HU193234B

HU193234B - Process for preparing optically active 3-/3,4-dihydroxy-phenyl/-serine and derivatives thereof

Info

Publication number: HU193234B
Application number: HU844071A
Authority: HU
Inventors: Hamao Umezawa; Tomio Takeuchi; Masa Hamada; Shuichi Iwadare; Ikuo Matsumoto; Hajime Morishima; Toshiharu Nagatsu
Original assignee: Banyu Pharma Co Ltd; Microbial Chem Res Found
Priority date: 1983-11-04
Filing date: 1984-11-02
Publication date: 1987-08-28
Also published as: EP0141613A2; US4699879A; EP0141613B1; HUT38393A; EP0141613A3; JPH0559719B2; CA1241612A; JPS6098995A; KR850003572A; DE3476560D1; ATE40570T1

Description

-1193234

5037), Streptomyces tendae (ISP 5101) és Streptomyces toyocaensls (ISP 5030) fajba tartozó mikroorganizmusban lévő vagy mikroorganizmus által termelt aciláz enzimmel lehidrolizálják, majd a keletkezett (II) általános képletű L-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin-származékot, ahol a képletben R¹ és R² jelentése a fentiekben megadott, a dezacilezés után változatlanul visszamaradó (III) általános képletű N-acil-D-3- (3,4-dihidroxi-fenil) -szerin-vegyülettől — ahol a képletben R¹, R², R³jelentése a fentiekben megadott — elkülönítik.

-2193234

A találmány tárgya új eljárás egy optikailag aktív 3- (3,4-dihidroxi-fenil)-szerin, illetve e vegyület egy olyan származéka előállítására, amelyben a fenilcsoporton levő 3- és 4helyzetö katekolos hidroxilcsoportok védettek, és amely származék alkalmas köztiterméke egy optikailag aktív 3- (3,4-dihidroxi-fenii)-N-metil-szerin előállítására irányuló eljárásnak. Az optikailag aktív 3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin gyógyszerként ismert anyag.

A 49252/75 és 20747/80 számú japán, vizsgálat nélküli első közrebocsátású („Kokai) szabadalmi bejelentésekből, a 3.920.728 és a 4.319.040 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokból ismeretes, hogy az L-treo-3- (3,4-dihidroxi-fenil) -szerin (amelyet egyes esetekben L-treo-DOPS-ként is emlegetnek) előnyösen alkalmazható depresszió ellenes vagy magasvérnyomás elleni szerként. A 125630/77 számú japán, vizsgálat nélküli első közrebocsátású („Kokai) szabadalmi bejelentés pedig e vegyületnek a Parkinson-kór kezelésére való felhasználhatóságát ismerteti. Az L-eritro-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin magasvérnyomás ellenes szerként használható a 49252/75 számú japán, vizsgálat nélküli első közrebocsátású („Kokai”) szabadalmi bejelentés szerint.

Továbbmenőleg, egy olyan L-treo-3-(3,4- dihid roxi-f eni 1) -szerin-származék, amelynek a benzolgyűrűn méta- és para-helyzetben található hidroxilcsoportjai oxigénatomjukon keresztül valamely szokásosan alkalmazott hidroxil-védőcsoporVal kapcsolódnak, kiindulási anyagként használható fel az L-treo-3-(3,4-dihidroxi-fenil) -N-metil-szerin szintézisénél, mely utóbbi vegyület értékes pszichotróp gyógyszerhatóanyag. A 221797/82 számú japán szabadalmi bejelentés, az 523.957 sorozatszámú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés és a 0112606 Al közzétételi számú európai szabadalmi bejelentés szerint különösképpen depresszió ellenes és Parkinson-kór elleni hatással rendelkezik.

Egy olyan L-eritro-3-(3,4-dihidroxi-fenil) -szerin-származék pedig, amelyben a fenilcsoport 3- és 4-helyzetű, katekolos jellegű hidroxilcsoportjai védve vannak, kiindulási vegyületként alkalmazható az L-eritro-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-N-metil-szerin szintézisénél. Ez utóbbi vegyület, a 72053/83 számú japán szabadalmi bejelentésben foglaltak szerint, értékes vérnyomáscsökkentő hatással rendelkezik.

A treo-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin egy optikailag aktív, azaz D- vagy L-alakja előállítására számos különféle, a technika állásához tartozó eljárás ismeretes: ezek mindegyike magában foglal egy olyan lépést, hogy egy optikailag inaktív vegyületet, a DL-treo-N-(benzil-oxi-karbonil) -3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerint, rezolválásnak vetnek alá, amelynek során egy optikailag aktív efedrinszármazékot vagy egy optikailag aktív treo-1 - (p-nitro-fenil) - 2-amino -1,3-pro pán dióit (lásd a 49252/75 számú japán, vizsgálat nélküli első közrebocsátású), („Kokai”) szaba2 dalmi bejelentést, kinint (lásd a 65242/77 számú japán, vizsgálat nélküli első közrebocsátású), („Kokai”) szabadalmi bejelentést, egy optikailag aktív treo-l-(p-metil-szulfonil-fenil)-2-amino-l,3-propándiolt (a 36233/79 számú japán, vizsgálat nélküli első közrebocsátású („Kokai”) szabadalmi bejelentés szerint) és optikailag aktív S-2-amfno-l,l-difenil-propanolt, S-2-amino-3-metil -1, 1 - d i fenil-butanolt vagy S-2-amino-4-metil-l,l-difenil-pentanolt (a 29551/81 számú japán, vizsgálat nélküli első közrebocsátású („Kokai”) szabadalmi bejelentésben foglaltak szerint) alkalmaznak. A rezolválás után az ily módon elkülönített, optikailag aktív treo-N- (benzil-oxi-karbonil) -3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerinről eltávolítják a benzil-oxi-karbohil-csoportot, amely az aminocsoport védelmére szolgált, és a katekolos hidroxilcsoportokat védő benzilcsoportokat. Mindezek ellenére, a technika állásához tartozó fentebb ismertetett eljárások hátrányai közé számít az, hogy az optikai rezolváláshoz használt fentemlített vegyületek kereskedelmi beszerzése nehézségekkel jár, hogy az optikai izoméria szempontjából nagytisztaságú L-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerint ezen a módon nem lehet előállítani csak a kikristályosítás és újralecsapás műveletének fáradságos, többszöri megismétlése révén, valamint az, hogy a köztitermékként kapott diasztereomer só elbontása céljából egy külön lépésre van szükség.

