HU196435B

HU196435B - Process for separating pancreatine

Info

Publication number: HU196435B
Application number: HU834516A
Authority: HU
Inventors: Hans Schultze
Original assignee: Nordmark Werke Gmbh
Priority date: 1982-12-30
Filing date: 1983-12-29
Publication date: 1988-11-28
Also published as: ES528537A0; CA1208580A; DK173599B1; US4623624A; AR232000A1; ES8407516A1; YU45584B; UA5996A1; EP0115023A2; DK605583D0; BR8307280A; MD411C2; DK605583A; PL141118B1; SU1644712A3; DE3377506D1; EP0115023A3; EP0115023B1; PL245381A1; DD212981A5

Description

A találmány tárgya új eljárás pankreatiri kinyerésére.

Pankreatinnak nevezzük a hasnyálmirigyből extrahált enzimelegyet, ami lipáz, amiláz és proteáz enzimekből áll. A pankreatint a hasnyálmirigy-elégtelenségen alapuló emésztési zavarok kezelésére alkalmazzuk. Kiindulási anyagként főleg a friss vagy fagyasztott sertéshasnyálmirigy szögéi, amiből eredetileg csak a vizet és a zsírt távolították el. Az enzimek érzékenysége miatt azonban ezt csak nagyon óvatosan lehet elvégezni.

A jelenleg szokásos eljárások szerint a szárítást és a zsirtalanítást olyan oldószerekkel hajtjuk végre, amelyek a vizet is és a zsírt is oldják, például acetonnal vagy nagyobb szénatomszámú alkoholokkal. Más ismert eljárások szerint a két folyamatot egymás után hajtjuk végre, többnyire előbb a szárítást (liofilizálás), majd illékony zsiroldőszerekkel a zsirtalanítást; vagy fordítva, előbb folyékony fázisban a zsirtalanítást (halogén (-szénhidrogénekkel, és azután a folyékony fázis szárítását.

Mindegyik pankrealinkészitménynek amelyek ezekkel az eljárásokkal készültek megvan az a hátránya, hogy bennük a proteázok, például a tripszin és a kimotripszin nem szabad állapotban, hanem inaktív enzimogén formában vannak jelen. Ezért éppen azoknál n betegeknél, akiknek nincs saját enterokináz termésük, ezek az enzimogén formák nem aktiválódhatnak, és így ezek a pankreatinkészitmények számukra teljesen hatástalanok. További hátránya ezeknek a pankreatinkészitményeknek a rosttartalmuk, ami a mirigy kötőszövetéből származik és orvosilag értéktelen. Ez a rosttartalom a galenikus készítménynél nemcsak a préseléses eljárást zavarja, hanem a hatás helyén a készítmény kívánatos szétesését is akadályozza, ezáltal az enzimek nagy része kihasználatlanul marad.

Néhány újabb eljárásnál ezeket az ismereteket már figyelembe vették. A rostokat eltávolítják és, hogy aktív enzimet kapjanak aulolizist hajtanak végre. Azonban az autolizis az enzimeket nemcsak szabaddá teszi, hanem károsítja is. igy ezeknél az eljárásoknál teljes enzimkinyerést nem lehet elérni.

Az aulolizist nagyon különböző módon hajthatjuk végre. A 3 223 594 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban például az aulolizist 2 óra hosszat végzik szobahőmérsékleten, sok viz jelenlétében, a 2 620 289 és 2 716 719 számú német szövetségi köztársasági nyilvánosságra hozatali irat szerinti eljárásoknál 15 óra hosszat, 15 °C-on illetve 4 óra hosezat, 15 °C-on, vízzel nem elegyedő zsíroldószerek jelenlétében. Az

328 202 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás szerint az aulolizist 0,5-2 óra hosszal, végzik 20-30 °C hőmérsékleten, nát.rium-hidroxid vagy ammónia hozzáadása mellett. A

106 706 számú német szövetségi köztársasági közzétételi irat olyan aulolizist ir le, amely az enterokináz aktiválásénak javítása céljából több mint 7 napig tart, 4 °C-on, serléspatkóbéi (duodenuhil jelenlétében.

A 3 223 594 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 11%-os kitermelést közöl 10 · NF enzimegység inellett, ami a lehetséges enzimkilermelés mintegy 69%-énak felel meg, mivel 100 g veszteség nélkül szárított és zsírtalanított mirigyszövetből általában 20 g 8 · NF minőségű pankreatint lehet nyerni.

