HU181009B

HU181009B - Process for preparing angiotensin-ii analogues with antagonictic activity containing in position 1 sarcosyl,hydroxyacetyl or l-alpha-aminoxy-propionyl group and in positiona 8 esteric group

Info

Publication number: HU181009B
Application number: HU8080101A
Authority: HU
Inventors: Olga Nyeki; Lajos Kisfaludy; Egon Karpati; Laszlo Szporny
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1980-01-18
Filing date: 1980-01-18
Publication date: 1983-05-30
Also published as: NO155100B; ES8205754A1; PH16791A; ATE13740T1; YU9281A; JPS56138155A; FI72732C; NO155100C; IL61923A; US4388304A; PL126240B1; EP0034259B1; CA1156222A; AU6627781A; FI810122L; IN153212B; NO810150L; ES498582A0; DE3170906D1; EP0034259A1

Description

Nyéki Olga okleveles vegyész 25%, dr. Kisfaludy Lajos okleveles vegyészmérnök 25%, dr. Kárpáti Egon orvos 30%, dr. Szporny László orvos 20%, Budapest

Szabadalmas:

Richter Gedeon Vegyészeti Gyár Rt., Budapest

Eljárás az 1-helyzetben szarkozit, hidroxiacetil- vagy L-ű-aminooxi-propionil-csoportot és a 8-helyzetben észtercsoportot tartalmazó antagonista hatású angiotenzin-II analógok előállítására

A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű új angiotenzin-Π antagonista hatású peptideknek

X-Arg-Val-Tyr—ile—His-Pro-Y—OA (I)

- e képletben

X szarkozil-, hidroxiacetil- vagy L-a-aminooxi-propionil-csoportot

Y L-izoleucil-, L-treonil-, L-O-metil-treonil- vagy L-alanil- csoportot,

A 1—5 szénatomos alkilcsoportot képvisel, az aszimmetrikus szénatomot tartalmazó aminosavak rövidítései minden esetben L-aminosavat jelentenek - valamint az e vegyületeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítményeknek az előállítására.

Az első angiotenzin-II analógot, mely mind in vitro, mind in vivő körülmények között az angiotenzin-II specifikus kompetitív inhibitoraként viselkedett, 1980-ben írták le [G. R. Marshal és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci USA 67, 1624 (1970); P. A. Khairallah és munkatársai: J. Med. Chem. 13 181 (1970)]. E megfigyelés széles körű kutatást indított el oly antagonista hatású angiotenzin-II analógok előállítására, melyek alkalmasak lehetnek a különböző eredetű hipertenziók diagnosztizálására és adott esetben terápiás kezelésére is. Az előállított számos analóg közül a (Sár¹, Alá⁸ )-angiotenzin-II Saralasin néven már forgalomba is került [D. T. Pals és munkatársai: Circ. Rés. 29, 673 (1971)]. Az e vegyülettel végzett klinikai tanulmányok során kiderült, hogy e vegyület valóban alkalmas a különböző ere₅ detű hipertenziók diagnosztizálására [G. Bönner és munkatársai: Dtsch. Med. Wschr. 104 432 (1979)], illetőleg kezelésére [J. L. Marx: Science 194, 821 (1976)]. Megállapították, továbbá, hogy a renovaszkuláris hipertenzió következményeként fellépő szívq elégtelenség kezelésére is alkalmasak az angiotenzin-II antagonisták [H. Gavras és munkatársai: JAMA 238 880 (1977)].

Az eddig előállított angiotenzin-II analógok szer5 kezete és biológiai hatása közti összefüggések tanulmányozása számos információt szolgáltatott az agonista és antagonista hatás értelmezésére. A jelenlegi kutatások homlokterébe oly antagonisták előállítása áll, melyek hosszabb biológiai felezési idővel bírnak 0 és mentesek oly mellékhatásoktól, mint például a kezdeti agonista hatás.

Azt találtuk, hogy ha az angiotenzin-Π molekulájában a 8-helyzetű fenilalanint különféle más alifás aminosavakkal helyettesítjük, miközben az 1-hely5 zetbe szarkozint, hidroxiecetsavat vagy L-a-aminooxi-propionsavat építünk be, továbbá a molekula C-terminális karboxil-csoportját valamely 1-5 szénatomszámú alkilcsoporttal észterezzük, oly angiotenzin-II kompetitív inhibitorokhoz jutunk, melyek je₀ lent ős mértékben csökkentik a mesterségesen előidé

-1181009 ett magas vérnyomást és ezt a hatást szubkután dásmód mellett is megtartják.

A találmány értelmében a fenti meghatározásnak negfelelő

X—Arg—Val—Tyr—He—His—Pro—Y—OA (I) általános képletü vegyületeket oly módon állítjuk elő, hogy valamely (II) általános képletü védett oktapeptid-származékról B—X’—Arg(C)—Val—Tyr(D)—Ile—His(E)— -Pro-Y-OA (II) ahol

B valamely az X’ helyén álló aminosav aminocsoportjának átmeneti védésére alkalmas, acidolízissel vagy katalitikus hidrogenolízissel eltávolítható csoportot, előnyösen benziloxikarbonil- vagy t-butiloxikarbonil-csoportot,

C az Arg guanidinocsoportjának átmeneti védésére alkalmas csoportot, előnyösen nitro- vagy tozilcsoportot,

D a Tyr aromás hidroxilcsoportjának átmeneti védésére alkalmas csoportot, előnyösen benzilvagy szubsztituált benzilcsoportot,

E a His imidazol csoportjának átmeneti védésére alkalmas csoportot, előnyösen dinitrofenilcsoportot,

X’ szarkozil-, aminooxi-acetil- vagy L-a-aminooxi propionil-csoportot képvisel,

A és Y jelentése a fent megadott -, a védőcsoportokat szelektíven vagy egyszerre eltávolítjuk.

A szintézishez felhasznált (II) általános képletü oktapeptid-származékot bármely, a peptidkémiában használatos módszerrel, például a 168 431 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett eljárás alkalmazásával, állíthatjuk elő. Az eljárásban az oldalfunkciós csoportok védésére olyan védőcsoportokat kell használni, melyek az N-védőcsoportnak a kapcsolás utáni eltávolításakor alkalmazott acidolízis körülményei közt stabilak.

A találmány szerinti eljárás egyik előnyös kiviteli módja szerint a (II) általános képletü védett oktapeptid-származékokat a lépésenként! felépítés elve alapján állítjuk elő. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy egy nagyobb, megfelelően védett peptiddel egy kisebb pepiidet, illetve aminosavat acilezünk. Utóbbi elvet követtük például az 1-helyzetben a-aminooxisavat tartalmazó peptid szintézisénél. Mindkét felépítési elv esetében az egyes aminosav-származékok NH₂-csoportjának átmeneti védésére acidolízissel könnyen eltávolítható védőcsoportot, például t-butiloxi-karbonil-csoportot használunk, majd a többi védőcsoportot - a dinitrofenil-csoport tiolízissel történő eltávolítása után - egy lépésben, folyékony hidrogénfluoriddal vagy katalitikus hidrogénezéssel távolítjuk el.

Az (I) általános képletü vegyületeket önmagukban ismert módszerekkel, célszerűen karboximetil -cellulózos ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk. Ennek során a vegyületeket liofilezett porok alakjában kapjuk, melyek alkalmasak különböző gyógyszerkiszerelési formák előállítására.

