CS217987B2

CS217987B2 - Method of making the antiangiotensines-ii antagonistically operating octapeptidestere

Info

Publication number: CS217987B2
Application number: CS81173A
Authority: CS
Inventors: Olga Nyeky; Lajos Kisfaludy; Egon Karpati; Laszlo Szporny
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1980-01-18
Filing date: 1981-01-08
Publication date: 1983-02-25
Also published as: IN153212B; FI72732B; SU1041030A3; PL229244A1; PH16791A; DD156968A5; US4388304A; ATE13740T1; YU9281A; IL61923A; IL61923A0; FI810122L; ES498582A0; FI72732C; CA1156222A; HU181009B; EP0034259A1; JPS56138155A; AU6627781A; NO810150L

Description

Vynález se týká způsobu výroby proti angiotensinu-II 'antagonisticky působících oktapeptidesterů obecného vzorce I

X—Arg—Val—^^—Ile—Hi-s—Pro—Y—OA, í (I) ve kterém

X znamená a-hydroxyace-tylovou, a-hydroxypropionylovou, a-aminoaxyacetylovou, «-.aminchoxypropiOnylovou nebo- sarkosylovou skupinu,

Y znamená isoleucylový, alanylový, threonylový nebo O-methylthreonylový zbytek, a

A znamená methylovou skupinu, a jejich adičních solí s kyselinami a farmaceuticky použitelných komplexů.

První analog angiotensinu-II, který působil jak in vitno, tak in vivo jako specifický kompetitivní inhibitor angiotensinu-II, byl popsán v roce 1970 [viz G. R. Marshal a spolupracovníci, ' Proč. Nat. Acad. Sci. USA 67, 1624 (1970); P. A. Khairallah a spolupracovníci, J. Med. Chem. 13, 161 (1970)].

Tento- nález dal podnět k -dalšímu rozšířenému výzkumu, který vedl k četným dalším podobným -antagonisticky působícím analogům angiotensinu-II. Uvedené produkty umožňují provádět diagnosy -a popřípadě i terapeutické léčení určitých hypertenzí závislých na reninu. Z řady tímto způsobem připravených antagonisticky působících sloučenin byl již (Sar1, Ala⁸)-angiotensin-II zaveden pod názvem Saralasin do· prodeje [viz D. T. Pals a spolupracovníci, Circ. Res. 29, 673 (1971)]; tento preparát se během klinického zkoušení -osvědčil jako vhodný prostředek k -diagnose [G. Bonner a spolupracovníci, Ditsch. Med. Wschr. 104, 432 (1979) ],

B—X—Arg( C) —Val—Tyr (D) — ve kterém

B znamená skupinu odstranitelnou acidolýzou nebo katalytickou hydrogenací, zvláště skupinu benzyloxykarbonylovou nebo terc.bútylo-xykarbonylovou,

C znamená chránící -skupinu vhodnou k dočasnému chránění guanidinové skupiny largininu, zvláště nitroskupinu nebo tosylovou skupinu,

D -znamená chránící -skupinu ' vhodnou k přechodnému chránění aromatické hydroxyiové skupiny tyrosinu, zvláště benzylovou, popřípadě substituovanou benzylovou skupinu,

E znamená chránící skupinu vhodnou k dočasnému chránění imidazolové skupiny histidinu, zvláště -dinitrofeny lovou skupinu a

A, X a Y mají shora uvedený význam, selektivně, buď postupně, nebo v jednom stupni, odstraní chránící skupiny a získaná sloučenina -obecného vzorce I se popřípadě převede na příslušnou adiční sůl -s kyselipopřípadě k terapeutickému léčení -[J. L. M-arx: Science 194, 621 (1976)] hypertenzí různého původu. Nedávno -bylo nalezeno, že antagonisté angiotensinu-II jsou rovněž vhodní k léčení srdeční - nedostatečnosti, vzniklé jako důsledek renovaskulární hypertenze [H. Gavras a -spolupracovníci, JAMA 236, 660 (197'7)].

Výzkum vztahů mezi strukturou a biologickou Účinností dosud připravených analogů angiotensinu-II poskytl rovněž užitečné informace k objasnění jejich agonistického- a antagonistického účinku. V popředí současného výzkumu stojí příprava takových antagonistů, které by vykazovaly delší biologické poločasy a - neměly -žádné nežádoucí vedlejší účinky, jako- například počáteční -agonistickou účinnost po aplikaci.

Autoři vynálezu nyní neočekávaně nalezli, že účinné kompetitivní inhibitory angiotensinu-II lze připravit tím způsobem, že se fenylalanin přítomný v poloze δ molekuly angiotensinu-II nahradí - -alifatickou aminokyselinou, do- polohy 1 molekuly se vestaví N-mOthylaminokysellna nebo α-hydroxy-, popřípadě a-aminooxykarboxylová kyselina a dále, že -se C-terminální karboxylová skupina molekuly zesterifikuje alkylovou skupinou s 1 až 5 atomy uhlíku. Tímto způsobem získané kompetitivní inhibitory ángiotensinu-II -snižují- podstatným způsobem hypertenzi vyvolanou angiotensinem-II a vykazují tuto účinnost i při - subkutánním podání.

Podstata výroby oktiapeptidesterů shora uvedeného -obecného vzorce I způsobem podle -vynálezu je v tom, že se z chráněného derivátu -oktapeptide-steru obecného vzorce II i—His- (E) —Pro—Y—OA (Π) nou nebo na farmaceuticky použitelný komplexní derivát. .....

Deriváty oktapept-idu:. obecného vzorce II, které se při shora - uvedeném postupu - používají jako výchozí látky, ' lze připravovat - libovolnými metodami peptidové -chemie, například způsobem -popsaným- v maďarském patentu č. - 166 431, - - tj. acylací - příslušných esterů - - aminokyselin pentafluorfenylestery aminokyselin - nebo peptidů,- .'chráněných - na N-terminální ' aminoskupině. ' Přitom se k chránění postranních funkčních skupin s- výhodou používá takových chránících skupin, které - jsou - po provedení zmíněné acylace stabilní za podmínek acidolýzy prováděné k odstranění N-chránicí -skupiny.

Podle výhodného způsobu provedení -tohoto postupu se deriváty -oktapeptidu obecného vzorce II syntetizují postupně ' z jednotlivých aminokyselin. Může se ale postupovat rovněž tak, že -se předem připravená,

6 vhodně chráněná část peptidu acyluje najednou druhým, rovněž již předem připraveným fragmentem peptidu. Tento způsob provedení lze například s výhodou používat při výrobě peptidů obsahujících v poloze 1 zbytek a-aminokyseliny. К dočasnému chránění amiiroskupin jednotlivých aminokyselin nebo aminokyselinových derivátů se při obou pracovních postupech s výhodou používá takových chránících skupin, které se později dají snadno odstranit acidolýzou; pro uvedené účely je zvláště vhodná terciární butyloxykarbonylová skupina.

Po provedení syntézy chráněného oktapeptidesteru obecného vzorce II se z něho podle vynálezu odštěpí chránicí skupiny. Přitom ise účelně postupuje tak, že se nejdříve odštěpí z histidinu dinitrofenylová chránicí skupina thiolysou, výhodně působením 2-merkaptoethaniolu. Zbývající přítomné chránicí skupiny se pak mohou s výhodou odštěpit v jednom reakčním stupni, a to buď acidolýzou, účelně působením kyseliny fluorovodíkové, nebo katalytickou hydrogenolýzou, například za použití paládia na aktivním uhlí jako katalyzátoru.

Má-li se však vyrobit sloučenina obecného vzorce I, ve kterém v poloze X má být alifatická acyl-ová skupina obsahující a-aminooxyskupinu, musí se chránicí skupiny odpovídajícího¹ chráněného oktapeptidesteru obecného vzorce II odstraňovat pouze acidolýzou, například působením kyseliny fluorovodíkové na chráněný oktapeptidester znaveny dinitrofenylové chránicí skupiny. Při katalytické hydrogenaci se totiž současně s α-aminooxyacylové skupiny umístěné v poloze X molekuly peptidu odštěpuje aminová skupina za vzniku odpovídajícího a-hydroxyacylového zbytku. V souhlase s tím lze sloučeniny obecného, vzorce I, ve kterém X značí alifatický α-hydroxyacylový zbytek, vyrábět z odpovídajících chráněných oktapeptidesterů obecného vzorce II, ve kterém X značí a-aminooxyacylový zbytek tím způ sobem, že se chránicí skupiny peptidu odstraní katalytickou hydrogenaci, za současného odštěpení aminoskupiny ze zbytku X.

Nové sloučeniny obecného vzorce I lze čistit známými způsoby, například chrom atogriafií na iontoměmčích, jako na kiarboxymethylcelulóze. Oktapeptidestery obecného vzorce I se účelně vyrábějí ve formě lyofilizovaných prášků, která se potom velmi dobře hodí к výrobě různých terapeutických přípravků.

