FI72732C

FI72732C - Foerfarande foer framstaellning av nya, i 8-staellning aminosyraestergrupp innehaollande, angiotensin-ii-antagoniserande oktapeptidestrar.

Info

Publication number: FI72732C
Application number: FI810122A
Authority: FI
Inventors: Laszlo Szporny; Egon Karpati; Lajos Kisfaludy; Olga Nyeki
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1980-01-18
Filing date: 1981-01-16
Publication date: 1987-07-10
Also published as: IN153212B; FI72732B; SU1041030A3; PL229244A1; PH16791A; DD156968A5; CS217987B2; US4388304A; ATE13740T1; YU9281A; IL61923A; IL61923A0; FI810122L; ES498582A0; CA1156222A; HU181009B; EP0034259A1; JPS56138155A; AU6627781A; NO810150L

Description

1 72732

Menetelmä uusien, 8-asemassa aminohappoesteriryhmän sisältävien oktapeptidiestereiden valmistamiseksi, jotka ovat angiotensiini II:n antagonisteja 5 Keksinnön kohteena on menetelmä yleisen kaavan (I) mukaisten terapeuttisesti käyttökelpoisten oktapeptidiestereiden sekä niiden happoadditiosuolojen valmistamiseksi, X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y-OA (I) 10 jossa X merkitsee sarkosyyliryhmää tai hydroksiasetyyli-tai o-amino-oksi-propionyyliryhmää, Y on Ile, Thr(Me), Thr tai Ala, ja A merkitsee C^_^-alkyyliryhmää.

15 Ensimmäinen angiotensiini-II-analogi, joka sekä in vitro että myös in vivo vaikutti tehokkaana estoainee-na angiotensiini-II vastaan, esitettiin vuonna 1970 (vert.

G.R. Marshal et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 67, 1624 (1970); P.A. Khairallah et ai., J. Med Chem. 13, 181 (1970)). 20 Tämä havainto on antanut sitten aiheen laajoihin jatkotutkimuksiin, jotka johtivat lukuisten muiden tällaisten antagonisoivasti vaikuttavien angiotensiini-II-analo-gien valmistamiseen; nämä tuotteet tarjosivat mahdollisuuden määrättyjen reniini-peräisten ylijännitystilojen diag-25 nostiikkaan ja mahdollisesti myös terapeuttiseen hoitoon.

Tällä tavalla valmistetuista lukuisista antagonisoivasti 1 8 vaikuttavista yhdisteistä on (Sar , Ala )-angiotensiini-II jo kaupallisesti saatavissa nimellä Saralasin (D.I.

Pals et ai., Circ. Res. 29, 673 (1071)); tämä yhdiste on 30 kliinisten tutkimusten perusteella osoittautunut sopivaksi diagnostiikkaan (G. Bönner et ai. Dtsch. Med. Vschr.

104, 432 (1979)) sekä terapeuttista käsittelyä varten (J.L. Marx, Science 194, 821 (1976)) erilaista alkuperää olevissa ylijännitystapauksissa. Äskettäin on todettu, 35 että angiotensiini-II-antagonistit soveltuvat myös reno-vaskulaarisen ylijännityksen aiehuttaman sydämen vajaatoiminnan seurausilmöiden hoitoon (H. Gavras et ai., JAMA 238, 880 (1977)) .

2 72732

Patenttijulkaisuista DE-ΛΙ 2 831 271 ja DE-A1 2 831 534 tunnetaan kemialliselta rakenteeltaan läheisiä ja samantyyppisen terapeuttisen vaikutuksen omaavia ok-tapeptidejä. Myös US-patenttijulkaisuista 3 923 769, 5 3 923 770 ja 3 976 770 tunnetaan angiotensiini II:n anta gonistisia analogeja. Näistä julkaisuista tunnettujen peptidien N-terminaaliset osat ovat tietyissä tapauksissa samat kuin esillä olevan keksinnön mukaisissa yhdisteissä, mutta C-terminaalinen osa eroaa olennaisesti. Tämä aiheuttaa 10 eroja myös yhdisteiden biologiseen vaikutukseen.

Tähän mennessä valmistettujen angiotensiini-II-analogien rakenteen ja biologisten vaikutusten välisen riippuvuuden tutkimus on antanut myös hyödyllistä tietoa agonististen ja antagonististen vaikutusten selvittämi-15 seksi. Nykyisen tutkimuksen etualalla on sellaisten antagonistien valmistus, joiden avulla saadaan pitemmät biologiset puoliintumisajät ja joissa ei esiinny haitallisia sivuvaikutuksia, kuten esimerkiksi yhdisteen annon jälkeen aluksi esiintyvä agonistinen vaikutus.

20 Nyt on havaittu, että voidaan valmistaa tehokkaita esotaineita angiotensiini-II vastaan, jos fenyylialaniini angiotensiini-II-molekyylissä korvataan alifaattisella aminohapolla ja molekyylin 1-asemaan lisätään N-metyyliamino-happo tai r<--hydroksi- tai r^-amino-oksikarboksyylihappo ja 25 lisäksi molekyylin C-päätteinen karboksyyliryhmä esteröi-dään 1-5 hiiliatomia sisältävällä alkyyliryhmällä. Tällä tavalla saadut kilpailukykyiset angiotensiini-II-estoai-neet alentavat huomattavassa määrässä angiotensiini-II:n aiheuttamaa ylijännitystä ja voivat saada aikaan tämän 30 vaikutuksen myös subkutaanisesti annosteltaessa.

Uusia, yleisen kaavan I

X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y-OA (I) 35 mukaisia yhdisteitä, joissa X, Y ja A tarkoittavat samaa kuin edellä, valmistetaan keksinnön mukaisesti siten, et- 3 72732 tä yleisen kaavan II mukaisen suojatun oktapeptidijohdannaisen B-X-Arg(C)-Val-Tyr(D)-Ile-His(E)-Pro-Y-OA (II) 5 jossa B tarkoittaa asidolyysin tai katalyyttisen hydrauk-sen avulla poistettavaa ryhmää, erikoisesti bentsyyliok-sikarbonyyli- tai tert.-butyylioksikarbonvyliryhmää, 10 C tarkoittaa Arg:in guanidinoryhmän väliaikaiseen suojaukseen soveltuvaa suojaryhmää, erikoisesti nitro-tai tosyyliryhmää, D tarkoittaa Tyrrin aromaattisen hydroksyyliryhmän väliaikaiseen suojaukseen soveltuvaa suojaryhmää, erikoi-15 sesti bentsyyli- tai substitoitua bentsyyliryhmää, E tarkoittaa His:in imidatsoliryhmän väliaikaiseen suojaukseen soveltuvaa suojaryhmää, erikoisesti dinitro-fenyyliryhmää ja A tarkoittaa samaa kuin yleisessä kaavassa I, suo-20 jaryhmät poistetaan yksitellen tai yhdessä vaiheessa ja haluttaessa saatu yleisen kaavan I mukainen yhdiste muutetaan happoadditiosuolaksi.

Edellä esitetyssä menetelmässä lähtöaineina käytetyt, yleisen kaavan II mukaiset oktapeptidijohdannaiset 25 voidaan valmistaa mielivaltaisten, peptidikemiassa tavanomaisten menetelmien mukaan, esimerkiksi unkarilaisessa patenttijulkaisussa 168 431 esitetyn menetelmän avulla asyloimalla pentafluorifenyyliestereillä N-päätteisellä aminoryhmällä suojattujen aminohappojen tai peptidien vas-30 taavat aminohappoesterit. Tällöin käytetään sivutoimin- nallisten ryhmien suojaukseen sellaisia suojaryhmää, jotka asyloinnin jälkeen N-suojaryhmän poistamiseen johtavassa asidolyysissä vallitsevissa olosuhteissa ovat stabiileja.

35 Tämän menetelmän suositeltavan toteutustavan mukaan muodostetaan yleisen kaavan II mukaiset suojatut oktapep- 4 72732 tidit vaiheittain yksittäisistä aminohapoista. Voidaan menetellä kuitenkin myös siten, että ennestään valmistettu, vastaavasti suojattu peptidiosa asyloidaan yhdellä kertaa toisen, myös ennestään valmistetun peptidiosan kanssa.

5 Tätä valmistustapaa voidaan käyttää edullisesti esimerkiksi 1-asemassa c^-amino-oksihapporyhmän sisältävien peptidien valmistuksessa. Yksittäisten aminohappojen tai aminohappo johdannaisten väliaikaiseen suojaukseen on molemmissa menettelytavoissa käytettävä sellaisia suojaryhmiä, 10 jotka voidaan poistaa helposti asidolyysin avulla; erikoisesti tert.-butyylioksikarbonyyliryhmä on tähän tarkoitukseen edullinen.

Yleisen kaavan II mukaisen suojatun oktapeptidi-esterin synteesin päätettyä poistetaan sitten keksinnön 15 mukaisesti tämän suojatun oktapeptidiesterin suojaryhmät. Tällöin menetellään edullisesti siten, että ensin poistetaan His-ryhmästä dinitrofenyyli-suojaryhmä tiolyysin avulla ja lisäksi tarkoituksenmukaisesti käsittelemällä 2-merkaptoetanolilla; jäljelle jääneet suojaryhmät voi-20 daan sitten poistaa edullisesti yhtenä vaiheena asidolyysin avulla tarkoituksenmukaisesti fluorivetyhapolla tai katalyyttisen hydrogenolyysin avulla käyttäen katalyyttinä esimerkisi palladium-aktiivihiiltä.

Jos kuitenkin valmistettavaan, yleisen kaavan I 25 mukaiseen yhdisteeseen halutaan o£-amino-oksiryhmän sisältävä alifaattinen asyyliryhmä X-ryhmän paikalle, voidaan yleisen kaavan II mukaisen, asianmukaisesti suojatun okta-peptidiesterin suojaryhmät poistaa vain asidolyysin avulla, esimerkiksi käsittelemällä dinitrofenyyliryhmästä 30 vapautettua suojattua oktapeptidiesteriä fluorivetyhapolla, koska katalyyttisessä hydrauksessa samanaikaisesti myös X-asemassa oleva ot-amino-oksiasyyliryhmä muuttuu aminoryhmän lohjetessa vastaavaksi <"t-hydroksiasyylitäh-teeksi. Sitävastoin voidaan X-asemassa alifaattisen ^c-hy-35 roksiasyylitähteen sisältävät, yleisen kaavan I mukaiset yhdisteet valmistaa vastaavista, X-asemassa OC-amino-oksi- 5 72732 asyylitähteen sisältävistä yleisen kaavan II mukaisista suojatuista oktapeptidiestereistä, jolloin suojaryhmät poistetaan katalyyttisen hydrauksen avulla X-ryhmästä lohkaisemalla pois samanaikaisesti aminoryhmä.

