CN1284882A - β－促脂解素及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了与β－促脂解素相关的分离的核酸、载体、转化的宿主细胞、类似物、功能性片段和融合蛋白。还提供了含有β－促脂解素或其片段和/或类似物的药用组合物,以及用于通过服用有效量的β－促脂解素治疗糖尿病和与其相关的并发症的方法。

Description

β-促脂解素及其用途

                    交叉引用

本申请要求下列专利的优先权：美国临时专利申请号60/068659，申请日为1997年12月23日；60/079857，申请日为1998年3月30日；60/086321，申请日为1998年5月21日；60/091385，申请日为1998年7月1日；60/095405，申请日为1998年8月5日；60/103976，申请日为1998年10月13日。

                       本发明背景

本发明涉及药理学和医学领域。具体地讲，本发明涉及β-促脂解素，其片段和类似物，药用制剂，以及用上述制剂治疗哺乳动物糖尿病和其他相关的症状的方法。

阿黑皮素原(POMC)是被转运到神经内分泌细胞中的分泌途径的神经肽前体分子。POMC在特殊内肽酶的作用下被裂解成诸如促肾上腺皮质素(ACTH)、β-促脂解素(BLT)、β-内啡肽、和促黑素(MSH)的肽。将POMC加工成一种或几种特殊肽的过程是以组织和细胞特异性方式进行的(一般参见M.Castro和E.Morrison，神经生物学临床综述，11，35-57，1997，Roberts,J.L.和Herbert,E.Proc.Nat.Acad.Sci,74，4826(1997)；Roberts,J.L.和Herbert,E.Proc.Nat.Acad.Sci,74，5300(1997)；Mains等,Proc.Nat.Acad.Sci,74，3014(1997))。POMC主要是在脑垂体和下丘脑中产生的。POMC在垂体前叶中的翻译后加工产生ACTH和BLT。另一方面，垂体中叶的主要产物是α-MSH、CLIP、γ-促脂解素、β-内啡肽、和β-MSH，而在下丘脑中POMC主要被加工成γ-MSH和β-内啡肽。

由POMC衍生的肽在代谢和生理学调节中起着多种重要作用。例如，ACTH是一种有39个氨基酸的肽，能刺激肾上腺皮质分泌糖皮质素。另一方面，MSH’s能通过表皮中的黑素细胞促进黑素合成，并且还表现出与脂肪代谢相关。β-内啡肽源于BLT的羧基末端(即人类序列的59-89号残基)，并具有止痛活性，该活性受纳络酮的拮抗，纳络酮是一种已知的吗啡的拮抗剂。因此，由POMC产生的肽激素在生理学和代谢调节中具有多种作用。

适当的葡萄糖和燃料代谢取决于非POMC相关的肽---胰岛素。具体地讲，胰岛素能促进糖原、脂肪酸、和蛋白合成，并且还能促进糖酵解。胰岛素在促进葡萄糖进入肌肉和脂肪细胞方面是很关键的。

有缺陷的胰岛素代谢会导致糖尿病。1型糖尿病需要服用外源胰岛素以便适当控制燃料和葡萄糖代谢。另一方面，2型糖尿病通常不需要外源胰岛素，直到这种病的晚期。适当控制葡萄糖和燃料代谢对于糖尿病的有效控制来说是必要的。否则的话有可能产生严重的、甚至是致命的后果，包括酮酸病、昏迷、视网膜病、糖尿病性微血管病、动脉粥样硬化、心肌梗塞形成、中风、坏疽、血甘油三酯过多、血胆甾醇过多、心肌病、皮肤病、糖尿病性脚综合症、肾病、尿路感染、乳头状坏死、白内障、糖尿病性胃肠病、便秘、外周血管病，甚至死亡。在很多场合下，必须在服用太多胰岛素和太少胰岛素之间的寻求微妙的平衡。因此，对糖尿病的理想的疗法应当是能够通过改善对胰岛素的敏感性控制血液葡萄糖含量的疗法。