Mindezek ismeretében, mi, a jelen találmány szerzői, vizsgálat tárgyává tettük, hogy vajon a DL-treo-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin optikailag rezolválható-e a D-, illetőleg L-izomerre egy enzimatikus eljárás segítségével? Azt találtuk, hogy ez az elképzelésünk sikerrel vihető keresztül abban az esetben, ha egy (1) általános képletű N-acil-DL-3-(3,4dihidroxi-fenil) -szer in-származékot állítunk elő — ahol az (I) általános képletben R¹ és R² jelentése hidrogénatom vagy fenil(1-4 szénatomos)alkil-, naftil-(l-4 szén atomos) alkilcsoport vagy R¹ és R² együtt (1-4 szénatomos) alkiléncsoport, és R³ jelentése adott esetben halogénatommal vagy hidroxilcsoporttal helyettesített (1-4 szénatomos) alkilcsoport, vagy fenil- vagy naftilcsoport —, és ezen N-acilezett szerinszármazékot egy olyan aciláz enzimmel reagáltatjuk, amely képes arra, hogy az R³CO- képletű N-acil-csoportot szelektíven, a fenti (1) általános képletű DL-vegyület L-izomerjének α-amino-csoportjáról távolítsa el, de ugyanakkor nem képes arra, hogy az említett (I) általános képletű DL-molekuIavegyület D-izomerjének α-amino-csoportjáról az acil védőcsoportot eltávolítsa; ily módon egy (II) általános képletű L-3- (3,4-dihidroxi-fenil) -szerin-származékhoz jutunk, amelynek képletében R¹ és R² jelentése fenti, s ugyanakkor a (III) általános képletű N-acilezett-D-3- (3,4-dihidroxi-fenil)-szerin, amelynek képleté ben R¹, R² és R³ jelentése előzők szerinti, változatlanul visszamarad. Kísérleteink eredmé3

-3193234 nyeképpen azt találtuk, hogy egyetlen ismert, a kereskedelemben jelenleg beszerezhető aciláz enzim sem képes az R³CO- képletü N-acil-védőcsoportot szelektíven az N-acil-L-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerinről aszimmetriás hidrolízis révén eltávolítani. Ennek megfelelően kiterjedt vizsgálatokat folytattunk a természetben előforduló anyagok és vegyületek széles körében, és felfedeztük, hogy néhány, a Streptomyces nemzetségbe tartozó mikroorganizmus és egyes, a Streptoverticillium nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok képesek arra, hogy az N-acil-védőcsoportot szelektíven az N-acil-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin L-enantiomerjéről hidrolizálják le, miáltal az (I) általános képletü DL-molekulavegyületben jelenlevő L-alak dezacileződik csak. Tehát ezek a Streptomyces, illetve Streptoverticillium nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok olyan aciláz enzimekkel rendelkeznek, amelyek képesek arra, hogy a treo- vagy eritro-N-acil-3- (3,4-dihidroxi-fenil) -szerin L-enantiomerjét hidrolizálják, ezáltal szelektíven csak az L-alakról távolítsák el az N-acil-védőcsoportot.

Ennélfogva azt találtuk, hogy a találmány célkitűzésének megvalósítása céljából a következőképpen járhatunk el: az ismert módon előállított DL-treo- vagy DL-eritro-DOPS, illetve ezen vegyületek O-védett származéka, amelyben a katekolos, 3- és 4-helyzetű hidroxilcsoportok védettek, N-acilezését valamilyen aktív alkanoil-, illetve aroilcsoportot tartalmazó vegyület felhasználásával, ismert módon hajtjuk végre, és az így kapott N-acil-DL-3- (3,4-dihidroxi-fenil) -szerint vagy annak O-védett származékát, amelyben a katekolos jellegű, 3- és 4-helyzetü hidroxilcsoportok védve vannak, azután enzimes kezelésnek vetjük alá, ahol az említett szerinszármazékokkal reakcióba lépő enzimet valamely, a Streptomyces vagy a Streptoverticillium nemzetségbe tartozó mikroorganizmus tenyészoldata szolgáltatja, amely a megfelelő acilázt tartalmazza. De enzimforrásként szolgálhat valamely, az említett tenyészoldat kezelése által nyert anyag is, amely az aciláz enzimet tartalmazza, így például az említett tenyészoldatból elkülönített mikroorganizmus-sejtek, vagy ez utóbbiak kezelése útján nyert enzimtartalmú anyag, vagy maga az említett mikroorganizmus által termelt és abból kivont aciláz enzim is. Az enzimes kezelés eredményeképpen, az N-acilezett szerinszármazék sztereoszelektív hidrolízise és az N-acil-védőcsoport eltávolítása következtében az L-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerint vagy annak olyan védett származékát kapjuk, amelynek molekulájában a katekolos, 3- és 4helyzetü hidroxilcsoportok védettek, míg az N-acil-D-3- (3,4-dihidroxi-fenil) -szerin vagy annak O-védett származéka, amelyben a katekolos, 3- és 4-helyzetű hidroxilcsoportok védettek, változatlanul visszamarad, anélkül, hogy az enzimatikus reakcióban részt vett volna. Az eljárás következő lépésében az L4

-3-(3,4-dihidroxi-íenil)-szerint a reagálat lanul visszamaradó N-acil-D-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin-származéktól könnyűszerrel elválaszthatjuk e vegyületek különböző oldékonyságának felhasználása révén, illetve bármilyen egyéb, eltérő fizikokémiai tulajdonságuk alapján. Ezen felismerések felhasználásával a jelen találmány célkitűzése megvalósítható.

Találmányunk így - egyfelől - eljárást biztosít egy optikailag aktív, (II) általános képletű L-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin és -származékok előállítására, ahol a képletben R¹ és R²jelentése hidrogénatom vagy fenil-(1-4 szénatomos) alkil-, naftil-(l-4 szénatomos) alkilcsoport, vagy R‘ és R² együtt (1-4 szénatomos) alkiléncsoport, továbbá optikailag aktív (III) általános képletü D-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin-származékok előállítására, ahol a képletben R¹ és R² jelentése a fenti és R³ jelentése adott esetben halogénatommal vagy hidro'xilcsoporttal helyettesített (1-4 szénatomos)alkilcsoport, vagy fenil- vagy naftilcsoport.

A találmány szerinti eljárást úgy végezzük, hogy egy (I) általános képletü N-acil-DL-3- (3,4-dihidroxi-fenil) -szerin, amelynek képletében R¹, R² és R³ jelentése a fentiekben megadott, L-izomerjének aminocsoportjáról az N-acilcsoportot egy

Actinomyces aureoverticillatus,

Actinomyces bicotor,

Streptomyces blastmyceticus,

Streptomyces chartreusis,

Streptomyces flavopersicus,

Actinomyces flavotricini Streptoverticillium griseocarneum, Streptomyces hachijoensis,

Streptomyces halstedii,

Streptoverticillium hiroshimense,

Streptomyces tendae,

Streptomyces toyocaensis fajba tartozó mikroorganizmus által termelt aciláz-enzimmel lehidrolizáljuk. Maga a mikroorganizmus helyett a mikroorganizmusnak egy olyan kivonata is alkalmazható, amely azt az aciláz enzimet tartalmazza, amely az (1) általános képletü DL-szerin-származékban jelenlevő L-enantiomer aminocsoportjáról az N-acil-védőcsoportot szelektíven eltávolítani képes, és ezáltal egy (II) általános képletü L-3- (3,4-dihidroxi-fenil) -szerin-származékot képes termelni.