Antagonistický účinek sloučenin obecného vzorce I vůči angiotensmu-II byl zkoušen na narkotizovaných kočičích samcích. Při testování byly bloudivé nervy (vagus nervus) zvířat na obou stranách krku přestřiženy a po blokování ganglion byl zvířatům podán Hypertensin (Ciba) ve formě infuse o rychlosti 0,5 ₍ug/kg/min. Po stabilizování zvýšeného krevního tlaku byla zvířatům aplikována intravenosně nebo podkožně zkoušená látka ve fyziologickém roztoku chloridu sodného nebo v roztoku vhodného nosiče, například karboxymethylcelulosy nebo želatiny. Pokles krevního tlaku způsobený aplikací testované látky byl zaznamenán v Pa a vyjádřen v procentech počátečního krevního tlaku, změřeného před podáním látky. Statistické vyjádření výsledků měření bylo prováděno na základě Studentova „t“ testu. Za dobu trvání účinku jednotlivých testovaných látek byla považována doba, která uplynula od aplikace sloučeniny až к poslednímu ještě signifikantně pozorovatelnému poklesu krevního tlaku (p = 5 proč.). Výsledky testování získané uvedeným způsobem jsou shrnuty dále v tabulce. Jako srovnávací látka byl při testování používán známý a jako anťagonista angiotensinu-II v terapii již používaný Saralasin, tj. (Sar¹, Ala⁸)angiotensin-II; výsledky, dosažené se Saralasinem za stejných podmínek jako při testování sloučenin podle vynálezu jsou rovněž v tabulce uvedeny.

L0 rH

O O CQ

TABULKA

Účinek analogů angiotensinu-II obecného vzorce I 'Obsahujících v poloze 8 zbytek esteru alifatické aminokyseliny na krevní tlak kočičích samců

Účinná sloučenina Způsob aplikace « i. v. s. c. (NaCl) s.c. (CMC) s. c. (žel.) fl

Cl fl

LO oo

CD

CO o in

CQ

CM

LD o o CM

O O CM

CM CM

CM CM rH rH rH·

CO tx

O O O LD o CO rH

LD

O LD

LD

CM

CM oo

CD CM oo ω S O

CQ CM

Λ O 'cb

O m χφ — CM

LD LD χφ

XP

LD CM o

CM tx CM

LD tx

LD

O O O LD oo CM CO rH

O 00 CM rH tx co

CD CD

CD CM

CD

O

CM fl ti s ω

>N

LD O XT CD

CO OO CM CM

ID Οχ

O O O o rH CM

O

CO

CM

CM tx

Q o-Xfl rH CM CM

O CD ώ fl i

Φ s o

I oo rH

Xti

CM xt<

řx CM

Xt<

O

CM

O LD CD хф

CD Φ CM CM

CD LD

O o O o rH CM

LD

CM co

CD >x

N Ю fl a . .

Φ fl U Ю > 'Cl -fl cd €

Φ £ o s cd Д1 fl O

Ch >

SŠ cd ей

X© fl o Си

O

2 t-H	fl v—<	Сн гн rj	fl
Ch fl	Ch fl	flS fl У Ен	tí N
CO	CO	йК в	O
X—7	’—'		CM

fl ·<—i

4-J fl

Φ >N

O

Ch

4-J 'cd

4-»

ÍM O ÍH

Z dat uvedených v tabulce je zřejmé, že nové sloučeniny obecného vzorce I mají významný účinek na snižování krevního tlaku, z čehož dále vyplývá, že náboj C-terminální karboxylové skupiny není žádnou nutnou podmínkou pro zmíněnou účinnost. Významný je i nález, že uvedené sloučeniny jsou účinné i při podkožním podání; v roztocích některých nosičů bylo v četných případech dosaženo doby trvání účinku až několika hodin.

Nové oktapeptidestery obecného vzorce I vyrobené způsobem podle vynálezu se mohou popřípadě převádět obvyklými metodami na terapeuticky použitelné adiční soli (s kyselinami, popřípadě na komplexy. Pod pojmem „terapeuticky použitelné komplexy“ se rozumí takové sloučeniny peptidů podle vynálezu, které vznikají přidáním některých organických nebo anorganických sloučenin к peptidům a vykazují protrahovanoiu účinnost. Jako příklad pro tento účel vhodných organických sloučenin lze uvést želatinu, karboxymethylcelulczy, estery kyseliny alginové, polyfloretinfosfáty, aminokyselinové polymery a kopolymery a podobné. Jako anorganické sloučeniny přicházejí v úvahu hydroxidy, popřípadě těžko rozpustné soli, například fosforečnany některých kovů, zvláště zinku.

Nových oktapeptidesterů obecného vzorce I a jejich adičních solí s kyselinami a komplexů lze při léčení používat ve formě obvyklých terapeutických přípravků. Uvedené terapeutické přípravky obsahují jako vzorce I a jako pomocné látky anorganické nebo organické nosiče vhodné pro enterální, popřípadě parenterální podávání. Zmíněné přípravky lze vyrábět buď ve formě pevných lyofilizáitů, které jako nosiče obsahují farmaceuticky vhodné a s peptidy nereagující pevné látky, například sacharidy, anebo ve formě zředěných nebo koncentrovaných suspenzí nebo emulzí, které vedle účinné látky mohou popřípadě obsahovat i konzervačně nebo stabilizačně působící pomocné látky.

Terapeutické přípravky obsahující oktapeptidestery obecného vzorce I lze vyrábět obvyklými farmaceutickými metodami a lze jich používat к diferenčním diagnosám hypertenzí různého původu a dále v terapii к normalizování hypertenzí renálního původu, při hypertenzních krizích, v případě sekundární srdeční insuficience a podobně.

Terapeutické přípravky se s výhodou vyrábějí ve formě injekcí obsahujících 1 až 10 mg účinné látky. Denní dávka oktapeptidesterů obecného vzorce I činí u dospělých nemocných 1 až 10 mg. Toto množství se výhodně podává najednou, a to intravenózně, podkožně, intramusk-ulárně nebo ve formě pomalé intravenózní infúze.

Způsob podle vynálezu je blíže objasněn dále v příkladech provedení, které však rozsah vynálezu žádným způsobem neomezují.

V příkladech používané zkratky aminokyselin, chráničích skupin a dalších látek odpovídají v literatuře obecně používaným zkratkám [viz J. Biol. Chem. 247, 977 (1972)]. Dále jsou používány následující zkratky:

HOAA = hydroxyoctová kyselina;

O Ala = a-aminooxypropionová kyselina;

OGly = aminiooxyoctová kyselina;

Pfp = pentafluorfenyl.

Při přípravě sloučenin obecného vzorce I a jejich meziproduktů se rozpouštědla vesměs odpařují na rotační vakuové odparce. Ke stanovování teploty tání sloučenin se používá přístroj podle dr. Tottolibo. Tenkovrstevná chromatografie se provádí na deskách silikagelu (podle Stahla). К vyvíjení chromatogramů se používají směsi rozpouštědel:

(1) ethylacetát : (pyridin : kys. octová :

: voda 20 : 6 : 11) v poměru 98 : 2, (2) ethylacetát: (pyridin : kys. octová :

: voda 20 : 6 : 11) v poměru 95 : 5, (3) ethylacetát: (pyridin : kys. octová : : voda 20 : 6 : 11) v poměru 90 : 10, (4) ethvlacetát: (pyridin : kys. octová : : voda 20 : 6 : 11) v poměru 80 : 20, (5) ethylacetát: (pyridin : kys. octová : : voda 20 : 6 : 11) v poměru 70 : 30, (6) ethylacetát: (pyridin : kys. octová : : voda 20 : 6 : 11) v poměru 60 : 40, (7) 1-butanol : kyselina octová : voda v poměru 4:1:5, (8) 1-butanol: kyselina octová : pyridin :

: voda v poměru 30 : 6 : 20 : 24, (9) 1-butanol : ethylacetát : kyselina octová : voda v poměru 1:1:1:1a (10) ethylacetát : (pyridin : kyselina oetová : voda 20 : 6 : 11) v poměru 75 : :25.

Detekce skvrn se provádí ninhydrinem, popřípadě chlortolidinem a jodidem draselným.

К čištění konečných produktů se používá tato obecná metoda:

Roztok 0,4 g volného peptidu ve 4 ml 0,01 M roztoku octanu amonného se nanese na sloupec připravený z 0,5 litru karboxymethylcelulózy (CMC-52), promytý předem až do rovnovážného stavu shora uvedeným pufrem octanu amonného.

Eluce sloupce se provádí gradientovou elucí, za použití 1,5 litru 0,01 M a 1,5 litru 0,4 M roztoku octanu amonného, které se na sloupec přivádí přes gradientní mísič, při rychlosti proudění 25 ml za hodinu; jímají se frakce po 10 ml. Eluát vytékající ze sloupce se kontinuálně hodnotí v ultrafialovém světle. Hlavní frakce, zjištěná pomocí získané křivky, se zlyofilizuje a získaný produkt se popřípadě rechromatografuje, iznovu za použití gradientové eluce.

Výroba nových analogů angiotensinu-II je blíže objasněna dále v příkladech provedení.