Az (I) általános képletü vegyületek antagonista hatását altatott hím macskákon vizsgáltuk. A vizsgálatok úgy történtek, hogy mindkét oldali vagus-átmetszés és ganglionblokkolás után Hypertensin (CIBA) infúziót adtunk (0,5 Mg/kg/perc), majd az

1. táblázat

A 8-helyzetben észtercsoportot tartalmazó angiotenzin-II analógok hatása a vérnyomásra

Analógok	i. V.	s. c. fiz.só	s. c. CMC	s. c. zselatin
n	%
	d	P	P	n	%	P	d	n	%	P	d	n	%	P
(Sár¹, Ile-OMe⁸)-Ang-II	20	8	21	25	50	5	8	180	50	3	9	Φ	100	8	5	15
	40	7	20	38	100	5	25	240	100	10	17	200	200	5	23	300
(Sár¹, Alá—OMe⁸ )-Ang-II	10	6	18	12	50	7	20	45	50	6	11	22
	20	9	29	60	100	8	20	45	100	7	18	22
(Sár*, Thr(Me)-OMe⁸)-
-Ang-II (HOAA¹, Ile—OMe⁸)- Ang-II	20	7	12	12	100	5	27	45
20	4	27	42	100	4	16	30
Saralasin	10	5	32	15	100	6	29	60	100	5	23	45	200	4	23	Φ
					200	55	24	45	200	7	28	90

n = dózis Mg/kg; n = a kísérletek száma; p = perc.

-2181009 emelkedett vérnyomás stabilizálódása után adtuk a vizsgálandó anyagokat intravénásán vagy szubkután, vizes fiziológiás, illetve vivőanyagot tartalmazó oldatban. A vérnyomásesést Hgmm-ben értékeltük a kezelés előtti érték %-ában, A statisztikai értékelés Student-féle egymintás „t” teszttel történt a vérnyomás különbségekből. A hatástartam az utolsó még szignifikáns vérnyomásesésig eltelő (p = 5%) időtartamot jelenti. Az eredményeket az alábbi 1. táblázatban foglaltuk össze.

A táblázat adataiból látható, hogy az (I) általános képletű angiotenzín-II antagonisták reprezentánsai jelentős vérnyomáscsökkentő hatással bírnak, amiből arra következtethetünk, hogy a C-terminális karboxilcsoport töltése nem feltétlenül szükséges a hatás kifejtéséhez. A hatás mértéke szubkután adagolási mód mellett is jelentős és vivőanyagokat tartalmazó oldatokban a hatás időtartama egyes esetekben a több órát is eléri.

Gyógyászatilag felhasználható komplexen a találmány szerinti eljárással készített peptidek oly vegyületei értendők, amelyek bizonyos szerves vagy szervetlen anyagok hozzáadására keletkeznek és a peptideknek elnyújtott hatást biztosítanak. Erre alkalmas szerves vegyületek lehetnek bizonyos zselatinok, karboximetil-cellulózok, alginsav-észterek, polifloretinfoszfátok, aminosav-polimerek és -kopolimerek stb. A szervetlen vegyületek közül bizonyos kétvegyértékű fémek, mint például a cink hidroxidja és nehezen oldódó sói, például foszfátjai jöhetnek számításba.

A találmány szerinti peptideket, valamint ezek sóit és komplexeit a szokásos gyógyszerkészítmények formájában használhatjuk fel a gyógyászatban. Az ilyen gyógyszerkészítmények a találmány szerinti vegyületeket enterális vagy parenterális beadásra alkalmas szervetlen vagy szerves vivőanyag kíséretében tartalmazzák. A gyógyszerkészítmények lehetnek szilárd liofilizátumok is, amikor is vivőanyagként a peptidekkel nem reagáló anyagok, például szénhidrátok jöhetnek tekintetbe, lehetnek továbbá híg vagy tömény szuszpenziók vagy emulziók, amelyek különböző tartósító és stabilizáló segédanyagokat is tartalmazhatnak.

A gyógyszerkészítmények felhasználhatók a különböző eredetű hipertenziós állapotok differenciált diagnosztizálására, továbbá terápiásán is, renális eredetű magas vérnyomás normalizálására, hipertenzív krízisek, szekunder szívelégtelenség és más, hipertenzióval járó kóros állapotok gyógykezelésére.

A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik.

A példákban alkalmazott rövidítések a szakirodalomban elfogadott rövidítéseknek felelnek meg [J. Bioi. Chem. 247 977 (1972)]. További rövidítések: HOAA a hidroxiecetsavnak, OGly az aminooxi-ecetsavnak, OAla pedig az α-aminooxi-propionsavnak az oxigénatomon illetőleg az amino-nitrogénatomon és a karbonilcsoporton keresztül kapcsolódó acilcsoportját jelenti; Pfp = pentafluorfenil.

A vegyületek előállítása során a bepárlásokat mindig Büchi-féle Rotavapor készülékben végeztük. Az olvadáspont-meghatározások Dr. Tottoli-féle (Büchi) készülékben történtek. A vékonyréteg-kromatogram mokat Stahl szerinti készített Kieselgel-6 (Merek) márkanevű szilikagél rétegen készítettük. A kromatogrammok kifejlesztésére a következő oldószerelegyeket használtuk:

(1) Etilacetát : PAW = 98 :2 (2) Etilacetát : PAW = 95 :5 (3) Etilacetát : PAW = 90 : 10 (4) Etilacetát : PAW = 80 : 20 (5) Etilacetát : PAW = 70 : 30 (6) Etilacetát ; PAW = 60 : 40 (7) n-Butanol: ecetsav : víz = 4 : 1 : 5 (8) n-Butanol: ecetsav : piridin : víz = 30 :6 :20 : 24 (9) n-Butanol: etilacetát: ecetsav : víz = 1 :1 :1 :1 (10) Etilacetát : PAW = 75 : 25

PAW = piridin : ecetsav : víz = 20 : 6 : 11

A vékonyréteg-kromatogrammok előhívása egyrészt ninhidrinnel, másrészt a klór-tolidin-KJ módszerrel történt.

A végtermékek tisztítására az alábbi általános módszert alkalmaztuk:

0,5 g szabad peptidet 4 ml 0,01 mólos ammónium-acetát pufferben oldunk és az oldatot 0,5 liter karboximetil-cellulóz (CMC-52) oszlopra iétegezzük, amelyet előzőleg a fenti pufferrel egyensúlyba hoztunk. Gradiens keverő vei 1,5 liter 0,01 mólos és

1,5 liter 0,4 mólos ammónium-acetát-oldatokat összekeverve 4,5 és 6,5 közötti pH-gradiens-elúciót alkalmazunk. Az áramlási sebesség 25 ml/óra; 10 ml térfogatú frakciókat fogunk fel. Az oszlopról lejövő eluátumot LKB Uvicord-II segítségével folyamatosan regisztráljuk, majd a kapott görbe alapján a főfrakciót Leybold-Hereus liofilező berendezésbe liofilezzük. Szükség esetén a terméket ugyancsak gradiens elúció segítségével rekromatografáljuk.

1. példa (Szarkozin¹, izoleucin-metilészter⁸)-angiotenzin-II előállítása

1. lépés

Boc-Arg(NO₂ )-Val-Tyr(Bzl)-He- His(Dnp)-Pro-Ile-OMe

1,36 g (7,5 mmól) Ile-OMe · HC1 30 ml kloroformmal készített oldatához 1,05 ml trietil-amint és

1,90 g (5 mmól) Boc-Pro-OPfp-t adunk. Az oldatot a pH-érték állandó szinten tartása mellett 30 percig állni hagyjuk, majd vízzel, azután 10%-os citromsavoldattal, végül ismét vízzel kirázzuk, szárítjuk és szárazra pároljuk. A maradékként kapott védett dipeptidet [Rp^ =0,8] elkülönítés nélkül 5 ml 8 n dioxános sósav-oldatban oldjuk, 15 perc múlva 20 ml vízmentes étert adunk hozzá, majd bepároljuk. A maradékként kapott szabad dipeptid-hidrokloridot [Rp) = 0,46] azonnal oldjuk 30 ml kloroformban, az oldat pH-értékét trietil-aminnal 8-ra állítjuk be, majd

