HU196218B

HU196218B - Process for preparing quinoline carboxylic acid boric acid anhydrides

Info

Publication number: HU196218B
Application number: HU854693A
Authority: HU
Inventors: Istvan Hermecz; Geza Kereszturi; DEBRECZY Lelle VASVARINE; Agnes Horvath; Maria Balogh; Zoltan Meszaros; Gabor Kovacs; Peter Ritli; Aniko Pajor; Judit Sipos
Original assignee: Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet
Priority date: 1985-12-09
Filing date: 1985-12-09
Publication date: 1988-10-28
Also published as: YU210886A; FI84072B; CS908986A2; HRP930558A2; DE3671628D1; SU1604156A3; WO1987003595A1; EP0250535A1; YU45388B; HUT44566A; US4803274A; NO169076C; NO873247D0; KR940009028B1; FI873443A0; FI873443A; CA1284800C; ATE53212T1; JPH0742299B2; SI8612108A8

Description

A találmány tárgya eljárás bázikus proteinek elkülönítésére proinzulin és/vagy származékai enzimatikus hasításakor keletkező proteinkeverékekből.

Humáninzulin góntechnikai előállításénál az inzulin bioszintézisét egy prekurzoron, a proinzulinon keresztül hajtják végre, melynek során a B-láncot a C-peptiden ( = Connecting Peptide) át kapcsolják össze az A-lánccal. Az Escherichia coli révén végbemenő géntechnológiai folyamatban olykor előbb egy fúziós proteint kapunk, melynél a proinzulinhoz még egy idegen protein, például /3-galaktozidáz kapcsolódik. Ezt az idegen proteint a további feldolgozás előtt először le kell hasítani, pl. halogén-cianiddal (1. DE-OS 34 40 988). A halogén-cianiddal való hasítás után a cisztein-maradékot szulfitolizissel (nétrium-szulf ittál és nátrium-tetrationáttal való kezeléssel) S-szulfonáttá alakítjuk. Ebből a formából a molekulát reduktív úton (például merkapto-etanollal való kezeléssel bázikus oldatban) a diszulfid-hid képzése közben natív térszerkezetébe viszik ét. A proinzulinból illetve pre-proinzulinböl (a = = proinzulin származéka; a .pre’ előtag a proinzulin N-terrainusán lévő egy vagy több kiegészítő aminosavra vonatkozik) enzimatikus hasítással (pl. tripszinnel) egy inzulinprekurzort, az inzulin-Arg-B31-B32-t és C-peptidet tartalmazó hasítási keveréket állítanak elő. A keverék ezek mellett még néhány mellékterméket, mint pl. inzulin-Des-Thr-B30-t, inzulin-Arg-B31-t valamint nem teljesen lehasadt intermediereket tartalmaz.

A kiindulási anyag kémiai kezelésével első lépcsőben keletkezett inzulinszármazékokat és vegyületeket egymástól el kell választani. Különösen nehéz ez a feladat, ha bázikus jellegű inzulinszármazékokat kell szétválasztani. amelyek a tercier-szerkezet képződése után a molekulán belül lévő aminosavakon derivatizálódást mutatnak.

Erre vonatkozólag egy összehasonlító kísérlet ad tájékoztatást (1. B rész): a 26 29 568 sz. német szövetségi köztársaság-beli szabadalmi leirás inzulin tisztítására vonatkozó anioncserélő eljárást ismertet, melynek során az eluáló folyadékhoz a protein-aggregáció elkerülése érdekében nemionos tenzidet adnak. Ez az eljárás jól alkalmazható inzulinok tisztításához, de ha pl. géntechnikai eredetű proinzulin tripszinnel történő hasításával kapott bázikus proteinek elválasztását és elkülönítését kísérlik meg, ez nem hozza meg a kivént eredményt, a szétválasztás nem sikerül. Ezt a megfelelő eluáléei profil (1. B rész) bizonyltja; látható, hogy az egyes peptídekre vonatkozó hullámcsúcsok egymásba átmennek.

Ismeretesek olyan eljárások is, amelyek segítségével az említett proinzulin hasítási termékek szétválaszthatok. - Steiner és társai a .Journ. of Bioi. Chem.' 246, 1365-1374. oldalán (1971) C-peptíd elkülönítésére vonatkozó eljárásról tájékoztatnak proinzulin hasítási termékből. Ennél az eljárásnál (hozamot nem adtak meg) gyengén savanyú, karboximetilcsoportokat (CM) tartalmazó, cellulózbázisú kationcserélőn kromatografálunk. A felvitelre kerülő és az eluáló oldathoz 7 mól/1 karbamidot adnak, hogy megakadályozzák a proteinek aggregációját. Ilyen nagy mennyiségű karbamid jelenléte azonban hátrányos, mert ez proteinszármazékok kialakulásához vezet, elsősorban a szabad aminocsoportok karbamoileződéséhez.