A (II) általános képletü L-szerin-származéknak a (III) általános képletü, nem dezacileződött N-acil-D-3- (3,4-dihid roxi-fenil )-szerintői való elkülönítésének lépése zárja a reakciósort.

Kívánt esetben a találmány szerinti eljárás egy további reakciólépést is magábafoglalhat: a megmaradt R' és R² hidroxil-védőcsoportok eltávolítását a kapott (II) általános képletü, O-védett, L-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin-származékról. Ez önmagában ismert eljárás segítségével történik és eredményeként az L-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerint

-4193234 kapjuk. Más esetben az N-acil-védőcsoportot kell eltávolítani — esetleg az O-védőcsoportok eltávolítása mellett — a találmány szerinti eljárással kapott (III) képletű N-acil-D-3- (3,4-dihidroxi-fenil) -szerin-vegyületről.

Amennyiben szükség van rá, ezt követi az R¹ és R² hidroxil-védőcsoportok eltávolítása a kapott D-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin O-védett származékáról, amelynek végrehajtása ismert módon történik és D-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerint eredményez. így amikor a (III) képletű, a találmány szerinti eljárásnak megfelelően előállított N-acil-D-3- (3,4-dihidroxi-fenil)-szerint valamely kémiai ágens segítségével, ismert módon elhidrolizáljuk az N-acilcsoport eltávolítása céljából, akkor a D-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerint vagy annak olyan O-védett származékát kapjuk, amelynek 3-as és 4-es helyzetű katekolos hidroxilcsoportja védőcsoporttal van ellátva.

A jelen találmány szerinti eljárás értelmében semmiféle optikai rezolválás céljából alkalmazott vegyszerre nincs szükség, amellett, hogy a köztitermékként keletkezett diasztereomer só elbontására szolgáló lépés

- amely szükségképpen elemét képezte a rezolváló ágens alkalmazásával járó optikai rezolválás! műveletnek — is elmaradhat, a találmány szerinti eljárásban felhasznált enzim alkalmazása következtében. így a találmány szerinti eljárással optikailag aktív 3- (3,4-dihidroxi-fenil)-szerint, illetve e vegyület katekolos hidroxilcsoportjain védőcsoportokat tartalmazó származéka könnyűszerrel, az optikai izoméria szempontjából igen tisztán állítható.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott az előzőekben felsorolt fajhoz tartozó mikroorganizmusok az (I) általános képletű DL-3- (3,4-dihidroxi-fenil) - szer in-vegyü létben jelenlévő L-alakról távolítják csak el az N-acil-védőcsoportot. Ezáltal szelektív dezacileződés valósul meg.

Bármely olyan mikroorganizmus alkalmazása számításba jöhet, amelynek szervezetében van ilyen, vagy amely maga termelni képes ilyen szelektív dezacilezést katalizáló enzimet.

Az alábbiakban példák gyanánt felsorolunk néhány olyan mikroorganizmust, amely a találmány szerinti eljárás kivitelezése során előnyösen alkalmazható:

Actinomyces aureoverticillatus (IMC S-0234) (ISP 5080) (FERM P-7216) (ATCC 19726) CBS 465.68) (IFO 12742), Actinomyces bicolor (IMC S-0276) (ISP 5140) (ATCC 23614; CBS 469.68) (IFO 12746), Streptomyces blastmyceticus (IMC S-0189) (ISP 5029) (FERM P-7217) (ATCC 19731; CBS 470.68) (IFO 12747), Streptomyces chartreusis (IMC S-226) (ISP 5085) (ATCC 19738; CBS 476.68) (IFO 12753), Streptomyces flavopersicus (IMC

S-0204) (ISP 5093) (ATCC 19756; CBS 494-68) (IFO 12769), Actinomyces flavotricini (IMC S-0219) (ISP 5152) (ATCC 23621; CBS

495.68) (IFO 12770), Streptoverticillium griseocarneum (IMC S-0237) (ISP 5004) (ATCC 19763; CBS 501.68) (IFO 12776), Streptomyces hachijoensis (IMC S-0244) (ISP 5114) (FERM P-7218) (ATCC 19769; CBS 507.68) (IFO 12782), Streptomyces halstedii (IMC

S-0194) (ISP 5068) (ATCC 19770; CBS 508. 68) (IFO 12783), Streptoverticillium hiroshimense (IMC S-0179) (ISP 5037) (FERM P-7252) (ATCC 19772; CBS 510.68) (IFO 12785), Streptomyces tendae (IMC S-0168) (ISP 5101) (ATCC 19812; CBS 565.68) (IFO 12822) és Streptomyces toyocaensis (IMC S-0163) (ISP 5030) (FERM P-7253) (ATCC 19814; CBS 567.68) (IFO 12824) és mások.

Mindeme fentemlített mikroorganizmusok jól ismert, törzsgyűjteményekben letétbe helyezett tenyészkultúrákból való. E mikroszervezetek mikrobiológiai tulajdonságainak leírása az „International Journal of Systematic Bacteriology” 18. kötet, 2. szám 1968 áprilisában megjelent számának 84—176. oldalain található; e műre történő hivatkozás a jelen szabadalmi leírásban utalásként itt fordul elő. Valamennyi fentebb felsorolt mikroorganizmus a köz számára hozzáférhető Japánban az oszakai „The Institute fór Fermentation, Osaka (IFO) Organization” nevű letéti intézménynél, amelynek címe: 17—85 Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka, 532, Japán. Az IFO nyilvántartási számok, amelyeket fentebb megadtunk, az IFO által kiadott „List of Cultures 1984, 7. kiadásában szerepelnek, illetve az ATCC-jelzések a Washington D. C., USA székhelyű „ American Type Culture Collection”-tól származnak. A fent megadott „IMC”-számok a jelen szabadalmi bejelentés bejelentőjének referenciaszámai a bejelentő laboratóriumában, a Tokióban, Kami-Osaki, Meguro-ku székhellyel működő „Institute of Mícrobial Chemistry nevű intézményben tárolt mikroorganizmus-tenyészetek megjelölésére. Az „ISP-számok, amelyek a felsorolásban szereplő egyes mikroorganizmusok neve után találhatók, az „International Streptomyces Projects elnevezésű nemzetközi kutatóprogram által e mikroorganizmusokhoz hozzárendelt standard referenciaszámok. A felsorolt mikroorganizmusok között szereplő, FERM P-7216, FERM P-7217 és FERM P-7218 j'elzésű törzseket, 1983. szeptember 5-én letétbe helyeztük a „Fermentation Research Institute”, Agency of Industrial Science and Technology nevű japáni intézménynél a fent megadott F.R.I. letéti jelzésekkel ellátva. Jelenleg ugyanott a „FERM BP-640, „FERM BP-641”, illetve „FERM BP-642 nyilvántartási számokon szerepelnek, és a Mikroorganizmusok Szabadalmi Célokra Történő Letétbehelyezésére Vonatkozó Budapesti Szerződés értelmében 1984. október 18. óta hozzáférhetők. A FERM P-7252 és a FERM P-7253 letéti számú törzseket 1983. szeptember 20-án helyeztük letétbe ugyancsak a „Fermentation Research lnstitute”-nál, és ezek most a „FERM BP-643 és „FERM