Az 1 328 202 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás 6-10 NF minőségű sterilre szűrt pankreatinnak 3,4 súlyszázalékos kitermelését írja, ami a számszerűleg lehetséges enzimkitermelés mindössze 13-21%-ának felel meg. A 2 620 289 és 2 716 719 számú német szövetségi köztársasági nyilvánosságra hozatali irat szerinti ejárés a lipázra nézve teljes enzimkinyerésről tudósít, mig az amiláz és proteáz kitermelések nyilvánvalóan annyira alacsonyak, hogy itt már nem lehet pankreatinról beszélni, hanem csak .lipázhan gazdag enzimkészi(.menyről

Az aktív enzim számszerűleg lehetséges teljes kinyerését tehát nyilvánvalóan még nem érték el. Ugyancsak nincs adat a proteázakliválódás mértékéről, amelyet az enterokinázakliválással és az enterokinázaktjválás nélküli proleazaktivilás összehasonlításával határozhatunk meg. Aktiválás nélkül kisebb mint 0,5 FIP enziinegység/ing értékek találhatók.

A technika jelenlegi szintjét bemutató leírásban említett NF a National Formulary rövidítése, amit az Amerikai Gyógyszerészeti Társaság (American Pharmaceutical Association) által kiadott hivatalos amerikai gyógyszerkönyv használ. A 13. kiadás (NF XIII) 514. oldalán a pankreatint enzimtartalmú anyagnak írják le, ami képes arra, hogy a saját súlyának legalább huszonötszörös súlyú burgonyakeményitót oldható szénhidrátokká alalalakitson, és a saját súlyának legalább huszonötszörös súlyú kazeint proteolizéljon. Az ennél nagyobb emésztóképességü pankreatinl a megfelelő szorzőfaktorral látjuk el.

igy például négyszeres NF (vagy 4 · NF) olyan pankreatint jelöl, amiben annyi amiláz, proteáz és lipáz van, hogy ebből a pankreatinból 1 g (négyszer huszonötszörös súlyú, azaz) 100 g megfelelő szubsztrátum (keményítő, kazein, olívaolaj) átalakulását katalizálni tudja.

A .Fédération Internationale Pharmaceutiquc ’ csúcsszövetség alatt működő .Comission on Pharmaceutical Enzymes' adja meg a FlP-egység definícióját a .Pharmaceutical Enzymes’ című monográfiájában (R. Ruyssen és A. Lauwers, 1978, Scientific Publishing Company, Gént (Relgium). A 22. oldalon találjuk az általános meghatározást, miszerint 1 FlP-enzimegységü készítmény, jól definiált külső körülmények között 1 mikromolnyi illetve 1 mikroekvivalensnyi szubsztrátumnak 1 perc alatt történő átalakulását katalizálja, 3 vagy - olyan esetekben, amikor a szubsztrátum kémiailag nem kielégítően ismert - percenként 1 mikrontól illetve 1 mikroekvivalens reakcióterméket állít elő. Az egyes enzimek meghatározásánál használt külső feltételeket a könyv n 21-84. oldalon ismerteti.

Λ FlP-egységet tehát katalizált kezdeti reakciósebesség értékekből határozzuk meg, és ezáltal ezeket az értékeket gyorsabban (és pontosabban) megkapjuk, mint az előbb tárgyalt NF-szorzófaktorok értékeit.

Egy, a FlP-egységeknek NF-szorzófaktorokra (kísérletileg) való átszámolásí táblázatot az alábbiakban közlünk, ami a lipáz-egységeket is tartalmazza annak ellenére, hogy az NF XIII lipán-meghatározást nem közöl. Ezért feltesszük, hogy egy pankreatinkészitmény, amelyik ainilázra nézve például 6 · NF minőségűnek bizonyul, a proteázokra és a lipázra nézve is 6 · NF minőségű, azaz az enzimek aktivitásarányát a természetes sertéshasnyálmirigyben és a belőle készült parik reatinkészitményben állandónak tekintjük.

A gyakorlati haszon az NF-szorzófaktorok használatánál az, Iiogy a pankreatinban lévő összes enzim aktivitását egyetlen egy szám jelzi.

