JP2001526061A

JP2001526061A - β−リポトロピンおよびその使用

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Publication number: JP2001526061A
Application number: JP2000525132A
Authority: JP
Inventors: ジェラルド・ウェイン・ベッカー; ジョン・ポール・バトラー; ジョン・エドワード・ヘイル; ウィリアム・フランシス・ヒース・ジュニア; マーク・ルイス・ヘイマン; ブリジット・エリザベス・ショーナー; アレキサンダー・デイビッド・バーシャフスキ
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1997-12-23
Filing date: 1998-12-21
Publication date: 2001-12-18
Also published as: EA200000709A1; US20030073621A1; US6323178B1; CO4930304A1; WO1999032142A1; EP0926239A2; IL136514A0; AR018532A1; HUP0100132A2; EP0926239A3; AU1938599A; PE20000062A1; TR200002611T2; CN1284882A; HRP20000426A2; PL341293A1; BR9814433A; KR20010024805A; CA2315888A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、β−リポトロピンに関連する、単離された核酸、ベクター、形質転換された宿主細胞、同族体、機能断片および融合タンパク質を提供する。また、β−リポトロピンまたはその断片および／または同族体を含む医薬組成物および、有効量のβ−リポトロピンを投与して、糖尿病およびその合併症を処置する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】相互参照本出願は、以下の米国仮出願、１９９７年１２月２３日提出の第６０／０６８
，６５９号；１９９８年３月３０日提出の第６０／０７９，８５７号；１９９８
年５月２１日提出の第６０／０８６３２１号；１９９８年７月１日提出の第６０
／０９１，３８５号；１９９８年８月５日提出の第６０／０９５，４０５号；お
よび１９９８年１０月１３日提出の第６０／１０３，９７６号の利益を主張する
。

【０００２】発明の背景本発明は製薬および医療分野に関する。特に本発明は、β−リポトロピン、そ
の断片および同族体、医薬製剤および、哺乳類の糖尿病および他の関連症状を治
療する際に、該化合物を使用する方法に関する。

【０００３】プロ−オピオメラノコルチン (POMC)は、神経内分泌細胞内で分泌経路に移される神経ペプチド前駆体分子である。ＰＯＭＣは特異的エンドペプチダーゼの作
用によって分解され、副腎皮質刺激ホルモン (ACTH)、β−リポトロピン（ＢＬＴ）、β−エンドルフィンおよびメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）のような
ペプチドを生じる。ＰＯＭＣは組織特異的および細胞特異的に、１つまたはそれ
以上の特定のペプチドにプロセッシングされる（一般に、M. Castro and E. Mor
rison, Crit. Rev. Neurobiol., 11, 35-57, 1997; Roberts, J. L. and Herber
t, E., Proc Nat Acad Sci, 74, 4826 (1977); Roberts, J. L. and Herbert, E
., Proc.Nat.Acad.Sci 74, 5300 (1977); Mains, et al., Proc.Nat.Acad.Sci 7
4, 3014 (1977)を参照のこと）。ＰＯＭＣは下垂体腺および視床下部で主に生産
される。下垂体前葉でＰＯＭＣが翻訳後にプロセッシングされると、ＡＣＴＨお
よびＢＬＴが生じる。一方、下垂体中葉の主な生産物はα−ＭＳＨ、ＣＬＩＰ、
γ−リポトロピン、β−エンドルフィンおよびβ−ＭＳＨであり、視床下部では
、ＰＯＭＣは主としてγ−ＭＳＨおよびβ−エンドルフィンにプロセッシングさ
れる。

【０００４】 POMCから誘導されたペプチドは、代謝的および生理的調節において種々の重要な役割を果たす。例えば、３９アミノ酸ペプチドである ACTH は副腎皮質から
の糖質コルチコイドの分泌を刺激する。一方、MSH は皮膚のメラニン細胞による
メラニン合成を刺激し、また、脂肪代謝に関与していると思われる。β−エンド
ルフィンはＢＬＴのカルボキシル末端（すなわち、ヒト配列の残基５９〜８９）から導かれ、モルヒネに対する既知のアンタゴニストである、ナロキソンによ
ってアンタゴナイズされる鎮痛活性を有している。このように、POMC 誘導体ペプチドホルモンは、生理的および代謝的調節において種々の役割を有している。

【０００５】適正なグルコースおよび燃料代謝は、POMC 関連ペプチドでない、インシュリンに依存する。具体的には、インシュリンはグリコーゲン、脂肪酸およびタンパ
ク質合成を刺激し、また糖分解を刺激する。インシュリンは、筋肉および脂肪細
胞へのグルコースの取り込みを促進するのに重要である。

【０００６】インシュリン代謝の欠損は糖尿病を引き起こし得る。タイプ１糖尿病（１型糖
尿病）は、食物およびグルコース代謝を適正に制御するために外因性インシュリ
ンの投与を必要とする。一方、タイプ２糖尿病（２型糖尿病）は一般に、糖尿病
の後期段階まで外因性のインシュリンを必要としない。グルコースおよび燃料代
謝の適正な制御は糖尿病の有効な管理に必須である。これを行わないと、ケトア
シドーシス, 昏睡, 網膜症, 糖尿病性小血管症, アテローム硬化症, 心筋梗塞,
ストローク, 壊疽, 高グリセリド血症, コレステロール過剰血症, 心筋症, 皮膚
病, 糖尿病性 foot 症候群, ネフロパシー, 尿路感染, 乳頭壊死（papillary ne
crosis）, 白内障, 糖尿病性胃腸症, 便秘, 末梢血管疾患および死をも含む、深
刻な、あるいは致死でさえあるような結果となる可能性がある。多くの場合、多
すぎるインシュリン投与と少なすぎるインシュリン投与間で微妙な均衡をとらな
ければならない。したがって、糖尿病の理想的な治療は、インシュリンに対する
感受性を改善することによって、血中グルコース濃度を制御するものであろう。

【０００７】本明細書中には、β−リポトロピンおよび／またはその断片および／または同
族体の医薬有効量を投与することを含む、タイプ１およびタイプ２糖尿病および
その関連する合併症の処置または予防において有効な処置方法および医薬組成物
が記載されている。

【０００８】発明の簡単な要旨本発明は、β−リポトロピン（ＢＬＴ）、その同族体、その断片を含む単離さ
れたタンパク質、該タンパク質をコードする核酸、およびＢＬＴの製造方法およ
び、糖尿病およびその関連する合併症の処置における使用方法を提供する。

【０００９】本明細書中には、医薬有効量のＢＬＴ、その同族体またはその機能断片（func
tional fragment)を投与することによって、ヒトを含む哺乳類における糖尿病お
よびその合併症を処置する方法が記載されている。本発明はさらに、タイプ１お
よびタイプ２糖尿病、網膜症, 糖尿病性小血管症, アテローム硬化症, 心筋梗塞
, ストローク, 壊疽, 高グリセリド血症, コレステロール過剰血症, 心筋症, 皮
膚病, 糖尿病性 foot 症候群, ネフロパシー, 尿路感染, 乳頭壊死（papillary
necrosis）, 白内障, 糖尿病性胃腸症, 便秘, および末梢血管疾患の処置方法に
関する。

【００１０】本明細書中には、E. coli および酵母内でのＢＬＴの製造方法を開示している
。E. coli では、高い塩濃度下、慣用の精製方法により細胞溶解液から回収可能
な融合タンパク質として BLT を製造する。この BLT 融合タンパク質は、特定の
プロテアーゼに対する認識部位を有し、このプロテアーゼを用いてＢＬＴから融
合パートナーを分離する。酵母 Pichia pastoris では、この融合タンパク質が細胞から分泌される際に分解され、培養培地から天然ＢＬＴが無傷で回収できる
。

【００１１】１つの態様では、本発明は、配列番号２、配列番号５または配列番号７のアミ
ノ酸配列を有する、実質的に純粋なタンパク質に関する。

【００１２】さらにもう１つの態様では、本発明は、β−リポトロピンを含む融合タンパク
質または組換えタンパク質またはペプチドをコードする、単離された核酸化合物
に関する。

【００１３】もう１つの態様では、本発明は、本発明のタンパク質またはペプチドをコード
する、少なくとも１つの単離された核酸化合物に関する。

【００１４】さらにもう１つの態様では、本発明は、本発明の単離された核酸化合物を含む
ベクターに関する。

【００１５】さらにもう１つの態様では、本発明は、プロモーター配列に作動可能に連結さ
れている本発明の単離された核酸を含むベクターに関する。

【００１６】もう１つの態様では、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。

【００１７】さらにもう１つの態様では、本発明は、β−リポトロピンの発現能を有する組
換え宿主細胞の構築方法であって、任意の適当な手段により該宿主細胞に本発明
のベクターを導入することを含む方法に関する。

【００１８】さらにもう１つの態様では、本発明は、組換え宿主細胞におけるβ−リポトロ
ピンの発現方法であって、遺伝子発現に適当な条件下で該組換え宿主細胞を培養
することを含む方法に関する。

【００１９】もう１つの態様では、本発明は活性成分である、β−リポトロピン、その同族
体またはその機能断片を、１つまたはそれ以上の製薬的に許容される担体、賦形
剤または希釈剤とともに含む医薬製剤に関する。

【００２０】さらにもう１つの態様では、本発明は、β−リポトロピン、その同族体または
その機能断片がヒトβ−リポトロピンである医薬製剤に関する。

【００２１】さらにもう１つの態様では、本発明は、糖尿病またはその合併症の処置におい
て使用するためのβ−リポトロピン、その同族体またはその機能断片に関する。

【００２２】さらにもう１つの態様では、本発明は、インシュリノトロピック活性を有する
ＢＬＴの断片に関する。

【００２３】さらにもう１つの態様では、本発明は、配列番号９〜配列番号１３からなる群
から選択される、インシュリノトロピック活性を有するペプチドに関する。

【００２４】さらにもう１つの態様では、本発明は、配列番号１４〜配列番号２５からなる
群から選択される、インシュリノトロピック活性を有するペプチドに関する。

【００２５】さらにもう１つの態様では、本発明は、本明細書中に開示されているβ−リポ
トロピンペプチドの機能的同族体に関する。

【００２６】さらにもう１つの態様では、本発明は、糖尿病の処置方法であって、配列番号
９〜配列番号２５からなる群から選択される少なくとも１つのペプチドの治療有
効量を投与することを含む方法に関する。

【００２７】さらにもう１つの態様では、本発明は、糖尿病の処置方法であって、配列番号
９〜配列番号１３からなる群から選択されるペプチドの治療有効量を投与するこ
とを含む方法に関する。

【００２８】さらにもう１つの態様では、本発明は、活性成分として、配列番号９〜配列番
号２５からなる群から選択される、インシュリノトロピック活性を有する少なく
とも１つのペプチドを含む医薬製剤に関する。

【００２９】さらにもう１つの態様では、本発明は、ヒトを含む哺乳類における糖尿病の処
置方法であって、β−リポトロピン、その同族体またはその機能断片の治療有効
量を投与することを含む方法に関する。

【００３０】さらにもう１つの態様では、本発明は、β−リポトロピン、その同族体または
その機能断片の有効量を投与することによって哺乳類の血中グルコース濃度を低
下させる方法に関する。

【００３１】さらにもう１つの態様では、本発明は、β−リポトロピン、その同族体または
その機能断片の有効量を投与することによって、高血糖症の処置を必要としてい
る哺乳類の高血糖症を処置する方法に関する。

【００３２】さらにもう１つの態様では、本発明は、β−リポトロピン、その同族体または
その機能断片の有効量を投与することによって、哺乳類のインシュリン過剰血症
を処置する方法に関する。

【００３３】もう１つの態様では、本発明は、β−リポトロピン、その同族体またはその機
能断片の有効量を投与することによって、哺乳類のインシュリン感受性を高める
方法に関する。

【００３４】もう１つの態様では、本発明はβ−リポトロピン、その同族体またはその機能
断片を合成するための固相合成法に関する。

【００３５】もう１つの態様では、本発明は、以下の工程を含む、β−リポトロピンの製造
方法に関する：ａ．β−リポトロピン、その同族体またはその機能断片をコードする発現ベク
ターで適当な宿主を形質転換する；ｂ．β−リポトロピンを発現可能な条件下で該形質転換宿主を培養する；ｃ．いずれかの適当な手法によって該β−リポトロピンを精製する。

【００３６】さらにもう１つの態様では、本発明は、以下の手段（ステップ）を含む、β−
リポトロピン活性についてのアッセイに関する：ａ）インシュリン非感受性と高い血中グルコース濃度を示す哺乳類に試験タン
パク質を投与する；ｂ）過程（ａ）の後の血中グルコース濃度および血中インシュリン濃度につい
て試験する。

【００３７】本発明はまた、β−リポトロピン、その同族体またはその機能断片の医薬有効
量を投与することによって、哺乳類のタイプ１またはタイプＩＩ糖尿病およびそ
の関連する合併症を処置する方法に関する。

【００３８】発明の詳細な記述定義用語「同族体」または「機能的同族体」とは、該同族体が、インビボおよび／
またはインビトロにおいて、修飾されていないＢＬＴと実質的に同じ生物学的活
性を保持するように少なくとも１つのアミノ酸置換が施されたＢＬＴの修飾形態
を表す。

【００３９】用語「ｂｉｄ」または「ｂ.ｉ.ｄ.」とは、１日２回投与されるＢＬＴまたは他の化合物の投与量を表す。

【００４０】「ＢＬＴ」とは、β−リポトロピンを表す。ヒトＢＬＴは８９アミノ酸残基（
配列番号８）を含む。ＢＬＴタンパク質は種々の生物において特徴付けされてお
り、ヒト、マウス、ヒツジおよびブタ（Li & Chung, Nature, 260, 622-24 (197
6)）；およびゾウ（Li et al. Int. J. Pept. Prot. Res. 32, 573-78, 1988）；および他の哺乳類を含む種々の生物においてアミノ酸配列が決定されている（
引用によりこれらはすべて本明細書中に包含される）。

【００４１】用語「β−リポタンパク質融合タンパク質」または「ＢＬＴ融合タンパク質」
とは、ＢＬＴを含む、ある種のハイブリッド組換えタンパク質分子であって、E.
coli または他の細胞タイプ内で生産され、これから、特異的タンパク質分解ま
たは化学的分解によってＢＬＴまたはＢＬＴ断片が製造され得るものを指す。Ｂ
ＬＴ融合タンパク質の例には、本明細書中で配列番号２、配列番号５および配列
番号７と記載されているものが含まれる。

【００４２】本明細書中で用いる用語「相補的」または「相補性」とは、プリンおよびピリ
ミジンヌクレオチドが水素結合を介して結合し、二本鎖核酸分子を形成すること
ができることを表す。次の塩基対が相補的な関係にある：グアニンとシトシン；
アデニンとチミン；およびアデニンとウラシル。本明細書中で用いる「相補的」
とは、前記の関係が、該分子の全長にわたって、２本の一本鎖核酸分子を構成す
る、実質的にすべての塩基対に適用されることを意味する。「部分的に相補的」
とは、２本の一本鎖核酸分子の一方の長さがもう一方より短く、この一方の分子
の一部が一本鎖のままである前記の関係を表す。

【００４３】本明細書中で用いる用語「合併症」または「その合併症」とは、タイプ１およ
びタイプ２糖尿病を含むがこれらに限定されない、欠損インシュリン代謝または
欠損炭水化物代謝、例えば欠損グルコース代謝に関連する、１つまたはそれ以上
の疾患または症候群、または症状に関連する症状、症候群、補助疾患（群）、慢
性的な軽い疾患などを表す。合併症の例には、ケトアシドーシス, 昏睡, 網膜症
, 糖尿病性小血管症, アテローム硬化症, 心筋梗塞, ストローク, 壊疽, 高グリ
セリド血症, コレステロール過剰血症, 心筋症, 皮膚病, 糖尿病性 foot 症候群
, ネフロパシー, 尿路感染, 乳頭壊死（papillary necrosis）, 白内障, 糖尿病
性胃腸症, 便秘, および末梢血管疾患が含まれるだろう。

【００４４】「保存的置換」または「保存的アミノ酸置換」とは、表１に例示されるタンパ
ク質またはペプチド中の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基（群）の置換を表す
。