-5193234

BP-644 nyilvántartási számokon 1984. október 18. óta a Budapesti Szerződés előírásai értelmében hozzáférhetők.

A találmány szerinti eljárás kivitelezése során az (I) általános képletü kiindulási vegyületet, mint az enzim szubsztrátját, úgy vihetjük reakcióba a jelen szabadalmi leírás kita nításával összhangban alkalmazott mikroorganizmussal, hogy az e mikroorganizmus tenyészoldatában jelenlevő mikroszervezetekkel a szubsztrátot közvetlenül érintkezésbe hozzuk. A mikroorganizmus tenyészoldatának előállítása céljából a mikroorganizmust hagyományos tápközegben, ismert módon tenyésztjük. A tápközegben szénforrásként alkalmazhatjuk az e célra szokás szerint felhasznált anyagokat, így például glükózt, szacharózt, fruktózt, mannózt, keményítőt, melaszféleségeket és hasonlókat; nitrogénforrásként ugyancsak a szokásos anyagok használhatók, például szerves anyagok, így pepton, húskivonat, élesztőkivonat, kukoricalekvár, karbamid és hasonlók, és/vagy szervetlen nitrogénvegyületek, mint például ammónium-hidroxid vizes oldata, ammónium-szulfát, nátrium-nitrát és hasonlók. A tenyésztéshez felhasznált tápoldatok továbbá célszerűen megfelelő mennyiségeket tartalmaznak szervetlen sókból, így magnézium-szulfátból, nátrium-kloridból, kálium-dihidrogén-foszfátból, dikálium-hidrogén-foszfátból és hasonló sókból, valamint a mikroszervezetek jó szaporodásához megkívánt bizonyos vegyületeket és/vagy az enzim képződését elősegítő adalékanyagokat tartalmaznak. A mikroorganizmus tenyésztését előnyösen aerob körülmények között végezhetjük, például levegőztetés és keverés mellett történő inkubálással. A célszerű tenyésztési hőmérséklet 20°C és 40°C között van. A tenyésztés időtartama normális körülmények között a legtöbb esetben 1 nap és 10 nap között van. A találmány szerinti eljárásban maga a felhasznált mikroorganizmus és a mikroorganizmus tenyészoldata szolgálnak az enzimatikus dezacilezési reakcióban résztvevő aciláz enzim forrásaként. A mikroorganizmus, illetve tenyészoldatának felhasználása helyett az is járható út, hogy a tenyészoldatból intakt állapotban elkülönített sejteket használjuk fel, amelyek lehetnek élők vagy nem élők, sőt amelyek rögzítettek is lehetnek a mikróbasejtek immobilizálására alkalmazott valamely ismert eljárásnak megfelelően. A jelen találmány szerinti eljárás oly módon is kivitelezhető, hogy az említett mikroorganizmusnak egy olyan kivonatát használjuk fel, amely az említett aciláz enzimet tartalmazza. A mikroszervezetnek ez az aciláz enzimet tartalmazó kivonata megjelenhet a mikroorganizmus tenyészoldatának szürlete alakjában, de nyerhető a sejtek, különösképpen az acilá,: enzimei tartalmazó sejthomogenátum kezt lí'se útján, vagy az előzetesen nyers vagy tiszta állapotban elkülönített aciláz enzim ol6 data formájában is alkalmazható. Ez utóbbi oldat lehet a nyers aciláz enzim oldata, amely enzimet a mikroorganizmus tenyészoldatában előforduló mikróbasejtekből ammónium-szulfátos frakcionált lecsapásos módszer segítségével nyerünk ki. A tisztított aciláz enzimhez úgy jutunk, hogy a nyers aciláz enzimet gélszűréssel vagy más ismert enzimtisztítási eljárással tisztítjuk. A tisztított enzim oldatát is alkalmazhatjuk.· Az aciláz enzim kinyerésénél és tisztításánál bármilyen, az aciláz enzimek előállítására használatos ismert eljárás alkalmazható.

A találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként használt (I) általános képletü N-acil-DL-3-(3,4-dihidroxi-fenil)- szerint vagy annak a katekolos hidroxilcsoportjain védett származékát a következőképpen állíthatjuk elő; egy (IV) általános képletü karbonsavval, amelynek képletében R. jelentése a korábban megadottal azonos, vagy e karbonsav egy reaktív származékával, így például savkloridjával vagy anhidridjével, valamely kondenzációt elősegítő anyag, illetve katalizátor jelenlétében vagy ilyen anyag alkalmazása nélkül, reagáltatjuk a DL-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerint, amelyet korábban ismertté vált eljárások segítségével állíthatunk elő. A DL-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin helyett alkalmazhatjuk e vegyület egy olyan származékát is reakciópartnerként, amelyben a fenilcsoporton 3- és 4-helyzetben levő katekolos hidroxilcsoportok védettek. A DL-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin előállítására nézve lásd a J.Chem.Soc. pp. 658-662 (1947), a J.Am.Chem.Soc. 76, pp. 1322-1326 (1954) és á Chem. Bér. 87, pp. 892-901 (1954) irodalmi helyeket. Az N-acil-csoportra előnyös példák gyanánt adhatjuk meg a következőket: acetil, klór-acetil, glikoloilcsoport, benzoilcsoport és hasonló csoportok, noha megjegyzendő, hogy bármely acilcsoport számításba jöhet a találmány szerinti eljárás kapcsán, azzal a feltétellel, hogy az a találmány szerinti enzimatikus reakció révén előnyösen le is hasítható.

