HU196220B

HU196220B - Process for preparing novel antrocycline derivatives

Info

Publication number: HU196220B
Application number: HU872657A
Authority: HU
Inventors: Antonio Suarato; Michele Caruso; Sergio Penco; Fernando Giuliani
Original assignee: Erba Farmitalia
Priority date: 1986-06-12
Filing date: 1987-06-10
Publication date: 1988-10-28
Also published as: PT85056B; GB2195998A; DK169076B1; FI84075C; DE3719377A1; BE1000158A4; FI872571A; DK298787D0; JP2516769B2; GB8713443D0; NL8701349A; AU7410887A; IT1215552B; IT8720834A0; AT392793B; SU1590045A3; SE8702409D0; HUT43866A; FR2600066B1; NZ220604A

Description

A találmány tárgya eljárás S-184 jelű heteropoliszacharid előállítására.

Ismeretes, hogy bizonyos mikroorganizmusok exocelluléris heteropoliszacharidokat képesek termelni. A heteropoliszacharidok olyan nagy molekulájú, általában lineáris szénhidrát polimerek, amelyek két vagy több monoszacharidot tartalmaznak, amelyek ismétlődő egységet alkotva polimerizálódnak.

A legtöbb heteropoliszacharidok használhatósága azon alapszik, hogy vizes oldatok viszkozitását és Teológiai tulajdonságait meg képesek változtatni. Emellett a heteropoliszacharidok másodlagos funkcióval is rendelkeznek, emulgáló, szuszpendáló, stabilizáló, flokkuláló, kenő, filmképző, stb. segédanyagokként használhatók.

A heteropoliszacharidokat széles körben használják élelmiszerekben, kútfúrásoknál, mezőgazdaságban és az ipar számos területén. Az utóbbi néhány évtizedben nagyon megnővekedett az ilyen vízoldható polimerek iránti igény. Ezen kívül az új ipari technikák újfajta fizikai tulajdonságokkal rendelkező heteropoliszacharidokat kívánnak meg. Következésképpen, a kereskedelmi szükséglettel párosuló, a különböző funkciójú heteropoliszacharidok iránti igény tisztán jelezte, hogy új és különböző fizikai tulajdonságú, új heteropoliszacharidokat kell kifejleszteni.

A találmány tárgya tehát eljárás új heteropoliszacharidok előállítására egy új Alcaligenes faj segítségével.

Kísérleteink sorén úgy találtuk, hogy egy új Alcaligenes faj bizonyos szénforráson olyan új heteropoliszacharidot képes termelni, amely 50-80 tömeg% szénhidrátból, 12-16 tömeg% proteinből és 3,0-4,5 tömeg% acilcsoportból (ecetsavként számitva) áll, a szénhidrátrész mintegy 7-16 tömeg% uronsavból és mintegy 1:3:5 mólarányban mannóz, glükóz és galaktóz semleges cukrokból áll. Ezt az új vegyületet egy Alcaligenes faj aerob fermentációjával állítjuk elő megfelelő vizes tápközegen. A mikroorganizmus biológialag tiszta tenyészetét a Budapesti Egyezménynek megfelelően 1985. június 19-én helyeztük letétbe az American Type Culture Collection, Rockville, Maryland intézetben ATCC 53160 számon.

A találmány szerinti eljárással előállított heteropoliszacharid, amelyet a továbbiakban

S-184 heteropoliszacharidként említünk, vizes rendszerekben a kívánt tulajdonságokkal rendelkezik, és különösen jól használható élelmiszerekben.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott mikroorganizmust Kaliforniában, San Diegoban, a Palomar-hegyen, Pauma Creeknél vett vízmintából izoláltuk. A mikroorganizmust YM agarlemezen 4 napig tartó 30 °C-on végzett inkubálás után gumiszerű kolóniák formájában gyűjtöttük. Az izolátumot ezután tápagaron történő tenyésztéssel tisztítottuk.

Az izolátum tápagaros tenyészetéből származó lombiknyi oltóanyaggal kezdtük a munkát. Az oltóanyagot egy másik, azónforrásként hidrolizált keményítőt tartalmazó lombik beoltására használtuk. Inkubálás után ez a lombik viszkózus, sörszerű anyagot tartalmazott, és izopropilalkohol hozzáadására szálas csapadék képződött. Egy másik lombik oltóanyagot a különböző tápközegeknek a polimerképzésre gyakorolt hatása meghatározására, valamint a mikroorganizmus legjobb tenyészközegének és fermentációs körülményeinek meghatározására használtunk.

Fermentációs körülmények

Az S-184 heteropoliszacharidot alkalmas vizes tápközeg aerob körülmények között végzett fermentációjával állítjuk elő, szabályozott körülmények között, az ATCC 53160 számú organizmus segítségével. A tápközeg asszimilálható szén-, nitrogén- és szervetlen sóforrást tartalmaz.

A tápközegben szénforrásként általában szénhidrátok (például glükóz, fruktóz, maltóz, xilóz, stb.) alkalmazhatók, önmagukban vagy kombinációban. A szénhidrátforrás vagy -források pontos mennyisége részben a tápközegben jelenlevő többi komponenstől függ, de általában 2 és 5 tömeg% között lehet, a tápkőzegre számítva. Az említett szénforrások önmagukban vagy kombinációban használhatók a tápközegben.