Tapasztalat szerint megfelel:

· NF = 6250 FlP-egység/g pankreatinamiláz 1 · NF = 5000 FlP-egység/g pankreatinlipáz 1 · NF = 375 FlP-egység/g pankreatintripszin · NF - 1250 FlP-egység/g pankreatinkimotripszin

A F1P értékek megduplázása az NF-szorzófaktorok megduplázását jelenti, és igy tovább.

Azoknál az ismert eljárásoknál, amelyek autolizátumból indulnak ki, a pankreatin sohasem válik ki olyan formában, hogy a további feldolgozása problémamentes legyen. Olyan eljárások, amelyek a hasnyálmirigyből közvetlenül nyerik ki a pankreatint, és főleg a nagy térfogatsúlyú pankreatint, szűkebb értelemben nem léteznek, az előbb említett .lipázban gazdag enzimkészitmény' előállításával kell számolni, és amelyek ugyanakkor jelentékeny technikai felszereltség mellett 3 különböző oldószerrel dolgoznak.

A találmány feladata ezért a lehető legegyszerűbb és legveszélytelenebb eljárás megadása, amivel nagy technikai felszereltség nélkül, teljes enzimkinyerés mellett a legnagyobb enzimaktivitású és szabad proteáztartalmú pankreatint nyerjük, amelyik ezenkívül csiraszegény, könnyen szétesik, nagy térfogatsúlyü és rostmentes, és amelyik gyakorlatilag enzimveszteség nélkül feldolgozható és raktározható, és a lényeges lépései a vizes, adott esetben kalciumion tartalmú hasnyálmirigy-szövetpép illetve vizes szövetszuszpenzió autolizálása, a rostanyagok eltávolítása, valamint adott esetben víztelenítés, zsírtalanitás, kicsapás és a kapott csapadék szárítása.

Ezt a feladatot a talámány szerinti módon úgy oidjuk meg, hogy az autolizist a szuszpenzióra vonatkoztatva legfeljebb -20 tőmegszázaléknyi izopropanol hozzáadása mellett, 6,5-8,5 pH értéknél, előnyösen 6,5-7,5 pH értékre beálló puffer, például a bevitt mirigyszövet súlyára vonatkoztatva legfeljebb 3%, de különösen 1-1,5% alkálifém-hidrogén-karbonát jelenlétében, adott esetben kismennyiségű kaiciumsó jelenlétében, 30 °C alatti hőmérsékleten végezzük, és az autolizíst megszakítjuk, mihelyt az autolizátumból kivett próbaminta 55-65%-os vizes izopropanolban a 3-10 mm/1-3 perc ülepedés) sebességet eléri. Az adat a földi nehézségi, tehát nem centrifugális erőtérben való úlepedési sebességre vonatkozik.

Az autolízis befejeződik izopropanol nak az autolieátum főtömegéhez, a víz és izopropanol összsúlyára vonatkoztatott 30-35 tőmegszázalékig való adásával, az erre higanfolyóssá váló aut.olizátumot a kötőszöveti rostoktól leszűrhetjük. A szürletet 15-25 °C-on izopropanolba öntjük úgy, hogy megint csak a víz és az izopropanol összsúlyára vonatkoztatva 55-65%-os oldat keletkezzen, amiből a pankreatin durvaszemcsés formában kiválik és rögtön leülepszik. Az anyaiüg dekantálása után a kiülepedett pankreatint izopropanollal való többszöri felkeveréssel és ülepítéssel zsír- és triptonmentessé mossuk. (A tripton tripszin hatáséra proteinből képződött pepton). A csapadéknak végül 70-85 tőmegszázalék - előnyösen 75-76 súlyszázalék - izopropanol koncentrációjúnak kell lennie, és ieszívatás5al vagy kicentrifugálással, előnyösen csökkentett nyomóson és száraz levegővel (például 20 °C-on kisebb mint 20% relatív nedvességtartalom) vagy nitrogénnel való kezeléssel megszáritjuk. A csapadék fentiekben leírt mosását izopropanol helyett acetonnal is végezhetjük.

A vizes oldatok illetve anyalúgok alkoholtartalmára vonatkozó előbbi adatoknál, amennyiben a bevitt nyersanyag súlyát, beszámítjuk, a víztartalmai 63 töniegszázaléknak tételezzük fel.