本文介绍了用于治疗或预防1型和2型糖尿病及相关并发症的方法和有效的药用组合物，包括服用药理学上有效量的β-促脂解素和/或其片段和/或类似物。

发明概述

本发明提供了含有β-促脂解素(BLT)的分离的蛋白，其类似物、其片段、编码这种蛋白的核酸，以及生产BLT并使用BLT治疗糖尿病以及与其相关的并发症的方法。

本文披露了通过服用药理学上有效量的BLT、其类似物、或其功能性片段用于治疗包括人在内的哺乳动物的糖尿病及其并发症的方法。本发明还涉及治疗1型和2型糖尿病、视网膜病、糖尿病性微血管病、动脉粥样硬化、心肌梗塞形成、中风、坏疽、血甘油三酯过多、血胆甾醇过多、心肌病、皮肤病、糖尿病性脚综合症、肾病、尿路感染、乳头状坏死、白内障、糖尿病性胃肠病、便秘、和外周血管病的方法。

本文披露了在大肠杆菌和酵母中生产BLT的方法。在大肠杆菌中，BLT是以融合蛋白形式产生的，可以在存在高盐的条件下通过常规纯化方法从细胞裂解物中回收。BLT融合蛋白含有用于将融合配偶体从BLT上分离的特定蛋白酶的识别位点。在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中，当所述融合蛋白从细胞中分离时被裂解，因此，可以从培养基中回收完整的天然BLT。