A fermentációs eljárásban nitrogénforrésként általában proteinek használhatók. Alkalmas nitrogénforrások például élesztőhidrolizát.um, élesztő, szójaliszt, gyapotmagliszt, kazeinhidrolizátumok, kukoricalekvár, desztillációs maradékok, paradicsompüré, stb. A nitrogénforrások önmagukban vagy kombinációban alkalmazhatók, a vizes közegre számítva 0,05 és 0,2 tömeg% közötti mennyiségben.

A tápközegben alkalmazható szervetlen sók bármely szokásos, nátrium-, kálium-, ammónium-, kalcium-, foszfát-, szulfát-, klorid-,. karbonát-iont szolgáltató sók lehetnek. Alkalmazhatók nyomelemek is, például kobalt, mangán, vas és magnézium.

A tápközeg itt ismertetett összetétele csupán illusztratív jellegű.

Az S-184 heteropoliszacharid alacsony kalciumiontartalom mellett is előállítható, azaz ionmentesitett vízben vagy más vizes rendszerben, amely kalciumiontól mentes (pl. kevesebb, mint 4 ppm CA^W per 1% polimer a végső fermentlében).

A fermentációt 25 és 35 °C közötti hőmérsékleten végezzük, az optimális eredmények elérése érdekében azonban előnyösebb 28 és 32 °C közötti hőmérsékleten dolgozni, az ATCC 53160 számú mikroorganizmus tenyésztéséhez és az S-184 heteropoliszacharid előállításához a tápközeg pH-ja 6 és 8 között változhat.

Bár az S-184 heteropoliszacharid mind felszíni, mind szubmerz tenyészetben előállít3

HU 198220 Β ható, előnyösebb a fermentációt szubmerz viszonyok között folytatni.

Kis méretekben a fermentációt előnyösen úgy végezzük, hogy egy alkalmas tépközeget beoltunk a tenyészettel, majd tenyésztő közegre történő átvitel után a fermentációt 30 °C körüli állandó hőmérsékleten, rázógépen hagyjuk lefolyni néhány napig.

A fermentációt sterilezett tápközegen kezdjük, egy vagy több oltóanyagtermelési lépésen keresztül. Az oltóanyag termelési lépésben a tápközeg szén- és nitrogénforrások bármilyen alkalmas kombinációja lehet, előnyös szénforrások azonban a glükóz vagy a hidrolizált keményítő. Az oltóanyagtermelő lombikot állandó hőmérsékletű kamrában, mintegy 30 °C-on 1-2 napig rázatjuk, vagy addig, amíg a növekedés megfelelő, és a kapott tenyészet egy részével vagy egy második oltóanyatermelő lombikot, vagy a termelő közeget oltjuk be. Ha közbülső oltóanyagtermelő lépéseket alkalmazunk, lényegében véve az előbbi módon tenyésztjük azokat, azaz az utolsó oltóanyagtermelési lépés lombikja tartalmának egy részét használjuk a termelő közeg beoltására. A beoltott lombikokat állandó hőmérsékleten néhány napig rázatjuk, és az inkubálás végén a lombikok tartalmát alkalmas alkohollal, például izopropanolial kicsapjuk.

Nagy méretekben végzett tenyésztéshez előnyös, ha a fermentációt alkalmas fermentorokban végezzük, amelyek keverővei és levegőztetóvel vannak felszerelve. Megfelelő mód5 szer az, ha a tenyésztőközeget a fermentorban állítjuk össze, έε 121 °C-ra történő felmelegítéssel sterilezzük. Hűtés után a steril közeget beoltjuk az előzőleg tenyésztett oltóanyaggal, és a fermentációt például 2-4 na10 pig folytatjuk, mialatt a tenyésztő közeget keverjük és/vagy levegőztetjük, és a hőmérsékletét kb. 30 °C-on tartjuk. Az S-184 heteropoliszacharid ilyen módon történő előállítása különösen alkalmas nagy mennyiségben történő termelésre.

S-184 jelű beteropoliszacharid

Az ATCC 53160 sz. mikroorganizmus által termelt heteropoliszacharid 50-80 tömegX szénhidrátból, 12-16 tömegX proteinből és 3,0-4,5 tömegX acilcsoportból (ecetsavként számítva) áll, a szénhidrát rész 7-16 tömegX uronsavból és mintegy 1:3:5 mólarányban mannóz, glükóz és galaktóz semleges cukrok25 ból áll.

Az S-184 heteropoliszacharid összetételének elemzési eredményét az I. táblázatban foglaltuk össze.