5 Yleisen kaavan I mukaiset uudet yhdisteet voi daan puhdistaa tunnettujen menetelmien avulla, esimerkiksi ioninvaihto-kromatografiän avulla karboksimetyyli-selluloosalla. Tuotteet valmistetaan tarkoituksenmukaisesti lyofilioitaviksi jauheiksi, jotka soveltuvat sit-10 ten erittäin hyvin erilaisten lääkeaineiden valmistukseen .

Tuotteiden antagonistinen vaikutus tutkittiin nukutetuilla urospuolisilla kissoilla. Tutkimuksissa leikattiin eläinten vagus-hermot kaulan molemmilta puo-15 liitä ja gangolionien sulkemisen jälkeen annosteltiin eläimille hypertensiiniä (Ciba) infuusion avulla nopeudella 0,5 jjg/kg/min. Kun kohonnut verenpaine oli stabiloitunut, annostettiin tutkittavaa yhdistettä fysiologisessa keittosuolaliuoksessa tai kantaja-aineen si-20 sältävässä liuoksessa suonensisäisesti tai ihonalaisesti. Tällöin esiintynyt verepaineen lasku mitattuna elohopea-millimetreinä kirjattiin prosentteina ennen käsittelyä mitatusta verenpaineen alkuarvosta. Mittaustulosten tilastollinen käsittely suoritettiin Student'in "t"-testin 25 perusteella. Yksittäisen vaikutusaineen vaikutusaikana pidettiin viimeiseen, vielä merkittävään verenpaineen laskuun (p = 5 %) kulunutta aikaa. Tällöin saadut koetulokset on esitetty yhteenvedettyinä seuraavassa taulukossa. Vertailuvaikutusaineena käytettiin näissä kokeis- 30 sa tunnettua ja angiotensiini-II-antagoivana aineena 1 8 terapiassa ennestään käytettyä Saralasiinia (Sar , Ala ) -antiotensiini-II); samoissa olosuhteissa saralasiinilla saadut tulokset on myös esitetty taulukossa.

72732 6 _ m ° « ε r-ι o n • i <-t rö <u m fo — ^ o cm £ 0)

CvJ ··» t7»

• C

-P °, c ® m ^ 2 V

s » : s 3 “ 8 s " 2 Ή (\J (\l tn Π3 3 φ (Λ •o λ; en ,r"l Q) ? e ro S iH tn o e tn > eTSocvjtM en u r* 00 tn o § u .* e

S ¥ >Ä> corn C -H

γη rt en t" *-< co c\j oo -P -h

21 υ ^ ^ <-ι 3 CO

9 . _ M tn •o pc n 2 ^ ^ ^^7 8 « M >7

^ O O o O o ·· «H

H Q in o in o O 8 s r-1

V ^ Ή rH 0Vj <D

‘ ·> CO

*7j <#> -H

-5 ^ ^ 3 >1 7 ε oo in m in o o tn «* >i

Ϊ co^r rt en S 7 tn -P

tu υ 7 g 0 «moor-tocDTj- -h H 2 CNJCVJOJCNJr-.CNjajC^

? · _ 0) O

S 8C tnio t^oo m rr a m Sf*

r\ *H M

S - w (0(0 5ω ^ OOOOOOOO B? x 3 2 Q ^Oroooggg g r-< »rri H <P( ro 3 g u M ε un 00 CM o OJ OJ in " ^ 7 CM D rH to r-t rj· 2 °'° “ to ·* ί C s!'3* ^ O 00 en c\i c\j 7 3 :(0 . w w h w h w n 7 o 1 :« 3 >i c nootoODrv'j-Lf) §7 O -* ro O, _ OOOOOOO 2o

Qj Q 3 5 C en

o . u tD O

U · M Γ7-) I) CC M 2 7 •H <D I O) 2

ε φ μ h Ϊ J

° s e e: 5 7 | * to ω I I I no rfl tn C 60 M \ e ..ro tn -h e e 00 <2 e m to to I < < tl) I m e cu tn i i s: \ .. iJ .

O C C ^ ^ O oo tn -h to tn a) 4-i co ro i φ 2cntn

(0 P 3 t) 4) S \ o M

IP^O) s: s 0)0 tn 2 ω oo > Ή C O O Sl 3 ο tn (0 Ή I I *^s, 0) -H Λ1 ro D (0 ρ e v tn o '-t S M -H tn >| 3 M < E--tn OtM-r-i ^ <0 3 i—l

•--t -t -<<--! G ·· -H

e e e < ro ro h e ! ro co to o e o -h ! tn en en 3: <0 · ·χ -h • '-· ^ ^ co i e z -p 7 72732

Taulukon arvoista voidaan havaita, että uusilla, yleisen kaavan I mukaisilla yhdisteillä on merkittävä verenpainetta alentava vaikutus, mikä on merkkinä siitä, että C-päätteisen karboksyyliryhmän varauksella ei vält-5 tämättä ole merkitystä tämän vaikutuksen esiintymiseen. Vaikutusteho on myös tämän vaikutusaineen ihonalaisessa annostuksessa merkittävä; kantaja-ainetta sisältävissä liuoksissa saavutettiin useissa tapauksissa useampia tunteja kestävä vaikutus.

10 Keksinnön mukaisesti valmistetut, yleisen kaavan I

mukaiset uudet peptidit voidaan haluttaessa muuttaa tavanomaisten menetelmien mukaan terapeuttisesti käytettäviksi happoadditiosuoloiksi ja komplekseiksi. Terapeuttisesti käytettävinä komplekseina ymmärretään sellaisia peptidi-15 yhdisteitä, jotka muodostuvat lisättäessä määrättyjä orgaanisia tai epäorgaanisia yhdisteitä peptideihin ja jotka antavat vaikutusaineille hidastuneen vaikutuksen. Esimerkkeinä tähän tarkoitukseen soveltuvista orgaanisista yhdisteistä mainittakoon gelatiini, karboksimetyyliselluloo-2Q sat, algiinihappoesterit, polyfloretiinifosfaatit, aminohappo-polymeerit ja -kopolymeerit jne; epäorgaanisina yhdisteinä tulevat kyseeseen määrättyjen metallien, erikoisesti sinkin, hydroksidit tai vaikeasti liukenevat suolat, esimerkiksi fosfaatit.

25 Keksinnön mukaisia uusia peptidejä sekä niiden hap- poadditiosuoloja ja komplekseja voidaan käyttää terapiassa tavanomaisina lääkeainevalmisteina. Nämä lääkeainevalmis-teet sisältävät keksinnön mukaisia, kaavaa I vastaavia uusia yhdisteitä yhdessä enteraaliseen tai parenteraaliseen 30 annostukseen sopivien epäorgaanisten tai orgaanisten kantajien kanssa. Nämä lääkeainevalmisteet voidaan valmistaa kiinteinä lyofilisaatteina, jotka sisältävät kantajina farmaseuttisesti käyttökelpoisia ja peptidien kanssa reagoimattomia kiinteitä aineita kuten hiilihydraatteja, edel-35 leen laimennettuina tai väkevöityinä, vaikutusaineiden 72732 8 lisäksi haluttaessa myös säilyttävästä tai stabiloivasti vaikuttavia apuaineita sisältävinä suspensioina tai emulsioina .

Tavanomaisten farmaseuttisten menetelmien mukaan 5 muodostettuja lääkeainevalmisteita voidaan käyttää eri alkuperää olevien ylijännitystilojen differentioivaa diagnostiikkaa varten, edelleen terapiassa renaalisen alkuperän omaavien ylijännitystilojen normalisoinnissa, kriittisissä ylijännitystiloissa, sydämen sekundäärisissä va-10 jaatoimintatiloissa jne.

Lääkeainevalmisteet muodostetaan tarkoituksenmukaisesti 1-10 mg vaikutusainetta sisältäviksi ruiskeiksi. Keksinnön mukaisen vaikutusaineen päivittäinen annos aikuisilla potilailla on 1-10 mg. Tämä määrä annostellaan 15 edullisesti yhdellä kertaa suonensisäisesti, ihonalaisesti, lihaksensisäisesti tai hitaan suonensisäisen infuusion avulla.

Keksinnön mukaisen menetelmän käytännöllistä toteutusta esitellään tarkemmin seuraavien esimerkkien avulla.

20 Esimerkeissä käyteyt aminohappojen, suojaryhmien jne. lyhennykset vastaavat kirjallisuudessa yleisesti käytettyjä lyhennyksiä (vert. J. Biol. Chem. 247, 977 (1972)). Lisäksi käytettiin vielä seuraavia lyhenteitä: HOAA = hydroksietikkahappo, OAla = oi-amino-oksipropioni-25 happo, OGly = amino-oksietikkahappo, PfP = pentafluori-fenyyli.

Eri yhdisteitä valmistettaessa suoritettiin liuosten kuiviinhaihdutus kulloinkin Buchi'in "Rotavapor" laitteessa. Sulamispisteiden määrityksessä käytettiin Dr.