本发明的一种实施方案涉及一种具有序列2、序列5、或序列7的氨基酸序列的大体上纯的蛋白。

本发明的另一种实施方案涉及一种编码含有β-促脂解素的融合蛋白或重组蛋白或肽的分离的核酸化合物。

本发明的另一种实施方案涉及编码本发明的蛋白或肽的至少一种分离的核酸化合物。

本发明的又一种实施方案涉及包括本发明的分离的核酸化合物的载体。

本发明的又一种实施方案涉及包括本发明的分离的核酸的载体，其中，所述分离的核酸化合物可操作地连接于一种启动子序列上。

本发明的另一种实施方案涉及含有本发明载体的宿主细胞。

本发明的另一种实施方案涉及构建具有表达β-促脂解素的潜力重组宿主细胞的方法，该方法包括通过合适的方法将本发明的载体导入所述宿主细胞中。

本发明的另一种实施方案涉及在重组宿主细胞中表达β-促脂解素的方法，所述方法包括在适于基因表达的条件下培养所述宿主细胞。

本发明的另一种实施方案涉及一种药用制剂，它含有β-促脂解素、其类似物或功能性片段作为活性成分，以及相关的一种或几种药理学上可接受的载体、赋形剂、或稀释剂。

本发明的另一种实施方案涉及药用制剂，其中，所述β-促脂解素、其类似物或功能性片段是人类β-促脂解素。

本发明的另一种实施方案涉及用于治疗糖尿病或其并发症的β-促脂解素、其类似物或功能性片段。

本发明的另一种实施方案涉及具有促胰岛素活性的BLT片段。

本发明的另一种实施方案涉及具有促胰岛素活性的选自序列9-序列13的肽。

本发明的另一种实施方案涉及具有促胰岛素活性的选自序列14-序列25的肽。

本发明的另一种实施方案涉及本文所披露的β-促脂解素肽的功能性类似物。

本发明的另一种实施方案涉及治疗糖尿病的方法，包括服用治疗上有效量的选自序列9-25的至少一种肽。

本发明的另一种实施方案涉及治疗糖尿病的方法，包括服用治疗上有效量的选自序列9-序列13的肽。

本发明的另一种实施方案涉及一种药用制剂，它含有至少一种具有促胰岛素活性的选自序列9-25的肽作为活性成分。

本发明的另一种实施方案涉及治疗包括人类在内的哺乳动物糖尿病的方法，包括服用治疗有效量的β-促脂解素、其类似物或功能性片段。

本发明的另一种实施方案涉及通过服用有效量的β-促脂解素、其类似物或功能性片段降低哺乳动物血液葡萄糖含量的方法。

本发明的另一种实施方案涉及通过服用有效量的β-促脂解素、其类似物或功能性片段治疗需要治疗的哺乳动物的高血糖的方法。

本发明的另一种实施方案涉及通过服用有效量的β-促脂解素、其类似物或功能性片段治疗哺乳动物胰岛素过多的方法。

本发明的另一种实施方案涉及通过服用有效量的β-促脂解素、其类似物或功能性片段增强哺乳动物对胰岛素的敏感性的方法。

本发明的另一种实施方案涉及合成β-促脂解素、其类似物或功能性片段的固相合成方法。

本发明的另一种实施方案涉及制备β-促脂解素的方法，包括：

a．用一种表达载体转化合适的宿主，其中，所述载体编码β-促脂解素、其类似物或功能性片段；

b．在所述β-促脂解素能够表达的条件下培养所述转化宿主；

c．通过任何合适方法纯化所述β-促脂解素。

本发明的另一种实施方案涉及对β-促脂解素活性的测定，包括下面步骤：

a)给表现出胰岛素不敏感性和较高血液葡萄糖水平的哺乳动物服用一种试验蛋白；和

b)在步骤a)之后检测血液葡萄糖和胰岛素含量。

本发明还涉及通过服用药理上有效量的β-促脂解素、其类似物或功能性片段治疗哺乳动物1型或2型糖尿病及其相关的并发症的方法。

发明详述

定义

术语“类似物”或“功能性类似物”是指BLT的修饰形式，其中，至少进行了一个氨基酸的取代，使得所述类似物在体内和/或体外保持与未修饰的BLT大体上相同的生物学活性。

术语“bid”或“b.i.d.”是指每天2次服用的BLT或其他化合物的剂量。

“BLT”是指β-促脂解素。人类BLT包括89个氨基酸残基(序列8)。业已在多种生物中鉴定了BLT蛋白，并且在多种生物中测定了其氨基酸序列，包括人类、小鼠、绵羊、和猪(Li&Chung，自然，260，622-24(1976)、和大象(Li等Int.J.Pept.Prop.Res.32，573-78(1978)以及其他哺乳动物，以上所有文献被收作本文参考文献。

术语“β-促脂解素融合蛋白”或“BLT融合蛋白”是指包括BLT的一类杂合重组蛋白分子，这种蛋白分子是在大肠杆菌或其他类型细胞中产生的，通过特殊的蛋白酶解或化学裂解可以用这种分子制备BLT或BLT片段。典型的BLT融合蛋白包括如序列2、序列5和序列7所示的蛋白。

本文所说的术语“互补”或“互补性”是指嘌呤和嘧啶核苷酸通过氢键结合形成双链核酸分子的能力。下面的碱基对与互补性相关：鸟嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；腺嘌呤和尿嘧啶。在本文中，“互补”是指应用在包括两个单链核酸分子的整个长度上的大体上所有碱基对的上述关系。“部分互补”是指在这样一种分子上的上述关系，其中，两个单链核酸分子中的一个的长度比另一个的长度短，因此，所述分子之一的一部分保持为单链。

本文所说的“并发症”或“其并发症”是指症状、综合症、附属性疾病、疾病、或与一种或几种疾病或综合症相关的症状，或与有缺陷的胰岛素代谢相关的症状、或有缺陷的糖代谢、例如有缺陷的葡萄糖代谢，包括，但不限于1型和2型糖尿病。并发症的例子包括酮酸病、昏迷、视网膜病、糖尿病性微血管病、动脉粥样硬化、心肌梗塞形成、中风、坏疽、血甘油三酯过多、血胆甾醇过多、心肌病、皮肤病、糖尿病性脚综合症、肾病、尿路感染、乳头状坏死、白内障、糖尿病性胃肠病、便秘、和外周血管病。