I. táblázat

S-184 heteropoliszacharid összetételének vizsgálati eredménye

Vizsgálat	Minta jele
BD-1842	BD-1827	BD-707	BD-2117	BD-2118
Protein (X)
(N x 6,25%)	15,8	12,3	12,6	11,8	12,4
Uronsav (X)
(mól. tömeg 176,
dekarboxilezés)	15,8	12,3	10,76	9,0	7,1
Acilcsoport (X)	(1)	(1)	(2)	(2)	(2)
(ecetsavként)	3,9	3,1	4,5	3,4	3,6
Piroszőlősav (X)	<0,1 *	<0,1	_	0	o.
Semleges cukrok:				V
(X-os mólarányok)	(3)	(3)		(4)	(5)
mannóz	12	12		19,4	9,4
				(17,9-23,8)	(9,3-9,8)
glükóz	35,6	35		30,1	29,2
				(27,6-31,9)	(28,7-29,5)
galaktóz	52,4	52,5		50,5	61,4
				(48,5-52,1)	(61,1-62,0)

Megjegyzés: (1)-(5) a következőkben ismertetett analitikai módszereket jelölik.

. (1) Az acetilcsoport-tartalmat úgy határoztuk meg, hogy az S-184 polimer 0,2%-os vizes oldatát bázisos hidroxilamin reagenssel, majd savas vas-klorid reagenssel kezeltük, és az eredményt kolorimetriásan mértük (S. Hestrin, J. Bioi. Chem. 180, 249-261 /1949/). Belső standardként acetil-kolin-kloridot használtunk.

(2) A 3,1 és 4,5% közötti acilcsoport-tartalmat (ecetsavként számítva) enzimes mérés60 sel határoztuk meg, miután híg bázissal hidrolizáltuk az O-acetiJ-kötéseket, (3) Az S-184 heteropoliszacharidban levő semleges cukrokat különböző módszerekkel határoztuk meg. Az első módszer szerint 50 mg S-184 heteropoliszacharidot 4 óra hosszat

HU 198220 Β

100 °C-on 1 mól/l-es kénsavval hidrolizáltunk. Lehűtés után 0,5 ml 3 mg/ml xilózt adtunk hozzá belső standardként. A mintákat 3 ml telített bárium-hidroxiddal semlegesítettük, majd 2 csepp kongó-vörös hozzáadása után addig adagoltuk a bárium-hidroxidot, míg a szín vörösre nem váltott. Centrifugálás után (20 perc, 3000 ford/perc) a minták felülúszóját bepároltuk. A száraz mintákat 0,1 ml 40 mg/ml-es, száraz piridinnel készült hidroxil-amin-hidroklorid-oldatban oldottuk, és 45 percig 90 °C-on melegítettük. Lehűtés utén 0,1 ml acetanhidridet adtunk hozzá, és újra 45 percig 90 °C-on melegítettük. A cukrokat aldonitril-acetát-származékaik gáz-folyadék-kromatogrófiájával választottuk el, és autentikus mintákkal történő összehasonlítással azonosítottuk, és határoztuk meg mennyiségüket (J.K. Baird, M.J. Holroyde és D.C. Ellwood, Carbohydr. Rés. 27, 464-467 /1973/).

(4) A fenti módszerrel végzett semleges cukor meghatározás előtt a mintákat 72%-os kénsavban oldva 1 óra hosszat 0 °C-on előkezeltük. A kapott értékek átlagértékek a BD-707, BD-2117 és BD-2118 mintákra.

(5) A semleges cukrokat egy másik módszerrel is meghatároztuk. 2 mg S-184 heteropoliszacharidot feloldottunk 2 ml 0,5 mól/l-es trifluor-ecetsavban. A mintákat éjszakán át 100 °C-on tartottuk, szárazra pároltuk, majd 2 ml vízben oldottuk. 25 mg nátrium-bór-hidridet adtunk hozzá, majd 2 óra múlva az oldatot Dowex 50 (H⁺)-val kezeltük, igy a pH

3,5-re csökkent. Szűrés után az oldatot koncentráltuk, és háromszor 5 ml metanollal kodesztilláltuk. A maradékot feloldottuk 1 ml acetanhidrid és 1 ml piridin elegyében, 1 óra hosszat 100 °C-on tartottuk, és betöményitettük. Háromszor 5 ml toluollal történt kodesztillálás után a maradékot metilén-kloridban oldottuk, és gáz-folyadék-kromatográfiával analizáltuk. A kapott eredmények átlagértékek a BD-707, BD-2117 és BD-2118 mintákra.

A poliszacharid uronsavtartalmát úgy határoztuk meg, hogy dekarboxilezést végeztünk 17%-os sósavval, és a felszabaduló szén-dioxidot nátrium-hidroxid-standardban felfogtuk, és visszatitráltuk (B.L. Browning, Methods of Wood Chemistry 2, 632-633, /1967/).

A piroszőlösav hiányát úgy határoztuk meg, hogy 1 ml, 2 mg/ml-es S-184 heteropoliszacharid-oldatot mértünk egy kémcsőbe, hozzáadtunk 1 ml 0,2 n sósavat és 4 óra hosszat 100 °C-on tartottuk. A hídrolizátum 0,5 ml-ét hozzáadtuk 0,1 ml redukált nikotin-amid-adenin-dinukleotid (NADH) és 2,4 ml trietanol-amin-oldat elegyéhez. Az abszorpció változását mértük spektrofotométerrel, és a piroszőlősavat meghatároztuk (Duckworth és

Yaphe, Chem. and Ind., 747. oldal /1970/). Piroszőlösav nem volt megfigyelhető.

A nitrogénmeghatározást Kjeldahl-módszerrel végeztük, mintegy 1,9 és 2,5 tömegX közötti értékeket mértünk, amely 11,8-15,8% proteinnek felel meg.

