HRP20000426A2

HRP20000426A2 - Beta-lipotropin and uses thereof

Info

Publication number: HRP20000426A2
Application number: HR20000426A
Authority: HR
Inventors: Jon Paul Butler; John Edward Hale; William Francis Heath; Mark Louis Heiman; Brigitte Elisabeth Schoner; Gerald Wayne Becker; Alexander David Varshavsky
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1997-12-23
Filing date: 2000-06-23
Publication date: 2000-10-31
Also published as: KR20010024805A; WO1999032142A1; AR018532A1; IL136514A0; TR200002611T2; EP0926239A2; CO4930304A1; EA200000709A1; HUP0100132A2; US20030073621A1; EP0926239A3; PE20000062A1; CA2315888A1; BR9814433A; CN1284882A; JP2001526061A; AU1938599A; US6323178B1; PL341293A1

Description

Upućivanje na podatke

Ovaj izum zahtjeva prednost od provizornih patentnih prijava SAD-a brojeva 60/068,659, prijavljen 23. prosinca 1997., 60/079,857, prijavljen 30. ožujka 1998., 60/086321, prijavljen 21. svibnja 1998., 60/091,385, prijavljen 1. srpnja 1998., 60/095,405, prijavljen 5. kolovoza 1998., 60/103,976 prijavljen 13. listopada 1998.

Pozadina izuma

Ovaj izum se odnosi na farmaciju i medicinu. Izum se posebno odnosi na beta-lipotropin, njegove fragmente i analoge, farmaceutske pripravke i postupke koji ga koriste u liječenju dijabetesa i drugih povezanih stanja kod sisavaca.

Proopiomelanokortin (POMC) je neuropeptidni prekursor molekule koja je translocirana u sekrecionim putovima u neuroendokrinim stanicama. POMC se cijepa djelovanjem specifičnih endopeptidaza i daje peptide kao što su adrenokortikotrofni hormon (ACTH), beta-lipotrofin (BLT), beta-endorfin i melanocitni stimulirajući hormon (MSH). Prevođenje POMC u jedan ili više specifičnih peptida odvija se u tkivu i stanicama na specifičan način (vidjeti općenito: M. Castro i E. Morrison, Crit. Rev. Neurobiol., 11, 35-57, 1997; Roberts, J. L. i Herbert, E., Proc Nat Acad Sci 74, 4826 (1977); Roberts, J. L. i Herbert, E., Proc.Nat.Acad.Sci 74, 5300 (1977); Mains, et al., Proc.Nat.Acad.Sci 74, 3014 (1977). POMC se uglavnom proizvodi u hipofizi i hipotalamusu. Post-translacijska obrada POMC u prednjoj hipofizi proizvodi ACTH i BLT. S druge strane, glavni produkti u središnjoj hipofizi su α-MSH, CLIP, γ-lipotropin, β-endorfin i β-MSH, dok se u hipotalamusu POMC prevodi prije svega u γ-MSH i β-endorfin.

Peptidi koji su derivati POMC izvode niz važnih uloga u metaboličkoj i fiziološkoj regulaciji. Na primjer, ACTH, peptid izgrađen od 39 aminokiselina, stimulira izlučivanje glukokortikoida iz adrenalnog korteksa. MSH, s druge strane, potiče sintezu melanina pomoću melanocita u koži i također je uključen u metabolizam masti. β-Endorfin je derivat karboksilnog kraja BLT-a (viz. ostaci 59 do 89 ljudske sekvence) i posjeduje analgestku aktivnost koja je antagonirana naloksonom, poznatim antagonistom za morfin. Prema tome, peptidni hormoni koji su derivati POMC imaju razne uloge u fiziološkoj i metaboličkoj regulaciji.

Točan mehanizam glukoze i goriva ovisi o inzulinu, peptidu koji nije povezan s POMC. Inzulin posebno stimulira glikogen, masne kiseline i sintezu proteina i također stimulira glukozu. Inzulin je presudan u podupiranju ulaska glukoze u mišićne i masne stanice.

Defektni inzulinski metabolizam može dovesti do dijabetesa. Dijabetes tipa 1 zahtijeva egzogeno davanje inzulina za točnu kontrolu metabolizma goriva i glukoze. S druge strane, dijabetes tipa 2 obično ne zahtijeva egzogeni inzulin sve do kasnijih faza bolesti. Točna kontrola metabolizma glukoze i goriva je neophodna za učinkovito upravljanje dijabetesom. Bez toga, može biti ozbiljnih, možda čak i fatalnih, posljedica koje uključuju ketoacidozu, komu, retinopatiju, dijabetsku mikroanginopatiju, aterosklerozu, miokardialnu infarkciju, kap, gangrenu, hipertrigliceridemiju, hiperkolesterolemiju, kardiomiopatiju, dermopatiju, dijabetski sindrom hrane, neuropatiju, infekciju urinarnog trakta, papilarnu nekrozu, mrenu, dijabetsku gasteroenteropatiju, konstipatiju, perifernu vaskularnu bolest i čak smrt. Stoga bi idealna terapija za dijabetes bila ona koja kontrolira razinu glukoze u krvi poboljšanom osjetljivošću na inzulin.

Ovdje je opisan postupak za liječenje i farmaceutski pripravak koji je efektivan u liječenju ili prevenciji dijabetesa tipa 1 ili tipa 2, i s njima povezanim komplikacijama, a sadrži davanje farmaceutski efektivne količine beta-lipotropina i/ili njegovih fragmenata i/ili analoga.

Bit izuma

Ovaj izum daje izolirane proteine koji sadrže beta-lipotropin (BLT), njegove analoge, njegove fragmente, nukleinske kiseline koje ga enkodiraju, i postupke za proizvodnju i korištenje BLT u liječenju dijabetesa i s njim povezanih komplikacija.

Ovdje su pokazani postupci za liječenje dijabetesa i njegovih komplikacija u sisavcima, uključujući ljude, davanjem farmaceutski efektivne količine BLT, njegovih analoga ili njegovih funkcijskih fragmenata. Izum se nadalje odnosi na postupke za liječenje dijabetesa tipa 1 i tipa 2, retinopatije, diabetske mikroangiopatije, ateroskleroze, miokardialne infarkcije, kapi, gangrene, hipertrigliceridemije, hiperkolesterolemije, kardiomiopatije, dermopatije, diatetskog sindroma hrane, nefropatije, infekcije urinanog trakta, papilarne nekroze, mrene, dijabetske gasteroenteropatije, konstipatije i periferne vaskularne bolesti.

Ovdje su pokazani postupci za proizvodnju BLT u E. coli i kvascu. U E. coli BLT se proizvodi kao fuzijski protein koji se može regenerirati iz staničnog lizata u prisustvu visoke soli uobičajenim postupcima pročišćavanja. BLT fuzijski protein sadrži mjesto prepoznavanja za specifičnu proteazu koja se koristi za odjeljivanje fuzijskog partnera od BLT. U kvascu Pichia pastoris, fuzijski protein se cijepa izlučivanjem proteina iz stanice tako da se nativni BLT može čitav regenerirati iz medijske kulture.

U jednom dijelu ovaj izum se također odnosi na stvarno čisti protein koji ima redoslijed aminokiselina koji je SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 7.

U sljedećem dijelu ovaj izum se odnosi na bar jednu izoliranu nukleinsko kiselinsku komponentu koja enkodira protein ili peptid iz ovog izuma.

U sljedećem dijelu ovaj izum se odnosi na vektor koji sadrži izolirani nukleinsko kiselinski spoj ovog izuma.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na vektor koji sadrži izoliranu nukleinsku kiselinu ovog izuma, gdje je rečeni nukleinsko kiselinski spoj operaciono povezan s promotorskom sekvencom.

U sljedećem dijelu ovaj izum se odnosi na stanicu domaćina koja sadrži vektor iz ovog izuma.

U daljnjem dijelu ovaj izum se odnosi na postupak za konstrukciju rekombinantne stanice domaćina koja ima potencijal za ekspresiju beta-lipotropina, rečeni postupak uključuje uvođenje vektora iz ovog izuma na bilo koji pogodan način u rečenu stanicu domaćina.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na postupak za ekspresiju beta-lipotropina u rekombinantnu stanicu domaćina, rečeni postupak sadrži kultiviranje rečene rekombinantne stanice domaćina pod uvjetima pogodnim za ekspresiju gena.

U sljedećem dijelu ovaj izum se odnosi na farmaceutski pripravak koji kao aktivni sastojak obuhvaća beta-lipotropin, njegov analog ili funkcijski fragment, povezan s jednim ili više farmaceutskih nosača, ekscipienta ili njihovih razrjeđivača.

U sljedećem dijelu ovaj izum se odnosi na farmaceutski pripravak gdje je rečeni beta-lipotropin, njegov analog ili funkcijski fragment beta-lipotropin čovjeka.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na beta-lipotropin, njegov analog ili funkcijski fragment za korištenje u liječenju dijabetesa ili njegovih komplikacija.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na fragmente BLT koji imaju inzulinotropsku aktivnost.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na peptid, koji ima inzulinotropsku aktivnost, izabran iz skupine koja se sastoji od SEQ ID NO:9 do SEQ ID NO:13.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na peptid, koji ima inzulinotropsku aktivnost, izabran iz skupine koja se sastoji od SEQ ID NO:14 do SEQ ID NO:25.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na funkcijski analog beta-lipotropinskog peptida koji je naveden ovdje.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na postupak za liječenje dijabetesa koji uključuje davanje terapeutski efektivne količine bar jednog peptida izabranog iz skupine koja se sastoji od SEQ ID NO:9 do SEQ ID NO:25.

U naredbom dijelu ovaj izum se odnosi na postupak za liječenje dijabetesa koji uključuje davanje terapeutski efektivne količine peptida izabranog iz skupine koja se sastoji od SEQ ID NO:9 do SEQ ID NO:13.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na farmaceutski pripravak koji sadrži kao aktivni sastojak bar jedan peptid, koji ima inzulinotropsku aktivnost, izabran iz skupine koja sadrži SEQ ID NO:9 do SEQ ID NO:13.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na postupak za liječenje dijabetesa u sisavcima uključujući čovjeka koji sadrži davanje terapeutski efektivne količine beta-lipotropina, njegovog analoga ili funkcijskog fragmenta.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na postupak za smanjenje razine glukoze u krvi sisavaca davanjem efektivne količine beta-lipotropina, njegovog analoga ili funkcijskog fragmenta.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na postupak za liječenje hiperglikemije u sisavcima kojima je to potrebno davanjem efektivne količine beta-lipotropina, njegovog analoga ili funkcijskog fragmenta.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na postupak za liječenje hiperinzulinemije u sisavcima davanjem efektivne količine beta-lipotropina, njegovog analoga ili funkcijskog fragmenta.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na postupak za povećanje osjetljivosti inzulina u sisavcima davanje efektivne količine beta-lipotropina, njegovog analoga ili funkcijskog fragmenta.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na sintetski postupak na krutoj fazi za pripravu beta-lipotropina, njegovog analoga ili funkcijskog fragmenta.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na postupak za pripravu beta-lipotropina koji obuhvaća:

a. transformaciju pogodnog domaćina ekspresijom vektora gdje rečeni vektor enkodira beta-lipotropin, njegov analog ili funkcijski fragment;

b. kultiviranje rečenog transformiranog domaćina pod uvjetima koji omogućuju ekspresiju rečenog beta-lipotropina;

c. čišćenje rečenog beta-lipotropina pogodnim načinima.

U narednom dijelu ovaj izum se odnosi na ispitivanje beta-lipotropinske aktivnosti koja sadrži sljedeće korake:

a. davanje pokusnog proteina sisavcima koji pokazuju inzulinsku neosjetljivost ili povećanu razinu glukoze u krvi; i

b. ispitivanje razine glukoze i inzulina u krvi nakon koraka (a).

Izum se također odnosi na postupak za liječenje dijabetesa tipa 1 ili tipa II i komplikacija povezanih s njima kod sisavaca davanjem farmaceutski efektivne količine beta-lipotropina, njegovog analoga ili funkcijskog fragmenta.

Detaljni opis izuma

Definicije

Pojam “analog” ili “funkcijski analog” odnosi se na modificirani oblik BLT-a u kojem je najmanje jedna aminokiselina supstitucijom promijenjena tako da rečeni analog zadržava bitan dio iste biološke aktivnosti kao i nemodificirani BLT in vivo i/ili in vitro.

Pojam “bid” ili “b.i.d.” odnosi se na doziranje BLT ili drugog spoja koji se daje dva puta dnevno.

“BLT” se odnosi na beta-lipotropin. BLT čovjeka sadrži 89 animokiselinskih ostataka (SEQ ID NO:8). BLT protein je karakteriziran u različitim organizmima i aminokiselinska sekvenca je određena u različitim organizmima uključujući čovjeka, miša, ovcu i svinju (Li & Chung, Nature, 260, 622-24 (1976); slona (Li et al. Int. J. Pept. Prot. Res. 32, 573-78, 1988); kao i kod drugih sisavaca, koji su ovime svi uključeni kao referenca.

Pojam “beta-lipotropinski fuzijski protein” ili “BLT fuzijski protein” odnosi se na razred hibrida rekombinantnih proteinskih molekula koje uključuju BLT, koji su proizvedeni u E. coli ili drugom tipu stanice i iz kojeg se može generirati BLT, ili BLT fragment pomoću specifične proteolize ili kemijskog cijepanja. Primjeri BLT fuzijskih proteina uključuju one koji su ovdje specificirani kao SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:7.

Pojam “komplementaran” ili “komplementarnost” kao što se koristi ovdje odnosi se na kapacitet purinskih ili pirimidinskih nukleotida da se povežu vodikovim vezama u oblik dvostruke uzvojnice nukleinsko kiselinske molekule. Sljedeće baze su povezane komplementarnošću: gvanin i citozin; adenin i timin; i adenin i uracil. Kao što se koristi ovdje, “komplementaran” znači da se gore navedeni odnos primjenjuje na stvarno sve parove baza koje sadrže jednostruku uzvojnicu nukleinsko kiselinske molekule preko cijele dužine rečene molekule. “Djelomično komplementaran” označava gore navedeni odnos u kojem je jedna od dvije jednostruke nukleinsko kiselinske molekule kraća u dužini od druge tako da je dio jedne od molekula u obliku jednostruke uzvojnice.

Pojam “komplikacije” ili “njegove komplikacije” kao što se koristi ovdje odnosi se na stanja, sindrome, podređenu(e) bolest(i), alimente ili slično povezane s jednom ili više bolesti ili sindroma ili stanja povezanih s defektnim inzulinskim metabolizmom, ili defektnim ugljikohidratnim metabolizmom, na primjer defektni glukozni metabolizam, koji uključuje ali nije ograničen na dijabetes tipa 1 i tipa 2. Primjeri komplikacija uključivali bi retinopatiju, diabetsku mikroangiopatiju, aterosklerozu, miokardialnu infarkciju, kap, gangrenu, hipertrigliceridemiju, hiperkolesterolemiju, kardiomiopatiju, dermopatiju, diatetski sindrom hrane, nefropatiju, infekciju urinanog trakta, papilarnu nekrozu, mrenu, dijabetsku gasteroenteropatiju, konstipatiju i periferne vaskularne bolesti.

“Konzervativna supstitucija” ili “konzervativna aminokiselinska supstitucija” odnosi se na izmjenu jednog ili više aminokiselinkih ostataka u proteinu ili peptidu kao što je prikazano u tablici 1.