Az (I) általános képletü N-acil-DL-3- (3,4-dihidroxi-fenil)-szerin kiindulási vegyület, illetve annak a katekolos hidroxilcsoportjain védett származéka két aszimmetriás szénatomot tartalmaz, ennélfogva a molekula

2-2 treo-izomer és eritro-izomer alakjában létezik. Akár a treo-izomert, akár az eritro-izomert, akár az elegyüket fel lehet használni kiindulási szubsztrátként a jelen találmány szerinti eljárás során.

Az (I) általános képletü kiindulási DL-szerin-vegyület, amely a találmány szerinti eljárásban szereplő enzimatikus dezacilezési reakció szubsztrátjaként szolgál, résztvehet a reakcióban úgy is, hogy a benzolgyürű 3- és

4-helyzetű katekolos hidroxilcsoportjai védettek, és úgy is, hogy e hidroxilcsoportok nincsenek védve — attól függően, hogy mi a rendeltetése a találmány szerinti eljárással előállított dezacilezett terméknek. így például, ami-6193234 kor az a cél, hogy egy optikailag aktív 3-(3.4-dihidroxi-fenil)-szerint állítsunk elő, az (I) képletű, szubsztrátként alkalmazott szerinvegyület katekolos hidroxilcsoportjai szabadok lehetnek. Másfelől, ha végül is egy optikailag aktív 3-(3,4-dihidroxi-fenil)-N-metil-szerin előállítása a cél, egy utólagos N-metilezés révén, akkor a találmányi eljárásban szereplő enzimatikus reakciót célszerűen úgy kell lejátszatni, hogy a kiindulási, (I) általános képletű DL-szerin-vegyület katekolos hidroxilcsöportjain védett származéka alakjában legyen jelen, mert a szerinszármazék katekolos hidroxilcsoportjain védelemben kell részesülniük a rákövetkező N-metilezési reakciólépés miatt. Ha a találmány szerinti eljárás kivitelezésénél a katekolos hidroxilcsoportjain védett N-acil-DL-3- (3,4-dihid roxi - f en il) -szerin-származékot használunk, akkor természetesen könnyűszerrel megkaphatjuk az optikailag aktív 3- (3,4-dihidroxi-fenil)-szerint a hidroxil-védőcsoportoknak a dezacilezett termékről történő, hagyományos védőcsoport-eltávolítási eljárást alkalmazó eltávolítása útján, az enzimreakció végrehajtását követően.

Az (I) általános képletű N-acil-DL-3-(3,4-dihid roxi-fenil) -szerin-vegyület katekolos,

3- és 4-helyzetű hidroxilcsoportjainak védelmére szolgáló Rj, R² hidroxil-védőcsoportok lehetnek:

fenil-(1-4 szénatomos) alkil-, naftil-(1-4 szénatomos) alkil-csoport vagy R¹ és R² együttesen (1-4 szénatomos) alkilén láncot képez.

A találmány szerinti eljárásban szereplő enzimreakciót, amelynek folyamán az (I) általános képletű N-acil-DL-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin-vegyületeket a mikroorganizmus, vagy a mikroorganizmusból származó aciláz enzim segítségével dezacilezzük, célszerűen pH 5 és 9 között, előnyösen 5 és 6 közötti pH-értéken, 20° és 80°C közötti hőmérsékleten, előnyösen 35° és 60°C közé eső hőmérsékleten végezzük. A reakcióközeg lehet víz, amely nem tartalmaz, vagy kívánt esetben tartalmaz megfelelő arányban egy olyan szerves oldószert, amely nem inaktiválja az enzimet, így például valamilyen kisszénatomszámú alkoholt, például etanolt. Kívánt esetben, vagy ha ez előnnyel jár, az enzimreakciót végezhetjük valamilyen fémkation, így például katalizátorként hozzáadott kobalt jelenlétében. A szükséges reakcióidő a felhasznált enzim mennyisége és aktivitása függvényében változhat; befolyással lehet rá a reakcióhőmérséklet és különböző más tényezők, de a reakcióidő normális esetben 30 perc és 20 óra között van. Egy 2 óra és 18 óra közé eső időtartam a legtöbb esetben elegendő a reakció lefolyásához.

Az enzimatikus reakciót követően hajthatjuk végre a keletkezett L-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin, illetve (II) általános képletű katekolos hidroxilcsoportjain védett származékának a (III) általános képletű N-acil-D10

-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerintői, illetve katekolos hidroxilcsoportjain védett származékától való elválasztását. Ez utóbbi vegyület ugyanis, miután nem vesz részt az enzimkatalizálta dezacilezésben, változatlanul viszszamarad a reakció lezajlása után. Az elkülönített lecsapás segítségével végezhetjük, felhasználva azt a körülményt, hogy az N-acil-D-3- (3,4-dihid roxi-fenil) - szer in-vegyületek általában kevésbé oldhatók vizes közegben, mint az L-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin-vegyületek, a savas pH-tartományban. Más megoldásként a (II) általános képletű L-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin-vegyület és a (III) képletű N-acil-D-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin-vegyület elkülönítését egy „fázisátvitel-kioldási módszer alkalmazásával érhetjük el, amint azt a későbbiekben a 2. példában bemutatjuk. Az eljárás kivitele a következő: az enzimes reakció reakcióelegyét n-butanollal extraháljuk; e művelet eredményeképpen egy olyan n-butanolos oldatot kapunk, amelyben mind a (II) általános képletű L-vegyület, mind a (III) általános képletű D-vegyület oldott állapotban van jelen. Az n-butanolt az oldatból elpárologtatjuk, a kapott maradékot 0,05 M pH=7,0 foszfátpufferben felvesszük, az így kapott oldatot, amely mind a (II), mind a (III) általános képletű vegyületet tartalmazza, sósavval megsavanyítjuk, majd etil-acetáttai extraháljuk a megsavanyított oldatot, miáltal főleg a (III) általános képletű vegyület oldódik át az etil-acetátba. Az etil-acetátos fázist ezután lúgos kémhatású (pH=9) vizes oldattal rázzuk ki, hogy a (III) általános képletű vegyületet ezáltal a vizes fázisba vigyük át, mely utóbbit savas (pH= 1) körülmények között ismételten etil-acetáttai rázunk ki, és így tovább.

A találmány szerinti eljárással kapott (II) és (III) általános képletű végtermékeket azután külön-külön izolálhatjuk és a szokásos kromatográfiás módszerrel tisztíthatjuk. A kromatográfiás tisztítási eljárás például szilikagél töltetű oszlopon történő kromatografálást vagy ioncserélő gyantán végzett kromatografálást jelent. Arra is lehetőség van, hogy a végtermékek izolálását és tisztítását egy nagyon egyszerű módon végezzük, például úgy, hogy — a (II) és (III) általános képletű termékek oldékonyságának különbségét kihasználva — a lecsapásos vagy a kristályosításos eljárást alkalmazzuk.