4,36 g (7,5 mmól) Boc— His(Dnp)—OPfp-t adunk hozzá. Az oldatot a pH-érték állandó szinten tartásával 1 óra hosszat állni hagyjuk, majd 0,83 ml

-3181009

Ν,Ν-dimetilamino-etil-amint adunk hozzá, 10 percig állni hagyjuk, majd nátrium-kloriddal telített 10%-os citromsav-oldattal, azután n-sósav-oldattal, 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, végül vízzel kirázzuk, szárítjuk és szárazra pároljuk. A maradékként kapott védett tripeptidet = 0,45] izolálás nélkül oldjuk 10 ml 8 n dioxános sósavoldatban, az oldatot 15 percig állni hagyjuk, majd vízmentes éter hozzáadásával leválasztjuk a szabad tripeptid-hidrokloridot, leszűrjük és mossuk. Az így kapott szabad tripeptid-hidrokloridot [R^⁵^=0,30] azonnal oldjuk 15 ml dimetil-formamidban, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 2,4 g (6 mmól) Boc-üe-OPfp-t adunk hozzá. Az oldatot állandó pH-érték fenntartása mellett 30 percig állni hagyjuk, azután az oldószert eltávolítjuk, a maradékot etil-acetátben oldjuk, az oldatot 10%-os vizes citromsav-oldattal, n-sósavoldattal, végül vízzel kirázzuk, szárítjuk és bepároljuk. A maradékot éter és n-hexán 1 :9 arányú elegyével eldörzsöljük és leszűrjük. Az így kapott védett tetrapeptidet [Rp) = 0,31] 7 ml 8 n dioxános sósav-oldatban oldjuk, az oldatot 15 percig állni hagyjuk, majd vízmentes éter hozzáadásával leválasztjuk a terméket és leszűrjük. Az így kapott szabad tetrapeptid-hidrokloridot [Rp¹ = 0,38] 20 ml kloroform és 10 ml dimetil-formamid elegyében oldjuk, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be, és 2,96 g (5,5 mmól) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp-t adunk hozzá. Az oldatát állandó pH-értéken tartva 15 percig állni hagyjuk, majd az oldószert elpárologtatjuk, majd a maradékot etil-acetátban oldjuk és 0,22 ml Ν,Ν-dimetilamino etil-amint adunk hozzá. Az elegyet 10 percig állni hagyjuk, majd 10%-os vizes citromsav-oldattal, n-sósav-oldattal, végül vízzel ki rázzuk, szárítjuk és bepároljuk. A maradékot vízmentes éterrel eldörzsöljük és leszűrjük. Az így kapott védett pentapeptidet [RP^{) =} 0,52] 10 ml 8 n dioxános sósavoldatban oldjuk, az oldatot 15 percig állni hagyjuk, majd a terméket vízmentes éter hozzáadásával leválasztjuk, leszűrjük és mossuk. A kapott szabad pentapeptid hidrokloridot [R^^s)=o,8] azonnal feloldjuk 20 ml dimetil-formamidban, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 2,3 g (6 mmól) Boc-Val—OPfp-t adunk hozzá. Az oldatot állandó pH-értéken tartva egy óra hosszat állni hagyjuk, majd az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot kloroformban oldjuk, ezt az oldatot 10%-os vizes citromsav-oldattal, n-sósavoldattal, végül vízzel kirázzuk, szárítjuk és bepároljuk. A maradékot vízmentes éterrel eldörzsöljük és leszűrjük; az így kapott védett hexapeptidet [R^²-* =0,43] azonnal oldjuk 8 n dioxános sósav-oldatban és az oldatot 15 percig állni hagyjuk, majd a terméket vízmentes éter hozzáadásával leválasztjuk, leszűrjük és mossuk. A kapott szabad hexapeptid-hidrokloridot azonnal oldjuk 15 ml dimetilformamidban, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 2,6 g (6 mmól) Boc-Arg(NO₂ )-OPfp-t adunk hozzá. Az oldatot állandó pH-érték fenntartása mellett 30 percig állni hagyjuk, majd 45 ml kloroformot adunk hozzá, az elegyet n-sósav-oldattal, majd vízzel kirázzuk, szárítjuk és bepároljuk. A maradékot etil-acetáttal eldörzsöljük és leszűrjük. Ily módon 3,3 g védett heptapeptidet [R^³⁾ = 0,37] kapunk (a Boc-Pro-OPfp-re számított elméleti hozam 51%-a, ami 90% lépésenként! termelési hányadnak felel meg).

2. lépés

Z-Sar-Arg(NO₂ )-Val-Tyr(Bzl)-Ile—His(Dnp)-Pro—Ile—OMe

3,3 g (2,5 mmól) Boc-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)-De-His(Dnp)-Pro-Ile-OMe 15 ml 8 n dioxános sósav-oldattal készített oldatát 20 percig állni hagyjuk, majd vízmentes étert adunk hozzá, a levált terméket leszűrjük és mossuk; az így kapott szabad heptapeptid-hidrokloridot [R^⁵) = 0,7] azonnal oldjuk 15 ml dimetil-formamidban, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 2,4 g (6 mmól) Z-Sar-OPfp-t adunk hozzá. Az oldatot állandó pH-érték fenntartása mellett 30 percig állni hagyjuk, majd 45 ml kloroformot adunk hozzá, az elegyet n-sósav-oldattal, majd vízzel kirázzuk, szárítjuk és bepároljuk. A maradékot etanollal eldörzsöljük és leszűrjük. Ily módon 3,17 g védett oktapeptidet [Rj⁴⁾ = 0,82] kapunk (az elméleti hozam 89%-a); op.: 197—209 °C.

3. lépés

A védőcsoportok eltávolítása

2,59 g (1,83 mmól) Z-Sar-Arg(NO₂)—Val-Tyr(Bzl)-Ile—His(Dnp)-Pro-Ile-OMe 5 ml dimetil-formamiddal készített oldatához 4,6 ml 2-merkapto-etanolt adunk, az elegyet 1,5 óra hoszszat keveijük, majd vízmentes éter hozzáadásával a terméket leválasztjuk és leszűrjük. Dy módon 2,0 g védett, de dinitro-fenil-csoportot már nem tartalmazó oktapeptidet [R£⁴⁾ =0,42] kapunk (az elméleti hozam 87%-a). A kapott védett oktapeptidet 40 ml 5:1:1 arányú metanol-ecetsav-víz elegyben oldjuk, az oldathoz 1,0 g 10%-os palládiumos aktívszén-katalizátort adunk és élénk keverés közben 20 óra hosszat hidrogéngázt buborékoltatunk át az oldaton. A reakció befejeztével a katalizátort kiszűrjük, a fenti oldószereleggyel mossuk, majd a mosófolyadékkal egyesített szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot vizes etanollal többször utánapároljuk, majd vízmentes éterrel kezeljük, leszűrjük és megszárítjuk. Ily módon 1,56 g szabad oktapeptid-metilésztert (az elméleti hozam 98%-a) kapunk.

4. lépés

A fenti módon kapott nyers szabad oktapeptidmetilésztert a leírásnak a példák előtti részében ismertetett általános módszerrel tisztítjuk. Az így kapott (szarkozin¹-, izoleucin-metilészter⁸)-Angiotenzin-II jellemzői: R^⁷^ =0,19; R^⁸^=0,59; R|’> = = 0,38;E_Giu (pH = 1,9): 1,00.

Aminosav-analízis: Pro 1,07 (1); Val 1,1 (1); Tyr 0,8 (1); His 1,03 (1); Arg 1,0 (1); De 1,87 (2); Sár 1,0 (1).

