Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych, -antagonizujaco wzgledem angiotensyny-IIdzialajacychestrów osmiopeptydu o ogólnym wzorze X-Arg-Val-Tyr-Ile-His- -Pro-Y-OA, w którym X oznacza grupe acylowa N-metylo- aminokwasów, zwlaszcza grupe sarkozylowa, albo grupe acylowa alifatycznego kwasu karboksylowego, zawiera¬ jacego w polozeniu-a grupe aminoksylowa lub hydroksylowa, Y oznacza reszte alifatycznego aminokwasu, a A oznacza grupe alkilowa o 1—5 atomach wegla, oraz soli addycyj¬ nych z kwasami i kompleksów tych peptydów. Omówione zwiazki sa cennymi substancjami czynnymi preparatów farmaceutycznych.Pierwszy analog angiotensyny-II, który zarówno in Aritro, jak i in vivo dzialal jako specyficzny srodek hamujac)' kompetycyjnie angiotensyne-II, zostal opisany w roku 1970 ;[porównaj: G.R. Marshal i wspólpracownicy, Proc. Nat.Acad. Sci. USA, 67, (1970); P.A. Khairallah i wspólpraco¬ wnicy, J. Med. Chem. 13, 181 (1970)].Ta obserwacja byla bodzcem do rozszerzonych dalszycli prac badawczych, które doprowadzily do wytworzenia licz¬ nych dalszych, takich antagonizujaco wzgledem angioten- ^yny-H dzialajacych analogów; produkty takie stwarzaly mozliwosc diagnozowania i ewentualnie tez terapeutycznego leczenia pewnych nadcisnien uwarunkowanych renina.Sposród na tej drodze wytworzonych, licznych antagoni¬ zujaco dzialajacych zwiazków (Sar1, Ala8)-angktensyna-II zostala juz wprowadzona do stosowania pod nazwa Safa- lasin fD.T. Pals i wspólpracownicy: Circ. Res. 29, 673 (1971)}; produkt ten w toku badan klinicznych okazal sie byc odpowiednim do diagnozowania [G. Bónner i wspólprac 10 15 20 25 30 2 cownicy: Dtsch. Med. Wschr. 104, 432 (1979)] lub do terapeutycznego leczenia [IX. Marx: Science 194, 821 (1976)] nadcisnien róznego pochodzenia.Niedawno stwierdzono, ze te wzgledem angiotensyny-II antagonistyczne srodki sa odpowiednie równiez do leczenia niewydolnosci serca, wystepujacej jako nastepstwo nad¬ cisnienia naczyn nerkowych [H. Gavras i wspólpracownicy: jama 238, 880 (1977)].Badanie zaleznosci miedzy struktura a dzialaniem bio¬ logicznym tych dotychczas wytworzonych analogów angiotensyny-II dostarczylo takze pozytecznych informacji dla wyjasnienia dzialan agonistycznych i antagonistycznych.Na pierwszy plan obecnych badan wysuwa sie wytwarzanie takich srodków antagonistycznych, które wykazuja dluzsze biologiczne okresy póltrwania i brak niepozadanych dzialan ubocznych, takich jak poczatkowe dzialanie agonistyczne po zaaplikowaniu; Stwierdzono, ze skuteczne kompetencyjne inhibitory angiotensyny-II mozna wytwarzac wtedy, gdy fenyloalanine w rJolozeniu-8 czasteczki angiotensyny-II wymieni sie na alifatyczny aminokwas, zas N-metyloaminokwas albo kwas a-hydroksy- lub a-aminoksykarboksylowy wbuduje sie w polozenie-1 tej czasteczki, a nadto C-krancowa grupe karboksylowa tej czasteczki zestryfikuje sie grupa alkilowa o I—5 atomach wegla. Na tej drodze otrzymane komrib- tycyjne inhibitory angiotensyny-II redukuja w powazriyrn stopniu nadcisnienie wywolane angiotensyna II i moga to dzialanie wykazywac takze w przypadku aplikowania pod¬ skórnego.Nowe zwiazki o ogólnym wzorze X-Arg-Val-Tyr-Ile 126 240126 240 3 -His-Pro-Y-OA, w którym Y, X i A maja wyzej podane znaczenia, wytwarza sie sposobem, polegajacym wedlug -wynalazku na tym, ze od zabezpieczonej pochodnej osmio- peptydu o ogólnym wzorze B-X-Arg(C)-Val-Tyr(D)-Ile , -His(E)-Pro-Y-OA,w którym B oznacza grupe odszczepialna na drodze hydrolizy kwasowej lub hydrogenolizy katalitycznej, f zwlaszcza grupe benzyloksykarbonylowa lub Ill-rz. butylo- -* ksykarbonylowa, CUoznacza zabezpieczajaca grupe odpo¬ wiednia do przejsciowego zabezpieczenia grupy guanidy- nowej skladnika Arg, zwlaszcza grupe nitrowa lub p-tolu- enosulfonowa, D oznacza zabezpieczajaca grupe odpowiednia do przejsciowego zabezpieczenia aromatycznej grupy hy¬ droksylowej skladnika Tyr, zwlaszcza grupe benzylowa lub podstawiona grupe benzylowa, E oznacza zabezpiecza¬ jaca grupe odpowiednia do przejsciowego zabezpieczenia grupy imidazolu skladnika His, zwlaszcza grupe dwu- nitrofenylowa, a A, X i Y maja znaczenia podane przy omawianiu wzoru nowych zwiazków, selektywnie odszczepia sie etapami lub w jednym etapie grupy zabezpieczajace i otrzymany zwiazek ewentualnie przeprowadza sie w sól addycyjna z kwasem lub w pochodna kompleksowa.W wyzej omówionym sposobie wedlug wynalazku sto¬ sowane jako substrat pochodne osmiopeptydu mozna wy¬ twarzac dowolnymi, w chemii peptydów znanymi metodami np. metoda omówiona w wegierskim opisie patentowym nr 168 431 na drodze acylowania estrów aminokwasów za pomoca pieciofluorofenylowych estrów zabezpieczonego na N-krancowej grupie aminowej aminokwasu lub peptydu.Przy tym do zabezpieczania bocznych grup funkcyjnych nalezy stosowac takie grupy zabezpieczajace, które sa sta¬ bilne w warunkach hydrolizy kwasowej, przeprowadzanej w celu usuniecia grup N-zabezpieczajacych po acylowaniu.Wedlug korzystnej postaci wykonania tego sposobu zabezpieczone pochodne osmiopeptydu syntetyzuje sie etapami z poszczególnych aminokwasów. Mozna tez jednak postepowac w ten sposób, ze juz wytworzona, odpowiednio zabezpieczona czesc peptydu od razu acyluje sie druga, równiez juz wytworzona czescia peptydu. Te droge poste¬ powania mozna korzystnie stosowac np. w przypadku wy¬ twarzania peptydów, zawierajacych w polozeniu-1 grupe a-aminokwasu.W celu przejsciowego zabezpieczenia grup aminowych poszczególnych aminokwasów lub pochodnych aminokwasów nalezy w obu drogach postepowania stosowac takie grupy zabezpieczajace, które nastepnie mozna latwo usunac droga hydrolizy kwasowej; do tego celu korzystnie stosuje sie zwlaszcza grupe II-rz.-butyloksykarbonylowa.Po zakonczeniu syntezy zabezpieczonego estru osmio¬ peptydu odszczepia sie nastepnie wedlug wynalazku grupy zabezpieczajace z tego zabezpieczonego estru osmiopeptydu.Przy tym celowo postepuje sie tak, zeby najpierw odszczepic dwunitrofenylowe grupy zabezpieczajace skladnika His na drodze tiolizy, a mianowicie celowo na drodze trakto¬ wania 2-merkaptoetanolem; pozostale obecne grupy za¬ bezpieczajace mozna nastepnie usuwac korzystnie w jednym etapie, a mianowicie na drodze hydrolizy kwasowej, celowo za pomoca kwasu fluorowodorowego, albo na drodze hy¬ drogenolizy katalitycznej, np. wobec stosowania jako katalizatora palladu na nosniku z wegla aktywnego.Jezeli jednak w nowych wytwarzanych zwiazkach zamiast grupy X ma byc alifatyczna grupa acylowa, zawierajaca grupe a-aminoksylowa, to wówczas grupy zabezpieczajace odpowiedniego, zabezpieczonego estru osmiopeptydu o ogólnym wzorze 2 mozna usuwac tylko na drodze hydrolizy kwasowej, np. na drodze traktowania kwasem fluorowo¬ dorowym uwolnionego od grup dwunitrofenylowych,, zabezpieczonego estru osmiopeptydu, gdyz w przypadka katalitycznego uwodornienia tez stojaca zamiast rodnika X grupa a-aminoksyacylowa równoczesnie przeksztalcilaby 5 sie w odpowiednia grupe o-hydroksyacylowa wobec od- szczepienia grupy aminowej.W przeciwienstwie do tego nowe zwiazki, zawierajace- zamiast rodnika X alifatyczna grupe c-hydroksyacylowa, mozna wytwarzac z odpowiednich, lecz zamiast rodnika io X grupe a-aminoksyacylowa zawierajacych, zabezpieczo¬ nych estrów osmiopeptydu, przy czym grupy zabezpiecza¬ jace usuwa sie na drodze katalitycznego uwodornienia z rów¬ noczesnym odszczepieniem grupy aminowej od rodnika X.Nowe zwiazki mozna oczyszczac znanymi metodami, 15 np. na drodze chromatografii jonowymiennej na karbo- ksymetylocelulozie. Produkty te celowo wytwarza sie wposta¬ ci liofilizowanych proszków, które wówczas swietnie na¬ daja sie do sporzadzania rozmaitych preparatów farma¬ ceutycznych. 