A csapadéknak az utóbb megadott izopropanol végkoncentráció jónál figyelembe kell venni, hogy az egyensúly beállása a csapadék és az anyalúg között nagyon sokáig tarthat, mívei a fehérjék a vizet nagyon makacsul megkötik, és ezért a kiulepedelt részecskéken belül vízben gazdag fázis van. Ezért a vég koncentrációadatok nem az oldatfázis analitikai összetételére vonatkoznak, hanem mint az előbb megadtuk, számítottak.

A találmány szerinti eljárást gyakorlatilag a következőképpen végezzük:

A foszlatott vagy megdaráit hasnyálmirigyhez a jobb keverhelóség céljából 20-80%-os vizet adunk. Az autolizis folyamatát 1-1,5% nátrium-hidrogén-karbonát hozzáadáséval kíméletesen, tehát anélkül, hogy az enzimek károsodnának, a kívánt módon vezetjük

-3196435 és gyorsítjuk; több mint 3% hidrogénkarbonát hozzáadása a pankreatin tárolhatóságát veszélyeztetheti. Kis mennyiségű kalciumsö hozzáadása (például 1% alatt) az autolizis számára kedvező. A proteázoknak proenzimjeikböl való szabaddá válásával párhuzamosan, az állandóan növekvő mennyiségű szabad proteázok által, először is felgyorsul a kísérő hasnyálmirigy fehérjék emésztődése.

Az emésztödés azonban végül átterjedne az érzékeny enzimekre is úgy, hogy különösen az amiláz, de maguk a proteázok is károsodnának. Éppen a proteázok kímélése céljából adunk az elegyhez legfeljebb 20%, előnyösen mintegy 10-15% izopropanolt. Ez az izopropanol mennyiség azonban magában nem elegendő arra, hogy a teljes enzimaktivitás megmaradjon. Ezért fontos a kezdődő enzimkárosodás időpontját kitaláni, és legkedvezőbb az autolizist röviddel ezelőtt az időpont előtt megszakítani. Az autolizisnek eddig az időpontig való tartama, a teljesen azonos külső fetételek ellenére is, akár 600%-kal is ingadozhat, a hasnyálmirigy eredetétől, koratői és tárolásától függően úgy, hogy általános idő nem adható meg.

A találmány szerint a legkedvezőbb időpontot úgy határozzuk meg, hogy egyszerű gyorsvizsgálattal az autolizátumböl kivett próbán, 55-65%-os izopropanolban az optimális ülepedési sebességet megfigyeljük. Ez az ülepedési vizsgálat, a kis próbákon gyakorlatilag az autolizátumnak a pankreatin kiválásáig végrehajtott további feldolgozása és az állandóan változó ülepedési viszonyok megfigyelése. Ehhez pédául félóránként - a vége felé 10-15 percenként - mindig 10 g autolizátumszuszpenziöt veszünk ki, 5 ml 84%-os izopropanollal elkeverjük, és a keletkezett oldatot keverés közben 20 ml 84%-os izopropanolba öntjük. A kivált csapadék ülepedési sebességét határozzuk meg. Ha 3 perc ülepedési idő után az 50 ml-es főzőpohárban például több mint 3-5 mm tiszta felső réteg figyelhető meg, úgy szabály szerint elértük az optimális ülepedési sebességet, és ezzel a keresett enzimkárosodás előtti időpontot is. A kezdődő enzimkárosodást arról lehet megismerni, hogy az anyalüg (a felső réteg) már nem liszta (illetve az üledék és az anyalúg között zavaros zóna van).

Különböző sarzsok egységesebb autolizálódásának elérésére előnyös egy korábbi nyeredékböl egy kevés pankreatint hozzáadni.

Az autolizist -2 °C és 30 °C közötti, előnyösen 25 °C alatti hőmérsékleten hajtjuk végre, de nem kell állandó hőmérsékletet tartani. Itt. egy sor hasznosítási lehetőség adódik, igy energiatakarékosság, éjszaka vagy hét végén végrehajtott autolizis, munkaidőmegtakaritás. Az autolizis legkedvezőbb végpontját mindig az ülepedési próbából határozzuk meg.