“Njegov fragment” odnosi se na fragment, dio ili sub-regiju peptida ili nukleinske kiseline tako da fragment sadrži 2 (dvije) ili više susjednih aminokiselina ili alternativno oko 5 do 14 aminokiselina ili više; ili 10 ili više nukleotida koji su susjedni u ishodnom peptidu ili nukleinsko kiselinskoj molekuli. Njegov fragment može ali ne mora zadržati biološku aktivnost. Na primjer, fragment peptida prikazan ovdje može se koristiti kao antigen za uzgoj specifičnog antitijela protiv ishodnog peptida iz kojeg je fragment deriviran. Kada se odnosi na nukleinsko kiselinsku molekulu, “njegov fragment” odnosi se na 10 ili više susjednih nukleotida, deriviranih iz ishodne nukleinske kiseline, i također, u odnosu na genetski kod, komplementarnoj sekvenci. Na primjer ako fragment određuje sekvencu 5’-AGCTAG-3’, onda “njegov fragment” može uključivati komplementarnu sekvencu 3’-TCGATC-5’.

Pojam “fuzijski protein” pokazuje hibridnu proteinsku molekulu koja nije nađena u prirodi, a obuhvaća translacijsku fuziju ili enzimatsku fuziju u kojoj su dva ili više različitih proteina ili njihovih fragmenata povezani kovalentno na jedan polipeptidni lanac.

“Fuzijski partner” odnosi se na sekvencu aminokiselina u BLT fuzijskom proteinu gdje rečena sekvenca nije derivirana iz BLT, na primjer sekvenca identificirana ovdje kao SEQ ID NO:6.

“Funkcijski fragment” ili “ekvivalent funkcijskog fragmenta”, kao što je korišten ovdje, odnosi se na regiju, ili fragment pune dužine BLT koji zadržava biološku aktivnost, na primjer sposobnost povećanja efekta inzulina in vivo i/ili in vitro; i/ili sposobnost poticanja sniženja glukoze u krvi in vivo, ili povećanja uptake-a u stanicama ili tkivu in vitro. Funkcijski fragment može također dati biološku aktivnost koja se očituje kao puna dužina BLT, in vivo i/ili in vitro, viz. kapacitet da potiče uptake glukoze i/ili poveća efekt inzulina i/ili poveća osjetljivost inzulina. Funkcijski fragment može također biti proizveden tehnologijom kloniranja, ili kemijskom sintezom pomoću kemijskog ili enzimatskog cijepanja.

“Stanica domaćin” se odnosi na bilo koju eukariotsku ili prokariotsku stanicu koja je pogodna za propagiranje i/ili ekspresiju kloniranog gena koji je sadržan na vektoru koji je uveden u rečenu stanicu domaćina, na primjer, transformacijom ili transfekcijom ili slično.

Pojam “homolog” ili “homologan” opisuje odnos između različitih nukleinsko kiselinskih molekula ili aminokiselinskih sekvenci u kojima se rečena sekvenca ili molekula odnosi kao identična ili djelomično identična i/ili slična s jednim ili više blokova ili regija sekvence rečene molekule.

Pojam “hibridizacija” kao što se koristi ovdje odnosi se na postupak u kojem se jednostruka uzvojnica nukleinsko kiselinske molekule pridružuje s komplementarnom uzvojnicom pomoću sparivanja nukleotidnih baza. “Selektivna hibridizacija” se odnosi na hibridizaciju pod uvjetima visoke oštrine. Stupanj hibridizacije ovisi o, na primjer, stupnju homologije, oštrini hibridizacije i o duljini hibridne uzvojnice.

Pojam “inzulinotropski” se odnosi na povećanje aktivnosti inzulina, na primjer, okretanjem ili oslobađanjem efekta inzulinske osjetljivosti.

“Izolirani nukleinsko kiselinski spoj” odnosi se na bilo koju RNA ili DNA sekvencu, bilo konstruiranu ili sintetiziranu, koja se lokacijski razlikuje od svoje prirodne lokacije, na primjer u stanici.

“Nukleinsko kiselinska proba” ili “proba” kao što se koristi ovdje je označen nukleinsko kiselinski spoj koji hibridizira drugi nukleinsko kiselinski spoj. “Nukleinsko kiselinska proba” znači jednostruki lanac nukleinsko kiselinske sekvence koji se kombinira s komplementarnim ili djelomično komplementarnim jednostrukim lancem ciljne nukleinsko kiselinske sekvence te daje dvolančanu molekulu. Nukleinsko kiselinska proba može biti oligonukleotid ili nukleotidni polimer. Proba će obično sadržavati mjerljivu skupinu koja može biti vezana na kraj(eve) probe ili biti unutrašnja u odnosu na sekvencu probe.

Pojam “plazmid” odnosi se na ekstrakromosomski genetski element. Plazmidi prikazani ovdje su komercijalno dostupni, javno dostupni na neograničenoj osnovi ili mogu biti lako konstruirani iz dostupnih plazmida u skladu s objavljenim postupcima.

“Primer” je nukleinsko kiselinski fragment koji služi kao inicirajući supstrat za enzimatsku ili sintetsku elongaciju, na primjer, nukleinsko kiselinskih molekula.

Pojam “promotor” odnosi se na nukleinsko kiselinsku sekvencu koja određuje transkripciju, na primjer, od DNA na RNA. Inducirajući promotor je onaj koji se može regulirati signalima iz okoline, kao što su, na primjer, izvori ugljika, toplina ili metalni ioni. Konstitutivni promotor općenito radi na stalnoj razini i nije ga moguće regulirati.

Pojmovi “protein” i “peptid” se koriste kao sinonimi, i odnose se na dva ili više aminokiselinskih ostatka koji su kovalentno povezani peptidnom vezom. U nekim slučajevima ti pojmovi opisuju aminokiselinske biopolimere koji se sastoje od 10 do oko 500 aminokiselinskih ostataka povezanih peptidnim vezama.

“Rekombinantni DNA klonirajući vektor” kao što se ovdje koristi odnosi se na agens koji se samostalno replicira, koji uključuje ali nije ograničen plazmidima i fagima, a sadrži molekulu DNA kojoj se može ugraditi, ili je ugrađen, jedan ili više dodatnih DNA segmenata.

“Rekombinantni DNA ekspresijski vektor” ili “ekspresijski vektor” kao što se koristi ovdje odnosi se na bilo koji rekombinantni DNA klonirajući vektor, na primjer plazmid ili fag, u kojem je prisutan promotor ili drugi regulacijski element i time je onemogućena transkripcija umetnute DNA, koja može enkodirati protein.

Pojam “oštrina” (engl. “stringency”) odnosi se na uvjete hibridizacije. Uvjeti visoke oštrine defavoriziraju nehomologno sparivanje baza. Uvjeti niske oštrine imaju suprotan efekt. Oštrina se može izmjenjivati, na primjer, uz pomoć temperature ili koncentracije soli.

Uvjeti “niske oštrine” obuhvaćaju, na primjer, temperaturu od oko 37° C ili manje, a koncentracija formamida je manja od oko 50%, i osrednja do niska koncentracija soli (SSC); ili alternativno temperaturu od oko 50° C ili manje, i osrednja do visoka koncentracija soli (SSPE), na primjer 1M NaCl.

Uvjeti “visoke oštrine” obuhvaćaju, na primjer, temperaturu od oko 42° C ili manje, koncentraciju formamida manju od oko 20%, i nisku koncentraciju soli (SSC); ili alternativno temperaturu od oko 65° C ili manje i nisku koncentraciju soli (SSPE). Na primjer, uvjeti visoke oštrine obuhvaćaju hibridizaciju u 0,5 M NaHPO4, 7% natrijev dodecil sulfat (SDS), 1 mM EDTA pri 65°C (Ausubel, F.M. et al. Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, 1989; Green Inc. New York, pri 2.10.3).

“SSC” obuhvaća otopinu za hibridizaciju i ispiranje. Ishodna 20X SSC otopina sadrži 3M natrijev klorid, 0,3M natrijev citrat, pH 7,0.

“SSPE” obuhvaća otopinu za hibridizaciju i ispiranje. 1X SSPE otopina sadrži 180 mM NaCl, 9mM Na2HPO4, 0,9 mM NaH2PO4 i 1 mM EDTA, pH 7,4.

“Stvarno čisto” u vezi s proteinom znači da je rečeni protein odijeljen od drugih staničnih i nestaničnih komponenti, što uključuje i druge proteinske molekule. Stvarno čista priprava je najmanje 85% čista; i prije svega najmanje 95% čista. “Stvarno čisti” protein može se pripraviti iz bilo kojeg broja pogodnih metoda, na primjer, metodom pročišćavanja proteina IMAC (U.S. Patent br. 4,569,794) koja je ovdje uključena kao referenca.

“Liječenje” kao što je korišteno ovdje opisuje upravljanje i brigu o pacijentu u svrhu suzbijanja bolesti, stanja, i nepravilnost i uključuje davanje proteina iz ovog izuma za sprječavanje napada simptoma ili komplikacija, ublažavanje simptoma ili komplikacija, ili eliminaciju bolesti, stanja ili nepravilnosti.

Sve reference koje su navedene u ovoj specifikaciji su uključene kao reference.

Beta-lipotropin je izoliran 1964. iz hipofize ovce, a njegova primarna struktura je objavljena naredne godine (Li et. al. Nature, 208, 1093, 1965). Od tada su objavljene primarne sekvence ovce, goveda, miša, svinje, gvinejske svinje, štakora, slona i BLT čovjeka. (Vidjeti na primjer Lohmar i Li, Biochim. Biophys. Acta, 147, 381, 1967; Li i Chung, Nature, 260, 622, 1976; Drouin i Goodman, Nature, 288, 619, 1980; Li et al. Int. J. Pept. Prot. Res. 32, 573-78, 1988; Blacke i Li, Proc. Nat. Acad. Sci. 80, 1556-1559, 1983; Takahashi et.al. FEBS Lett. 135, 97-102, 1981; koji su svi ovdje uključeni kao reference). Sekvencijski podaci pokazuju da je karboksilni kraj BLT vrlo sličan kod različitih vrsta. S druge strane, opažene su znatne razlike na amino kraju BLT molekula različitih vrsta.

Ovaj izum se nadalje odnosi na BLT fuzijski protein, koji obuhvaća BLT čovjeka (SEQ ID NO:8) ili BLT iz druge vrste, ili njegov funkcijski fragment. Primjeri BLT fuzijskih proteina su prikazani ovdje kao SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:7.

Funkcijski fragment BLT je obično identificiran kao fragment BLT koji pokazuje biološku aktivnost, na primjer, kapacitet na amelioratne simptome dijabetesa, koji se daju sisavcu po potrebi, ili smanjenje razine inzulina u serumu, i/ili povećanje osjetljivosti inzulina, i/ili nižu razinu glukoze u krvi, i/ili poticanje uptake-a glukoze u adipoznom ili mišičinom tkivu, in vivo ili in vitro, ili u adipocitima in vitro. Funkcijski fragmenti BLT obuhvaćaju bilo koji fragment koji zadržava biološku aktivnost i koji obuhvaća bar dva (2) ili više aminokiselinska ostatka koji je u nekim slučajevima blizak BLT proteinu. Preferirani fragmenti obuhvaćaju susjedne regije BLT mapiranja koje su djelomično ili potpuno izvan regije ostataka 59 do 89 BLT čovjeka (SEQ ID NO:8), ili ekvivalentne regije ne-čovjekovog BLT (na primjer regija koja enkodira β-endorfin).

Primjeri funkcijskih fragmenata BLT čovjeka su prikazani ovdje kao SEQ ID NO:9 do SEQ ID NO:25. Preferirani fragmenti su označeni ovdje kao SEQ ID NO:9 do SEQ ID NO:13; a najviše preferirani fragmenti su označeni ovdje kao SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 i SEQ ID NO:13. U nekim slučajevima, funkcijski fragment može obuhvaćati internu deleciju ishodnog BLT, na primjer SEQ ID NO:13, u kojem su aminokiselinski ostatci 7 do 23 BLT čovjeka izbrisani. Funkcijski fragment može se proizvesti kemijskom sintezom na krutoj fazi i/ili rekombinantnim DNA tehnikama koje su dobro znane stručnjacima područja. Vidjeti na primjer K. Struhl, “Reverse biochemistry: Methods and applications for synthesizing yeast proteins in vitro,” Meth. Enzymol. 194, 520-535. Na primjer, u jednom postupku, set delecijskih mutacija je uveden u nukleinsku kiselinu koja enkodira BLT tako da je promijenjena količina regije za enkodiranje peptida koja je izbrisana, bilo s amino terminalnog kraja bilo s karboksi terminalnog kraja molekule. Ova metoda može se također koristiti za dobivanje internih fragmenata intaktnog proteina u kojem su uklonjeni i karboksilni i amino terminalni krajevi. Pogodne nukleaze za stvaranje ovih delecija uključuju na primjer Bal31 ili u slučaju jednolančane nukleinsko kiselinske molekule, mung bean nukleazu. Zbog jednostavnosti, poželjno je da se BLT enkodirajuća nukleinska kiselina klonira u jednolančani klonirajući vektor, kao što je bakteriofag M13, ili ekvivalentan. Ako je potrebno, dobiveni delecijski fragment može se subklonirati u bilo koji pogodni vektor za propagaciju i ekspresiju u bilo kojoj pogodnoj stanici domaćinu.

Funkcijski fragmenti BLT mogu biti identificirani i ispitani na biološku aktivnost korištenjem pogodnih ispitivanja, na primjer, sposobnost peptidnog fragmenta da stimulira ili poveća osjetljivost i/ili uptake’a glukoze u stanicama in vivo ili in vitro.

Funkcijski analozi BLT mogu se generirati delecijom, insercijom, inverzijom i/ili supstitucijom jednog ili više aminokiselinskih ostataka u rečenom BLT ili bilo kojem peptidu prikazanom ovdje. Supstitucijski analozi mogu se općenito napraviti tehnikama čvrste faze ili rekombinacije kod kojih se načini jedna ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija, na primjer u skladu s tablicom 1. Općenito, u slučaju višestruke supstitucije, preferira se promjena manje od deset ostataka u bilo kojoj danoj molekuli, najradije se promjene između jednog i pet ostataka u bilo kojoj danoj molekuli tako da je oko 90% do 99% ostataka istih kao i kod sekvence SEQ ID NO:8; alternativno tako da je otprilike između 95% do 99% ostataka istih kao i kod SEQ ID NO:8 ili drugog pogodnog BLT iz druge specije.