A metilezési analízist részlegesen tisztított S-184 mintákon végeztük dialízis és fagyasztva szárítás után. A minták metilezését a Sandford és Conrad, Biochem. 5, 1508-1507 (1966) helyen ismertetett módon végeztük. A cukrok O-metil-étereit aditol-acetátjuk formájában gázkromatográfiásán választottuk el, és autentikus mintával való összehasonlítással számítógéppel azonosítottuk. A nagyobb, azonosított metílezett cukrokat a II. táblázatban foglaltuk össze.

II. táblázat

S-184 heteropoliszacharid metílezett cukorrészei

Azonosított cukorrész Kapcsolódás

2,3,6 Me3 hexitoí	1-4
	(galaktóz)
2,3,6	Me3 hexitol
	(mannóz)	1-4
2,3,6	Me3 hexitol
	(glükóz)	1-4

A teljes szénhidráttartalmat a fenol-kénsavas módszerrel (Dubois és munkatársai, Anal. Chem. 28, 350 /1959/), standardként glükózt használva határoztuk meg, azaz az eredmények glükóz-egyenértékben vannak megadva. A különböző monoszacharidok különböző abszorbanciát mutatnak ebben a módszerben, mivel ismerjük az S-184 heteropoliszacharid monoszacharid-összetételét, ezeket az abszorbancia-értékeket a következőképpen korrigáljuk:

	Relatív abszorbancia	Monoszacharid arány (hozzá- vetőleg)
GlűkÓ2	0,78	3
Mannóz	1,01	1
Galaktóz	0,664	5
Glükuronát	0,287	_1_

A korrigált teljes szénhidráttartalmat úgy számítjuk, hogy a glükóz-egyenértékben kapott teljes szénhidráttartalmat szorozzuk a következő faktorral:

HU 198220 Β

Ezek szerint a szénhidráttartalom:

Minta jele

Teljes szénhidráttartalom glükóz-egyenértékben (X)

Korrigált teljes szénhidráttartalom (X)

BD-2117	63,9
BD-2118	56,3
BD-707	53,8
BD-1827	40,6

69,6

66,5

50,2

Megjegyzendő, hogy bár az itt ismertetett heteropoliszacharid analizáló módszerek jelenleg használatos módszerek az összetétel meghatározására, szakember számára más 15 analizáló módszerek is hozzáférhetők. Más módszerek hasonló eredményeket adnak, de a mennyiségi eredményekben némi eltérés adódhat.

Úgy találtuk, hogy az S-184 heteropoli- 20 szacharid vizes oldatban kiváló tulajdonságokkal rendelkezik, különösen azért, mert igen kis koncentrációnál is nagy a viszkozitása, jó a felületaktivitása, jól összefér proteinekkel és kiváló stabilizáló/emulgáló tulaj- 25 donságokkal rendelkezik. Ezek következtében jól használható töltőanyagként, szuszpendáló-, emulgáló-, stabilizólószerként, kenőanyagként, filmképzőként vagy kötőanyagként gumiarábikum helyett nagyon sok he- 30 lyen alkalmazható. Az S-184 heteropoliszacharid nagyon sok helyen használható az iparban és az élelmiszergyártásban, ahol a felületaktivitás és a fehérjékkel való összeférhetőség követelmény. Különösen a következő 35 területeken alkalmazható: ragasztószerek, cementek, víz-visszatartó habarcsok, konzervdoboz tömítőanyagok, forralási segédanyagok, gumi habositó anyagok, hegesztópálca adalékok, pároló paszták, kerámia üvegek és ext- 40 rudátumok, tisztítószerek és polirozószerek, játékok, emulziók (gumi, aszfalt, szilikon), ezüstvisszanyerés, vetőmag-bevonószerek, permetezési adalékanyagok peszticidek és herbicidek használatához, peszticidek és her- 45 bicidek emulgálható koncentrátumaihoz adalékanyagok, dohány-kötőanyagok, vizes tinták, litográfiái festékadagoló oldatok, bőrkikészítószerek, talaj vizes takarása és bevetése, textilfestés és kikészítés, vizes papírki- 50 készítőanyagok és formázóanyagok, fénytelenitő anyagok, őntőforma-kikenőanyagok, folyékony gyanták, zagyformájú és csomagolt robbanóanyagok, viz- és olajkút fúrófolyadékok, olajfeldolgozási adalékanyagok, kozmetikumok, gyógyszer szuszpenziók és emulziók.

Az S-184 heteropoliszacharid használható az élelmiszergyártás területén is, például zselék és más nagy cukortartalmú rendszerekben, italokban, igy citromsavtartalmú italokban is, tejtermékekben, igy fagylaltokban és joghurtban, saláta-dresszingekben, porkészitményekben, fagylaltporokban, mázakban, szirupokban, puddingokban, liszttartalmú élelmiszerekben, konzervekben és sütőipari töltőanyag ké nt.

Különösen előnyösen alkalmazható saláta-dresszingekben, italokban és tejtermékekben. Úgy találtuk, hogy az S-184 heteropoliszacharid felületaktív, proteinösszeférhető és stabilizáló/emulgáló tulajdonságai következtében különösen előnyösen használható az élelmiszergyártás területén.