Příklad 1 (Siarkosini, rsoleucin-methylester⁸) -angioteinsin-II

Stupeň 1

Boc—Arg( NOa) — Val—Tyr (Bzl] —Ile-Hls(D-np] —Pro—Ile—OMe

K roztoku 1,36 g (7,5 mmolů) Ile—OMe . . HC1 ve 30 ml chloroformu se přidá 1,05 ml triethylaminu a 1,90 g (5 ' mmolů) Boc— —Pro—OPfp. Směs se nechá stát 30 minut při konstantně udržované hodnotě pH, pak se promyje vodou, 10% vodným roztokem kyseliny citrónové a posléze opět vodou, roztok se vysuší bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří k suchu. Ve formě odparku získaný chráněný dipeptid (Rf (1) = = 0,8] se ihned rozpulstí v 5 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá 15 minut stát, zředí se 20 ml bezvodého etheru a rozpouštědla se oddestilují. Ve formě odparku získaný volný dipeptidhydrochlorid [Rf (5) = 0,46] se ihned rozpustí ve 30 ml chloroformu, pH hodnota roztoku se upraví triethylamínem na 8 a přidá se 4,36 g [7,5 mmolů) Boc-His(Dnp)—OPfp. Reakční směs se nechá stát jednu hodinu, pak se přidá 0,83 ml N,N-dimethylaminoethylaminu, směs se nechá 10 minut stát, promyje se 10% roztokem kyseliny citrónové nasyceným chloridem sodným, 1N roztokem kyseliny chlorovodíkové, 5% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou v uvedeném pořadí, roztok se vyisuší bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se oddestiluje. Ve formě odparku získaný chráněný tripeptid [Rf (2) = 0,45] se bez čištění rozpustí v 10 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá 15 minut stát, pak se · přidáním bezvodého etheru vysráží hydrochlorid volného tripeptidu a sraženina se _ odfiltruje a ' promyje. Získaný hydrochlorid '· volného tripeptidu [Rf (5) = 0,30] se · ihned rozpustí v 15 · ml dimethylformamidu, pH roztoku se upraví · triethylamínem na hodnotu · 8 a přidá· se 2,4 g (6 mmolů) Boc—Ile—OPfp. Roztok se nechá stát 30 minut při konstantně udržovaném · pH, pak se· rozpouštědlo oddestiluje, odparek se rozpustí v ethylacetátu, roztok · se promyje 10%' vodným roztokem kyseliny citrónové, IN roztokem ·kyseliny· chlorovodíkové . a posléze · vodou, roztok se vysuší bezvodým síranem sodným · a rozpouštědlo se odpaří. Odparek se rozetře se směsí etheru s hexanem 1:9 a · pevná látka ·· se odfiltruje. Tímto způsobem získaný · chráněný tetriapeptid (R_f (2) = 0,31] · se rozpustí v 7 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá · 15 minut stát a pak se produkt vysráží přidáním · bezvodého· etheru · a odfiltruje ise. Tímto způsobem získaný hydrochlorid volného tetirapep-tidu (R_f (5] = 0,38] se · rozpustí ve směsi 20 ml chloroformu s 10 ml dimethylformamidu, pH roztoku se upraví triethylaminem na hodnotu 8 a přidá se · 2,96 g (5,5 mmolů) Boc—Tyr(Bzl)—OPfp. Roztok se nechá siiát 15 minut při pH udržovaném na konstantní hodnotě a rozpouštědlo se odpaří. Odparek se rozpustí v ethylacetátu, k roztoku se přidá 0,22 ml N,N-dimethylaminoethylaminu, směs se nechá stát 10 minut, pak se promyje 10% roztokem vodné kyseliny citrónové, 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové a nakonec vodou, organický podíl se vysuší bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se oddestiluje. Odparek se rozetře s bezvodým etherem a pevná · látka se odfiltruje. Získaný chráněný pentapeptid (Rf (2) = 0,52] se rozpustí v 10 ml 8 N rdztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, po 15 minutách stání se produkt vysráží přidáním bezvodého etheru, odfiltruje a promyje etherem. Tímto způsobem získaný hydrochlorid volného pentapeptidu (Rf (5) = 0,8] se ihned rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu, pH roztoku se upraví triethylamínem na hodnotu 8 a přidá se 2,3 g (6 mmolů) Bioc—Val—OPfp. Smě se nechá stát jednu hodinu při pH udržovaném na konstantní hodnotě, pak se rozpouštědlo odpaří, odparek se rozpustí v chloroformu, roztok se promyje 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové a nakonec vodou, vysuší se bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se oddestiluje. Odparek se rozetře s bezvodým etherem a produkt se odfiltruje. · Získaný chráněný hexapeptid (Rf (2) = 0,43] se ihned · rozpustí v 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá 15 minut stát, pak se produkt vysráží· přidáním bezvodého etheru, odfiltruje se a promyje. Získaný hydrochlorid volného hexapeptidu se ihned rozpustí v 15 ml dimethylformamidu, pH roztoku se upraví triethylaminem na hodnotu 8 a přidá se 2,6 g (6· ·mmolů Boc—Arg(NO2)—OPfp. · Roztok se nechá stát 30 minut při pH udržovaném na konstantní hodnotě, pak se přidá 45 ml chloroformu ·· a · směs se promyje IN roztokem · kyseliny · chlorovodíkové · a vodou. Po vysušení · bezvodým · síranem sodným a po oddestilování rozpouštědel se odparek rozetře iis ethylacetátem a produkt · se odfiltruje. Tímto způsobem se získá 3,3 g chráněného heptapeptidu Boc—Arg(NO2) — —Val—Tyr (Bzl )—Ile—His (Dnp) —Pro— —Ile—OMe (Rf (3) · = 0,37]; toto · množství odpovídá · výtěžku 51 % teorie, počítáno· na Boc—Pro—OPfp, z čehož vyplývá průměrný·· výtěžek v jednotlivých reakčních krocích 90· · %.

Stupeň· 2

Z—Sar—Arg( NO2) — Val—Tyr (Bzl·)—Ile— —His · ( Dnp.)—Pro—Ile—OMe

3,3 g (2,5 mmolů) Boc—ArgfNOž] —

017987 —Val—Tyr (B’Z1 )—Ile—His( Dnp ) —Pro—. —Ile—OMe se rozpustí v ' 15 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá .stát 20 minut při teplotě místnosti a pak se přidá bezvodý ether; vyloučený produkt se odfiltruje a promyje etherem. Získaný hydrochlorid volného heptapeptidu [Rf (5) = 0,7] se ihned rozpustí v 15 ml dimethylformamidu, pH roztoku se upraví tríethylamnem na hodnotu 8 a přidá se 2,4 g (6 mmolů) Z—Sanr—OPfp. Směs se nechá stát 30 minut při pH udržovaném na konstantní hodnotě, pak se přidá 45 ml chloroformu, roztok se promyje 1N roztokem kyseliny chlorovodíkové a vodou, vysuší se bezvodým síranem sodným .a rozpouštědla se oddestilují. Odparek se rozetře s ethanolem a produkt se odfiltruje. Tímto způsobem se získá 3,17 g chráněného oktapeptidu . Z—SaT—Arg(NO2)—Val—Tyr(Bz^ll) — —Ile—His( Dnp) —Pro—Ile—OME '(výtěžek 89 % teorie); teplota tání 197 až 209 °C, Rf (4) = 0,82.

Stupeň 3

Odstranění chránících skupin

K roztoku 2,59 g (1,83 mmolu) Z—Sar— —Arg (NOg) —Val—Tyr (Bzl )—Ile—His(Dnp)—Pro—Ile—OMe v 5 ml dimethylformamidu se přidá 4,6 ml 2-mer.kaptoethanolu. Reakční směs se 1,5 hod:ny míchá, pak se přidá bezvodý ether a vyloučený produkt se odfiltruje. Získají se 2,0 g chráněného oktapeptidu, který však již neobsahuje dinitrofenylovou chránící skupinu; R_f (4) = 0,42, výtěžek 87 % teorie. Získaný produkt se rozpustí ve směsi methanolu, kyseliny octové a vody v poměru 5:1: 1, k roztoku se přidá 1,0 g 10% paládia na aktivním uhlí a . do .roztoku se z.a intenzivního míchání uvádí po dobu 20 hodin plynný vodík. Po skončení reakce se katalyzátor odfiltruje, promyje stejnou směsí rozpouštědel a ze spojených filtrátu se oddestilují rozpouštědla. Odparek se rozmíchá s vodným ethanolem, směs se odpaří k suchu a tato operace se ještě jednou opakuje. Posléze se odparek rozetře s bezvodým etherem, produkt se · odfiltruje a vysuší. Tímto způsobem, se získá 1,56 g methylesteru volného oktapeptidu (výtěžek 98 % teorie). Tento surový produkt se čistí shora popsaným částicím postupem.

Získaný (Sairkosin1, isoleucin-methylester⁸ )-ang^;.Otensin-II vykazuje charakteristické vlastnosti:

• Rf (7) = 0,19,

Rf (8) = 0,59, Rf (9) = 0,38, E_g1u (pH = 1,9): 1,00.

Aminokyselinová analýza:

Pro 1,07 (1),

Val 1,1 (1), Tyr 0,8 (1),

His - 1,03 (1),

Arg 1,0 (1),

Ile 1,87 (2),

Sar 1,0 (1).