Na primjer, analozi BLT čovjeka (SEQ ID NO:8) obuhvaćajući jednostruku ili višestruku supstituciju u regiji između aminokiselinskih ostataka 1 do 89, obuhvaćaju supstitucije gdje su:

ostatak u položaju 1 je alternativno Glu, Ala, Asp ili Gln;

ostatak u položaju 2 je alternativno Leu, Ile, Val ili Met;

ostatak u položaju 3 je alternativno Thr, Ala, Glu, Ser, Pro, ili Gly;

ostatak u položaju 4 je alternativno Gly, Arg, Ala, Leu, Pro ili Ser;

ostatak u položaju 5 je alternativno Glu, Gln, Asp, Asn ili Ala;

ostatak u položaju 6 je alternativno Arg, Glu, Leu, Lys, Gln ili Ala;

ostatak u položaju 7 je alternativno Leu, Pro, Asp, Val, Ile ili Met;

ostatak u položaju 8 je alternativno Arg, Glu, Ala, Tyr, Leu, Lys, Pro, Gln ili Trp;

ostatak u položaju 9 je alternativno Glu, Ala, Pro, Asp, Asn, ili Gln;

ostatak u položaju 10 je alternativno Gly, Ala, Ser ili Asp;

ostatak u položaju 11 je alternativno Asp, Arg, Pro, Asn Gln, Ala ili Glu;

ostatak u položaju 12 je alternativno Gly, Ala, Ser ili Met;

ostatak u položaju 13 je alternativno Pro, Glu, Gly ili Val;

ostatak u položaju 14 je alternativno Asp, Glu, Asn, Gln ili Gly;

ostatak u položaju 15 je alternativno Gly, Ala, Ser ili Glu;

ostatak u položaju 16 je alternativno Pro, Gln, Leu, Gly ili Glu;

ostatak u položaju 17 je alternativno Ala, Asp, Ser ili Gly;

ostatak u položaju 18 je alternativno Asp, Glu, Gln ili Asn;

ostatak u položaju 19 je alternativno Asp, Glu, Asn ili Gln;

ostatak u položaju 20 je alternativno Gly, Ser ili Ala;

ostatak u položaju 21 je alternativno Ala, Gly, Ser ili Phe;

ostatak u položaju 22 je alternativno Gly, Ala, Ser ili Lys;

ostatak u položaju 23 je alternativno Ala, Phe, Thr, Gly, Ser ili Leu;

ostatak u položaju 24 je alternativno Gln, Arg, Asp, Asn, Leu ili Val;

ostatak u položaju 25 je alternativno Ala, Leu, Asp, Ile, Gly, Ser ili Thr;

ostatak u položaju 26 je alternativno Asp, Glu, Gly, Asn, Gln ili Lys;

ostatak u položaju 27 je alternativno Leu, Ala, Ile, Met ili Val;

ostatak u položaju 28 je alternativno Glu, Gln, Asn ili Asp;

ostatak u položaju 29 je alternativno His, Asn, Tyr, Ala, Gln ili Glu;

ostatak u položaju 30 je alternativno Ser, Gly, Glu, Ala, Leu ili Asp;

ostatak u položaju 31 je alternativno Leu, Ala, Val, Met ili Ile;

ostatak u položaju 32 je alternativno Leu, Ala, Val, Ile, Met ili Pro;

ostatak u položaju 33 je alternativno Val, Ala, Glu, Ile, Met ili Arg;

ostatak u položaju 34 je alternativno Ala, Ser, Pro, Glu ili Gly;

ostatak u položaju 35 je alternativno Ala, Asp, Gly, Ser ili Leu;

ostatak u položaju 36 je alternativno Glu, Ala, Thr, Leu, Asp, Asn ili Gln;

ostatak u položaju 37 je alternativno Lys, Glu, Thr, Arg, Gln ili Asp;

ostatak u položaju 38 je alternativno Lys, Arg, Gln ili Glu;

ostatak u položaju 39 je alternativno Asp, Ala, Asn, Glu, Gln ili Lys;

ostatak u položaju 40 je alternativno Glu, Ser, Asp, Asn, Gln ili Gly;

ostatak u položaju 41 je alternativno Gly, Ala ili Ser;

ostatak u položaju 42 je alternativno Pro, Gly, Ser ili Asn;

ostatak u položaju 43 je alternativno Tyr, Phe ili Trp;

ostatak u položaju 44 je alternativno Arg, Lys, Gln ili Glu;

ostatak u položaju 45 je alternativno Met, Ile, Ser ili Val;

ostatak u položaju 46 je alternativno Glu, Gln, Asp, Asn, His, Arg ili Gly;

ostatak u položaju 48 je alternativno Tyr ili Trp;

ostatak u položaju 49 je alternativno Arg ili Lys;

ostatak u položaju 50 je alternativno Trp, Tyr ili Phe;

ostatak u položaju 51 je alternativno Gly, Ala, Ser ili gln;

ostatak u položaju 52 je alternativno Ser, Thr, Asn ili Ala;

ostatak u položaju 53 je alternativno Pro ili Gly;

ostatak u položaju 54 je alternativno Pro, Ala, Gly, Arg, Leu ili Thr;

ostatak u položaju 55 je alternativno Lys, Arg, Gln ili Ala;

ostatak u položaju 56 je alternativno Asp, Asn, Glu, Gln, Ala, Gly ili Ile;

ostatak u položaju 57 je alternativno Lys, Gln ili Arg;

ostatak u položaju 58 je alternativno Arg, Gln ili Lys;

ostatak u položaju 59 je alternativno Tyr, Phe ili Trp;

ostatak u položaju 60 je alternativno Gly, Ala ili Ser;

ostatak u položaju 61 je alternativno Gly, Ala ili Ser;

ostatak u položaju 62 je alternativno Phe, Tyr ili Trp;

ostatak u položaju 63 je alternativno Met, Leu, Ile ili Val;

ostatak u položaju 64 je alternativno Thr, Ala, Ser ili Lys;

ostatak u položaju 65 je alternativno Ser, Ala, Thr ili Pro;

ostatak u položaju 66 je alternativno Glu, Asp, Asn, Lys ili Gln;

ostatak u položaju 67 je alternativno Lys, Arg ili Gln;

ostatak u položaju 68 je alternativno Ser, Ala, Thr ili Gly;

ostatak u položaju 69 je alternativno Gln, Glu, Asp, Asn, Arg ili His;

ostatak u položaju 70 je alternativno Thr, Ser, Ala ili Lys;

ostatak u položaju 71 je alternativno Pro ili Gly;

ostatak u položaju 72 je alternativno Leu, Ile, Met ili Val;

ostatak u položaju 73 je alternativno Val, Leu, Ile ili Met;

ostatak u položaju 74 je alternativno Thr, Ala ili Ser;

ostatak u položaju 75 je alternativno Leu, Ile, Met ili Val;

ostatak u položaju 76 je alternativno Phe, Tyr, Trp ili Leu;

ostatak u položaju 77 je alternativno Lys, Gln ili Arg;

ostatak u položaju 78 je alternativno Asn, Asp, Glu, Gln ili His;

ostatak u položaju 79 je alternativno Ala, Gly, Ser, Ile ili Val;

ostatak u položaju 80 je alternativno Ile, Leu, Met, Val ili Thr;

ostatak u položaju 81 je alternativno Ile, Met, Val, Thr ili Leu

ostatak u položaju 82 je alternativno Lys, Gln ili Arg;

ostatak u položaju 83 je alternativno Asn, Asp, Glu, Gln ili Ser;

ostatak u položaju 84 je alternativno Ala, Val, Ser, Gly ili Glu;

ostatak u položaju 85 je alternativno Tyr, Phe, Trp ili His;

ostatak u položaju 86 je alternativno Lys, Gln ili Arg;

ostatak u položaju 87 je alternativno Lys, Gln ili Arg;

ostatak u položaju 88 je alternativno Gly, Ala ili Ser;

ostatak u položaju 89 je alternativno Glu, Gln, Asp, Asn ili His.

Dodatno specifično supstituiran BLT (SEQ ID NO:8) uključuje jednostruke ili višestruke supstitucije u SEQ ID NO:8, gdje:

je ostatak u položaju 3 Glu;

je ostatak u položaju 4 Arg;

je ostatak u položaju 6 Gln;

je ostatak u položaju 7 Pro;

je ostatak u položaju 8 Glu, Ala ili Pro;

je ostatak u položaju 9 Pro ili Ala;

je ostatak u položaju 11 Arg ili Pro;

je ostatak u položaju 16 Leu ili Gln;

je ostatak u položaju 21 Phe;

je ostatak u položaju 23 Thr, Leu ili Pro;

je ostatak u položaju 24 Arg ili Val;

je ostatak u položaju 27 Ala;

je ostatak u položaju 29 Asn, Tyr ili Ala;

je ostatak u položaju 30 Glu;

je ostatak u položaju 31 Ala;

je ostatak u položaju 32 Ala;

je ostatak u položaju 33 Ala ili Glu;

je ostatak u položaju 34 Pro ili Ser;

je ostatak u položaju 35 Asp;

je ostatak u položaju 36 Thr ili Ala;

je ostatak u položaju 37 Glu;

je ostatak u položaju 40 Ser;

je ostatak u položaju 42 Ser;

je ostatak u položaju 44 Glu;

je ostatak u položaju 45 Val;

je ostatak u položaju 52 Asn;

je ostatak u položaju 54 Ala ili Arg;

je ostatak u položaju 56 Gly;

je ostatak u položaju 84 Val;

je ostatak u položaju 85 His; i

je ostatak u položaju 89 His.

Tablica 1

Primjeri supstitutivnosti aminokiselina

[image]

Tablica 2

Popis identifikacije sekvenci

[image]

Postupci izolacije gena

Kao što je znano stručnjacima područja, nukleinska kiselina koja enkodira BLT, ili fuzijski protein BLT, može se dobiti tehnikama množinske rekombinacije DNA, koje uključuju na primjer, amplifikacije reakcija lanaca pomoću polimeraze (engl. PCR), ili sintezu DNA de novo. (Vidjeti na primjer, T. Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izd., poglavlje 14 (1989)).

Na primjer, oligonukleotidni primeri koji se nalaze na 3’ i 5’ krajevima SEQ ID NO:1 mogu se koristiti za PCR amplifikaciju Met-Arg-BLT. Vidjeti na primjer PCR Protocols: A Guide to Method and Application, izd. M. Innis et al., Academic Press (1990). PCR amplifikacija obuhvaća template DNA, pogodne enzime, primere, te pufere, i obično se izvodi u DNA Thermal Cycleru (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT). Pozitivni rezultat se ustanovi detekcijom DNA fragmenta pogodne veličine (viz. 273 parova baza) sljedeći elektroforezu na agaroznom gelu.

Postupci proizvodnje proteina

Jedan dio ovog izuma se odnosi na korištenje BLT proteina kao farmaceutskog spoja.

Kao što je znano stručnjacima područja, proteini, njihovi fragmenti ili funkcijski fragmenti ovog izuma mogu se sintetizirati brojnim različitim postupcima, kao što su kemijski postupci dobro poznati u području, koji uključuju peptidnu sintezu na krutom nosaču ili rekombinacijske postupke. Oba postupka su opisana u američkom patentu U.S. 4,617,149, i uključeni su ovdje kao referenca.

Načela kemijske sinteze na krutom nosaču su dobro poznata u području i mogu se naći u općim udžbenicima za ovo područje. Vidjeti, na primjer, H. Dugas i C. Penny, Bioorganic Chemistry (1981) Springer-Verlag, New York, 54-92. Na primjer, peptidi se mogu pripraviti postupkom na krutom nosaču korištenjem sintetizatora peptida Applied Biosystems 430A (Applied Biosystems, Foster City, CA) i sintetskim ciklusima dobivenim od Applied Biosystems.

Sekvencijska t-butoksikarbonilna kemija se koristi za protokol dvostrukih parova i primjenjuje na ishodni C-terminalni karboksamid. Za proizvodnju C-terminalne kiseline koristi se odgovarajući piridin-2-aldoksim metiodidna smola. Asparagin, glutamin i arginin su povezani korištenjem benzotriazolnih estera. Nakon završetka sinteze peptidi se mogu deprotektirati i odcijepiti sa smole pomoću bezvodnog vodikovog fluorida koji sadrži 10% meta-krezola. Cijepanje zaštitne skupine (ili skupina) pokrajnjih lanaca i peptida sa smole izvodi se pri nula stupnjeva Celzijusa ili manje, prije svega pri –20°C tijekom trideset minuta te nakon toga trideset minuta na 0°C.

Općenito, sinteza peptida se sastoji od niza koraka kao što slijedi. Prvo, aminokiselina se sa svojom α-amino skupinom (i funkcionalnim skupinama na pokrajnjim lancima ako je to potrebno) zaštiti i aktivira u oblik reaktivnog estera. Ova aktivirana aminokiselina se veže na inertni kruti nosač preko ove aktivirane esterske skupine i vezana aminokiselina se temeljito ispere. Nakon ovog koraka, sljedeća zaštićena aminokiselina se aktivira u ester u odvojenoj reakciji. α-Amino skupina prve aminokiseline se deprotektira i dobije se reaktivni amin i druga aktivirana aminokiselina se dovede u reakciju s njom te se dobije di-peptid na krutom nosaču. Uzastopno ponavljanje ovih stupnjeva dovodi do peptida rastuće duljine. Nakon završetka sinteze, peptid se ukloni s krutog nosača i funkcionalne skupine pokrajnjih lanaca se deprotektiraju obradom peptida s jakom kiselinom. Peptid se onda odvoji od krutog nosača filtracijom, precipitira se s organskim otapalom i pročisti tehnikama koje su dobro znane u području.

U ovom primjeru, zaštita α-amino skupine je 9-fluroenilmetilkarbonilna skupina (Fmoc). Zaštitne skupine pokrajnjeg lanca su; Boc (za Lys i Trp ostatke), Trt (za Asn, His, Gln), tBu (za Ser, Thr i Trp ostatke), OtBu za Asp, Glu ) i Pmc (za Arg). Aktivni esteri nastaju s (1H-benzo-triazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil uronijevim heksafluorofosfatom (HBTU).

Fmoc, zaštitna skupina α-amino skupine se ukloni obradom krute faze s piperidinom. Pod tim uvjetima Fmoc skupina se lako ukloni dok veza s krutom fazom i zaštitne skupine pokrajnjih lanaca ostaju sačuvane. Zaštićena aminokiselina koja se doda peptidnom lancu koji nastaje je aktivirana s HBTU.

Sinteza BLT čovjeka postavljala je nekoliko posebnih izazova. Prvo, sekvenca peptida sadrži ser-pro-pro tripeptidni segment. Standardna kemija povezivanja daje niz delecijskih grešaka u sintezi. Takve delecije mogu se smanjiti dvostrukim povezivanjem pro ostataka. U preferiranom dijelu sinteza je izvedena dvostrukim povezivanjem Pro i Ser ostataka. Uz to, nakon završetka stupnja povezivanja, bilo koji neproreagirani deprotektirani peptid je blokiran s acetanhidridom da bi se spriječilo produljenje lanca delecije peptida.

Drugo, peptid čovjeka sadrži 3 asp-gly dipeptidne sekvence. Ove sekvence dopuštaju nastajanje cikličkih imina, čak i kad je asp pokrajini lanac zaštićen. Ovi ciklički imini mogu onda reagirati s piperidinom u stupnju deprotekcije te dati peptid modificiran piperidinom. Ova ciklizacija je eliminirana korištenjem N-a-Hmb zaštite svakog glicinskog ostatka koji je prethodio asp ostatku. Vidjeti na primjer Qubbell et.al. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 2343, 1994, što je ovdje navedeno kao referenca. Ispred dva asp-gly dipeptida nalazi se pro. S obzirom na ovo svojstvo sekvence, i manju reaktivnost od hmb zaštićene aminokiseline, svaki od njih je višestruko povezan, i onda zaštićen acetanhidridom. U preferiranom dijelu oni su dvostruko povezani.

U preferiranom postupku peptidi su sintetizirani u jednoj reakciji korištenjem Fmoc kemije. Sinteza BLT je zakomplicirana prisustvom nekoliko asp-gly dipeptidnih sekvenci na N-terminalnom dijelu molekule. Opaženo je aspartilni pokrajini lanac u asp-gly dipeptidnoj sekvenci podliježe bazno kataliziranoj ciklizaciji i nakon toga adiciji s piperidinom tijekom FMOC sinteze. Ova reakcija je uklonjena korištenjem Fmoc- (FmocHmb) -glicina u svakoj asp-gly sekvenci u sintezi. Zaštita glicil amida s Hmb skupinom inhibira ciklizaciju aspartilnih pokrajnjih lanaca. Nakon cijepanja, deprotekcije i čišćenja HPLC-om reverzne faze, peptid se može analizirati elektrosprej masenom spektrometrijom. Glavna specija viđena u ovoj sintezi BLT je peptid pune duljine koji ima očekivanu masu. Korištenje ovog postupka dozvoljava proizvodnju količina pročišćenog proteina više od 100 mg u jednoj reakciji na 0,1 mmol skali.