Saláta-dresszing például úgy készíthető, hogy az S-184 heteropoliszacharidot tömegének két-ötszörősének megfelelő mennyiségű olajban szuszpendáljuk, ezt az zagyot vízhez adjuk, erős keverés közben hidratáljuk, öszszekeverjük a többi száraz komponenst, és hozzáadjuk a víz-olaj-zagyhoz, paradicsompürét adunk hozzá, és 3 percig keverjük, paprikaolajat adunk hozzá, és 3 percig keverjük, további olajat adunk hozzá, és 3 percig keverjük, ecetet adunk hozzá, és 3 percig keverjük, és végül kolloid-malomban homogenizáljuk.

Az S-184 heteropoliszacharidot emulzióstabilizátorként adtuk a saláta-dresszinghez mintegy 0,10-0,40% tőmegX mennyiségben. A saláta-dresszing viszkozitását, pH-ját, tárolási stabilitását és textúráját vizsgáltuk, az eredményeket a III. táblázatban foglaltuk össze.

III. táblázat

S-184 heteropoliszacharid saláta-dresszingben

Adagolt mennyiség X	Viszkozitás mPs (24 óra)	PH	Stabilitás (nap)	Textúra, folyási tulaj donságok
49 °C	szobahőm.
0,10	1000	3,6	7	83	Sima, lassan folyó
0,15	1450	3,6	31	61
0,20	1650	3,6	26	71	Sima, krémszerű
0,25	2700	3,6	33	365 fölött	Stabil, elfogadható

HU 198220 Β

Adagolt mennyiség %	Viszkozitás mPs (24 óra)	PH	Stabilitás (nap) 49 °C szobahőm.	Textúra, folyási tulajdonságok
0,40	4700	3,6	nem vizsgáltuk	Gélszerű,
				nem fogadható el
Az S-184	heteropoliszacharid	oldatbeli	10 zők, és megkülönböztetik	más poliszachari-
tulajdonságai	speciális profilt írnak	le, ame-	dóktól. Az S-184 heteropoliszacharid tulaj-

lyek erre a poliszacharidra különösen jellem♦

I. Viszozitási és nyírási tulajdonságok donságai a következők:

A. Brookfield-féle viszkozitás

	Szintetikus csap víz *	Szintetikus csapvíz* + 0,1%
1.	1,0%,	60 ford./perc	1080 ciklus/mp	1030 ciklus/mp
		6 ford./perc	6000 ciklus/mp
	orsó	száma	3
2.	0,1%,	(UL adapter,
		6 ford./perc)	7 ciklus/mp	7 ciklus/mp
3.	0,5%,	Wells-Brookfield
		9,6 sec^-nél	330 ciklus/mp	320 ciklus/mp
4.	1,0%,	Dl H2O, 60 ford./perc	1460 ciklus/mp
	orsó	száma	3

Megjegyzés: * ionmentes víz, amely 1000 ppi NaCl-t és 147 ppm CaCh.2H2O-t tartalmaz
B.	Nyírás (Wells-Brookfield)
1.	1,92 sec^_1-nél	4100 ciklus/mp
2.	9,6 sec¹-nél	1270 ciklus/mp
3.	76,8 sec¹-nél	290 ciklus/mp
4.	384 sec^-1-nél	nagyobb mint 60 ciklus/mp (kezdeti)
5.	384 sec'-nél	nagyobb mint 60 ciklus/mp (5 perc)
6.	9,6 sec¹-nél	1180 ciklus/mp
C.	Tárolás 4,4 °C-on (Brookfield)

1320 cP 60 ford/percnél, 3 sz. orsóval; gélesedés nincs

2.	Összeférhetőség sóval és	festékekkel
A.	Sók
1.	CaCb (telített)	összeférhető
2.	ammónium-polifoszfát	kicsapódik
3.	60%-os NH4NO3	összeférhető
4.	1%-os AL2(SO<)3.18H2O	összeférhető
5.	1%-os CaCh.2H2Ö	összeférhető
6.	1%-os KC1	összeférhető
B.	Festékek
1.	Milling-zöld	összeférhető
2.	Metilénkék	összeférhető

A törzs leírása

Az S-184 heteropoliszacharid egy Alcaligenes törzs alkalmas tápközegen történő fermentációjával állítható elő. Az alkalmazott mikroorganizmust a Budapesti Egyezmény értelmében az American Type Culture Collecti- 65 on, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok intézetnél 1985. június 19-én ATCC 53180 számon helyeztük letétbe.

A. Kolónia-morfológiai tulajdonságok

Tápagaron az izolált telepek kerek kolóniát alkotnak, opalizéló középpel és áttetsző szélekkel. A pigmentéció fehértói szürkéig változik. A kolóniák mérete 30 °C-on 72 óra után 1-3 mm.

B. Sejt-morfológiai tulajdonságok

A sejtek Gram-negatív, hosszúkás pálcikák (0,8 -2,3 pm), vakuólumot tartalmaznak.

Ostoros formák mind poláris, mind laterális, mind peritrich formák megfigyelhetők. Bizonyos tenyésztési körülmények között a mikroorganizmusok rózsaszín pigmentet termelnek.