Ezután az autolizátum egész mennyiségéhez további izopropanolt adunk, hogy az autolizist megszakítsuk. A találmány szerinti eljárásnál a víz és alkohol össztömegére vonatkoztatva 30-35% izopropanol tartamú elegy rövid keverésével csaknem tiszta és annyira hígan folyós oldal keletkezik az oldhatatlan rostok mellett, hogy a rostok elválasztása nagy méretekben is teljesen problémamentes

4-5 mm lyukbőségű ezitaszövetból készült kosár alkalmazásával, amit a legjobb keverővei ellátni, hogy végül száraz rostmaradékot nyerjünk. A leszűrt oldatot pankreatin kinyerése céljából annyi 80-100%-os izopropanolba folyatjuk, hogy az a 30-35% izopropanol tartalmú eleggyel elkeveredve a csapadék kiválásához szükséges 55-65% izopropanol koncentrációt elérje. Előnyös a vizes oldatból visszanyert, úgynevezett 84%-os izopropanolt használni, ami a 88%-os azeotróp elegyet megközelítve mintegy 84% izopropanol tartalmú.

55% alatti koncentrációnál a leválás nem tökéletes, ilyenkor tehát kitermelésveszteséggel kell számolni. 65% feletti koncentrációnál valószínűleg a nem kívánt enziminhibitorok is kiválnak, és ezáltal a proteázok aktivitása alacsonyabb lesz.

A találmány szerinti eljárással kapott pankreatin annyira durvaszemcsés, hogy egy órán belül az eredeti térfogat 10-20%-ára kiülepszik, és a felső tiszta anyalúgot egyszerűen dekantálhatjuk vagy leszivat.hatjuk. A leülepedett csapadékot egyszerű módon a visszanyert 84%-os, legvégén friss, vízmentes izopropanollal való felkeverésekkel és az ezeket követő ülepitésekkel mossuk. Bár ezt az ülepitési módszert az 1 328 202 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás már ismertette, mégsem volt semmi jelentősége, mivel az ülepités többnyire nem sikerült. Pontosabban, csak a találmány szerinti ülepitési próbával válik ez biztos eljárássá.

Ehhez a folyamathoz más szokásos eljárások zárt, védógázzal ellátott centrifugát használnak, ami a terméket melegedés miatt károsítja, a leváláshoz lényegesen hosszabb idő szükséges, és a pankreatin mosása csak friss oldószerben való intenzív aprítással (a helyi túlmelegedés veszélye) és az ezt követő újabb centrifugálással lehetséges, miáltal sok energiára és munkaidőre van szükség.

Az elválasztott anyalűgból az izopropanolt desztillációval visszanyerhetjük. A desztillációs maradék szétválik egy alsó vizes fázisra, ami szappant és triptont tartalmaz oldott állapotban és egy ezen úszó zsírrétegre, ami lehűlés után megdermed. A visszanyert 84%-os izopropanolt a találmány szerinti eljárás bármely folyamatához közvetlenül újra felhasználhatjuk.

Az izopropanoltartalomnak 70-85%-ra való beállítása a következőkben leírt szárítási eljárásnál kedvező; izopropanol helyett 805

-95%-os aceton is használható, ehhez azonban oldószert kell cserélni.

Λ kapott pankreatin üledék kiválóan szűrhető, így a legegyszerűbb, ha nuccson leszivatjuk. Természetesen önműködően dől- 5 gozó szűrőt vagy automata centrifugát is alkalmazhatunk. A maradékot a szokásos módon, például liofilezéssel Lehetjük eltarthatövá; előnyös azonban a következőképpen eljárni: 10

A kristálykása száradása közben - amihez 70-85%, előnyösen 75-80% izopropanol tartalmú anyákig tapad - erős térfogatcsókkenést figyelhetünk meg. Ez a zsugorodási folyamat nagy térfogatsúlyú pankreatint 15 eredményez 10,5-0,7 g/ml), amiből dúrvaőrlés után jól szórható részecskék keletkeznek. Ezzel szemben, ha a szárítandó pankreatin izopropanol tartalma lényegesen 85-86% felett van, úgy nincs térfogatcsökkenés, és olyan 20 alacsony térfogatsúlyú termék keletkezik 10,2 g/ml), hogy ez elektrosztatikusán könynyen feltöltódik, és ezáltal nehezen kezelhető. Másfelől, ha a szárítandó pankreatin izopropanol tartalma 70% alatt van, úgy bekö- 25 vetkezik ugyan a kívánt térfogatcsökkenés, de a lipáz bizonyos mértékig károsodik, még ha a szárítást 0 °C-on, csökkentett nyomáson is hajtjuk végre. Enzimkárosodás akkor is felléphet, ha 25 °C felett szárítunk, vagy ha 30 - csökkentett nyomáson vagy anélkül - a szárítóst olyan levegővel végezzük el, aminek relatív nedvességtartalma 20 °C-on több mint 20%. A most megadott értékek egy kevéssé függnek a tényleges izopropanoltartalomtól.