Proteini ovog izuma mogu se također proizvesti postupkom rekombinantne DNA. Ekspresija kloniranih nukleinskih kiselina koje enkodiraju BLT ili BLT fuziju (na primjer SEQ ID NO:1), mogu se izvoditi u nizu pogodnih stanica domaćina, koje su dobro poznate stručnjacima područja. Iz ovog razloga, BLT enkodirajuća nukleinska kiselina se uvede u stanicu domaćina bilo kojim pogodnim načinom, koji je dobro poznat stručnjacima područja. Dok je kromosomska integracija u dosegu ovog izuma, preferirano je da sekvenca bude klonirana u pogodnom ekstra-kromosomski zadržanom ekspresijskom vektoru tako da se kodirajuća regija BLT gena operativno poveže na konduktivni ili inducirani promotor.

Osnovni koraci u rekombinantnoj proizvodnji BLT proteina su:

a) konstrukcija neutralne, sintetske ili semi-sintetske DNA koja enkodira BLT, ili neki njegov fuzijski protein;

b) integracija rečene DNA u ekspresijski vektor na način pogodan za ekspresiju rečenog proteina;

c) transformiranje ili neko drugo uvođenje rečenog vektora u pogodnu eukariotsku ili prokariotsku stanicu domaćina koja daje rekombinantnu stanicu domaćina,

d) kultiviranje rečene rekombinantne stanice domaćina na način pogodan za ekspresiju rečenog proteina; i

e) regeneriranje i stvarno čišćenje rečenog proteina bilo kojim pogodnim načinom.

Ekspresija rekombinantne BLT fuzijskog proteina u prokariotskim i eukariotskim stanicama domaćinima

Beta-lipotropin (BLT) čovjeka je aminokiselinski hormon s 89 aminokiselina koju proizvodi hipofiza u obliku prekursora proteina kod podliježe post-translacijskom procesiranju te daje nekoliko bioaktivnih hormona uključujući BLT. Zbog toga što je BLT mali i sadrži proteolitički osjetljiva mjesta, mi smo proizveli ovaj protein najprije kemijskom sintezom. Ipak, ovaj postupak nije koristan za dobivanje velikih količina. U ovom izumu, opisujemo postupak prema kojem se BLT može proizvesti u bakterijskim ili gljivičnim ekspresijskim domaćinima u obliku fuzijskog proteina. Ovi fuzijski proteini su zaštićeni od proteolitičke razgradnje i dozvoljavaju regeneraciju intaktnog BLT postupcima opisanim dolje.

U E. coli, BLT se proizvodi kao fuzijski protein koji se može regenerirati iz stanica lizata u prisustvu visokih soli uobičajenim postupcima pročišćavanja. Fuzijski protein sadrži mjesto prepoznavanja za specifičnu proteazu koja se koristi za odjeljivanje fuzijskog partnera od BLT. U Pichia pastoris, fuzijski protein se cijepa nakon izlučivanja iz stanice na takav način da se nativni BLT može detektirati i regenerirati intaktan iz kulturnog medija.

Ovaj postupak nudi postupak proizvodnje za BLT. Za razliku od kemijske sinteze, postupak opisan ovdje može se povećati da daje velike količine BLT.

Prokarijoti se mogu upotrijebiti u proizvodnji rekombinantnog BLT proteina. Na primjer, Escherichia coli K12 lanac 294 (ATCC broj 31446) je posebno koristan za ekspresiju stranih proteina u prokariotskoj stanici. Drugi lanci E. coli, bacili kao što je Bacillus subtilis, enterobakterije kao što je Salmonella typhimrium ili Serratia marcescans, razne vrste Pseudomonas i druge bakterije, kao što je Streptomyces, mogu se također primijeniti kao stanice domaćini kod kloniranja i ekspresije rekombinantnih proteina ovog izuma.

Sekvenca promotora je pogodna za vođenje ekspresije gena u prokarijotima uključujući b –laktamazu [na primjer vektor pGX2907, ATCC 39344, koji sadrži replikacijski i b –laktamazni gen], laktozni sustav [Chang et al., Nature (London), 275:615 (1978)]; Goeddel et al., Nature (London), 281:544 (1979)], alkalna fosfataza i triptofanski (trp) promotorski sustav [vektor pATH1 (ATCC 37695)], koji je dizajniran za olakšanje ekspresije otvorenog okvira za čitanje, kao što je trpE fuzijski protein pod nadzorom trp promotora. Hibridni promotori kao što je tac promotor (može se izolirati iz plazmida pDR540, ATCC-32282) je također pogodan, a isto tako i T7 promotori. I drugi bakterijski promotori, čije su nukleotidne sekvence opće poznate, mogu biti ligirani za DNA enkodiranje proteina ovog izuma, korištenjem likera ili adaptera koji daju bilo koje potrebno restrikcijsko mjesto. Promotori koji se korite u bakterijskim sustavima će također sadržavati Shine-Dalgarnovu sekvencu koje je operacijski povezana na DNA i enkodira željeni polipeptid. Ovi primjeri su ilustrativni, a ne ograničavajući.

Proteini ovog izuma mogu se sintetizirati bilo direktnom ekspresijom ili kao fuzijski protein iz kojeg se fuzijski partner može ukloniti enzimskim ili kemijskim cijepanjem. U načelu, ovaj izum se primjenjuje na fuzijski sustav koji može biti ekspresiran u bakterijskom ili fungalnom domaćinu. U jednom dijelu pogodnog fuzijskog sustava, mjesto za prepoznavanje se smjesti između BLT i fuzijskog partnera, gdje je na primjer, fuzijski partner smješten na amino terminalni kraj BLT. Pogodno mjesto može biti sekvenca koju prepoznaje proteaza, ili mjesto koje je pogodno za kemijsko cijepanje.

Primjeri pogodnih bakterijskih fuzijskih partnera uključuju glutation-S-transferazu, protein za vezanje maltoze, prokarboksipeptidazu, protein za vezanje kalmodulina ili bilo koju sekvencu koja se nalazi na aminoterminalnom kraju i potiče visoki stupanj ekspresije fuzijskog proteina.

Primjeri pogodnih proteaza uključuju faktor Xa, trombin i enterokinazu. Agensi za kemijsko cijepanje uključuju cijanogen bromid, kiselinu, itd.

Primjeri fuzijskih partnera koji su korisni za fungalne sustave uključuju alfa mating faktor, propeptid, albuminski serum čovjeka i bilo koju drugu sekvencu koja potiče ekspresiju i izlučivanje fuzijskog proteina i uzastopno cijepanje (tijekom izlučivanja) te oslobađa nativni BLT u kulturni medij.

U jednom pristupu, BLT fuzijski protein obuhvaća nativnu BLT sekvencu koja je povezana s dipeptidom (viz. Met-Arg) na amino terminalnom kraju nativne BLT molekule (na primjer SEQ ID NO:2). Dipeptidni partner ove fuzijske molekule može se otpustiti obradom s Katepsinom C, i nativna molekula BLT se čisti tehnikama koje su znane u području, kao što je na primjer HPLC. U drugom postupku za proizvodnju rekombinantnog BLT fuzijskog proteina, glutation-S-transferaza (GST) se koristi kao fuzijski partner za proizvodnju proteina ovdje označenog kao SEQ ID NO:7, zapravo opisanog u Smith i Johnson (Gene, 67, 31, 1988), što je ovime uključeno kao referenca.

Često je opaženo u proizvodnji određenih peptida u rekombinantnim sustavima da ekspresija fuzijskog proteina produžuje vrijeme života, povećava iskorištenje željenog peptida ili daje prikladan način za pročišćavanje proteina. Ovo je posebno važno kada se ekspresira protein sisavca u prokariotskim domaćinima. Poznate su različite peptidaze (na primjer enterokinaza ili trombin) koje cijepaju polipeptide na specifičnim mjestima ili rastvore peptid sa amino ili karboksi kraja (na primjer diaminopeptidaza) peptida. Nadalje, neke kemikalije (na primjer cijanogen bromid) će cijepati polipeptidni lanac na specifičnim mjestima. Stručnjak područja će znati da su potrebne modifikacije aminokiselinske sekvence (i sintetska ili semi-sintetska kodirajuća sekvenca ako se koristi rekombinantni način) da se ugradi specifično interno mjesto cijepanja. Vidjeti na primjer, P. Carter, “Site Specific Proteolysis of Fusion Proteins”, poglavlje 13, u Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large Scale Proceses, American Chemical Society, Washington, D.C. (1990).

Uz prokarijote, mogu se koristiti razni amfibijski ekspresijski sustavi kao što su žaba oocit i stanice sisavaca. Izbor određene stanice domaćina ovisi do neke mjere o određenom ekspresijskom vektoru koji se koristi. Primjeri stanica sisavaca koje služe kao domaćini pogodni za korištenje u ovom izumu uključuju na primjer HepG-2 (ATCC HB 8065), CV-1 (ATCC CCL 70), LC-MK2 (ATTCC CCL 7,1), 3T3 (ATCC CCL 92), CHO-K1 (ATCC CCL 61), HeLa (ATCC CCL 2), RPMI8226 (ATCC CCL 155), H4IIEC3 (ATCC CCL 1600), C127I (ATCC CCL 1616), HS-Sultan (ATCC CCL 1484) i BHK-21 (ATCC CCL 10).

Mnogo različitih vektora je pogodno za transformaciju stanica sisavaca koje služe kao domaćini. Na primjer, vektori tipa pSV2 obuhvaćaju segmente genoma simian virusa 40 (SV40) koji je potreban za transkripciju i poliadenilaciju. Veliki broj plazmida vektora tipa pSV2 je konstruiran, kao što su pSV2-gtp, pSV2-neo, pSV2-dhfr, pSV2-hyg i pSV2-b-globin u kojima SV40 promotor vodi transkripciju na insertiranom genu. Ovi vektori su široko dostupni iz izvora kao što su American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20851, ili Northern Regional Research Laboratory (NRRL), 1815 N. University Street, Peoria, Illinois, 61604.

Promotori pogodni za ekspresiju stanica sisavaca uključuju kasni SV40 promotor, promotore iz eukariotskih gena, kao što su na primjer ovalbuminski gen kokoši koji inducira estrogen, interfernoski gen, aminotransferazni gen tirozina koji inducira glukokortikoid, gen koji promovira timidin kinazu i promotori gena glavnog ranog i kasnog adenovirusa.

Transformacija stanice sisavaca vektorom može se izvesti nizom dobro poznatih postupaka, koji uključuju ali nisu ograničeni s protoplast fuzijom, ko-precipitacijom kalcijeva fosfata, elektroporacijom i slično. Vidjeti, na primjer, Maniatis et al. ̧supra.

Neki virusi također rade pogodne vektore. Primjer uključuju adenoviruse, adeno-asocirane viruse, vaccinia viruse, viruse herpesa, bakuloviruse i rous sarkom viruse kao što je opisano u patentu U.S. 4,775,624, koji je ovime uključen kao referenca.

Eukariotski mikroorganizmi kao što je kvasac i druge gljivice su također pogodni kao stanice domaćini. Kvasci Sacharomyces cervisiae i Pichia pastoris su preferirani eukariotski mikroorganizmi. Drugi kvasci kao što je Kluyveromyces lactis su također pogodni. Za ekspresiju u Saccharomyces se može na primjer koristiti plazmid YRp7 (ATCC-40053). Vidjeti, na primjer, L. Stinchcomb et al., Nature, 282, 39, (1979); J. Kingsman et al., Gene, 7, 141, (1979); S. Tschemper et al., gene, 10, 157 (1980). Plazmid YRp7 sadrži TRP1 gen koji daje marker koji se može izabrati za korištenje u trp1 auksotropnom mutantu.

Naredni dio ovog izuma obuhvaća izoliranje nukleinsko kiselinske sekvence koja enkodira BLT ili njegov fragment. Kao što će prepoznati stručnjaci područja, aminokiselinski spojevi ovog izuma mogu se enkodirati velikim brojem različitih nukleinsko kiselinskih sekvenci. Zato što bi ove alternativne nukleinsko kiselinske sekvence enkodirale istu aminokiselinsku sekvencu, ovaj izum obuhvaća ove alternativne nukleinsko kiselinske sekvence.

Nukleinske kiseline ovog izuma koje enkodiraju BLT mogu se također proizvesti postupcima kemijske sinteze. Sinteze nukleinskih kiselina su dobro poznate u području. Vidjeti, na primjer, E.L. Brown, R. Belagaje, M.J. Ryan i H.G. Khorana, Methods in Enzymology, 68:109-151 (1979). Fragmenti DNA sekvence koja odgovara BLT mogli su biti generirani korištenjem uobičajenih uređaja za sintezu DNA, kao što je Applied Biosystems Model 380A ili 380B DNA synthetizer (Applied Biosystems, Inc., 850 Licoln Center Drive, Foster City, CA 94404) korištenjem fosfoamiditne kemije, nakon toga ligiranjem fragmenata tako da daju cijeli gen. Alternativno, se može koristiti fosfotriesterska kemija za sintezu nukleinskih kiselina ovog izuma. (Vidjeti, na primjer, M.J. Gait, izd., Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, (1984)).

Vektori

Drugo gledište ovog izuma se odnosi na vektore za kloniranje rekombinantne DNA i obuhvaća nukleinske kiseline ovog izuma. Preferirani nukleinsko kiselinski vektori su oni koji obuhvaćaju DNA. Najviše preferiran vektor rekombinantne DNA obuhvaća izoliranu DNA sekvencu, SEQ ID NO:1.

Kao što razumije stručnjak područja, izbor najpogodnijeg vektora za kloniranje ili vektora za ekspresiju ovisi o nizu faktora koji uključuju dostupnost restrikcijskog mjesta enzima, vrstu stanice domaćina u koju se vektor treba transfektirati ili transformirati, svrha transfekcije ili transformacije (na primjer, stabilna transformacija kao ekstrakromosomski element ili integracija u kromosom domaćina), prisustvo ili odsustvo selektivnih markera koji se mogu lako isprobati (na primjer markeri antibiotske rezistencije ili metabolički markeri jednog ili drugog tipa), i željeni broj kopija gena u stanici domaćina.

Vektori koji su pogodni za nošenje nukleinskih kiselina ovog izuma obuhvaćaju RNA viruse, DNA viruse, litske bakteriofage, lizogenske bakteriofage, stabilne bakteriofage, plazmide, viroide i slično. Najviše preferirani vektori su plazmidi.

Kao što je poznato stručnjacima područja, kod priprave vektora za ekspresiju treba uzeti u obzir mnoge varijable, na primjer, da li koristiti konstitutivne ili inducibilne promotore. Praktičar također razumije da količina nukleinske kiselina ili proteina koju treba sintetizirati određuje, u jednom djelu, izbor sustava za ekspresiju. U odnosu na promotorsku sekvencu, inducibilni promotori su preferirani jer omogućuju visoki stupanj regulirane ekspresije operativno povezanog gena. Kao što će prepoznati stručnjaci područja, broj pogodnih promotora koji odgovaraju brojnim induktorima, na primjer, izvori ugljika, metalni ioni ili toplina. Drugi bitni uvjeti u vezi ekspresije vektora uključuju dali uključiti sekvencu za određivanje lokacije rekombinantnog proteina. Na primjer, sekvenca koja enkodira signani peptid, koji prethodi kodirajućoj regiji gena, je koristan za dirigiranje ekstracelularnog izvoza dobivenog polipeptida.

Ovaj izum također daje postupak za izradu rekombinantne stanice domaćina koja je sposobna za ekspresiju BLT proteina, rečeni postupak obuhvaća transformaciju ili drugačije uvođenje u stanicu domaćina rekombinantnog DNA vektora koji obuhvaća izoliranu DNA sekvencu koja enkodira BLT. Preferirana stanica domaćina je bilo koja stanica koja može smjestiti visoki stupanj ekspresije eksogeno uvedenog gena ili proteina. Transformirana stanica domaćina može se kultivirati pod uvjetima koji su dobro poznati stručnjacima područja kao što ekspresija rekombinantnog BLT.