【００４５】「その断片」とは、ペプチドの断片、片（piece）または副領域（sub-region ）、または核酸であって、該断片が隣接した２個またはそれ以上のアミノ酸また
は約５〜１４個またはそれ以上のアミノ酸を含むか；親ペプチドまたは核酸分子
中で隣接している１０個またはそれ以上のヌクレオチドを含むものを表す。その
断片は生物学的活性を保持しているかもしれないし、保持していないかもしれな
い。例えば、本明細書中に開示されているペプチドの断片を抗原として用いて、
該断片の親ペプチドに対する特異的抗体を生じさせることができる。核酸分子に
関する場合、「その断片」とは、親核酸から誘導された１０またはそれ以上の隣
接するヌクレオチドを表し、また、遺伝的コードにより、その相補的配列をも表
す。例えば、該断片が配列：5'-AGCTAG-3'を内包する場合、「その断片」はまた
、その相補的配列：3'-TCGATC-5'をも含む。

【００４６】用語「融合タンパク質」は、２個またはそれ以上の異なるタンパク質またはそ
の断片が単一のポリペプチド鎖上で共有結合している、翻訳的融合または酵素的
融合を含む、天然には見られないハイブリッドタンパク質分子を意味する。

【００４７】「融合パートナー」とは、ＢＬＴ融合タンパク質内の、ＢＬＴ由来でないアミ
ノ酸配列、例えば、本明細書中、配列番号６と同定される配列を表す。

【００４８】本明細書中で用いる「機能断片」または「機能的に等価な断片」とは、生物学
的活性、すなわちインビボおよび／またはインビトロにおいてインシュリンの作
用を高める能力；ならびに／あるいはインビボにおいて血中グルコースの低下を
促進し、あるいはインビトロにおいて細胞または組織へのグルコースの取り込み
を高める能力を保持している、完全長ＢＬＴの領域または断片を表す。機能断片
はまた、インビボおよび／またはインビトロにおいて、完全長ＢＬＴによって明
らかにされた生物学的活性、すなわち、グルコースの取り込みを促進する能力お
よび／またはインシュリンの作用を高める能力および／またはインシュリンの感
受性を高める能力を提供するかもしれない。機能断片はクローニング技術、また
は化学合成法、または化学的または酵素的分解によって製造することができる。

【００４９】「宿主細胞」とは、例えば形質転換またはトランスフェクションなどによって
宿主細胞に導入されるベクター中に含まれるクローン化された遺伝子の増殖およ
び／または発現に適当な、任意の真核生物または原核生物細胞を表す。

【００５０】用語「相同体」または「相同な」とは、種々の核酸分子またはアミノ酸配列が
、該分子内配列の１つまたはそれ以上のブロックまたは領域での同一性または部
分同一性および／または類似性によって関連する、その種々の核酸分子またはア
ミノ酸配列間の関係を表す。

【００５１】本明細書中で用いる用語「ハイブリッド形成」とは、一本鎖核酸分子がヌクレ
オチド塩基対形成を介して相補鎖と結合する過程を表す。「選択的ハイブリッド
形成」とは、高度にストリンジェンシーな条件下でのハイブリッド形成を表す。
ハイブリッド形成の程度は、例えば、相同性の程度、ハイブリッド形成のストリ
ンジェンシーおよびハイブリッド形成する鎖の長さに依存する。

【００５２】用語「インシュリノトロピック」とは、例えばインシュリン非感受性の作用（
効果）を逆転させ、除去することによってインシュリンを高める活性を表す。

【００５３】「単離された核酸化合物」とは、例えば細胞内での位置のように、その天然の
存在位置と位置的にはっきり区別される、構築あるいは合成された任意のＲＮＡ
またはＤＮＡ配列を表す。

【００５４】本明細書中で用いる「核酸プローブ」または「プローブ」とは、もう１つの核
酸化合物とハイブリッド形成するラベルされた核酸化合物である。「核酸プロー
ブ」とは、相補的あるいは部分的に相補的な一本鎖標的核酸配列と結合し、二本
鎖分子を形成する、一本鎖核酸配列を意味する。核酸プローブはオリゴヌクレオ
チドまたはヌクレトチドポリマーであってよい。プローブは通常、プローブの末
端に結合しているか、あるいはプローブの配列の内部にある検出可能な部分を含
む。

【００５５】用語「プラスミド」とは、染色体外遺伝因子を表す。本明細書中に開示されて
いるプラスミドは市販されているか、公に自由に入手可能であるか、あるいは、
公開されている手法にしたがって、容易に入手可能なプラスミドから構築可能で
ある。

【００５６】「プライマー」とは、例えば核酸分子の酵素的または合成的鎖延長の開始基質
として機能する核酸断片である。

【００５７】用語「プロモーター」とは、転写、例えばＤＮＡからＲＮＡへの転写を支配す
る核酸配列を表す。誘導性プロモーターとは、環境シグナル、例えば炭素源、熱
または金属イオンによって調節可能なプロモーターである。構成性プロモーター
は一般に、一定レベルで機能し、調節不能である。

【００５８】用語「タンパク質」および「ペプチド」とは、完全に交換可能に用いられ、ペ
プチド結合によって共有結合している、２個またはそれ以上のアミノ酸残基を表
す。いくつかの例では、これらの用語は、ペプチド結合によって結合している、
１０個以上、約５００個までのアミノ酸残基を含むアミノ酸生物ポリマーを示す
。

【００５９】本明細書中で用いる「組換えＤＮＡクローニングベクター」とは、プラスミド
およびファージを含むがこれらに限定されない、任意の自己複製物質であって、
１つまたはそれ以上のさらなるＤＮＡセグメントを組み込むことが可能であるか
、あるいは既に組み込まれているＤＮＡ分子を含む物質を表す。

【００６０】本明細書中で用いる用語「組換えＤＮＡ発現ベクター」または「発現ベクター
」とは、プロモーターおよび他の調節因子が存在し、それにより、タンパク質を
コードしていることもある挿入ＤＮＡの転写が可能である、任意の組換えＤＮＡ
クローニングベクター、例えばプラスミドまたはファージを表す。

【００６１】用語「ストリンジェンシー」とは、ハイブリッド形成条件を表す。高度にスト
リンジェンシーな条件は非相同な塩基対形成に不利である。低度にストリンジェ
ンシーな条件は反対の作用を有する。ストリンジェンシーは、例えば温度および
塩濃度によって変更してもよい。

【００６２】「低度にストリンジェンシー」な条件は、例えば、温度約３７℃またはそれ以
下、ホルムアミド濃度約５０％以下、および中〜低塩（ＳＳＣ）濃度；あるいは
温度約５０℃またはそれ以下、および中〜高塩（ＳＳＰＥ）濃度、例えば１ＭＮａＣｌを特徴とする。

【００６３】「高度にストリンジェンシー」な条件は、例えば温度約４２℃またはそれ以下
、ホルムアミド濃度約２０％以下、および低塩（ＳＳＣ）濃度；あるいは、温度
約６５℃またはそれ以下および低塩（ＳＳＰＥ）濃度を特徴とする。例えば、高
度にストリンジェンシーな条件は、０．５ＭＮａＨＰＯ₄、７％ドデシル硫酸ナ
トリウム硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭＥＤＴＡ、６５℃を特徴とする（A
usubel, F.M. et al. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, 198
9; Green Inc. New York, at 2.10.3）。

【００６４】「ＳＳＣ」はハイブリッド形成および洗浄溶液を構成する。保存２０×ＳＳＣ
溶液には、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）が
含まれる。

【００６５】「ＳＳＰＥ」はハイブリッド形成および洗浄溶液を構成する。保存１×ＳＳＰ
Ｅ溶液には、１８０ｍＭＮａＣｌ、９ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、０．９ｍＭＮａＨ₂ ＰＯ₄および１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）が含まれる。

【００６６】タンパク質に関して「実質的に純粋」とは、該タンパク質が、他のタンパク質
分子を含む他の細胞性および非細胞性成分から分離されていることを意味する。
実質的に純粋な調製物は少なくとも８５％純粋であり；好ましくは少なくとも約
９５％純粋である。「実質的に純粋」なタンパク質は、例えば、引用により本明
細書中に包含されるＩＭＡＣタンパク質精製法（米国特許第４，５６９，７９４
号）を含む、たくさんの適当な方法のいずれかによって製造することができる。

【００６７】本明細書中で用いる「処置」とは、疾患、症状または障害との闘病を目的とす
る患者の管理およびケアを示し、これには本発明のタンパク質を投与して症状ま
たは合併症の開始を予防し、症状または合併症を軽減し、あるいは疾患、症状ま
たは障害を排除することが含まれる。

【００６８】本明細書中のすべての引用文献は、引用により本明細書中に包含される。

【００６９】 β−リポトロピンは１９６４年にヒツジ（ovine）下垂体腺から単離され、その一次構造は翌年に報告された（Li et. al. Nature, 208, 1093, 1965）。その
後、ヒツジ（sheep）、ウシ、ヒツジ（ovine）、マウス、ブタ、モルモット、ラ
ット、ゾウおよびヒトＢＬＴｓの一次配列が報告された。例えば、引用によりす
べて本明細書中に包含される、Lohmar and Li, Biochim. Biophys. Acta, 147,
381, 1967; Li and Chung, Nature, 260, 622, 1976; Drouin and Goodman, Nat
ure, 288, 619, 1980; Li et al. Int. J. Pept. Prot. Res. 32, 573-78, 1988
; Blake and Li, Proc. Nat. Acad. Sci. 80, 1556-1559, 1983; Takahashi et.
al. FEBS Lett. 135, 97-102, 1981 を参照のこと。この配列データは、ＢＬＴのカルボキシ末端が、種間にわたって高度に保存されていることを示す。一方、
異なる種由来のＢＬＴ分子のアミノ末端では、かなりの配列の相違が存在する。

【００７０】本発明はさらに、ヒトＢＬＴ（配列番号８）または他の種由来のＢＬＴまたは
その機能断片を含むＢＬＴ融合タンパク質に関する。ＢＬＴ融合タンパク質の例
は、本明細書中で配列番号２、配列番号５および配列番号７として開示されてい
るものである。

【００７１】ＢＬＴの機能断片は、生物学的活性、例えば糖尿病の処置を必要としている哺
乳類に投与した場合に糖尿病の症状を改善するか、あるいは血清インシュリン濃
度を減少させ、ならびに／あるいはインシュリン感受性を高め、ならびに／ある
いは血中グルコース濃度を低下させ、ならびに／あるいは、インビボまたはイン
ビトロの脂肪組織または筋肉組織あるいはインビトロの脂肪細胞におけるグルコ
ースの取り込みを刺激する能力を示すＢＬＴの断片として都合良く同定される。
ＢＬＴの機能断片には、生物学的活性を保持し、ＢＬＴタンパク質中で隣接して
いることもある、少なくとも２個またはそれ以上のアミノ酸残基を含む任意の断
片が含まれる。好ましい断片には、ヒトＢＬＴ（配列番号８）の残基５９〜８９
の領域、またはヒト以外のＢＬＴの等価な領域の一部外側、あるいは完全に外側
に位置するＢＬＴの隣接領域（すなわち、β−エンドルフィンのコード領域）が
含まれる。

【００７２】ヒトＢＬＴの機能断片の例は、本明細書中に配列番号９〜配列番号２５として
開示されているものである。好ましい断片は、本明細書中で配列番号９〜配列番
号１３と記載されているものであり；最も好ましい断片は本明細書中で配列番号
１０、配列番号１２および配列番号１３と記載されているものである。いくつか
の例では、機能断片は親ＢＬＴの内部欠失を含むこともある（例えば配列番号１
３であり、ここではヒトＢＬＴのアミノ酸残基７〜２３が欠失している）。機能
断片は、当業者に周知の固相化学合成および／または組換えＤＮＡ技術によって
製造することができる。例えば K. Struhl, "Reverse biochemistry: Methods a
nd applications for synthesizing yeast proteins in vitro," Meth. Enzymol
. 194, 520-535 を参照のこと。例えば、ある方法では、ＢＬＴをコードする核酸に１セットの欠失突然変異を導入し、分子のアミノ末端またはカルボキシル末
端から種々の量のペプチドコード領域が欠失しているようにする。またこの方法
を用いて、カルボキシル末端およびアミノ末端の両方が除去されている、無傷の
タンパク質の内部断片を創出することもできる。このような欠失体を創出するの
に適当なヌクレアーゼには、例えば Bal31 が含まれ、あるいは一本鎖核酸分子の場合には mung bean ヌクレアーゼが含まれる。簡単に行うためには、ＢＬＴをコードする核酸を、一本鎖クローニングベクター、例えばバクテリオファージ
Ｍ１３または同等物にクローニングするのが好ましい。所望であれば、任意の適
当な宿主細胞内での増殖および発現のため、得られた欠失断片を任意の適当なベ
クターにサブクローニングしてもよい。

【００７３】ＢＬＴの機能断片を同定し、任意の適当なアッセイを用い、生物学的活性、例
えばペプチド断片が、インシュリン感受性および／またはインビボまたはインビ
トロでの細胞によるグルコースの取り込みを刺激し、あるいは高める能力につい
て試験してもよい。

【００７４】ＢＬＴまたは本明細書中に開示されているいずれか１つのペプチドの１個また
はそれ以上のアミノ酸残基を欠失、挿入、逆位および／または置換することによ
り、ＢＬＴの機能的同族体を製造してもよい。置換同族体は一般に、固相または
組換え技術によって製造され、この同族体には、例えば表１に記載のような単一
または複数の保存的アミノ酸置換が施される。一般に、複数置換される場合には
、任意の分子中、１０個以下の残基が変化しているのが好ましく、最も好ましく
は１〜５個の残基が変化し、約９０〜９９％の範囲の残基が配列番号８と同一で
あるようにし；あるいは、約９５％〜９９％の範囲の残基が配列番号８または別
の種由来の他の適当なＢＬＴと同一であるようにする。