Příklad 2 (Hydroxyacetyl¹, isoleucin-methylester8) -angiotensin-II

Stupeň 1

Z—OGly—Arg( NO2) — Val—Tyr (Bzl) — —Ile—His-( Dnp) —Pro—Ile—OMe

1,5 g (0,8 mmolu) Boc—Arg(NO2) — —Val—Tyr (Bizl) —Ile—Hls( Dnp) —Pro— —Ile—OMe (vyrobeného způsobem popsaným v příkladu 1, stupeň 1) se rozpustí . v 6 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, směs se nechá stát 20 minut při teplotě místnosti, pak se přidá bezvodý ether a vyloučený produkt se odfiltruje. Získaný hydrochlorid volného heptapeptidu [Rf (5) = 0,7] se ihned rozpustí . v 10 . ml dlmethylformamidu, ·pH roztoku se upraví ' triethylaminem na hodnotu 8 a přidá se 0,46 g (1,17 mmolu) Z—OGly—OPfp. Směs se ’ nechá stát 30 minut, pak se přidá 30 . ml chloroformu, roztok se promyje 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové a nakonec · vodou,. vysuší bezvodým síranem sodným a rozpouštědla se oddestilují. Odparek se rozetře s etherem a produkt se odfiltruje. Tímto způsobem se získá 1,05 g chráněného okktapeptidu ' Z—OGly—Arg(NO2) — Val— —Tyr( Bzl) —Ile—His (Dnp) —Pro—He— — OMe (výtěžek 93 % teorie); teplota tání 140 až 145 °C, Rf (3) = 0,24.

Stupeň 2

Odstranění chránících skupin

K roztoku 1,05 g (0,74 mmolů) Z—OGly— —Ar.g(NOz)—Val—Tyr(Bzl )—Ile—H:is(Dnp)—Pro—Ile—OMe v 5 ml dimethylformamidu se přidá 2,3 ml 2-merkaptoetha.nolu. Směs se nechá stát 1,5 hodiny při teplotě místnosti, pak se přidá bezvodý ether, vysrážený produkt se odfiltruje a promyje etherem. Tímto způsobem se získá 0,85 g chráněného oktapeptidu, který však již neobsahuje chránící dinitrofenylovou skupinu; výtěžek 85 % teorie, Rf (4) =0,40. K roztoku 0,75 g (0,6 ' mmolů) uvedeného produktu ve 20 ml směsi methanolu, kyseliny octové a vody v poměru 5:1:1 se přidá 0,8 g 10% pa^di-a na aktivním uhlí a do směsi se za intenzivního· míchání uvádí po dobu 18 hodin plynný vodík. Po. skončení reakce .se katalyzátor odfiltruje, promyje stejnou směsí rozpouštědel, prcmývací kapalina se spojí s prvním filtrátem a rozpouštědla se .odpaří k suchu. Odparek se několikrát rozmíchá .s vodným ethanolem a směs se odpaří k suchu, . pak se látka rozmíchá s bezvodým etherem, produkt se odfiltruje . a vysuší. Tímto způsobem se získá 0,48 g methylesteru volného· oktapeptidu (výtěžek 82 %· teorie). Surový produkt ' se čistí .shora popsanou obecnou čisticí metodou. Čistý produkt vykazuje tyto· charakteristické vlastnosti:

Rf (7) = 0,29,

Rf (8) = 0,72,

Rf (9) = 0,60.

Aminokyselinová analýza:

Pro· 1,0 (1),

Val 1,0 (1],

Ile 1,7 (2),

Tyr 0,88 · (1), His 1,02 (1), Arg 0,96 (1).

Příklad 3 (L-a-aminooxypropionová kyselina¹, isoleucin-methyleister⁸) angiotensin-II

Stupeň 1

Boc—Arg (Tos) — Val—Tyr (Bzl ) — Ile— —Hrs'( Dnp) — Pro—OBzl

K roztoku 2,9 g (12 mmolů) Pro—OBzl. . HC1 v · 50 ml chloroformu se přidá 1,68 ml triethylaminu a 5,87 g (10 mmolů) Boc— —His'(Dnp)—OPfp. Roztok se míchá jednu hodinu při pH udržovaném na konstantní hodnotě, pak se promyje v dávkách po 25 ml a v uvedeném pořadí 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, 1 N roztokem kyseliny · chlorovodíkové, 5% vodným roztokem hydrognuhliičrtanu . sodného a vodou, vysuší se bezvodým .síranem sodným a rozzetře s n-hexanem a produkt se odfiltruje. Získaný chráněný dipeptid [Rf (3) = 0,80] se rozpustí ve 13 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu a po 15 minutách stání se přidá bezvodý ether, vyloučený produkt se odfiltruje a promyje etherem. Tímto způsobem získaný hydrochlorid volného dipeptidu [Rf (4j = 0,24] se ihned rozpustí ve 30 ml dimethylformamidu, pH roztoku se upraví triethylaminem na hodnotu 8 a přidá se 4,7 g (12 mmolů) Boc—Ile—OPfp. Reakční směs se nechá stát jednu hodinu při pH . udržovaném na konstantní hodnotě, pak se rozpouštědlo oddestiluje, odparek se rozpustí v chloroformu a roztok se promyje v uvedeném pořadí 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové, 5% vodným roztokem . hydrogenuhličitanu sodného a vodou, vysuší se bezvodým . síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří. Odparek se rozetře se směsí etheru s n-haxanem v poměru 1:2a produkt se odfiltruje. Získaný chráněný tripeptid [R_ř(3)= 0,82) se rozpustí v 15 ml 8N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá stát 15 minut, pak se přidá bezvodý . ether, vyloučený podukt se odfiltruje a promyje etherem. Získaný hydrochlorid volného. tripeptidu [Rf (5) = 0,38] se ihned rozpustí v . 50 ml dimethylformamidu, pH roztoku se upraví triethylaminem na . hodnotu 8 a přidá se 5,9 g (11 mmolů) Boc— —T^i’(B^l)—OPfp. Roztok se nechá stát 30 . minut při konstantně udržovaném pH, pak se rozpouštědlo oddestiluje, .odparek se rozpustí v ethylacetátu, k roztoku se přidá 0,22 ml N,N-dimethylaminoethylaminu a směs se nechá 15 minut stát. Pak se roztok promyje 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové a nakonec vodou, vysuší se bezvodým . .síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří. Odpairek se rozetře s etherem a produkt se odfiltruje. Tímto způsobem získaný chráněný tetrapeptid [R_ř (3) . = 0,73] se ihned rozpustí ve 20 ml roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, po 15 minutách stání se k roztoku přidá bezvodý ether, vyloučený produkt se odfiltruje a promyje etherem. Získaný hydrochlorid volného tetrapeptidu [R_ř (5) = 0,69] se ihned rozpustí v 50 ml dimethylformamidu, pH roztoku se upraví triethylaminem na hodnotu 8 a přidá se 4,2 g (11 mmolů) Boc—Val—OPfp. Roztok se nechá stát jednu hodinu za udržování pH na konstantní hodnotě, pak se rozpouštědlo oddestiluje, odparek se rozpustí v . ethylacetátu, roztok se obvyklým způsobem promyje, vysuší a .odpaří. . Odparek .se rozetře s n-hexanem .a pak s bezvodým etherem a produkt se odfiltruje. Získaný chráněný pentapeptid [Rf (3) = 0,65] se rozpustí ve 20 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá 15 minut stát, pak se zředí bezvodým etherem a vysrážený produkt se odfiltruje a promyje. Tímto .způsobem získaný hydrochlorid volného pentapeptidu [Rf (5) = 0,57] se ihned rozpustí v 60 ml dimethylformamidu, pH roztoku se upraví triethylaminem na hodnotu 8 a přidá se 5,94 g (10 mmolů) Boc—A-rg(Tos.)—OPfp. Roztok se nechá stát jednu hodinu při pH udržovaném na konstantní hodnotě, pak se rozpouštědlo oddestiluje, odparek se rozpustí v chloroformu, roztok se promyje v níže uvedeném pořadí 10% roztokem vodné kyseliny citrónové, 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové, 5% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou, vysuší se bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se .oddestiluje. Odparek se rozetře s bezvodým etherem a produkt se .odfiltruje. Uvedeným . způsobem se získá 5,8 g Boc—Arg(Tos)—Val—Tyr(Bzl) —Ile-His(Dnp) —Pro—OBzl [Rf (3j rovná se 0,63], ve výtěžku 42 % teorie, počítáno na His, což odpovídá průměrnému výtěžku 84 % v jednotlivých reakčních krocích; teplota tání 167 až 174 °C.

Stupeň 2

Boc—Arg (Tos) —Val—Tyr (Bz 1) —I le— —Hi-s—Pro—OH

K roztoku 2,8 g (2,1 mmolů) shora uvedeným způsobem připraveného chráněného hexapeptldu - Boc—Arg(Tos)—Val—Tyr(Bzl)—ne—His(D.np)—P^:ro—OBzl v 8 ml dimethylformamidu se přidá 2,9 ml 2-merkaptoethanolu a směs se míchá 1 hodinu. Pak se peptid -zbavený dinitrofenylové chránící skupiny [Rf (4) = 0,17] vysráží přidáním bezvodého etheru, odfiltruje, nasuspenduje do 30 ml dioxanu a k suspenzi se přidá 1 N roztok hydroxidu sodného. Směs se nechá stát jednu hodinu, pak se pH získaného čirého roztoku upraví 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové na 7 a dioxan se oddestiluje. Zbývající vodný roztok se okyselí kyselinou chlorovodíkovou na pH 3, vyloučená sraženina se odfiltruje a rozpustí v 60 ml směsi dimethylformamidu s chloroformem v poměru 2 : 3. Organický podíl získaného roztoku se oddělí a rozpouštědla se oddestilují. Ve formě odparku se získá 2,3 g Boc—Arg (Tos )—Val—Ty.r (Bz z) —Ile— —His—Pro—OH (výtěžek 96 %); Rt (5) = =0,37, teplota tání 160 až 164 °C za rozkladu.