Ovaj izum također daje postupke za liječenje čovjeka ili drugih sisavaca afliktiranih bolestima ili stanjima povezanim s defektima metabolizma inzulina ili metabolizma ugljikohidrata, kao što je na primjer hiperglikemija, hiperinzulinemija, dijabetes tipa 1 i tipa 2 i komplikacije koje su povezane s time. Postupak obuhvaća davanje organizmu kojem je to potrebno efektivnu količinu BLT proteina ili peptida, ili fuzijskog proteina koji obuhvaća BLT ili njegovog funkcijskog fragmenta ili njegovog analoga u dozi koja je između oko 1 do 1000 ug/kg tjelesne težine. U izvođenju ovog postupka, BLT se može davati u jediničnoj dnevnoj dozi, u više doza na dan ili kontinuiranim ili diskontinuiranim davanjem pomoću mehaničkog uređaja s pumpom koji je umetnut u tijelo ili na drugi način povezan s njim. Količina BLT ili srodnog proteina ili peptida kojeg treba dati biti će određena od fiziologa i ovisi o takvim faktorima kao što su priroda i seviritnost stanja, sindroma ili bolesti koje se liječi i dobi i općeg zdravlja pacijenta.

Ovaj izum također daje farmaceutski pripravak koji obuhvaća aktivni agens BLT proteina, njegovog funkcijskog fragmenta ili njegovog analoga, na primjer onaj predstavljen sa SEQ ID NO:8 ili njegovom farmaceutski prihvatljivom neotrovnom soli u smjesi s farmaceutski prihvatljivim krutim ili tekućim nosačem. Protein, preferirano u obliku farmaceutski prihvatljive soli, može se pripraviti za parenteralno davanje za terapeutsko ili profilaktično liječenje dijabetesa ili njegovih komplikacija. Na primjer, spojevi SEQ ID NO:8 ili drugi BLT ili njegov fragment mogu se pomiješati s uobičajenim farmaceutskim nosačima ili ekscipientima. Pripravci obuhvaćaju BLT proteina koji sadrži od oko 0,1 do 90% po težini proteina, preferirano u topljivom obliku, i općenitije od oko 10 do 30%. Nadalje, ovaj protein može se davati sam ili u kombinaciji s drugim agensima protiv dijabetesa ili agensima korisnim za liječenje dijabetesa.

Za intravenozno (IV) korištenje, BLT protein, fragment ili analog daje se u uobičajeno korištenom intravenoznom fluidu (ili fluidima) i daje se pomoću infuzije. Mogu se, na primjer, koristiti fluidi kao što su fiziološki salin, Ringerova otopina ili 5%-tna otopina dekstroze.

Za intramuskularne preparate, sterilna formulacija, preferirano pogodni topljivi oblik soli BLT proteina, na primjer SEQ ID NO:8, kao što je hidrokloridna sol, mogu se otopiti i dati u farmaceutskom razrjeđivaču kao što je bezpirogena voda (destilirana), fiziološki salin ili 5%-tna otopina glukoze. Pogodni netopljivi oblik spoja može se pripraviti i dati kao suspenzija u vodenoj bazi ili farmaceutski prihvatljivoj uljnoj bazi, na primjer ester s dugim lancem masne kiseline kao što je etli oleat.

Sljedeći primjeri potpunije opisuju ovaj izum i korištenje BLT za liječenje dijabetes. Kao što će prepoznati stručnjaci područja, određeni reagensi, oprema i postupci opisani su samo ilustrativno i nije namjera da oni ograničavaju ovaj izum na bilo koji način.

PRIMJER 1

Sinteza na krutoj fazi i čišćenje BLT proteina čovjeka

BLT protein čovjeka (SEQ ID NO:8) je sintetiziran u jednom pokusu korištenjem Fmoc kemije. Sinteza BLT je komplicirana prisustvom asp-gly dipeptidnim sekvencama u N-terminalnom dijelu peptida. Opaženo je da aspartilni pokrajini lanci u asp-gly dipeptidnim sekvencama podliježu bazno kataliziranoj ciklizaciji i uzastopnoj adiciji s piperidinom tijekom Fmoc sinteze. Ova reakcija je eliminirana korištenjem Fmoc- (FmocHmb) –glicina na svakoj asp-gly sekvenci u sintezi. Zaštita glicil amida s Hmb skupinom inhibira ciklizaciju aspartilnog pokrajnjeg lanca. Nakon cijepanja, deprotekcije i čišćenja HPLC-om reverzne faze, peptid se može analizirati elektrosprej masenom spektrometrijom. Glavna specija viđena u ovoj sintezi BLT je peptid pune duljine koji ima očekivanu masu. Korištenje ovog postupka dozvoljava proizvodnju količina pročišćenog proteina više od 100 mg u jednoj reakciji na 0,1 mmol skali.

Materijali: prethodno dodani Fmoc-Glu (OtBu) Wang smola (1% unakrsno povezan polistiren funkcionaliziran s p-benzoksibenzilnim alkoholom) kod približno 0,6 mmol aminokiseline/g smole. N-metilpirolidin (NMP), piperidin, 2-(1H-benzotriazol-1il)-1,1,3,3-tetrametiluronium heksafluorofosfat (HBTU), 2M N,N-diizopropiletilamin (DIEA) 1-hidroksibenzotriazol (HOBt), Diklorometan (DKM), Dimetilformamid (DMF).

Smola i prethodno dodana C-terminalna aminokiselina s Fmoc-zaštitom (0,1 ili 0,25 mmol aminokiseline) su odvagani i stavljeni u reakcijsku komoru. Smola je prethodno nabubrena ispiranjem s DKM. Smola je onda isprana NMP. N-terminalna Fmoc skupina je uklonjena inkubacijom smole u 18-22 %-tnoj otopini piperidina u NMP. Nakon deprotekcije, smola je temeljito isprana s NMP.

Jedan mmol sljedeće Fmoc-zaštićene aminokiseline koju treba dodati peptidu je otopljena u 2,1 g NMP, 2,0 g 0,45 M HBTU/HOBt reagensa u DMF. Nakon otapanja, aktivacija aminokiseline je inicirana dodatkom 3 ml 2M DIEA u NMP. Aktivirana aminokiselina je onda dodana deprotektiranoj smoli i dozvoljeno je povezivanje. Nakon završetka povezivanja, smola je temeljito isprana NMP. Potpuni ciklus deprotekcije i povezivanja je ponovljen za svaku narednu aminokiselinu.

Specifični stupnjevi ciklusa u sintezi su kao što slijedi:

[image]

Za aminokiseline koje reagiraju sporo ili nedovoljno, provode se 2 odijeljene reakcije povezivanja. Bilo koji zaostali neproreagirani peptid je blokiran obradom s anhidridom octene kiseline. redoslijed koraka za jednu od ovih aminokiselina je deprotekcija, povezivanje reakcijom 1, ispiranje, povezivanje reakcijom 2, ispiranje, Ac2O zaštita, ispiranje, deprotekcija.

Kratice: OtBu: t-butilni ester, tBu: t-butil, Boc: t-butiloksikarbonil, Pmc: 2,2,5,7,8-pentametilkroma-6-sulfonil, Hmb: 2-hidroksi-4-metoksibenzil, Fmoc: 9-flurenilmetiloksikarbonil.

PRIMJER 2

Konstrukcija sintetskog gena koji enkodira BLT

Konstrukcije plazmida su izvedene korištenjem standardnih postupaka kloniranja kao što su opisane u Maniatis et.al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (1982). Enzimi i drugi reagensi su dobiveni od Gibco-BRL, Gaithersgurg, MD ili New England Boilabs, Beverly MA 01915. Postupci digestiranja, identificiranja, regeneracije i pročišćavanja raznih oligonukleotida i DNA fragmenata korišteni u ovom izumu su poznati stručnjacima područja, kao što su postupci za ligaciju ovi sekvenci u vektore, transformacija mikroorganizma domaćina i kultiviranje ovih mikroorganizama domaćina pod uvjetima koji dozvoljavaju proizvodnju plazmida DNA i rekombinantnih proteinskih produkata.

DNA sekvenca koja enkodira BLT čovjeka (SEQ ID NO:8) je složena iz 8 kemijski sintetiziranih oligonukleotida čija je veličina bila od 52 do 86 baza. Oligonukleotidi su generirani korištenjem uobičajenih uređaja za sintezu DNA kao što je Applied Biosystems Model 380A ili 380B (komercijalno dostupan od Applied Biosystems, Inc., 850 Licoln Center Drive, Foster City, CA 94404). Sekvenca oligonukleotida je dizajnirana na takav način da 4 od tih oligonukleotida generira jedan lanac sintetskog gena a preostala 4 oligonukleotida generiraju komplementarni lanac sintetskog gena. Prije slaganja, oligonukleotidi su obrađeni s polinukleotid kinazom u prisustvu ATP da fosforilira slobodne hidroksilne skupine na pojedinim oligonukleotidima.

Tih 8 oligonukleotida je pomiješano u ekvimolarnoj koncentraciji (3 picomola/ul) u volumenu od 100 ul, grijano na 95°C, gradijentno ohlađeno na sobnu temperaturu tijekom perioda od nekoliko sati. To je dozvoljeno pravilno sparivanje baza pojedinih oligonukleotida. T4 DNA ligaza je dodana za ligaciju oligonukleotida i generiranje dvolančane DNA s ~285 parova baza, koja je analizirana i pročišćena na 2%-tnom agaroznom gelu. Ovaj fragment, koji ima “sparene” krajeve je ligiran u pUC18 vektorom koji se digestiran s NdeI i BamHI. Smjesa za ligaciju je transformirana u kompetentne DH10B stanice koje su stavljene na ploče agara od triptonskog kvasca sa 100ug/ml ampicilina. Kolonije koje su narasle preko noći su analizirane na prisustvo plazmida koji sadrži kemijski sintetizirane gene. To je provedeno čišćenjem plazmida DNA iz tih kolonija, digestiranjem plazmida DNA s NdeI i BaHI i provjerom prisustva fragmenta s ~285 parova baza. Ispravna sekvenca je uzastopno potvrđena sekvencijskom analizom DNA. Plazmid je nazvan pOJ838.

PRIMJER 3

Konstrukcija plazmida koji ekspresira BLT fuzijski protein

Zbog toga što je BLT mali protein, bilo je povoljno povećati njegovu veličinu kreiranjem fuzijskog proteina. U tu svrhu, korištena su dva različita fuzijska partnera. Jedan je bio glutation-S-transferaza (GST), koji ima Xa faktor na mjestu cijepanja i aminokiselinska sekvenca označena ovdje kao SEQ ID NO:6, koja je enkodirana vektorom pGEX-2T (Pharmacia Biotehnology, Piscataway, NJ 08855); drugi je kratka peptidna sekvenca MIIGLMVGGSGSGSGSGDDDDP (SEQ ID NO:3).

Da se dobije nativni beta-lipotropin, fuzijski proteini su obrađeni bilo kemijskom bilo enzimatskom digestijom, da deasociraju beta-lipotropin s fuzijskog partnera. To je postignuto umetanjem mjesta za enzimatsko ili kemijsko cijepanje između fuzijskih partnera i beta-lipotropina. Za GST fuziju, odabrana su mjesta prepoznavanja za enterokinazu ili faktor Xa; za malu sintetsku peptidnu fuziju (SEQ ID NO:3) umetnut je prolin, čime je omogućeno kemijsko cijepanje, nakon čega je slijedila obrada kiselinom.

Plazmid koji enkodira GST fuziju sa sekvencom koja ima mjesto prepoznavanja faktora Xa (IEGR) konstruiran je prema narednom postupku. Plazmid pOJ838 (pUC18 sadrži sintetski beta-lipotropin; vidjeti primjer 4) je digestiran s NdeI i Nrui, a najveći fragment vektora je pročišćen na gelu. Sintetski linker sekvence 5’-TATGAGATCTATCGAAGGTCGTGAGCTCACCGGTCAGCGTGTTCG-3’ (SEQ ID NO:4) i njegov komplement su pomiješani u ekvimolarnim količinama, grijani na 95°C i dozvoljeno je da se aneliraju graduentnim snižavanjem temperature do oko 25°C. Anelirani linker je ligiran na fragment vektora i ligacijska smjesa je transformirana u kompetentne DH10B stanice. Transformirana stanica je stavljena na ploče agara s tripton-kvascem koji sadrži 100ug/ml ampicilina. Kolonije koje su narasle preko noći su analizirane na prisutnost plazmida koji sadrži linkerske sekvence. To je načinjeno čišćenjem plazmida DNA od tih kolonija i potvrđivanjem prisustva BglII mjesta koje je uvedeno pomoću linkera. Ispravna linkerska sekvenca je uzastopno potvrđena DNA sekvencijskom analizom. Dobiveni plazmid je nazvan pOJ839.

Plazmid pOJ839 je digestiran s BglII i EcoRI i mali fragment koji sadrži beta-lipotropinski gen (sada pričvršćen na faktor Xa sekvence za prepoznavanje) je pročišćen na gelu i ligiran u pGEX 2-T digestiran s BamHI i EcoRI. Ligacijska smjesa je transformirana u kompetentne DH10B stanice, koje su stavljene na ploče agara s tripton-kvascem koji sadrži 100ug/ml ampicilina. Kolonije koje su narasle preko noći analizirane su na prisustvo plazmida koji sadrži novi fragment s ~300 pb, a nakon toga je slijedila digestija sa SacI. Novi plazmid je nazvan pOJ840.

PRIMJER 4

Rekombinantni vektor pHMM260-ProCpB(10)/LVPR/Beta lipotropin (R49) koji enkodira prokarboksipeptidaza-BLT fuzijski protein

Rekombinantni DNA vektor za ekspresiju, pHMM260, sadrži ProCpB(10)/LVPR/Beta lipotropin (R49) ekspresijsku kazetu, koja enkodira prokarboksipeptidaza-BLT fuzijski protein. Ovaj vektor je proizveden korištenjem standardnih tehnika kloniranja. Tumačenje ekspresijske kazete pHMM260 je pokazano na slici 16. Ekspresijska kazeta stoji uz bok s NdeI mjestom na 5’ kraju i BamHI mjestom na 3’ kraju. Propeptidna porcija prokarboksipeptidaze B proteina kod svinje nalazi se na 5’ kraju kazete, s Met ostatkom na početku i Ser ostatkom na kraju. Sekvenca prepoznavanja trombinske proteaze, LVPR, nalazi se neposredno na 3’ kraju mjesta cijepanja trombina koji enkodira divlji tip beta-lipotropina čovjeka.

Nekoliko derivata kasete su konstruirani tako da je položaj 49 BLT sekvence iz sekvence divljeg tipa promijenjen iz Arg (R49) u Ala (A49) pHMM261, ili u Glu (E49) pHMM262, ili u Gln (Q49) pHMM263. Ovi derivati su napravljeni zbog smanjenja osjetljivosti na proteolizu tijekom sinteze i pročišćavanja fuzijskog proteina. Svi ovi vektori enkodiraju topljive fuzijske proteine.

PRIMJER 5

Rekombinantni vektor pHMM268 koji enkodira metiltransferaza (SHMT) -BLT fuzijski protein

Fuzijski protein koji sadrži amino-terminalnu sekvencu iz enzima serin hidroksi metilaze transferaze (SHMT) je konstruiran korištenjem standardnih tehnika kloniranja. Plazmid pHMM268 je ekspresiran na visokoj razini u E. coli. Fuzijski protein proizveden pomoću pHMM268 bio je netopljiv i mogao je biti regeneriran s partikulatnim frakcijama. Ova osobina dala je prednost u zaštiti od proteolitske razgradnje.