【００７５】例えば、アミノ酸残基１〜８９の間の領域に単一または複数のアミノ酸置換を
有するヒトＢＬＴ（配列番号８）の同族体には以下のような置換が含まれる：第１位の残基は Glu, Ala, Asp または Gln のいずれか；第２位の残基は Leu, Ile, Val, または Met のいずれか；第３位の残基は Thr, Ala, Glu, Ser, Pro, または Gly のいずれか；第４位の残基は Gly, Arg, Ala, Leu, Pro, または Ser のいずれか；第５位の残基は Glu, Gln, Asp, Asn, または Ala のいずれか；第６位の残基は Arg, Glu, Leu, Lys, Gln, または Ala のいずれか；第７位の残基は Leu, Pro, Asp, Val, Ile, または Met のいずれか；第８位の残基は Arg, Glu, Ala, Tyr, Leu, Lys, Pro, Gln または Trp のいずれか；第９位の残基は Glu, Ala, Pro, Asp, Asn, または Gln のいずれか；第１０位の残基は Gly, Ala, Ser, または Asp のいずれか；第１１位の残基は Asp, Arg, Pro, Asn, Gln, Ala, または Glu のいずれか；第１２位の残基は Gly, Ala, Ser, または Met のいずれか；第１３位の残基は Pro, Glu, Gly, または Val のいずれか；第１４位の残基は Asp, Glu, Asn, Gln, または Gly のいずれか；第１５位の残基は Gly, Ala, Ser, または Glu のいずれか；第１６位の残基は Pro, Gln, Leu, Gly, または Glu のいずれか；第１７位の残基は Ala, Asp, Ser, または Gly のいずれか；第１８位の残基は Asp, Glu, Gln, または Asn のいずれか；第１９位の残基は Asp, Glu, Asn, または Gln のいずれか；第２０位の残基は Gly, Ser, または Ala のいずれか；第２１位の残基は Ala, Gly, Ser, または Phe のいずれか；第２２位の残基は Gly, Ala, Ser, または Lys のいずれか；第２３位の残基は Ala, Phe, Thr, Gly, Ser, または Leu のいずれか；第２４位の残基は Gln, Arg, Asp, Asn, Leu, または Val のいずれか；第２５位の残基は Ala, Leu, Asp, Ile, Gly, Ser, または Thr のいずれか；第２６位の残基は Asp, Glu, Gly, Asn, Gln, または Lys のいずれか；第２７位の残基は Leu, Ala, Ile, Met, または Val のいずれか；第２８位の残基は Glu, Gln, Asn, または Asp のいずれか；第２９位の残基は His, Asn, Tyr, Ala, Gln または Glu のいずれか；第３０位の残基は Ser, Gly, Glu, Ala, Leu, または Asp のいずれか；第３１位の残基は Leu, Ala, Val, Met, または Ile のいずれか；第３２位の残基は Leu, Ala, Val, Ile, Met, または Pro のいずれか；第３３位の残基は Val, Ala, Glu, Leu, Ile, Met, または Arg のいずれか；第３４位の残基は Ala, Ser, Pro, Glu, または Gly のいずれか；第３５位の残基は Ala, Asp, Gly, Ser, または Leu のいずれか；第３６位の残基は Glu, Ala, Thr, Leu, Asp, Asn, または Gln のいずれか；第３７位の残基は Lys, Glu, Thr, Arg, Gln, または Asp のいずれか；第３８位の残基は Lys, Arg, Gln, または Glu のいずれか；第３９位の残基は Asp, Ala, Asn, Glu, Gln, または Lys のいずれか；第４０位の残基は Glu, Ser, Asp, Asn, Gln, または Gly のいずれか；第４１位の残基は Gly, Ala, または Ser のいずれか；第４２位の残基は Pro, Gly, Ser, または Asn のいずれか；第４３位の残基は Tyr, Phe, または Trp のいずれか；第４４位の残基は Arg, Lys, Gln, または Glu のいずれか；第４５位の残基は Met, Ile, Ser, または Val のいずれか；第４６位の残基は Glu, Gln, Asp, Asn, His, Arg または Gly のいずれか；第４８位の残基は Tyr または Trp のいずれか；第４９位の残基は Arg または Lys のいずれか；第５０位の残基は Trp, Tyr, または Phe のいずれか；第５１位の残基は Gly, Ala, Ser, または gln のいずれか；第５２位の残基は Ser, Thr, Asn, または Ala のいずれか；第５３位の残基は Pro または Gly のいずれか；第５４位の残基は Pro, Ala, Gly, Arg, Leu, または Thr のいずれか；第５５位の残基は Lys, Arg, Gln, または Ala のいずれか；第５６位の残基は Asp, Asn, Glu, Gln, Ala, Gly, または Ile のいずれか；第５７位の残基は Lys, Gln, または Arg のいずれか；第５８位の残基は Arg, Gln, または Lys のいずれか；第５９位の残基は Tyr, Phe または Trp のいずれか；第６０位の残基は Gly, Ala, または Ser のいずれか；第６１位の残基は Gly, Ala, または Ser のいずれか；第６２位の残基は Phe, Tyr, または Trp のいずれか；第６３位の残基は Met, Leu, Ile, または Val のいずれか；第６４位の残基は Thr, Ala, Ser, または Lys のいずれか；第６５位の残基は Ser, Ala, Thr, または Pro のいずれか；第６６位の残基は Glu, Asp, Asn, Lys, または Gln のいずれか；第６７位の残基は Lys, Arg, または Gln のいずれか；第６８位の残基は Ser, Ala, Thr, または Gly のいずれか；第６９位の残基は Gln, Glu, Asp, Asn, Arg, または His のいずれか；第７０位の残基は Thr, Ser, Ala, または Lys のいずれか；第７１位の残基は Pro または Gly のいずれか；第７２位の残基は Leu, Ile, Met, または Val のいずれか；第７３位の残基は Val, Leu, Ile, または Met のいずれか；第７４位の残基は Thr, Ala, または Ser のいずれか；第７５位の残基は Leu, Ile, Met, または Val のいずれか；第７６位の残基は Phe, Tyr, Trp, または Leu のいずれか；第７７位の残基は Lys, Gln, または Arg のいずれか；第７８位の残基は Asn, Asp, Glu, Gln, または His のいずれか；第７９位の残基は Ala, Gly, Ser, Ile または Val のいずれか；第８０位の残基は Ile, Leu, Met, Val, または Thr のいずれか；第８１位の残基は Ile, Met, Val, Thr, または Leu のいずれか；第８２位の残基は Lys, Gln, または Arg のいずれか；第８３位の残基は Asn, Asp, Glu, Gln, または Ser のいずれか；第８４位の残基は Ala, Val, Ser, Gly, または Glu のいずれか；第８５位の残基は Tyr, Phe, Trp, または His のいずれか；第８６位の残基は Lys, Gln, または Arg のいずれか；第８７位の残基は Lys, Gln, または Arg のいずれか；第８８位の残基は Gly, Ala, または Ser のいずれか；第８９位の残基は Glu, Gln, Asp, Asn, または His のいずれか。

【００７６】ヒトＢＬＴ（配列番号８）中のさらなる具体的な置換には、配列番号８におけ
る、以下のような単一または複数の置換が含まれる：第３位の残基は Glu ；第４位の残基は Arg ；第６位の残基は Gln ；第７位の残基は Pro ；第８位の残基は Glu, Ala, または Pro ；第９位の残基は Pro または Ala ；第１１位の残基は Arg または Pro ；第１６位の残基は Leu または Gln ；第２１位の残基は Phe ；第２３位の残基は Thr, Leu または Pro ；第２４位の残基は Arg または Val ；第２７位の残基は Ala ；第２９位の残基は Asn, Tyr, または Ala ；第３０位の残基は Glu ；第３１位の残基は Ala ；第３２位の残基は Ala ；第３３位の残基は Ala または Glu ；第３４位の残基は Pro または Ser ；第３５位の残基は Asp ；第３６位の残基は Thr または Ala ；第３７位の残基は Glu ；第４０位の残基は Ser ；第４２位の残基は Ser ；第４４位の残基は Glu ；第４５位の残基は Val ；第５２位の残基は Asn ；第５４位の残基は Ala または Arg ；第５６位の残基は Gly ；第８４位の残基は Val ；第８５位の残基は His ；第８９位の残基は His 。

【００７７】

【表１】表１典型的なアミノ酸置換能

【００７８】

【表２】表２配列表の説明

【００７９】遺伝子単離手順当業者であれば、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅または de no
vo ＤＮＡ合成を含むたくさんの組換えＤＮＡ技術によって、ＢＬＴまたはＢＬＴ融合体をコードする核酸配列を得ることができることを認識するであろう。（
例えば T. Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed.
Chap. 14 (1989) を参照のこと）。

【００８０】例えば、配列番号１の３’末端および５’末端を標的とするオリゴヌクレオチ
ドプライマーを Met-Arg-BLT のＰＣＲ増幅用に用いることができる。例えば PC R Protocols: A Guide to Method and Application , Ed. M. Innis et al., Aca
demic Press (1990) を参照のこと。ＰＣＲ増幅は、鋳型ＤＮＡ、適当な酵素、プライマーおよび緩衝液から構成され、ＤＮＡ熱サイクラー（Perkin Elmer Cet
us, Norwalk, CT）において都合良く行われる。ポジティブな結果は、アガロースゲル電気泳動による適当なサイズのＤＮＡ断片（すなわち２７３塩基対）の検
出によって測定される。

【００８１】タンパク質製造方法本発明の１つの態様はＢＬＴタンパク質の医薬化合物としての使用に関する。

【００８２】当業者であれば、たくさんの種々の方法、例えば、固相ペプチド合成を含む当
分野に周知の化学的方法または組換え法によって、本発明のタンパク質およびそ
の断片または機能断片を合成することができることを認識するであろう。両方法は、引用により本明細書中に包含される、米国特許第４，６１７，１４９
号に記載されている。

【００８３】タンパク質の固相化学合成の原理は当分野に周知であり、この分野の一般的文
献中に見出すことができる。例えば H. Dugas and C. Penney, Bioorganic Chem istry (1981) Springer-Verlag, New York, 54-92 を参照のこと。例えば、Appl
ied Biosystems 430A peptide synthesizer (Applied Biosystems, Foster City
, CA) および Applied Biosystems によって供給される合成サイクルを用いる固
相方法論によってペプチドを合成してもよい。

【００８４】 double-couple プロトコルを用いる連続ｔ−ブトキシカルボニル化学を、出発
ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂に適用して、Ｃ末端カルボキサミド化合物
を製造する。Ｃ末端酸化合物の製造には、対応するピリジン−２−アルドオキシ
ムメチオダイド樹脂を用いる。前もって形成されたヒドロキシベンゾトリアゾー
ルエステルを用いて、アスパラギン、グルタミンおよびアルギニンをカップリン
グさせる。合成完了後、このペプチドを脱保護し、１０％メタ−クレゾールを含む無水のフッ化水素を用いて樹脂から開裂させる。側鎖保護基（群）の開裂、
およびペプチドの樹脂からの開裂は、摂氏０℃またはそれ以下、好ましくは−２
０℃で３０分間、その後０℃で３０分間行う。

【００８５】一般に、ペプチドの合成は以下のような一連の工程から構成される。まず、α
−アミノ（および、必要であれば、側鎖の官能基）が保護されているアミノ酸を
活性化させ、反応性エステルを形成させる。この活性化アミノ酸をその活性化エ
ステル基を介して不活性固形支持体に結合させ、結合アミノ酸を十分に洗浄する
。この工程の後、別の反応において、第２の保護アミノ酸をエステルに活性化さ
せる。第１のアミノ酸のα−アミノ基を脱保護し、反応性アミンを得、第２の活
性化アミノ酸をそれと反応させて、固形支持体上にジペプチドを形成させる。こ
れらの工程を連続して繰り返し、ペプチドを長くする。合成完了後、このペプチ
ドを固形支持体から切り離し、このペプチドを強酸で処理して側鎖官能基を脱保
護する。次いでろ過によってこのペプチドを固形支持体と分離し、有機溶媒で沈
殿させ、当分野に周知の種々の技術によって精製する。

【００８６】この例では、α−アミノ保護基は９−フルオロエニルメチルカルボニル（Ｆｍ
ｏｃ）基である。側鎖保護基は；Boc（Lys および Trp 残基に対して）, Trt（
Asn, His, Gln に対して）, tBu（Ser, Thr, Tyr に対して）, OtBu（Asp, Glu
に対して）および Pmc（Arg に対して）である。活性化エステルは２−（１Ｈ −ベンゾ−トリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウ
ムヘキサフルオロホスフェイト（ＨＢＴＵ）を用いて形成させる。

【００８７】固相をピペリジンで処理することによってα−アミノＦｍｏｃ保護基を除去す
る。これらの条件下、固相結合および側鎖保護基には影響を与えずに、Ｆｍｏｃ
基を容易に除去することができる。発生期のペプチド鎖に付加することが可能な
ように、この保護アミノ酸をＨＢＴＵで活性化する。

【００８８】ヒトＢＬＴの合成ではいくつかの特別な難題を提示された。まず、このペプチ
ド配列は ser-pro-pro トリペプチドセグメントを含んでいる。標準的カップリング化学は、この合成において一連の欠失エラーを生じる。pro 残基の double-
coupling によってこのような欠失を最小化する。好ましい態様では、Pro および Ser 残基の double-coupling によってこの合成を行う。さらに、カップリン
グ工程が完了した後、未反応のまま残った、脱保護ペプチドすべてを無水酢酸に
よって保護し、欠失ペプチドの鎖延長を防止する。

【００８９】第２に、ヒトペプチドは３個の asp-gly ジペプチド配列を含む。これらの配列は、asp 側鎖が保護されている場合でさえ、サイクリックイミンが形成しやす
い。次いでこれらのサイクリックイミンは、脱保護工程においてピペリジンと反
応し、ピペリジン修飾ペプチドを生じることもある。asp 残基の前にある各グリ
シン残基のＮ−ａ−Ｈｍｂ保護を利用して、この環化を排除した。例えば、引用
により本明細書中に包含される Qubbell et.al. J. Chem. Soc. Chem. Commun.
2343, 1994 を参照のこと。２個の asp-gly ジペプチドの前に pro がある。配列のこの特徴およびｈｍｂ保護アミノ酸の低い反応性のおかげで、これらの各々
は多重カップリング（multiply-coupled）され、次いで無水酢酸でキャップされ
る。好ましい態様では、これらは二重カップリング（double-coupled）される。

【００９０】好ましい方法では、Ｆｍｏｃ化学を用い、一回の実行でペプチドを合成する。
ＢＬＴの合成は、分子のＮ末端部分にいくつかの asp-gly ジペプチド配列が存在することによって面倒になる。asp-gly ジペプチド配列中のアスパルチル（As
partyl）側鎖が、ＦＭＯＣ合成中に、塩基で触媒される環化とその後のピペリジ
ン付加を受けることが観察された。この反応は、合成中、各 asp-gly 配列でＦｍｏｃ−（ＦｍｏｃＨｍｂ）−グリシンを用いることにより排除される。Ｈｍｂ
基を用いてグリシルアミドを保護すると、アスパルチル側鎖の環化が阻害される
。分解し、脱保護し、ならびに逆相ＨＰＬＣで精製した後、このペプチドをエレ
クトロスプレー質量スペクトル分析によって分析することができる。このＢＬＴ
の合成で見られる主な種類は、予想される質量を有する完全長ペプチドである。
この方法を用いて、０．１ｍｍｏｌｅスケールでの一回の実行から１００ｍｇを
超える大量の精製タンパク質を製造することができる。

【００９１】本発明のタンパク質はまた、組換えＤＮＡ法によって製造することもできる。
当業者に周知の種々の適当な宿主細胞中で、ＢＬＴ、またはＢＬＴ融合体（例え
ば配列番号１）をコードするクローン化核酸を発現させることができる。この目
的のため、当業者に周知のいずれかの適当な方法によって、ＢＬＴをコードする
核酸を宿主細胞に導入する。染色体組込みは本発明の範囲内であるが、ＢＬＴ遺
伝子のコード領域が構成性または誘導性プロモーターに作動可能に連結されるよ
うに、染色体外に維持される適当な発現ベクターにこの配列をクローン化するの
が好ましい。

【００９２】ＢＬＴタンパク質の組換え生産における基本工程は：ａ）ＢＬＴまたはその融合タンパク質をコードする、天然、合成または半合成
のＤＮＡを構築する工程；ｂ）該タンパク質の発現に適当なようにＤＮＡを発現ベクターに組込む工程；ｃ）該ベクターを適当な真核または原核宿主細胞に形質導入するか、あるいは
別の方法で導入し、組換え宿主細胞を形成させる工程；ｄ）該タンパク質の発現に適当なように組換え宿主細胞を培養する工程；およ
び、ｅ）いずれかの適当な手法により、該タンパク質を回収し、実質的に精製する工
程である。

【００９３】原核および真核宿主細胞内での組換えＢＬＴ融合タンパク質の発現ヒトβ−リポトロピン（ＢＬＴ）は８９アミノ酸ホルモンであり、前駆体タン
パク質の形態で下垂体によって生産され、この前駆体は翻訳後にプロセッシング
を受けていくつかの生物に影響するホルモンを生じ、この中にＢＬＴも含まれる
。ＢＬＴは小さく、タンパク質分解に感受性の部位を含むので、最初、我々は化
学合成によってこのタンパク質を製造した。しかし、この方法は大量生産に有用
ではない。本発明では、細菌または真菌発現宿主内で、融合タンパク質形態のＢ
ＬＴを生産することができる方法を記載する。これらの融合タンパク質をタンパ
ク質分解から保護し、以下に記載の方法によって無傷のＢＬＴを回収可能にする
。

【００９４】 E. coli では、高濃度の塩の存在下、慣用の精製法によって細胞溶解液から回
収可能な融合タンパク質としてＢＬＴを製造する。融合タンパク質は特異的プロ
テアーゼの認識部位を含み、これはＢＬＴから融合パートナーを分離するのに用
いられる。Pichia pastoris では、融合タンパク質は細胞から分泌される際に開
裂されるので、培養培地から天然ＢＬＴを検出し、無傷で回収することができる
。

【００９５】この方法はＢＬＴの製造方法を提供する。化学合成と違い、本明細書中に記載
される方法は、大量のＢＬＴの製造にまで規模を拡大することができる。

【００９６】組換えＢＬＴタンパク質の製造に原核生物を用いてもよい。例えば、Escheric
hia coli K12 株 294 (ATCC No. 31446) は、原核細胞内での外来性タンパク質の発現に特に有用である。本発明の組換えタンパク質のクローニングおよび発現
に、宿主細胞として、他の E. coli 株、Bacillus subtilis のようなバチルス、Salmonella typhimurium または Serratia marcescans のような腸内細菌（en
terobacteriaceae）、種々のシュードモナス種および他の細菌、例えば Strepto
myces を用いてもよい。