C. Fiziológiai és biokémiai jellemzők A fiziológiai és biokémiai tesztek eredményeit a IV. táblázatban foglaltuk össze. A mikroorganizmus citokrómoxidáz pozitív, ka55 taláz pozitív és metabolizmusban oxidativ. Citrát, hasznosításban és kénhidrogénfejlesztésben az eredmények pozitívak voltak. Hidrolizélja a keményítőt, zselatint, kazeint és a Polysorbat 80, USP-t (felületaktív anyag,

Difco gyártmány). 30 és 37 °C között jól növekszik, de magasabb hőmérsékleten nem vizsgáltuk. 1,5% nátrium-kloridot elvisel, de 3%-ot már nem. 6 és 10 közötti pH-nál fejlődik.

-611

HU 198220 Β

Szénhidrátokból történő	savtermeléet	a	D-oC-alanin
következőkben mutatjuk be:				0-alanin L-treonin
Savtermelés				L-leucin
L-arabinóz			5	DL-izoleucin
Fruktóz				L-aszpartát
Galaktóz				L-glutamét
Maltóz (gyenge)				L-lizin
Mannitol (gyenge)				DL-ornitin
Mannóz			' 10	L-hisztin L-prolin
Nincs savtermelés				L-tirozin
Adonitol Dulcitol				L-fenilalanin
Etanol			15	IV. táblázat
D-glükóz				Fiziológiai és biokémiai tesztek eredménye
D-xilóz				Citokróm-oxidáz	+
Inozitol				Kataléz	+
Inulin				OF teszt	Oxidativ
Laktóz			20	Anaerob növekedés	-
Melibióz				TSI agar, ferde	NC
Alfa-metil-glikozid				In dől	-
Raffinóz				Metilvőrös	-
Ramnóz				Voges-Proskauer	-
Szalicin			25	Simmon-féle citrát	+
Szorbitol				Nitrit redukció	-
Szacharóz				Nitrát-redukció	-
Trehalóz				Lakmusz-tej	NC
D-xilóz				Arginin-dehidroláz	-
A mikroorganizmus a	következő	46	30	Lizin-dekarboxiláz	-
szubsztrátot hasznosította egyetlen szén-	és		Ornitin-dekarboxiláz	-
energiaforrásként:				Fenil-alanin- deamináz	NG
D-xilóz				Ammónia peptonból	-
L-arabinóz				Ureéz	-
D-glükóz			35	Kénhidrogén-fejlesztés
D-mannóz				(peptonból, cisztinből és
D-galaktóz				szulfit-közegból)	+
D-fruktóz				3-Ketolaktóz	-
Maltóz				Kongóvörős abszorpció	-
Cellobióz			40	Foszfatáz	-
Inulin				Hemolizis (birkavér)	NT
Glukonát				Tojássárgája reakció	i
Szacharát				Keményítő hidrolízis	+
Műkét				Zselatin hidrolízis	+
Acetát			45	Kazein hidrolízis	+
Propionát				Eszkulin hidrolízis	-
Butirát				Poliszorbát 80 hidrolízis	+
Kaprost				Növekedés különböző hőmérsékleteken:
Heptanoát				4 °C
Kaprilót			50	30 °C	4
Pelargonát				37 °C	4
Kaprát				Növekedés különböző NaCI koncentrációknál:
Malonát				1,5 töm/térfX	4
Szukcinát				3,0
Fumarát			55	6,5
L-malált				7,5
DL-0-hidroxi-butirát				10,0
DL-laktét				Növekedés különböző pH-értékeknél:
DL-glicerát				4
Citrát			60	6	4
oC-Ketoglutarát				8	4
Piruvát				10	4
Levulinát				11	4
Mannitol Glicerol			65	12

-713

HU 198220 Β

Megjegyzés: NG: nincs növekedés

NC: nincs változás NT: nem vizsgáltuk +: pozitív -: negatív

Mivel a mikroorganizmus szigorúan aerob, Gram-negativ, vegyes ostoros formákat mutat, az Alcaligenes nemzetségbe tartozónak találtuk a Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (1974) 8. kiadása alapján.

Az Alcaligenes nemzetséget a legutóbbi Bergey-kézikönyv (Bergey’s Manual of Systematic Microbiology, 1. kötet, 1. kiadás, 1984) újra meghatározta, és kizárja az összes pigmenttartalú organizmust. Az izolált, S-184 heteropoliszacharidot termelő mikroorganizmus beleillik ebbe az újra meghatározott nemzetségbe, de nem tartozik a felsorolt két faj, az Alcaligenes faecalis, Alcaligenes denitrificans subsp. denitrificans és Alcaligenes denitrificans subsp. xylosoxidans egyikébe sem. Az S-184 heteropoliszacharid termelő mikroorganizmus tehát egy új Alcaligenes faj.

A találmány szerinti eljárást a következő, nem korlátozó jellegű példákkal szemléltetjük.