20 Antagonistyczne dzialanie tych produktów zbadana na uspionych meskich osobnikach kotów. Podczas badan prze¬ cieto nerwy bledne u zwierzat po obu stronach szyi a po zablokowaniu zwojów aplikowano zwierzetom Hyper- tensin'e (firmy Ciba) droga irifuzji z szybkoscia 0,5 //g/kg/min. 25 Po ustabilizowaniu sie podwyzszonego cisnienia tetniczego krwi, dozylnie lub podskórnie podawano badany zwiazek: w fizjologicznym roztworze soli kuchennej lub w roztworze zawierajacym nosnik. Nastepnie zachodzace obnizenie cisnienia tetniczego krwi reejestrowano w mm Hg, w pro- 30 centach poczatkowej wartosci cisnienia tetniczego krwi^ zmierzonej przed zaaplikowaniem.Statystyczna ocene wyników pomiaru prowadzono na podstawie jednowzorowego ,,t" testu studenta.Jako okres dzialania poszczególnych substancji czynnych 35 traktowano czas, który uplynal do momentu ostatniego^ jeszcze wyraznego obnizenia cisnienia tetniczego krwi (p=5%). Tak otrzymane wyniki doswiadczalne zestawiono* w podanej tablicy.Jako porównawcza substancje czynna w tych próbach 40 stosowano znana i jako antagonistyczny srodek wzgledem angiotensyny-II juz w leczeniu wprowadzona Saralasin'e^ czyli (Sar, Ala8)-angiotensyne-II, przy czym w tych sa¬ mych warunkach za pomoca Saralasin'y otrzymane wyniki zestawiono równiez w podanej tablicy. 45 Z danych zawartych w tablicy wynika, ze nowe zwiazki wykazuja silne dzialania obnizajace cisnienie tetnicze krwi, co jest oznaka tego, ze ladunek C-krancowej grupy karbo¬ ksylowej nie jest niezbednym warunkiem istnienia tego dzia¬ lania. Rozmiar tego dzialania jest wazki takze w przypadku 50 podskórnego zaaplikowania tych substancji czynnych; w roztworach, zawierajacych nosniki, osiaga sie w licznych przypadkach okres trwania tego dzialania rzedu kilku- godzin.Wytworzone sposobem wedlug wynalazku nowe peptydy 55 mozna ewentualnie znanymi metodami przeprowadzac^ w farmakologicznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasami lub kompleksy.Pod pojeciem farmakologicznie dopuszczalnych komplek¬ sów nalezy rozumiec takie zwiazki tych peptydów, które 60 powstaja przez dodanie pewnych zwiazków organicznych lub nieorganicznych do tych peptydów i nadaja tym sub¬ stancjom czynnym dzialanie przedluzone.Jako przyklady do tego celu odpowiednich zwiazków organicznych mozna wspomniec m.in. zelatyny, karboksy— $5 mctylocelulozy, estry kwasu alginowego, polifluoroetyno-*126 240 5 6 Tablica Dzialanie na cisnienie tetnicze krwi analogów angiotensyny-II, zawierajacych w polozeniu-8 grupe estrowa aminokwasu 1 Substancja czynna (Sar1, Ile-OMe8)-Ang-II (Sar1, Ala-OMe8)-Ang-II (Sar1, Thr(Me)-OMe8)- j -Ang-II (HOAA1, Ile-OMe8)- J -Ang-II 1 Saralasin Dozylnie D 20 40 10 20 20 20 10 n 8 7 6 9 7 4 5 % 21 20 18 29 12 27 32 m 25 38 12 60 12 42 15 PodskórnieNaCl D 50 100 50 100 100 100 100 200 n 5 5 7 8 5 4 6 5 % 8 25 20 20 27 16 29 24 m 180 240 45 45 45 30 60 45 Podskórnie CMC D 50 100 50 100 100 200 n 3 10 ~6~ 7 5 7 % 9 17 11 18 23 28 m 0 200 22 22 45 90 Podskórnie zel. i D 100 200 200 n 8 5 4 % 5 23 23 m | 15 300 0 D — dawka, //g/kg; n — ilosc prób; % — obnizenie cisnienia tetniczego krwi w %; m — okres trwania dzialania w minutach; NaCl — w fizjologicznym roztworze soli kuchennej; CMC — w roztworze karboksymetylocelulozy; zel. — w roztworze zelatyny. fosforany, polimery i kopolimery aminokwasu; zas jako zwiazki nieorganiczne wchodza w rachube wodorotlenki lub trudnorozpuszczalne sole, np. fosforany pewnych metali, zwlaszcza cynku.Wytworzone sposobem wedlug wynalazku nowe peptydy oraz ich sole addycyjne z kwasami i ich zwiazki komplek¬ sowe mozna stosowac do terapii w postaci rozpowszechnio¬ nych preparatów farmaceutycznych.W takich preparatach farmaceutycznych wytworzone sposobem wedlug wynalazku nowe zwiazki sa zawarte w towarzystwie nieorganicznych lub organicznych nosników, odpowiednich do podawania dojelitowego i pozajelitowego.Te preparaty farmaceutyczne mozna sporzadzic w postaci stalych liofilizatów, zawierajacych jako nosnik farmako¬ logicznie dopuszczalna i z peptydami nie reagujaca sub¬ stancje stala, np. weglowodany, nadto w postaci rozcien¬ czonych lub stezonych zawiesin lub emulsji, zawierajacych obok substancji czynnej ewentualnie tez konserwujaco lub stabilizujaco dzialajace substancje pomocnicze.Znanymi farmaceutycznymi metodami sporzadzone pre¬ paraty farmaceutyczne mozna stosowac do róznicowego diagnozowania jiadcisnien róznego pochodzenia, nadto w terapii do normalizowania nadcisnien róznego pocho¬ dzenia nerkowego, w przesileniach nadcisnieniowych, w przypadkach wtórnej niewydolnosci serca, itd.Preparaty farmaceutyczne sporzadza sie celowo w postaci dawek do wstrzykiwan, zawierajacych 1—10 mg substancji czynnej. Dawka dzienna nowych substancji czynnych, wy¬ tworzonych sposobem wedlug wynalazku, wynosi dla doroslych pacjentów 1—10 mg. Ilosc te podaje sie korzy¬ stnie na jeden raz dozylnie, podskórnie, domiesniowo lub w dluzej trwajacym wlewaniu dozylnym.W przykladach stosowane skróty aminokwasów, grup zabezpieczajacych itd. odpowiadaja skrótom ogólnie roz¬ powszechnionym w literaturze fachowej [porównaj J.Biol. Chem. 247, 977 (1972)]. Nadto stosowano jeszcze nastepujace skróty: HOAA = kwas hydroksyoctowy, OAla = kwas a-aminoksypropionowy, OGly = kwas amino- ksyoctowy, Pfp = pieciofluorofenyl.Podczas wytwarzania róznych zwiazków kazdorazowo odparowywanie przeprowadzano w prózniowej wyparce obrotowej — aparacie firmy Biichi o nazwie „Rotavapor".W celu okreslenia temperatury topnienia stosowano aparat wedlug dr Tottoli (firma Buchi). 25 30 35 40 45 50 15 60 Chromatogramy cienkowarstwowe sporzadzono na plyt¬ kach zelu krzemionkowego produkcji firmy Merck o nazwie ,,Kieselgel G nach Stahl".W celu rozwijania chromatogramów stosowano nastepu¬ jace mieszaniny rozpuszczalnikowe: 1): octan etylowy:(pirydyna:kwas octowy:woda = 20:6: :11) = 98:2, 2): octan etylowy:(pirydyna:kwas octowy:woda = 20:6: :11) = 95:5, 3): octan etylowy :(pirydyna:kwas octowy:woda = 20:6: :11) = 90:10, 4): octan etylowy.-(pirydyna :kwas octowy:woda = 20:6: :11) = 80:20, 5): octan etylowy:(pirydyna:kwas octowy:woda =± 20:6: :11) = 70:30, 6): octan etylowy:(pirydyna:kwas octowy:woda = 20:6: :11) = 60:40, 7): n-butanol :kwas octowy:woda = 4:1:5, 8): n-butanol :kwas octowy .-pirydyna:woda = 30:6:20:24, 9): n-butanol :octan etylowy :kwas octowy:woda = 1:1:1:1, 10): octan etylowy:(pirydyna:kwas octowy :woda = 20:6: :11) = 75:25.Rozwijanie plam nastepowalo za pomoca ninhydryny lub za pomoca ukladu chlorotoluidyna/jodek potasowy.W celu oczyszczenia produktów koncowych stosowano ogólnie znana, nastepujaca metode: 0,5 g wolnego peptydu rozpuszczano w 4 ml 0,01M roz¬ tworu octanu amonowego, po czym roztwór ten podaje sie na kolumne, zawierajaca 0,5 litra karboksymetylocelulozy (CMC-52) i doprowadzona uprzednio do stanu równowagi za pomoca powyzszego buforowego roztworu octanu amo¬ nowego. Kolumne te eluowano nastepnie droga gradien¬ towego eluowania za pomoca 1,5 litra 0,01M i 1,5 litra 0,4M roztworów octanu amonowego, które doprowadzono z mieszalnika gradientowego. Predkosc przeplywu odpo¬ wiadala 25 ml na godzine; wylapywano frakcje po 10 ml.Eluat splywajacy z kolumny rejestrowano na biezaco za pomoca aparatu o nazwie ,,LKB Uvicord-II" (produkcji firmy LKB-Produkter AB, Szwecja), po czym frakcje glówna, okreslona na podstawie otrzymanych krzywych, liofilizowano w urzadzeniu do liofilizacji firmy Leybold^ -Heraeus. W przypadku potrzeby otrzymany produkt powtórnie chromatografowano z zastosowaniem równiez eluowania gradientowego.IM 34i Wytwarzanie nowych analogów angiotcnsyny-II blizej, objasniaja podane nisd, pga*tady. »ti Przyklad I. Wytwarzanie sarko^npVi&oteucyno- metylowego8 estru angiotensypy-LL Etap. L ^-ArgO^)^Yal-Tyr(Bzi -OMe. ¦ ¦ " \& $ (7*5 nfnjpja) <|lerÓMe,HCl rozpuszcza sie w 30 ml chl^ofpnmi i zadaje za pomoca 1,06 m$ trójelyloaminy i 1,90 g(5 fnmoli) Bpc-Pro-OPfp. Mieszanine te pozostawia sie w ciagu 30 minut przy stale, utrzymywanej wartosci pH, po czym wytrzasa sie z woda, z 10% wodnym roz¬ tworem kwasu cytrynowego i ostatecznie znowu z wo4a, suszy si£ za pomoca bezwodnego siarczanu sodowego i