“保守性取代”或“保守性氨基酸取代”是指如表1所示的蛋白或肽上的一个或多个氨基酸残基的取代。

“其片段”是指一种肽、或核酸的片段、碎片、或小的部分，因此所述片段包括2个或更多个连续的氨基酸，或者包括大约5-14个氨基酸或更多，或10个或更多个在亲代肽或核苷酸分子上连续的核苷酸。其片段可以保留或者不保留生物学活性。例如，本文所披露的一种肽的片段可以被用作抗原产生抗该片段的亲代肽的特异性抗体。在表示核酸分子时，“其片段”是指10或更多个源于其亲代核酸的连续的核苷酸，而且由于其遗传密码，是指其互补序列。例如，如果所述片段的序列为5’-AGCTAG-3’，则“其片段”还包括互补序列3’-TCGATC-5’。

术语“融合蛋白”表示自然界不存在的杂合蛋白分子，包括翻译融合或酶促融合，其中，两种或两种以上不同蛋白或其片段共价连接在一个多肽链上。

“融合配偶体”是指BLT融合蛋白上的一种氨基酸序列，所述序列不是由BLT产生，例如，在本文中被确定为序列6的序列。

本文所说的“功能性片段”或“功能上等同的片段”是指完整长度BLT的保留了生物学活性的一个部分或片段，即具有在体内和/或体外增强胰岛素作用的能力；和/或在体内促进降低血液葡萄糖的能力，或在体外增强葡萄糖被摄入细胞或组织的能力。功能性片段还可以在体内和/或体外产生完整长度LBT所具有的生物学活性，即促进葡萄糖摄取和/或增强胰岛素作用和/或增强胰岛素敏感性的能力。功能性片段可以通过克隆技术或通过化学合成方法或通过化学或酶促裂解产生。

“宿主细胞”是指适于繁殖和/或表达包含在一种载体上的克隆基因的任何真核或原核细胞，所述载体通过诸如转化或转染之类的方法导入所述宿主细胞。

术语“同系物”或“同源的”表示不同核酸分子或氨基酸序列之间的关系，其中，所述序列或分子通过在所述分子的一个或几个片段或部分上的相同性或部分相同性和/或相似性联系在一起。

本文所使用的术语“杂交”是指单链核酸分子通过核苷酸碱基配对与互补链结合的过程。“选择性杂交”是指在高严格条件下的杂交。杂交程度取决于诸如同源性程度、杂交的严格性、和杂交链的长度等。

术语“促胰岛素”是指胰岛素增强活性，例如，通过逆转或减轻胰岛素不敏感性的作用。

“分离的核酸化合物”是指任何RNA或DNA序列，不管它是构建的还是合成的，它在位置上离开其天然位置例如细胞中。

本文所说的“核酸探针”或“探针”是一种能与另一种核酸化合物杂交的标记过的核酸化合物。“核酸探针”是指单链核酸序列，它能与互补的或部分互补的单链靶核酸序列结合，形成双链分子。核酸探针可以是寡核苷酸或核苷酸聚合物。探针通常含有一个可检测的部分，该部分可以连接在探针的末端或在探针序列内部。

术语“质粒”是指染色体外遗传因子。本文所披露的质粒是通过商业渠道获得的，可以不受限制的公开获得，或者用容易得到的质粒按照公开的方法构建。

“引物”是一种核酸片段，它被作为酶促或合成延伸例如核酸分子的起始物质。

术语“启动子”是指指导转录的核酸序列，例如指导DNA向RNA的转录。诱导型启动子是能通过诸如碳源、热、或金属离子的环境信号调节的启动子。组成型启动子通常以稳定的水平起作用，并且是不可调节的。

术语“蛋白”和“肽”在本文中可以交换使用，它们是指通过肽键共价连接的两个或两个以上氨基酸残基。在某些场合下，这些术语描述了包括通过肽键连接的大于10和高达大约500个氨基酸残基的氨基酸生物聚合物。