PRIMJER 6

Davanje mišje BLT tijekom 7 dana muškim Avy/A miševima

Avy/A miševi su model za gojaznost i dijabetes. Ovaj urođeni lanac razvija hiperglikemiju, hiperinzulinemiju, i neosjetljivost na inzulin u srednjim godinama i stoga daje koristan model i za gojaznosti i dijabetes.

Muški Avy/A miševi su dobiveni od Harlan Co. (Indianapolis, IN) i bili su stari oko 6 mjeseci. Životinje su smještene, 6 po kavezu, i hranjene ad libitum 5008 hranom i vodom. Razina glukoze u krvi je mjerena u pravilnim razmacima; kada je razina jutarnje glukoze dosegla najmanje 300mg/dL životinje su uzete u eksperimentalni postupak. Pet životinja, slučajno izabranih, smještene su zajedno kao kontrola; 5 životinja, slučajno odabranih, smještene su zajedno te su obrađene s BLT miša (sekvenca BLT miša je lako dostupna; vidjeti na primjer M. Notake et. al. FEBS Lett. 156, 67-71, 1983; ovdje uključena kao referenca), koja je sintetizirana tehnikom krute faze.

Miševi podvrgnuti obradi s BLT su dobili 60μg bid potkožno (SC) (za svaku dozu ukupno 200μl); kontrolne životinje dobivaju 200μl prijenosnika bid(otopina salina). Životinjama su injektirane dva puta na dan, ujutro i poslije podne, tijekom 6 dana; sedmi dan su dobile samo jutarnju injekciju.

Razina glukoze u krvi, tjelesna težina i potrošnja hrane su mjereni ujutro na dan 0. Tjelesna težina i potrošnja hrane su mjereni svakog jutra prvog do šestog dana. Miševi su postili preko noći od popodneva šestog dana do jutra sedmog dana. Sedmog dana je proveden test tolerancije glukoze. Mjerena je razina glukoze u krvi u vremenu nula 2 sata nakon jutarnje injekcije salina ili BLT. Za ovaj test, životinjama je dano oralno 25%-tna otopina dekstroze (100μl/10g tjelesne težine), onda je uzeta krv 30, 60 i 120 minuta kasnije. Uzorci krvi su korišteni za određivanje razine glukoze i inzulina. Nakon testa oralne tolerancije glukoze, životinje su hranjene ad libitum. Prvog i trećeg dana te četrnaestog dana poslije zadnje SC injekcije, bilo salina bilo BLT, životinjama je uzeta krv da se odrede vrijednosti glukoze u krvi.

REZULTATI:

Davanje BLT smanjuje glukozu i inzulin u krvi in vivo

Rezultati ovih eksperimenata su sažeti u tablicama 1-8. Tijekom sedmodnevne obrade, životinje kontrolne skupine i ispitivane skupine konzumirale su oko 4,5 do 6 grama hrane (slika 1.). Tjelesna težina u obje skupine je ostala ista, oko 50 grama (slika 2),

Obrada s BLT smanjuje trigliceride u plazmi u obrađenim miševima nakon 6 dana obrade (vidjeti sliku 3). Kontrolne životinje pokazale su prosječnu vrijednost od 3,05 nmol/L (s.d. 0,58), dok je za obrađene životinje izmjerena prosječnu vrijednost od 2,05 nmol/L (s.d. 0,43). Ovo predstavlja opadanje serumskih triglicerida od oko 30% do 35%.

BLT također potiče značajno opadanje razine glukoze u krvi kod obrađenih životinja (slika 4). Nakon 7 dana davanja BLT obrađena skupina pokazala je razinu glukoze u krvi od 135 mg/dL (s.d. 16); u znatnoj suprotnosti s kontrolnom skupinom kod koje je izmjereno 171 mg/dL (s.d. 16).

Opadanje razine glukoze u krvi kod obrađenih životinja se je nastavilo za bar 3 dana nakon zadnjeg davanja BLT sedmog dana (slika 5). Kontrolne životinje su pokazale razinu glukoze od 331 mg/dL (s.d. 79). S druge strane, obrađene životinje su zadržale bitno nižu razinu glukoze u krvi, pri 205 mg/dL (s.d. 76). Ovaj efekt BLT u smanjenju razine glukoze u krvi nije opažen 14 dana nakon zadnjeg davanja BLT (slika 6).

Da se osvrnemo na efekt obrade s BLT na razinu inzulina, proveden je oralni test tolerancije glukoze nakon sedmog dana perioda obrade i posta preko noći (slika 7 i slika 8). Kontrolne i obrađene životinje su pokazale inicijalno povećanje razine glukoze u krvi od oko 80 mg/dL na 200 mg/dL, ili više, u točci od 30 minuta nakon inicijacije testa; nakon toga su obje skupine pokazale usporedivu brzinu opadanja vrijednosti, do točke od 2 sata (slika 7). Očito, obrađene životinje su pokazale vrijednosti inzulina u plazmi znatno ispod kontrolnih životinja (slika 8). Na primjer, pri točci od 30 minuta, kontrolne životinje su imale razinu od 11,5 ng/ml (s.d. 1,9), dok su obrađene životinje imale razinu inzulina od 6,0 ng/ml (s.d. 3,0).

PRIMJER 7

Davanje BLT miša tijekom 14 dana muškim Avy/A miševima

Muški Avy/A miševi su smješteni, 6 po kavezu, i hranjeni ad libitum 5008 hranom i vodom. Razina glukoze u krvi je mjerena u pravilnim razmacima; kada je razina jutarnje glukoze dosegla najmanje 300mg/dL životinje su uzete u eksperimentalni postupak. Pet životinja, slučajno izabranih, smještene su zajedno kao kontrola; 5 životinja, slučajno odabranih, smještene su zajedno te su obrađene s BLT miša, koji je sintetiziran tehnikama krute faze.

Miševi podvrgnuti obradi s BLT su dobili 60μg bid potkožno (SC) (za svaku dozu ukupno 200μl); kontrolne životinje dobivaju 200μl prijenosnika (otopina salina). Životinje su injektirane dva puta na dan, ujutro i poslije podne, tijekom 13 dana; četrnaesti dan su dobile samo jutarnju injekciju.

Razina glukoze u krvi, tjelesna težina i potrošnja hrane su mjereni ujutro na dan 0. Tjelesna težina i potrošnja hrane su mjereni svakog jutra prvog do trinaestog dana. Miševi su postili preko noći od popodneva trinaestog dana do jutra četrnaestog dana. Četrnaestog dana je proveden oralni test tolerancije glukoze. Mjerena je razina glukoze u krvi u vremenu nula 2 sata nakon jutarnje injekcije salina ili BLT. Za ovaj test, životinjama je dano oralno 25%-tna otopina dekstroze (100μl/10g tjelesne težine), onda je uzeta krv 30, 60 i 120 minuta kasnije. Uzorci krvi su korišteni za određivanje razine glukoze i inzulina. Nakon testa oralne tolerancije glukoze, životinje su hranjene ad libitum. Prvog i trećeg dana te četrnaestog dana poslije zadnje SC injekcije, bilo salina bilo BLT, životinjama je uzeta krv da se odrede vrijednosti glukoze u krvi.

REZULTATI:

Davanje BLT tijekom 14 dan smanjuje glukozu i inzulin u krvi in vivo

Rezultati su sažeti u tablicama 9-10. Tijekom 14 dana obrade, životinje kontrolne skupine i ispitivane skupine konzumirale su oko 4,5 do 6 grama hrane i tjelesna težina u obje skupine je ostala ista, oko 50 grama (podaci nisu pokazani).

Da se osvrnemo na efekt obrade s BLT tijekom dva tjedna na razinu inzulina, proveden je oralni test tolerancije glukoze nakon četrnaest dana perioda obrade (slika 9 i slika 10). Kontrolne i obrađene životinje su pokazale inicijalno povećanje razine glukoze u krvi od oko 80 mg/dL na 300 mg/dL, ili više, u točci od 30 minuta nakon inicijacije testa; nakon toga su obje skupine pokazale usporedivu brzinu opadanja vrijednosti, do krajne točke od 2 sata (slika 9). Na primjer, obrađene životinje su pokazale prosječnu razinu glukoze u krvi u točci od 30 min. od 289 mg/dL (s.d. 24), dok su kontrolne imale razinu od 348 mg/dL (s.d. 18). Niža razina je također opažena pri 60 min. i 120 min. točkama. Na primjer pri 120 min. obrađene životinje su imale prosječnu razinu glukoze u krvi od 114 mg/dL (s.d. 4), dok su kontrolne imale razinu od 188 mg/dL (s.d.).

Testirane životinje su također pokazale vrijednosti inzulina u plazmi znatno ispod kontrolnih životinja (slika 10). Na primjer, pri točci od 30 minuta, kontrolne životinje su imale razinu inzulina pri 7,4 ng/ml (s.d. 2,1), dok su obrađene životinje imale razinu inzulina od 4,8 ng/ml (s.d. 0,6).

PRIMJER 8

BLT stimulira uptake glukoze u 3T3 adipocitima

Stanice miša 3T3-L1 su stavljene na ploče u oko 100 μl medija za rast po rupici na ploči s 96 rupica tako da je oko 25.000 stanica raspodijeljeno po rupici.

Medij za rast:

DMEM, visoka glukoza, w/out L-glutamin

10% Calf seruma

2 mM L-glutamina

1% PenStrep

1,25μg/ml fungizona

Stanice su inducirane za diferencijaciju u adipocitima 3 dana nakon stavljanja na ploče zamjenom medija za rast s diferencijacijskim medijem.

Diferencijacijski medija:

DMEM, visoka glukoza, w/out L-glutamin

10% FBS

2 mM L-glutamina

1% Pen Strep

1,25μg/ml fungizona

10mM Hepes

0,25μM deksametazona (1μl/ml od 0,25mM početne otopine)

0,5mM IBMX (10μl/ml od 50mM početne otopine)

5μg/ml inzulina (1μl/ml, početna otopina 5mg/ml)

Medij je uklonjen iz stanica aspiracijom korištenjem osmokanalne cijevi povezane s kućnim izvorom vakuuma i regulatorom toka. Svježi medij je podijeljen u rupice korištenjem osmokanalnog matričnog elektroničkog pipetora, ostavljenog na najsporiju brzinu, tako da minimizira uznemirivanje stanica.

Prvog dana, dodano je 100μl diferencijacijskog medija u svaku rupicu da se inicira diferencijacija 3T3 stanica u adipocitima. Trećeg dana nakon početka diferencijacije, medij je promijenjen na diferencijacijski medij koji sadrži inzulin, ali bez IBMX ili deksmetazona (inzulinski medij). Šestog dana medij je ponovo promijenjen na diferencijacijski medij koji ne sadrži inzulin, IBMX ili deksametazon (FBS medij). Stanice su zadržane u FBS mediju, s hranjenjem svakog drugog dana, dok nisu spremne za ispitivanje transporta glukoze od petnaestog do dvadesetprvog dana nakon početka diferencijacije.

PRIMJER 9

Ispitivanje transporta glukoze u 3T3 stanicama induciranim da diferenciraju u adipocite u prisustvu BLT

Stanice miša 3T3 su inducirane na diferencijaciju u adipocite kao u primjeru 8. Kod 15 – 24 sata prije izvođenja ispitivanja transporta glukoze, stanice su obrađene kao što slijedi:

1. Rupice su isprane dva puta sa 100μl fosfatno puferiranog salina (PBS) pri 37°C, uz aspiriranje između ispiranja.

2. Nakon toga su u svaku rupicu dodani 100μl DMEM, visoka glukoza, 1%-tna otopina antibiotika/antimikotika, 2 mM glutamina, 0,1%-tni BSA (zagrijan na 37°C), 0 do 1000 nM BLT miša (sintetiziranog tehnikom krute faze) i 0 do 100 nM inzulina. To je faza gladovanja seruma.

3. Onda su stanice inkubirane preko noći na 37°C.

Na dan ispitivanja, stanice su obrađene kao što slijedi:

1. Medij je uklonjen, ploče su osušene papirnatim ručnicima, i stanice su isprane dva puta sa 100ml KRBH pufera (Krebs-Ringer pufer sadrži Hepes, pH 7,4).

2. Nakon uklanjanja zadnjeg ispiranja, stanice su inkubirane na 37°C tijekom 1 sata u 100μl KRBH, 0,1%-tnom BSA sa 100μl/ml (0,1μCi/rupici) radiotopno obilježen 2-deoksiglukozom (C14), i željenom koncentracijom inzulina.

3. Nakon inkubacije s radiotopno obilježenom glukozom, 10μl 10x citoklazina B (200μM) je dodano da zaustavi daljnji uptake glukoze u stanicama.

4. Uptake radiotopno obilježene glukoze je određen čitanjem ploča pomoću čitača ploča Microbeta.

Rezultati:

Rezultati ovog eksperimenta su sakupljeni u Slici 11. Uptake glukoze u 3T3 stanice induciranih da diferenciraju u adipocite je stimuliran oko trostruko do oko šesterostruko kada su adipociti prethodno obrađeni s BLT prije ispitivanja uptake-a.

PRIMJER 10

Ispitivanje transporta glukoze u 3T3 stanicama induciranim da diferenciraju u adipocite u prisustvu funkcijskog fragmenta BLT

2. Kao sljedeće su u svaku rupicu dodani 100μl DMEM, visoka glukoza, 1%-tna otopina antibiotika/antimikotika, 2 mM glutamina, 0,1%-tni BSA (zagrijan na 37°C), 0 do 1000 nM BLT miša ili čovjeka (sintetizirani tehnikom krute faze) i 0 do 100 nM inzulina. To je faza gladovanja seruma. Na primjer, u jednom ispitivanju korišten je fragment BLT čovjeka označen ovdje kao SEQ ID NO:10; u drugom ispitivanju korišten je fragment BLT čovjeka označen ovdje kao SEQ ID NO:12.

3. Onda su stanice inkubirane preko noći na 37°C.

Na dan ispitivanja, stanice su obrađene kao što slijedi:

1. Medij je uklonjen, ploče su obrisane papirnatim ručnicima, i stanice su isprane dva puta sa 100ml KRBH pufera (Krebs-Ringer pufer sadrži Hepes, pH 7,4).

2. Nakon uklanjanja zadnjeg ispiranja, stanice su inkubirane na 37°C tijekom 1 sata u 100μl KRBH, 0,1%-tnom BSA sa 100μl/ml glukoze, 10μl/ml (0,1μCi/rupici) radiotopno obilježene 2-deoksiglukozom (C14), i željenom koncentracijom inzulina.

Rezultati:

Uptake glukoze u 3T3 stanice koje su inducirane da diferenciraju u adipocite je povećan u odnosu na kontrolu kada su adipociti obrađeni funkcijskim fragmentom BLT prije ispitivanja uptake-a.

PRIMJER 11

Funkcijski analozi BLT

Stanice miša 3T3 su inducirane da diferenciraju u adipocite kao u primjeru 10. Adipociti su onda izloženi analogu BLT čovjeka, na primjer SEQ ID NO:26 od SEQ ID NO:35 i transport glukoze je praćen kao u primjeru 8. Funkcijski analozi pokazuju potpuno iste rezultate kao i nativni BLT.

PRIMJER 12

Davanje BLT čovjeka tijekom 14 dana muškim Avy/A miševima

BLT čovjeka sintetiziran na krutoj fazi dan je muškim Avy/A miševima u dozama i režimima kao što je opisano u primjeru 7.

Rezultati:

Davanje BLT čovjeka smanjilo je značajno razinu inzulina u serumu kod muških Avy/A miševa (vidjeti slike 12 i 13).

Rezultati su sakupljeni u slikama 12-13. Tijekom obrade od 14 dana, životinje kontrolne skupine i ispitivane skupine konzumirale su oko 4,5 do 6 grama hrane i tjelesna težina u obje skupine je ostala ista, oko 50 grama (podaci nisu pokazani).