Markussen és társai a .Protein Engineering’ 1. köt. 3. sz. 205-213. oldalán (1987) kromatográfiás eljárást ismertetnek háromdimenziós, térhálósított poliszacharid mátrix alapú, dietil-2-hidroxi-propil-amino-etil-tartalmú (QAE) anioncserélön. - Ennél az eljárásnál - az anioncserélős kromatográfia hozamát nem adták meg - a proteinek aggregációjának meggátlására 60%-os etanol-oldatban dolgoznak. A koncentrált etanol-oldatok alkalmazásának az a hátránya, hogy a koncentrált szerves oldószerekkel kapcsolatban szükséges technikai, biztonsági előírásokat kell követni. Másfelől pedig az említett alkohol-koncentrációnál a proteinek denaturálódása lép fel.

A fentiek ismeretében azt a feladatot tűztük ki, hogy megfelelő szétválasztási és elkülönítési eljárást dolgozunk ki bázikus proteinek előállításához proteinkeverékekből. Azt tapasztaltuk, hogy ha a proteinkeverékeket erősen savas kationcserélőn kromatografaljuk és az eluáláshoz viszonylag kis mennyiségű alkoholt használunk, a technika állásához képest egyrészt a szétválasztás kedvezőbb eredményt ad, másrészt a proteinek átalakulása is messzemenően elkerülhető. Figyelemreméltó, hogy olyan származékok is elválaszthatók, amelyek - a proinzulin előkezelésénél keletkező - változást mutatnak a ezóbanlevő proteinek tercier-szerkezetében. A szétválasztott proteinek aggregációjára nem került sor. Az ioncserélő ismételt alkalmazása semmiféle nehézséget nem okoz.

A találmány tárgya tehát eljárás bázikus proteinek elkülönítésére proinzulin és/vagy ennek természetes, félszintetikus vagy géntechnikai eredetű származékai enzimatikus hatásával kapott proteinkeverékekből, melynek során a proteinkeveréket ioncserélőre visszük fel és eluáljuk. Találmányunkat az jellemzi, hogy ioncserélőként erősen savas kationcserélőt alkalmazunk és az eluáláshoz viz és 1-4 szénatomos alkanol keverékét használjuk, a keverék kb. 10-50 térfogatX, előnyösen kb. 20-40 térfogatX, különösen 30 térfogatX alkanolt tartalmaz. A találmány szerinti eljárással nagy hozammal lehet bázikus proteineket elkülöníteni tetszés szerinti proinzulinok illetve ezek származékai, mint pl. majom-pre-proinzulin hasítási keverékeiből. Ioncserélőként elvben valamennyi erősen savas kationcserélő szóba jöhet. Előnyösek

HU 198218 Β azok az erősen savas kationcser élők, melyek funkciŐB csoportként szulfocsoportot, különösen szulfo-propilceoportot (-CH2-CH2-CH2-SO3H) tartalmaznak, pl. hidrofil, hidroxicsoportot tartalmazó vinilpolimer (pl. WFractogel TSK, gyártó cég Merck, Darmstadt), akril-kopolimer (pl. SP W Trisacryl M, gyártó cég Réactifs IBF, Villeneuve-la-Gavenne, Franciaország) mátrixon vagy térhálós agaróz részt tartalmazó géleken (pl. S-W Sepharose, gyártó cég Pharmacia, Upsala, Svédország); különösen előnyös az S-Sepharose.

Közvetlenül a hasítási keverék felvitele előtt az erősen savas kationcserélőhőz pufferoldatot kell adni. A pufferoldat előnyösen viz és 1-4 szénatomos alkohol keveréke, melyben az alkohol mennyisége előnyösen kb.

10-50 térfogata, célszerűen kb. 20-40 térfogatX, különösen kb. 30 térfogatX. Előnyben részesülnek az etanol és az izopropanol, különösen az izopropanol. A pufferoldathoz további adalékanyagok adhatók, pl. só, előnyösen fiziológiásán elviselhető ásványi sók, egy vagy több tetszés szerinti szerves sav, előnyösen tejsav, valamilyen bázis, előnyösen NaOH, és/vagy konzerváló anyagok. A pufferoldat előnyős pH-értéke kb. 2,5-5,5 között, különösen kb. 3,5-4,0 között van.