本文所说的“重组DNA克隆载体”是指任何自主性复制剂，包括，但不限于质粒和噬菌体，它含有业已整合了一个或几个额外DNA片段的DNA分子。

本文所使用的术语“重组DNA表达载体”或“表达载体”是指任何重组DNA克隆载体，例如质粒或噬菌体，其中，存在启动子和其他调控因子，因此，使得可能编码一种蛋白的插入DNA能够转录。

术语“严格性”是指杂交条件。高严格条件不利于非同源碱基配对。低严格条件具有相反的作用。严格性可以改变，例如通过温度和盐的浓度加以改变。

“低严格性”条件包括诸如大约37℃或更低的温度，低于大约50％的甲酰胺浓度，和中等至低盐(SSC)浓度；或大约50℃或更低的温度，和中等至高盐(SSPE)浓度，例如1M氯化钠。

“高严格性”条件包括诸如大约42℃或更低的温度，低于大约20％的甲酰胺浓度，和低盐(SSC)浓度；或大约65℃或更低的温度，和低盐(SSPE)浓度。例如高严格性条件包括在0.5M磷酸氢钠、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中，在65℃下杂交，Ausubel,F.M.等，现代分子生物学方法，Ⅰ卷，1989；Green公司，纽约，2.10.3)。

“SSC”包括杂交和洗涤溶液。20×SSC溶液的母液含有3M氯化钠、0.3M柠檬酸钠、pH7.0。

“SSPE”包括杂交和洗涤溶液。1×SSPE溶液含有180mM氯化钠、9mM磷酸氢二钠、0.9mM磷酸二氢钠和1mM EDTA、pH7.4。

“大体上纯的”在指一种蛋白时，表示所述蛋白是与包括其他蛋白分子在内的其他细胞和非细胞成分分离的。大体上的纯的制剂至少为85％的纯度；优选至少大约95％的纯度。“大体上纯的”的蛋白可以通过多种合适方法中的任一种制备，例如，所述方法包括IMAC蛋白纯化方法(美国专利No4569794)，收作本文参考文献。

本文所说的“治疗”表示为了消除疾病、症状或失调而对患者进行的控制和护理，包括服用本发明的蛋白以便预防症状或并发症的发作，减轻症状或并发症，或消除疾病、症状或失调。

在本说明书中所引用的所有文献均被收作本文参考文献。

β-促脂解素是于1964年从绵羊脑垂体中分离的，其一级结构于次年报导(Li等，自然，208，1093，1960)。从那时起，业已报导了绵羊(sheep)、牛、绵羊(ovine)、小鼠、猪、豚鼠、大鼠、大象、和人BLTs的一级序列。(例如，参见Lohmar和Li，生物化学生物物理学公报，147，381，1967；Li和Chung，自然，260，622，1976；Drouin和Gooman，自然，288，419，1980；Li等，Int,J.Pept.Prot.Res.32，573-78，1988；Blake和Li,Proc.Natl.Acad.Sci,80，1556-1559，1983；Takahashi等，Febs通讯135，97-102，1981；以上所有文献被收作本文参考文献)。其序列资料表明，BLT的羧基末端在不同物种之间是高度保守的。另一方面，在不同物种的BLT分子的氨基酸末端之间存在相当大的序列差别。

本发明还涉及BLT融合蛋白，包括人BLT(序列8)，或源于其他物种的BLT，或其功能性片段。本文所披露的典型的BLT融合蛋白为序列2、序列5、和序列7。

BLT的功能性片段可以以具有生物学活性的BLT的片段形式方便地鉴定，例如，在给需要治疗的哺乳动物服用时具有减轻糖尿病症状的能力，或降低血清胰岛素含量和/或增强胰岛素敏感性和/或降低血液葡萄糖含量和/或促进脂肪或肌肉组织对葡萄糖的摄取，在体内或体外起作用，或在体外对脂肪细胞起作用。BLT的功能性片段包括保留了生物学活性并且包括在某些场合下在BLT蛋白中是连续的至少2个或更多个氨基酸残基的任何片段。优选的片段包括BLT的部分或完全位于人BLT(序列8)的残基59-89部分以外的连续片段，或非人BLT的等同片段(即编码β-内啡肽的片段)。