Da se osvrnemo na efekt dvotjedne obrade s BLT čovjeka na razinu glukoze i inzulina u plazmi, provedeno je ispitivanje oralne tolerancije glukoze nakon perioda od 14 dana. Kontrolne životinje su pokazale početno povećanje razine glukoze u krvi od oko 80 mg/dL do 300 mg/dL ili veće, u točci 30 minuta; nakon toga su obje skupine pokazale usporedive brzine opadanja vrijednosti, sve do krajne točke pri 2 sata (slika 12). Na primjer, ispitivane životinje su pokazale prosječnu razinu glukoze u krvi pri točci od 30 minuta od oko 400 mg/dL (s.d. 12), dok su kontrolne imale razinu od 330 mg/dL (s.d. 19). Niže razine su također opažene pri točkama od 60 min. i 120 min. Na primjer, pri 120 min. obrađene životinje su imale prosječnu razinu glukoze u krvi od 178 mg/dL (s.d. 16), dok su kontrolne imale razinu od 202 mg/dL (s.d. 13).

Obrađene životinje su pokazale vrijednosti inzulina u plazmi znatno ispod razine kontrolnih životinja (slika 13). Na primjer, u točci od 30 minuta, kontrolne životinje su imale razinu inzulina od 14,0 ng/mL (s.d. 1,5), dok su obrađene životinje imale razinu inzulina od 10,2 ng/mL (s.d. 0,4). Pri točci od 120 minuta, kontrolne životinje su imale razinu inzulina pri 9,3 ng/mL (s.d. 2,3) i obrađene životinje su imale razinu inzulina od 5,4 ng/mL (s.d. 0,9).

PRIMJER 13

Davanje Beta Lipotropina miša muškim Lepob/Lepob miševima

Muški Lepob/Lepob miševi dobiveni od Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME), smješteni su pojedinačno i hranjeni ad libitum 5008 hranom i vodom. Miševima je uzeta krv iz repa za početne vrijednosti glukoze, inzulina i triglicerida. Miševi su izabrani ili za kontrolu, 60μg-sku ili 120μg-sku bid obradu beta lipotropinom miša. Obrađeni miševi su primili ili 60μg SC ili 120μg SC (svaka doza ima ukupno 200μl); kontrolni miševi su dobili 200μl prijenosnika (salin). Miševi su injektirani u 7.00 prije podne i u 3.00 poslije podne svaki dan tijekom 16 dana, i injektirani sedamnaestog dana samo u 7.00 prije podne. Tjelesna težina i potrošnja hrane su praćeni ujutro od nultog do sedamnaestog dana. Miševima je uzeta krv iz repa ujutro sedmog dana za vrijednosti glukoze, inzulina i triglicerida u krvi. Životinje su postile preko noći od posljepodneva trinaestog dana do jutra četrnaestog dana. Na četrnaesti dan je provedeno ispitivanje oralne tolerancije glukoze. Mjereni su glukoza i inzulin nultog vremena u krvi 2 sata nakon jutarnje injekcije. Miševima je oralno dana 25%-tna otopina dekstroze (100μl/10g tjelesne težine), i onda je uzeta krv 30, 60 i 120 minuta kasnije. Uzorci krvi su korišteni za određivanje glukoze i inzulina. Nakon ispitivanja oralne tolerancije glukoze, miševi su hranjeni ad libitum. Na šesnaesti dan, iz repa su uzeti uzorci kriv za određivanje vrijednosti glukoze, inzulina, triglicerida i kotikosterona u krvi. Na sedamnaesti dan miševi su žrtvovani.

Rezultati ovih eksperimenata su prikazani u slici 14. Vrijednosti inzulina iz plazme su znatno smanjene kod obrađenih životinja tijekom perioda obrade od 16 dana. Na primjer, sedmog dana obrade kontrolne životinje su pokazale vrijednosti inzulina od oko 300 ng/ml, dok je za obrađene životinje izmjereno oko 215 ng/ml, barem 30%-ton smanjenje. Nadalje, vrijednosti inzulina u plazmi ostale su niže kod obrađenih životinja 16-tog dana obrade (slika 14).

PRIMJER 14

Davanje BLT čovjeka AlzetTM pumpom muškim Lepob/Lepob miševima

Muški Lepob/Lepob miševi dobiveni od Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME), smješteni su pojedinačno i hranjeni ad libitum 5008 hranom i vodom s osvjetljavanjem u ciklusima od 12 sati (isključeno od 6:00 poslije podne do 6:00 prije podne). Miševima je uzeta krv iz repa za vrijednosti početne glukoze, inzulina i triglicerida u krvi. Obrađene životinje su neprekidno dobivale 0,24mg/danu ili 0,48mg/danu beta lipotropina čovjeka (ER4-VBH-43) pomoću potkožno implantirane AlzetTM pumpe (Alza, Inc.) tako da su prosječne vrijednosti glukoze i triglicerida bile jednake u sve tri skupine. Kontrolnim životinjama je davana otopina salina. Pumpe su napunjene salinom za kontrolnu skupinu, 20mg/ml beta lipotropina čovjeka za skupinu niske doze i 40mg/ml beta lipotropina čovjeka za skupinu visoke doze. Miševi su anestezirani izofluoranom prije implantacije pumpe. Tjelesna težina i potrošnja hrane su mjereni ujutro od dana 0 do 7. Miševima je uzeta krv iz repa ujutro četvrtog dana za vrijednosti glukoze, inzulina i triglicerida u krvi. Miševi su postili preko noći od posljepodneva šestog dana do jutra sedmog dana.

Sedmog dana je napravljeno oralno ispitivanje tolerancije glukoze. Miševima je uzeta krv iz repa za inzulin i glukozu u vremenu nula, onda je oralno dana 25%-tna otopina dekstroze (100μl/10g tjelesne težine), onda uzeta krv 30, 60 i 120 minuta kasnije. Uzorci krvi su korišteni za određivanje glukoze i inzulina. Nakon ispitivanje oralne tolerancije glukoze, miševi su hranjeni ad libitum.

Rezultati ispitivanja tolerancije glukoze u odnosu na razinu inzulina u plazmi su prikazani na slici 15. Vrijednost pri 0,24 mg BLT/danu bila je oko 25% niža od kontrole, dok je vrijednost pri 0,48 mg BLT/danu bila oko 40% niža od kontrole (vidjeti sliku 15, dodatak za površine ispod krivulja).

PRIMJER 15

Sinteza na krutoj fazi i čišćenje analoga BLT proteina čovjeka

Analog BLT peptida čovjeka (na primjer analog koji je predstavljen s SEQ ID NO:26), u kojem je Ala zamijenjen s Glu u SEQ ID NO:8, sintetiziran je u jednom pokusu korištenjem. Fmoc kemije. Sinteza BLT je komplicirana prisustvom asp-gly dipeptidnim sekvencama u N-terminalnom dijelu peptida. Opaženo je da aspartilni pokrajini lanci u asp-gly dipeptidnim sekvencama podliježu bazno kataliziranoj ciklizaciji i uzastopnoj adiciji s piperidinom tijekom Fmoc sinteze. Ova reakcija je eliminirana korištenjem Fmoc- (FmocHmb) –glicina na svakoj asp-gly sekvenci u sintezi. Zaštita glicil amida s Hmb skupinom inhibira ciklizaciju aspartilnog pokrajnjeg lanca. Nakon cijepanja, deprotekcije i čišćenja HPLC-om reverzne faze, peptid se može analizirati elektrosprej masenom spektrometrijom. Glavna specija viđena u ovoj sintezi BLT je peptid pune duljine koji ima očekivanu masu. Korištenje ovog postupka dozvoljava proizvodnju količina pročišćenog proteina više od 100 mg u jednoj reakciji na 0.1 mmol skali.

Specifični stupnjevi ciklusa u sintezi su kao što slijedi:

[image]

PRIMJER 16

Davanje BLT čovjeka Alzet pumpom muškim ZDF štakorima

Muški štakori, debeli šećerni dijabetičari (engl. ZDF), dobiveni su od Genetic Models Inc. (Indianapolis, IN), smješteni su pojedinačno i hranjeni ad libitum 5008 hranom i vodom. Kada su bili stari pet tjedana štakori su postili preko noći za početno ispitivanje oralne tolerancije glukoze. Krv je uzeta iz repa za određivanje razine inzulina i glukoze u vremenu nula, i onda je životinjama dana oralno 50%-tna otopina glukoze (2,5g/kg tjelesne tž.), i krv je uzeta 30, 60 i 120 minuta nakon davanja. Nakon ispitivanja oralne tolerancije glukoze, štakori su hranjeni ad libitum. Kod starosti od 6 tjedana, životinje su podijeljene u skupine od po 4 životinje za davanje BLT čovjeka. Na nulti dan ispitivanja, krv iz repa je ponovo uzeta za mjerenje glukoze, inzulina, kortikosterona i triglicerida. Štakori su nasumično izabrani za kontrolu, 0,5mg/danu ili 1,0mg/danu kontinuiranog davanja BLT čovjeka (ER4-VTA-2) pomoću potkožno implantirane Alzet pumpe. Pumpa je napunjena salinom za kontrolu, 20,835mg/ml beta lipotropina čovjeka za skupinu niske doze i 41,67mg/ml za skupinu visoke doze. Pumpa je inkubirana preko noći na 37°C u salinu prije potkožne implantacije. Tjelesna težina i potrošnja hrane su mjereni od nultog dana od osmog dana. Uzorci krvi su uzeti ujutro trećeg dana za vrijednosti glukoze, inzulina, kortikosterona i triglicerida. Štakori su postili preko noći od posljepodneva petog dana do jutra šestog dana. Šestog dana je provedeno ispitivanje oralne tolerancije glukoze. Nakon ispitivanja oralne tolerancije glukoze, štakori su hranjeni ad libitum.

Zuker životinje korištene u ovoj studiji daju dobar model za dijabetes tipa 2. Kod starosti od 6 do 7 tjedana vrijednosti glukoze u krvi i razina triglicerida rastu zbog opadanja izlučivanja inzulina. Ove životinje su hiperkortikosteronemične i rezistentne na inzulin.

Tablica 3. ZDF štakori obrađeni s BLT čovjeka

[image]

Rezultati prikazani u tablici 3 i na slici 16 pokazuju povećani efekt BLT čovjeka na ZDF štakore kod doze od 1 mg BLT čovjeka po danu. Kod 30 minuta nakon inicijacije razine OGTT glukoze u plazmi bile su u prosjeku 191 ± 16 mg/dL u kontroli i 172 ± 5 mg/dL u životinjama obrađenim s BLT čovjeka (vidjeti slika 16). Kod 60 minuta nakon inicijacije kontrolne životinje pokazuju razinu glukoze od 157 ± 6 mg/dL, dok životinje obrađene BLT imaju tu vrijednost pri 154 ± 8 mg/dL u BLT obrađenim životinjama.

Tablica 3 pokazuje da razina glukoze u krvi ostaje niža kod životinja obrađenih BLT u odnosu na kontrolne životinje, posebno kod viših doza. Kontrolne životinje su pokazale vrijednosti glukoze od oko 150 mg/dL nultog, drugog i sedmog dana nakon početka davanja BLT. S druge strane, životinje obrađene s 1 mg/danu BLT čovjeka imali su u prosjeku 140 mg/dL sedmog dana, nekih 7% manje od kontrolnih životinja. Obrađene životinje su također pokazale oko 11% nižu razinu triglicerida u serumu od kontrolnih životinja (tablica 3), što pokazuje inzulinotropski učinak BLT obrade.

PRIMJER 17

Transport glukoze u skeletnim mišićima ZDF štakora stimuliran s BLT čovjeka

Izvedena je studija da se odredi efekt beta-lipotropina na transport glukoze u skeletnim mišićima. Muški štakori, debeli šećerni dijabetičari (ZDF/GmiTM-fa/fa) su dobiveni od Genetic Models Inc. (Indianapolis, IN). Štakori su držani na Purina Formulab 5008 hrani za štakore (Puina Mils, Inc., St. Louis, MO) i smješteni u sobu s nadziranim svjetlom gdje se izmjenjuju ciklusi od 12 sati svjetla i mraka. Štakori su smješteni pojedinačno i dan im je slobodan pristup hrani i vodi.

Zbog određivanja transporta glukoze u mišićnom tkivu, životinje iz primjera 16 su anestezirane pomoću interperitonalne injekcije natrijevim pentabarbitolom (6,5 mg/100 gm tjelesne težine), i soleus mišići su izolirani i podijeljeni na pola. Svaka polovica uzorka tkiva je isprana salinom tijekom 2 minute i onda gazirana (95% O2-5% CO2) KBH s 1% BSA, 8 mM glukoze i 32 mM manitola.

Ispitivanje transporta glukoze je provedeno kako slijedi.

Pre-inkubacija:

Uzorci mišićnog tkiva su preneseni u 20 ml posudice koje sadrže 1,8 ml gaziranog KHB s 1% BSA, 32 mM manitola, sa ili bez 500 nM beta-lipotropina miša. Uzorci su smješteni u vodenu kupelj uz potresanje tijekom 20 sati pri sobnoj temperaturi s dvije promjene pufera.

Nakon pre-inkubacije, uzorci mišićnog tkiva su isprani pri 29°C tijekom 15 minuta pod stalnim gaziranjem od 95% O2-5% CO2. Uzorci su isprani u posudice koje sadrže 1,8 ml KBH s 40 mM manitola, inzulin (2000 uU/ml) ili bez inzulina i sa ili bez beta-lipotropina (500 mM).

Uzorci mišića su onda preneseni u nove posudice pod stalnim gaziranjem od 95% O2-5% CO2. Inkubacijski medij se sastojao od 8 mM 3-O-metil-glukoze (OMG), 2 mCi/ml 3H-3-OMG, 30 mM manitola, 0,3 mCi/ml 14C manitola, 2mM piruvata, inzulina (2000 μU/ml) i beta-lipotropin miša. Kontroli je nedostajao inzulin i/ili beta-lipotropin. Nakon 10 minuta pri 29°C, uzorci zamrznuti u gomilu i spremljeni zamrznuti dok se mogao ispitati transport glukoze.

Transport glukoze:

Mišići su složeni do približno 20-25 mg za digestiju u 0,5 ml 1M KOH pri 70°C tijekom 30 min. Nakon digestije, uzorci su stavljeni u led i uklonjen je 100μl uzorka za analizu glikogena. Preostalih 0,4 ml uzorka dodano je 0,4 ml 1N HCl i posuda je žestoko miješana. Onda je 300 ml uzorka obrađenog s HCl dodano u 6,4 ml scintilacijske tekućine i radioaktivnost uzorka je određena na scintilacijskom brojaču.

Transport glukoze je izračunat na temelju intracelularne 3H-3-OMG akumulacije korištenjem 14C manitola kao ekstracelularnog markera.

Razina glikogena:

Uzorku od 100μl spomenutom gore dodano je 17μl ledene octene kiseline zajedno s 500μl 0,3 M pufera natrijevog acetata (Ph 4,8 + 5 mg/ml aminoglukozidaze). Posude su onda inkubirane preko noći na 37°C. Sljedeći dan su uzorci od 50μl stavljeni na ploču s 96 rupica i dodano je 200 μl Trinderovog reagensa (Sigma 315-100; razrijeđen do 20 μl s vodom). Ploče su inkubirane tijekom 10 minuta na 37°C i apsorbacija je očitana na valnoj dužini od 505 nm.

Tablica 4. Transport glukoze u mišićnom tkivu ZDF štakora obrađenih s BLT čovjeka

[image]

Claims

1. Stvarno čist protein, naznačen time, da ima aminokiselinsku sekvencu iz skupine koja se sastoji od SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:7.