1. példa

YM lombik oltóanyagot egy rázógépen 30 °C-on 48 óra hosszat tenyésztett tápagaros tenyészetből nyertünk. Kb. 24 órával később ezzel az oltóanyaggal beoltottunk egy lombikot, amely Ei tápkőzeget tartalmazott 3% hidrolizált keményítővel mint szénforrással. A lombikot rázógépre helyeztük 30 “C-os hőmérsékleten. Kb. 72 óra múlva a lombik viszkózus, sörszerű anyagot tartalmazott, amelyhez 2-szeres térfogat 99%-os izopropilalkoholt adva szálas csapadék képződött.

Az Ei tápközeg összetétele: 5 g dikálium-hidrogén-foszfát, 0,1 g magnézium-szulfát, 0,9 g ammónium-nitrát, 0,5 g Promosoy 100 (enzimesen emésztett szójaliszt, Central Soya Chemurgy Division gyártmánya), 30 g dextróz és 1 liter csapvíz, pH 7,6-7,8.

Egy másik YM oltóanyag lombikot készítettünk a fenti módon, és a 24 órás oltóanyaggal beoltottunk 4 lombikot, amelyek különböző tápközeget tartalmaztak, 30 “C-on 72 óra hosszat rázógépen tenyésztettük, és ezután mértük a pH-t, viszkozitást, termelt polimert és a termék viszkozitását. Az eredményeket az V. táblázatban foglaltuk össze.

M

4-i c

(U

E c

o

a.

o *

x o

ft u

x

in

4-5 ^4 ‘«a £

a <D

S'S

S-' «0 1) § a, '3

M

Ί

E a

o

4-1 £

w ft

-a) a

&

t«o (V

N «Ο

X

Cu ‘03

CM © CM CO © tt cű ω t— oo b- cm o © ο o o © o © to Tr cm ©

C- t- CM

CD <75 © CD CD CD

N	N	N	N
‘O	Ό	‘O	*O
X	X	X	X
2	o	2	2
ti	W)	ti	υο

CO	co	co	eo

X w

X

•o —* te >> ι Ο Φ tt X ° ε x o + Cl, w

jj u

tt a

>» ta a

>

co v

4-5

C

4) ε

c o

4)

X ·*»

TJ a

υ x a co c φ c o cu ε o X *o t5Ű £ 4) μ ε

‘5 a

x ε

φ c

a •a

N

Φ tű

Φ következő oldalon):

N

4)

X

-815

HU 198220 Β

H3BO3	285 mg
MnCb.áHzO	1800 mg
FeSO«	1360 mg
CuClz	26,9 mg
ZnCh	20,8 mg
C0CI2	40,4 mg
Mg2Mo04.2H20	25,2 mg
Na-tartarát	1770 mg

Ebből a törzsoldatból a tépkőzeghez literenként 1 ml-t adunk.

Amint az eredmények mutatják, a legjobb növekedést a 3% glükóztartalmú Ei tápközeggel kapjuk.

2. példa

Nagy mennyiségű S-184 heteropoliszacharid fermentációs előállítását a kővetkezőképpen végezzük.

100 ml YM tápközeget (Difco) tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer lombikot beoltunk egy oltókacsnyi, tápagarról vett 48 órás tenyészettel. A lombikot 24 óra hosszat 30 °C-on inkubáljuk egy 400 ford/perc sebességgel mozgó rázógépen. Két 500 ml-es Erlenmeyer lombikban 1%-os inokulumot készítünk 100 ml oltó-tápközeggel. Az oltó-tápközeg összetétele:

Glükóz	3%
K2HPO4	0,5%
NH4NO3	0,09%
MgSO4.7H2O	0,01%
Promosoy 100	0,05%

A tápközeget csapvizzel készítjük. A lombikot 30 °C-on 24 óra hosszat inkubáljuk egy 400 ford/perc sebességgel mozgó rázógépen, majd egy 3000 ml (ugyanolyan összetételű) tápközeget tartalmazó 5 literes fermentor beoltására használjuk. A fermentálást

30 °C-on 1 l/perc levegőztetési sebesség mellett végezzük. A keverést 400 ford/perc sebességgel kezdjük, és addig emeljük, amennyi a jó keveredést biztosítja. 24 óra múlva 2,5 liter kivett oltóanyaggal beoltunk egy, 20 liter következő tápközeget tartalmazó 30 literes fermeritort:

glükóz	3,0%
K2HPO4	0,05%
NlhNO3	0,09%
MgSO2.7HzO	0,01%
Promosoy 100	0,05%
Fe	1 ppm
Ság 5691	0,005%

(habzásgátló,

Union Carbide gyártmánya)

A hőmérsékletet 30 °C-on tartjuk, a levegőztetést 22 óra hosszat 5 l/perc sebességgel, majd 10 l/perc sebességgel végezzük a fermentáció befejeztéig. A pH-t 6,3 fölött tartjuk KOH (40%-os) adagolásával automatikus pH-szabályozó rendszerrel. A keverést 300 ford/perc sebességgel kezdjük, majd 22 óra múlva 400 ford/percre és a fermentráció

45. órájától 700 ford/perc sebességre emeljük, és ezt a sebességet tartjuk a fermentáció befejeztéig. A fermentáció eredményeit a VI. táblázatban foglaljuk össze.