Az erősen savas kationcserélőre való felvitelhez a hasítási keveréket egy pufferoldatban - előnyösen az előbbiekben leírt öszszetételben és a megadott pH értéken - oldjuk és az így kapott oldatot az erősen savas kationcserélővei érintkezésbe hozzuk.

Az eluáló oldat - melynek lényegében az előbb leírt pufferoldattal azonos összetétele van - pH-értéke előnyösen 3,5-4,0 között van. Különösen olyan elúciós eljárás minősül előnyösnek, melynél az eluáló oldat előnyösen lineáris felfutású sókoncentráció-gradienst mutat.

Ez a koncentráció-gradiens például úgy hozható létre, hogy az eluélás kezdetén az eluáló oldat sókoncentrációja csekély (határesetben közel O) és az eluciós folyamat során a sókoncentrációt növeljük. Ezen a módon a proteinkeveréket különösen hatékonyan lehet szétválasztani. Az előnyös sókoncentrációgradiens a közel 0 mól só/1 (az eluálás kezdete) és a kb. 1 mól só/1 (az eluálás vége, között váltakozhat, különösen előnyös a kb. 0,15 (az eluálás kezdete) és a 0,35 mól/1 (az eluélás vége) közötti érték. Sóadalékként számos szerves és szervetlen só jöhet számításba. Előnyösek a fiziológiásán elviselhető sók, mint az ammónium- és alkáli-sók, célszerűen nátrium-sók, különösen a nátrium-klorid.

A találmány szerinti szétválasztási eljárást különböző módon, előnyösen oszlopon vagy szakaszosan valósíthatjuk meg. A hőmérsékletet - amelyet az ioncserélő-kromatográfiában előnyösen konstants értéken kell tartani - széles körben variálhatjuk. Előnyös a kb. -10 °C-50 °C közötti, különösen a 15-20 °C közötti hőmérséklet-intervallum.

Az alábbi, kiviteli példában (A) a találmányt közelebbről mutatjuk be. Az utána következő összehasonlító példával (B) a találmány ezerinti eljárás előnyeit kívánjuk bizonyítani a technika állásához tartozó (26 29 568 sz. NSZK-beli szabadalmi leírás), inzulin tisztítására vonatkozó eljárással szemben.

A) példa a találmány szerinti eljáráshoz mmól/1 tejsavat, 30 tömegX izopropanolt és 1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó kb. 3,5 pH-értékű vizes pufferoldatban 6 1

S-Sepharose-t feliszapolunk és kb. 80 cm magasságban 10 cm átmérőjű oszlopba töltünk. Az oszlopot 10 1 vizes start-pufferoldattal (50 mmól/1 tejsav, 30 tömegX izopropanol, 0,15 mmól/1 nátrium-klorid, pH-érték kb. 3,5) tartjuk egyensúlyban. Pre-prohumáninzulin tripszinnel végrehajtott hasításából származó, 6,2 g inzulin-Arg-B31-32-t, 3 g inzulin-Arg-B31-t és inzulin-Des-Thr-B30-t, valamint ismeretlen hasítási intermediereket és származékokat tartalmazó kristályos hasítási keverékből 15 g-t 3 1 start-pufferben oldunk és az oszlopra felvisszük. Utána 50 mmól/1 tejsavat és 30 tömegX izopropanolt tartalmazó, 3,5 pH-értéken (NaOH-val beállított) vizes oldattal és 0,15 mól/1-0,35 mól/1 gradiensű nátrium-koriddal eluáijuk. Az eluáló oldat tömege 2 x 20 1. Az átfolyási sebesség 1,5 1/óra. Azokat a frakciókat, melyek inzulin-Arg-B31-32 tartalma HPLC (High Pressure Líquid Chromatography = nagynyomású folyadék-kromatográfia) szerint 90X fölött van, összegyűjtjük, 1:1 arányban vízzel hígítjuk, majd 10 ml ΙΟΧ-os ZnCLz-oldat/1 oldat hozzáadásával és a pH 6,8-ra való beállításával kicsapjuk. A hozam 5 g inzulin-Arg-B31-32, ami az inzulin-Arg-B31-32-re vonatkoztatva 80% oszlophozamnak felel meg.