Stupeň 3

Bos—Arg (Tos) — Val—Tyr (Bzl) — Ile— —His—Pro—Ile—OMe

K roztoku 1,25 g (1,1 mmolů) produktu, získaného v předcházejícím stupni 2, v 15 ml dimethylformamidu se přidá 0,5 ml (3,6 mmolů) triethylaminu, 0,65 g (3,6 mmolů) hydrochloridu Ile—OMe a 1,35 g (2 mmioly) krystalického komplexu dicyklohexylkarbodiimidu s pentaf luorf eno lem (molární poměr složek 1:3). Reakční směs se nechá stát při pH udržovaném na konstantní hodnotě a po 24 hodinách se přidá stejné množství shora uvedeného- komplexu -a dalších 0,65 g (3,6- -mmolů) hydrochloridu Ile—OMe. Po dalších 24 hodinách -se reakční směs zředí 45 ml chloroformu a roztok se promyje, vždy po 20 ml, dvakrát 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, jednou 5% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a posléze jednou vodou, vysuší se bezvodým síranem sodným a -rozpouštědlo se oddeísitiluje. Odparek se -rozetře s bezvodým etherem a produkt -se odfiltruje. Tímto způsobem získaný chráněný - heptapeptidester [Rf (10] = 0,26] se rozpustí ve 20 ml horkého- ethanolu, roztok -se ochladí a vyloučený produkt se odfiltruje. Získá se 0,95 gramu Boc—Arg (To s) —Val—Tyr (Bzz) — —Ile—His—Pro—Ile—OMe (výtěžek 65 % teorie).

Stupeň 4

Bos—L—OAla—Arg (Tos) - Val—Tyr (Bzl) — —Ile—His—Pro—Ile—OMe

0,95 g Bos—Arg (Tos) — Val—TyrJBzl) — —Ile—His—Pro—Ile—OMe se rozpulstí ve 3 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá 15 minut stát, pak se přidá bezvodý ether a vysrážený hydrochlorid volného heptapeptidesteru [Rf (5) = 0,24] se -odfiltruje, promyje etherem a ihned rozpustí v 10 ml dimethylfořmamidu. Roztok se zalkalizuje triethylaminem na pH 8 a -přidá se 0,5 g (1,1 mmolů) Boc— —OAla—OPfp. Směs se nechá -stát při pH udržovaném na konstantní hodnotě, pak se přidá 30 ml chloroformu, -roztok se promyje 10% vodným roztokem kyseliny citrónové -a vodou, vysuší bezvodým síranem sodným a rozpouštědla se oddestilují. Získaný chráněný -oktapeptidester se -rozetře s bezvodým etherem a -odfiltruje. Získá se 0,83 g Boc—L—OAla—Arg (Tos) — Val—Tyh( Bz'1) — —Ile—His—Pro—Ile—OMe (výtěžek 87 % teorie); R_f - (4) = 0,34; teplota tání 143 - až 146 °C (zla rozkladu).

Stupeň 5

Odstranění chránících skupin

0,75 g (0,57 mmolů) shora uvedeným způsobem získaného chráněného oktapeptidesteru se rozpustí ve -směsi 0,5 ml thioanisolu -se 2 ml kapalného fluorovodíku. Reakční směs- se udržuje 1,5 hodiny -při 0 °C, pak se přidá bezvodý ether a vyloučený volný oktapeptidester se odfiltruje. Tento produkt se -rozpustí ve 30 ml methanolu a přidáním bezvodého etheru se znovu vysráží. Tímto -způsobem se získá 0,5 g surového oktapeptidesteru (výtěžek 89 % teorie). Surový produkt se pak čistí shora popsanou obecnou čisticí metodou. Získaný čistý (L-α-aminooxypropionová kyselina1, isoleucin-methylester⁸) -angiotensin-II vykazuje tyto charakteristické vlastnosti:

Rf [7] = 0,30,

Rf (8) = 0,68,

R_ř (9) = 0,46. +

Aminokyselinová analýza:

Pro 1,0 (1),

Val 1,05 (1),

Ile 2.0 (2),

Tyr 0,73(1), His 0,85 (1), Arg 0,97 (1).

P ř í k 1 a d - 4 (Sarkosin¹, threonin (Me ] -methyle-ster⁸) angiotensin-II < W > - .5

Stupeň 1

Z—Sar—Arg(NO2) — Val—Tyr (Bzl ' ] —Ile— —His( Dup ] —Pro—Thr (Me)—OMe

K roztoku 0,68 g (4,5 mmolu) Thr(Me) — OMe v 10 ml chloroformu se přidá 2,28 g (6 mmolů) Boc—Pro—OPfp. Roztok se nechá stát půl hodiny při pH udržovaném konstantně na hodnotě 8, pak se rozpouštědlo oddestiluje, ’ odparek se rozpustí v ethylacetátu -a přidá se 0,22 ml N,N-dimethylaminoethyla-minu. Reakční směs se nechá 15 minut stát a pak se promyje nejdříve 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, nasyceným chloridem sodným, pak 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové a naposled vodou, vysuší -se bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se oddestiluje. Ve formě -odparku získaný chráněný dipeptid (Rf (2J = 0,76] se bez čištění rozpustí ve 3 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá 15 minut stát, pak se přidá bezvodý ether a -rozpouštědla se odpaří. Ve formě odparku získaný hydrochlorid volného dipeptidu [Rf (4] = 0,18] se ihned rozpustí v 10 mililitrech dimethylformamidu, pH roztoku se upraví triethylaminem na hodnotu 8 a přidá se 2,95 gramu (5 mmolů] Boc—His(Dnp)—OPfp. Roztok se nechá stát jednu hodinu při pH udržovaném konstantně na hodnotě 8, pak se rozpouštědlo oddestiluje a odparek se rozpustí v ethylacetátu. K roztoku se přidá 0,11 ml Ν,Ν-dimethylaminoethylaminu, směs se nechá 10 minut stát, pak -se promyje 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, nasyceným chloridem -sodným a poté vodou, vysuší se bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se oddestiluje. Ve formě odparku získaný chráněný tripeptid [R_f (2) = 0,47] se ihned rozpustí v 5 ml dimethylformamidu, po 15 minutách stání se k roztoku přidá bezvodý ether, vysrážený reakční produkt se odfiltruje a promyje etherem. Tímto způsobem získaný hydrochlorid volného tripeptidu [Rf (4) = 0,3] se ihned rozpustí v 10 ml dimethylformamidu, pH .roztoku se upraví triethylammem na hodnotu 8 a přidá se 2,0 g (5 mmolů) Boc—Ile—OPfp. Roztok se -nechá stát půl hodiny při pH udržovaném konstantně na hodnotě 8, pak se rozpouštědlo oddeBtiluje, odparek se rozpustí v ethylacetátu, -roztok se promyje obvyklým způsobem, vysuší a rozpouštědlo se oddestiluje. Odparek se rozetře se směsí etheru s n-hexanem v objemovém poměru 3:7a produkt se odfiltruje. Uvedeným způsobem získaný chráněný tetrapeptid [Rf (2) = 0,28] se ihned -rozpustí v 7 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se - nechá 15 minut stát, pak se přidá bezvodý -ether a -vysrážený hydrechlorid volného tetrapeptidu se -odfiltruje a promyje etherem. Získaný produkt [Rf (5) = - 0,27] se rozpustí v 10 ml dimethylformamidu, pH roztoku se upraví tritthylamintm -na hodno tu 8 a přidá -se 2,7 g (5 mmolů) Boc—Tyr(Bzl)-OPfp. Roztok se nechá půl hodiny stát při pH udržovaném konstantně na hodnotě 8, pak se -rozpouštědlo oddestiluje, odparek se rozpustí v ethylacetátu a k roztoku se přidá 0,11 ml N,N-dimethylamineethylaminu. Směs se -nechá 15 minut stát, pak se promyje 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, nasyceným -chloridem sodným a vodou, - vysuší se bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo -se oddestiluje. Ve formě -odparku získaný chráněný pentapeptid [Rf (2) = 0,51] se rozetře - s bezvodým etherem, -odfiltruje se a ihned se rozpustí v 5 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Roztok se nechá 15 minut stát, pak se přidá bezvodý ether, vysrážený hydrochlorid volného pentapeptidu [Rf (5) = = 0,48] se -odfiltruje, promyje etherem a rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu. Roztok se zalkalizuje tritthylamintm na pH 8, přidá se 1,9 g (9 mmolů] Boc—Val—OPfp a -směs -se nechá -stát půl hodiny při pH udržovaném na konstantní -hodnotě. Rozpouštědlo se oddestiluje, -odparek se rozpustí v chloroformu, roztok se promyje -obvyklým způsobem, vysuší a -rozpouštědlo se odpaří. Odparek se rozetře s bezvodým etherem a produkt -se odfiltruje. Získaný chráněný hexapeptid [Rf (2) = 0,44] se rozpustí v 10 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, po 15 minutách -stání- se přidá bezvodý ether, vysrážený produkt se odfiltruje a promyje. Získaný hydrochlorid volného hex-apepitidu [Rf (4) = 0,36] se ihned rozpustí v 15 ml -dimtthylfermamidu, pH roztoku se upraví trtethylaminem na hodnotu 8 a přidá -se 2,25 g (5 mmolů] Boc—Arg-(NOgJ—OPfp. Roztok se nechá stát jednu hodinu při pH udržovaném konstantně na hodnotě 8, pak se zředí 45 ml chloroformu, roztok se obvyklým způsobem promyje a rozpouštědlo se oddestiluje. Odparek - se rozetře s ethanolem a produkt -se odfiltruje. Uvedeným způsobem -se získá 3,3 g chráněného heptapeptidesteru Boc—Arg(NOž) — —Val—Tyr (B^l) —Ile—His( Dnp ] —Pro— —Th-r^MeJ—OMe (výtěžek 56 % teoreticky vypočítaného množství, což odpovídá průměrnému výtěžku v jednotlivých reakčních stupních 91 % ]; teplota tání 188 -až 193 °C, R_ř (3) = 0,38, Rf (4) = 0,87.