【００９７】原核生物における遺伝子の発現を駆動させる適当なプロモーター配列には、ｂ
−ラクタマーゼ［例えば、ベクター pGX2907, ATCC 39344 であり, これはレプリコンおよびｂ−ラクタマーゼ遺伝子を含む］、ラクトース系［Chang et al.,
Nature (London), 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature (London), 281:54
4 (1979)］、アルカリホスファターゼおよび、ｔｒｐプロモーターの制御下で、
オープンリーディングフレームのｔｒｐＥ融合タンパク質としての発現を促進す
るように設計されているトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［ベクター p
ATH1 (ATCC 37695)］が含まれる。ハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター（プラスミド pDR540, ATCC-37282 から単離可能）も T7 プロモータ
ーと同様、適当である。ヌクレオチド配列が概して既知である、さらに他の細菌
プロモーターを、リンカーまたはアダプターを用いて本発明のタンパク質をコー
ドするＤＮＡに連結し、必要な任意の制限部位を供給してもよい。細菌系で用い
るためのプロモーターはまた、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可
能に連結されたシャイン・ダルガルノ配列を含むであろう。これらの例は限定的
ではなく、例示的である。

【００９８】本発明のタンパク質を直接発現させるか、あるいは融合タンパク質であって、
これから融合パートナーが酵素的あるいは化学的分解によって除去され得るもの
として発現させることによって本発明のタンパク質を合成してもよい。原理的に
は、本発明は、細菌または真菌宿主内で発現可能な任意の融合系に適用される。
適当な融合系の１つの態様では、例えば融合パートナーをＢＬＴのアミノ末端に
配置するなど、認識部位をＢＬＴと融合パートナーの間に配置する。適当な部位
は、プロテアーゼの認識配列または化学的分解を受けやすい部位であり得る。

【００９９】適当な細菌の融合パートナーの例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼ、マルトース結合タンパク質、プロカルボキシペプチダーゼ、カルモジュリン
結合タンパク質または、融合タンパク質の大量発現そ促進する、アミノ末端に位
置する任意の配列が含まれる。

【０１００】適当なプロテアーゼの例には、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼ
が含まれる。化学的分解用の試薬には、臭化シアン、酸などが含まれる。

【０１０１】真菌系で有用な融合パートナーの例には、α交配因子（alpha mating factor ）、プロペプチド、ヒト血清アルブミンおよび、融合タンパク質の発現および分
泌およびその後の開裂（分泌中）を促進し、天然ＢＬＴを培養培地内に放出させ
る、任意の他の配列が含まれる。

【０１０２】１つのアプローチでは、ＢＬＴ融合タンパク質は、天然ＢＬＴ分子のアミノ末
端でジペプチド（すなわち Met-Arg）と融合した天然ＢＬＴ配列（例えば配列番
号２）を含む。カテプシンＣで処理することによって、この融合分子のジペプチ
ドパートナーを放出させ、当分野に既知の技術、例えばＨＰＬＣによって、天然
ＢＬＴ分子を精製することができる。組換えＢＬＴ融合タンパク質を製造する別
の方法では、本質的には、引用により本明細書中に包含される Smith and Johns
on（Gene, 67, 31, 1988）に記載のように、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼ（ＧＳＴ）を融合パートナーとして用い、本明細書中で配列番号７と記載さ
れるタンパク質を製造する。

【０１０３】あるペプチドを組換え系で製造する際にしばしば観察されるのは、融合タンパ
ク質としての発現によって、所望のペプチドの寿命が延長され、収量が増加し、
あるいは該タンパク質の好都合な精製方法が提供されることである。このことは
、原核宿主内で哺乳類のタンパク質を発現させた場合に特に関係する。ポリペプ
チドを特異的部位で開裂させる（例えば、エンテロキナーゼおよびトロンビン）
か、あるいはペプチドを、該ペプチド鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端から
消化する（例えばジアミノペプチダーゼ）種々のペプチダーゼが既知である。さ
らに、特定の化学物質（例えば臭化シアン）はポリペプチド鎖を特異的部位で開
裂させる。当業者であれば、アミノ酸配列（および、組換え法が用いられている
場合には、合成または半合成のコード配列）に対して、部位特異的内部開裂部位
を包含させる、必要な修飾を理解するであろう。例えば P. Carter, "Site Spec
ific Proteolysis of Fusion Proteins", Chapter 13, in Protein Purificatio n: From Molecular Mechanisms to Large Scale Processes , American Chemical
Society, Washington, D.C. (1990) を参照のこと。

【０１０４】原核生物に加えて、種々の両生類発現系、例えばカエル卵母細胞、および哺乳
類細胞系を用いることができる。特定の宿主細胞の選択は、ある程度、実際に用
いられる発現ベクターに依存する。本発明において用いるのに適当な哺乳類宿主
細胞の例には、例えば HepG-2 (ATCC HB 8065), CV-1 (ATCC CCL 70), LC-MK2 (
ATCC CCL 7.1), 3T3 (ATCC CCL 92), CHO-K1 (ATCC CCL 61), HeLa (ATCC CCL 2
), RPMI8226 (ATCC CCL 155), H4IIEC3 (ATCC CCL 1600), C127I (ATCC CCL 161
6), HS-Sultan (ATCC CCL 1484), および BHK-21 (ATCC CCL 10) が含まれる。

【０１０５】広範な種々のベクターが哺乳類宿主細胞を形質転換するのに適当である。例え
ば、pSV2 型ベクターは、転写およびポリアデニル化に必要とされる simian vir
us 40 (SV40) ゲノムのセグメントを含む。SV40 プロモーターが挿入遺伝子の転
写を駆動する、多数のプラスミド pSV2 型ベクター、例えば pSV2-gpt, pSV2-ne
o, pSV2-dhfr, pSV2-hyg, および pSV2-b-globin が構築された。これらのベクターは、例えば the American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parkla
wn Drive, Rockville, Maryland, 20852, または the Northern Regional Resea
rch Laboratory (NRRL), 1815 N. University Street, Peoria, Illinois, 6160
4 のような供給元から広く入手可能である。

【０１０６】哺乳類細胞内での発現に適当なプロモーターには、SV40 後期プロモーター、真核生物遺伝子由来のプロモーター、例えばエストロゲン誘導チキン卵白アルブ
ミン遺伝子、インターフェロン遺伝子、糖質コルチコイド誘導チロシンアミノト
ランスフェラーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子プロモーターおよび主要な初
期および後期アデノウイルス遺伝子のプロモーターが含まれる。

【０１０７】プロトプラスト融合、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーションなど
を含むが、これらに限定されないたくさんの周知の方法により、哺乳類細胞をベ
クターでトランスフェクションすることができる。例えば Maniatis et al. 上記を参照のこと。

【０１０８】また、いくつかのウイルスは適当なベクターになる。この例には、引用により
本明細書中に包含される、米国特許第４，７７５，６２４号に記載の、アデノウ
イルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、バキュ
ロウイルスおよびラウス肉腫ウイルスが含まれる。

【０１０９】真核微生物、例えば酵母および他の真菌もまた、適当な宿主細胞である。酵母
Saccharomyces cerevisiae および Pichia pastoris は好ましい真核微生物である。他の酵母、例えば Kluyveromyces lactis もまた適当である。Saccharomy
ces 内での発現用には、例えばプラスミド YRp7 (ATCC-40053) を用いてもよい。例えば L. Stinchcomb et al., Nature, 282, 39 (1979); J. Kingsman et al
., Gene, 7, 141 (1979); S. Tschemper et al., Gene, 10, 157 (1980) を参照
のこと。プラスミド YRp7 には trp1 栄養要求性突然変異体内での使用について
の選択的マーカーを提供する TRP1 遺伝子が含まれる。

【０１１０】本発明の他の態様には、ＢＬＴまたはその断片をコードする単離された核酸配
列が含まれる。当業者であれば、本発明のアミノ酸化合物が、たくさんの種々の
核酸配列によってコードされ得ることを理解できよう。これらの別の核酸配列は
同じアミノ酸配列をコードするため、本発明にはさらに、これらの別の核酸配列
が含まれる。

【０１１１】また、本発明のＢＬＴをコードする核酸を、化学合成法によって製造してもよ
い。核酸の合成は当分野に周知である。例えば E.L. Brown, R. Belagaje, M.J.
Ryan, and H.G. Khorana, Methods in Enzymology, 68:109-151 (1979) を参照
のこと。ホスホルアミダイト（phosphoramidite）化学を利用する、慣用のＤＮＡ合成装置、例えば、Applied Biosystems Model 380A or 380B DNA synthesize
rs (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA
94404) を用いて、ＢＬＴに対応するＤＮＡ配列の断片を製造することができ、
次いでこの断片を連結し、完全な遺伝子を再構成することができる。別法として
、ホスホトリエステル化学を用いて、本発明の核酸を合成してもよい。（例えば
M.J. Gait, ed., Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, (1984)
を参照のこと）。

【０１１２】ベクター本発明のもう１つの側面は、本発明の核酸を含む、組換えＤＮＡクローニング
ベクターおよび発現ベクターに関する。好ましい核酸ベクターはＤＮＡを含むも
のである。最も好ましい組換えＤＮＡベクターは、単離されたＤＮＡ配列、配列
番号１を含むものである。

【０１１３】当業者であれば、最も適当なクローニングベクターの選択は、制限酵素部位の
利用可能性、該ベクターがトランスフェクトあるいは形質導入される宿主細胞の
タイプ、トランスフェクションおよび形質転換の目的（例えば染色体外因子とし
ての安定な形質転換または宿主染色体への組込み）、容易にアッセイ可能あるい
は選択可能なマーカーの存在または不存在（例えば１つのタイプおよびもう１つ
のタイプの抗生物質耐性および代謝マーカー）および宿主細胞内の所望の遺伝子
のコピー数を含むたくさんの要因に依存することを理解する。

【０１１４】本発明の核酸を保持するのに適当なベクターには、ＲＮＡウイルス、ＤＮＡウ
イルス、溶菌性バクテリオファージ、溶原性バクテリオファージ、安定バクテリ
オファージ、プラスミド、ウイロイドなどが含まれる。最も好ましいベクターは
プラスミドである。

【０１１５】発現ベクターを調製する場合、例えば、構成性プロモーター用いるか、あるい
は誘導性プロモーターを用いるかのような考慮すべき多くの変数が存在すること
が当業者には理解される。また当業者には、製造される核酸またはタンパク質の
量が、発現系の選択を部分的に左右することを理解される。プロモーター配列に
ついて言えば、誘導性プロモーターは、作動可能に連結された遺伝子を大量に調
節して発現できるので好ましい。当業者であれば、種々の誘導物質、例えば炭素
源、金属イオンおよび熱に応答するたくさんの適当なプロモーターを認識してい
るであろう。発現ベクターに関する他の関連する考察には、組換えタンパク質を
局在化させる配列を含ませるかどうかが含まれる。例えばシグナルペプチドをコ
ードする配列を遺伝子のコード領域の前に配置すると、得られたポリペプチドを
細胞外へ輸送させるのに有用である。

【０１１６】本発明はまた、ＢＬＴタンパク質を発現可能な組換え宿主細胞を構築する方法
であって、ＢＬＴをコードする単離されたＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡベクタ
ーを宿主細胞に形質導入あるいは別の方法で導入することを含む方法を提供する
。好ましい宿主細胞は、外来の導入遺伝子またはタンパク質の大量発現を可能に
する任意の細胞である。形質転換された細胞を当業者に周知の条件下で培養し、
組換えＢＬＴを発現させてもよい。

【０１１７】本発明はまた、インシュリン代謝または炭水化物代謝の欠損に関連する疾患ま
たは症状、例えば高血糖症、インシュリン過剰血症、タイプ１およびタイプ２糖
尿病およびその合併症を患っているヒトおよび他の哺乳類を処置する方法を提供
する。この方法はそれを必要としている生物に有効量のＢＬＴタンパク質または
ペプチド、または、ＢＬＴを含む融合タンパク質、またはその機能断片、または
その同族体を約１〜１０００ｕｇ／体重ｋｇの範囲の用量で投与することを含む
。この方法を行う際、一日１回の投与、一日当たり複数回の投与、または体内に
移植されているか、あるいは身体に装着されている機械ポンプ装置を介して継続
的または断続的に投与することによりＢＬＴを投与可能である。投与すべきＢＬ
Ｔまたは関連するタンパク質またはペプチドの量は、医師によって決定され、処
置される症状、症候群または疾患の性質および重篤度、および患者の年齢および
全体的健康状態などの要因に依存する。

【０１１８】本発明はまた、活性物質として、ＢＬＴタンパク質またはその機能断片、また
はその同族体、例えば配列番号８で示されるもの、または製薬的に許容されるそ
の無毒の塩を、製薬的に許容される固形または液状担体と組み合わせて含む医薬
組成物を提供する。好ましくは製薬的に許容される塩形態である本発明のタンパ
ク質を、糖尿病またはその合併症を治療または予防処置するための非経口投与用
に製剤化することができる。例えば、配列番号８の化合物または他のＢＬＴ、ま
たはその断片を慣用の製薬的担体および賦形剤と混合することができる。ＢＬＴ
タンパク質を含む組成物は、好ましくは可溶形態で、約０．１〜９０重量％、よ
り一般的には約１０〜３０％のこのタンパク質を含む。さらに、本発明のタンパ
ク質は、単独で、あるいは他の抗糖尿病剤または糖尿病の処置に有用な物質と組
み合わせて投与してもよい。

【０１１９】静脈内（ＩＶ）で使用するには、ＢＬＴタンパク質、断片または同族体を、一
般に用いられる静脈内投与用液状物（群）中で投与し、ならびに注入によって投
与する。そのような液状物として、例えば生理食塩水、リンガー溶液または５％
デキストロース溶液を用いることができる。

【０１２０】筋肉内製剤用に、滅菌製剤、好ましくはＢＬＴタンパク質、例えば配列番号８
の適当な可溶塩形態、例えば塩酸塩を、製薬的希釈剤、例えば発熱原を含まない
水（蒸留水）、生理食塩水または５％グルコース溶液中に溶解させ、投与するこ
とができる。適当な不溶性形態の本発明化合物を水性基剤または製薬的に許容さ
れる油状基剤、例えば長鎖脂肪酸のエステル、例えばエチルオレアート中の懸濁
液として調製し、投与してもよい。

【０１２１】以下に実施例を挙げ、本発明および糖尿病の処置におけるＢＬＴの使用をさら
に完全に説明する。当業者であれば、記載されている具体的な試薬、装置および
手法が単に例示的であり、いかなる意味においても本発明を限定するためのもの
ではないことを認識するであろう。

【０１２２】実施例１ヒトＢＬＴタンパク質の固相合成および精製ヒトＢＬＴペプチド（配列番号８）をＦｍｏｃ化学を利用する一回の実行で合
成した。ＢＬＴの合成は、このペプチドのＮ末端部分にいくつかの asp-gly ジペプチド配列が存在するために面倒である。asp-gly ジペプチド配列中のアスパ
ルチル側鎖は、ＦＭＯＣ合成中、塩基によって触媒される環化およびその後のピ
ペリジン付加を受けることが観察された。この合成において、各 asp-gly 配列での Fmoc-(FmocHmb)-グリシンの使用によりこの反応を排除する。グリシルアミ
ドをＨｍｂで保護すると、アスパルチル側鎖の環化が阻害される。分解、脱保護
および逆相ＨＰＬＣ精製を行った後、このペプチドをエレクトロスプレー質量ス
ペクトル分析によって分析することができる。この合成において見られる主要な
種類は、予想される質量を有する完全長のペプチドである。この方法の使用によ
り、０．１mmole 規模で、一回の実行から１００ｍｇを超える大量の精製タンパ
ク質の生産が可能になる。

【０１２３】材料：前負荷された Fmoc-Glu (OtBu) Wang (ｐ−ベンゾキシベンジルアルコールで機能化された1%架橋ポリスチレン）樹脂（約０．６mmole アミノ酸／樹脂
ｇ）。Ｎ−メチルピロリドン (NMP), ピペリジン, ２−（１Ｈ−ベンゾトリア
ゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ
ホスフェイト (HBTU), ２ＭＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン (DIEA) １−
ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt), ジクロロメタン (DCM), ジメチルホルムアミド (DMF)。