A találmány szerint előállított pankreatin csiraszegény. A csírák legnagyobbrészt a rostokon maradnak, amiről a pankreatin oldalol leszűrtük. Ezenkívül a szükséges koncentrációjú izopropanol tudvalevőleg a csirák dőlésére szolgál, különösen azért, mert a kezdetben a tiszta vizes szuszpenziöban adott esetben jelenlévő spórák a autolízis közben az érzékeny vegetatív alakba mennek át.

A találmány szerint előállított pankreatin jó eltarthatóságát a terhelési próba teszi egyértelművé, amivel drazsévá való további feldolgozásnál számolunk: a terhelés abban áll, hogy a pankreatin!. először 20 óra hoszszat, 20 °C-os és 58% relatív nedvességtartalmú levegőn tároljuk, és ezután zárt edényben 24 óra hosszat 50 °C-on melegítjük.

1. Táblázat

A technika jelenlegi állása és a találmány szerint előállított pankreatinkészitmények amiláz- és lipáz-stabilitását hasonlítjuk össze. Az 1., 2. és 3. jelű pankreatinkészítmények különböző gyártó cégek kereskedelmi forgalomban lévő készítményei.

Előállítási eljárás	Amiláz	Terhelési	Lipáz	Terhelési
	Kiindulási	veszteség	Kiindulási	veszteség
	aktivitás	%	aktivitás	%
	FlP-egység/mg		FíP-egység/ing
1. Techn. jelenlegi állása szerinti	43.1	6	40.7	7
2. Techn. jelenlegi állása szerinti	57.2	43	37.0	14
3. Techn. jelenlegi állása szerinti	51.0	41	48.3	31
4. Találmány szerinti	93.6	3	90.3	6

Az 1. táblázat azt mutatja, hogy a hagyományos pankreatinkészítményeknél a terhelési veszteségek az enzimaktivitással erősen nőnek. Meglepő módon azonban a talál- 50 mány szerinti eljárással előállított pankreatinkészítménynek, lényegesen nagyobb enzimaktivitása ellenére, a legkisebb a terhelési vesztesége.

Példa

100 kg mélyhűtött sertéshasnyálmirigyet foszlatunk vagy ledarálunk, és 250 1-es üst- 60 ben 100 g kalcium-glükonátot tartalmazó 20 1 vízben 200 g szilikon hab zás gátlóval elkeverünk. A mirigy szabad tripszintartalma szerint legfeljebb 1 kg kész pankreatinnak 5 1 vízzel készült oldatát adjuk az autolizátum- 65 hoz, mint kezdeti reakciósegítő anyagot. Ezt a pankreatint az alább leírt .37°-hidrolizis próbával vizsgáljuk meg. Erre a célra a főtömegből 120 g-ot veszünk ki.

Ezután keverés közben az elegyhez adunk 15 liter 84%-os izopropanolt és 1,5 kg nátriurn-hidrogén-karbonátnak 20 liter vizzel készült oldatát. Egy éjjen át állni hagyjuk, 55 ezalatt a hőmérséklet körülbelül 2 °C-ról 12 °C-ra emelkedik, reggel 20 °C-ra melegítjük és ezen a hőmérsékleten továbbkeverjük.

Az autolizis végpontját az ülepedési vizsgálat adja. Az autolízis utolsó szakaszéban minden fél-, később minden negyedórában 10 g szuszpenziót veszünk ki az elegyból, a mintát üvegbottal 5,4 ml 84%-os izopropanollal elkeverjük, és egy percig továbbkeverjúk. A keletkezett oldatból az üvegbotra ragadt rostokat eltávolítjuk, és az

-511 oldatot mágneses keverővei ellátott 50 ml-es főzőpohárban 20 ml 84%-os vizes izopropanolba bekeverjük. Egy perc múlva a keveröt leállítjuk, és az elegyet egy illetve három percen át ülepedni hagyjuk. 5

A próbát pozitívnak, és ezáltal az autolizist befejezettnek értékeljük mihelyt az elegyben egy perc múlva 3 mm, illetve három perc múlva 10 mm magasságú (többé-kevésbé tiszta) felső fázis keletkezik. 10

Példaként tipikus ülepedési próbasort mutatunk, ami akkor kezdődik, amikor az autolizátum hőmérséklete eléri a 20 “C-ot.