1,95 g (1,5 mmolu) shora uvedeným způsobem získaného chráněného heptapepitidesteru se rozpustí v 10 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá 20 minut stát, pak se přidá bezvodý ether a vysrážený produkt -se -odfiltruje a promyje. Získaný hydrochlorid volného heptapeptidesteru [Rf (4= 0,20)] se rozpustí v 15 ml dimethylformamidu, pH roztoku se upraví triethylamintm na hodnotu 8 a přidá se 0,87 g (2,25 mmolu) Z—Sar—OPfp. Roztok se nechá -stát jednu hodinu při pH udržovaném konstantně na hodnotě 8, pak se přidá 45 ml chloroformu a roztok se pro217987 myje desetiprocentním vodným roztokem kyseliny citrónové, 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové a nakonec vodou, vysuší se bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se oddestiluje. Odparek se rozetře s ethanolem, produkt se odfiltruje a promyje ethanolem. Uvedeným způsobem se získá 1,85 g chráněného oktapeptidesteru Z— —Sar—Arg [ NOz) —Val—Tyr (Bzl )—Ile— —His (Dn.p) —Pro—Thr (Me) —OMe (výtěžek 87 % teorie); teplota tání 20 až 208 °C, Rf (3) = 0,20, Rf (4) = 0,86.

Stupeň 2

Odstranění chránících skupin

K roztoku 1,85 g (1,4 mmolů) chráněného oktapepiiideisteru Z—Sar—Arg[ NO2) — —Val—Tyr (B^t )—Ile—His (Dnp) —Pro— —Thr· (Me) —OMe v 8 ml dimethylformamidu se přidá 2,6 ml ž-i^í^JTkaptoethanolu. Směs se míchá jednu hodinu, pak se přidá bezvodý ether a vysrážený chráněný okitapeptidester zbavený dinitrofenylové skupiny [1,6 g; Rf (4) = 0,52] se odfiltruje a promyje. Tento produkt · se rozpustí v 30 ml směsi methanolu, kyseliny octové a vody v poměru 5:1:1, přidá se · 1,0 g 10% paládia na aktivním uhlí a diO' směsi se za intezívního míchání uvádí 30 hodin plynný vodík. Katalyzátor se odfiltruje, promyje stejnou směsí roopooištědel, promývací kapalina se spojí s· prvním filtrátem a rozpouštědla se oddestilují. Odparek se rozetře se směsí etheru s ethanolem v poměru 2:1a produkt se odfiltruje. Uvedeným způsobem se získá 0,98 g volného oktapeptidesteru (výtěžek 83 % teorie). Suťový produkt se pak čistí shora popsanou obecnou čisticí metodou. Získaný čistý (sarkosin¹, threonin [Me] -methylester8 )-angiotensin-II vykazuje tyto· charakteristické vlastnosti:

Rf (6) = 0,29,

Rf (8) = 0,55,

Rf (9) = 0,27.

Aminokyselinová analýza:

His 1,03 (1),

Arg 0,95 (1), Thr 0,93 (1), Pro 1,03 (1), Val 1,15 (1), Ile 1,03 (1), Tyr 0,90 (1), Sar 1,0 (1).

Příklad · 5 (Hydroxyoctová kyselina¹, threonin(Me)-methylester⁸ )-angiotensin-II

Stupeň 1

Z—OGly—Arg (NOz) —Val—Tyr [ Bzl ] — Ile— —His( Dnp) —Pro—Thr (Me )—OMe

0,62 g (0,47 mmolů) Boc-Arg^Ch) — —Val—Tyr (Bzl ]—Ile—His (Dn.p) —Pro— —Thr(Me)—OME · (připraveného způsobem popsaným v příkladu 4, stupeň 1) se rozpustí ve 4 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá 15 minut stát, pak se přidá bezvodý ether, vyloučený hydrochlorid volného heptapeptidesteru se odfiltruje a promyje etherem. Získaný produkt [Rf (5) = 0,35] se · ihned rozpustí v 10 ml dimethylformamidu, pH roztoku se upraví triethylaminem na hodnotu 8 a přidá se 0,8 g (2 mmoly) Z—OGly—OP^. Roztok se nechá stát jednu hodinu při pH udržovaném konstantně na hodnotě 8, pak se přidá 30 ml chloroformu, roztok se vytřepe 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, pak 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové a nakonec vodou, vysuší se bezvodým síranem sodným a rozpouštědla se •oddestilují. Odparek se rozetře se směsí etheru s ethanolem v poměru 9:1a produkt se odfiltruje. Uvedeným způsobem se získá 0,60 gramu chráněného ·oktapeotidesieou Z—OG1—Arg(NO2)—Val—Tyr(Bzl) —Ile—His(Dnp) — —Pro—Thr(Me)—OMe (výtěžek 90 % teorie); teplota tání 158 až 162 °C; Rf [3] = = 0,44.

Stupeň 2

Odstranění chránících skupin

K roztoku 0,6 g (0,42 mmolů) shora uvedeného chráněného □^pep^e-steru ve 2 ml dimethylformamidu se přidá 1,2 ml 2-merkaotoeihanolu, · roztok se nechá jednu hodinu stát, pak se přidá bezvodý ether a vysrážený chráněný okiaoeotidesieo zbavený dinitrofenylové chránící skupiny se odfiltruje. Získaný produkt se rozpustí v me-. thanolu, roztok se vyčeří přidáním aktivního uhlí, zfiltruje a · z filtrátu se oddestiluje rozpouštědlo. Odparek se rozetře s etherem a produkt se odfiltruje. Získá se 0,46 g produktu; Rf (4) = 0,16; Rf (5) · = 0,52.

Peptidesteir se · rozpustí ve směsi methanolu, kyseliny octové a vody v poměru ·4 : : 1 : 1 (25 ml), k roztoku se přidá 0,3 g 10% paládia na aktivním uhlí a do směsi se za intenzivního míchání uvádí 17 hodin plynný vodík. Po skončení reakce se katalyzátor odfiltruje, promyje stejnou směsí rozpouštědel, promývací kapalina · se spojí s prvním filtrátem a rozpouštědla se oddestilují. Odparek se několikrát · rozmíchá se směsí vody s ethanolem a rozpouštědla se po každém rozmíchání odpaří do sucha; poté se odparek rozetře s etherem a produkt se odfiltruje. Získá se 0,32 g volného otítapeptidesteru (výtěžek 91 % teorie). Tento surový produkt se pak čistí shora popranou obecnou čisticí metodou. Získaný čistý (hydroxyoctová kyselina! threoni^Me] -methylester⁸ )-angiotensin-II vykazuje tyto charakteristické vlastnosti:

Rf (7) = 0,22,

R_f (8) = 0,73,

R_f (9) = 0,56.

Aminokyselinová -analýza:

Thr 0,92 (1),

Pro 1,03 (1),

Val 1,0 (1), Tyr 0,7 (1), His 1,0 (1), Arg 1,0 (1],

Příklad 6 ( Hydroxyoctová kyselina¹, threonin-methylester⁸) -angiotensin-II

Stupeň 1

Boc—Arg(NO2)—Val—Tyr(Bz.l)—Ile— —HisiiDnp ] —Pno—Thr—OMe

K roztoku 3,8 g (20 mmol] Thr—OMe . HCl v 50 ml chloroformu se přidá 2,8 ml (20 mmio-1) triethylaminu a 3,8 g (10 mmol) Boc—Pro—OPfp. Roztok se nechá stát jednu hodinu při pH udržovaném na konstantní hodnotě, pak se promyje 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové a nakonec vodou, vysuší se bezvodým síranem- sodným a rozpouštědlo -se oddestiluje. Získaný chráněný dipeptldester (R((3) = 0,77] se rozpustí ve 20 ml 8 N -roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá 15 minut stát, pak se přidá bezvodý ether, vyloučený hydrochlorid volného dipeptideateru -se odfiltruje a promyje. Získaný produkt [R([5) = = 0,2] se rozpustí ve 30 ml chloroformu, pH roztoku se upraví -triethylaminem na hodnotu 8 a přidá se 4,7 g (3 mmol) Boc— —HisiiDnp)—OPfp. Roztok -se nechá -stát jednu hodinu při pH udržovaném konstantně- na hodnotě 8, pak se, v uvedeném pořadí, promyje 10% - vodným -roztokem kyseliny - citrónové, 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové, 5% vadným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a. vodou, vysuší se bezvodým síranem -sodným a rozpouštědlo se -oddestiluje. Ve formě -odparku získaný chráněný tripeptidester [Rf(3] = 0,47] se rozpustí ve 20 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, -roztok se nechá 15 minut stát, pak se přidá bezvodý ether a vysrážený hydrochlorid volného -tripeptideateru (R((5) = 0,23] se odfiltruje. Tentoprodukt se -rozpustí ve 20 ml směsi chloroformu s dimethylformamidem v poměru 5:1, pH roztoku -se upraví triethylaminem na hodnotu 8 a přidá se 4,0 g (10 mmol) Boc— —Ile—OPfp. Roztok se nechá půl hodiny stát při pH udržovaném konstantně na hodnotě 8, pak se promyje 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, 5% vodným roztokem hydírogenuhličitanu sodného a posléze vodou, vysuší se bezvodým -síranem sodným a rozpouštědlo se oddestiluje. Odparek se několikrát rozetře s n-hexanem a produkt se -odfiltruje. Tímto způsobem získaný chráněný tetrapeptidester -(Rf(3) = 0,45] se rozpustí v 15 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v -dioxanu, roztok -se nechá 15 minut stát, pak -se přidá bezvodý -ether a vyloučený hydrochlorid volného tetrapeptidesteru. se odfiltruje. Získaný produkt [Rf[5] = 0,25] se ihned rozpustí ve 30 ml dimethylformamidu, pH roztoku se upraví triethylaminem na hodnotu 8 a přidá se 2,05 g (3,8 mmol] Boc—Tyr(Bzl)—OPfp. Roztok se nechá stát půl hodiny při pH udržovaném konstantně na hodnotě 8, pak se rozpouštědlo oddestiluje, -odparek se -rozpustí v -ethylacetátu a přidá se 0,11 ml N . N-dimethylaminoethylaminu. Směs se nechá 15 minut stát, pak se -roztok obvyklým způsobem -promyje, vysuší a rozpouštědlo se oddestiluje. Ve formě odparku získaný chráněný pentapepitidester [_f (3 ] = 0,57] se rozetře s- bezvodým etherem, produkt se odfiltruje -a ihned -rozpustí v 10 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu. Roztok se nechá 15 minut stát, pak -se přidá bezvodý ether, vysrážený hydrochlorid volného pentapeptidester.u se -odfiltruje a promyje etherem. Tento produkt (Rf(5) = 0,27] se ihned rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu, pH roztoku se upraví triethylaminem na hodnotu 8 -a přidá se 1,75 g (4,5 mmol] Boc—Val—OPfp. Roztok se nechá stát jednu hodinu při pH udržovaném konstantně na hodnotě 8, pak se rozpouštědlo -oddestiluje, odparek -se rozpustí v chloroformu a roztok se obvyklým způsobem promyje, vysuší a rozpouštědlo se oddestiluje. Olejovitý odparek se rozetře s etherem, produkt se odfiltruje -a promyje. Tímto způsobem- získaný chráněný hexapeptidester (Rf(3) = = 0,55] se rozpustí v 8 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá 15 -minut stát, pak se přidá bezvodý ether, vysrážený hydrochlorid volného hexapeptidesteru se odfiltruje -a promyje -etherem. Získaný produkt (f(5) = 0,23] se ihned rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu, pH roztoku se upraví triethylaminem na hodnotu 8 -a přidá se 1,8 g (4 mmol] B-oc— —A-rg(NOž)—OPfp. Roztok -se nechá stát jednu hodinu při pH udržovaném konstantně na hodnotě 8, pak se rozpouštědlo oddestiluje, odparek se -rozpustí v chloroformu a roztok -se obvyklým způsobem promyje, vysuší a -rozpouštědlo se odpaří. Odparek se rozetře se -směsí -etheru s eiihanolem - v poměru 9:1, produkt se -odfiltruje a promyje. Získá -se 2,7 g chráněného heptapeptidesteru Boc—Arg^Ch)—Val—Tyr(Bzl—Ile—His (Dnp) —Pro—Thr—OMe (26 proč, teoretického množství, počítáno na histidin, což odpovídá průměrnému výtěžku % v jednotlivých reakčních stupních];

teplota tání 190 - až 195 °C (za -rozkladu),

Rf [4] = 0,47.

Í21 798 7

Stupeň 2

Z—OGly—ArgfNOz) — Val—Tyr { Bzl) — —I le—Hisi (Dnp) — Pro—Thr—OMe

1,7 g (1,4 mmol) shora uvedeného chráněného heptapepitidesteru se rozpustí v 10 mililitrech 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá 15 minut istát, pak se přidá bezvodý ether, vysrážený hydrochlorid volného heptapeptidesteru [ R_f (5) = 0,21] se odfiltruje a ihned rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu. Roztok se zalkalizuje triethylaminem na pH 8 a přidá se 0,82 g (2,1 mmol) Z—OGly—OPfp. Roztok se nechá sitát půl hodiny při pH udržovaném konstantně na hodnotě 8, pak se přidá 40 ml chloroformu, reakční směs se priomyje 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové a vodou, vysuší a rozpouštědla se oddestilují. Odparek se rozetře s bezvodým etherem a produkt se odfiltruje. Získá se

1,6 g chráněného oktapeptidesteru (výtěžek 87 % teorie) o teplotě tání 188 až 194 °C; R_f(4) = 0,48.

Stupeň 3

Odstranění chránících skupin:

1,6 g (1,2 mmol) chráněného oktapeptidesterulZ—OGly—Arg (NO2) — Val—Tyr (Bzl) — —I le—His (Dnp) — Pro—Thr—OMe se rozpustí v 5 ml dimethylformamidu а к roztoku se přidá 3,8 ml 2-merkaptoethanolu. Směs se nechá stát jednu hodinu, pak se přidá bezvodý ether, vysrážený oktapeptidester zbavený dinitrofenylové chránící skupiny se odfiltruje, rozpustí v methanolu a znovu vysráží přidáním etheru. Získá se 1,3 g produktu (výtěžek 94 % teorie), R_ř(4) = 0,35, R_f(5) = 0,72.

Tento produkt se rozpustí ve směsi methanolu, kyseliny octové a vody v poměru 5:1:1, přidá se 0,6 g 10% paládia na aktivním uhlí a do roztoku se za intenzivního míchání uvádí 17 hodin plynný vodík. Po skončení reakce se katalyzátor odfiltruje, promyje stejnou směsí rozpouštědel, promývací kapalina se spojí s prvním filtrátem a rozpouštědla se oddestilují. Odparek se několikrát rozmíchá se směsí ethanolu s vodou a rozpouštědla se vždy odpaří; posléze se získaný odparek rozetře ^!s etherem, produkt se odfiltruje a promyje etherem. Získá se 0,64 g volného oktapeptidesteru (výtěžek 92 % teorie). Tento surový produkt se pak čistí shora popsanou obecnou čisticí metodou. Tímto způsobem získaný čistý oktapeptidester (hydroxyoctová kyselina¹, threonin-methylester⁸) angiotensin-II vykazuje tyto charakteristické vlastnosti:

Rf(7) -0,22;

,R_f(8) = O¹,73;

R_f(9) = 0,56;

aminokyselinová analýza:

Thr 0,92 (1),

Pro 1,03(1),

Val 1,0(1),

Ile 1,05(1),

Tyr 0,7 (1),

His 1,0(1),

Arg 1,0 (1).