A következőkben találmányunkat példákkal illusztráljuk, anélkül azonban, hogy találmányunkat bármilyen tekintetben e példákra korlátoznánk.

1. példa (a) A mikroorganizmus tenyésztéshez alkalmazott tápközeg a következő anyagokat tartalmazta: 1% burgonyakeményítő, 1% glükóz, 0,75% húskivonat, 0,75% polipepton, 0,3% nátrium-klorid, 0,1% magnézium-szulfát-heptahidrát, 0,0007% réz(II)-szulfát-pentahidrát, 0,0001% vas (11)-szulfát-heptahid7

-7193234 rát, 0,0008% mangán (II)-klorid-tetrahidrát és 0,0002% cink-szulíát-heptahidrát. A tápközeget 100 ml-es részletekben 500 ml-es Erlenmeyer-lombikokba töltöttük, majd a tápközeget a Streptomyces hachijoensis (IMC S-0244) (ISP 5114) (FERM P-7218) (FERM BP 642) ferde tenyészetének egy oltókacsnyi mennyiségével beoltottuk. Az inkubációt 27°C hőmérsékleten, rázatás mellett, 3 napon keresztül végeztük egy törzstenyészet előállítása céljából. A törzstenyészet 10-10 ml-ét a fent leírttal azonos összetételű tápközegbe oltottuk, amelyet 1-1 literes részletekben 5 1-es Erlenmeyer-lombikokba adagoltunk. Az inkubációt 27°C-on rázatás mellett 4 napon keresztül folytattuk. Az így nyert tenyészoldatot megszűrtük a mikróbasejtek eltávolítása végett, és a kapott (3 liter) szűrlethez kis részletekben, keverés közben ammónium-szulfátot adagoltunk a 80%-os telítettség eléréséig. Az elegyet ezután 5°C hőmérsékletű hidegszobában éjszakán át állni hagytuk, majd 9000 fordulat/perc fordulatszám és 5°C hőmérséklet fenntartása mellett lecentrifugáltuk. A kivált enzimtartalmú csapadékot összegyűjtöttük és 150 ml 0,05 M foszfátpufferben feloldottuk. Ily módon egy nyers acilázenzim-oldatot kaptunk.

(b) 1 g DL-treo-N-acetil-3-(3,4-dibenzil-oxí-fenil)-szerinhez 60 ml vizet adtunk, és az így kapott vizes szuszpenzióhoz cseppenként 30%-os vizes nátrium-hidroxid-oldatot adagoltunk mindaddig, amíg a DL-szerin-vegyület feloldódása következtében víz tiszta oldatot nem kaptunk. Ehhez az oldathoz 20 ml 0,5 M 7,0 pH-jú foszfátpuffert öntöttünk, majd annyi vizet adtunk, amennyi az oldat térfogatát 90 ml-re egészítette ki. A szubsztrát szerin-vegyület ily módon előállított oldatát 10 ml fent leírt módon előállított enzimoldattal kevertük össze, majd 37°C-on 18 órára inkubáltuk az enzimatikus reakció lefolytatása céljából. A reakció lezajlása után a reakcióelegyet leszűrtük, a képződött csapadékot eltávolítottuk. Az így nyert szűrlet pH-ját sósav hozzáadásával 1-re állítottuk be, és az ennek nyomán kivált csapadékot szűrőre gyűjtöttük. Ily módon első nyeredékként 150 mg D-treo-N-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerint kaptunk. Az említett reakcióelegy szűrésekor kapott első csapadékot 0,1 n sósavoldatban melegítés közben feloldottuk. A kapott oldatot szobahőmérsékleten állni hagytuk, miáltal egy csapadék vált ki. E csapadékot a folyékony fázistól szűréssel elkülönítettük; ily módon 240 mg D-treo-N-acetil-3-(3,4-dibenzil-oxi-íenil)-szerinhez jutottunk, második nyeredék formájában. Az első és második nyeredékként kapott termék egyaránt [a]p°=-20,9° fajlagos forgatóképességet mutatott (c=l, etanolban). A D-izomer második nyeredékének (240 mg) szűréssel történt elválasztása után visszamaradt szűrletet n-butanollal extraháltuk, az n-butanolos extraktumot csökkentett nyomáson desztillálónak vetettük alá az n-butanol eltávolítása céljából. A maradékot izo8 propanolból kikristályosítva 360 mg L-treo-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerin-hidrokloridot kaptunk, amelynek fajlagos forgatóképessége [a]£”=-5,99° volt (c=l, etanolban).

(c) A fenti módon előállított D-treo-N-acetil-3-(3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerint 1:1 terfogatarányú metanol — In sósavoldat elegyében feloldottuk, és az oldatot 5 órán keresztül viszszafolyató hűtés mellett forraltuk az N-acetilcsoport eltávolítása céljából, hogy ezáltal D-treo-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerint kapjunk. Ezalatt a fentebb leírt módon kapott L-treo-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerin-hidrokloridot etanolban feloldottuk és katalitikus redukciónak (hidrogenolízis) vetettük alá az oldatot hidrogéngáz-atmoszférában, 10⁵ Pa nyomáson, szobahőmérsékleten, 10%-os palládium/csontszén katalizátor jelenlétében. A hidrogenolitikus reakció — mint a katekolos hidroxilcsoportokat védő benzilcsoportok eltávolításának szokásos módja — kivitelezésével 100%-os hozammal kaptuk meg az L-treo-3- (3,4-dihi droxi-fen il) -szerint.

2. példa (a) Az 1. példában leírttal megegyező öszszetételű tápközeget Actinomyces aureoverticillatus (IMC S-0243) (ISP 5080) (FERM P-7216) (FERM Bp-640) ferde tenyészetének egy oltókacsnyi mennyiségével beoltottuk, és a beoltott tápközeget 27°C hőmérsékleten 5 napon át inkubáltuk. Az így nyert tenyészoldatot a mikróbasejtek eltávolítása végett leszűrtük, és a kapott, az aciláz enzimet tartalmazó szűrlet 100 ml-éhez 108 mg DL-eritro-N-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerint adtunk. Az elegyet 37°C-on 18 órán keresztül inkubáltuk az enzimreakció lejátszatása céljából.