2. példa

Hidroxiecetsav¹, izoleucin-metilészter⁸ )-angiotenzin-II

1. lépés

Z-OGly—Arg(NO₂ )-Val-Tyr(Bzl)-Ile— -His(Dnp)-Pro-Ile-OMe

1,5 g (0,8 mmól) Boc-Arg(N0₂)-Val-Tyr(Bzl)-De-His(Dnp)-Pro-Ile—OMe — előállítva az 1. példa 1. lépése szerint — 6 ml 8 n dioxános sósav-oldattal készített oldatát 20 percig állni hagyjuk, majd vízmentes éter hozzáadásával leválasztjuk a kapott terméket. Az így kapott szabad heptapeptid-hidrokloridot [R^^s)=0,7] mosás után azonnal oldjuk 10 ml dimetil-formamidban, az oldat pH-értékét trietil-aminnal 8-ra állítjuk be és 0,46 g (1,17 mmól) Z-OGly-OPfp-t adunk hozzá. Az elegyet 30 percig állni hagyjuk, majd 30 ml kloroformot adunk hozzá, 10%-os vizes citromsav-oldattal, majd n-sósav-oldattal, végül vízzel kirázzuk, szárítjuk és bepároljuk. A maradékot éténél eldörzsöljük és leszűrjük. Ily módon 1,05 g védett oktapeptidet [Rp> =0,24] kapunk (az elméleti hozam 93%-a); OP.: 140-145 °C.

2. lépés

A védőcsoportok eltávolítása

1,05 g (0,74 mmól) Z-OGly-Arg(NO₂ )-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His (Dnp)-Pro-Ile-OMe 5 ml dimetil-formamiddal készített oldatához 2,3 ml 2-merkapto-etanolt adunk. Az elegyet 1,5 óra hosszat állni hagyjuk, majd vízmentes éter hozzáadásával leválasztjuk a terméket, leszűrjük és mossuk. Ily módon 0,85 g védett, de dinitro-fenil-csoportot már nem tartalmazó oktapeptidet [R|⁴^ = 0,40] kapunk (az elméleti hozam 85%-a). 0,75 g (0,6 mmól) fenti módon kapott védett oktapeptidet 20 ml 5:1:1 arányú metarol-ecetsav-víz elegyben oldunk, az oldathoz 0,8 g 10%-os palládiumos aktívszén-katalizátort adunk és élénk keverés közben 18 óra hosszat hidrogéngázt buborékoltatunk át az oldaton. A reakció befejeztével a katalizátort kiszűrjük, a fenti oldószereleggyel mossuk, majd a mosófolyadékkal egyesített szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot vizes etanollal többször utánapároljuk, majd vízmentes éténél kezeljük, leszűrjük és megszárítjuk. Ily módon 0,48 g szabad oktapeptid-metilésztert kapunk (az elméleti hozam 82%>-a).

3. lépés

A fenti módon kapott nyers oktapeptid-metilésztert a fentebb leírt általános módszerrel tisztítjuk; a kapott termék jellemzői: Rp'=0,29; R^⁸%0,72; Rp> = 0,60; Eciu(pH = 1,9): 0,60; Aminosav-analízis: Pro 1,0 (1); Val 1,0 (1); Ile (1,7 (2); Tyr 0,88 (1); His 1,02 (1); Arg 9,96 (1).

3. példa (L-a-aminooxipropionsav¹, izoleucin-metilészter*)-angiotenzin-II előállítása

1. lépés

Boc—Arg(Tos)—Val—Tyr(Bzl)—Ile-His(Dnp)-Pro-OBzL

2,9 g (12 mmól) Pro—OBzl · HC1 50 ml kloroformmal készített oldatához 1,68 ml trietil-amint és

5,87 g (10 mmól) Boc-His(Dnp)—OPfp-t adunk. Az oldatot a pH-érték állandó szinten tartása mellett egy óra hosszat keverjük, majd 25 ml 10%-os vizes citromsav-oldattal, n-sósav-oldattal, azután 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, végül vízzel kirázzuk, szárítjuk és bepároljuk. A maradékot n-hexánnal eldörzsöljük és leszűrjük. Az így kapott védett dipeptidet [Rp³=O,8O] 13 ml 8 n dioxános sósav•oldatban oldjuk, az oldatot 15 percig állni hagyjuk, majd vízmentes éter hozzáadásával leválasztjuk a terméket. A kapott, leszűrt és mosott szabad dipeptid-hidrokloridot [Rp^ =0,24] azonnal oldjuk 30 ml dimetil-formamidban, az oldat pH-értékét trietil-aminnal 8-ra állítjuk be és 4,7 g (12 mmól) Boc-He—OPfp-t adunk hozzá. Az oldatot állandó pH-értéken tartva egy óra hosszat állni hagyjuk, majd az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot kloroformban oldjuk, az oldatot 10%-os vizes citromsav-oldattal, azután n-sósavoldattal, majd 5%-os nátriumhidrogén· -karbonát-oldattal, végül vízzel kirázzuk, szárítjuk és bepároljuk. A maradékot éter és n-hexán 1 :2 arányú elegyével eldörzsöljük és leszűrjük. Az így kapott védett tripeptidet [Rp³=O,82] 15 ml 8 n dioxános sósav-oldatban oldjuk, az oldatot 15 percig állni hagyjuk, majd vízmentes éter hozzáadásával leválasztjuk a terméket. A leszűrés és mosás után kapott szabad tripeptid-hidrokloridot [Rp^=0,38] azonnal oldjuk 50 ml dimetil-formamidban, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 5,9 g (11 mól) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp-t adunk hozzá. Az oldatot állandó pH-érték fenntartása mellett 30 percig állni hagyjuk, majd az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot etilacetátban oldjuk és 0,22 ml N,N-dimetilamino-etil-amint adunk az oldathoz. Az elegyet 15 percig állni hagyjuk, majd 10%-os vizes citromsav-oldattal, azután n-sósav-oldattal, végül vízzel kirázzuk, szárítjuk és bepároljuk. A kapott maradékot éterrel eldörzsöljük és leszűrjük. Az így kapott védett tetrapeptidet [Rp^J = 0,73] azonnal oldjuk 20 ml 8 n dioxános sósavoldatban, az oldatot 15 percig állni hagyjuk, majd vízmentes éter hozzáadásával leválasztjuk a terméket, szűrjük, és mossuk. Az így kapott szabad tetrapeptid-hidrokloridot [Rp%0,69] azonnal oldjuk 50 ml dimetil-formamidban, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 4,2 g (11 mól) Boc—Val—OPfp-t adunk hozzá. Az oldatot a fenti pH-érték fenntartásával egy óra hosszat állni hagyjuk, majd az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot etil-acetátban oldjuk és az oldatot a szokásos módon kirázzuk, szárítjuk és bepároljuk. A maradékot n-hexánnal, majd vízmentes éterrel kezeljük és leszűrjük. Az így kapott védett pentapeptidet [RP³ = 0,65] 20 ml 8 n dioxános sósavoldatban oldjuk és az oldatot 15 percig állni hagyjuk, majd vízmentes étert adunk hozzá, a levált terméket leszűrjük és mossuk. Az így kapott szabad pentapeptid-hidrokloridot [Rp%0,57] azonnal oldjuk 60 ml dimetil-formamidban, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 5,94 g (10 mmól) Boc—

-5181009

-Arg(TOs)—OPfp-t adunk hozzá. Az oldatot a fenti pH-érték fenntartásával egy óra hosszat állni hagyjuk, majd az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot kloroformban oldjuk, az oldatot 10%-os vizes citromsav-oldattal, n-sósavoldattal, majd 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, végül vízzel kirázzuk, szárítjuk és bepároljuk. A maradékot vízmentes éterrel eldörzsöljük és leszűrjük. Ily módon 5,8 g Boc—Arg(T os)—Val—T yr(Bzl)—He—His(Dnp)— -Pro-OBzl védett hexapeptid-észtert [R}³^ = 0,63] kapunk (a His-re számított elméleti hozam 42%-a, ami 84%-os lépésenkénti termelési hányadnak felel meg); op.: 167-174 °C.