【０１２４】Ｆｍｏｃ保護Ｃ末端アミノ酸（０．１または０．２５mmole アミノ酸）を前負
荷しておいた樹脂の重さを量り、反応室に置いた。この樹脂をＤＣＭで洗浄し、
前もって膨潤させておいた。次いでこの樹脂をＮＭＰで洗浄した。この樹脂をＮ
ＭＰ中の１８−２２％ピペリジン溶液中でインキュベートし、Ｎ−末端Ｆｍｏｃ
基を除去した。脱保護後、樹脂をＮＭＰで何回も洗浄した。

【０１２５】このペプチドに付加すべき次のＦｍｏｃ保護アミノ酸１mmoleを、ＤＭＦ中のＮＭＰ２．１ｇ、0.45 M HBTU/HOBt 試薬２．０ｇに溶解させた。溶解後、ＮＭ
Ｐ中の 2M DIEA ３ｍＬを加えてアミノ酸の活性化を開始した。次いで活性化されたアミノ酸を脱保護した樹脂に加えて、カップリングさせた。カップリングが
完了した時点で、この樹脂をＮＭＰで何回も洗浄した。次いで各後続アミノ酸に
ついて、脱保護およびカップリングの完全サイクルを繰り返した。

【０１２６】この合成の具体的なサイクル工程は以下のものであった：サイクルアミノ酸工程 1 Glu(OtBu) Complete wash 2 Gly Single Couple 3 Lys(Boc) Single Couple 4 Lys(Boc) Single Couple 5 Tyr(tBu) Single Couple 6 Ala Single Couple 7 Asn(Trt) Single Couple 8 Lys(Boc) Single Couple 9 Ile Single Couple 10 Ile Single Couple 11 Ala Single Couple 12 Asn(Trt) Single Couple 13 Lys(Boc) Single Couple 14 Phe Single Couple 15 Leu Single Couple 16 Thr(tBu) Single Couple 17 Val Single Couple 18 Leu Single Couple 19 Pro Double couple/Ac2O cap 20 Thr(tBu) Single Couple 21 Gln(Trt) Single Couple 22 Ser(tBu) Single Couple 23 Lys(Boc) Single Couple 24 Glu(OtBu) Single Couple 25 Ser(tBu) Single Couple 26 Thr(tBu) Single Couple 27 Met Single Couple 28 Phe Single Couple 29 Gly Single Couple 30 Gly Single Couple 31 Tyr(tBu) Single Couple 32 Arg(Pmc) Single Couple 33 Lys(Boc) Single Couple 34 Asp(OtBu) Single Couple 35 Lys(Boc) Single Couple 36 Pro Double couple/Ac2O cap 37 Pro Double couple/Ac2O cap 38 Ser(tBu) Single Couple 39 Gly Single Couple 40 Trp(Boc) Single Couple 41 Arg(Pmc) Single Couple 42 Phe Single Couple 43 His(Trt) Single Couple 44 Glu(OtBu) Single Couple 45 Met Single Couple 46 Arg(Pmc) Single Couple 47 Tyr(tBu) Single Couple 48 Pro Double couple/Ac2O cap 49 Gly Single Couple 50 Glu(OtBu) Single Couple 51 Asp(OtBu) Single Couple 52 Lys(Boc) Single Couple 53 Lys(Boc) Single Couple 54 Glu(OtBu) Single Couple 55 Ala Single Couple 56 Ala Single Couple 57 Val Single Couple 58 Leu Single Couple 59 Leu Single Couple 60 Ser(tBu) Single Couple 61 His(Trt) Single Couple 62 Glu(OtBu) Single Couple 63 Leu Single Couple 64 Asp(OtBu) Single Couple 65 Ala Single Couple 66 Gln(Trt) Single Couple 67 Ala Single Couple 68 Gly Single Couple 69 Ala Single Couple 70 Gly(Fmoc-hmb) Double couple/Ac2O cap 71 Asp(OtBu) Single Couple 72 Asp(OtBu) Single Couple 73 Ala Single Couple 74 Pro Double couple/Ac2O cap 75 Gly(Fmoc-hmb) Double couple/Ac2O cap 76 Asp(OtBu) Single Couple 77 Pro Double couple/Ac2O cap 78 Gly(Fmoc-hmb) Double couple/Ac2O cap 79 Asp(OtBu) Single Couple 80 Gly Single Couple 81 Glu(OtBu) Single Couple 82 Arg(Pmc) Single Couple 83 Leu Single Couple 84 Arg(Pmc) Single Couple 85 Gln(Trt) Single Couple 86 Gly Single Couple 87 Thr(tBu) Single Couple 88 Leu Single Couple 89 Glu(OtBu) Single Couple 90 Final deprotect Complete wash（完全な洗浄） Single Couple（一重カップリング） Double couple（二重カップリング） Final deprotect（最終的な脱保護）

【０１２７】ゆっくり、非効率的に反応するアミノ酸に関して、２回の別のカップリング反
応を行った。無水酢酸で処理して、残りの反応しなかったペプチドをすべて保護
した。これらのアミノ酸の１個についての工程手順は、脱保護、カップリング反
応１、洗浄、カップリング反応２、洗浄、Ac2O cap、洗浄、脱保護であった。略語： OtBu: t-ブチルエステル, tBu: t-ブチル, Boc: t-ブトキシカルボニ
ル, Pmc: 2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマ-6-スルホニル, Hmb: 2-ヒドロキシ-4
-メトキシベンジル, Fmoc: 9-フルオレニルメトキシカルボニル。

【０１２８】実施例２ＢＬＴをコードする合成遺伝子の構築 Maniatis et.al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring H
arbor Laboratory, N.Y. (1982) に記載のような標準的クローニング方法論を用
いてプラスミドを構築した。酵素および他の試薬は Gibco-BRL, Gaithersgurg,
MD または New England Biolabs, Beverly MA 01915 から入手した。本発明で用
いられる種々のオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡ断片を消化、同定、回収および
精製する方法は当業者に既知であり、これらの配列をベクターに連結し、宿主微
生物を形質転換し、プラスミドＤＮＡおよび組換えタンパク質産物の製造を可能
にする条件下でこれらの宿主微生物を培養する方法も同様である。

【０１２９】ヒトＢＬＴ（配列番号８）をコードするＤＮＡ配列を、５２〜８６塩基の範囲
のサイズの８個の化学合成オリゴヌクレオチドと結合させた。このオリゴヌクレ
オチドは慣用のＤＮＡ合成装置、例えば Applied Biosystems model 380A or 38
0B（Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA
94404 から市販されている）を用いて製造されたものである。このオリゴヌクレ
オチドの配列は、４個のオリゴヌクレオチドが合成遺伝子の一方の鎖を生じさせ
、残りの４個のオリゴヌクレオチドが合成遺伝子のその相補鎖を生じさせるよう
に設計されたものである。結合の前に、このオリゴヌクレオチドを、ＡＴＰの存
在下、ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、それぞれのオリゴヌクレオチドの遊
離のヒドロキシル基をリン酸化する。

【０１３０】８個のオリゴヌクレオチドを容量１００ｕＬ中、等濃度（３ピコモル／ｕＬ）
で混合し、９５℃にまで加熱し、数時間かけて、室温にまで徐々に冷却した。こ
れにより、それぞれのオリゴヌクレオチドを適正に塩基対形成させた。T4 DNA リガーゼを加えて、オリゴヌクレオチドを連結し、二重鎖の〜２８５塩基対ＤＮ
Ａを得、これを２％アガロースゲルで分析し、精製した。「付着」末端を有する
この断片を、NdeI および BamHI で消化したｐＵＣ１８ベクターに連結した。こ
の連結混合物を感応 DH10B 細胞に形質導入し、これを１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリンを含むトリプトン−酵母寒天プレートにまいた。一晩で生育したコロニ
ーを、化学合成された遺伝子を含むプラスミドの存在に関して分析した。これは
、これらのコロニーからプラスミドＤＮＡを精製し、このプラスミドＤＮＡをNd
eI および BamHI で消化し、〜２８５塩基対断片の存在を確かめることによって
行った。次いでＤＮＡ配列分析により正しい配列を確認にした。このプラスミド
を pOJ838 と名付けた。

【０１３１】実施例３ＢＬＴ融合タンパク質を発現するプラスミドの構築ＢＬＴは小さいタンパク質であるため、融合タンパク質を創出して、そのサイ
ズを大きくすることは有益であった。この目的のため、２個の異なる融合パート
ナーを用いた。一方は、因子Ｘａ開裂部位および本明細書中では配列番号６とし
て記載されるアミノ酸配列を有する、ベクター pGEX-2T (Pharmacia Biotechno
logy, Piscataway, NJ 08855) によってコードされるグルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ（ＧＳＴ）であり；他方は短いペプチド配列 MIIGLMVGGVSGSGSGSGD
DDDP（配列番号３）であった。

【０１３２】天然のβ−リポトロピンを得るため、融合タンパク質を化学的処理あるいは酵
素的消化によって処理し、β−リポトロピンをその融合パートナーから解離させ
る。融合パートナーとβ−リポトロピンの間に酵素的あるいは化学的開裂用の部
位を挿入することによってこれを行う。ＧＳＴ融合物の場合には、エンテロキナ
ーゼまたは因子Ｘａの認識部位を選択し；合成小ペプチド融合物（配列番号３）
の場合には、プロリンを挿入し、これにより酸での処理によって化学的に開裂さ
せることができるようにした。

【０１３３】因子Ｘａ認識配列 (IEGR) を伴うＧＳＴ融合物をコードするプラスミドを以下
のように構築した。プラスミド pOJ838（合成β−リポトロピンを含む pUC18；実施例４を参照のこと）を NdeI および NruI で消化し、最大のベクター断片を
ゲル精製した。配列：5'-TATGAGATCTATCGAAGGTCGTGAGCTCACCGGTCAGCGTGTTCG-3' （配列番号４）の合成リンカーおよびその相補体を等量混合し、９５℃にまで加
熱し、温度を約２５℃にまで徐々に下げてアニーリングさせた。アニーリングさ
れたリンカーをベクター断片に連結し、連結混合物を感応 DH10B 細胞に形質導入した。形質転換細胞を、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含むトリプトン−
酵母寒天プレートにまいた。一晩生育したコロニーを、リンカー配列を含むプラ
スミドの存在に関して分析した。これらのコロニーからプラスミドＤＮＡを精製
し、リンカーを介して導入された新たな BglII 部位の存在を確かめることによってこれを行った。次いでＤＮＡ配列分析によって正しいリンカー配列を確認し
た。得られたプラスミドを pOJ839 と名付けた。

【０１３４】プラスミド pOJ839 を BglII および EcoRI によって消化し、（因子Ｘａ認識
配列と結合されている）β−リポトロピン遺伝子を含む小さい断片をゲル精製し
、BamHI および EcoRI で消化された pGEX 2-T に連結した。この連結混合物をコンピテント DH10B 細胞内に形質導入し、これを、１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリンを含むトリプトン−酵母寒天プレートにまいた。一晩生育したコロニーを
、SacI で消化した後に新たな〜３００ｂｐ断片を含むプラスミドの存在に関して分析した。この新規プラスミドを pOJ840 と名付けた。

【０１３５】実施例４プロカルボキシペプチダーゼ−ＢＬＴ融合タンパク質をコードする組換えベクター pHMM260-ProCpB(10)/LVPR/β−リポトロピン (R49) 組換えＤＮＡ発現ベクター、pHMM260 は、プロカルボキシペプチダーゼ−ＢＬ
Ｔ融合タンパク質をコードする ProCpB(10)/LVPR/β−リポトロピン（Ｒ４９）発現カセットを含む。標準的クローニング技術を用いてこのベクターを製造した
。pHMM260 の発現カセットの注釈を図１６に示す。この発現カセットには、５’
末端において NdeI 部位が隣接し、３’末端において BamHI 部位が隣接している。ブタプロカルボキシペプチダーゼＢタンパク質のプロペプチド部分はカセッ
トの５’末端に存在し、Ｍｅｔ残基で始まって、Ｓｅｒ残基で終わっている。ト
ロンビンプロテアーゼ認識配列、LVPR はプロカルボキシペプチダーゼ配列の３ ’側に隣接して存在する。トロンビン開裂部位の３’末端側のＧｌｕ残基で始ま
る配列は、野生型ヒトβ−リポトロピンをコードしている。

【０１３６】ＢＬＴ配列の第４９位が野生型配列の Arg (R49) から Ala (A49) pHMM261, または Glu (E49) pHMM262, または Gln (Q49) pHMM263 に変化している、いくつかの誘導体カセットを構築した。これらの誘導体は、融合タンパク質を合成お
よび精製する間のタンパク質分解の感受性を減少させるために作成されたもので
ある。これらのベクターはすべて可溶性融合タンパク質をコードしている。

【０１３７】実施例５セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）−ＢＬＴ融合タンパク質をコードする組換えベクター pHMM268 標準的クローニング技術を用いて、酵素、セリンヒドロキシメチラーゼトラン
スフェラーゼ（ＳＨＭＴ）由来のアミノ末端配列を含む融合タンパク質を構築し
た。プラスミド pHMM268 を E. coli 中で大量に発現させた。pHMM268 によって
生産された融合タンパク質は不溶性であり、粒子分画（フラクション）で回収す
ることができた。この特徴はタンパク質分解に対して保護するのに利点を提供し
た。

【０１３８】実施例６雄性 A^vy/A マウスに対する７日間のマウスＢＬＴの投与 A^vy/A マウスは肥満および糖尿病のモデルである。この同系交配株は、中年期
に高血糖症、インシュリン過剰血症およびインシュリン非感受性を発症するため
、肥満および糖尿病の両者についての有用なモデルを提供する。

【０１３９】年齢約６月の雄性 A^vy/A マウスを Harlan Co. (Indianapolis, IN) から購入
した。この動物をかご当たり６匹飼育し、ad libitum（任意量）の 5008 えさと
水を与えた。規則的間隔で血中グルコース濃度を測定した；朝のグルコース濃度
が少なくとも３００ｍｇ／ｄＬに達したときに、動物を実験プロトコルに付した
。無作為に選択した被検動物５匹をコントロールとしていっしょに飼育し；また
、無作為に選択した被検動物５匹をいっしょに飼育し、固相技術によって合成さ
れたマウスＢＬＴ（マウスＢＬＴ配列は容易に入手可能である；例えば引用によ
り本明細書中に包含される M. Notake et. al. FEBS Lett. 156, 67-71, 1983 を参照のこと)で処置した。

【０１４０】ＢＬＴで処置されたマウスには一日２回、６０μｇを皮下（ＳＣ）投与し（各
用量の総容量は２００μＬ）；コントロール動物には一日２回ビヒクル（食塩水
）２００μＬを投与した。この被検動物に対して、６日間、一日２回、朝と午後
に注射をし；７日目は朝の注射だけ行った。

【０１４１】０日目の朝、血中グルコース濃度、体重およびえさ消費量を測定した。１〜６
日目の朝には体重およびえさ消費量を測定した。６日目の朝には、血漿トリグリ
セリドを測定した。６日目の午後から７日目の朝まで一晩、マウスを絶食させた
。７日目に、経口グルコース許容試験を行った。朝の食塩水またはＢＬＴの注射
の２時間後、時間０の血中グルコース濃度を測定した。この試験では、動物に２
５％デキストロース溶液（１００μＬ／体重１０ｇ）を経口投与し、３０分、６
０分および１２０分後に採血した。この血液サンプルを用いてグルコースおよび
インシュリンの濃度を測定した。経口グルコース許容試験の後、動物をad libit
um で飼育した。食塩水またはＢＬＴを最後にＳＣ注射した後、１、３および１４日目に、動物から採血し、血中グルコース値を測定した。

【０１４２】結果ＢＬＴ投与はインビボで血中グルコースおよびインシュリンを低下させるこれらの実験の結果を図１〜８にまとめる。７日間の処置過程を通して、コン
トロール群および試験群の動物はおおよそ４．５〜６グラムのえさを消費した（
図１）。体重は両群で同等に維持され、約５０グラムであった（図２）。