odparowuje do sucha. , -Jako pozostalos^ otrzymany, zabezpieczony dwupeptyd kwasusolnegO-W dioksanie, po 15-minutowym pozostawieniu fftztwfo za4aje. sie 20 mj,J^az^p4nego eteru i odparowuje.JgJcpt pozostalosc otrzymany wo4#y chlorowodorek dwupeptydu (Rf(5)=0,46) natychmiast rozpuszcza sie w 30 ml chloroformu, odczyn tegor roztworu doprowadza sie trójetylóirnina ca. wartosci pH=8 i dodaje sie 4,36 a (7,5 mmola) Boc-His(Dnp)-OPfp,. Miejszanine te, pozostawia sie w ciagu godziny, po czym zadaje sie 0,83 ml N,N-dwu- metyloaminoetyloaminy, pozostawia w ciagu 10 minut, a nastepnie wytrzasa z 10 % roztworem kwasu cytrynowego, nasyconym przez chlorek sodowy, z In roztworem kwasu solnego, z 5% wodnym roztworern wodoroweglanu sodo¬ wego i z woda w podanej kolejnosci, suszy za pomoca bezwodnego siarczanu sodowego, i odparowuje do sucha.Jako pozostalosc otrzymany, zabezpieczony trójpeptyd (Rf(2)=o,45) nie wyodrebniony rozpuszcza sie w 10 ml §n roztworu kwasu solnego w dioksanie, rozpór, ten pozosta¬ wia sie w ciagu 15 minut i nastepnie dodatkiem bezwodnegp eteru etylowego straca sie wolny chlorowodorek trój- pept^du, odsacza i przemywa. Tjen, wolny ctilorowodorejc trojpeptydu (Rf=O,30) natychmiast rpzpuszcza, sie w 15 ml dwumetyloformamjdu.Odczjtn roztwpju doprowadza, sje za, pomoce trjójetylo- amipj 4awa^H^clP^^^i dpa^sje.3»4&($mmoli) 3oc- -Ij^HCPfp. Rpztwór ten pr^y s^s utrzjcmywanej wartosci pH pozostawia sie w ciagu 30 minut, po czym;rozpuszczalnik oj^o^^ujers^ ppz3s#l£§Q rpzfH^zc_za m w ocjtaro* ety¬ lowym, ro;g^tent^^ si&sW/*.v*9&Mm roztworem !©W»^^yfl9Weg9 lM rozt^gsepL Hwasu, solnego i osta¬ tecznie z woda, suszy z% pomoca, bsgtfodnegp siarczanu; s^9Wf«^ t)pflparpwujfe $&^\&&rQmpTAsie z rniesza- i^a^9f^ft^e^J^w^%l^saa i{ oracza. Na, tej; drodze o^manjf* z^he^piacz0?ix czterope^tycfc (Rf^=0,31) roz¬ puszcza .$*$ wTerali§p xo#wmtesm soinegct^w cjioksanifr, i^^órfte^r^z^s^wia si$ W/CJagu 1&minut, a nastepnie, do^tkjen^b^c^ sie produkt i odsacza.Ofrzymany na tej drodze, wp}ny; chlorowodorek czteror pefl&gu ^X5)-o,3a) rozpuszcza, sie w mieszaninie 2fc ml c^ojp,fojmur i lf) mij, dwumetyjoferaam^a, ;odczyn, tego. roz^w^ru, dpjTQwacU^v sie. trójetarloamina do. wartosci r^%r dodaje, 2,?£gJ&£ nampla) Boc:TWBzl)-OF)fc.Eo^jte ten pozostawia s& w ciast lS^nwim^przy stale; ujjrjciggywflnej, w^oscjj pl*, po czym< odparowuje, sie raz- tu§z H^jte ten zadaja sie 0,22 ml TftM^wunjetyloamJnoeJyter iflNBft: pozywia w ciaga 1Q rninuk pet czym wyiraasa Zv4fl% wo^jfm roztworem kwaswj/^ryripwegpa ^ 1» roz¬ tworem kwasu solnego i ostatecznie ,z woda, suszy za,pomoca io, 15 25 30: 35. 40 3fc 55e aa hezwodnego siarczanu sodowego i odparowuje. Pozostalosc^ te lozciNa sie z bezwodnym eterem i odsacza.Otrzymany, zabezpieczony pieciopeptyd (Rf(2=0,52 rozpuszcza sie^ w 1Q ml- 8n roztworu solnego- w dioksanie^ i po_ uplywie 15 minut produkt straca sie dodatkiem bez-r wodnego eteru etytowego, odsacza i przemywa eterem: etylowym,. Otrzymany na tej drodze, woln^^cl^fo^odo^e^ pieciopeply^u (Jl (3)=0,8) natychmiast rozpuszcza sie w 2^ ml dwumetytoformamidu, odczyntego roztworu doprowadza sie trójetyloamina do wartosci pH=8 i dodaje sie 2,3 a: (6 mmoli) Boc-Val-OPfp. Otrzymany roztwór pozostawia, sie w ciagu 1 godziny przy stalje utrzymywanej wartosci pH; po czym rozpuszczalnik odparowuje sie^ pozostalosc roz¬ pieszcza sie w chloroformie, roztwór wytrzasa sie t 19% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, z In roztworem kwasu solnego i ostatecznie z woda, suszy tel pomoca bezwodnego siarczanu sodowego i odparowuje. Pozostalosc rozciera sie z bezwodnym^ eterern^efylowym i odsacza.Otrzymany, zabezpieczotiy °szescibpeptyid; '(^ ^ =rCL43 20 natychmiast rozpuszcza sie; w 8n roztworze kwasil solnega w dioksanie, roztwór ten pozostawia sie w ciagu 15 minut,, po czym produkt straca sie dodatkiem bezwodnego eteru etylowego, odsacza i. przemywa. Otrzymany wolny chloro-r wodorek szesciopeptydu natychmiast rozpuszcza sie w 15 ml dwumetyloformamidu, odczyn, roztworu doprowadza sie trójetytaaminfe do wartosci pH=^8 i dodaje sie 2,6 g. (6 mmoli) Boc^Acg(NO^)rOPfp. Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH pozostawia sie w ciagu 30 minuty po czym zadaje 45 ml chloroformu, a mieszanine te wytrzasa sijgtz In roztworem kwasusolnego i z woda, suszy za pomoca bezwodnego siarczanu sodowego i odparowuje^ Pozostalosc rozciera sie z»v©ctanem etylowym i odsacza. Otrzymuje sie ta droga 3,3t g zabezpieczonego siedmiopeptydu Boc-Arg^ (NOi)rVal-Tyr(azl^Ue-His(Dnp)^Pro.Ile-OMe(Rf(3)=0,37)y przy czym ilosc ta odpowiada 51% wydajnosci teoretycznej; w przeliczeniu na Boc-Pro-OPfp, z czego wynika srednia wydajnosc etapowa rzeda 90%.Etag 2i Z-Sar-Arg(NO2)-Yal-Tyr(Bzl)-He-His(Dnp)-Pf0 -Ile-rOMe* 3,3 g (2,5 mmola) Boe-ArgCNO^-Yal^TyrCBzO-Ile-His.(DnpPfOrJle-OMe rozpuszcza sie w 15- ml 8n roztworu kwasu solnego w dioksanie, roztwór ten pozostawia- sie w ciagu, 20 minut w temperaturze pokojowej, po czym zadaje* bezwodnym, eterem; etylowym; wytracony produkt odsacza sie i .przemywa eterem etylowym.Otrzymany wolny chlorowodorek siedmiopeptydu (RfW= =0,7) natychmiast rozpuszcza sie w 15 ml dwumetylofor¬ mamidu, odczyn tego roztworu doprowadza sie trójetylo-^ amina, do; wartosci pH=8< i dodaje sie 2,4- g (6 mmoli Z^Sar-OPFpi Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH. pozostawia sie w ciagu. 30 minut, po czym zadaje sie- 45jml chloroformu i wytrzasa z In roztworem kwasu solnego- a nastepnie z woda, suszy za pomoca bezwodnego siarczanu sodowego i odparowuje. Pozostalosc rozciera sie z etanolem i odsaczal Otrzymuje sie tak 3,17 g zabezpieczonego osmio- peptydu Z^Sar-Aj?g(N02)-Val-Tyr(flzl)-He-HJs(DnpVPro-Il© -OMe (89% wydajnosci teoretycznej) o temperaturze top¬ nienia 197^109.C i o wspólezynmku Rr^^=0j82.Btap^ 3* Usuniecie grup zabezpieczajacych. 2,59 g (1,83 mmola)^Z^S8uvArg0»iOi)-Val-T,yr(Bzl)-Ilfr -H?s(Dilp)rtPro-Be-OMerozpuszcza sie w 5 ml dwumetyk)- formamidu i zadaje 4,6 ml ^merkaptoetanolUi Mieszanine/ te miesza,sie w ciagu 1,5 godziny, po czym dodatkiem bez*- wodnego eteru etylowego wytraca sie produkt i od&pzki 6^ Otrzymuje sie 2,0 g zabezpieczonego lecz^ #np dwiaftifeo^128 249 9 fenylowyck nie zawierajacego osmiopcptydu (Rf(4)=Q»42; (8^% wydajnosci teoretycznej). Produkt ten rozpuszcza sie w 49 ml mieszaniny 5:1:1 metanolu, kwasu octowego i wody, roztwór ton zadaje sie 1,0 g 10% katatizatórL palla¬ dowego na nosniku z wegla aktywnego i w 'warunkach energicznego mieszania przepuszcza sie w ciagu 20 godzin wodór przez roztwór. Po zakonczeniu reakcji katalizator usuwa sie droga saczenia, przemywa sie taka sama miesza¬ nina rozpuszczalnikowa, a przesacz polaczony z ciecza myjaca odparowuje sie do sucha. Pozostalosc te zadaje sie wodnym roztworem etanolu, ponownie odparowuje sie do sucha i te operacje powtarza sie jeszcze raz. Wreszcie po¬ zostalosc rozciera sie z bezwodnym eterem etylowym i suszy.Na drodze tej otrzymuje sie 1,56 g wolnego metylowego estru osmiopeptydu (98% wydajnosci teoretycznej). Ten surowy produkt oczyszcza sie wyzej omówionymi, ogólnymi metodami oczyszczania.Otrzymany,sarkozyao*r izoleucynometylowy* ester angio* tcusynywIJ wykazuje nastepujace wlasciwosci charaktery- *totfe;Rf^^0,lft; »r(,=^59; Rf(9=0,3a; EGiu(pH^ Analizatsmino^iwasewr-f^^ (1), Val/ lvi m, Tfr^ittiHat#& <1). ;= - H ¦ ¦ - ;¦ rf!P,.-.:;L- Przyklad II. Hydroksyacetylo\ izoleuctynomety- lowy8 ester angiotensyny-H.Etap L Z-OGly-ArgCN^-yal-TyrCBzW^Ile-Ha^Dop^Pro- -IleHOMe. 