Ülepedési próba 15

Autolízis időtartama 20 “C-on	mm/0.5 perc	megfelel mm/perc	megfelel mm/3 perc
1.00 óra	0	0	0
2.00 óra	0	0	0
2.50 óra	0	0	1
2.75 óra	0	1	4
3.00 óra	1	3	10
3.25 óra	3	6	18
3.50 óra	5	10	20
3.75 óra	9	18	20
4.00 óra	14	20	20 .

Ebben a példában tehát az autolízis befejezésének a legkedvezőbb időpontját 3 óra múlva érjük el. Ezáltal az is lehetővé válik, hogy más, ismeretlen (például hosszabb vagy 40 rövidebb ideig tárolt) sertéspankreatin készítményekről összehasonlítható képet kapjunk a ,37“-hidrolizispróba' végrehajtásával:

A kalcium-glükonátos mirigypépből 120 g-ot kiveszünk, hozzáadjuk 1,5 g nátri- 45 um-hidrogén-karbonátnak 25 ml vízzel készült oldatát, és 37 °C-on fél óra hosszat keverjük. Ebből a gyorsautotízátumból hajtjuk végre az ülepedési vizsgálatot. 2 mm/3 perc alatti értéknél 2 millió egység szabad 50 tripszint, a legfeljebb 12 mm/perc értéknél 1 millió egységnyit és a még nagyobb ülepedési sebességnél pedig szabad tripszint már nem adunk a főrészhez (pankreatin formájában). Például 1 millió egység szabad trip- 55 szint 4000 egység/g aktivitású 250 g súlyú pankreatin tartalmaz. Ilyen módon a különböző eredetű nyersanyagokat az üzemi gyakorlat számára standardizálhatjuk.

Miután a megfelelő időpontot megállapi- 60 tottuk, az autotizist 72,5 liter 84%-os (visszanyert) izopropanol bekeverésével megállítjuk.

Még egy fél óra hosszat keverünk, mire az oldhatatlan rostok mellett tiszta oldat keletkezik, amiből a rostokat kiszűrjük. Ehhez az 65 üsttartalmat 50 literes nyitott üstbe behelyezett körülbelül 5 mm lyukbőségű szitán keresztülengedjuk, ami horgonvkeverövel van felszerelve. A szitaüst fenékkifolyója szivattyún keresztül csatlakozik egy 500 literes polipropilén tartályhoz. Ebben a tartályban 318 liter visszanyert 84%-os izopropanol van, és ezt a tartályt lassú keverés közben a szitán elbocsátott szúrt oldattal tovébbtölljúk. A szitaüstben visszamaradó rostokat még 10 percen át szárazra keverjük. A rostok súlya 7-8 kg.

Az 500 literes tartályban a pankreatin durvaszemcsés kristályként I óra alatt 80 literes térfogatra kiülepszik (20 “C-on; 24 “C-on fél óra alatt). Az anyalúgot dekantáljuk, és desztillációval izopropanolt nyerünk viszsza belőle. Az üledéket 63 liter visszanyert 84%-os izopropanollal keverjük, és egy éjjen át ülepedni hagyjuk. A következő nap ezt a folyamatot megismételjük, és az igy kapott üledékhez körülbelül 45 liter 84%-os izopropanolt adunk, illetve annyit, amennyi ahhoz keli, hogy a pankreatin szuszpenziót 76%-os izopropanolban állítsuk elő. Ezt a szuszpenziót 40 cm átmérőjű nuccson leszűrjük és jó szárazra szívatjuk.

A szüredéket rövid ideig aprítjuk és tálcákon szétterítjük. A szárítást egy éjjen át végezzük legfeljebb 55 °C hőmérsékleten és 5 mbar-nál kisebb

Pankreatin súlya:

Amilázak tivitása:

L i pázak ti vi tása:

Proteázak ti vitása enterokinázzal aktiválva: aktiválás nélkül:

Trip színak tivitása enterokinázzal aktiválva: aktiválás nélkül:

Kimotripszinak tivitása enterokinázzal aktiválva: aktiválás nélkül:

Szárazán yag tártál ma:

Zsírtartalma:

Térfogatsúlya:

Sűrűsége:

Csiraszáma:

nyomáson.