30 Tottoli'in (Biichi) laitetta. Ohutkalvokromatogrammit valmistettiin piigeelilevyillä "Kieselgel G nach Stahl" (Merck). Kromatogrammien kehityksessä käytettiin seuraavia liuotinseoksia: 9 72732 (1) : etyyliasetaatti: (pyridiini:etikkahappo:vesi= 20:6:11)=98:2 (2) : etyyliasetaatti: (pyridiini:etikkahappo:vesi=20:6:11) = 95:5 (3) : etyyliasetaatti: (pyridiini:etikkahappo:vesi=20:6:11)= 90:10 (4) : etyyliasetaatti: (pyridiini:etikkahappo:vesi=20:6:11)= 80:20 5 (5): etyyliasetaatti: (pyridiini:etikkahappo:vesi=20:6:ll)= 70:30 (6) : etyyliasetaatti: (pyridiini:etikkahappo:vesi= 20:6:11)= 60:40 (7) : n-butanoli:etikkahappo:vesi= 4:1:5 (8) : n-butanoli:etikkahappo:pyridiini:vesi = 30:6:20:24 (9) : n-butanoli:etyyliasetaatti:etikkahappo:vesi = 1:1:1:1 10 (10): etyyliasetaatti: (pyridiini:etikkahappo:vesi=2C:6:11)= 75:25 Täplien kehitys suoritettiin ninhydriinillä tai klorotolidiini/kaliumjodidilla.

Lopputuotteiden puhdistuksessa käytettiin seuraavaa 15 yleistä menetelmää: 0,5 grammaa vapaata peptidiä liuotettiin 4 milli-litraan Ο,ΟΙΜ ammoniumasetaattiliuosta, tämä liuos pantiin sitten 0,5 litraa karboksimetyyliselluloosaa (CMC-52) sisältävään ja etukäteen edellämainitulla ammoniumasetaat-20 tipuskuriliuoksella tasapainoon saatettuun pylvääseen.

Pylväs eluoitiin sitten gradienttieluoinnin avulla käyttäen 1,5 litraa Ο,ΟΙΜ ja 1,5 litraa 0,4M ammoniumasetaatti-liuoksia, jotka johdettiin fradienttisekoittajän lävitse. Virtausnopeus oli 25 millilitraa tunnissa; kulloinkin 25 otettiin talteen 10 millilitran jakeet. Pylväästä ulos- virtaavaa eluaattia mitattiin jatkuvasti "LKB Uvicord-II laitteen avulla (LKB-Produkter AB, Ruotsi), sitten lyofilioi-tiin saadun käyrän avulla määritetty pääjae Leybold-Heraeus Lyofiliointilaitteessa. Tarvittaessa suoritettiin saa-30 dulle tuotteelle uusi kromatograafinen käsittely gradient-tieluointia käyttäen.

Uusien angiotensiini-II-analogien valmistusta esitellään tarkemmin seuraävien esimerkkien avulla.

10 72732

Esimerkki 1 1 8 (Sarkosiini , Isoleusiini-metyyliesteri )-antio- tensiini-II:n valmistus

Vaihe 1: 5 Boc-Arg(NOj)-Val-Tyr(Bsl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-OMe 1,36 grammaa (7,5 mmoolia) Ile-OMe. HC1 liuotettiin 30 millilitraan kloroformia ja lisättiin 1,05 millilitraa trietyyliamiinia ja 1,90 grammaa (5 mmoolia) Boc-Pro-OPfp:tä. Seoksen annettiin seistä vakiona pide-10 tyssä pH-arvossa 30 minuuttia, ravisteltiin sitten veden, 10-prosenttisen sitruunahapon vesiliuoksen ja lopuksi jälleen veden kanssa, kuivattiin vedettömän natriumsul-faatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöksenä saatu suojattu dipeptidi (R^1^ = 0,8) liuotettiin välittömästi 15 5 millilitraan 8n suolahappoliuosta dioksaanissa, 15 mi nuutin seisomisen jälkeen lisättiin liuokseen 20 milli-litraa vedetöntä eetteriä ja seos haihdutettiin kuiviin. Jäännöksenä saatu vapaa dipeptidi-hydrokloridi = 0,46) liuotettiin välittömästi 30 millilitraan kloroformia, 20 liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 4,36 grammaa (7,5 mmoolia) Boc-His(Dnp)-OPfp:tä. Seoksen annettiin seistä yksi tunti, sitten lisättiin 0,83 millilitraa Ν,Ν-dimetyyliaminoetyyliamiinia, annettiin seistä 10 minuuttia ja sitä ravisteltiin sitten 25 natriumkloridilla kyllästetyllä 10-prosenttisella sitruu-nahappoliuoksella, In suolahappoliuoksella, 5-prosentti-sella natriumvetykarbonaatin vesiliuoksella ja vedellä mainitussa järjestyksessä, kuivattiin vedettömän natrium-sulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöksenä 30 saatu suojattu tripeptidi (R ' = 0,45) liuotettiin eristämättä 10 millilitraan 8n suolahappoliuosta dioksaanissa, liuoksen annettiin seistä 15 minuuttia ja sitten lisäämällä vedetöntä eetteriä saostettiin vapaa tripep- tidi-hydrokloridi, eroitettiin suodattamalla ja pestiin.

(5) 35 Tämä vapaa tripeptidi-hydrokloridi (R^ = 0,30) liuotet- n 72732 tettiin välittömästi 15 millilitraan dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 2,4 grammaa (6 mmoolia) Boc-Ile-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa 30 5 minuuttia, sitten poistettiin liuotin haihduttamalla, jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin, liuosta ravisteltiin 10-prosenttisen sitruunahappoliuoksen, In suolahappo-liuoksen ja lopuksi veden kanssa, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännös-10 tä hangattiin eetterin ja n-heksaanin seoksen kanssa suhteessa 1:9 ja suodatettiin. Tällä tavalla saatu suojat- (2) tu tetrapeptidi (R^ = 0,31) liuotettiin 7 millilitraan 8n suolahappoliuosta dioksaanissa, liuoksen annettiin seistä 15 minuuttia ja tuote saostettiin sitten lisäämällä 15 vedetöntä eetteriä ja suodatettiin. Tällä tavalla saatu vapaa tetrapeptidi-hydrokloridi = 0,38) liuotettiin seokseen, joka sisälsi 20 millilitraa kloroformia ja 10 millilitraa dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 2,96 grammaa 20 (5,5 mmoolia) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa 15 minuuttia ja sitten poistettiin liuotin haihduttamalla. Jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin, liuokseen lisättiin 0,22 millilitraa Ν,Ν-dimetyyliamino-etyyliamiinia, annettiin seistä 10 25 minuuttia, ravisteltiin sitten 10-prosenttisella sitruuna-hapon vesiliuoksella, In suolahapolla ja lopuksi vedellä, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hangattiin vedettömän eetterin kanssa ja suodatettiin. Saatu suojattu pentapeptidi (2) 30 (Rf = 0*52) liuotettiin 10 millilitraan 8n suolahappo-liuosta dioksaanissa ja 15 minuutin kuluttua saostettiin tuote lisäämällä vedetöntä eetteriä, eroitettiin suodattamalla ja pestiin eetterillä. Tällä tavalla saatu vapaa (5) pentapeptidi-hydrokloridi (R^ = 0,8) liuotettiin vä- 35 littömästi 20 millilitraan dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 2,3 grammaa (6 mmoolia) Boc-Val-OPfp:tä. Saadun liuoksen 12 72732 annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa yksi tunti, sitten haihdutettiin liuotin pois, jäännös liuotettiin kloroformiin, liuosta ravisteltiin 10-prosent-tisen sitruunahapon vesiliuoksen, In suolahappoliuoksen 5 ja lopuksi veden kanssa, kuivattiin vedettömän natrium-sulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hangattiin vedettömän eetterin kanssa ja suodatettiin.

(2)

Saatu suojattu heksapeptidi (Rf ' = 0,43) liuotettiin välittömästi 8n suolahappoliuokseen dioksaanissa, liuoksen 10 annettiin seistä 15 minuuttia, tuote saostettiin sitten lisäämällä vedetöntä eetteriä, suodatettiin ja pestiin. Saatu vapaa heksapeptidi-hydrokloridi liuotettiin välittömästi 15 millilitraan dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 2,6 15 grammaa (6 mmoolia) Boc-Arg (NC>2) -OPfp: tä . Liuoksen annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa 30 minuuttia, lisättiin sitten 45 millilitraa kloroformia ja seosta ravisteltiin In suolahappoliuoksen ja veden kanssa, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin 20 kuiviin. Jäännöstä hangattiin etyyliasetaatin kanssa ja suodatettiin. Tällä tavalla saatiin 3,3 grammaa suojattua heptapeptidiä Boc-Arg(NO„)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-pro- (3) 1

Ile-OMe (R^. = 0,37) (tämä määrä vastaa 51 % Boc-Pro- OPfp:n mukaan lasketusta teoreettisesta saannosta, josta 25 saadaan keskimääräinen vaiheittainen saanto 90 prosentiksi) .

Vaihe 2; Z-Sar-Arg(NC^)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-OMe 3,3 grammaa (2,5 mmoolia) Boc-Arg(NC^)-Val-Tyr(Bzl)-30 Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-OMe:tä liuotettiin 15 millilitraan 8n suolahappoliusota dioksaanissa, liuoksen annettiin seistä 20 minuuttia huoneenlämpötilassa, sitten lisättiin vedetöntä eetteriä; saostunut tuote eroitettiin suodattamalla ja pestiin eetterillä. Saatu vapaa heptapeptidi-hyd-35 rokloridi (Rf^ = 0,7) liuotettiin välittömästi 15 milli-litraan dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 2,4 grammaa (6 ramoo- 13 72732 lia) Z-Sar-OPfP:tä. Liuoksen annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa 30 minuuttia, sitten lisättiin 45 millilitraa kloroformia, ravisteltiin In suolahappo-liuoksella ja sitten vedellä, kuivattiin vedettömän nat-5 riumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierrettiin etanolin kanssa ja suodatettiin. Tällä tavalla saatiin 3,17 grammaa suojattua oktapeptidiä. A-Sar-Arg(NC^) -Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-OMe, (89 % teor.); sp. 197-209°C? Rf(4) = 0,82.