2. Izolirani nukleinsko kiselinski spoj, naznačen time, da enkodira protein iz zahtijeva 1.

3. Vektor, naznačen time, da obuhvaća izolirani nukleinsko kiselinski spoj iz zahtijeva 2.

4. Vektor iz zahtijeva 3, naznačen time, da je rečeni izolirani nukleinsko kiselinski spoj operativno vezan na promotorsku sekvencu.

5. Stanica domaćin, naznačena time, da sadrži vektor iz zahtijeva 4.

6. Postupak za konstrukciju rekombinantne stanice domaćina, naznačen time, da ima potencijal za ekspresiju beta-lipotropina, rečeni postupak obuhvaća uvođenje vektora iz zahtijeva 5 na bilo koji pogodan način u rečenu stanicu domaćina.

7. Postupak za ekspresiju beta-lipotropina u rekombinantnoj stanici domaćinu iz zahtjeva 6, naznačen time, da rečeni postupak obuhvaća kultiviranje rečene stanice domaćina pod uvjetima pogodnim za ekspresiju gena.

8. Farmaceutski pripravak, naznačen time, da obuhvaća kao aktivni sastojak beta-lipotropin, njegov analog ili funkcijski fragment, povezan s jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, ekscipienta ili njihovih razrjeđivača.

9. Farmaceutski pripravak iz zahtijeva 8, naznačen time, da je rečeni beta-lipotropin beta-lipotropin čovjeka.

10. Beta-lipotropin, njegov analog ili funkcijski fragment, naznačen time, da se koristi u liječenju dijabetes ili njegovih komplikacija.

11. Postupak za liječenje dijabetesa kod sisavaca, naznačen time, da obuhvaća davanje terapeutski efektivne količine beta-lipotropina ili njegovog analoga.

12. Postupak za liječenje dijabetesa kod sisavaca, naznačen time, da obuhvaća davanje terapeutski efektivne količina funkcijskog fragmenta beta-lipotropina.

13. Postupak kao u zahtjevu 11, naznačen time, da je rečeni beta-lipotropin beta-lipotropin čovjeka sa sekvencom koja je ustanovljena ovdje kao SEQ ID NO:8.

14. Postupak iz zahtijeva 11, naznačen time, da je rečeni beta-lipotropin rekombinantni beta-lipotropin čovjeka.

15. Postupak iz zahtijeva 11, naznačen time, da je rečeni dijabetes dijabetes tipa 1 ili tipa 2.

16. Postupak iz zahtijeva 11, naznačen time, da je rečeni sisavac čovjek.

17. Postupak za liječenje komplikacija dijabetesa, naznačen time, da je pacijentu potrebno davanje terapeutski efektivne količine beta-lipotropina, njegovog analoga ili funkcijskog fragmenta.

18. Postupak za sniženje razine glukoze u krvi kod sisavca kada je to potrebno, naznačen time, da se daje efektivna količina beta-lipotropina, njegovog analoga ili funkcijskog fragmenta.

19. Postupak za liječenje hiperglikemije kod sisavca kada je to potrebno, naznačen time, da se daje efektivna količina beta-lipotropina, njegovog analoga ili funkcijskog fragmenta.

20. Postupak za liječenje hiperglikemije kod sisavca, naznačen time, da se daje efektivna količina beta-lipotropina, njegovog analoga ili funkcijskog fragmenta.

21. Postupak za povećanje osjetljivosti inzulina kod sisavaca, naznačen time, da se daje efektivna količina beta-lipotropina, njegovog analoga ili funkcijskog fragmenta.

22. Sintetski postupak na krutoj fazi za pripravu beta-lipotropina, njegovog analoga ili funkcijskog fragmenta u jednom pokusu, obuhvaća sljedeće korake: a) aktiviranje aminokiseline koja ima svoju α-amino skupinu i alternativno, funkcionalne skupine na pokrajnjem lancu, zaštićene u obliku reaktivnog estera; b) vezanje rečene aktivirane aminokiseline na inertni kruti nosač; c) aktiviranje druge zaštićene aminokiseline do estera, gdje je s α-amino skupine prve aminokiseline uklonjena zaštita te je dobiven reaktivni amin, i druga aktivirana aminokiselina reagira s rečenom prvom aminokiselinom i daje dipeptid na krutom nosaču; c) ponavljanje koraka (a) do (c); d) uklanjanje peptida s krutog nosača i uklanjanje zaštite funkcionalnih skupina pokrajnjeg lanca; e) odjeljivanje peptida s krutog nosača; i f) čišćenje peptida bilo kojim pogodnim načinom; naznačen time, da g) kada BLT sekvenca sadrži ser-pro-pro tripeptidni segment, provedeno je višestruko povezivanje pro ostataka; h) nakon završetka stupnja povezivanja, bilo koji neproreagirani, nezaštićeni peptid je blokiran da spriječi produljenje lanca delecijskog peptida; i i) kada BLT sekvenca sadrži asp-gly dipeptidnu sekvencu, korišten je N-α zaštićena skupina na svakom glicinskom ostatku koji se nalazi prije asp ostatka.

23. Postupak za pripravu beta-lipotropina kao što je zahtijevano u zahtjevu 1, naznačen time, da obuhvaća: a. transformaciju pogodnog domaćina ekspresijom vektora gdje rečeni vektor enkodira beta-lipotropin; b. kultiviranje rečenog transformiranog domaćina pod uvjetima koji omogućavaju ekspresiju rečenog beta-lipotropina; c. čišćenje rečenog beta-lipotropina bilo kojim pogodnim načinom.

24. Ispitivanje beta-lipotropinske aktivnosti, naznačeno time, da obuhvaća sljedeće korake: a) davanje test proteina sisavcu koji pokazuje neosjetljivost na inzulin i povećanu razinu glukoze u krvi; i b) ispitivanje razine glukoze u krvi i inzulina bilo kojim pogodnim načinom nakon koraka (a).

25. Postupak, kao u zahtjevu 11, naznačen time, da je rečeni beta lipotropin izabran iz skupine koja se sastoji od SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 i SEQ ID NO:8.

26. Peptid, naznačen time, da ima inzulinotropsku aktivnost izabranu iz skupine koja sadrži SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 i SEQ ID NO:13.

27. Peptid, naznačen time, da ima inzulinotropsku aktivnost izabranu iz skupine koja sadrži SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 i SEQ ID NO:25.

28. Peptid, naznačen time, da ima inzulinotropsku aktivnost izabranu iz skupine koja sadrži SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 i SEQ ID NO:25.

29. Postupak za liječenje dijabetesa, naznačen time, da obuhvaća davanje terapeutski efektivne količine bar jednog peptida izabranog iz skupine koja se sastoji od SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 i SEQ ID NO:25.

30. Postupak za liječenje dijabetesa, naznačen time, da obuhvaća davanje terapeutski efektivne količine bar jednog peptida izabranog iz skupine koja se sastoji od SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13.

31. Farmaceutski pripravak, naznačen time, da obuhvaća kao aktivni sastojak peptid inzulinotropske aktivnosti izabran iz skupine koja se sastoji od SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 i SEQ ID NO:25.

32. Funkcijski analog, naznačen time, da je funkcijski analog beta-lipotropina.

33. Fragment beta-lipotropina, naznačen time, da ima inzulinotropsku aktivnost in vitro ili in vivo.

34. Funkcijski analog beta-lipotropina, naznačen time, da je oko 90% do 95% identičan sa SEQ ID NO:8, gdje su supstitucije aminokiselina izabrane iz skupine koja se sastoji od: ostatak u položaju 1 je alternativno Glu, Ala, Asp ili Gln; ostatak u položaju 2 je alternativno Leu, Ile, Val ili Met; ostatak u položaju 3 je alternativno Thr, Ala, Glu, Ser, Pro, ili Gly; ostatak u položaju 4 je alternativno Gly, Arg, Ala, Leu, Pro ili Ser; ostatak u položaju 5 je alternativno Glu, Gln, Asp, Asn ili Ala; ostatak u položaju 6 je alternativno Arg, Glu, Leu, Lys, Gln ili Ala; ostatak u položaju 7 je alternativno Leu, Pro, Asp, Val, Ile ili Met; ostatak u položaju 8 je alternativno Arg, Glu, Ala, Tyr, Leu, Lys, Pro, Gln ili Trp; ostatak u položaju 9 je alternativno Glu, Ala, Pro, Asp, Asn ili Gln; ostatak u položaju 10 je alternativno Gly, Ala, Ser ili Asp; ostatak u položaju 11 je alternativno Asp, Arg, Pro, Asn, Gln, Ala ili Glu; ostatak u položaju 12 je alternativno Gly, Ala, Ser ili Met; ostatak u položaju 13 je alternativno Pro, Glu, Gly ili Val; ostatak u položaju 14 je alternativno Asp, Glu, Asn, Gln ili Gly; ostatak u položaju 15 je alternativno Gly, Ala, Ser ili Glu; ostatak u položaju 16 je alternativno Pro, Gln, Leu, Gly ili Glu; ostatak u položaju 17 je alternativno Ala, Asp, Ser ili Gly; ostatak u položaju 18 je alternativno Asp, Glu, Gln ili Asn; ostatak u položaju 19 je alternativno Asp, Glu, Asn ili Gln; ostatak u položaju 20 je alternativno Gly, Ser ili Ala; ostatak u položaju 21 je alternativno Ala, Gly, Ser ili Phe; ostatak u položaju 22 je alternativno Gly, Ala, Ser ili Lys; ostatak u položaju 23 je alternativno Ala, Phe, Thr, Gly, Ser ili Leu; ostatak u položaju 24 je alternativno Gln, Arg, Asp, Asn, Leu ili Val; ostatak u položaju 25 je alternativno Ala, Leu, Asp, Ile, Gly, Ser ili Thr; ostatak u položaju 26 je alternativno Asp, Glu, Gly, Asn, Gln ili Lys; ostatak u položaju 27 je alternativno Leu, Ala, Ile, Met ili Val; ostatak u položaju 28 je alternativno Glu, Gln, Asn ili Asp; ostatak u položaju 29 je alternativno His, Asn, Thr, Ala, Gln ili Glu; ostatak u položaju 30 je alternativno Ser, Gly, Glu, Ala, Leu ili Asp; ostatak u položaju 31 je alternativno Leu, Ala, Val, Met ili Ile; ostatak u položaju 32 je alternativno Leu, Ala, Val, Ile, Met ili Pro; ostatak u položaju 33 je alternativno Val, Ala, Glu, Ile, Met ili Arg; ostatak u položaju 34 je alternativno Ala, Ser, Pro, Glu ili Gly; ostatak u položaju 35 je alternativno Ala, Asp, Gly, Ser ili Leu; ostatak u položaju 36 je alternativno Glu, Ala, Thr, Leu, Asp, Asn ili Gln; ostatak u položaju 37 je alternativno Lys, Glu, Thr, Arg, Gln ili Asp; ostatak u položaju 38 je alternativno Lys, Arg, Gln ili Glu; ostatak u položaju 39 je alternativno Asp, Ala, Asn, Glu, Gln ili Lys; ostatak u položaju 40 je alternativno Glu, Ser, Asp, Asn, Gln ili Gly; ostatak u položaju 41 je alternativno Gly, Ala ili Ser; ostatak u položaju 42 je alternativno Pro, Gly, Ser ili Asn; ostatak u položaju 43 je alternativno Tyr, Phe ili Trp; ostatak u položaju 44 je alternativno Arg, Lys, Gln ili Glu; ostatak u položaju 45 je alternativno Met, Ile, Ser ili Val; ostatak u položaju 46 je alternativno Glu, Gln, Asp, Asn, His, Arg ili Gly; ostatak u položaju 48 je alternativno Tyr ili Trp; ostatak u položaju 49 je alternativno Arg ili Lys; ostatak u položaju 50 je alternativno Trp, Tyr ili Phe; ostatak u položaju 51 je alternativno Gly, Ala, Ser ili gln; ostatak u položaju 52 je alternativno Ser, Thr, Asn ili Ala; ostatak u položaju 53 je alternativno Pro ili Gly; ostatak u položaju 54 je alternativno Pro, Ala, Gly, Arg, Leu ili Thr; ostatak u položaju 55 je alternativno Lys, Arg, Gln ili Ala; ostatak u položaju 56 je alternativno Asp, Asn, Glu, Gln, Ala, Gly ili Ile; ostatak u položaju 57 je alternativno Lys, Gln ili Arg; ostatak u položaju 58 je alternativno Arg, Gln ili Lys; ostatak u položaju 59 je alternativno Tyr, Phe ili Trp; ostatak u položaju 60 je alternativno Gly, Ala ili Ser; ostatak u položaju 61 je alternativno Gly, Ala ili Ser; ostatak u položaju 62 je alternativno Phe, Tyr ili Trp; ostatak u položaju 63 je alternativno Met, Leu, Ile ili Val; ostatak u položaju 64 je alternativno Thr, Ala, Ser ili Lys; ostatak u položaju 65 je alternativno Ser, Ala, Thr ili Pro; ostatak u položaju 66 je alternativno Glu, Asp, Asn, Lys ili Gln; ostatak u položaju 67 je alternativno Lys, Arg ili Gln; ostatak u položaju 68 je alternativno Ser, Ala, Thr ili Gly; ostatak u položaju 69 je alternativno Gln, Glu, Asp, Asn, Arg ili His; ostatak u položaju 70 je alternativno Thr, Ser, Ala ili Lys; ostatak u položaju 71 je alternativno Pro ili Gly; ostatak u položaju 72 je alternativno Leu, Ile, Met ili Val; ostatak u položaju 73 je alternativno Val, Leu, Ile ili Met; ostatak u položaju 74 je alternativno Thr, Ala ili Ser; ostatak u položaju 75 je alternativno Leu, Ile, Met ili Val; ostatak u položaju 76 je alternativno Phe, Tyr, Trp ili Leu; ostatak u položaju 77 je alternativno Lys, Gln ili Arg; ostatak u položaju 78 je alternativno Asn, Asp, Glu, Gln ili His; ostatak u položaju 79 je alternativno Ala, Gly, Ser, Ile ili Val; ostatak u položaju 80 je alternativno Ile, Leu, Met, Val ili Thr; ostatak u položaju 81 je alternativno Ile, Met, Val, Thr ili Leu ostatak u položaju 82 je alternativno Lys, Gln ili Arg; ostatak u položaju 83 je alternativno Asn, Asp, Glu, Gln ili Ser; ostatak u položaju 84 je alternativno Ala, Val, Ser, Gly ili Glu; ostatak u položaju 85 je alternativno Tyr, Phe, Trp ili His; ostatak u položaju 86 je alternativno Lys, Gln ili Arg; ostatak u položaju 87 je alternativno Lys, Gln ili Arg; ostatak u položaju 88 je alternativno Gly, Ala ili Ser; ostatak u položaju 89 je alternativno Glu, Gln, Asp, Asn ili His.

35. Funkcijski analog beta-lipotropina kao u zahtjevu 34, naznačen time, da je rečeni analog otprilike oko 95% do 99% identičan sa SEQ ID NO:8.

36. Peptid, naznačen time, da ima inzulinotropsku aktivnost izabran iz skupine koja se sastoji od SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22.

37. Postupak iz zahtijeva 22, naznačen time, da je stupanj: h) gdje BLT sekvenca sadrži ser-pro-pro tripeptidni segment, provedeno je dvostruko povezivanje pro i set ostataka; a) nakon završetka stupnja povezivanja, bilo koji neproreagirani, nezaštićeni peptid je blokiran s anhidridom da spriječi produljenje lanca delecijskog peptida

38. Postupak kao što je naveden u zahtjevu 37, naznačen time, da je stupanj: j) rečena N-a zaštita obuhvaća N-a-Hmb ili metil benzoat.

39. Funkcijski analog beta-lipotropina, naznačen time, daje najmanje 90% identičan s SEQ ID NO:8.