2. lépés

Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-De-His-Pro—OH

2,8 g (2,1 mmól) védett hexapeptidet (3. példa,

1. lépés) 8 ml dimetil-formamidban oldunk, hozzáadunk 2,9 ml 2-merkapto-etanolt és egy órai keverés után vízmentes éterrel kicsapjuk a dinitrofenil-csoporttól mentes terméket [Rp' = 0,17]. Ezt szuszpendáljuk 30 ml dioxánban és 12 ml n-nátrium-hidroxid-oldatot adunk hozzá. Egy óra múlva az oldat kitisztul, ekkor az oldat pH-értékét n-sósawal 7-re állítjuk és a dioxánt ledesztilláljuk. A maradék vizes oldat pH-értékét 3-ra állítjuk és a kívánt csapadékot 60 ml 2:3 arányú dimetil-formamid-kloroform elegyében oldjuk, a szerves oldatot a vizes résztől elválasztjuk, majd a szerves oldószereket ledesztilláljuk. Termelés: 2,3 g (96%) hexapeptid; Rí^s> =0,37; op.: 160-164 °C (bomlik).

3. lépés

Boc—Arg(Tos)—Val—Tyr(Bzl)—Ile— —His-Pro-Ile-OMe

1,25 g (1,1 mmól) hexapeptidet (3. példa, 2. lépés) 15 ml dimetil-formamidban oldunk, hozzáadunk 0,5 ml (3,6 mmól) trietil-amint és 0,65 g (3,6 mmól) Ile-OMe-hidrokloridot, valamint diciklohexil-karbodiimid és pentafluor-fenol 1,35 g (2 mmól) 1:3 arányú kristályos komplexét. A pH-érték tartása mellett 24 óra múlva újabb fenti mennyiségű komplexet és Ile-OMe-hidrokloridot adunk hozzá; újabb 24 óra múlva a reakcióelegyet 45 ml kloroformmal hígítjuk és kirázzuk kétszer 20 ml 10%-os citromsav, 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, végül vízzel. Szárítás és bepárlás után a védett heptapeptid-észtert [Rp^o) = 0,26] száraz éter hozzáadásával leválasztjuk. A terméket 20 ml etanolban forrón oldjuk, majd hűtés után szűrjük. Termelés 0,95 g (65%) Boc-Arg(Tos)-Val—Tyr(Bzl)—De—His—Pro—De—OMe védett heptapeptid-észter.

4. lépés

Boc- L—Ο A1 a-Arg(T os)-Val-T yr(Bzl)—

- D e-His-Pro-Ile-OMe

0,95 g (0,75 mmól) védett heptapeptid-észtert (3. példa, 3. lépés) 3 ml 8 n dioxános sósav-oldatban oldunk, majd 15 perc múlva vízmentes éterrel ki6 csapjuk, leszűrjük, és mossuk a szabad heptapeptid-észter-hidrokloridot [R|^s^=0,24]. Ezt azonnal oldjuk 10 ml dimetil-formamidban, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 0,5 g (1,1 mmól) Boc-OAla—OPfp-t adunk hozzá. Az oldat pH-értékének tartása mellett egy óra múlva 30 ml kloroformot adunk hozzá és 10%-os citromsav-oldattal, majd vízzel kirázzuk. Szárítás és bepárlás után a védett oktapeptid-észtert éterrel eldörzsöljük és leszűrjük. Dy módon 0,83 g Boc-L-OAla-Arg(Tos)-Val—Tyr(Bzl)-De-His—Pro- De—OMe védett oktapeptid-észtert (87%) kaounk; op.^- 143—146 °C, (bomlik); R|⁴⁾ = 0,34.

5. lépés

A védőcsoportok eltávolítása

0,75 g (0,57 mmól) védett oktapeptidet (3. példa, 4. lépés 0,5 ml tioanizolt tartalmazó 2 ml cseppfolyós hidrogén-fluoridban oldunk. A reakcióelegyet 1,5 óráig 0 °C-on tartjuk, majd a szabad oktapeptidet vízmentes éter hozzáadásával leválasztjuk. Ezt a terméket 30 ml metanolban oldjuk és vízmentes éterrel újból kicsapjuk. Dy módon 0,5 g (89%) nyers szabad oktapeptid-észtert kapunk.

6; lépés

A szabad oktapeptid-észtert az általános részben leírt módon tisztítjuk. Az így kapott L-a-aminooxipropionsav¹, izoleucin-metilészter⁸/-angiotenzin-II végtermék jellemzői: Rp> =0,30; Rp^ =0,68; Rp) =0,46. Aminosav-analízis: Pro 1,0 (1); Val 1,05 (1); Ile 2,0 (2); Tvr 0,73 (1); His 0,85 (1); Arg 0,97 (1).

4. példa (Szarkozin¹ ,treonin(Me)-metilészter⁸ )angiotenzin-II előállítása

1. lépés

Z-Sar-Arg(NO₂ )-Val-Tyr(Bzl)-ne-His(Dnp)—Pro—Thr(Me)—ÖMe

0,68 g (4,5 mmól) Thi(Me)-OMe 10 ml kloroformmal készített oldatához 2,28 g (6 mmól) Boc-Pro-OPfp-t adunk. Az oldat pH-értékét 8-on tartva 30 percig állni hagyjuk, majd az oldószert ledesztilláljuk, a maradékot etil-acetátban oldjuk és 0,22 ml Ν,Ν-dimetilamino-etil-amint adunk hozzá. 15 perc múlva kirázzuk nátriumkloriddal telített 10%-os vizes citromsav-oldattal, majd n-sósav-oldattal, végül vízzel. Szárítás és bepárlás után a védett dipeptidet [R^²⁾=0,76] izolálás nélkül oldjuk 3 ml 8 n dioxános sósavoldatban és 15 perc múlva vízmentes éterrel hígítjuk és bepároljuk. A maradékként kapott szabad dipeptid-hidrokloridot [Rp)=0,18] azonnal oldjuk 10 ml dimetil-formamidban, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és

-613

2,95 g (5 mmól) Boc—His(Dnp)—OPfp-t adunk hozzá. Az oldat pH-értékének tartása mellett 30 percig állni hagyjuk, majd az oldószert ledesztilláljuk és a maradékot etilacetátban oldjuk, 0,11 ml N,N-dimetilamino-etil-amint adunk hozzá, majd 10 perc múlva nátriumkloriddal telített vizes 10%-os citromsavoldattal, majd vízzel kirázzuk. Szárítás és bepárlás után nyert védett tripeptidet [Rp>=0,47] azonnal oldjuk 5 ml 8 n dioxános sósavoldatban, 15 perc elteltével a szabad tripeptid hidrokloridot [Rf =0,3] vízmentes éterrel leválasztjuk, szűrjük és mossuk. A terméket azonnal oldjuk 10 ml dimetil-formamidban, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 2,0 g (5 mmól) Boc—He—OPfp-t adunk hozzá. Az oldatot a fenti pH-érték fenntartása mellett 30 percig állni hagyjuk, majd az oldószert ledesztilláljuk, a maradékot etil-acetátban oldjuk és a szokásos módon kirázzuk. Az oldat szárítása és bepárlása után a védett tetrapeptidet [Rp)=0,28] éter és n-hexán = 3 : 7 elegyével el dörzsöljük és leszűrjük. A terméket azonnal oldjuk 7 ml 8 n dioxános sósavoldatban, majd 15 perc elteltével a szabad tetrapeptid-hidrokloridot vízmentes éténél kicsapjuk, szűrjük és mossuk [Rp) =0,27]. Ezt a terméket 10 ml dimetil•formamidban oldjuk, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 2,7 g (5 mmól) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp-t adunk hozzá. Az oldatot a fenti pH-érték fenntartása mellett 30 percig állni hagyjuk, majd az oldószert ledesztilláljuk, a maradékot etil-acetátban oldjuk, 0,11 ml Ν,Ν-dimetilamino-etil-amint adunk hozzá és 15 perc múlva nátriumkloriddal telített vizes 10%-os citromsav-oldattal, majd vízzel kirázzuk. Szárítás és bepárlás után a védett pentapeptidet [R^²⁾ = 0,51] vízmentes éterrel eldörzsöljük, leszűrjük, majd 5 ml 8 n dioxános sósavoldatban oldjuk és 15 perc múlva vízmentes éter hozzáadásával kicsapjuk a szabad pentapeptid-hidrokloridot [Rp' = 0,48], szűrjük, mossuk és oldjuk 20 ml dimetil-formamidban. Az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 1,9 g (5 mmól) Boc-Val-OPfp-t advmk hozzá. Az oldatot a fenti pH-érték fenntrrtásávcl 3Ö percig állni hagyjuk, majd az oldószert ledesztilláljuk, a maradékot kloroformban oldjuk és a szokásos módon kirázzuk. Szárítás és bepárlás után a védett hexapeptidet [R|²^=0,44] vízmentes éterrel kezelve izoláljuk, majd oldjuk 10 ml 8 n dioxános sósavoldatban és 15 perc elteltével a szabad hexapeptid-hidrokloridot [R)⁴^ = 0,36] vízmentes éterrel kicsapjuk, szűrjük és mossuk. Azonnal oldjuk 15 ml dimetil-formamidban az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és