10 Vaihe 3:

Suojaryhmien poisto 2,59 grammaa (1,83 mmoolia) Z-Sar-Arg(NC^)-Val-

Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-OMe:tä liuotettiin 5 milli- litraan dimetyyliformamidia ja lisättiin 4,6 millilitraa 15 2 merkaptoetanolia. Seosta sekoitettiin 1,5 tuntia, sitten saostettiin tuote lisäämällä vedetöntä eetteriä ja eroi- tettiin suodattamalla. Saatiin 2,0 grammaa suojattua, mutta dinitrofenyyliryhmiä sisältämätöntä oktapeptidiä (4) (Rj = 0,42; 87 % teor.). Tämä tuote liuotettiin 40 20 millilitraan metanolin, etikkahapon ja veden suhteessa 5:1:1 olevaan seokseen, liuokseen lisättiin 1,0 grammaa 10-prosenttista palladium/aktiivihiili-katalyyttiä ja liuoksen lävitse johdettiin voimakkaasti sekoittaen 20 tunnin ajan vetykaasua. Reaktion päätyttyä poistettiin ka-25 talyytti suodattamalla, pestiin samalla liuotinseoksella ja pesunesteen kanssa yhdistetty suodos haihdutettiin kuiviin. Jäännökseen lisättiin vesipitoista etanolia, haihdutettiin uudestaan kuiviin ja tämä käsittely suoritettiin vielä muutamia kertoja. Lopuksi hangattiin jäännöstä vedet-30 tömän eetterin kanssa, suodatettiin ja kuivattiin. Tällä tavalla saatiin 1,56 grammaa vapaata oktapeptidi-metyyli-esteriä (98 % teor.). Tämä raaka tuote puhdistettiin edelläesitetyn yleisen puhdistusmenetelmän mukaan.

1 e

Saadun (Sarkosiini , Isoleusiini-metyyliesteri )- 35 angiotensiini-II:n luonteenomaiset ominaisuudet olivat (7) (P ) (9) seuraavat: Rf =0,19; Rf =0,59; Rf =0,38;

Erlll (pH= 1,9) : 1,00.

Lj j. LI

14 72732

Aminohappoanalyysi: Pro 1,07 (1), Vai 1,1 (1), Tyr 0,8 (1), His 1,03 (1); Arg 1,0 (1), Ile 1,87 (2), Sar 1,0 (1).

Esimerkki 2 1 8 (HYdroksiasetyyli , Isoleusiini-metyyliesteri )-

5 angiotensiini-II

Vaihe 1: Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-OMe 1.5 grammaa (0,8 mmoolia) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr (Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-OMe:tä (valmistettuna 10 esimerkin 1 vaiheen 1 mukaan) liuotettiin 6 millilitraan 8n suolahappoliuosta dioksaanissa, liuoksen annettiin seistä 20 minuuttia huoneenlämpötilassa, sitten saostettiin tuote lisäämällä vedetöntä eetteriä ja suodatettiin. Saatu vapaa heptapeptidi-hydrokloridi (R^^ = 0,7) liuotet-15 tiin välittömästi 10 millilitraan dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 0,46 grammaa (1,17 mmoolia) Z-OGly-OPfp:tä. Seoksen annettiin seistä 30 minuuttia, sitten lisättiin 30 millilitraa kloroformia, ravisteltiin 10-prosenttisen 20 sitruunahapon vesiliuoksen, In suolahapon ja lopuksi veden kanssa, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hangattiin eetterin kanssa ja suodatettiin. Tällä tavalla saatiin 1,05 grammaa suojattua oktapeptidiä, Z-OGly-Arg (NC>2) -Val-25 Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-OMe, (93 % teor.); sp. 140-145°C, Rf(3) = 0,24.

Vaihe 2:

Suojaryhmien poisto 1.05 grammaa (0,74 mmoolia) Z-OGly-Arg(N02)-Val-30 Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Ile-OMe:tä liuotettiin 5 milli- litraan dimetyyliformamidia ja lisättiin 2,3 millilitraa 2-merkaptoetanolia. Seoksen annettiin seistä huoneenlämpö-tilassa 1,5 tuntia, sitten tuote saostettiin lisäämällä vedetöntä eetteriä ja pestiin eetterillä. Tällä tavalla 35 saatiin 0,85 grammaa suojattua oktapeptidiä, joka ei enää 15 72732 (4) sisältänyt dinitrofenyyliryhmiä (85 % teor.= 0,4. 0,75 grammaa (0,6 mmoolia) tätä tuotetta liuotettiin 20 millilitraan metanolin, etikkahapon ja veden suhteessa 5:1:1 olevaan seokseen, liuokseen lisättiin 0,8 gram-5 maa 10-prosenttista palladium/aktiivihiili-katalyyttiä ja seoksen lävitse johdettiin voimakkaasti sekoittaen vetykaasua 18 tunnin ajan. Reaktion päätyttyä poistettiin katalyytti suodattamalla, pestiin samalla liuottimena ja pesunesteeseen yhdistetty suodos haihdutettiin kuiviin. 10 Jäännös haihdutettiin useita kertoja vesipitoisen etanolin kanssa kuiviin, sitä hangattiin sitten vedettömän eetterin kanssa, suodatettiin ja kuivattiin. Tällä tavalla saatiin 0,48 grammaa vapaata oktapeptidi-metyyliesteriä (82 % teor.). Tämä raaka tuote puhdistettiin sitten edel- 15 läesitetyn yleisen menetelmän mukaan; puhtaan tuotteen (7) luonteenomaiset ominaisuudet olivat seuraavat: R ' = f o) (9) 0,29; R^ = 0,72; =0,60; aminohappoanalyysi:

Pro 1,0 (1), Vai 1,0 (1), Ile 1,7 (2), Tyr 0,88 (1),

His 1,02 (1), Arg 0,96 (1).

20 Esimerkki 3 (L- ot-amino-oksipropionihappo''·, isoleusiini-metyy- g liesteri )-angiotensiini-II:n valmistus.

Vaihe 1:

Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-OBzl 25 2,9 grammaa (12 mmoolia) Pro-OBzl.HCl:ää liuotet tiin 50 millilitraan kloroformia ja lisättiin 1,68 milli-litraa trietyyliamiinia ja 5,87 grammaa (10 mmoolia) Boc-His(Dnp)-OPfp:tä. Liuosta sekoitettiin vakiona pidetyssä pH-arvossa yksi tunti, sitten sitä ravisteltiin 30 kulloinkin 25 millilitran kanssa 10-prosenttista sitruuna-hapon vesiliuosta, In suolahappoliuosta, 5-prosenttista natriumvetykarbonaatin vesiliuosta ja vettä mainitussa järjestyksessä, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hangattiin 35 n-heksaanin kanssa ja suodatettiin. Saatu suojattu dipep- ie 72732 (3) tidi (Rf = 0,80) liuotettiin 13 millilitraan suola- happoliuosta dioksaanissa ja 15 minuutin seisomisen jälkeen saostettiin tuote lisäämällä vedetöntä eetteriä, suodatetaan ja pestiin eetterillä. Tällä tavalla saatu (4) 5 vapaa dipeptidi-hydrokloridi (R^ =0,24) liuotettiin välittömästi 30 millilitraan dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädettiin arvoon 8 ja lisättiin 4,7 grammaa (12 mmoolia) Boc-Ile-OPfP:tä. Liuoksen annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa yksi tunti, sitten poistet-10 tiin liuotin haihduttamalla, jäännös liuotettiin kloroformiin, liuosta ravisteltiin 10-prosenttisen sitruuna-hapon vesiliuoksen, In suolahappoliuoksen, 5-prosenttisen r.atriumvetykarbonaatin vesiliuoksen ja veden kanssa mainitussa järjestyksessä, kuivattiin vedettömän natrium-15 sulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierrettiin eetterin ja n-heksaanin suhteessa 1:2 olevan seoksen kanssa ja suodatettiin. Saatu suojattu tripeptidi (3) (R^ = 0,82) liuotettiin 15 millilitraan 8n suolahappo- liuosta dioksaanissa ja 15 minuutin seisomisen jälkeen 20 saostettiin tuote lisäämällä vedetöntä eetteriä, suodatettiin ja pestiin eetterillä. Saatu vapaa tripeptidi-hydro-kloridi (R^^ = 0,38) liuotettiin välittömästi 50 milli-litraan dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädettiin tri-etyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 5,9 grammaa (11 mmoo-25 lia) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa 30 minuuttia, sitten haihdutettiin liuotin pois, jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin, lisättiin 0,22 millilitraa N,N-dimetyyliaminoetyyli-amiinia ja seoksen annettiin seistä 15 minuuttia. Reaktio-30 seosta ravisteltiin sitten 10-prosenttisen sitruunahapon vesiliuoksen, IN suolahappoliuoksen ja viimeksi veden kanssa, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierrettiin eetterin kanssa ja suodatettiin. Tällä tavalla saatu suojattu (3) 35 tetrapeptidi (R^ = 0,73) liuotettiin välittömästi 20 17 72732 millilitraan suolahappoliuosta dioksaanissa ja 15 minuutin seisomisen jälkeen saostettiin tuote lisäämällä vedetöntä eetteriä, suodatettiin ja pestiin. Saatu vapaa tetrapeptidi-hydrokloridi (R^^ = 0,69) liuotettiin 5 välittömästi 50 millilitraan dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 4,2 grammaa (11 mmoolia) Boc-Val-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä tunnin ajan vakiona pidetyssä pH-arvossa, sitten poistettiin liuotin haihduttamalla, jäännös liuo-10 tettiin etyyliasetaattiin, liuosta ravisteltiin tavanomaisella tavalla, kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä käsiteltiin n-heksaanilla ja sitten vedettömällä eetterillä ja suodatettiin. Saatu suojattu pentapeptidi (3) (Rj = 0,65) liuotettiin 20 millilitraan 8n suolahappo-15 liuosta dioksaanissa, liuoksen annettiin seistä 15 minuuttia, lisättiin sitten vedetöntä eetteriä ja saostunut tuote eroitettiin suodattamalla ja pestiin. Tällä taval- (5) la saatu vapaa pentapeptidi-hydrokloridi (R^ = 0,57) liuotettiin välittömästi 60 millilitraan dimetyyliform-20 amidia, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 5,94 grammaa (10 mmoolia) Boc-Arg(Tos)-OPfprtä. Liuoksen annettiin seistä yksi tunti vakiona pidetyssä pH-arvossa, sitten poistettiin liuotin haihduttamalla, jäännös liuotettiin kloroformiin, liuosta ravis-25 teltiin 10-prosenttisella sitruunahapon vesiliuoksen,

In suolahappoliuoksen ja 5-prosenttisen natriumvetykarbo-naatin vesiliuoksen ja veden kanssa mainitussa järjestyksessä, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierrettiin vedettömän 30 eetterin kanssa ja suodatettiin. Tällä tavalla saatiin 5,8 grammaa Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)- (3)

Pro-0Bzl:ää (R^ = 0,63) (42 % His-ryhmän mukaan laske tusta teoreettisesta saannosta, mikä vastaa vaiheittaista keskiarvosaantoa 84 %); sp. = 167-174°C.