(b) A reakció végeztével a reakcióelegy pH-ját 2-re állítottuk be sósav hozzáadásával, majd n-butanollal extraháltuk. Az n-butanolos extraktumot csökkentett nyomáson desztilláltuk az n-butanol eltávolítása érdekében, s a desztillálási maradékot 7,0 pH-jú 0,05 M foszfátpufferben vettük fel. Az így kapott oldat pH-ját vizes sósavoldattal újra 2-re állítottuk be, majd etil-acetáttal kiráztuk. A kapott szerves extraktumot, amely az etil-acetátba átoldódott D-eritro-N-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerint tartalmazta, vízzel elegyítettük, és az elegy pH-ját 9-re állítottuk be vizes nátrium-hidroxid-oldat segítségével. Ekként a D-eritro-N-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerin átoldódott a vizes fázisba. A vizes fázis pH-ját ezt követően sósavval pH=l-re állítottuk, és a megsavanyított vizes oldatot etil-acetáttal ismételten kiráztuk. Az így nyert etil-acetátos extraktumot csökkentett nyomáson desztilláltuk az etil-acetát eltávolítása végett. Ily módon 34 mg D-eritro-N-acetil-3-(3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerint kaptunk.

[a]£°=-14,6° (c=l, etanolban).

(c) A fenti (b) eljárás során kapott, fentemlített desztillálási maradék sósavval pH=2-re megsavanyított oldatának etil-acetátos extrakciója után visszamaradt vizes fázist

-8193234 π-butanollal extraháltuk. Az így nyert n-butanolos extraktumot csökkentett nyomáson desztilláltuk az n-butanol eltávolítása céljából, és a desztillálási maradékot metanollal elegyítettük. Az elegyet leszűrtük az oldhatatlan anyagok eltávolítása céljából, a szűrletet a metanol eltávolítására csökkentett nyomáson desztillációnak vetettük alá. Az így kapott desztillálási maradék izopropanolból történő átkristályosítása 26 mg L-eritro-3-(3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerin-hidrokloridot eredményezett. [a]£°=+19,5° (c=l, etanolban).

Ha ezt az L-eritro-3-(3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerin-hidrokloridot az 1. (c) példában leírt módon katalitikus hidrogenolízisnek vetjük alá a hidroxilcsoportokat védő benzilcsoportok eltávolítása céljából, akkor L-eritro-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerint kapunk 100%-os hozammal.

3. példa

DL-Treo-N-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerint, DL-treo-N-klór-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-íenil) -szerint, DL-treo-N-glikolil-3-(3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerint, DL-treo-Nbenzoil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerint, DL-treo-N-acetil-3- (3,4-metilén-dioxi-fenil) -szerint, DL-treo-N-acetil-3- (3,4-dihidroxi-fenil) -szerint, vagy DL-eritro-N-ace.til-3-(3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerint oldottunk, illetve szuszpendáltunk fel 2 mg/ml koncentrációban 7,0 pH-jú 0,1 M foszfátpufferben, hogy a kiindulási DL-szerin-vegyületekből, mint az enzimreakció szubsztrátjaiból különféle törzsoldatokat készítsünk. A szubsztrát-törzsoldatok 0,5 ml-ét azonos térfogatú enzimoldattal elegyítettük, amelyet az 1. (a) példa eljárásának megfelelően állítottunk elő, s amely a Streptomyces hachijoensis mikroorganizmus aciláz enzimét tartalmazta. Az így kapott elegyet azután 37°C hőmérsékleten 17 óra időtartamra inkubáltuk az N-acilcsoport eltávolítását jelentő dezacilezési enzimreakció lejátszódásának biztosítására.

A reakció lejátszódása után a reakcióelegyet nagyteljesítményű folyadékkromatográfiás módszerrel megelemeztük. A HPLC-oszlop tölteteként „Nucleosil 5 C,₈-t alkalmaztunk; az oszlop mérete 4,6 mm x 125 mm volt.

¹⁰ Az analízis célja a dezacilezett reakciótermék hozamának meghatározása volt, amely a sztereoszelektív enzimatikus reakció folyamán, az N-acilcsoport hidrolitikus eltávolítása révén képződött. A kapott eredményeket az alábbi

1. táblázatban foglaljuk össze.

1. táblázat

Szubsztrát A dezacilezett ²θ termék hozama %-ban

DL-treo-N-acetil-3- (3,4-diben-	100
zil-oxi-fenil)-szerin
DL-treo-N-klór-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerin	100
DL-treo-N-glikoloil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerin	31
DL-treo-N-benzoil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerin	10
DL-treo-N-acetil-3- (3,4-metilén-dioxi-fenil) -szerin	68
DL-treo-N-acetil-3- (3,4-dihidroxi-fenil)-szerin	20
DL-eritro-N-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil) -szerin	81

A fenti táblázatban szereplő, a dezacilezett termék %-os hozamát kifejező számértékeket ⁴⁰ az alábbi egyenlet segítségével számítottuk ki:

A képződött dezacilezett termék mólszáma

Dezacilezett termék hozama %-ban=-------------------------x 2 x 10U a szubsztrát mólszáma

4. példa

Az 1. példában megadott összetételű táp közeget Actinomyces aureoverticillatus (IMC

S-0234) (ISP 5080) (FERM P-7216) (FERM BP-640); Streptomyces blastmyceticus (IMC S-0189) (ISP 5029) (FERM P-7217) (FERM BP-641); vagy Streptomyces hachijoensis (IMC S-0244) (ISP 5114) (FERM P-7218) (FERM BP-642) ferde tenyészeteinek egy-egy oltókacsnyi mennyiségével beoltottuk. Az inkubátumokat rázatás mellett 4 napig 27°C-on tartottuk. A kapott tenyészoldatból a mikróbasejteket kiszűrtük, és az így nyert tenyészoldat-szűrlet 0,5 ml-ét, amely az aciláz enzimet tartalmazta, 0,5 ml szubsztrátoldattal elegyítettük. Ez utóbbi 2 mg/ml koncentrációban 0,1 M 7,0 pH-jú foszfátpufferben oldva tartalmazta a DL-treo-N-acetil-3- (3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerint. Az enzim-szubsztrát elegyet 37°C hőmérsékleten 17 órán keresztül inkubáltuk az enzimreakció előidézése és lejátszatása céljából.

A reakció befejeztével a reakcióelegyet

0,1 ml 1 N sósavoldat hozzáadásával megsavanyítottuk, majd n-butanol 1 ml-es részleteivel kétszer egymás után extraháltuk. Az egye55 sített n-butanolos extraktumokat csökkentett nyomáson desztilláltuk az n-butanol eltávolítása végett. A desztillálási maradékot 0,1 M foszforsav és metanol 40:60 térfogatarányú elegyében feloldottuk, és az így kapott oldatot nagyteljesítményű folyadékkromatográfiás analízisnek vetettük alá ugyanazon „Nucleosil 5 C_I8” oszlop segítségével, mint amelyet a 3. példában alkalmaztunk. Ily módon meghatároztuk a képződött dezacilezett termék, az Lθ₅ -treo-3-(3,4-dibenzil-oxi-fenil)-szerin hozamát.