2,25 g (5 mmól) Boc-Arg(N0₂ )-OPfp-t adunk hozzá. Az oldatot a fenti pH-érték fenntartása mellett egy óra hosszat állni hagyjuk, majd 45 ml kloroformmal hígítjuk és a szokásos módon kirázzuk. Szárítás és bepárlás után etanollal kezelve kapjuk a védett heptapeptid-észtert. Termelés: 3,3 g (Thr-ra számítva 56%, ami 91 %-os lépésenként i termelésnek felel meg); op.: 188-193 °C; R<³⁾=0,38; Rp) = 0,87. A védett heptapeptidből 1,95 g-ot (1,5 mmól) 10 ml 8 n dioxános sósavoldatban oldunk és 20 perc múlva a szabad heptapeptid-hidrokloridot [R£⁴) = 0,20] vízmentes éterrel kicsapjuk, szűrjük, mossuk és 15 ml dimetil-formamidban oldjuk. Az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk, majd 0,87 g (2,25 mmól) Z-Sar-OPfp-t adunk hozzá. Az oldatot pH-értékének tartása mellett egy óra hosszat állni hagyjuk, majd 45 ml kloroformmal hígítjuk, vizes 10%-os citromsav-oldattal, n-sósavoldattal, végül vízzel kirázzuk, szárítjuk és bepároljuk. A maradék⁵ ként kapott védett oktapeptid-észtert etanollal eldolgozva szüljük és mossuk. Termelés 1,85 g (87%); op.: 202-208 °C; Rp° =0,20; R^⁴⁾ =0,86.

2. lépés 0

A védőcsoportok eltávolítása

1,85 g (1,4 mmól) védett oktapeptid-észtert (4. példa, 1. lépés) 8 ml dimetil-formamidban oldunk és ⁵ 2,6 ml 2-merkapto-etanolt adunk hozzá. Az oldatot egy óráig keverjük, majd vízmentes száraz éter hozzáadásával kicsapjuk a dinitrofenil-csoporttól mentes védett oktapeptidet [1,6 g; R|⁴⁾=0,52], leszűrjük, mossuk, majd 30 ml 5:1:1 arányú metanol-ecet0 sav-víz elegyében oldjuk és 1,0 g 10%-os palládiumos aktívszén-katalizátort adunk hozzá. Ezután az oldaton 30 órán keresztül, intenzív keverés mellett hidrogéngázt buborékoltatunk át, majd a reakció befejeztével a katalizátort kiszűrjük, a fenti oldószer 5 eleggyel mossuk, és a mosófolyadékkal egyesített szűrletet szárazra pároljuk. A szabad oktapeptid-észtert éter és etanol 2 : 1 arányú elegyével kezelve izoláljuk. Termelés: 0,98 g (83%).

Ό

3. lépés:

A nyers szabad oktapeptid észtert az általános részben megadott módon tisztítjuk. A kapott 5 [szarkozin¹, treonin(Me)-metilészter ]-angiotenzin-II végtermék jellemzői: r£⁶⁾=0,29; Rj-⁸⁾=0,55;

R)⁹⁾ =0,27;

Amínosav-analízis: His 1,03 (1); Arg 9,95 (1); Thr 0,93 (1); Pro 1,03 (1); Val 1,15 (1); He 1,03 (1); 0 Tyr 0,90(1); Sár 1,0(1).

5. példa [Hidroxiecetsav¹, treonin(Me)-metilészter⁸ ]-angiotenzin-II

1. lépés

Z-OGly-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)—Pro- Thr(Me)—OMe

0,62 g (0,47 mmól) Boc-Arg(NO₂ )-Val-Tyr(Bzl)-Ile—His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe-t (4. 5 példa, 1. lépés) 4 ml 8 n dioxános sósavoldatban oldunk, 15 perc múlva vízmentes éterrel kicsapjuk a szabad heptapeptid · HCl-t [R^^s^=0,35] szüljük, mossuk és azonnal oldjuk 10 ml dimetil-formamidban. Az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk és 0,8 g (2 3 mmól) Z-OGly-OPfp-t adunk hozzá. Egy ór? múlva - a pH-érték tartása mellett — az oldatot 30 ml kloroformmal hígítjuk és kirázzuk 10%-os vizes citromsav-oldattal, majd n-sósavoldattal, végül vízzel. Szárítás és bepárlás után a védett oktapeptid5 -észtert éter és etanol = 9:1 arányú elegyével ke7

-715 zelve izoláljuk. Termelés: 0,60 g védett oktapeptid-észter (az elméleti hozam 90%-a); op.: 158-162 °C; Rp> = 0,44.

2. lépés 5

A védőcsoportok eltávolítása

0,6 g (0,42 mmól) védett oktapeptid-észtert (5. példa, 1. lépés) 2 ml dimetil-formamidban oldjuk,¹⁰

1,2 ml 2-merkapto-etanolt adunk hozzá és egy óra múlva vízmentes éterrel kicsapjuk a dinitro-fenil-csoporttól mentes oktapeptid-észtert. Ezt azután metanolban oldjuk, derítjük, majd szárazra pároljuk és éterrel dolgozva izoláljuk [0,46 g; R}⁴⁾=O,16;¹⁵R^⁵^ =0,52]. Újra oldjuk 25 ml 5 : 1 : 1 arányú metanol-ecetsav-víz elegyében, 0,3 g 10%-os palládiumos aktívszén-katalizátort adunk hozzá és 17 órán keresztül intenzív keverés közben hidrogéngázt buborékoltatunk át az elegyen. A reakció befejeztével 20 a katalizátort kiszűrjük, a fenti oldószereleggyel mossuk, és a mosó folyadékkal egyesített szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot víz-etanol eleggyel többször utána pároljuk, majd a szabad oktapeptid észtert éterrel eldörzsöljük és leszűrjük. Termelés: 25 0,32 g (91%).