18 72732

Vaihe 2:

Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-OH

2,8 grammaa (2,1 mmoolia) edelläesitetyllä tavalla saatua suojattua heksapeptidiä Boc-Arg(Tos)-Vai-5 Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-OBzl liuotettiin 8 millilit-raan dimetyyliformamidia, lisättiin 2,9 millilitraa 2-merkaptoetanolia ja sekoitettiin yksi tunti. Sitten säestettiin dinitrofenyylisuojaryhmistä vapautettu (4) tuote (Rj = 0,17) lisäämällä vedetöntä eetteriä, sus-10 pendoitiin se sitten 30 millilitraan dioksaania ja lisättiin 12 millilitraa In natriumhydroksidiliuosta. Seoksen annettiin seistä tunnin ajan, sitten säädettiin saadun kirkkaan liuoksen pH In suolahapolla arvoon 7 ja dioksaa-ni poistettiin tislaamalla. Jäljelle jääneen vesiliuoksen 15 pH säädettiin suolahapolla arvoon 3, saatu sakka eroitet-tiin suodattamalla ja liuotettiin 60 millilitraan dime-tyyliformamidin ja kloroformin suhteessa 2:3 olevaa seosta. Saadun liuoksen orgaaninen faasi eroitettiin ja orgaaninen liuotin poistettiin tislaamalla. Jäännöksenä 20 saatiin 2,3 grammaa Boc-Arg-(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-OH: ta (96 % teor.) Rf^5) = 0,37; sp. 160-164°C (hajaantuu).

Vaihe 3:

Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Ile-OMe 25 1,25 grammaa (1,1 mmoolia) vaiheesta 2 saatua tuotetta liuotettiin 15 millilitraan dimetyyliformamidia ja liuokseen lisättiin 0,5 millilitraa (3,6 mmoolia) trietyyliamiinia, 0,65 grammaa (3,6 mmoolia) Ile-OMe-hydrokloridia ja 1,35 grammaa (2 mmoolia) disykloheksyyli-30 karbodi-imidin ja tetrafluorifenolin kiteistä kompleksia (aineosien moolisuhde 1:3). Seosta pidettiin vakiona pidetyssä pH-arvossa ja 24 tunnin kuluttua lisättiin vielä sama määrä edellämainittua kompleksia ja edelleen 0,65 grammaa (3,6 mmoolia) Ile-OMe-hydrokloridia. 24 tun-35 nin kuluttua laimennettiin reaktioseosta 45 millilitralla 19 727 32 kloroformia ja sitä ravisteltiin kulloinkin 20 milli-litran kanssa 10-prosenttista sitruunahapon vesiliuosta kahdesti, sitten 5-prosenttisen natriumvetykarbonaatin vesiliuoksen ja lopuksi veden kanssa kulloinkin kerran, 5 kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä käsiteltiin vedettömällä eetterillä ja suodatettiin. Tällä tavalla saatu suojattu heptapeptidi = 0,26) liuotettiin 20 millilitraan kuumaa etanolia ja jäähtymisen jälkeen eristettiin tuote 10 suodattamalla. Saatiin 0,95 grammaa Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Ile-OMe:tä (65 % teor.).

Vaihe 4:

Boc-L-Ola-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-Pro-Ile-OMe 0,95 grammaa Boc-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-15 Pro-Ile-OMe:tä liuotettiin 3 millilitraan 8n suolahappo- liuosta dioksaanissa, liuoksen annettiin seistä 15 minuuttia ja sitten saostettiin lisäämällä vedetöntä eetteriä (5) vapaa heptapeptidiesteri-hydrokloridi (R^ = 0,24), pestiin eetterillä ja liuotettiin välittömästi 10 milli-20 litraan dimetyyliformamidia. Liuoksen pH säädettiin tri-etyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 0,5 grammaa (1,1 mmoolia) Boc-OAla-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa yksi tunti, laimennettiin sitten 30 millilitralla kloroformia, ravisteltiin 10-pro-25 senttisen sitruunahapon vesiliuoksen ja veden kanssa, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Saatua suojattua oktapeptidiä hierrettiin eetterin kanssa ja suodatettiin. Tällä tavalla saatiin 0,83 grammaa Boc-L-Ola-Arg(Tos)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His-30 Pro-Ile-OMe:tä (87 % teor.); Rf(4) = 0,34, sp. 143-146°C (haj.) .

Vaihe 5:

Suojaryhmien poisto 0,75 grammaa (0,57 mmoolia) edelläesitetyllä tavalla 35 saatua suojattua oktapeptidiä liuotettiin seokseen, joka sisälsi 0,5 millilitraa tioanisolia ja 2 millilitraa nes- 20 72732 temäistä fluorivetyä. Seosta pidettiin 1,5 tuntia 0°C lämpötilassa ja saostettiin sitten lisäämällä vedetöntä eetteriä vapaa oktapeptidiesteri. Tämä tuote liuotettiin 30 millilitraan metanolia ja saostettiin uudes-5 taan lisäämällä vedetöntä eetteriä. Tällä tavalla saatiin 0,5 grammaa raakaa oktapeptidiesteriä (89 % teor.). Tämä raaka tuote puhdistettiin sitten edellä esitetyn yleisen puhdistusmenetelmän avulla. Saadun puhtaan (L- oO -amino-oksipropionihappo\ isoleusiini-metyyli- g 10 esteri )-angiotensiini-II:n luonteenomaiset ominaisuudet olivat seuraavat: Rf ^ = 0,30; R_p ^ = 0,68; R^ ^ = 0,46. Aminohappoanalyysi: Pro 1,0 (1), Vai 1,05 (1),

Ile 2,0 (2), Tyr 0,73 (1), His 0,85 (1) Arg 0,97 (1).

Esimerkki 4 1 8 15 (Sarkosiini , threoniini(Me)-metyyliesteri )-an

giotensiini-II

Vaihe 1; Z-Sar-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe 20 0,68 grammaa (4,5 mmoolia) Thr(Me)-OMe:tä liuo tettiin 10 millilitraan kloroformia ja lisättiin 2,28 grammaa (6 mmoolia) Boc-Pro-OPfP:tä. Liuoksen annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa puoli tuntia, sitten poistettiin liuotin tislaamalla, jäännös liuotettiin 25 etyyliasetaattiin ja lisättiin 0,22 millilitraa N,N-di-metyyliamino-etyyliamiinia. 15 minuutin seisomisen jälkeen ravisteltiin reaktioseosta ensin natriumkloridilla kyllästetyn 10-prosenttisen sitruunahappoliuoksen, sitten In suolahappoliuoksen ja lopuksi veden kanssa, kuivattiin 30 vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kui- (2) viin. Jäännöksenä saatu suojattu dipeptidi (R^ = 0,76) liuotettiin puhdistamatta 3 millilitraan 8n suolahappo-liuosta dioksaanissa, liuoksen annettiin seistä 15 minuuttia, laimennettiin sitten vedettömällä eetterillä ja haih-35 dutettiin kuiviin. Jäännöksenä saatu vapaa dipeptidihydro- (4 ) 21 72732 kloridi (R^ = 0,18) liuotettiin välittömästi 10 millilitraan dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 2,95 grammaa (5 mmoolia) Boc-His(Dnp)-OPfprtä. Liuoksen annettiin 5 seistä puoli tuntia vakiona pidetyssä pH-arvossa, sitten poistettiin liuotin tislaamalla ja jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin. Liuokseen lisättiin 0,11 milli-litraa Ν,Ν-dimetyyliaminoetyyliamiinia. Liuoksen annettiin seistä 10 minuuttia ja sitten sitä ravisteltiin 10 natriumkloridilla kyllästetyn, 10-prosenttisen sitruuna-hapon vesiliuoksen sekä vielä veden kanssa, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kui- (2) viin. Jäännöksenä saatu suojattu tripeptidi (R^ liuotettiin välittömästi 5 millilitraan dimetyyliformamidia, 15 seoksen annettiin seistä 15 minuuttia ja rektiotuote saos-tettiin lisäämällä vedetöntä eetteriä, suodatettiin ja pestiin eetterillä. Tällä tavalla saatu vapaa tripeptidi-hydrokloridi (R^^ = 0,3) liuotettiin välittömästi 10 millilitraan dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädettiin 20 trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 2,0 grammaa (5 mmoolia) Boc-Ile-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä puoli tuntia vakiona pidetyssä pH-arvossa, sitten poistettiin liuotin tislaamalla, jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja liuosta ravisteltiin tunnetulla tavalla, 25 kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierrettiin eetterin ja n-heksaanin tilavuussuhteessa 3:7 olevalla seoksella ja suodatettiin. Tällä tavalla saatu suojattu (2) tetrapeptidi (R^ = 0,28) liuotettiin välittömästi 7 millilitraan 8n suolahappoa dioksaanissa, liuoksen annet-30 täin seistä 15 minuuttia ja sitten saostettiin vapaa tetrapeptidi-hydrokloridi lisäämällä vedetöntä eetteriä, suodatettiin ja pestiin eetterillä. Tämä tuote (R^~^ = 0,27) liuotettiin 10 millilitraan dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja li-35 sättiin 2,7 grammaa (5 mmoolia) Boc-Tyr-(Bzl)-OPfprtä.