-9193234

A kapott eredményeket az alábbi 2. táblázatban tüntettük fel.

2. táblázat

Törzs	Dezacilezett termék hozama ^-ban
1	2

Actinomyces aureoverticillatus 75 (ISP 5080) (FERM BP-640)

Dezacilezett termék hozama 2í-ban=

5. példa

A 4. példa eljárását követtük, de más mikroorganizmus törzseket használtunk. Az eredményeket az alábbi 3. táblázatban foglaltuk össze.

3. táblázat

Törzs	Dezacilezett termék hozama ^-ban
Streptoverticillium hiroshi-	>30
mense (ISP 5037) (FERM BP-643)
Streptomyces toyocaensis (ISP 5030) (FERM BP-644)	>30
Actinomyces bicolor (ISP 5140)	>30
Streptomyces chartreusis (ISP 5085)	>30
Streptomyces flavopersicus (ISP 5093)	>30
Actinomyces flavotrichini (ISP 5152)	>30
Streptoverticillium griseocarneum (ISP 5004)	>30
Streptomyces halstedii (ISP 5068)	>30
Streptomyces tendae (ISP 5101)	>30

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

1) Eljárás (II) általános képletű optikailag aktív L-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin és származékok előállítására, ahol a képletben R¹ és R² jelentése hidrogénatom vagy fenil- (1 -4 szénatomos) alkil-, naftil-(1-4 szénatomos) alkilcsoport vagy

R¹ és R³ együtt (1-4 szénatomos) alkiléncsoport, továbbá optikailag aktív (III) általános képletű D-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin-származékok előállítására, ahol a képletben

R¹ és R² jelentése a fenti, és

R³ jelentése adott esetben halogénatommal vagy hidroxilcsoporttal helyettesített (1-4 szén10

2. táblázat folytatása

1_2

5 Streptomyces blastmyceticus 54 (ISP 5029) (FERM BP-641)

Streptomyces hachijoensis 92 (ISP 5114) (FERM BP-642)

10 A fenti táblázatban szereplő, a dezacjlezett termék %-os hozamát kifejező számértékeket az alábbi egyenlet segítségével számítottuk ki:

képződött dezacilezett érmék mólszáma

------------------------- x 2 x 100 szubsztrát mólszáma atomos) alkilcsoport, vagy fenil- vagy naftilcsoport,

20 azzal jellemezve, hogy valamely (I) általános képletű N-acil-DL-3-(3,4-dihidroxi-fenil)-szerin, amelynek képletében R^{* 1}, R² és R³ jelentése a tárgyi körben megadott, L-izomerjének aminocsoportjáról az N-acilcsoportot egy Actino25 myces aureoverticillatus, Actinomyces bicolor, Streptomyces blastmyceticus, Streptomyces chartreusis, Streptomyces flavopersicus, Actinomyces flavotricini, Streptoverticillium griseocarneum, Streptomyces hachijoensis, Strepto₇

30 ^myces halstedii, Streptoverticillium hiroshimense, Streptomyces tendae, Streptomyces toyocaensis fajba tartozó mikroorganizmusban lévő vagy mikroorganizmus által termelt aciláz enzimmel lehidrolizá 1 juk, majd egy ke35 letkezett (II) általános képletű L-3-(3,4-dihidroxi-fenil) -szerin-származékot, ahol a képletben R¹ és R² jelentése a tárgyi körben megadott, a dezacilezés után változatlanul visszamaradó (III) általános képletű N-acil-D-340 - (3,4-dihidroxi-fenil)-szerin-vegyülettől, ahol a képletben R', R² és R³ jelentése a tárgyi körben megadott, elkülönítjük.

2) Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (I) általános képletű vegyü45 létként olyan vegyületet alkalmazunk, amelynek képletében R¹ és R² jelentése benzilcsoport és R³ jelentése metil-, klór-metil-, hidroxi-metil- vagy fenilcsoport.

3) Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal

50 jellemezve, hogy (I) általános képletű vegyületként olyan vegyületet alkalmazunk, amelynek képletében R³ és R² együttes jelentése metiléncsoport és R³ jelentése metil-, klór-metil-, hidroxi-metil- vagy fenilcsoport.

55

4) Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (I) általános képletű vegyületként olyan vegyületet alkalmazunk, amelynek képletében R¹ és R² jelentése hidrogénatom és R³ jelentése metil-, klór-metil-, hidroxi-metil- vagy fenilcsoport.

5) Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aciláz enzimet tartalmazó vagy aciláz enzimet termelő mikroorganizmusként Actinomyces aureoverticillatus (ISP 5080), Actinomyces bicolor (ISP 5140), Streptomyces blastmyceticus (ISP 5029), Strepto-10193234 myces chartreusis (ISP 5085), Streptomyces flavopersicus (ISP 5093), Actinomyces flavotricini (ISP 5152), Streptoverticillium gríseocarneum (ISP 5004), Streptomyces hachijoetisis (ISP 5114), Streptomyces halstedii (ISP 5068), Streptoverticillium hiroshimense (ISP 5037), Streptomyces tendae (ISP 5101), és Streptomyces toyocaensis (ISP 5030) törzsbe tartozó mikroorganizmust alkalmazunk.

6) Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Actinomyces aureoverticillatust (ISP 5080) (FERM

BP-640), Streptomyces blastmyceticust (ISP

5029) (FERM Bp-641), Streptomyces hachijoensist (ISP 5037) (FERM Bp-643), Streptomyces hiroshimenset (ISP 5037) (FERM Bp5 -643), vagy Streptomyces toyocaensist (ISP

5030) (FERM Bp-644) alkalmazunk.

7) Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletű N-acil-DL-3- (3,4-dihidroxi-fenil) -szerin-vegyü10 letet és a mikroorganizmust, illetve az aciláz enzimet tartalmazó mikroorganizmus kivonatot 30—80°C hőmérsékleten, pH 5—9 értéken, 30 perc — 18 órán át reagáltatjuk.

1 lap rajz képletekkel

-11193234

Int.Cl₄ C 12 P 13/04, C 12 N 9/78 r’o , λΓΛ (DL) p?o -vjv— ch- ch-cooh

OH NH C=O

I,

R³ (I)

R¹0

F?0-#2^—CH—CH-COOH OH Ν«2 (ID

R¹0 \=y i OH r2₀-^V CH-CH—COOH

NH I

C=0

L

R³ (III)

R³COOH (IV)

Kiadja: Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Himer Zoltán osztályvezető •N° 4247. Nyomdaipari vállalat, Uzsgorod