【０１４３】ＢＬＴ処置は、処置マウスの血漿トリグリセリドを６日間の処置後に減少させ
た（図３を参照のこと）。コントロール動物は平均値 3.05 nmol/L (s.d. 0.58)
を示し、一方処置された動物では平均値 2.05 nmol/L (s.d. 0.43) が測定され
た。これは血清トリグリセリドが約３０％〜３５％減少したことを示す。

【０１４４】ＢＬＴはまた、処置された動物において血中グルコース濃度の実質的な減少を
誘導した（図４）。７日間のＢＬＴの投与後、処置された群は血中グルコース濃
度 135 mg/dL (s.d. 16) を示し；コントロール群では、著しく対照的に、171 m
g/dL (s.d. 16) であることが測定された。

【０１４５】処置された動物における血中グルコース濃度の減少は、７日目に最後にＢＬＴ
投与した後、少なくとも３日間継続した（図５）。コントロール動物はグルコー
ス濃度 331 mg/dL (s.d. 79) を示した。一方、処置された動物は、実質的に低い血中グルコース濃度を維持し、205 mg/dL (s.d. 76) であった。血中グルコー
ス濃度を低下させるＢＬＴの効果は、最後にＢＬＴ投与してから１４日後には、
観察されなかった（図６）。

【０１４６】インシュリン濃度に対するＢＬＴ処置の効果を扱うため、７日間の処置期間お
よび一晩の絶食後に経口グルコース許容試験を行った（図７および図８）。コン
トロール動物および処置された動物は、試験開始後３０分の時点で、約 80 mg/d
L 〜 200 mg/dL またはそれ以上の血中グルコース濃度の初期上昇を示し；その後、両群は２時間の時点まで同等の割合の、値の減少を示した（図７）。印象的
なのは、処置された動物が実質的にコントロール動物以下の血漿インシュリン値
を示したことである（図８）。例えば、３０分の時点で、コントロール動物はイ
ンシュリン濃度 11.5 ng/ml (s.d. 1.9) を示したのに対し、処置された動物はインシュリン濃度 6.0 ng/ml (s.d. 3.0) を示した。

【０１４７】実施例７雄性 A^vy/A マウスに対する１４日間のマウスＢＬＴの投与雄性 A^vy/A マウスをかご当たり６匹ずつ飼育し、ad libitum の 5008 えさお
よび水を与えた。血中グルコース濃度を規則的間隔で測定し；朝のグルコース濃
度が少なくとも 300mg/dL に達した時点で、動物を実験プロトコルに付した。コ
ントロールとして、無作為に選択した動物５匹をいっしょに飼育し；また、無作
為に選択した動物５匹をいっしょに飼育し、固相技術によって合成されたマウス
ＢＬＴで処置した。

【０１４８】ＢＬＴで処置されたマウスには、一日２回６０μｇをＳＣで投与し（各用量の
総容量は２００μＬ）；コントロール動物にはビヒクル（食塩水）２００μＬを
投与した。動物に対して、１３日間、一日２回、朝と午後に注射をし；１４日目
は朝の注射だけを行った。

【０１４９】０日目の朝、血中グルコース濃度、体重およびえさ消費量を測定した。１〜１
３日目の朝には体重およびえさ消費量を測定した。１３日目の午後から１４日目
の朝まで一晩、マウスを絶食させた。１４日目に、経口グルコース許容試験を行
った。朝の食塩水またはＢＬＴの注射の２時間後、時間０の血中グルコース濃度
を測定した。この試験では、動物に２５％デキストロース溶液（１００μＬ／体
重１０ｇ）を経口投与し、３０分、６０分および１２０分後に採血した。この血
液サンプルを用いてグルコースおよびインシュリンの濃度を測定した。経口グル
コース許容試験の後、動物をad libitum で飼育した。食塩水またはＢＬＴを最後にＳＣ注射した後、１、３および１４日目に、動物から採血し、血中グルコー
ス値を測定した。

【０１５０】結果：１４日間のＢＬＴ投与は血中グルコースおよびインシュリンを低下させる結果を図９、１０にまとめる。１４日間の処置過程を通して、コントロール群
および試験群の動物はおおよそ４．５〜６グラムのえさを消費し、体重は両群で
同等に維持され、約５０グラムであった（データは示していない）。

【０１５１】インシュリン濃度に対する、２週間のＢＬＴ処置の効果を扱うため、１４日間
の期間後に経口グルコース許容試験を行った（図９および図１０）。コントロー
ル動物および処置された動物は、３０分の時点で、約 80 mg/dL 〜 300 mg/dL またはそれ以上の血中グルコース濃度の初期上昇を示し；その後、両群は２時間
の時点で試験が終了するまで同等の割合の、値の減少を示した（図９）。例えば
、３０分の時点で、処置された動物は平均の血中グルコース濃度 289 mg/dL (s.
d. 24) を示したのに対し、コントロール動物は濃度 348 mg/dL (s.d. 18) を示
した。６０分および１２０分の時点では、濃度の低下が観察された。例えば１２
０分では、処置された動物は平均の血中グルコース濃度 114 mg/dL (s.d. 4) を
示したのに対し、コントロール動物は濃度 188 mg/dL (s.d. 23) を示した。

【０１５２】また、処置された動物は実質的にコントロール動物より低い血漿インシュリン
値を示した（図１０）。例えば、３０分の時点で、コントロール動物はインシュ
リン濃度 7.4 ng/ml (s.d. 2.1) を示したのに対し、処置された動物はインシュ
リン濃度 4.8 ng/ml (s.d. 0.6) を示した。

【０１５３】実施例８ＢＬＴは３Ｔ３含脂肪細胞へのグルコースの取り込みを刺激するマウス 3T3-L1 細胞を、９６ウェルプレート中、ウェル当たり約１００μＬの
培養培地に、ウェル当たり約２５，０００細胞が分配されるようにプレーティン
グした。培養培値： DMEM, 高濃度グルコース, w/out L-グルタミン 10% 子ウシ血清 2mM L-グルタミン 1% PenStrep 1.25μg/ml Fungizone プレーティングの３日後、培養培地を分化用培地で置換することによって、細胞
を誘導し、含脂肪細胞に分化させた。分化用培地： DMEM, 高濃度グルコース, w/out L-グルタミン 10% FBS 2mM L-グルタミン 1% Pen Strep 1.25μg/ml Fungizone 10mM Hepes 0.25μM デクサメタゾーン (1μl/ml の 0.25mM保存溶液) 0.5mM IBMX (10μl/ml の 50mM 保存溶液) 5μg/ml インシュリン (1μl/ml の 5mg/ml 保存溶液) 流量調節器を備えた house vacuum 源と結合した８チャンネルマニホルドを用い
て吸引し、細胞から培地を除去した。細胞の破壊を最小化するために最低速度に
設定した８チャンネル Matrix electronic pipettor を用いて、新たな培地をウ
ェルに分配した。

【０１５４】１日目、分化用培地１００μＬを各ウェルに加えて、3T3 細胞の含脂肪細胞へ
の分化を開始させた。分化の開始から３日後に、培地を、インシュリンを含むが
、IBMX またはデクサメタゾーンを含まない分化用培地（インシュリン培地）に変えた。６日目に、再度、培地を、インシュリン、IBMX またはデクサメタゾーンを含まない分化用培地（ＦＢＳ培地）に変えた。細胞を、分化の開始から１５
〜２１日後のグルコース輸送アッセイに備えるまで、一日おきに栄養を与えなが
ら、ＦＢＳ培地中に維持した。

【０１５５】実施例９含脂肪細胞への分化を誘導された 3T3 細胞における、ＢＬＴ存在下でのグルコース輸送アッセイ実施例８のように、マウス 3T3-L1 細胞を誘導し、含脂肪細胞へ分化させた。
グルコース輸送アッセイを行う１５〜２４時間前、細胞を以下のように処理した
：１．３７℃で、吸引しながら、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）１００ｍＬで２
回、ウェルを洗浄した。２．次いで、１００ｍＬのDMEM, 高濃度グルコース、 1% 抗性物質/抗真菌物質溶液、2mM グルタミン、(37C にまであたためた) 0.1% BSA、（固相技術によって合成された）0 〜 1000 nM マウス BLT および 0 〜 100 nM インシュリンを各ウェルに加えた。これは血清窮乏相（serum starvation phase）である。３．次いで、３７℃で一晩、細胞をインキュベートした。

【０１５６】アッセイの日、細胞を以下のように処理した：１．培地を除去し、プレートをペーパータオルにブロッティングし、細胞を、
ＫＲＢＨ緩衝液（ヘペスを含むクレブス・リンガー緩衝液、ｐＨ７．４）１００
ｍＬで２回洗浄した。２．最後の洗浄液を除去した後、細胞を、１００μＭグルコース、10μl/ml (
0.1μCi/ウェル) の放射性ラベルされた２−デオキシグルコース（Ｃ¹⁴）と一緒
に、所望のインシュリン濃度の１００μＬのＫＲＢＨ、０．１％ＢＳＡ中、３７
℃で１時間インキュベートした。３．放射性ラベルされたグルコースとインキュベートした後、10x サイトカラ
シン B (200μM) 10μl を加え、細胞のさらなるグルコース取り込みを停止させ
た。４．Microbeta plate reader でプレートを読み取り、放射性レベルされたグルコースの取り込みを測定した。

【０１５７】結果：この実験の結果を図１１にまとめる。含脂肪細胞を取り込みアッセイ前にＢＬ
Ｔで前処理した場合、含脂肪細胞への分化を誘導された 3T3 細胞へのグルコースの取り込みは約３倍〜約６倍刺激された。

【０１５８】実施例１０含脂肪細胞への分化を誘導された 3T3 細胞の、ＢＬＴ機能断片の存在下におけるグルコース輸送アッセイ実施例８のように、マウス 3T3-L1 細胞を誘導し、含脂肪細胞へ分化させる。
グルコース輸送アッセイを行う約１５〜２４時間前、細胞を以下のように処理す
る：１．３７℃で、吸引しながら、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）１００ｍＬで２
回、ウェルを洗浄する。２．次いで、１００ｍＬのDMEM, 高濃度グルコース、 1% 抗性物質/抗真菌物質溶液、2mM グルタミン、(37C にまであたためた) 0.1% BSA、（固相技術によって合成された）0 〜 1000 nM マウス BLT またはヒトＢＬＴおよび 0 〜 10
0 nM インシュリンを各ウェルに加える。これは血清窮乏相である。例えば、ある試験では、本明細書中で配列番号１０と記載されるヒトＢＬＴ断片を用い；別
の試験では、本明細書中で配列番号１２と記載されるヒトＢＬＴ断片を用いる。３．次いで、３７℃で一晩、細胞をインキュベートする。

【０１５９】アッセイの日、細胞を以下のように処理する：１．培地を除去し、プレートをペーパータオルにブロッティングし、細胞を、
ＫＲＢＨ緩衝液（ヘペスを含むクレブス・リンガー緩衝液、ｐＨ７．４）１００
ｍＬで２回洗浄する。２．最後の洗浄液を除去した後、１００μＭグルコース、10μl/ml (0.1μCi/
ウェル) の放射性ラベルされた２−デオキシグルコース（Ｃ¹⁴）と一緒に、所望
のインシュリン濃度を有する１００μＬのＫＲＢＨ、０．１％ＢＳＡ中、３７℃
で１時間、細胞をインキュベートする。３．放射性ラベルされたグルコースとインキュベートした後、10x サイトカラ
シン B (200μM) 10μl を加え、細胞のさらなるグルコース取り込みを停止させ
る。４．Microbeta plate reader でプレートを読み取り、放射性レベルされたグルコースの取り込みを測定する。

【０１６０】結果：含脂肪細胞が取り込みアッセイ前にＢＬＴの機能断片で前処理された場合、含
脂肪細胞への分化を誘導された 3T3 細胞へのグルコースの取り込みはコントロールより高くなる。

【０１６１】実施例１１ＢＬＴの機能的同族体実施例１０のように、マウス 3T3-L1 細胞を誘導し、含脂肪細胞へ分化させる
。次いで、含脂肪細胞をヒトＢＬＴの同族体、例えば配列番号２６〜配列番号３
５に暴露し、実施例８のようにグルコース輸送をモニターする。機能的同族体は
天然ＢＬＴと実質的に同じ結果を示す。

【０１６２】実施例１２雄性 A^vy/A マウスに対する１４日間のヒトＢＬＴの投与実施例７に記載の方法にしたがい、固相合成されたヒトＢＬＴを雄性 A^vy/A マウスに投与した。

【０１６３】結果：ヒトＢＬＴを投与すると、雄性 A^vy/A マウスの実質的な血清インシュリン濃度が低下した（図１２および１３を参照のこと）。

【０１６４】結果を図１２、１３にまとめる。１４日間の処置を通して、コントロール群お
よび試験群の動物はおおよそ４．５〜６グラムのえさを消費し、体重は両群で同
等に維持され、約５０グラムであった（データは示していない）。

【０１６５】血漿グルコースおよびインシュリン濃度に対する、２週間のヒトＢＬＴでの処
置の効果を扱うため、１４日間の期間後に経口グルコース許容試験を行った。コ
ントロール動物および処置された動物は、３０分の時点で、約 80 mg/dL 〜 300
mg/dL またはそれ以上の血中グルコース濃度の初期上昇を示し；その後、両群は２時間の時点で試験が終了するまで同等の割合の、値の減少を示した（図１２
）。例えば、３０分の時点で、処置された動物は平均の血中グルコース濃度約 4
00 mg/dL (s.d. 12) を示したのに対し、コントロール動物は濃度 330 mg/dL (s
.d. 19) を示した。また、６０分および１２０分の時点では、濃度の低下が観察
された。例えば１２０分では、処置された動物は平均の血中グルコース濃度 178
mg/dL (s.d. 16) を示したのに対し、コントロール動物は濃度 202 mg/dL (s.d
. 13) を示した。

【０１６６】処置された動物は実質的にコントロール動物より低い血漿インシュリン値を示
した（図１３）。例えば、３０分の時点で、コントロール動物はインシュリン濃
度 14.0 ng/ml (s.d. 1.5) を示したのに対し、処置された動物はインシュリン濃度 10.2 ng/ml (s.d. 0.4) を示した。１２０分の時点で、コントロール動物はインシュリン濃度 9.3 ng/ml (s.d. 2.3) であり、処置された動物はインシュ
リン濃度 5.4 ng/ml (s.d. 0.9) であった。

【０１６７】実施例１３雄性 Lep^ob/Lep^ob マウスに対するマウスβ−リポトロピンの投与 Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) から購入した雄性 Lep^ob/Lep^ob マウスを単独で飼育し、ad libitum の 5008 えさおよび水を与えた。初期グルコース、インシュリンおよびトリグリセリド値用に、マウスの尾から採血した。一
日２回の、コントロール、60μg または 120μg マウスβ−リポトロピン処置用
にマウスを選択した。処置されたマウスには、６０μｇまたは１２０μｇを一日
２回皮下投与し（各用量の総容量は２００μＬ）；コントロールマウスには、ビ
ヒクル（食塩水）を２００μＬ投与した。１６日間、午前７時と午後３時にマウ
スに注射し、１７日目は午前７時だけ注射した。０〜１７日目の朝、体重および
えさ消費量を測定した。７日目の朝、血中グルコース、インシュリンおよびトリ
グリセリド値用に、マウスの尾から採血した。１３日目の午後から１４日目の朝
まで一晩、この動物を絶食させた。１４日目に、経口グルコース許容試験を行っ
た。朝の注射の２時間後に時間０の血中グルコースおよびインシュリンを測定し
た。マウスに２５％デキストロース溶液 (100μl/体重10g) を経口投与し、３０
分、６０分および１２０分後に採血した。この血液サンプルを用いてグルコース
およびインシュリンを測定した。経口グルコース許容試験の後、マウスを ad li
bitum で飼育した。１６日目に、尾の血液サンプルを採り、血中グルコース、イ
ンシュリン、トリグリセリドおよびコルチコステロン値を測定した。１７日目に
マウスを犠牲にした。