22 727 32

Liuoksen annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa puoli tuntia, sitten poistettiin liuotin tislaamalla, jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin, liuokseen lisättiin 0,11 millilitraa N,N-dimetyyliaminoetyyliamiinia 5 ja 15 minuutin seisomisen jälkeen ravisteltiin sitä natriumkloridilla kyllästetyn, 10-prosenttisen sitruuna-hapon vesiliuoksen ja veden kanssa ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöksenä saatua suojattua oentapeotidiä (2) (Rp = välittömästi 5 millilitraan 8n suolahappoliuosta 10 dioksaanissa. 15 minuutin seisottamisen jälkeen saostet-tiin vapaa pentapeptidi-hydrokloridi (^^ = 0,48, eristettiin suodattamalla, pestiin eetterillä ja liuotettiin 20 millilitraan dimetyyliformamidia. Liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 1,9 grammaa 15 (9 mmoolia) Boc-Val-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä puoli tuntia vakiona pidetyssä pH-arvossa 8, sitten poistettiin liuotin tislaamalla, jäännös liuotettiin kloroformiin, liuosta ravisteltiin tavanomaisella tavalla, kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierret- 20 tiin vedettömän eetterin kanssa ja suodatettiin. Saatu (2) suojattu heksapeptidi (R^ = 0,44) liuotettiin 10 milli- litraan 8n suolahappoliuosta dioksaanissa ja 15 minuutin seisottamisen jälkeen saostettiin tuote lisäämällä vedetöntä eetteriä, eristettiin suodattamalla ja pestiin.

(4) 25 Saatu vapaa heksapeptidi-hydrokloridi = 0,36) liuo tettiin välittömästi 15 millilitraan dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 2,25 grammaa (5 mmoolia) Boc-Arg(NC^)-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä tunnin ajan vakiona pidetyssä 30 pH-arvossa 8, sitten se laimennettiin 45 millilitralla kloroformia ja sitä ravisteltiin tavanomaisella tavalla, kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierrettiin etanolin kanssa ja eristettiin se suodattamalla.

Tällä tavalla saatiin 3,3 grammaa suojattua heptapeptidiä 35 Boc-Arg (NO,,) -Val-Tyr (Bzl) -Ile-His (Dnp) -Pro-Thr (Me) -OMe 23 72732 (56 % teoreettisesti Thr-ryhmän suhteen lasketusta saannosta, joka vastaa 91 % olevaa vaiheittaista keskimääräistä saantoa); sp. 188-193°C Rf^ = 0,38, ^ = 0,87 .

5 1*95 grammaa (1,5 mmoolia) edellä saatua suojat tua heptapeptidiesteriä liuotettiin 10 millilitraan 8n suolahappoliuosta dioksaanissa ja 20 minuutin kuluttua saostettiin tuote lisäämällä vedetöntä eetteriä, eristettiin suodattamalla ja pestiin. Saatu vapaa heptapep-10 tidiesteri-hydrokloridi (R^ ' = 0,20) liuotettiin 15 millilitraan dimetyyliformamidia, pH säädettiin trietyyli-amiinilla arvoon 8 ja liuokseen lisättiin 0,87 grammaa (2.25 mmoolia) Z-Sar-OPfp:tä. Liuoksen annett-in seistä tunnin ajan vakiona pidetyssä pH-arvossa 8, sitten se 15 laimennettiin 45 millilitralla kloroformia, ravisteltiin 10-prosenttisen sitruunahapon vesiliuoksen, In suolahappo-liuoksen ja lopuksi veden kanssa, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierrettiin etanolin kanssa, eristettiin suodattamalla 20 ja pestiin etanolilla. Tällä tavalla saatiin 1,85 grammaa suojattua oktapeptidiesteriä Z-Sar-Arg(N02)-Val-Tyr (Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe (87 % teor.); sp. 202-208°C; Rf(3) = 0,20; Rf(4) = 0,86.

Vaihe 2; 25 Suojaryhmien poisto 1,85 grammaa (1,4 mmoolia) suojattua oktapeptidiä Z-Sar-Arg(NC^)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-THr(Me)-OMe liuotettiin 8 millilitraan dimetyyliformamidia ja lisättiin 2,6 millilitraa 2-merkaptoetanolia. Seosta sekoi-30 tettiin yksi tunti ja sitten saostettiin lisäämällä vedetöntä eetteriä dinitrofenyyliryhmistä vapautettu suojat- (4) tu oktapeptidi (1,6 g; = 0,52), eristettiin suo dattamalla ja pestiin. Tämä tuote liuotettiin 30 milli-litraan suhteessa 5:1:1 olevaan metanolin, etikkahapon 35 ja veden seokseen ja lisättiin 1,0 grammaa 10-prosenttis- 24 727 32 ta palladium/aktiivihiili-katalyyttiä. Liuoksen lävitse johdettiin voimakkaasti sekoittaen vetykaasua 30 tunnin ajan, sitten poistettiin katalyytti suodattamalla, pestiin samalla liuotinseoksella ja pesunesteeseen yhdistet-5 ty suodos haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierrettiin suhteessa 2:1 olevalla eetterin ja etanolin seoksella ja tuote eristettiin suodattamalla. Tällä tavalla saatiin 0,98 grammaa vapaata oktapeptidiesteriä (83 % teor.).

Tämä raaka tuote puhdistettiin sitten edelläesitetyn ylei- 10 sen puhdistusmenetelmän avulla. Saadun puhtaan (sarko- 1 8 siini , threoniini(Me)metyyliesteri )-angiotensiini-II:n (6) luonteenomaiset ominaisuudet olivat seuraavat: v ; = 0,29; Rf(8) = 0 »55; Rf(9) = 0,27; EGlu (pH = 1,9); amino-happoanalyysi: His 1,03 (1), Arg 0,95 (1), Thr 0,93 (1), 15 Pro 1,03 (1), Vai 1,15 (1), Ile 1,03 (1), Tyr 0,90 (1),

Sar 1,0 (1).

Esimerkki 5 (HYdroksietikkahappo^, threoniini(Me)-metyylies- g terä )-angiotensiini-II 20 Vaihe 1: Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe 0,62 grammaa (0,47 mmoolia) Boc-Arg(N02)-Val-Tyr (Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe:tä (valmistettuna 25 esimerkin 4 vaiheen 1 mukaan) liuotettiin 4 millilitraan 8n suolahappoliuosta dioksaanissa. Liuoksen annettiin seistä 15 minuuttia ja vapaa heptapeptidiesteri-hydroklo-ridi saostettiin sitten lisäämällä vedetöntä eetteriä, eristettiin suodattamalla ja pestiin eetterillä.

30 Tämä tuote (Rf^ = 0,35) liuotettiin välittömästi 10 millilitraan dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 0,8 grammaa (2 mmoolia) Z-OGly-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa 8 tunnin ajan, sitten laimen-35 nettiin se 30 millilitralla kloroformia, ravisteltiin li 25 727 32 10-prosenttisen sitruunahapon vesiliuoksen, In suola-happoliuoksen ja lopuksi veden kanssa, kuivattiin vedet-tämän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierrettiin eetterin ja etanolin suhteessa 9:1 5 olevan seoksen kanssa ja eristettiin suodattamalla.

Tällä tavalla saatiin 0,60 grammaa suojattua oktapeptidi-esteriä Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr(Me)-OMe (90 % teor.); sp. 158-162°c; R-(3) = 0,44. Vaihe 2: 10 Suojaryhmien poisto 0,6 grammaa (0,42 mmoolia) suojattua oktapeptidiä liuotettiin 2 millilitraan dimetyyliformamidia, lisättiin 1,2 millilitraa 2-merkaptoetanolia ja yhden tunnin seisomisen jälkeen saostett-in dinitrofenyyliryhmistä vapau-15 tettu, suojattu oktapeptidiesteri lisäämällä vedetöntä eetteriä. Tämä tuote liuotettiin metanoliin, liuos selkeytettiin aktiivihiilellä, suodatettiin ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierrettiin eetterin kanssa ja suoda- (4) (5) tettiin. Saanto: 0,46 grammaa; =0,16; R^ =0,52.

20 Tuote liuotettiin suhteessa 5:1:1 olevaan metanolin, etikkahapon ja veden seokseen (25 ml), lisättiin 0,3 grammaa 10-rpsosenttista palladium/aktiivihiili-katalyyt-tiä ja seoksen lävitse johdettiin voimakkaasti sekoittaen vetykaasua 17 tunnin ajan. Reaktion päätyttyä poistet-25 tiin katalyytti suodattamalla, pestiin samalla liuotin-aineseoksella ja pesunesteen kanssa yhdistetty suodos haihdutettiin kuiviin. Jäännökseen lisättiin useita kertoja veden ja etanolin seosta ja haihdutettiin kuiviin, jäännöstä hierrettiin eetterin kanssa ja suodatettiin.

30 Saatiin 0,32 grammaa vapaata oktapeptidiesteriä (91 % teor.). Tämä raaka tuote puhdistettiin edelläesitetyn yleisen puhdistusmenetelmän avulla; tällä tavalla saadun puhtaan (hydroksietikkahappo1, threoniini(Me)-metyylies- g teri )-angiotensiini-II:n luonteenomaiset ominaisuudet 35 olivat seuraavat: Rf^ = 0,22; Rf ^ = 0,73; Rf ^ = 0,56 .

72732 26

Aminohappoanalyysi: Thr 0,92 (1), Pro 1,03 (1), Val 1,0 (1), Tyr 0,7 (1), His 1,0 (1), Arg 1,0 (1).

Esimerkki 6 1 8 (Hydroksietikkahappo , threoniini-metyyliesteri )-

5 angiotensiini-II

Vaihe 1:

Boc-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr-OMe 3,8 grammaa (20 mmoolia) Thr-OMe.HC1:ää liuotettiin 50 millilitraan kloroformia ja lisättiin 2,8 milli-10 litraa (20 mmoolia) trietyyliamiinia ja 3,8 grammaa (10 mmoolia) Boc-Pro-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä tunnin ajan vakiona pidetyssä pH-arvossa, sitä ravisteltiin sitten 10-prosenttisen sitruunahapon vesiliuoksen, In suolahapon ja lopuksi veden kanssa, kuivattiin vedettö-15 män natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin.