3. lépés

A szabad oktapeptid-észter tisztítását az általános részben megadott módon végezzük. R^⁷⁾ = 0,22; Rp> = 0,73; R<⁹> = 0,56. Aminosav-analizis: Thr 0,92 (1); Pro 1,03 (1); Val 1,0 (1); Tyr 0,7 (1); His 1,0 (1); Arg 1,0 (1). 35

6. példa (Hidroxiecetsav¹ .treonin-metilészter⁸ > -angiotenzin-II ⁴⁰

1. lépés

Boc—Arg(NO₂)—Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr-OMe 45

3,8 g (20 mmól) Thr-OMe · hidrokloridot 50 ml kloroformban oldunk, 2,8 ml (20 mmól) trietilamint és 3,8 g (10 mmól) Boc-Pro-OPfp-t adunk hozzá. A pH-érték tartása mellett egy óra múlva az oldatot 50 kirázzuk 10%-os vizes citromsavoldattal, n-sósavoldattal, végül vízzel. Szárítás és bepárlás után a kapott védett dipeptid-észtert [R|³⁾ = 0,77] 20 ml 8 n dioxános sósavoldatban oldjuk és 15 perc múlva a szabad dipeptid-hidrokíoridot vízmentes éterrel ki- 55 csapjuk, szűrjük, mossuk [R^^s)=0,2]. Ezt a terméket azonnal oldjuk 30 ml kloroformban, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 4,7 g (8 mmól) Boc-His(Dnp)-OPfp-t adunk hozzá. Az oldat pH-értékének tartása mellett egy óra múlva az olda- 60 tót kirázzuk 10%-os vizes citromsavoldattal, majd n-sósavoldattal, azután 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, végül vízzel. Szárítás és bepárlás után a védett tripeptid-észtert [Rp> = 0,47] oldjuk 20 ml 8 n dioxános sósavoldatban és 15 perc múlva víz- 65 mentes éterrel kicsapjuk a szabad tripeptid-észter-hidrokloridot [R^⁵^ =0,23], amit azonnal oldunk 20 ml 5:1 arányú kloroform-dimetílformamid elegyében, a pH-értéket 8-ra állítjuk és 4,0 g (10 mmól) Boc-Ile-OPfp-t adunk hozzá. Az oldat pH-értékének tartása mellett 30 perc állás után kirázzuk 10%-os vizes citromsavoldattal, majd 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, végül vízzel. Szárítás és bepárlás után az aktív észter feleslegét többszöri n-hexános kezeléssel eltávolítjuk. A kapott védett tetrapeptidet [R|³⁾ = 0,45] 15 ml 8 n dioxános sósavoldatban oldjuk, majd 15 perc elteltével a szabad tetrapeptid-észter-hidrokloridot vízmentes éter hozzáadásával leválasztjuk [R^ =0,25]. Ezt a terméket azonnal oldjuk 30 ml dimetil-formamidban, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 2,05 g (3,8 mmól) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp-t adunk hozzá. Az óidat pH-értékének tartása mellett 30 perc múlva az oldatot bepároljuk, a maradékot etil-acetátban oldjuk, 0,11 ml Ν,Ν-dimetilamino-etil-amint adunk hozzá, majd 15 perc múlva a szokásos módon kirázzuk. Szárítás és bepárlás után a kapott védett pentapeptidet [r£³> =0,57] vízmentes éterrel eldörzsöljük és leszűrjük, majd 10 ml 8 n dioxános sósavoldatban oldjuk és 15 perc múlva a szabad pentapeptid-észterhidrokloridot vízmentes éterrel kicsapjuk, szüljük és mossuk [R|^s) =0,27]. Ezt a terméket azonnal oldjuk 20 ml dimetil-formamidban, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 1,75 g (4,5 mmól) Boc-Val-OPfp-t adunk hozzá. A pH-érték tartása mellett egy óra múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot kloroformban oldjuk és a szokásos módon kirázzuk. Szárítás és bepárlás után az olajos maradékot éterrel szilárdítjuk, szűrjük és mossuk. A kapott védett hexapeptidet [R^³⁾ =0,55] 8 ml 8 n dioxános sósavoldatban oldjuk és 15 perc múlva a szabad hexapeptid-észter-hidrokloridot vízmentes éterrel kicsapjuk, szűrjük és mossuk [R^^s)=0,23]. Azonnal oldjuk 20 ml dimetilformamidban, a pH-értéket 8-ra állítjuk be és 1,8 g (4 mmól) Boc-Arg(NO₂)—OPfp-t adunk hozzá. A pH-érték tartása mellett egy óra múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot kloroformban oldjuk és a szokásos módon kirázzuk. Szárítás és bepárlás után a maradékot éter és etanol 9 : 1 arányú elegyével eldörzsölve szűrjük és mossuk. Termelés: 2,7 g védett heptapeptid-észter (a His-re számított elméleti hozam 26%-a, ami 80%-os lépésenkénti termelésnek felel meg); op.: 190— -195 °C (bomlik); Rp°=0,47.

2. lépés

Z-OGly-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro—Thr-OMe

1,7 g (1,4 mmól) védett heptapeptidet (6. példa,

1. lépés) 10 ml 8n dioxános sósavoldatban oldunk, 15 perc múlva a szabad heptapeptid-észter-hidrokloridot [Rj⁵) =0,21] vízmentes éter hozzáadásával kicsapjuk és azonnal oldjuk 20 ml dimetilformamidban, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 0,82 g (2,1 mmól) Z—OGly—OPfp-t adunk hozzá. A pH-érték tartása mellett 30 perc múlva az oldatot 40 ml kloroformmal hígítjuk, majd n-sósavoldattal és vízzel kirázzuk. Szárítás és bepárlás után a védett oktapeptidésztert [R|⁴⁾ =0,48] száraz éteres kezeléssel izoláljuk. Termelés 1,6 g (87%); op.: 188-194 °C.

3. lépés

A védőcsoportok eltávolítása

1,6 g (1,2 mmól) védett oktapeptidet (6. példa,

2. lépés) 5 ml dimetil-formamidban oldunk, 3,8 ml

2-merkapto-etanolt adunk hozzá, majd egy óra elteltével vízmentes éterrel leválasztjuk a dinitro-fenil-csoporttól mentes oktapeptidet, amelyet metanol-éteres átcsapással tisztítunk. Termelés: 1,3 g (94%); R|⁴⁾ = 0,35; Rp> = 0,72. Ezt oldjuk 50 ml 5 : 1 : 1 arányú metanol-ecetsav-víz elegyében, 0,6 g 10%-os palládiumos aktívszén-katalizátort adunk hozzá és intenzív keverés közben 17 óra hosszat hidrogéngázt buborékoltatunk át az oldaton. A reakció befejeztével a katalizátort kiszűrjük a fenti oldószereleggyel mossuk, majd a mosófolyadékkal egyesített szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot etanol-víz eleggyel többször bepároljuk és végül a maradékként kapott szabad oktapeptid-észtert éterrel eldolgozva szűrjük és mossuk. Termelés: 0,64 g (92%).

4. lépés

A nyers szabad oktapeptid-észter tisztítását az általános részben leírt módon végezzük. R^⁷⁾ = 0,22; R|⁸⁾ = 0,73; R<⁹⁾ = 0,56.

Aminosav-analízis: Thr 0,92 (1); Pro 1,03 (1); Val 1,0 (1); Ile 1,05 (1); Tyr 0,7 (1); His 1,0 (1); Arg 1,0 (1).