1,5 g (0,8 mmola) Boc-Arg(N02)-Vat-Tyr(Bzl)-Ile-His (Dnp)-Pro-Ile-OMe (wytworzonego wedlug przykladu Iw etapie 1) rozpuszcza sie, 6. ml 8n roztworu kwasu solnego w dioksanie, roztwór ten pozostawia sie w ciagu 20 minut w temperaturze pokojowej, po czym. dodatkiem bezwodnego eteru etylowego straca sie. produkt i odsacza.Otrzymany wolny chlorowodorek siedmiopeptydu< (fa<5 = =0^7) natychmiast rozpuszcza sie w 10- ml djyumetylofbr- mamidu, odczyn roztworu doprowadza sie trójetyloamina do wartosci pH=8 i dodaje sie 0,46 g*(l,17 mmola) Z-OGly- -OPfp. Mieszanine ter pozostawia sie w ciagui 30 minut, po czym zadaje sie 30 ml chloroformu, wytrzasa sie z 10% wodnym* roztworem kwasu cytrynowego, z In- roztworem kwasu solnegp i ostatecznie z woda, suszy za pomoca bezwodnego siarczanu, sodowego i odparowuje. Pozostalosc rozciera sie; z eterem etylowym i odsacza. Otrzymuje sie na tej drodze 1,05 g zabezpieczonego osmiopeptydu.Z(-OGly- -Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl,IletHis(DnpPro-Ile-OMe (93% wy¬ dajnosci teoretycznej), o temperaturze topnienia 140—145°C i o wspólczynniku Rf^)—0;24t Etap 2. Usuniecie grup zabezpieczajacych^ 1,05 g (0,74 mmola) Z-OGly-Arg(N02)-VajTTyr -De^His(Dnp)-Ero-IleOMe rozpuszcza sie w 5 ml dwume- tyloformamtdu i zadaje za pomoca 2,3 ml 2-merkapto- etanolu. Mieszanine te pozostawia sie w temperaturze po¬ kojowej wciagu 1,5 godziny, po czym dodatkiem bezwodnego cterni etylowego) wytraca sie produkt i przemywa eletem.Na drodze tej otrzymuje sie 0,85 g zabezpieczonego, lecz grup: dwunitrofenylowych juzi nie wykazujacegp: osmio¬ peptydu (83% wydajnosci teoretycznej ; Rf.(4)=0,40); 0*751g (0^6 miaoi^ tegOj produktu rozpuszcza sie w 20 ml mieszar nitty 5U ;1 metanolu, kwasu octowego i wody, roztwórr ten zadaje sie 0*&g<10% katalizatora: palladowego na nosniku Weglowym- i w warunkach' energicznego mieszania: przez mieswnn(i-przepuszcza sie wodór w< ciagli 18 godzili. Pb zakonczeniutejreakcjiJwtarnator odsaczane, przemywa taka sam^mieczanina rozpuszczalnikowa* a, przesacz polaczony 10 z ciecza myjaca odparowuje, sie do sucha. Pozostalosc z wodnym roztworem etanolu kilkakrotnie odparowuje sie do sucha, po czym rozciera sie z bezwodnym eterem ety¬ lowym, odsacza i suszy. Otrzymuje sie na tej drodze 0,48 g 5 wolnego metylowego estru osmiopejtfydu (82% wydajaosci teoretycznej). Ten surowy produkt oczyszcza sie nastepnie metoda wyzej omówiona. Czysty produfet wykazuje na stepujacewlasciwosci charakterystyczne: Rf(7)=0,29;Rf<8?F= -0,72; Rf<9)=0,60. 10 Analiza aminokwasów wykazuje: Pro 1,0 (l)k Val1& (IXIle 1,7 (2), Tyr0,88(1), His 1,02(1), Arg0,96 (l).Przyklad III. Wytwarzanie (L-kwas a-aminoksypro- pionowy1, ester izolcucynometylowy^-angiotensyny^H.Etap 1. Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-Hts(S^»p)-Pro- 13 -OBzl. 2*9 g (12 mmoh) Pro-OBzl.HCl rozpuszczar sie w 50 ml chloroformu i dodaje sie 1,68 ml trójetyloaminy i 5,87 g (10 mmoli) Boc-His(Dnp)-OPfp. Roztwór ten przy state utrzymywaoei wartosci pH miesza sie W ciaga 1 godziny* 20 po czym wytrzasa z porcjami po 25 ml IG% wodnego roz^ tworu- kwasu cytrynowego, In Tcarworu kwasa solnego, 5% wodnego roztworu wodoroweglanu, sodowego i wody w podanej, kolejnosci, suszy za pomoca bezwodnego siar¬ czanu sodowego i odparowuje. Pozostalosc rozciera sie 25 z n-heksanem i odsacza.Otraympny, zabezpieczony dwupeptyd rpz^ puszcza sie. w 13 ml roztworu kwasu solnego w dioksanie i po 15-rnim»tK)wym pozostawieniu prodiikt straca sie dodat¬ kiem bezwodnego eteru etylowego, odaacza i przemywa 30 eterem etylowym* Otrzymany nit tej drodze, wolny chloro¬ wodorek dwwpept5?du (RfC4)=0,24) flalj^femlast noznuszcza sie w 30 ml dwumetyloformamidu, odczyn tego roztwouu doprowadza sie trojstyloamina do wartosci pH=&* dodaje sie 47 g (12 mmoHd Bocrlle-OPfp. 35 Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH po¬ zostawia sie, w ciagu 1 godziny, po czym rozpuszczalnik odparowuje sie, pozostalosc ro*pu32ffiS5* sie w chloroformie ro ztwór ten wytrzasa sie z 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, z In roztworem kwasu solnego, z &%:wodnym 40 roztworem wodoroweglanu sodowego i 2 woda w podaapj kolejnosci, suszy za pomoca bezwodnego siareza-nu &o4flr wego i odparowuje. Pozostalosc rozciera; sie z mieszanina 1:2 eteru i ni-heksami h odsacza.Otrzymany, zabezpieczony trójpeptyd 45 poszcza, sie w 15 ml 8n roztworu kwasu sotoego w dioksanie i pa 15-mmutowym pozostawieniu straea sie produkt dodatkiem hcEwodnegaeteriketylowego, odsaczaj przemywa eterem etylowym; Otrzymany; wolny chlorowodorek- trójr peptydu (Rf(5)=Qi38) natychmiast roBpuszezfc sie; w 50 ml 50 dwumetyloiormamidu, odczyot itztworu doprowadza sie trójetyloamina do wartosci pl$=8 i dodaje sie 5,9 r g- (11 mmoli)Boc-Tyr(Bzl)-OPfp.Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH pot- zostawia sie w ciagu 30 minut, po czym rozpmzcyalnik 55 odparowuje sie, pozostalosc rozpuszczarsic/wr octanie etyr lowym, zadaje 0,22 ml N,N^wumetylOanimo-etyloaminy i pozostawia w ciagu 15 minut. Mieszanine reakcyjna; wy¬ trzasa, sie nastepnie z 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, z litrroztworem kwasu solnego i ostatecznie 60 z woda, suszy za pomoca bezwodnego siLiczami sodowego i odparowuje. Pozostalosc rozciera; sie\z eterem!dylowym iodsacza* { Otezymany na tej drodze, zabezpieczony czteropeptjftl (Re (*=0;73) natychmiast rozpuszcza- si$ w 20 mi roztworu 55 kwasu solnega w dioksanie i ppf 15-minutow^m pozoft^126 246 ll wieniu straca sie produkt dodatkiem bezwodnego eteru etylowego, odsacza i przemywa.- Otrzymany wolny chlorowodorek czteropeptydu (Rf (5)= =0,69) natychmiast rozpuszcza sie w 50 ml dwumetylo- formamidu, odczyri t*go roztworu doprowadza* sie trój- etyloamina do wartosci pH=8 i dodaje sie 4,2 g (11 mmoli) Bóc-Val-0Pfp. Roztwór ten przy stale utrzymywanej war¬ tosci pH pozostawia sie w ciagu 1 godziny, po czym roz¬ puszczalnik odparowuje sie, pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylowym,1 roztwór wytrzasa sie w znany sposób, suszy i odparowuje. Pozostalosc traktuj? sie ó-heksanem, a pózniej bezwodnym eterem etylowym i odsacza.Otrzymany, zabezpieczony pieeiopeptyd rozpuszcza sie w 20 mi Sn roztworu kwasu solnego w diok¬ sanie, roztwór ten pozostawia sie w ciagu 15 minut, po czym zadaje bezwodnym eterem etylowym, a wytracony produkt odsacza si£ i przemywa. Otrzymany na tej drodze, wolny chlorowodorek pieciopeptydu (Rf(5)=0,57) natychmiast rozpuszcza sie w 60 ml dwumetylofórmamidu, odczyn tego roztworu doprowadza sie trójetyloamina do wartosci pH=8 i dodaje sie 5,94 g (10 mmoli) Bóc-Arg(Tos)-OPfp.Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH pozosta¬ wia sie w ciagu 1 godziny, po czym rozpuszczalnik odparo¬ wuje sie, pozostalosc rozpuszcza sie w chloroformie, roz¬ twór ten wytrzasa sie z 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, In roztworem kwasu solnego, z 5% wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego i z woda w podanej kolejnosci, suszy za pomoca bezwodnego siarczanu sodo¬ wego i odparowuje: Pozostalosc-rozciera sie z bezwodnym eterem etylowym i odsacza. Otrzymuje sie na tej drodze 5.8 g Boc-Arg(Tós)-VaI-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-OBzl (Rf(3)=o,63), czyli 42 % wydajnosci teoretycznej liczac na His, co odpowiada sredniej wydajnosci etapowej rzedu 84%* Produkt ten wykazuje temperature topnienia 167—174°C.Etap 2. Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-OH. 2,8 g (2,1 mmola) otrzymanego ta droga, zabezpieczonego szesciopeptyduBos-Arg(TosVal-Tyr(Bzl)-Ils-His(Dnp)-Pro- -OBzi rozpuszcza Sie w 8 ml dwumetylofórmamidu, zadaje 2.9 ml 2-merkaptoetanolu i miesza w ciagu 1 godziny.Nastepnie produkt (Rf(4}»=0,17), uwolniony od- grup dwttmtrofenylowych,' straca sie dodatkiem bezwodnego eteru etylowego* sporzadza sie zawiesine w 30 ml dioksanu i zadaje 12 ml In roztworu wodorotlenku sodowego. Mie¬ szanine te pozostawia siew ciagu 1 godziny, po czym od- cz*i otrzymanego klarownego roztworu doprowadza sie kwasem solnym do wartosci pH=7 i oddestylowuje sie dioksan. Odczyn otrzymanego jako pozostalosc roztworu wodnego doprowadza sie kwasem solnym do odczynu oWartosci pH=3, otrzymany osad oddziela sie i rozpuszcza w 60 rnl« mieszaniny 2:3 dwumetylofórmamidu i chloro* formu. Warstwe organiczna otrzymanego roztworu od¬ dziela sie i oddestylowuje sie rozpuszczalnik organiczny.Otrzymuje sie jako pozostalosc 2,3 g Boc^A«-Arg(Tos)- -yal-TyKBzlMle^is-Pro-OH (96 % wydajnosci teorety- T2nej) o wspólczynniku Rf(5)=*0,37 io temperaturze top¬ nienia 160—164°C (z rozkladem). ^ ci Etap 3. B3c-Arg(To3)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Ile-OMe. 1|25 g (1,1 mola) produktu, otrzymanego w etapie 2, rozpuszcza sie w 15 ml dwumetylofórmamidu, a roztwór ten zadaje sie 0*5 ml (9*6 mmola) trójetyloaminy, 0,65 g (3^6 mmota) chlorowodorku Ile-OMe i 1,35 g (2 mmole) krystalicznego kompleksu dwucykloheksylokarbodwuimi- du i pieciofluorofenolu (stosunek molowy tych skladników równy 1:3. Mieszanine te przy stale utrzymywanej wartosci pH pozostawia sie, a po uplywie 24 godzin zadaje sie dalsza 12 * taka sama iloscia powyzszego kompleksu i dalsza iloscia 0*65 g (3,6 mmola) chlorowodorku Ile-OMe. Po uplywie dalszych 14 godzin mieszanine reakcyjna rozciencza sie za pomoca 45 mlchloroformu i wytrzasa z porcjami po 20 ml 5 10/£ wodnego roztworu kwasu cytrynowego dwukrotnie, nastepnie 5% wodnego roztworu wodoroweglanu sodowego i wreszcie wody jednokrotnie, suszy za pomoca bezwodnego siarczanu sodowego i odparowuje. Pozostalosc traktuje sie bezwodnym eterem etylowym i odsacza. Otrzymany 10 ta droga, zabezpieczony ester siedmiopeptydu (Rf(10) = =0,26) rozpuszcza sie w 20 ml goracego etanolu i po ochlo¬ dzeniu odsacza sie produkt. Otrzymuje sie 0,95 g (65% wydajnosci teoretycznej) Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His ^Pror-Ile-OMe. 15 Etap 4. B33vL-01a-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Ile^ -OMe. . , 0,95 g Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl^Ile-His-Pro-Ee-OMe rozpuszcza sie w 3 ml 8n roztworu kwasu solnego w dioksa¬ nie, roztwór ten pozostawia sie w ciagu 15 minut, po czym 20 dodatkiem bezwodnego eteru etylowego straca sie wolny chlorowodorek estru siedmiopeptydu (Rf(5)=0,24), prze¬ mywa eterem etylowym i natychmiast rozpuszcza w 10/ml dwumetylofórmamidu. Odczyn roztworu doprowadza sie trójetyloamina do wartosci pH=8 i dodaje sie 0,5 g (1,1 25 mmola) Boc-OAla-OPfp. Roztwór ten przy stale utrzymy¬ wanej wartosci pH pozostawia sie w ciagu 1 godziny, po czym rozciencza sie;60 ml chloroformu, wytrzasa z 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego i z woda, suszy za pomoca bezwodnego siarczanu sodowego i odparowuje. 30 Otrzymany zabezpieczony ester osmiopeptydu rozciera sie z eterem etylowym i odsacza. Otrzymuje sie na tej drodze 0,83 g (87% wydajnosci teoretycznej) Boc-L-OAla-Arg(Tos)- -Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Ile-OMeo wspólczynniku Rf <4= =0,34 i o temperaturze topnienia 143—146 C z rozkladem. 35 Etap 5. Usuniecie grup zabezpieczajacych. 0,75 g (0,57 mmola) otrzymanego w powyzszy sposób* zabezpieczonego osmiopeptydu rozpuszcza sie. w miesza¬ ninie 0,5 ml tioanizolu i 2 ml cieklego fluorowodoru. Mie¬ szanine te utrzymuje sie w ciagu 1,5 godziny w temperaturze 40 0°C, po czym dodatkiem bezwodnego eteru etylowego straca sie wolny ester osmiopeptydu. Produkt ten rozpuszcza sie w 30 ml metanolu i dodatkiem bezwodnego eteru etylo¬ wego ponownie wytraca sie produkt. Na drodze tej otrzy¬ muje sie 0,5 g (85% wydajnosci teoretycznej) surowego 45 estru osmiopeptydu. Ten surowy produkt nastepnie oczy¬ szcza sie omówiona wyzej ogólna mstoda oczyszczania.Otrzymana, czysta (L-kwas a-aminoksypropionowy\ ester izoleucynometylowy8)-angiotensyna-II wykazuje na¬ stepujace wlasciwosci charakterystyczne: Rf(7=Q,30; Rf (8 50 =0,68;RfC9=0,46.Analiza aminokwasów wykazuje: Pro lv0 (1), Val 1,05 (1), De 2,0 (2), Tyr0,73 (1), His 0,85 (1)„Arg 0,97 (1).Przyklad IV. Ester (sarkozyno1, treonino/Me/-mety^ lowy*)-angiotensyny-IL 55 Etap 1. Z-Sar-Arg(N02)- Val-Tyr(Bzl)-De-His(Dnp)-Pro- -Thr(Me)-OMe.r ,. - - 0,68 g<(4,5 mmola) Thr(Me)-OMe rozpuszcza sie w 10 ml chloroformu i zadaje 2,28 g (6 mmoli), EocrPro-OPfp* Roztwór przy stale utrzymywanej wartosci pH=8 pozostawia 60 sie w ciagu pól godziny, po czym oddestylowuje sie rozpusz¬ czalnik, pozostalosc rozpuszcza, sie w octanie etylowym i dodaje sie 0,22 ml N^N-dwumetyloaminoetyloaminy.PO 15-minutowym pozostawieniu swytrzasa sie najpierw z 10% roztworem kwasu cytrynowego nasyconym przez 53 chlorek sodowy, nastepnie z In roztworem kwasu solnego126 240 13 i ostatecznie z woda, suszy sie za pomoca bezwodnego siarczanu sodowego i odparowuje.Jako pozostalosc otrzymany, wolny chlorowodorek dwu- peptydu (Rf(4)=0,18) natychmiast rozpuszcza sie w 10 ml dwumetyloformamidu, odczyn tego roztworu doprowadza 5 sie trójetyloamina do wartosci pH=8 i dodaje sie 2,95 g (5 mmoli) Boc-His(Dnp)-OPfp. Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH=8 pozostawia sie w Ciagu pól godziny, po czym oddestylowuje sie rozpuszczalnik, a po¬ zostalosc rozpuszcza sie w octanie etylowym. Roztwór zadaje 10 sie 0,11 ml N,N-dwumetyloaminoetyloaminy, pozostawia sie w ciagu 10 minut, po czym wytrzasa sie z nasyconym przez chlorek sodowy 10% roztworem kwasu cytrynowego, a nastepnie z woda, suszy sie bezwodnym siarczanem so¬ dowym i odparowuje. 15 Otrzymany jako pozostalosc zabezpieczony trójpeptyd Rf(2)=0,46) natychmiast rozpuszcza sie w 5 ml dwumetylo¬ formamidu, po 15-minutowym pozostawieniu straca sie produkt reakcji dodatkiem bezwodnego eteru etylowego, odsacza i przemywa eterem etylowym. Otrzymany na tej 20 drodze wolny chlorowodorek trójpeptydu (Rf(4)=0,3) natychmiast rozpuszcza sie w 10 ml dwumetyloformamidu, odczyn roztworu doptowadza sie trójetyloamina do war¬ tosci pH=S i dodaje sle 2^0 g<(5 mmoli) Boc^De-OPfp.Roztwór ten przy stale utrzymywanej ;war*bks pH=*=8 25 pozostawia sie wciagu pól godziny,pó cz^m oddestylowuje sie rozpuszczalnik, pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylowym, a roztwór ten wytrzasacie w znany sposób,isuszy i odparowuje* Pozostalosc rozciera sie z mieszanina eteru etylowego i n-heksanu o stosunku objetosciowym 3:7 30 i odsacza.Otrzymany na tej drodze zabezpieczony czteropeptyd (Rf(2)=0,28) natychmiast rozpuszcza sie w 7 ml 8n roz¬ tworu kwasu solnego w dioksanie, roztwór ten pozostawia sie w ciagu 15 minut, po czym dodatkiem bezwodnego eteru 35 etylowego wytraca sie wolny chlorowodorek czteropeptydu, odsacza i przemywa eterem etylowym. Produkt ten (Rf(5)= =0,27) rozpuszcza sie w 10 ml dwumetyloformamidu, odezyn roztworu doprowadza sie trójetyloamina do wartosci pH=8 i dodaje sie 2,7 g (5 mmoli) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp. 40 Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH=8 pozostawia sie w ciagu pól godziny, po czym oddestylowuje sie rozpuszczalnik, pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylowym, roztwór ten zadaje sie 0,11 ml N,N-dwumetylo- amino-etyloaminy i po 15-minutowym pozostawieniu 45 wytrzasa sie z.nasyconym przez chlorek sodowy 10% wod¬ nym roztworem kwasu cytrynowego i z woda, suszy sie za pomoca bezwodnego siarczanu sodowego i odparowuje.Otrzymany jako pozostalosc, zabezpieczony pieciopeptyd (Rf(2)=0,51) rozciera sie z bezwodnym eterem etylowym, 50 odsacza i natychmiast rozpuszcza w 5 ml 8n roztworu kwasu solnego w dioksanie. Po 15-minutowym pozosta¬ wieniu wytraca sie wolny chlorowodorek pieciopeptydu (Rf(O=0,48) dodatkiem bezwodnego eteru etylowego, odsacza, przemywa eterem etylowym i rozpuszcza w 20 ml 55 dwumetyloformamidu. Odczyn tego roztworu doprowadza sie trójetyloamina do wartosci pH=8 i dodaje sie 1,9 g (9 mmoli) BdC7Val-OPfp. Roztwór ten przy stale utrzymy¬ wanej wartosci pH=8 pozostawia sie w ciagu pól godziny, po czym oddestylowuje sie rozpuszczalnik, pozostalosc # rozpuszcza sie w chloroformie, roztwór w znany sposb wytrzajsa sie, suszy i odparowuje. Pozostalosc rozciera sie z bezwodnym eterem etylowym,i odsacza.Otrzymany, zabezpieczony szesciopeptyd (Rf(2)=0,44) rozpuszcza sie w 10 ml 8n roztworu kwasu solnego w diok- w 14 sanie i po 15-minutowym pozostawieniu produkt wytraca sie dodatkiem bezwodnego eteru etylowego, odsacza i prze¬ mywa. Otrzymany, wolny chlorowodorek szesciopeptydu (Rf(4)=0,36) natychmiast rozpuszcza sie w 15 ml dwumety¬ loformamidu, odczyn tego roztworu doprowadza; sie trój¬ etyloamina do wartosci pH=8 i dodaje sie 2,25 g (5 mmoli) Boc-Arg(N02)-OPfp. Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH=8 pozostawia sie w ciagu 1 godziny, po czym rozciencza sie 45 ml chloroformu, i na znanej drodze wy¬ trzasa sie, suszy i odparowuje.Pozostalosc rozciera sie z etanolem i odsacza. Otrzymuje sie na tej drodze 3,3 g zabezpieczonego estru siedmiopep¬ tydu Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-Hi^ -OMe (56% wydajnosci teoretycznej w przeliczeniu na skladnik Thr), co odpowiada sredniej wydajnosci etapowej 91%, przy czym produkt ten wykazuje temperature top¬ nienia 188—193°C i wspólczynniki: Rf <3)=0,38 oraz Rf(4)= =0,87. 1,95 g (1,5 mmola) powyzszego, zabezpieczonego estru siedmiopeptydu rozpuszcza sie w 10 ml 8n roztworu kwasu solnego w dioksanie i po 20-minutowym pozostawieniu produkt wytraca sie dodatkiem bezwodnego eteru etylowego, odsacza i przemywa. , \ f Otrzymany, wolny chlorowodorek estrtt'siedmiopeptydu (Rf(4)=0,20) rozpuszcza sie w 15 ml dwumetyloformamidu, odczyn tego roztworu doprowadza sie trójetyloamina do wartosci pH==8 i dodaje sie 0,$7 g (2,25 mmola) Z-Sar-OPfp.Roztwór ten. przy stale utrzymywanej wartosci pH=8 pozostawia sie w ciagu 1 godziny, po czym rozciencza sie 45 ml chloroformu, wytrzasa z 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, pózniej z In roztworem kwasu solnego i wreszcie z woda, suszy za pomoca bezwodnego siarczanu sodowego i odparowuje.Pozostalosc rozciera sie z etanolem, odsacza i przemywa etanolem. Otrzymuje sie na tej drodze 1,85 g (87% wydaja nosci teoretycznej) zabezpieczonego estru osmiopeplydt* Z-Sar-Arg (N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(Me) -OMe o temperaturze topnienia 202—208 °C i o wspólczynT nikach Rf<3)=0,20 oraz Rf(4)=0,86.Etap 2. Usuniecie grup zabezpieczajacych. 1,85 g (1,4 mmola) zabezpieczonego estru osmjopepty- du Z-Sar-Arg (N02)-Val-Tyr (BzO-Ue-Hi^Dnp^ProrThr, (Me)-OMe rozpuszcza sie w 8 ml dwumetyloformamidu i zadaje 2,6 ml 2-merkaptoetanolu. Mieszanine te miesza sie w ciagu godziny, a nastepnie dodatkiem bezwodnego eteru etylowego wytraca sie pozbawiony grup dwunitro- fenylowych, zabezpieczony ester osmiopeptydu (1,6 g; Rf £*) =0,52), odsacza i przemywa. Produkt ten rozpuszcza sie w 30 ml mieszaniny 5:1:1 metanolu, kwasu octowego i wody i dodaje sie 1,0 g 10% katalizatora palladowego na nosniku z wegla aktywnego. Energicznie mieszajac przepuszcza sie w ciagu 30 godzin wodór przez roztwór, po czym.katalizator odsacza sie, przemywa taka sama mieszanina rozpuszczal¬ nikowa i polaczony z ciecza myjaca przesacz odparowuje sie do sucha. Pozostalosc rozciera sie z mieszanina 2:1 eteru i etanolu i odsacza. Na drodze tej otrzymuje sie 0,98 g wolnego estru osmiopeptydu (83% wydajnosci teoretycznej).Ten surowy produkt nastepnie oczyszcza sie wyzej omówio¬ nymi, ogólnymi metodami oczyszczania.Otrzymany, czysty (sarkazyno1, treonino(Me)-metylowy8 ester)-angiotensyny-II wykazuje nastepujace wlasciwosc1 charakterystyczne: RfO-0,29; Rf(8=0,55; Rf<9)=0,27; Eg1u(pH=1,9); analiza aminokwasów: His 1,03 (1), Arg 0,95 (1), Thr 0,93 (1), Pro 1,03 (1), VaU,15 (1), Ile 1,0* (01), Tyr 0,90 (1), Sar 1,0 (1).126 240 Przy klad V. (KwasIrydroksyoctowy1, ester treonino (Me^ibwytei^^^mgioiteJisyna-JI.Em *. ^-OOty-Ar^N02)-Val-Tyr(BzlHte-His(Dnp)- ^Pro-Thr 0,62 g {0,47 mbiata)^Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(BriHle- ^Hi^Dn^-Pro-Thi^Me^Ofcdie (wytworzonego wedlug przy¬ kladu IV- etap 1) rozpuszcza sie w 4 ml 8n roztworu kwasu solnego w dioksanie i po 15-mfnmiowym pozostawieniu wytraca sie wobiy chlorowodorek estru siedmiopeptydu dodatkiem bezwodnego eteru-etylowego, odsacza i przemywa eterem etylowym. Produkt ten (Rf(5)=0,35) natychmiast rozpuszcza sie w 10 ml dwumetyloformamidu, odczyn tego roztworu doprowadzacie tJrójetjfloamina do wartosci pH=8 i dodaje sie 0*6 g (2 tfunole) Z-OGiy-OPfp. Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH-= 8 pozostawia sie w ciagu 1 godziny, po czym rozciencza sie 30 ml chloro¬ formu, wytrzasa z 10% wodnym roztworem kwasu cytry¬ nowego, pózniej z In roztworem kwasu solnego i wiezcie z woda, suszy za pomoca bezwodnego siarczanu sodowego i odparowuje. Pózniej rozciera sie z mieszanina 9;1 eteru etylowego i etanolu oraz odsacza. Otrzymujesie na tej drodze 0,60 g<90% wydajnosci teoretycznej) zabezpieczonego estra osmiopeptyduZ-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile*His-(Dm)^ -Pro-Thr(taeOMe o temperaturze topnienia 158—162°C i o wspólczynniku Rf(3^©,44. i Etap 2. Usuniecie grup zabezpieczajacych. 0,6 g (0,42 mmtflaf zabezpieczonego estru osmiopeptydu rozpuszcza sie w 2 ml dwumetyloformamidu, zadaje sie 1,2 ml 2-merkaptoetanolu i po 1-godzinnym pozosta¬ wieniu pozbawiony grup dwunitrofenylowych, zabezpie* czonyester osmiopeptydu wytraca sie dodatkiem bezwodnego eteru etylowego. Produkt ten rozpuszcza sie w metanolu, roztwór klaruje sie za pomoca wegla aktywnego, saczy rodparowuje do sucha. Pozostalosc rozciera sie z eterem i odsacza. Otrzymuje si40,46 g tego produktu o wspólczyn* liikach HfW-0,16 i Rf(0=0,52. frttdiikt ten rozpuszcza sie w mieszaninie 5:1:1 metanolu, kwasu octowego i wody (25 ml), zadaje sie 0,3 g 10% ka¬ talizatora palladowego na nosniku z wegla aktywnego i energicznie mieszajac przepuszcza sie w ciagu 17 godzin wodo* przez te mieszanine. Po zakonczeniu tej reakcji odsacza Sie katalizator, przemywa taka sama mieszanina rozpuszczalnikowa, a z ciecza myjaca polaczony przesacz odparowuje sie do sucha. Pozostalosc zadaje sie kilkakrot- nie mieszanina wody i etanolu i odparowuje do sucha, po czym rozciera sie zeterem etylowym i odsacza. Otrzymuje sie. 0,32 g (91 % wydajnosci teoretycznej) wolnego estru osmiopeptydu. Ten surowy produkt oczyszcza sie wyzej omówionymi metodami oczyszczania; otrzymany na tej drodze, czysty (kwas iiydroksyoctowy1, ester treonino(Me)- -metylowy*)-angiotensyny*II wykazuje nastepujace wlasci¬ wosci charakterystyczne: Rf (7=0,22; Rf(*)=0,73; Rf<9)= Analiza aminokwasów wykazuje: Thr 0,92 (1), Pro 1,09 (L), Val ljO (IX Ty*-0,7 (1), His 1,0 (1), Arg 1,0 (1).Przyklad VI. (Kwas hydroksyóctowy1, ester tre- óetaometylowy»)-angiotensynry-liL Etap 1. B^c^Arg^NO^-V«^Tyr^Bzl)-Be-His(Dnp)-Pro-Thr- -OMe. '.¦¦:¦. ¦.•¦!\J -a,. 3,8 (20 mitioli) Thr-OMe.HCl rozpuszcza sie w 50 ml chloroformu i dodaje sie 2,3 ml (20 mtholi) trójetyloaminy i £,8 g (10 mraoli) Boc-Fra-OPfp. Roztwór ten przy stale Otrzymywanej wartosci pH pozostawia sie w tia&ii 1 godzinyr po czym "wytrzasa sie z 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, pózniej z In kwasem solnym pwreszcie z woda, suszy za pomoca bezwodnego siarczanu sodowego i od¬ parowuje.Otrzymany zabezpieczony ester dwup2ptydu rozpuszcza sie w 20 ml 8n roztworu kwasu solnego w diolr- 5 sanie, a po 15-minutowym pozostawieniu wytraca sie wolny chlorowodorek estru dwupeptydu dodatkiem bez¬ wodnego «teru etylowego, odsacza i przemywa. Produkt ten (Rf(s)=0,2) natychmiast rozpuszcza sie w 30 ml chloro¬ formu, odczyn roztworu doprowadza sie trójetyicacrrina do 10 wartosci pH=8 i dodaje sie 4,7 g (8 mmoli) Boc-His(Dnp)- -OPfp. Roztwór przy stale utrzymywanej wartosci pH=8 pozostawia w ciagu 1 godziny, po czym wytrzasa sie z 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, z In roztworem kwasu solnego, z 5 % wodnymroztworem wodoroweglanu so- 1S dowego i z woda w podanej kolejnosci, suszy za pomoca bezwodnego siarczanu sodowego i odparowuje.Otrzymany jako pozostalosc, zabezpieczony ester trój* peptydu (Rf<3WQ,47) rozpuszcza sie w 20 ml 8n roztworu kwasu solnego w dioksaniei po l&minutowympozostawieniu 2o wolny chlorowodorek estru trójpeptydu (Rjf C5) =*0*23) wytraca sie dodatkiem bezwodnego eteru etylowego. Pro¬ dukt ten rozpuszcza sie w 20 inl mieszaniny 5:1 chloroformu i dwumetyloformamidu, odczyn roztworu doprowadza sie trójetyloamina do wartosci pH=8 i dodaje sie 4,0 g 25 (10 mmob) Jloc-Ile-OPfp. Roztwór ten przy stale utrzymy¬ wanej Wartosci pH3^ 8 pozostawia sie w ciagupól godziny, po czym wytrzasa sie 10%. wodnym roztwoiiem kwasu cytry¬ nowego, pózniej z 5 % wodnym roztworem wodoroweglanu sodowego i wreszcie z woda, suszy za pomoca siarczanu 30 sodowego i odparowuje. Pozostalosc te kilkakrotnie roz¬ ciera sie z n-heksanem i odsacza.Otrzymany na tej drodze, zabezpieczony ester cztero- pcptydu (Rf(3)=0,35) rozpuszcza sie w 15 ml Bn roztwoni kwasu solnego w dioksanie i po 15-minutowym pozostawieniu 35 wytraca sie wolny chlorowodorek estru czteropeptydu do¬ datkiem bezwodnego eteru'etylowego. Produkt ten (Rf(5)= =0,25) natychmiast rozpuszcza sie w 30 ml dwumetylofor¬ mamidu, odczyn tego roztworu doprowadza sie trójetylo- amina do wartosci pH=8 i dodaje sie 2,05 g (3,08 rnmola) 40 Boc-Tyr(Bzl)-OPfp. Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH—8 pozostawia sie w ciagu pól godziny, po czym odparowuje sie, pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylowym i zadaje 0,11 ml N,N-dwumetyloamino-etylo- aminy. Po IS^nrinutowym pozostawieniu roztwór wytrzasa 45 sie w znany sposób * suszy sie i odparowuje; Otrzymany jako pozostalosc, zabezpieczony ester pleoio- peptydu (Rf(3=0,57) rozciera sie z bezwodnym^ eterem etylowym i odsacza, po czym rozpuszcza sie w 10 ml 8n roztworu kwasu solnego w dioksanie. Po 15-minutowym 50 pozostawieniu wolny chlorowodorek estru pieciópefrtydtt wytraca sie dodatkiem bezwodnego eteru etylowego, odsacza i przemywa eterem etylowym. Produkt ten (RfC-5)=0,27) natychmiast rozpuszcza sie w 20 ml dwumetylofbrmamitdu, odczyn tego roztworu doprowadza sie trójetylóamina do 55 WartoscipH-8 i dodajesie l,75»g (4,5mmola) Boc-Val-OPfp.Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH*=fc pozostawia sie w ciagu 1 godzitiy, po czym rozpuszczalnik odparowuje sie, pozostalosc rozpuszcza sie w cWoroformie, a roztwór w znany sposóbiJsyytrzasa sie, suszy i odparowuje. 60 Olewta^pozostalosc rozciera sie z eterem ¦etylowym, odsacza i przemywa.Otrzymany na tej drodze, zabezpieczony ester sapseio- peptydu (Rf(3)=0,55) rozpuszcza sie w 8 ml 8n roztworu kwasu solnego w dioksanie i po l^-midotowym pozosta- 65 wieniu wyiraca sie wolny chlorowodorek estru szescio-126 240 17 peptydu dodatkiem bezwodnego eteru etylowego, odsacza i przemywa eterem etylowym. Produkt ten (Rf(5)=0,23) natychmiast rozpuszcza sie w 20 ml dwumetyloformamidu, odczyn roztworu doprowadza sie trójetyloamina do war¬ tosci pH=8 i dodaje sie 1,8 g (4 mmole) Boc-Arg(N02)- -OPfp. Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH=8 pozostawia sie w ciagu 1 godziny, po czym rozpuszczalnik odparowuje sie, pozostalosc rozpuszcza sie w chloroformie, a roztwór w znany sposób wytrzasa sie, suszy i odparowuje.Pozostalosc rozciera sie w mieszaninie 9:1 eteru i etanolu, odsacza i przemywa. Otrzymuje sie 2,7 g (26% wydajnosci teoretycznej w przeliczeniu na skladnik His, co odpowiada sredniej wydajnosci etapowej rzedu 80%) zabezpieczonego estru siedmiopeptydu Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His (DnpPro-Thr-OMe o temperaturze 190—195°C (z roz¬ kladem) i o wspólczynniku Rf(4)=0,47.Etap 2. Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzr)-Ile-His(Dnp)- -Pro-Thr-OMe. 1,7 g (l;4 mmola) powyzszego zabezpieczonego estru siedmiopeptydu rozpuszcza sie w 10 ml 8ri roztworu kwasu solnego w dioksanie, a po 15-minutowym pozostawieniu wytraca sie wolny chlorowodorek estru siedmiopeptydu (Rf(«)=0,21) dodatkiem bezwodnego eteru etylowego i natychmiast rozpuszcza sie w 20 ml dwumetyloformamidu.Odczyn tego roztworu doprowadza sie trójetyloamina do wartosci pH=8 i dodaje sie 0,82 g (2,1 mmola) Z-OGly- -OPfp. Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH=8 pozostawia sie w ciagu pól godziny, po czym rozciencza za pomoca 40 ml chloroformu, wytraca z In roztworem kwasu solnego i z woda, suszy i odparowuje. Pozostalosc te rozciera sie za pomoca bezwodnego eteru etylowego i odsacza.Otrzymuje sie 1,6 g (87% wydajnosci teoretycznej) zabez¬ pieczonego estru osmiopeptydu o temperaturze topnienia 188—194°C i o wspólczynniku Rf(4)=0,48.Etap 3. Usuniecie grup zabezpieczajacych. 1,6 g (1,2 mmola) zabezpieczonego estru osmiopeptydu Z-OGly-Arg (N02)-Val-Tyr (Bzl)-Ile-His (Dnp)-Pro-Thr- -OMe rozpuszcza sie w 5 ml dwumetyloformamidu i zadaje za pomoca 3,8 ml 2-merkaptoetanolu. Mieszanine te po¬ zostawia sie w ciagu 1 godziny, po czym pozbawiony grup dwunitrofenylowych ester osmiopeptydu wytraca sie do¬ datkiem bezwodnego eteru etylowego, odsacza, rozpuszcza w metanolu i ponownie wytraca dodatkiem eteru etylowego.Otrzymuje sie 1,3 g (94% wydajnosci teoretycznej) produktu o wspólczynnikach Rf(4)=0,35 i Rf(5)=0,72.Produkt ten rozpuszcza sie w mieszaninie 5:1:1 metanolu, kwasu octowego i wody, dodaje sie 0,6 g 10% kata¬ lizatora palladowego na nosniku z wegla aktywnego i ener¬ gicznie mieszajac przepuszcza sie w ciagu 17 godzin wodór przez te mieszanine. Po zakonczeniu tej reakcji odsacza sie katalizator i przemywa taka sama mieszanina -rozpuszczal¬ nikowa; polaczony z ciecza myjaca przesacz odparowuje sie do sucha. Pozostalosc kilkakrotnie odparowuje sie z mieszanina etanolu i wody; ostatecznie otrzymana po¬ zostalosc rozciera sie zeterem etylowym, odsacza i przemywa eterem etylowym. Otrzymuje sie 0,64 g wolnego estru osmiopeptydu (92% wydajnosci teoretycznej). Ten surowy produkt oczyszcza sie wyzej omówionymi metodami oczysz¬ czania; otrzymany ta droga, czysty (kwas hydroksyoctowyi1 ester treoninometylowy^-angiotensyny-II wykazuje na¬ stepujacewlasciwosci charakterystyczne: Rf(7)=0,22; Rf(8)= =0,73; RfCO=0,56.Analiza aminokwasów: Thr 0,92 (1), Pro 1,03 (1), Val 1,0 (1), Ile 1,05 (1), Tyr0,7 (1), His 1,0 (1), Arg 1,0 (1). 18 Przyklad VII. Ester sarkozyno1, alaninometylowy* angiotensyny-n.Etap 1. Z- Sar-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)- TPro-Ala-OMe 0,7 g (5 mmoli) Ala-OMe.HCl rozpuszcza 5 sie w 20 ml chloroformu, zadaje sie 0,7 ml trójetyloaminy i 1,14 g (3 mmole) Boc-Pro-OPfp i przy stale utrzymywanej wartosci pH pozostawia sie w ciagu pól godziny. Roztwór ten wytrzasa sie z 10% wodnym roztworem kwasu cytryno¬ wego, pózniej z In roztworem kwasu solnego i wreszcie 10 z woda, suszy sie za pomoca bezwodnego siarczanu sodo¬ wego i odparowuje.Otrzymany jako pozostalosc, zabezpieczony ester dwu- peptydu (Rf(2)=0,61) rozpuszcza sie w 5 ml 8n roztworu kwasu solnego w dioksanie, po 10-minutowym pozostawie- 15 niu roztwór rozciencza sie bezwodnym eterem etylowym i odparowuje.Otrzymany jako pozostalosc, wolny chlorowodorek estru dwupeptydu (Rf(5)=0,32) rozpuszcza sie w 20 ml chloro¬ formu, odczyn tego roztworu doprowadza sie trójetylo- 20 amina do wartosci pH=8 i dodaje sie 2,7 g (4,5 mmola) Boc-His(Dnp)-OPfp. Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH=8 pozostawia sie w ciagu 1 godziny, po czym zadaje sie go 0,33 ml dwumetyloamino-etyloaminy, a po 15-minutowym pozostawieniu mieszanine wytrzasa sie 25 z 10% wodnym roztworem kwasu cytrynowego, z In roz¬ tworem kwasu solnego, z 5 % wodnym roztworem wodoro¬ weglanu sodowego i z woda w podanej kolejnosci, suszy sie za pomoca bezwodnego siarczanu sodowego i odparowuje.Otrzymany jako pozostalosc, zabezpieczony ester trój- 30 peptydu (Rf(2)=0,27) rozpuszcza sie w 10 ml 8n roztworu kwasu solnego w dioksanie i po 15-minutowym pozosta¬ wieniu wolny chlorowodorek estru trójpeptydu (Rf(5)=0,48) wytraca sie dodatkiem bezwodnego eteru etylowego, odsacza i przemywa eterem etylowym. Produkt ten natychmiast 35 rozpuszcza sie w 30 ml mieszaniny 2:1 chloroformu i dwu¬ metyloformamidu, odczyn tego roztworu doprowadza sie trójetyloamina do wartosci pH=8 i dodaje sie 2,4 g (6 mmoli) Boc-Ue-OPfp. Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH=8 pozostawia sie w ciagu pól godziny, po czym 40 rozpuszczalnik odparowuje sie, pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylu, a roztwór w znany sposób wytrzasa sie, suszy i odparowuje. Pozostalosc te rozciera sie z mieszanina 1:9 eteru etylowego i n-heksanu oraz odsacza* Otrzymany ta droga, zabezpieczony ester czteropeptydu 45 (Rf(2)=0,29) rozpuszcza sie w 10 ml 8n roztworu kwasu solnego w dioksanie i po 10-minutowym pozostawieniu wolny chlorowodorek estru czteropeptydu (Rf(5)=0,67) wytraca sie dodatkiem bezwodnego eteru etylowego, odsacza, przemywa i natychmiast rozpuszcza w mieszaninie 2:1 50 chloroformu i dwumetyloformamidu. Odczyn tego roz¬ tworu doprowadza sie trójetyloamina do wartosci pH=8 i dodaje sie 1,78 g (3,3 mmola) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp. Roz¬ twór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH pozostawia sie w ciagu 15 minut, po czym rozpuszczalnik odparowuje 55 sie, pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylowym, a roz¬ twór ten w znany sposób wytrzasa sie, suszy i odparowuje.Pozostalosc rozciera sie z bezwodnym eterem etylowym i odsacza; otrzymany, zabezpieczony pieciopeptyd (Rf (2)= =0,33) rozpuszcza sie w 10 ml 8n roztworu kwasu solnego 60 w dioksanie, a po 10-minutowym pozostawieniu wolny chlorowodorek estru pieciopeptydu (Rf(4)=0,35) wytraca sie dodatkiem bezwodnego eteru etylowego, odsacza i natych¬ miast rozpuszcza w 20 ml dwumetyloformamidu. Odczyn roztworu doprowadza sie trójetyloamina do wartosci pH=8 65 i dodaje sie 1,55 g (4 mmole) Boc-Val-OPfp. Roztwór tenm 24§ it przy stale utrzymywanej wartosci pH pozostawia sie w ciagu pól godziny, po czym odparowuje sie rozpuszczalnik, pozostalosc rozpuszcza sie w chloroformie, a roztwór w znany sposób wytrzasa sie, suszy i odparowuje. Pozosta¬ losc te rozciera sie z bezwodnym eterem etylowym i odsacza.Otrzymany, zabezpieczony ester szesciopeptydu (Rf&= =0,35 rozpuszcza sie w 8 ml 8n roztworu kwasu solnego w dioksanie i po 20-minutowym pozostawieniu wody chlorowodorek estru szesciopeptydu (Rf(5=0,75) wytraca sie dodatkiem bezwodnego eteru etylowego, odsacza 1 prze¬ mywa eterem. Produkt ten natychmiast rozpuszcza sie w 2Qml dwumetyloformamidu, odczyn roztworu doprowadza sie trójetyloamina do wartosci pH=8 i dodaje sie 2,64 g (6 mmoli) Boc-rArgCNOa^OPfp. Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH pozostawia sie w ciagu 1 godziny po czym rozciencza sie 60 ml chloroformu, wytrzasa z In roztworem kwasu solnego i z woda, suszy oraz odparowuje.Pozostalosc te rozciera sie w mieszaninie 1:3 etanolu i eteru etylowego, odsacza i przemywa.Otrzymany, zabezpieczony ester siedmiopeptydu (Rf(4)= =0,85) rozpuszcza sie w 10 ml 8n roztworu kwasu solnego w dioksanie, po 15-minutdwym pozostawieniu wolny chlorowodorek estru siedmiopeptydu (Rf GO=0,15) wytraca sie dodatkiem bezwodnego eteru etylowego, odsacza, przemywa i natychmiast rozpuszcza w 20 ml dwumetylo¬ formamidu. Odczyn roztworu doprowadza sie trójetylo¬ amina do wartosci pH=8 i dodaje 1,27 g (3,3 mmola) ZrSar^OPfp.Roztwór ten przy stale utrzymywanej wartosci pH po¬ zostawia sie w ciagu 15 minut, po czym rozciencza sie chloroformem i w znany sposób wytrzasa, suszy i odparowu¬ je. Otrzymany jako pozostalosc, zabezpieczony ester osmio- peptydu rozciera sie z 25 ml etanolu, odsacza i przemywa.Otrzymuje sie na tej drodze 1,37 g (33% wydajnosci teore¬ tycznej w przeliczeniu na skladnik Pro, co odpowiada Sredniej wydajnosci etapowej rzedu 86%) Z-Sar-Arg(N02)- -Val-Tyr(BriHle-His(Dnp)-PFOrAla-OMe o temperaturze topnienia 192—196°C i o wspólczynniku RfC«)=0,70.Etap 2- Usuniecie grup zabezpieczajacych. 1,37 g (\ mmot) otrzymanego w powyzszy sposób, za¬ bezpieczonego estru osmiopeptydu rozpuszcza sie w 3 ml dwumetyloformamidu, zadaje sie 1,9 ml 2-merkaptoetanoki i po 1-godzinnym pozostawieniu dodatkiem bezwodnego eteru etylowego wytraca sie pozbawiony grup dwunitro- fenyfowyofe ester osmiopeptydu (1,2 g; 99% wydajnosci teoretycznej; Rfc4=0,20), odsacza i przemywa. Produkt ten rozpuszcza sie w 20 ml mieszaniny 5:1:1 metanolu, kwasu octowego i wody, roztwór ten zadaje sie 0,6 g 10% katalizatora palladowego na nosniku z wegla aktywnego i energicznie mieszajac przepuszcza sie przez mieszanine gazowy wadór w ciagu 20 godzin. Ro zakonczeniu tej re¬ akcji katalizator usuwa sie droga saczenia i przemywa taka sama mieszanina rozpuszczalnikowa, polaczony z ciecza myjaca przesacz odparowuje sie do sucha i zadaje kilka¬ krotnie mieszanina etanolu i wody oraz ponownie odparo¬ wuje do sucha. Pozostalosc ostatecznie rozciera sie z mie¬ szanina 1:1 etanolu i eteru etylowego- oraz odsacza. Otrzy¬ muje sie ta droga 01,7 g- (73% wydajnosci teoretycznej) LDD Z-d 2, z. 20 wolnego estru osmiopeptydu, który nastepnie oczyszcza sie wyzej omówionymi metodami oczyszczania. Czysty ester (sarkozyno1, alaninometylowy**)-angiotensyny-II wy¬ kazuje nastepujace wlasciwosci charakterystyczne: RfW= 5 ±=0,23, Rf(«)=0,54, Rf0=0,27; Analiza aminokwasów wykazuje: His 0,97 (1), Arg 1,03 (1), Pro 1,06 (1), Val 1,03 (1), Ile 0,9&(1), Tyr 0,6 (1), Sar 1,0(1). io Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych, antagonizujaco wzgledem angiotensyny-II dzialajacych estrów osmiopeptydu o ogól¬ nym wzorze: X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y-OA, w którym 15 X oznacza grupe acylowa N-metyloaminokwasów, zwlasz¬ cza grupe sarkozylowa, albo grupe acylowa alifatycznego- kwasu karboksylowego, zawierajacego w poloieniu-a grupe aminoksylowa lub hydroksylowa, Y oznacza reszte alifa¬ tycznego aminokwasu, a A oznacza crupe alkilowa o 1^5 20 atomach wegla, oraz, soli addycyjnych z kwasami i farmako¬ logicznie dopuszczalnych kompleksów tych estrów pepty- dowych, znajiuniiy tyi% ta, od zabezpieczonej pochodnej estru osmiopeptydu o ogólnym wzorze: ?-X-Arg(C)-Val- -Tyr(D)-ne-Hi^(E)^Pro-Y-OA,w którym B oznacza grupe 25 odszczepialna przez hydrolize kwasowa lub hydrogeno- lize katalityczna, zwlaszcza grupe benzyloksykarbonylowa lub Ill-rz.-butyloksykarbonylowa, C oznacza zabezpiecza¬ jaca grupe odpowiednia do przejsciowego zabezpieczenia grupy guanidynowej skladnika Arg, zwlaszcza grupe ni- 30 trqwa lub p-toluenosulfonowa, D oznacza zabezpieczajaca grupe odpowiednia, do przejsciowego zabezpieczenia aro¬ matycznej grupy hydroksylowej skladnika Tyr, zwlaszcza grupe benzylowa lub podstawiona grupe benzylowa, E oznacza zabezpieczajaca grupe odpowiednia do przejscio- 35 wego zabezpieczenia grupy imidazolu skladnika His, zwlasz¬ cza grupe dwunitrofenylowa, a A, X i Y maja znaczenia wyzej podane, selektywnie odszczepia sie etapami lub w jed¬ nym etapie grupy zabezpieczajace i otrzymany zwiazek ewentualnie przeprowadza sie w sól addycyjna z kwasem 40 lub w farmakologicznie dopuszczalna pochodna komplek¬ sowa. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przy¬ padku wytwarzania estrów osmiopeptydu, zawierajacego alifatyczna grupe a-aminoksyacylowa zamiast rodnika X, 45 stosuje sie jako substrat zabezpieczony ester osmiopeptydu zawierajacy równiez alifatyczna grupe a-aminoksyacylowa zamiast rodnika X, a odszczepianie zabezpieczajacej grupy B, oraz ewentualnie innych, przeprowadza sie zwlaszcza przez traktowanie kwasem fluorowodorowym. 50 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania estrów osmiopeptydu, zawierajacego alifaty¬ czna j^upea-hydroksyacylowa zamiast rodnika X,stosujesie jako substrat zabezpieczony ester osmiopeptydu zawierajacy alifatyczna grupe a-aminoksyacylowa, a odszczepianie 5* zabezpieczajacej grupy B, oraz ewentualnie- innych, prze¬ prowadza sie przez uwodornienie katalityczne w warunkach równoczesnego odszczepienia aminowej grupy rodnika a-aminoksyacylowego. 100/85/1, n. 85+20 egz. 100 zl PL PL PL