Saatu suojattu dipeptidiesteri (R^^ = 0,77) liuotettiin 20 millilitraan 9n suolahappoliuosta dioksaanissa ja 15 minuutin kuluttua saostettiin vapaa dipeptidiesteri- hydrokloridi lisäämällä vedetöntä eetteriä, eristettiin (5) 20 suodattamalla ja pestiin. Tämä tuote (R^ =0,2) liuo tettiin välittömästi 30 millilitraan kloroformia, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 4,7 grammaa (8 mmoolia) Boc-His(Dnp)-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä tunnin ajan vakiona pidetyssä pH-arvossa 25 8, sitä ravisteltiin sitten 10-prosenttisen sitruunahapon vesiliuoksen, In suolahappoliuoksen, 5-prosenttisen nat-riumvetykarbonaatin vesiliuoksen ja veden kanssa mainitussa järjestyksessä, kuivattiin vedettömän natriumsulfaa- tin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöksenä saatu (3) 30 suojattu tripeptidiesteri (Rf = 0,47) liuotettiin 20 millilitraan 8n suolahappoliuosta dioksaanissa ja 15 minuutin seisomisen jälkeen saostettiin vapaa tripeptidies- (5) teri-hydrokloridi (Rf = 0,23) lisäämällä vedetöntä eetteriä. Tämä tuote liuotettiin 20 millilitraan kloro-35 formin ja dimetyyliformamidin suhteessa 5:1 olevaan seok-

II

27 7 2 7 3 2 seen, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 4,0 grammaa (10 mmoolia) Boc-Ile-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa 8 puoli tuntia, sitten sitä ravisteltiin 10-prosentti-5 sen sitruunahapon vesiliuoksen, 5-prosenttisen natrium-vetykarbonaatin vesiliuoksen ja lopuksi veden kanssa, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierrettiin useita kertoja n-heksaanin kanssa ja suodatettiin. Tällä tavalla saatu (3) 10 suojattu tetrapeptidi (R^ = liuotettiin 15 millilit- raan 8n suolahappoliuosta dioksaanissa ja 15 minuutin seisomisen jälkeen saostettiin vapaa tetrapeptidi-hydro-kloridi lisäämällä vedetöntä eetteriä. Tämä tuote (Rj ^ = 0,25) liuotettiin välittömästi 30 millilitraan 15 dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädettiin arvoon 8 lisäämällä trietyyliamiinia ja lisättiin 2,05 grammaa (3,8 mmoolia) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp:tä. Liuosta pidettiin sitten puoli tuntia vakiona pidetyssä pH-arvossa 8, haihdutettiin sitten kuiviin, jäännös liuotettiin etyyli-20 asetaattiin ja lisättiin 0,11 millilitraa N,N-dimetyyli-aminoetyyliamiinia. Liuoksen annettiin seistä 15 minuuttia ja sitä ravisteltiin sitten tavanomaisella tavalla, kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöksenä saatua (3) suojattua pentapeptidiesteriä (Rf = 0,57) hierrettiin 25 vedettömän eetterin kanssa ja suodatettiin ja liuotettiin sitten 10 millilitraan 8n suolahappoliuosta dioksaanissa. Liuoksen annettiin seistä 15 minuuttia, vapaa pentapepti-diesteri-hydrokloridi saostettiin lisäämällä vedetöntä eetteriä, eristettiin suodattamalla ja pestiin eetterillä. 30 Tämä tuote (R^^ = 0,27) liuotett-in välittömästi 20 millilitraan dimetyliformamidia, liuoksen pH säädettiin lisäämällä trietyyliamiinia arvoon 8 ja lisättiin 1,75 grammaa (4,5 mmoolia) Boc-Val-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa 8 tunnin ajan, sitten 35 poistettiin liuotin haihduttamalla, jäännös liuotettiin 28 72732 kloroformiin ja liuosta ravisteltiin tavanomaisella tavalla, kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin, öljymäistä jäännöstä hierrettiin eetterillä, suodatettiin ja pestiin. Tällä tavalla saatu suojattu heksapeptidies- (3) 5 teri (R^ ' - 0,55) liuotettiin 8 millilitraan 8n suolahappoliuosta dioksaanissa ja 15 minuutin seisomisen jälkeen saostettiin vapaa heksapeptidiesteri-hydrokloridi lisäämällä vedetöntä eetteriä, eristettiin suodattamalla (5) ja pestiin eetterillä. Tämä tuote (Rf = 0,23) liuotet-10 tiin välittömästi 20 millilitraan dimetyyliformamidia, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 1,8 grammaa (4 mmoolia) Boc-Arg(NO^)-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa 8 tunnin ajan, liuotinaine poistettiin sitten haihduttamal-15 la, jäännös liuotettiin kloroformiin ja liuosta ravisteltiin tavanomaisella tavalla, kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierrettiin eetterin ja etanolin suhteessa 9:1 olevalla seoksella, suodatettiin ja pestiin. Saatiin 2,7 grammaa suojattua heptapeptidiesteriä 20 Boc-Arg (NC>2) “Val-Tyr) Bzl) -Ile-His (Dnp) -Pro-Thr-OMe (26 % His-ryhmän mukaan lasketusta teoreettisesta saannosta, joka vastaa 80 % olevaa keskimääräistä vaiheittaista saantoa); sp. 190-195°C (haj.); Rf^4' = 0,47.

Vaihe 2: 25 Z-OHly-Arg(tK^)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-

Thr-OMe 1,7 grammaa (1,4 mmoolia) edelläsaatua suojattua heptapeptidiesteriä liuotettiin 10 millilitraan 8n suolahappoliuosta dioksaanissa ja 15 minuutin kuluttua 30 saostettiin vapaa heptapeptidiesteri-hydrokloridi (R^ ^ = 0,21) lisäämällä vedetöntä eetteriä ja liuotettiin välittömästi 20 millilitraan dimetyyliformamidia. Liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 0,82 grammaa (2,1 mmoolia) Z-OHly-OPfp:tä.

35 Liuoksen annettiin seistä vakionapidetyssä pH-arvossa 8 I).

29 7 2 7 3 2 puoli tuntia, laimennettiin sitten 40 millilitralla kloroformia, sitä ravisteltiin In suolahappoliuoksen ja veden kanssa, kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierrettiin vedettömän eetterin kanssa ka suodatet-5 tiin. Saatiin 1,6 grammaa suojattua oktapeptidiesteriä (87 % teor.); sp. 188-194°C; Rf(4) = 0,48.

Vaihe 3:

Suojaryhmien poisto 1,6 grammaa (1,2 mmoolia) suojattua oktapeptidi-10 esteriä Z-OGly-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dnp)-Pro-Thr-OMe liuotettiin 5 millilitraan dimetyyliformamidia ja lisättiin 3,8 millilitraa 2-merkaptoetanolia. Seoksen annettiin seistä tunnin ajan, sitten saostettiin dinitro-fenyyliryhmistä vapautettu oktapeptidiesteri lisäämällä 15 vedetöntä eetteriä, eristettiin suodattamalla, liuotettiin metanoliin ja lisäämällä eetteriä saostettiin uudestaan. Saanto: 1,3 grammaa (94 % teor.); R^ ^ = 0,35; Rf^ = 0,72.

Tämä tuote liuotettiin suhteessa 5:1:1 olevaan 20 metanolin, etikkahapon ja veden seokseen, lisättiin 0,6 grammaa 10-prosenttista palladium/aktiivihiili-kata-lyyttiä ja seoksen lävitse johdettiin vetykaasua voimakkaasti sekoittaen 17 tunnin ajan. Reaktion päätyttyä poistettiin katalyytti suodattamalla ja pestiin samalla liuo-25 tinseoksella; pesunesteeseen yhdistetty suodos haihdutettiin kuiviin. Jäännös haihdutettiin useita kertoja etanolin ja veden seoksesta; lopuksi saatua jäännöstä hierrettiin eetterin kanssa, suodatettiin ja pestiin eetterillä. Saatiin 0,64 grammaa vapaata oktapeptidiesteriä (92 % teor.). 30 Tämä raaka tuote puhdistettiin edellä esitetyn yleisen puhdistusmenetelmän avulla; tällä tavalla saadun puhtaan oktapeptidiesterin, (hydroksietikkahappo^, threoniini- g metyyliesteri )-angiotensiini-II:n luonteenomaiset ominaisuudet olivat seuraavat: ^ = 0,22; Rf^ = 0,73; ^9) 30 72732

Rf ' = 0,56; aminohappoanalyysi: Thr 0,92 (1), Pro 1,03 (1), Val 1,0 (1), He 1,05 (1), Tyr 0,7 (1), His 1,0 (1) , Arg 1,0 (1) .