本文所披露的人BLT的代表性功能性片段为序列9-序列25。优选片段在本文中被指定为序列9-序列13，最优选的片段在本文中被指定为序列10、序列12、和序列13。在某些情况下，功能性片段可以包括亲代BLT的一个内部缺失，例如，在序列13中缺少了人BLT的氨基酸残基7-23。功能性片段可以通过本领域技术人员熟知的固相化学合成和/或通过重组DNA技术生产。例如，参见K.Struhl，反向生物化学；“体外合成酵母蛋白的方法和应用”，酶学方法194，520-535。例如，在一种方法中，将一组缺失突变导入编码BLT的核酸，以便缺失不同数量的肽编码区，或者从该分子的氨基末端缺失；或者从该分子的羧基末端缺失。该方法还可用于制备完整蛋白的内部片段，其中，去掉了羧基末端和氨基末端。用于产生所述缺失的合适的核酸酶包括诸如Bal31，或在单链核酸分子的情况下为绿豆核酸酶。为简便起见，优选将BLT编码核酸克隆到诸如噬菌体M13或等同物的单链克隆载体上。如果需要，可将所述得到的缺失片段亚克隆到任何合适的载体上，以便在任何合适的宿主细胞中繁殖和表达。

BLT的功能性片段可以用任何合适的方法鉴定并测定其生物学活性，例如，一种肽片段在体内或体外促进或增强胰岛素敏感性和/或细胞摄取葡萄糖的能力。

BLT的功能性类似物可以通过在所述BLT或本文所披露的任一种肽上一个或几个氨基酸残基的缺失、插入、倒位、和/或取代而制备。所述取代类似物通常可以通过固相或重组技术制备，其中，可以诸如按照表1所示产生单一或多个保守性氨基酸取代。一般，对于多重取代来说，优选在任何特定分子中改变10个以下的残基，最优选在任何特定分子中改变1-5个残基，以便有大约90-99％的残基与序列8的序列相同；或者使得大约95-99％的残基与序列8或源于其他物种的其他合适的BLT相同。