11.6 kg

93.6 FlP-egység/mg 90.3 FlP-egység/mg

5.6 FlP-egység/mg 5.6 FlP-egység/mg

4.2 FlP-egység/mg 4.1 FlP-egység/mg

28.3 FlP-egység/mg 28.3 FlP-egység/mg 98.7%

0.4%

0.65 g/ml 0.76 g/ml 200 csíra/g Az USP XVII szerint nem kívánt csirák a készítményből hiányoznak.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás pankreatin kinyerésére, adott esetben kalciumionokat tartalmazó vizes basnyálmirig.vszövet szuszpenzió autolizisével, a rostok eltávolításával, adott esetben víztelenítéssel, zsírtalanitással, kicsapással és a kapott csapadék szárításával azzal jellemezve,

-613 hogy az autolizist a szuszpenzióra vonatkoztatva legfeljebb 20 tömegszázalék izopropanol és adott esetben korábbi sarzsból származó pankreatin jelenlétében végezzük, 6,5-8,5 pil-értéknél, 30 °C alatti hőmérsékleten, és g amikor az autolizátumpróba 55-65%-os vizes izopropanolban a földi nehézségi gyorsulásnál mért 3-10 mm/1-3 perc ülepedési sebességet eléri, a viz és izopropanol óssztömegére vonatkoztatva legfeljebb 30-35% izopropa- 10 nol koncentráció eléréséhez szükséges izopropanol hozzáadásával az autolizist megszakítjuk, a higfolyóssá váló oldatot a kötőszövet! rostokról leszűrjük, az oldatot 15-25 °C-on annyi izopropanolba folyatjuk, hogy 55- 15

-05 töniegszázalék izopropanol-tarlalmú vizes oldat keletkezzen, a kivált pankreatint szemcsés formában ülepedni hagyjuk, az anyalúg dekantálása vagy leszívatása után izopropanollal vagy acetonnal való adott esetben 20 többszöri felkeveréssel és ülepítéssel zsirés triptonmentesre mossuk, és előnyösen csökkentett, nyomáson szárítjuk. (Elsőbbsége:

1983. 12. 29.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal 25 jellemezve, hogy a pH-értéket a hasnyálmirigyszövetre vonatkoztatva legfeljebb 3% alkálifém-hidrogén-karbonáttal állitjuk be. (Elsőbbsége: 1983. 12. 29.)
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal 30 jellemezve, hogy az autolizist egy korábbi sarzsból nyert pankreatin jelenlétében végezzük. (Elsőbbsége: 1983. 12. 29.)
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a kivált és leülepedett ^5 pankreatint az anyalúg leszívatása ulán izopropanollal vagy acetonnal adott esetben többszöri felkeverés mellett zsír- és triptonmentesre mossuk, a kapott, 70-85% izopropanol-, illetve 80-95% acelontarlalmú csapadékot leszivatjuk vagy centrifugázzuk, és száraz levegővel vagy nitrogénné! 25 °C alatti hőmérsékleten, előnyösen csökkentett nyomáson szárítjuk. (Elsőbbsége: 1983. 12. 29.)
5. Eljárás pankreatin kinyerésére, adott esetben kalciumionokat tartalmazó vizes hasnyálmirigyszővet szuszpenzió autolizisével, a rostok eltávolításával, adott esetben víztelenítésével, zsírtalani lássál, kicsnpással és a kapott csapadék szárításával azzal jellemezve, hogy az autolizist a szuszpenzióra vonatkoztatva legfeljebb 20 tömegszázalék izopropanol és adott esetben korábbi sarzsból nyert pankreatin jelenlétében végezzük, 6,5-8,5 pH értéknél, 30 °C alatti hőmérsékleten, és az autolizist megszakítjuk, amikor az autolizátuinpróba 55-65%-os vizes izopropanolban, a földi nehézségi gyorsulásnál mért 3-10 mm/1-3 perc ülepedési sebességet eléri. (Elsőbbsége: 1982. 12. 30.)
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a pH értéket a bevitt hasnyálmirigyszövetre vonatkoztatva legfeljebb 3% alkálifém-hidrogén-karbonáttal állítjuk be. (Elsőbbsége: 1982. 12. 30.)
7. Az 5. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az autolizist egy korábbi sarzsból nyert pankreatin jelenlétében végezzük. (Elsőbbsége: 1982. 12. 30.)