B) összehasonlító példák

Az I összehasonlító példát a 26 29 568 sz. NSZK-beli szabadalmi leiráe, és a II példát a találmány szerint hajtottuk végre. Az 1. táblázatban az eljárási paramétereket és az elért eredményeket állítottuk egymással szembe. Az 1. ábra az I összehasonlító példánál, a 2. ábra a II, a találmány szerinti eljárásnál felvett elúciós profilt mutatja. Az A abszorpciót az UV-tartoményban 278 nm hullámhosszúságnál (Arra), szemben az elúciós idővel illetve a frakciók számával vittük fel. Az elúciós profilok mutatják, hogy a találmány szerint jobban szétválaszthatok a bázikus proteinek, mint a 26 29 568 sz. NSZK-beli szabadalmi leírásban ismertetett eljárással. Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárás nagyobb hozamot és a termék nagyobb tisztaságát is eredményezi (1. 1. táblázat).

-3HU 198218 B c

•^í h

υ

N <0 c

-<Ö s

g	» 2
o
co	b
5 υ	S
44	75
C 3	w
«Μ	-□ E

•o « 44 § ^QO

Φ to Λ Ο τ

A

I &

& S » 43 ö *rt i

0}	o
•C	«
0í
..	>—<
3 2	'1
	tn
>8	CQ
*3	©

frí 04 <0 X ft i

O’V u •r- M

X (λ ο

c «3

CM

0.

ο

N

X ο

tUJ

X o

X tO o

o σι «

’S

-<Ö x

co

-Φ co

I to <

I c

CQ

I tű fr<

<

í c

<—í

P ¢4

Összehasonlító ioncserélőé kromatográfia (E. coli révén géntechnikailag előállított majora-proinzulin tripszines kezelésével nyert proteinkeverékre vonatkozóan)

?·§

M

4. .S

Φ ..

¢0 u ü c o gg

IS

CŰ r4 6.2 ^φft-Ö Λ £ Sí ί 5 í* o

fi ^ü Xí w

w « £

Ο Ό I :2 .. ώ £ .2 rn ~ *q3

s. B ll ° 3

Q. ÚÖ « s c 5 • >M OS > ö c

X c

ε

I »*

9 c £ e* js I * <5 ε

ο

X ο

frí

Έ

I t>0 §2 í—4 XS

I «—» ο

ο 3 «γ c 4 v o v £ « # S *o x

O I tű

X ©

© &

Ϊ

N

M rS

-CÖ >

-B31-32, inzulin-Arg-B31 és bézikus szennyezők között bázisvonal-szétválasztés szennyezők között

2	CO		tű
•φ	l	41
fr<	» c	*5 o	N
φ	frí ω	»0
ta u a o	«Μ TJ «w d 3 2	N ta (0	44 Ό F*í
H-4	Oí to	o	-cö

E <ö

N

X no sö

CO

N

-cö 5

M

-<n N

HU 198218 Β

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás bázikus proteinek elkülönítésére proinzulin és/vagy ennek természetes, félezintetikus vagy géntechnikai .eredetű 5 származékai enzimatikus hasításával kapott proteinkeverékekböl, melynek során a proteinkeveréket ioncserélőre visszük fel és eluáljuk, azzal jellemezve, hogy ioncserélőként erősen savas kationcseré- 10 löt alkalmazunk, és az eluáláshoz víz és 1-4 szénatomos alkanol olyan keverékét használjuk, mely 10-50 térfogatx, előnyösen kb. 20-40 térfogatx, különösen 30 térfogatx alkanolt tartalmaz.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy erősen savas kationcseré lóként ezulfocsoportot, különösen szulfopropilcsoportot tartalmazó kationcserélőt alkalmazunk. 20
3. Az 1. vagy 2. igénypontok szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a proteinkeveréket 2,5-5,5 előnyösen 3,5-4,0 pH-értéken visszük fel az erősen savas kationceerélőre.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike ezerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az eluáláshoz, viz és 1-4 szénatornos alkanol olyan keverékét alkalmazzuk, mely alkanolként etanolt vagy izopropanolt, különösen izopropanolt tartalmaz.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az elüciós oldat pH-ját 3,5-4,0 pH-értékre állítjuk be.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti 15 eljárás azzal jellemezve, hogy a felvitelre kerülő és az elüciós oldathoz puffért, előnyösen szerves savat, különösen tejsavat alkalmazunk.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az eluálást 0-1 mól/1, különösen 0,15-0,35 mól/1 ammónium- vagy alkálisó-gradienssel hajtjuk végre.