例如，人BLT(序列8)的类似物包括在1-89号氨基酸残基之间的片段上的单个或多个氨基酸取代，包括下列取代，其中：

1号位置上的残基可以是Glu、Ala、Asp或Gln；

2号位置上的残基可以是Leu、Ile、Val或Met；

3号位置上的残基可以是Thr、Ala、Glu、Ser、Pro或Gly；

4号位置上的残基可以是Gly、Arg、Ala、Leu、Pro或Ser；

5号位置上的残基可以是Glu、Gln、Asp、Asn或Ala；

6号位置上的残基可以是Arg、Glu、Leu、Lys、Gln或Ala；

7号位置上的残基可以是Leu、Pro、Asp、Val、Ile或Met；

8号位置上的残基可以是Arg、Glu、Ala、Tyr、Leu、Lys、Pro、Gln或Trp；

9号位置上的残基可以是Glu、Ala、Pro、Asp、Asn或Gln；

10号位置上的残基可以是Gly、Ala、Ser或Asp；

11号位置上的残基可以是Asp、Arg、Pro、Asn、Gln、Ala或Glu；

12号位置上的残基可以是Gly、Ala、Ser、或Met；

13号位置上的残基可以是Pro、Glu、Gly或Val；

14号位置上的残基可以是Asp、Glu、Asn、Gln或Gly；

15号位置上的残基可以是Gly、Ala、Ser或Glu；

16号位置上的残基可以是Pro、Gln、Leu、Gly或Glu；

17号位置上的残基可以是Ala、Asp、Ser或Gly；

18号位置上的残基可以是Asp、Glu、Gln或Asn；

19号位置上的残基可以是Asp、Glu、Asn、或Gln；

20号位置上的残基可以是Gly、Ser、或Ala；

21号位置上的残基可以是Ala、Gly、Ser、或Phe；

22号位置上的残基可以是Gly、Ala、Ser、或Lys；

23号位置上的残基可以是Ala、Phe、Thr、Gly、Ser、或Leu；

24号位置上的残基可以是Gln、Arg、Asp、Asn、Leu、或Val；

25号位置上的残基可以是Ala、Leu、Asp、Ile、Gly、Ser、或Thr；

26号位置上的残基可以是Asp、Glu、Gly、Asn、Gln、或Lys；

27号位置上的残基可以是Leu、Ala、Ile、Met、或Val；

28号位置上的残基可以是Glu、Gln、Asn、或Asp；

29号位置上的残基可以是His、Asn、Tyr、Ala、Gln、或Glu；

30号位置上的残基可以是Ser、Gly、Glu、Ala、Leu、或Asp；

31号位置上的残基可以是Leu、Ala、Val、Met、或Ile；

32号位置上的残基可以是Leu、Ala、Val、Ile、Met或Pro；

33号位置上的残基可以是Val、Ala、Glu、Leu、Ile、Met、或Arg；

34号位置上的残基可以是Ala、Ser、Pro、Glu、或Gly；

35号位置上的残基可以是Ala、Asp、Gly、Ser、或Leu；

36号位置上的残基可以是Glu、Ala、Thr、Leu、Asp、Asn、或Gln；

37号位置上的残基可以是Lys、Glu、Thr、Arg、Gln、或Asp；

38号位置上的残基可以是Lys、Arg、Gln、或Glu；

39号位置上的残基可以是Asp、Ala、Asn、Glu、Gln、或Lys；

40号位置上的残基可以是Glu、Ser、Asp、Asn、Gln、或Gly；

41号位置上的残基可以是Gly、Ala、或Ser；

42号位置上的残基可以是Pro、Gly、Ser、或Asn；

43号位置上的残基可以是Tyr、Phe、或Trp；

44号位置上的残基可以是Arg、Lys、Gln、或Glu；

45号位置上的残基可以是Met、Ile、Ser、或Val；

46号位置上的残基可以是Glu、Gln、Asp、Asn、His、Arg、或Gly；

48号位置上的残基可以是Tyr或Trp；

49号位置上的残基可以是Arg或Lys；

50号位置上的残基可以是Trp、Tyr、或Phe；

51号位置上的残基可以是Gly、Ala、Ser、或gln；

52号位置上的残基可以是Ser、Thr、Asn、或Ala；

53号位置上的残基可以是Pro或Gly；

54号位置上的残基可以是Pro、Ala、Gly、Arg、Leu、或Thr；

55号位置上的残基可以是Lys、Arg、Gln、或Ala；

56号位置上的残基可以是Asp、Asn、Glu、Gln、Ala、Gly、或Ile；

57号位置上的残基可以是Lys、Gln、或Arg；

58号位置上的残基可以是Arg、Gln、或Lys；

59号位置上的残基可以是Tyr、Phe、或Trp；

60号位置上的残基可以是Gly、Ala、或Ser；

61号位置上的残基可以是Gly、Ala、或Ser；

62号位置上的残基可以是Phe、Tyr、或Trp；

