 1989-01-11 DD DD32499389A patent/DD278357A5/de not_active IP Right Cessation
- 1989-01-11 JP JP1501513A patent/JPH02502881A/ja active Pending
- 1989-01-12 PT PT89427A patent/PT89427B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-01-12 CA CA000588110A patent/CA1317247C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-01-13 CN CN89100184A patent/CN1034756A/zh active Pending
- 1989-01-13 IL IL8895389A patent/IL88953A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-01-13 ZA ZA89304A patent/ZA89304B/xx unknown
- 1989-01-13 IE IE7989A patent/IE66500B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-09-07 DK DK442289A patent/DK442289A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-09-12 FI FI894304A patent/FI97302C/fi not_active IP Right Cessation
- 1989-09-12 NO NO89893643A patent/NO893643L/no unknown
- 1989-09-13 BG BG89739A patent/BG60596B1/bg unknown
-
1992
- 1992-11-05 AU AU28183/92A patent/AU2818392A/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3215989A (en) | 1989-08-11 |
| WO1989006687A1 (en) | 1989-07-27 |
| DD278357A5 (de) | 1990-05-02 |
| IL88953A0 (en) | 1989-08-15 |
| ATE103325T1 (de) | 1994-04-15 |
| DE58907274D1 (de) | 1994-04-28 |
| FI97302B (fi) | 1996-08-15 |
| HUT57270A (en) | 1991-11-28 |
| PT89427A (pt) | 1990-02-08 |
| CN1034756A (zh) | 1989-08-16 |
| IE890079L (en) | 1989-07-13 |
| EP0325933A1 (de) | 1989-08-02 |
| EP0354945B1 (de) | 1994-03-23 |
| CA1317247C (en) | 1993-05-04 |
| HU208341B (en) | 1993-09-28 |
| FI894304A0 (fi) | 1989-09-12 |
| IL88953A (en) | 1995-03-30 |
| DK442289D0 (da) | 1989-09-07 |
| EP0354945A1 (de) | 1990-02-21 |
| PT89427B (pt) | 1993-09-30 |
| BG60596B1 (en) | 1995-09-29 |
| AU2818392A (en) | 1993-01-14 |
| NO893643D0 (no) | 1989-09-12 |
| NO893643L (no) | 1989-09-12 |
| ES2051894T3 (es) | 1994-07-01 |
| EP0325933B1 (de) | 1994-03-09 |
| IE66500B1 (en) | 1996-01-10 |
| JPH02502881A (ja) | 1990-09-13 |
| ZA89304B (en) | 1989-10-25 |
| DE3801023A1 (de) | 1989-07-27 |
| DK442289A (da) | 1989-09-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kunze et al. | Apicularens A and B, new cytostatic macrolides from Chondromyces species (myxobacteria): production, physico-chemical and biological properties | |
| CN111018954B (zh) | 具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-缬-亮肽及制备方法 | |
| Kunze et al. | Ajudazols, New Inhibitors of the Mitochondrial Electron Transport from Chondromyces crocatus Production, Antimicrobial Activity and Mechanism of Action | |
| CN113307848A (zh) | 具有抗真菌和清除自由基活性的环色-丝-缬-异亮-亮肽及制备方法 | |
| FI97302C (fi) | Menetelmä organismien entsyymiaktiivisuuksien ja synteesisuorituksen lisäämiseksi | |
| Domenech et al. | Bacillus spp. and Pisolithus tinctorius effects on Quercus ilex ssp. ballota: a study on tree growth, rhizosphere community structure and mycorrhizal infection | |
| El-sersy et al. | Antagonistic effect of marine Nocardia brasiliensis against the fish pathogen Vibrio damsela: Application of Plackett | |
| Hitchcock et al. | Actinomycin biosynthesis by protoplasts derived from Streptomyces parvulus | |
| CN109762046B (zh) | 环肽类抗生素及其制备方法和在制备抗结核分枝杆菌药物中的应用 | |
| WO1990010010A1 (fr) | Nouvelle substance, trehalostatine, et sa production | |
| WO2007135941A1 (ja) | 酢酸菌型セラミドの製造方法 | |
| Gutierrez et al. | The effect of some culture maintenance and inoculum development techniques on solvent production by Clostridium acetobutylicum | |
| Skotnicki et al. | Bacterial and bacteroid properties of mutants of Rhizobium trifolii strain T1 uncoupled in oxidative phosphorylation | |
| Smirnova et al. | L-Lysine-α-Oxidase: Acidovorax citrulli Bacterium Inhibitor | |
| Krivosheeva et al. | The stimulating effect of exometabolites of the marine microalgae Phaeodactylum tricornutum Bohlin on reproduction of Listeria monocytogenes | |
| Giraldi et al. | Effects of some N-diazoacetyl-glycine derivatives on the growth of E. coli | |
| JP3796540B2 (ja) | 黄色色素の製造方法 | |
| Kingsley et al. | Production of antibiotic from actinomycete from unexplored region of Kolli Hills, Tamilnadu and antibacterial activity against UTI pathogens | |
| Meena | Survival and effect of Pseudomonas fluorescens formulation developed with various carrier materials in the management of late leaf spot of groundnut. | |
| RU2016895C1 (ru) | Штамм бактерий arthrobacter crystallopoictes - деструктор пиридина | |
| Stanek | Micro-organisms and cultivated edible fungi | |
| JPH0625277A (ja) | 新規テストステロン−５α−レダクターゼ阻害物質ＳＮＡ−４６０６産生菌、新規テストステロン−５α−レダクターゼ阻害物質ＳＮＡ−４６０６及びその製造法 | |
| JPH0383947A (ja) | 新規なｑ―５４８６―ａ物質及びその製造法 | |
| JPS5945894A (ja) | 補酵素ｑ↓１↓０の製造法 | |
| Mehta et al. | Claviceps: A Biotechnologically Exploited Fungus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: SCHERING AKTIENGESELLSCHAFT |