Esimerkki 7 1 8 5 (Sarkosiini , Alaniini-metyyliesteri )-angioten-

siini-II

Vaihe 1; Z-Sar-Arg (NC^) -Val-Tyr (Bzl) -Ile-His (Dnp) -Pro-Ala-OMe 0,7 grammaa (5 mmoolia) Ala-OMe.HC1:ää liuotet-10 tiin 20 millilitraan kloroformia, lisättiin 0,7 milli-litraa trietyyliamiinia ja 1,14 grammaa (3 mmoolia) Boc-Pro-OPfp:tä ja seoksen annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa puoli tuntia. Liuosta ravisteltiin sitten IC-prosenttisen sitruunahapon vesiliuoksen, In suolahappo-15 liuoksen ja lopuksi veden kanssa, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jään- (2) noksenä saatu suojattu dipeptidiesteri (R^ = 0,61) liuotettiin 5 millilitraan 8n suolahappoliuosta dioksaa-nissa, annettiin seistä 10 minuuttia ja laimennettiin 20 vedettömällä eetterillä ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöksenä saatu vapaa dipeptidiesteri-hydrokloridi (R^^= 0,32) liuotettiin 2Q millilitraan kloroformia, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 2,7 grammaa (4,5 mmoolia) Boc-His(Dnp)-OPfp:tä. Liuoksen 25 annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa 8 tunnin ajan, sitten lisättiin 0,33 millilitraa dimetyyliamino-etyyliamiinia ja 15 minuutin kuluttua ravisteltiin seosta 10-prosenttisen sitruunahapon vesiliuoksen, In suola-happoliuoksen ja veden kanssa mainitussa järjestyksessä, 30 kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin avulla ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöksenä saatu suojattu tripeptidi-esteri (Rf^ = Q,27) liuotettiin 10 millilitraan 8n suolahappoliuosta dioksaanissa ja 15 minuutin kuluttua (5) saostettiin vapaa tripeptidiesteri-hydrokloridi (R^ = 1 0,48) lisäämällä vedetöntä eetteriä, eristettiin suodat- 31 727 32 tantalla ja pestiin eetterillä. Tämä tuote liuotettiin välittömästi 30 millilitraan suhteessa 2:1 olevaa kloroformin ja dimetyyliformamidin seosta, liuoksen pH säädettiin arvoon 8 trietyyliamiinin avulla ja lisät-5 tiin 2,4 grammaa (6 mmoolia) Boc-Ile-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä puoli tuntia vakiona pidetyssä pH-arvos-sa 8, sitten poistettiin liuotin haihduttamalla, jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja liuosta ravisteltiin tavanomaisella tavalla, kuivattiin ja haihdutettiin kui-10 viin. Jäännöstä hierrettiin suhteessa 1:9 olevalla eetterin ja n-heksaanin seoksella ja suodatettiin. Tällä (2) tavalla saatu suojattu tetrapeptidiesteri (R^ = 0,29) liuotettiin 10 millilitraan 8n suolahappoliuosta dioksaa- nissa ja 10 minuutin kuluttua saostettiin vapaa tetrapep- (5) 15 tidiesteri-hydrokkloridi (R^ = 0,67) lisäämällä vede töntä eetteriä, eristettiin suodattamalla, pestiin ja liuotettiin välittömästi suhteessa 2:1 olevaan kloroformin ja dimetyyliformamidin seokseen. Liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 1,78 grammaa 20 (3,3 mmoolia) Boc-Tyr(Bzl)-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä 15 minuuttia vakiona pidetyssä pH-arvossa, sitten poistettiin liuotin haihduttamalla, jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja liuosta ravisteltiin tavanomaisella tavalla, kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä 25 hierrettiin vedettömän eetterin kanssa ja suodatettiin; (2) saatu suojattu pentapeptidi (R^ = 0,22) liuotettiin 10 millilitraan 8n suolahappoliuosta dioksaanissa ja 10 minuutin kuluttua saostettiin vapaa pentapeptidiesteri- (4) hydrokloridi lisäämällä vedetöntä eetteriä (Rf = 0,35), 30 suodatettiin ja liuotettiin välittömästi 20 millilitraan dimetyyliformamidia. Liuoksen pH säädettiin trietyyliamii-nilla arvoon 8 ja lisättiin 1,55 grammaa (4 mmoolia) Boc-Val-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa puoli tuntia, sitten poistettiin liuotin 35 haihduttamalla, jäännös liuotettiin kloroformiin ja liuosta 32 72 7 32 ravisteltiin tavanomaisella tavalla, kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierrettiin vedettömän eetterin kanssa ja suodatettiin. Saatu suojattu heksapep- (2) tidiesteri (R^ = 0,35) liuotettiin 8 millilitraan 8n 5 suolahappoliuosta dioksaanissa ja 20 minuutin kuluttua saostettiin vapaa heksapeptidiesteri-hydrokloridi (R^^= 0,75), suodatettiin ja pestiin eetterillä. Tämä tuote liuotettiin välittömästi 20 millilitraan dimetvyliform-amiöia, liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 10 8 ja lisättiin 2,64 grammaa (6 mmoolia) Boc-Arg(N02)~ OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä vakiona pidetyssä pH-arvossa tunnin ajan, laimennettiin sitten 60 millilit-ralla kloroformia, sitä ravisteltiin 60 millilitran kanssa kloroformia, In suolahappoliuoksen ja veden kanssa, 15 kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöstä hierrettiin suhteessa 1:3 olevan etanolin ja eetterin seoksen kanssa, suodatettiin ja pestiin. Saatu suojattu hepta- (4) peptidiesteri (R^ = 0,85) liuotettiin 10 millilitraan 8n suolahappoliuosta dioksaanissa, 15 minuutin kuluttua (4) 20 saostettiin vapaa heptapeptidiesteri-hydrokloridi (R^ = 0,15) lisäämällä vedetöntä eetteriä, suodatettiin ja pestiin ja liuotettiin välittömästi 20 millilitraan dime-tyyliformamidia. Liuoksen pH säädettiin trietyyliamiinilla arvoon 8 ja lisättiin 1,27 grammaa (3,3 mmoolia) 25 Z-Sar-OPfp:tä. Liuoksen annettiin seistä 15 minuuttia vakiona pidetyssä pH-arvossa, laimennettiin sitten 60 mil-lilitralla kloroformia ja ravisteltiin tavanomaisella tavalla, kuivattiin ja haihdutettiin kuiviin. Jäännöksenä saatua suojattua oktapeptidiesteriä hierrettiin 25 milli-30 litran kanssa etanolia, suodatettiin ja pestiin. Tällä tavalla saatiin 1,37 grammaa Z-Sar-Arg(N02)-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Dbp)-Pro-Ala-OMe:tä (33 % Pro-ryhmän suhteen lasketusta teoreettisesta saannosta, mikä vastaa keskimääräistä vaiheittaista saantoa 86 %); sp. 192-196°C; (4) 35 Rf = 0,70.

33 72732

Vaihe 2:

Suojaryhmien poisto 1,37 grammaa (1 mmooli) edelläesitetyllä tavalla saatua suojattua oktapeptidiesteriä liuotettiin 3 milli- 5 litraan dimetyyliformamidia, lisättiin 1,9 millilitraa 2-merkaptoetanolia, annettiin seistä tunnin ajan ja sitten saostettiin dinitrofenyyliryhmistä vapautettu oktapepti- (4) diesteri (1,2 g, 99 % teor., v ' = 0,20) lisäämällä vedetöntä eetteriä, eroitettiin suodattamalla ja pestiin. 10 Tämä tuote liuotettiin 20 millilitraan suhteessa 5:1:1 olevaa metanolin, etikkahapon ja veden seosta, liuokseen lisättiin 0,6 grammaa 10-prosenttista palladium/aktiivihiili-katalyyttiä ja seoksen lävitse johdettiin voimakkaasti sekoittaen vetykaasua 20 tunnin ajan. Reaktion pää-15 tyttyä poistettiin katalyytti suodattamalla ja pestiin samalla liuotinaineseoksella, pesunesteen kanssa yhdistetty suodos haihdutettiin kuiviin ja lisättiin useita kertoja etanolin ja veden seosta sekä haihdutettiin kuiviin jälleen. Lopuksi hierrettiin jäännöstä suhteessa 1:1 20 olevan etanolin ja eetterin seoksen kanssa ja poistettiin suodattamalla. Tällä tavalla saatiin 0,7 grammaa vapaata oktapeptidiesteriä (75 % teor.), joka puhdistettiin edelläesitetyn yleisen puhdistusmenetelmän avulla. Puhtaan 1 8 (sarkosiini , alaniini-metyyliesteri )-antiotensiini-II:n (7) 25 luonteenomaiset ominaisuudet olivat seuraavat: R^ = 0,23. Rf^ = 0,54, ^ = 0,27; aminohappoanalyysi:

His 0,97 (1), Arg 1,03 (1), Pro 1,06 (1), Vai 1,03 (1),

Ile 0,98 (1), Tyr 0,6 (1), Sar 1,0 (1).

Claims

34 7 2 7 3 2

1. Menetelmä yleisen kaavan (I) mukaisten terapeuttisesti käyttökelpoisten oktapeptidiestereiden sekä 5 niiden happoadditiosuolojen valmistamiseksi, X-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Y-OA (I) jossa X merkitsee sarkosyyliryhmää tai hydroksiasetyyli-10 tai α-amino-oksi-propionyyliryhmää, Y on Ile, Thr(Me), Thr tai Ala, ja A merkitsee C^_4~alkyyliryhmää, tunnettu siitä, että yleisen kaavan (II) mukaisesta suojatusta oktapeptidiesterijohdannaisesta, 15 B-X-Arg(C)-Val-Tyr(D)-Ile-His(E)-Pro-Y-OA (II) jossa kaavassa B tarkoittaa asidolyysin tai katalyyttisen hydroge-20 nolyysin avulla poistettavaa ryhmää, erikoisesti bentsvv-lioksikarbonyyli- tai tert.-butyylioksikarbonyyliryhmää, C tarkoittaa Arg-osan guanidinoryhmän väliaikaiseen suojaukseen soveltuvaa suojaryhmää, erikoisesti nitro-tai tosyyliryhmää, 25. tarkoittaa Tyr-osan aromaattisen hydroksyyliryh- män väliaikaiseen suojaukseen soveltuvaa suojaryhmää, erikoisesti bentsyyliryhmää tai substituoitua bentsyyli-ryhmää, E tarkoittaa His-osan imidatsoliryhmän väliaikai-30 seen suojaukseen soveltuvaa suojaryhmää, erikoisesti di-nitrofenyvliryhmää ja A, X ja Y tarkoittavat samaa kuin edellä, poistetaan suojaryhmät selektiivisesti vaiheittain tai yhdessä vaiheessa ja haluttaessa saatu yleisen kaavan I mukainen yh-35 diste muutetaan happoadditiosuolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä yleisen kaavan I mukaisten, X-asemassa alifaattiscn i-amino- 35 7 2 7 3 2 oksi-asyyliryhmän sisältävien oktapeptidiesterien valmistamiseksi vastaavista, yleisen kaavan II mukaisista X-ase-massa myös alifaattisen o^-amino-oksi-asyyliryhmän sisältävistä suojatuista oktapeptidiestereistä, tunnet-5 t u siitä, että suojaryhmän B poistaminen sekä mahdollisesti muiden asidolyysin avulla poistettavien suojaryhmien poistaminen suoritetaan asidolyysin avulla, erikoisesti käsittelemällä fluorivetyhapolla.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä ylei-10 sen kaavan I mukaisten, X-asemassa alifaattisen oi-hydrok-siasyyliryhmän sisältävien oktapeptidiesterien valmistamiseksi vastaavista kaavan (II) mukaisista, mutta X-asemassa alifaattisen oi-amino-oksi-asyyliryhmän sisältävistä suojatuista oktapeptidiestereistä, tunnettu 15 siitä, että suojaryhmän B sekä mahdollisesti muiden asidolyysin tai katalyyttisen hydrogenolyysin avulla poistettavien suojaryhmien poistaminen suoritetaan katalyyttisen hydrauksen avulla poistaen samanaikaisesti ^-ami-no-oksi-asyylitähteen aminoryhmä. 72732 Patentkrav ' 1 ^