【０１６８】この実験の結果を図１４に示す。１６日の処置期間を通して、処置された動物
では血漿インシュリン値が大きく低下した。例えば、処置７日目では、コントロ
ール動物はインシュリン濃度約 300 ng/ml を示したのに対し、処置された動物は約 215 ng/ml であることが測定され、少なくとも３０％減であった。さらに、処置１６日目の処置された動物では、血漿インシュリン濃度が低い維持されて
いた（図１４）。

【０１６９】実施例１４雄性 Lep^ob/Lep^ob マウスに対するヒトＢＬＴのAlzet^TM ポンプ投与 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME) から購入した、年齢１月の雄性 Lep^o ^b /Lep^ob マウスを単独で飼育し、ad libitum の 5008 えさおよび水を与え、１２時間サイクルで光を照らした（午後６時から午前６時まで消灯）。初期グルコ
ース、インシュリンおよびトリグリセリド値用にマウスの尾から採血した。処置
された動物には、皮下移植された Alzet ポンプ (Alza, Inc.) を介して、0.24m
g/日または 0.48mg/日のヒトβ−リポトロピン (ER4-VBH-43) を継続投与し、３
群すべてにわたって平均のグルコースおよびトリグリセリド値が等しくなるよう
にした。コントロール動物には食塩水を投与した。コントロール群に関しては食
塩水で、低用量群に関しては 20mg/ml ヒトβ−リポトロピンで、高用量群に関しては 40mg/ml ヒトβ−リポトロピンでこのポンプを満たした。ポンプを移植する前に、イソフルランでマウスを麻酔した。０〜７日目の朝に体重およびえさ
消費量を測定した。４日目の朝、血中グルコース、インシュリンおよびトリグリ
セリド値用に、マウスの尾から採血した。６日目の午後から７日目の朝まで一晩
、マウスを絶食させた。

【０１７０】７日目に、経口グルコース許容試験を行った。時間０でのインシュリンおよび
グルコース用に、マウスの尾から採血し、次いで２５％デキストロース溶液 (10
0μl/体重10g) を経口投与し、３０分、６０分および１２０分後に採血した。こ
の血液サンプルを用いて、グルコースおよびインシュリンを測定した。経口グル
コース許容試験の後、マウスを ad libitum で飼育した。

【０１７１】血漿インシュリン濃度に関するグルコース許容試験の結果を図１５に示す。0.
24 mg BLT/日での値は、コントロールより約２５％低下し、0.48 mg BLT/日での
値はコントロールより約４０％低下していた（図１５、曲線下面積（auc)に関す
る図を参照のこと）。

【０１７２】実施例１５ヒトＢＬＴタンパク質の同族体の固相合成および精製Ｆｍｏｃ化学を用いる１回の実行で、配列番号８中のＧｌｕがＡｌａで置換さ
れている、ヒトＢＬＴペプチドの同族体（すなわち、配列番号２６によって表さ
れる同族体）を合成した。この合成は、ペプチドのＮ末端部分にいくつかの asp
-gly ジペプチド配列が存在することによって面倒になる。asp-gly ジペプチド配列のアスパルチル側鎖は、ＦＭＯＣ合成中に、塩基によって触媒される環化お
よびその後のピペリジンの付加を受けることが観察された。合成中、それぞれの
asp-gly 配列において Fmoc-(FmocHmb)-グリシンを使用することによりこの反応を排除する。グリシルアミドをＨｍｂ基で保護することにより、アスパルチル
側鎖の環化が阻害される。開裂、脱保護および逆相ＨＰＬＣ精製した後、エレク
トロスプレー質量スペクトル分析によってこのペプチドを分析することができる
。この合成で観察される主要な種類は、予想される質量を有する完全長ペプチド
である。この方法を用いることにより、０．１mmole 規模での１回の実行から、
１００ｍｇを超える大量の精製タンパク質を製造することが可能になる。

【０１７３】材料: 前負荷された Fmoc-Glu (OtBu) Wang (ｐ−ベンゾキシベンジルアルコールで機能化された1%架橋ポリスチレン) 樹脂（約０．６mmole アミノ酸／樹脂
ｇ）。N-メチルピロリドン (NMP), ピペリジン, 2-(1H-ベンゾトリアゾール-1
-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェイト (HBTU),
2M N,N-ジイソプロピルエチルアミン (DIEA) 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
(HOBt), ジクロロメタン (DCM), ジメチルホルムアミド (DMF)。

【０１７４】Ｆｍｏｃ保護Ｃ末端アミノ酸（０．１または０．２５mmole アミノ酸）を前負
荷しておいた樹脂の重さをはかり、反応室に入れた。この樹脂をＤＣＭで洗浄し
て、あらかじめ膨潤させた。次いでこの樹脂をＮＭＰで洗浄した。この樹脂をＮ
ＭＰ中の１８〜２２％ピペリジン溶液中でインキュベートし、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基
を除去した。脱保護した後、この樹脂をＮＭＰで何回も洗浄した。

【０１７５】ペプチドに付加すべき次のＦｍｏｃ保護アミノ酸（１mmole）を、ＤＭＦ中のＮＭＰ２．１ｇ、０．４５Ｍ HBTU/HOBt 試薬２．０ｇ中に溶解した。溶解後、ＮＭＰ中の２ＭＤＩＥＡ３ｍＬを加えて、このアミノ酸の活性化を開始させた。次いで、この活性化アミノ酸を脱保護された樹脂に加え、カップリングさせた
。カップリングが完了した時点で、この樹脂をＮＭＰで何回も洗浄した。次いで
、連続するアミノ酸のそれぞれに対して脱保護およびカップリングの完全サイク
ルを繰り返した。

【０１７６】この合成の具体的なサイクル工程を以下に示す：サイクルアミノ酸工程 1 Ala Complete wash 2 Gly Single Couple 3 Lys(Boc) Single Couple 4 Lys(Boc) Single Couple 5 Tyr(tBu) Single Couple 6 Ala Single Couple 7 Asn(Trt) Single Couple 8 Lys(Boc) Single Couple 9 Ile Single Couple 10 Ile Single Couple 11 Ala Single Couple 12 Asn(Trt) Single Couple 13 Lys(Boc) Single Couple 14 Phe Single Couple 15 Leu Single Couple 16 Thr(tBu) Single Couple 17 Val Single Couple 18 Leu Single Couple 19 Pro Double couple/Ac2O cap 20 Thr(tBu) Single Couple 21 Gln(Trt) Single Couple 22 Ser(tBu) Single Couple 23 Lys(Boc) Single Couple 24 Glu(OtBu) Single Couple 25 Ser(tBu) Single Couple 26 Thr(tBu) Single Couple 27 Met Single Couple 28 Phe Single Couple 29 Gly Single Couple 30 Gly Single Couple 31 Tyr(tBu) Single Couple 32 Arg(Pmc) Single Couple 33 Lys(Boc) Single Couple 34 Asp(OtBu) Single Couple 35 Lys(Boc) Single Couple 36 Pro Double couple/Ac2O cap 37 Pro Double couple/Ac2O cap 38 Ser(tBu) Single Couple 39 Gly Single Couple 40 Trp(Boc) Single Couple 41 Arg(Pmc) Single Couple 42 Phe Single Couple 43 His(Trt) Single Couple 44 Glu(OtBu) Single Couple 45 Met Single Couple 46 Arg(Pmc) Single Couple 47 Tyr(tBu) Single Couple 48 Pro Double couple/Ac2O cap 49 Gly Single Couple 50 Glu(OtBu) Single Couple 51 Asp(OtBu) Single Couple 52 Lys(Boc) Single Couple 53 Lys(Boc) Single Couple 54 Glu(OtBu) Single Couple 55 Ala Single Couple 56 Ala Single Couple 57 Val Single Couple 58 Leu Single Couple 59 Leu Single Couple 60 Ser(tBu) Single Couple 61 His(Trt) Single Couple 62 Glu(OtBu) Single Couple 63 Leu Single Couple 64 Asp(OtBu) Single Couple 65 Ala Single Couple 66 Gln(Trt) Single Couple 67 Ala Single Couple 68 Gly Single Couple 69 Ala Single Couple 70 Gly(Fmoc-hmb) Double couple/Ac2O cap 71 Asp(OtBu) Single Couple 72 Asp(OtBu) Single Couple 73 Ala Single Couple 74 Pro Double couple/Ac2O cap 75 Gly(Fmoc-hmb) Double couple/Ac2O cap 76 Asp(OtBu) Single Couple 77 Pro Double couple/Ac2O cap 78 Gly(Fmoc-hmb) Double couple/Ac2O cap 79 Asp(OtBu) Single Couple 80 Gly Single Couple 81 Glu(OtBu) Single Couple 82 Arg(Pmc) Single Couple 83 Leu Single Couple 84 Arg(Pmc) Single Couple 85 Gln(Trt) Single Couple 86 Gly Single Couple 87 Thr(tBu) Single Couple 88 Leu Single Couple 89 Glu(OtBu) Single Couple 90 Final deprotect Complete wash（完全な洗浄） Single Couple（一重カップリング） Double couple（二重カップリング） Final deprotect（最終的な脱保護）

【０１７７】ゆっくり、非効率的に反応するアミノ酸に関して２回の別のカップリング反応
を行った。無水酢酸で処理して、残りの反応しなかったペプチドをすべて保護し
た。これらのアミノ酸の１個についての工程手順は、脱保護、カップリング反応
１、洗浄、カップリング反応２、洗浄、Ac2O cap、洗浄、脱保護であった。略語： OtBu: t-ブチルエステル, tBu: t-ブチル, Boc: t-ブトキシカルボニ
ル, Pmc: 2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマ-6-スルホニル, Hmb: 2-ヒドロキシ-4
-メトキシベンジル, Fmoc: 9-フルオレニルメトキシカルボニル。

【０１７８】実施例１６雄性 ZDF ラットに対するヒトＢＬＴの Alzet ポンプでの投与 Genetic Models Inc. (Indianapolis, IN) から購入した雄性 Zucker Diabeti
c Fatty (ZDF) ラットを単独で飼育し、ad libitum の 5008 えさおよび水を与
えた。初期経口グルコース許容試験用に、年齢５週間のラットを一晩絶食させた
。時間０の時点でのインシュリンおよびグルコース濃度を測定するため、尾から
血液を採取した後、この動物に５０％デキストロース溶液 (2.5g/体重kg) を経
口投与し、投与３０分、６０分および１２０分後に採血した。経口グルコース許
容試験の後、このラットを ad libitum で飼育した。ヒトＢＬＴの投与のため、
年齢６週間で、この動物をそれぞれ動物４匹ずつの群に分けた。試験０日目に、
グルコース、インシュリン、コルチコステロンおよびトリグリセリド値の測定用
に、再び尾の血液を採取した。コントロール、皮下移植された Alzet ポンプによる、0.5mg/日または 1.0mg/日のヒトβ−リポトロピン (ER4-VTA-2) の継続投与に関して、ラットを無作為に選択した。コントロール群に関しては食塩水で
、低用量群に関しては 20.835mg/ml ヒトβ−リポトロピンで、高用量群に関しては 41.67mg/ml ヒトβ−リポトロピンでこのポンプを満たした。このポンプを
、皮下移植する前に、食塩水中、３７℃で一晩インキュベートした。体重および
えさ消費量を０〜８日目に測定した。３日目の朝、グルコース、インシュリン、
コルチコステロンおよびトリグリセリド値用に血液サンプルを採取した。５日目
の午後から６日目の朝まで一晩、ラットを絶食させた。６日目に、経口グルコー
ス許容試験を行った。経口グルコース許容試験の後、このラットを ad libitum
で飼育した。

【０１７９】この試験で使用した Zucker 動物は、タイプ２糖尿病の良好なモデルを提供す
る。年齢６〜７週間で、血中グルコース値およびトリグリセリド濃度は上昇し、
インシュリン分泌は減少する。これらの動物は高コルチコステロン血症（hyperc
orticosteronemic）かつインシュリン耐性である。

【表３】表３ヒトＢＬＴで処置されたＺＤＦラット

【０１８０】表３および図１６に示される結果は、ヒトＢＬＴ１ｍｇ／日の用量での、ＺＤＦラットに対するヒトＢＬＴの明らかな効果を示す。ＯＧＴＴ開始後３０分の
時点で、血漿グルコース濃度は、コントロールでは平均 191 ± 16 mg/dL、ＢＬ
Ｔで処置された動物では平均 172 ± 5 mg/dL であった（図１６を参照のこと）
。開始後６０分の時点で、コントロール動物はグルコース濃度 157 ± 6 mg/dL
を示したのに対し、ＢＬＴで処置された動物は 154 ± 8 mg/dL であった。

【０１８１】表３は、特に高い用量の場合に、ＢＬＴで処置された動物では、コントロール
動物より血中グルコース値が低く維持されることを示している。ＢＬＴの投与開
始後、０、２および７日目の時点で、コントロール動物はグルコース濃度約 150
mg/dL を示した。一方、1 mg/日のヒトＢＬＴで処置された動物は、７日目の時
点で平均約 140 mg/dL であり、コントロール動物より７％ほど低かった。また、処置された動物は、コントロール動物より約１１％低い血清トリグリセリド濃
度を示し（表３）、これにより、ＢＬＴ処置のインシュリノトロピック効果（イ
ンシュリン向性効果）が証明された。

【０１８２】実施例１７ヒトＢＬＴはＺＤＦラットの骨格筋におけるグルコース輸送を刺激する骨格筋のグルコース輸送に対するβ−リポトロピンの効果を測定するため、試
験を行った。Zucker Diabetic Fatty (ZDF/Gmi^TM-fa/fa) 雄性ラットは Genetic
Models Inc. (Indianapolis, IN) から入手した。このラットをPurina Formula
b 5008 rat chow (Puina Mills, Inc., St. Louis, MO) で養い、光制御室中、明と暗の交互の１２時間サイクルで飼育した。ラットを単独で飼育し、えさおよ
び水を自由に摂取できるようにした。

【０１８３】筋肉組織内のグルコース輸送を測定するため、ペントバルビタールナトリウム
（pentabarbitol sodium）(6.5 mg/体重 100 gm) の腹膜内注射によって、実施例１６の動物を麻酔し、ひらめ筋を単離し、半分に分けた。この組織サンプルの
各半分を食塩水中で２分間、次いで 1% BSA, 8 mM グルコースおよび 32 mM マ
ンニトールを含む、ガス(95% O₂-5% CO₂)で処理されたＫＨＢ中で洗浄した。

【０１８４】グルコース輸送アッセイを以下のように行った。プレインキュベーション： 1% BSA, 8 mM グルコース 32 mM マンニトールを伴い、500 nM マウスβ−リポトロピンを含むか、あるいは含まない、ガスで処理されたＫＨＢ１．８ｍＬが
入った２０ｍＬビンに筋肉組織サンプルを入れた。途中で２回緩衝液交換を行い
ながら、室温で２０時間、サンプルを振とう水浴中に置いた。

【０１８５】プレインキュベーション後、絶えず 95% O₂-5% CO₂ ガスで処理しながら、筋肉組織サンプルを２９℃で１５分間洗浄した。40 mM マンニトールを伴い、イン
シュリン (2000 uU/ml) を伴うか、あるいはインシュリンを伴わず、β−リポト
ロピン (500 nM) を伴うか、あるいは伴わないＫＨＢ１．８ｍＬを含むビン中でこのサンプルを洗浄した。

【０１８６】次いで、絶えず 95% O₂-5% CO₂ ガスで処理しながら、筋肉サンプルを新たなビンに移した。インキュベーション培地の組成は、8 mM 3-O-メチル-グルコース
(OMG), 2 mCi/ml ³H-3-OMG, 30 mM マンニトール, 0.3 mCi/ml ¹⁴C マンニトー
ル, 2mM ピルビン酸塩, インシュリン (2000 μU/ml), およびマウスβ−リポト
ロピンであった。コントロールはインシュリンおよび／またはβ−リポトロピン
を欠いていた。２９℃で１０分後、サンプルをフリーズクランプ（freeze clamp
）し、グルコース輸送をアッセイするまで、凍結保存した。

【０１８７】グルコース輸送：筋肉を１ＭＫＯＨ０．５ｍＬ中、７０℃で３０分間消化して、約２０〜２５
ｍｇに切り揃えた。消化後、サンプルを氷上に置き、サンプル 100 μl をグリコーゲン分析用に取り出した。残りのサンプル０．４ｍＬに、1N HCl ０．４ｍＬを加え、試験管をボルテックスした。次いで、ＨＣｌで処理したサンプル３０
０ｍＬをシンチレーション液６．４ｍＬに加え、シンチレーションカウンターで
サンプル中の放射能を測定した。