7. példa (Szarkozin¹, alanin-metilészter⁸-angiotenzin-II előállítása

1. lépés

Z-Sar-Arg(NO₂)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ala—OMe

0,7 g (5 mmól) Ala-OMe-hidrokloridot 20 ml kloroformban oldunk 0,7 ml trietilamint és 1,14 g (3 mmól) Boc-Pro-OPfp-t adunk hozzá. A pH-érték tartása mellett 30 perc múlva az oldatot 10%-os vizes citromsavoldattal, n-sósavoldattal, végül vízzel kirázzuk. A szárítás és bepárlás után a kapott védett dipeptidet [R^ =0,61] izolálás nélkül oldjuk 5 ml 8 n dioxános sósavoldatban, majd 10 perc múlva vízmentes éterrel hígítjuk és bepároljuk. A szabad dipeptid-hidrokloridot [Rp%0,32] 20 ml kloroformban oldjuk, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 2,7 g (4,5 mmól) Boc-His(Dnp)-OPfp-t adunk hozzá. Az oldat pH-értékének tartása mellett egy óra múlva hozzáadunk 0,33 ml dimetilamino-etil-amint, majd 15 perc múlva kirázzuk 10%-os vizes citromsavoldattal, n-sósavoldattal, 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, végül vízzel. A szárítás és bepárlás után kapott védett tripeptidet [R^²^ =0,27] 10 ml 8 n dioxános sósavol datban oldjuk, majd 15 perc múlva a szabad tripeptid-hidrokloridot [Rf⁵^ = 0,48] vízmentes éterrel kicsapjuk, szűtjük és mossuk. A terméket azonnal oldjuk 30 ml 2:1 arányú kloroform-dimetilformamid elegyében, az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és

2,4 g (6 mmól) Boc—Ile—OPfp-t adunk hozzá. Az oldat pH-értékének tartása mellett 30 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot etilacetátban oldjuk és a szokásos módon kirázzuk. Szárítás és bepárlás után a védett tetrapeptidet ]R)²^ = 0,29] éter és n-hexán 1 :9 arányú elegyével eldolgozva izoláljuk, majd 10 ml 8 n dioxános sósavoldatban oldjuk. 10 perc múlva a szabad tetrapeptid-hidrokloridot [Rp) = 0,67] vízmentes éterrel kicsapjuk, mossuk és azonnal oldjuk 30 ml 2:1 arányú kloroform-dimetilformamid elegyében. Az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 1,78 g (3,3 mmól) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp-t adunk hozzá. Az oldat pH-értékének tartása mellett 15 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot etilacetátban oldjuk és a szokásos módon kirázzuk. A védett pentapeptidet [R^²) = 0,33] vízmentes éteres kezeléssel izoláljuk, majd 10 ml 8 n dioxános sósavoldatban oldjuk és a szabad pentapeptid-hidrokloridot [R^⁴^ = 0,35] vízmentes éterrel kicsapjuk, szűrjük és azonnal oldjuk 20 ml dimetil-formamidban. Az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 1,55 g (4 mmól) Boc-Val-Opfp-t adunk hozzá. Az oldat pH-értékének tartása mellett 30 perc múlva az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot kloroformban oldjuk és a szokásos módon kirázzuk. Szárítás és bepárlás után a kapott védett hexapeptidet [R|²⁾=0,35] vízmentes éterrel eldolgozva izoláljuk. Ezután 8 ml 8 n dioxános sósavoldatban oldjuk és 20 perc múlva a szabad hexapeptid-hidrokloridot [R|^s'=0,75] vízmentes éterrel kicsapjuk, szűrjük, mossuk és azonnal oldjuk 20 ml dimetil-formamidban. Az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 2,64 g (6 mmól) Boc-ArgíNOj )-OPfp-t adunk hozzá. Az oldat pH-értékének tartása mellett egy óra múlva a reakcióelegyet 60 ml kloroformmal hígítjuk, n-sósavoldattal, majd vízzel kirázzuk, szárítjuk és bepároljuk. A kapott védett heptapeptidet 1:3 arányú etanol-éter elegyével eldolgozzuk, szűrjük és mossuk [R^⁴⁾ =0,85]. A terméket 10 ml S n dioxános sósavoldatban oldjuk, majd a szabad heptapeptid-hidrokloridot [R^⁴ -0,15] vízmentes éter hozzáadásával kicsapjuk, szüljük, mossuk és azonnal oldjuk 20 ml dimetil-formamidban. Az oldat pH-értékét 8-ra állítjuk be és 1,27 g (3,3 mmól) Z-Sar-OPfp-t adunk hozzá. Az oldat pH-értékének tartása mellett 15 perc múlva 60 ml kloroformmal hígítjuk és a szokásos módon kirázzuk. Szárítás és bepárlás után a kapott védett oktapeptidet 25 ml etanollal eldolgozva szüljük és mossuk. így 1,37 g (Pro-ra számított elméleti hozam 33%-a, ami lépésenként 86%-os termelésnek felel meg) védett oktapeptidésztert kapunk; op.: 192-196 °C; [R^⁴⁾ = 0,70],

2. lépés

A védőcsoportok eltávolítása

1,37 g (1 mmól) védett oktapeptid-észtert (7. példa, 1. lépés) 3 ml dimetil-formamidban oldunk,

-9181009

1,9 ml 2-merkapto-etanolt adunk hozzá és egy óra múlva a dinitro-fenil-csoporttól mentes pepiidet [l,2g = 99%; R|⁴⁾=0,20] vízmentes éterrel kicsapjuk, szűrjük és mossuk, majd 20 ml 5 : 1 :1 arányú metanol-ecetsav-víz elegyében oldjuk. Az oldathoz 5 0,6 g 10%-os palládiumos aktívszén-katalizátort adunk és intenzív keverés mellett 20 óra hosszat hidrogéngázt buborékol tatunk az oldaton keresztül. A reakció befejeztével a katalizátort kiszűtjük, a fenti oldószereleggyel mossuk és a mosófolyadékkal 10 egyesített oldatot szárazra pároljuk, majd etanol-víz eleggyel többször újra bepároljuk. A kapott szabad oktapeptid-észtert etanol és éter 1 : 1 arányú elegyével eldolgozva izoláljuk. Termelés 0,7 g (75%).

3. lépés

A nyers oktapeptid-észtert az általános részben leírt módon tisztítjuk; R|^?) = O,23; R|⁸⁾ = 0,54; R|⁹⁾ = 0,27. 20

Aminosav-analízis: His 0,97 (1); Arg 1,03 (1); Pro 1,06 (1): Val 1,03 (1); lle 0,98 (1); Tyr 0,6 (1); Sár 1,0 (1).

Szabadalmi igénypontok:

Claims

Szabadalmi igénypontok:

1. Eljárás az (I) általános képletü új angiotenzin-11 antagonista hatású peptideknek 30

X-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Y-OA (I)

- e képletben

X szarkozil-, hidroxiacetil- vagy L-a-aminooxi-pro- 35 pionil-csoportot,

Y L-izoleucfl-, L-treonil-, L-Ö-metil-treonil- vagy

L-alanil-csoportot,

A 1-5 szénatomos alkilcsoportot képvisel, az aszimmetrikus szénatomot tartalmazó aminosavak 40 rövidítései minden esetben L-aminosavat jelentenek — előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely (II) általános képletü védett oktapeptid-származékról -

B-X’~Arg(C)-Val-Tyr(D)-Ile-His(E)—Pro—Y-OA (II) ahol

B valamely az X’ helyén álló aminosav aminocsoportjának átmeneti védésére alkalmas, acidolízissel vagy katalitikus hidrogenolízissel eltávolítható csoportot, előnyösen benziloxikarbonil- vagy t-butiloxikarbonil-csoportot,

C az Arg guanidinocsoportjának átmeneti védésére alkalmas csoportot, előnyösen nitro- vagy tozilcsoportot

D a Tyr aromás hidroxilcsoportjának átmeneti védésére alkalmas csoportot, előnyösen benzilvagy szubsztituált benzÜcsoportot,

E a His imidazol csoportjának átmeneti védésére alkalmas csoportot, előnyösen dinitrofenilcsoportot,

X’ szarkozil-, aminooxi-acetil- vagy L-a-aminooxi-propionil-csoportot képvisel,

A és Y jelentése a fent megadott a védőcsoportokat szelektíven vagy egyszerre eltávolítjuk.
2. Eljárás antihipertenzin hatású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként valamely az 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletü peptidet - ahol X, Y és A jelentése megegyezik az 1. igénypontban adott meghatározás szerintivel - valamely, a hatóanyaggal szemben indifferens szilárd vagy folyékony gyógyszerészeti vivőanyaggal és/vagy segédanyaggal keverünk össze és a keveréket enterális vagy parenterális beadásra alkalmas készítménnyé alakítjuk.

A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója

84.4265 - Zrínyi Nyomda, Budapest