VI. táblázat

Idő (óra)	PH	Fermentlé viszkozitása (cP)	Kitermelés (g/100 ml)	Maradék szénforrás (%)
0	7,0	ND	ND	3,0
22	6,3	620	ND	ND
45	6,9	4200	1,26	0,41
68	7,2	5100	1,37	kevesebb mint 0,1

Megjegyzés: ND = nincs adat

A fermentlét mintegy 75 °C-on tartjuk 50 15 percig, majd kb. 30 °C-ra hűtjük. A fermentlét háromszoros térfogatú 99%-os izopropanolhoz adjuk. A poliszacharid szálas csapadék formájában kiválik, amelyet könnyű leszűrni. A csapadékot 60 °C-on tálcás lég- 55 szárítóban 2,5 óra hosszat szárítjuk, majd porrá őröljük.

3. példa

Egy 100 ml YM tápközeget (Difco) tar- 60 talmazó 500 ml-es Erlenmeyer-lombikot beoltunk egy oltókacsnyi, tápagarról vett 48 órás tenyészettel. A lombikot 24 óra hosszat 30 °C-on inkubáljuk egy 400 ford/perc sebességgel mozgó rázógépen. Öt 500 ml-es Er- 65

lenmeyer lombikban 1%-os inokulumot készi-
tünk 100 ml oltó-tápközeggel.	. Az oltó-tápkö-
zeg összetétele:
Glükóz	3,0%
K2HPO4	0,5%
NH4NO3	0,09%
MgSO4.7H2O	0,01%
Promosoy 100	0,05%
Fe	1 ppm
Csapviz
A lombikokat 30 °C-on	24 óra hosszat

inkubáljuk egy 400 ford/perc sebességgel mozgó rázógépen, és ekkor beoltunk velük egy 14 literes fermentort, amely 10 1 végső térfogatnak megfelelő tápközeget tartalmaz. A

-917

HU 198220 Β fermentációt 30 °C-on, 3 1/perc levegőztetési sebesség mellett folytatjuk. A keverést 400 ford/perc sebességgel kezdjük, majd olyan sebességre emeljük, amely a jó keveredést biztosítja. A tápkőzeg összetétele a kővetkező:

Glükóz 3,0%

K2HPO4 0,5%

NH4NO3 0,09%

MgSO4.7HzO 0,01%

Promosoy 100 0,05%

Fe” 1 ppm

A pH-t 6,5 fölött tartjuk 25%-οβ KOH adagoláséval automatikus pH-ezabályozó rendszerrel. A fermentáció eredményeit a VII. táblázatban foglaljuk össze.

VII. táblázat

Idő (óra)	pH	Fermentlé viszkozitása (cP)	Kitermelés (g/100 ml)	Maradék szénforrás (%)
0	7,3	ND	ND	3,15
21	7,05	20	0,65	1,59
45	6,8	3450	1,22	0,48
78	7,1	2550	1,50	kevesebb mint 0,1

Megjegyzés: ND = nincs adat

A fermentlét 15 percig mintegy 75 °C-on tartjuk, majd kb. 30 °C-ra hűtjük, és háromszoros térfogatú 99%-os izopropanolhoz adjuk. A poliszacharid szálas csapadék formájában válik ki, amelyet könnyű leszűrni. A csapadékot 60 °C-on tálcás szárítóban levegővel 2,5 óra hosszat szárítjuk, majd porrá őröljük.

Poliszacbaridok fermentációs előállítása esetén a konverziós hatásfokot a következő képlet alapján számítjuk:

., végtermék koncentrációja x 100

Konverziós hatásfok = — .& -r i· kezdeti esubeztrét-koncentráció

A termelési arányt a következő képlet alapján számítjuk:

termék mennyisége (g)

Termelési arány = -— ;—γτγ;

fermentáció ide te (óra) x térfogat (1/

Az előző példákban ismertetett eljárások esetén a következő eredményeket kaptuk:

Példa- szám	Kezdeti szénforrás kon- centráció (%)	Végső poliszacharid koncentráció (%)	Fermen- táció ideje (óra)	Konverziós hatásfok (%)	Termelési arány (g/l/óra)
1.	3	1,70	72	57	0,24
	3	1,84	72	61	0,26
	3	1,76	72	59	0,24
	3	1,27	72	42	0,18
2.	3	1,37	68	46	0,20
3,	3	1,5	78	50	0,19

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 50

Claims

1. Eljárás S-184 jelű heteropoliszacharid előállítására, amely heteropoliszacharid 50-80 tömeg% szénhidrátból, 12-16 tömeg% proteinből, 3,0-4,5 tömeg% acilcsoportból (ecetsavként számítva) áll, a szénhidrát- 55 rész 7-16 tömeg% uronsavból és 1:3:5 mólarányban mannóz, glükóz és galaktóz semleges cukrokból áll, azzal jellemezve, hogy Alcaligenes nemzetségbe tartozó, ATCC 53160 számon letétbe helyezett mik- 60 roorganizmust asszimilálható szén-, nitrogén- és ásványisó forrást tartalmazó viKiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest R-4854 zes lápközegen aerob körülmények között tenyésztünk, és a termelt S-184 jelű heteropoliszacharidot kinyerjük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy asszimilálható szénforrásként szénhidrátot használunk.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szénhidrátként glükózt használunk.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kalciumion-mentes tápközeget használunk.