【０１８８】 ¹⁴C マンニトールを細胞外マーカーとして用い、細胞内 ³H-3-OMG 蓄積に基づ
いてグルコース輸送を計算した。

【０１８９】グリコーゲン濃度：上記のサンプル 100 μl 中に、0.3 M 酢酸ナトリウム緩衝液 (Ph 4.8 + 5 mg
/ml アミログルコシダーゼ) 500 μl とともに氷酢酸 17 μl を加えた。次いで
この試験管を３７℃で一晩インキュベートした。翌日、サンプル 50 μl を９６
ウェルプレートに入れ、Trinder 試薬 (Sigma 315-100; 水で 20 μl に希釈) 2
00 μl を加えた。このプレートを３７℃で１０分間インキュベートし、波長 50
5 nm で吸光度を測定した。

【表４】表４ヒトＢＬＴで処理されたＺＤＦラット由来の筋肉組織内のグルコース輸送

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/67 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/32 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (31)優先権主張番号６０／０８６，３２１ (32)優先日平成10年５月21日(1998．5．21) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０９１，３８５ (32)優先日平成10年７月１日(1998．7．1) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０９５，４０５ (32)優先日平成10年８月５日(1998．8．5) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／１０３，９７６ (32)優先日平成10年10月13日(1998．10．13) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ジョン・ポール・バトラーアメリカ合衆国46064インディアナ州ペンドルトン、ウエスト・1000・サウス1934番 (72)発明者ジョン・エドワード・ヘイルアメリカ合衆国46038インディアナ州フィッシャーズ、フォレスト・ドライブ7644番 (72)発明者ウィリアム・フランシス・ヒース・ジュニアアメリカ合衆国46038インディアナ州フィッシャーズ、タフトン・ストリート11214 番 (72)発明者マーク・ルイス・ヘイマンアメリカ合衆国46250インディアナ州インディアナポリス、ブルックビュー・サークル7523番 (72)発明者ブリジット・エリザベス・ショーナーアメリカ合衆国46157インディアナ州モンロビア、ボックス30エフ、ルーラル・ルート２番 (72)発明者アレキサンダー・デイビッド・バーシャフスキアメリカ合衆国46033インディアナ州カーメル、レイクショアー・ウエスト・ドライブ11321番Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA02 CA05 CA07 4B064 AG01 AG16 CA10 CA19 CC24 DA03 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC20 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 BA01 BA20 CA53 CA56 DB20 ZC351 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA37 EA27 FA33 FA41 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２、配列番号５および配列番号７からなる群から選
択されるアミノ酸配列を有する実質的に純粋なタンパク質。
【請求項２】請求項１に記載のタンパク質をコードする単離された核酸化
合物。
【請求項３】請求項２に記載の単離された核酸化合物を含むベクター。
【請求項４】単離された核酸化合物がプロモーター配列に作動可能に連結
されている、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】請求項４に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項６】いずれかの適当な方法により、請求項５に記載のベクターを
宿主細胞内に導入することを含む、β−リポトロピンの発現能を有する組換え宿
主細胞の構築方法。
【請求項７】遺伝子発現に適当な条件下で組換え宿主細胞を培養すること
を含む、請求項６に記載の組換え宿主細胞におけるβ−リポトロピンの発現方法
。
【請求項８】活性成分として、β−リポトロピン、その同族体またはその
機能断片を、１つまたはそれ以上の製薬的に許容される担体、賦形剤または希釈
剤とともに含む医薬製剤。
【請求項９】 β−リポトロピンがヒトβ−リポトロピンである、請求項８
に記載の医薬製剤。
【請求項１０】糖尿病またはその合併症の処置において使用するための、
β−リポトロピン、その同族体またはその機能断片。
【請求項１１】 β−リポトロピンまたはその同族体の治療有効量を投与す
ることを含む、哺乳類における糖尿病の処置方法。
【請求項１２】治療有効量のβ−リポトロピンの機能断片を投与すること
を含む、哺乳類における糖尿病の処置方法。
【請求項１３】 β−リポトロピンが、本明細書中で配列番号８として同定
される配列を有するヒトβ−リポトロピンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】 β−リポトロピンが組換えヒトβ−リポトロピンである、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】糖尿病がタイプ１またはタイプ２糖尿病である、請求項１
１に記載の方法。
【請求項１６】該哺乳類がヒトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】 β−リポトロピン、その同族体またはその機能断片の治療
有効量を投与することを含む、糖尿病の合併症の処置を必要としている患者にお
ける糖尿病の合併症の処置方法。
【請求項１８】 β−リポトロピン、その同族体またはその機能断片の有効
量を投与することによって、哺乳類の血中グルコース濃度を低下させる方法。
【請求項１９】 β−リポトロピン、その同族体またはその機能断片の有効
量を投与することによって、高血糖症の処置を必要としている哺乳類における高
血糖症を処置する方法。
【請求項２０】 β−リポトロピン、その同族体またはその機能断片の有効
量を投与することによって、哺乳類におけるインシュリン過剰血症を処置する方
法。
【請求項２１】 β−リポトロピン、その同族体またはその機能断片の有効
量を投与することによって、哺乳類におけるインシュリン感受性を高める方法。
【請求項２２】 β−リポトロピン、その同族体またはその断片を一回の実
行で合成する、以下の工程を含む固相合成法：ａ）保護されたαアミノ基および／または側鎖官能基を有するアミノ酸を活性
化して、反応性エステルを形成させる；ｂ）活性化されたアミノ酸を不活性固形支持体に結合させる；ｃ）第二の保護アミノ酸をエステルに活性化し、第一のアミノ酸のα−アミノ
基を脱保護して、反応性アミンを形成させ、第二の活性化アミノ酸を第一のアミ
ノ酸と反応させて、固形支持体上でジペプチドを形成させる；ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返す；ｅ）固形支持体からペプチドを解離させ、側鎖官能基を脱保護する；ｆ）ペプチドを固形支持体から分離する；およびｇ）いずれかの適当な方法によってペプチドを精製する［ここに、ｈ）ＢＬＴ配列が ser-pro-pro トリペプチドセグメントを含む場合、pro 残基の多重カップリングを行い；ｉ）カップリングが完了した後、すべての未反応の脱保護ペプチドを保護して
、欠失ペプチドの鎖延長を防止し；ならびにｊ）ＢＬＴ配列が asp-gly ジペプチド配列を含む場合、asp 残基の前にある各グリシン残基にＮ−α保護基を用いる］。
【請求項２３】以下の手段を含む、請求項１に記載のβ−リポトロピンの
製造方法：ａ．β−リポトロピンをコードする発現ベクターで適当な宿主を形質転換する
；ｂ．形質転換された細胞を、β−リポトロピンを発現可能な条件下で培養する
；ｃ．いずれかの適当な方法によってβ−リポトロピンを精製する。
【請求項２４】以下の工程を含む、β−リポトロピン活性に関するアッセ
イ：ａ）インシュリン非感受性および高い血中グルコース濃度を示す哺乳類に試験
タンパク質を投与する；およびｂ）工程（ａ）の後、いずれかの適当な方法によって、血中グルコースおよび
インシュリン濃度に関して試験する。
【請求項２５】 β−リポトロピンが、配列番号２、配列番号５、配列番号
７および配列番号８からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２
および配列番号１３からなる群から選択される、インシュリノトロピック活性を
有するペプチド。
【請求項２７】配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１
７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２
、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５からなる群から選択される、
インシュリノトロピック活性を有するペプチド。
【請求項２８】配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２
、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、
配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配
列番号２３、配列番号２４および配列番号２５からなる群から選択される、イン
シュリノトロピック活性を有するペプチド。
【請求項２９】配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２
、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、
配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配
列番号２３、配列番号２４および配列番号２５からなる群から選択される少なく
とも１個のペプチドの治療有効量を投与することを含む、糖尿病の処置方法。
【請求項３０】配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２
および配列番号１３からなる群から選択される少なくとも１個のペプチドの治療
有効量を投与することを含む、糖尿病の処置方法。
【請求項３１】活性成分として、配列番号９、配列番号１０、配列番号１
１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６
、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、
配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５からなる群から
選択されるインシュリノトロピック活性を有するペプチドを含む医薬製剤。
【請求項３２】 β−リポトロピンの機能的同族体。
【請求項３３】インビトロまたはインビボでインシュリノトロピック活性
を有するβ−リポトロピンの断片。
【請求項３４】配列番号８と約９０％〜９５％同一なβ−リポトロピンの
機能的同族体であって、アミノ酸置換が以下のものからなる群から選択される同
族体：第１位の残基は Glu, Ala, Asp または Gln のいずれか；第２位の残基は Leu, Ile, Val, または Met のいずれか；第３位の残基は Thr, Ala, Glu, Ser, Pro, または Gly のいずれか；第４位の残基は Gly, Arg, Ala, Leu, Pro, または Ser のいずれか；第５位の残基は Glu, Gln, Asp, Asn, または Ala のいずれか；第６位の残基は Arg, Glu, Leu, Lys, Gln, または Ala のいずれか；第７位の残基は Leu, Pro, Asp, Val, Ile, または Met のいずれか；第８位の残基は Arg, Glu, Ala, Tyr, Leu, Lys, Pro, Gln または Trp のいずれか；第９位の残基は Glu, Ala, Pro, Asp, Asn, または Gln のいずれか；第１０位の残基は Gly, Ala, Ser, または Asp のいずれか；第１１位の残基は Asp, Arg, Pro, Asn, Gln, Ala, または Glu のいずれか；第１２位の残基は Gly, Ala, Ser, または Met のいずれか；第１３位の残基は Pro, Glu, Gly, または Val のいずれか；第１４位の残基は Asp, Glu, Asn, Gln, または Gly のいずれか；第１５位の残基は Gly, Ala, Ser, または Glu のいずれか；第１６位の残基は Pro, Gln, Leu, Gly, または Glu のいずれか；第１７位の残基は Ala, Asp, Ser, または Gly のいずれか；第１８位の残基は Asp, Glu, Gln, または Asn のいずれか；第１９位の残基は Asp, Glu, Asn, または Gln のいずれか；第２０位の残基は Gly, Ser, または Ala のいずれか；第２１位の残基は Ala, Gly, Ser, または Phe のいずれか；第２２位の残基は Gly, Ala, Ser, または Lys のいずれか；第２３位の残基は Ala, Phe, Thr, Gly, Ser, または Leu のいずれか；第２４位の残基は Gln, Arg, Asp, Asn, Leu, または Val のいずれか；第２５位の残基は Ala, Leu, Asp, Ile, Gly, Ser, または Thr のいずれか；第２６位の残基は Asp, Glu, Gly, Asn, Gln, または Lys のいずれか；第２７位の残基は Leu, Ala, Ile, Met, または Val のいずれか；第２８位の残基は Glu, Gln, Asn, または Asp のいずれか；第２９位の残基は His, Asn, Tyr, Ala, Gln または Glu のいずれか；第３０位の残基は Ser, Gly, Glu, Ala, Leu, または Asp のいずれか；第３１位の残基は Leu, Ala, Val, Met, または Ile のいずれか；第３２位の残基は Leu, Ala, Val, Ile, Met, または Pro のいずれか；第３３位の残基は Val, Ala, Glu, Leu, Ile, Met, または Arg のいずれか；第３４位の残基は Ala, Ser, Pro, Glu, または Gly のいずれか；第３５位の残基は Ala, Asp, Gly, Ser, または Leu のいずれか；第３６位の残基は Glu, Ala, Thr, Leu, Asp, Asn, または Gln のいずれか；第３７位の残基は Lys, Glu, Thr, Arg, Gln, または Asp のいずれか；第３８位の残基は Lys, Arg, Gln, または Glu のいずれか；第３９位の残基は Asp, Ala, Asn, Glu, Gln, または Lys のいずれか；第４０位の残基は Glu, Ser, Asp, Asn, Gln, または Gly のいずれか；第４１位の残基は Gly, Ala, または Ser のいずれか；第４２位の残基は Pro, Gly, Ser, または Asn のいずれか；第４３位の残基は Tyr, Phe, または Trp のいずれか；第４４位の残基は Arg, Lys, Gln, または Glu のいずれか；第４５位の残基は Met, Ile, Ser, または Val のいずれか；第４６位の残基は Glu, Gln, Asp, Asn, His, Arg または Gly のいずれか；第４８位の残基は Tyr または Trp のいずれか；第４９位の残基は Arg または Lys のいずれか；第５０位の残基は Trp, Tyr, または Phe のいずれか；第５１位の残基は Gly, Ala, Ser, または gln のいずれか；第５２位の残基は Ser, Thr, Asn, または Ala のいずれか；第５３位の残基は Pro または Gly のいずれか；第５４位の残基は Pro, Ala, Gly, Arg, Leu, または Thr のいずれか；第５５位の残基は Lys, Arg, Gln, または Ala のいずれか；第５６位の残基は Asp, Asn, Glu, Gln, Ala, Gly, または Ile のいずれか；第５７位の残基は Lys, Gln, または Arg のいずれか；第５８位の残基は Arg, Gln, または Lys のいずれか；第５９位の残基は Tyr, Phe または Trp のいずれか；第６０位の残基は Gly, Ala, または Ser のいずれか；第６１位の残基は Gly, Ala, または Ser のいずれか；第６２位の残基は Phe, Tyr, または Trp のいずれか；第６３位の残基は Met, Leu, Ile, または Val のいずれか；第６４位の残基は Thr, Ala, Ser, または Lys のいずれか；第６５位の残基は Ser, Ala, Thr, または Pro のいずれか；第６６位の残基は Glu, Asp, Asn, Lys, または Gln のいずれか；第６７位の残基は Lys, Arg, または Gln のいずれか；第６８位の残基は Ser, Ala, Thr, または Gly のいずれか；第６９位の残基は Gln, Glu, Asp, Asn, Arg, または His のいずれか；第７０位の残基は Thr, Ser, Ala, または Lys のいずれか；第７１位の残基は Pro または Gly のいずれか；第７２位の残基は Leu, Ile, Met, または Val のいずれか；第７３位の残基は Val, Leu, Ile, または Met のいずれか；第７４位の残基は Thr, Ala, または Ser のいずれか；第７５位の残基は Leu, Ile, Met, または Val のいずれか；第７６位の残基は Phe, Tyr, Trp, または Leu のいずれか；第７７位の残基は Lys, Gln, または Arg のいずれか；第７８位の残基は Asn, Asp, Glu, Gln, または His のいずれか；第７９位の残基は Ala, Gly, Ser, Ile または Val のいずれか；第８０位の残基は Ile, Leu, Met, Val, または Thr のいずれか；第８１位の残基は Ile, Met, Val, Thr, または Leu のいずれか；第８２位の残基は Lys, Gln, または Arg のいずれか；第８３位の残基は Asn, Asp, Glu, Gln, または Ser のいずれか；第８４位の残基は Ala, Val, Ser, Gly, または Glu のいずれか；第８５位の残基は Tyr, Phe, Trp, または His のいずれか；第８６位の残基は Lys, Gln, または Arg のいずれか；第８７位の残基は Lys, Gln, または Arg のいずれか；第８８位の残基は Gly, Ala, または Ser のいずれか；第８９位の残基は Glu, Gln, Asp, Asn, または His のいずれか。
【請求項３５】配列番号８と約９５％〜９９％の範囲の同一性を有する、
請求項３４に記載のβ−リポトロピンの機能的同族体。
【請求項３６】配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１
７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２
からなる群から選択される、インシュリノトロピック活性を有するペプチド。
【請求項３７】前記工程において、ｈ）ＢＬＴ配列が ser-pro-pro トリペプチドセグメントを有する場合、pro および ser 残基の二重カップリングを行い；ｉ）カップリング工程完了後、すべての未反応の脱保護ペプチドを無水物で保
護し、欠失ペプチドの鎖延長を防止する、請求項２２に記載の方法。
【請求項３８】前記工程において、Ｊ）該Ｎ−α保護は、Ｎ−α−Ｈｍｂまたは安息香酸メチルから構成される、
請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】配列番号８と少なくとも９０％同一である、β−リポトロ
ピンの機能的同族体。