Příklad 7 (Sarkosin¹, alanin-methy lester⁸) -angiotensin-II

Stupeň 1

Z—Sar—Arg(NO2)—Val—Tyr(Bzl)—Ile— —His( Dnp) —Pro—Ala—OMe

К roztoku 0,7 g (5 mmol) Ala—OMe . HC1 ve 20 ml chloroformu se přidá 0,7 ml triethylaminu a 1,14 g (3 mmol) Boc—Pro— —OPfp a směs se nechá stát půl hodiny při pH udržovaném na konstantní hodnotě. Roztok se promyje 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, pak 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové a nakonec vodou, vysuší se bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se oddestiluje. Ve formě odparku získaný chráněný dipeptidester [R_f(2] = 0,61] se rozpustí v 5 . ml 8 N. roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá 10 minut stát, pak se přidá bezvodý ether a rozpouštědla se oddestilují. Ve formě odparku získaný volný hydrochlorid dipeptidesteru (R_f(5) = 0,32] se rozpustí ve 20 ml chloroformu, pH roztoku se upraví triethylaminem na hodnotu 8 a přidá se 2,7 g (4,5 mmol) Boc—His(Dnp)—OPfp. Roztok se nechá stát jednu hodinu při pH udržovaném konstantně na hodnotě 8, pak se přidá 0,33 mililitru dimethylaminoethylaminu a po 15 minutách stání se směs promyje, v níže uvedeném pořadí, 10% vodným roztokem kyseliny citrónové, 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové, 5% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vod-ou, vysuší se bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se •oddestiluje. Ve formě odparku získaný chráněný tripeptidester [R_f(2) = 0,27] se rozpustí v 10 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok 'se nechá 15 minut stát, přidá se bezvodý ether a vysrážený hydrochlorid volného tripeptidesteru [ R_f (5) = 0,48] se odfiltruje a promyje etherem. Získaný produkt se ihned rozpustí ve 30 ml směsi chloroformu s dioxanem v poměru 2:1, pH roztoku se upraví triethylaminem ha hodnotu 8 a přidají se 2,4 g (6 mmol) Boc—Ile—OPfp. Směs se nechá stát půl hodiny při pH udržovaném na konstantní hodnotě 8, rozpouštědla se oddestilují, odparek 'se rozpustí v ethylacetátu a roztok se obvyklým způsobem promyje, vysuší a odpaří. Odparek se rozetře se směsí etheru s n-hexanem v poměru 1:9 a produkt se odfiltruje. Tímto způsobem získaný chráněný tetrapepidessiteir [Rf(2] = 0,29] se rozpustí v 10 mil 8 N roztoku . kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá 10 minut stát, pak se přidá bezvodý ether a vysrážený hydrochlorid volného tetrapeptidesite.ru (f(5) = ·== 0,67] sie odfiltruje, promyje a ihned rozpustí ve směsi chloroformu s dimethylformamidem 2:1. Roztok se zalkalizuje triethylaminem na pH 8 a přidá se 1,78 g [3,3 mmol) Boc—Tyr (B.zl)—OPfp, Roztok se nechá stát 15 minut při pH udržovaném na konstantní hodnotě, pak se rozpouštědla oddestilují, odparek se rozpustí v ethylacetátu, roztok se .obvyklým způsobem promyje a vysuší a rozpouštědlo se oddestiluje. Odparek se rozetře s bezvodým etherem a produkt se o^í^i^^l^truje. Získaný chráněný pentapeptid (Rf(2) = 0,33] se rozpustí v 10 ml 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu a po 10 minutách stání se přidá bezvodý ether, vysirážený hydrochlorid volného pentapeptidesiteru (Rf(4) = 0,35] se odfiltruje a ihned rozpustí ve 20 ' ml dimethylformamidu. Roztok se zalkalizuje triethylaminem na pH 8 a přidá se 1,55 g (4 mmol) Boc—Val—OPfp. Roztok se nechá stát půl hodiny při pH udržovaném na konstantní hodnotě, pak se rozpouštědlo oddestiluje, odparek se rozpustí v chloroformu, roztok se .obvyklým způsobem promyje a vysuší a rozpouštědlo se oddestiluje. Odparek se rozetře s bezvodým etherem a produkt se .odfiltruje. Získaný chráněný hexapeptidester [Rf(2) = 0,35] se rozpustí v 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá 20 minut . stát, pak se přidá bezvodý ether, vysrážený hydrochlorid volného hexapeptidesteru (Rf(5) = 0,75] se odfiltruje a promyje etherem. Tento produkt se ihned rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu, pH roztoku se upraví triethylaminem na hodnotu 8 a přidá se 2,64 g (6 mmol] Boc— —Arg(NO2]—OPfp. Směs se nechá stát jednu hodinu při pH udržovaném na konstantní hodnotě, pak s.e přidá 60 ml chloroformu, roztok se promyje 1 N roztokem kyseliny chlorovodíkové a vodou, vysuší bezvodým síranem sodným a rozpouštědlo se oddestiluje. Odparek se rozetře se směsí ethanolu s etherem . v poměru 1:3, produkt se .odfiltruje a promyje. Získaný chráněný hexapeptidester [Rf(4] =. 0,85] se rozpustí v 10 m'l 8 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v dioxanu, roztok se nechá 15 minut stát, pak se přidá bezvodý ether, vysrážený hydrochlorid volného heptapeptidesiteru [Rf(4] = =0,15] se .odfiltruje, promyje a ihned rozpustí ve 20 ml dimethylformamidu. Roztok se zalkalizuje triethylaminem na pH 8 a přidá se 1,27 g (3,3 mmol] Z—Sar—OPfp. Směs· se nechá stát 15 minut při pH udržo26 vaném na konstantní hodnotě, pak se přidá 60 ml chloroformu, roztok se obvyklým způsobem promyje a vysuší a rozpouštědlo· se oddestiluje. Ve formě .odparku získaný · chráněný okiiapeptidester se rozetře s 25 ml ethanolu, produkt se odfiltruje a promyje. Tímto. způsobem se získá 1,37 g Z—Sar— —Arg( NO2) — Val—Tyr (Bul) — Ile— —Hi:s(Dnp) —Pro—Ala—OMe (33% teoretického výtěžku, počítáno na prolin, což odpovídá průměrnému výtěžku 86 % v jednotlivých reakčních stupních); teplota tání 192 až 196°C; Rf(4) = 0,70.

Stupeň 2 ·

Odstranění chráničích skupin

1,37 g (1 mmol) shora uvedeným způsobem získaného. chráněného oktapeptidesteru .se rozpustí ve 3 ml dimethylformamidu, k roztoku se přidá 1,9 ml 2-merkaptoethanolu, po jedné hodině stání se směs zředí bezvodým etherem, vysrážený oktapeptidester zbavený -hránící dinitrofenylové skupiny [1,2 g, výtěžek 99 % teorie; Rf(4) . = = 0,20] se odfiltruje a promyje. Získaný produkt se rozpustí ve 20 ml směsi meithanolu, kyseliny octové a vody v poměru 5:1: :1, k roztoku se přidá 0,6 g 10% paládia na aktivním uhlí a do směsi se za intenzivního. míchání uvádí po dobu 20 hodin plynný vodík. Po skončení reakce se katalyzátor odfiltruje, promyje stejnou směsí rozpouštědel, promývací kapalina se spojí s prvním filtrátem a rozpouštědla se oddestilují; odparek -s.e několikrát rozmíchá se směsí ethanolu s vodou a rozpouštědla se vždy odpaří k suchu. Posléze se odparek rozetře se směsí ethanolu s etherem v poměru 1:1 a produkt se odfiltruje. Uvedeným způsobem se získá . 0,7 g volného oktapeptidesteru (výtěžek 75 proč, teorie), který se pak čistí shora . popsaným .obecným čisticím postupem. Získaný čistý (sarkosin¹, alanin-methylester⁸)-'angiatensin-II vykazuje tyto charakteristické vlastnosti:

Rf(7) = 0,23,

Rf(8) = 0,54,

Rf(9) = 0,27; ‘ aminokyselinová analýza:

His 0,97 (1),

Arg 1,03 (1), Pro. 1,06 (1), Val 1,03 (1), Ile 0,98 (1), Tyr 0,6 (1), Sar 1,0 (1).

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Způsob výroby proti angiotensinu-II antagonisticky působících oktapeptidesterů obecného vzorce I

X—Arg—Val—Тут—Ile—His—Pro—Y—OA , (I), 've kterém

X znamená a-hydroxyacetylovou, a-hydroxypropionylovou, ^-aminooxyacetylovou, a-aminiooxypropionylovou nebo sarkosylovou skupinu,

Y znamená isoleucylový, alanylový, threonylový nebo O-methylthreonylový zbytek a

A znamená methylovou skupinu, a jejich adičních solí s kyselinami a farmaceuticky použitelných komplexů, vyznačující se tím, že se z chráněného derivátu oktapeptidesteru obecného· vzorce II

В—X—Arg [ C) — Val—Tyr (D) — Ile—His( E) — Pr o—Y—OA (П), ve kterém

В znamená skupinu odstranitelnou acidolýzou nebo katalytickou hydrogenaci, zvláště skupinu benzyloxykarbcnylovou nebo terc.butyloxykarbonylovou,

C znamená chránící skupinu vhodnou к dočasnému chránění guanidinové skupiny argininu, zvláště nitroskupinu nebo tosylovou skupinu,

D znamená chránící skupinu vhodnou к přechodnému chránění aromatické hydroxylové skupiny tyrosinu, zvláště benzylovou, popřípadě substituovanou benzylovou skupinu,

E znamená chránící skupinu vhodnou к dočasnému chránění imidazolové skupiny histidinu, zvláště dinitrofenylovou skupinu a

А, X a Y mají shora uvedený význam, selektivně buď postupně, nebo v jednom stupni, odstraní chránící skupiny a získaná sloučenina obecného vzorce I se popřípadě převede na příslušnou adiční sůl s kyselinou nebo na farmaceuticky použitelný komplexní derivát.
2. Způsob podle bodu 1, pro výrobu Oktapeptidesterů shora uvedeného obecného vzorce I, ve kterém X znamená a-amioxyacetylovou nebo a-aminooxypropionylovou skupinu a Y a A mají význam uvedený v bodě 1, vyznačující se tím, že se z chráněných oktapeptidesterů shora uvedeného obecného vzorce II, ve kterém X znamená a-aminooxyacetylovou nebo a-aminooxypropionylovou skupinu a Y, А, В, C, D a E mají význam uvedený v bodě 1, odštěpí chránící skupina В, a popřípadě další kyselinami odštěpitelné chránící skupiny, acidolýzou, zvláště působením kyseliny fluorovodíkové.
3. Způsob podle bodu 1, pro výrobu oktapeptidesterů shora uvedeného obecného vzorce I, ve kterém X znamená a-hydroxyacetylovou nebo a-hydrioxypropionylovou skupinu a Y a A mají význam uvedený v bodě 1, vyznačující se tím, že se z chráněných oktiapepítidesiterů shora uvedeného obecného vzorce II, ve kterém X znamená «-amínooxyacety levou nebo a-aminooxypropionylovou skupinu a Y, А, В, C, D a E mají význam uvedený v bodě 1, odštěpí chrániči skupina В, a popřípadě další hydrogenolýzou odšitěpítelné chránící skupiny, katalytickou hydrogenaci, za současného odštěpení aminoskupiny z a-aminooxyacetylového nebo a-aminooxypropionylového zbytku.