63号位置上的残基可以是Met、Leu、Ile、或Val；

64号位置上的残基可以是Thr、Ala、Ser、或Lys；

65号位置上的残基可以是Ser、Ala、Thr、或Pro；

66号位置上的残基可以是Glu、Asp、Asn、Lys、或Gln；

67号位置上的残基可以是Lys、Arg、或Gln；

68号位置上的残基可以是Ser、Ala、Thr、或Gly；

69号位置上的残基可以是Gln、Glu、Asp、Asn、Arg、或His；

70号位置上的残基可以是Thr、Ser、Ala、或Lys；

71号位置上的残基可以是Pro、或Gly；

72号位置上的残基可以是Leu、Ile、Met、或Val；

73号位置上的残基可以是Val、Leu、Ile、或Met；

74号位置上的残基可以是Thr、Ala、或Ser；

75号位置上的残基可以是Leu、Ile、Met、或Val；

76号位置上的残基可以是Phe、Tyr、Trp、或Leu；

77号位置上的残基可以是Lys、Gln、或Arg；

78号位置上的残基可以是Asn、Asp、Glu、Gln、或His；

79号位置上的残基可以是Ala、Gly、Ser、Ile、或Val；

80号位置上的残基可以是Ile、Leu、Met、Val、或Thr；

81号位置上的残基可以是Ile、Met、Val、Thr、或Leu；

82号位置上的残基可以是Lys、Gln、或Arg；

83号位置上的残基可以是Asn、Asp、Glu、Gln、或Ser；

84号位置上的残基可以是Ala、Val、Ser、Gly、或Glu；

85号位置上的残基可以是Tyr、Phe、Trp、或His；

86号位置上的残基可以是Lys、Gln、或Arg；

87号位置上的残基可以是Lys、Gln、或Arg；

88号位置上的残基可以是Gly、Ala、或Ser；

89号位置上的残基可以是Glu、Gln、Asp、Asn、或His；

人BLT(序列8)上的其他特定取代包括在序列8上的单个或多个取代，其中：

3号位置上的残基是Glu；

4号位置上的残基是Arg；

6号位置上的残基是Gln；

7号位置上的残基是Pro；

8号位置上的残基是Glu、Ala或Pro；

9号位置上的残基是Pro或Ala；

11号位置上的残基是Arg或Pro；

16号位置上的残基是Leu或Gln；

21号位置上的残基是Phe；

23号位置上的残基是Thr、Leu、或Pro；

24号位置上的残基是Arg或Val；

27号位置上的残基是Ala；

29号位置上的残基是Asn、Tyr、或Ala；

30号位置上的残基是Glu；

31号位置上的残基是Ala；

32号位置上的残基是Ala；

33号位置上的残基是Ala或Glu；

34号位置上的残基是Pro或Ser；

35号位置上的残基是Asp；

36号位置上的残基是Thr或Ala；

37号位置上的残基是Glu；

40号位置上的残基是Ser；

42号位置上的残基是Ser；

44号位置上的残基是Glu；

45号位置上的残基是Val；

52号位置上的残基是Asn；

54号位置上的残基是Ala或Arg；

56号位置上的残基是Gly；

84号位置上的残基是Val；

85号位置上的残基是His；和

89号位置上的残基是His；

表1代表性氨基酸可取代性

原始残基	代表性取代
		ALAARGASNASPCYSGLNGLUGLYHISILELEULYSMETPHESERTHRTRPTYRVALPRO	SER,GLYLYSGLN,HIS,ASP,GLUGLU,GLN,ASNSERASN,GLU,ASPASP,GLN,ASNPRO,SER,ALAASN,GLNLEU,VAL,METILE,VAL,METARG,GLN,GLULEU,ILE,VALMET,LEU,TYR,TRPTHR,ALASER,ALATYR,PHETRP,PHEILE,LEU,METGLY

表2序列表标志序列号                               说明

1                  编码Met-Arg-BLT的核酸

2                  Met-Arg-BLT的氨基酸序列

3                  用于形成序列5的融合配偶体的氨基酸序列

4                  用于构建BLT融合体的寡核苷酸接头

5                  BLT融合体的氨基酸序列

6                  谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合配偶体

7                  GST/BLT融合蛋白

8                  人BLT的氨基酸序列

9                  人BLT(1-49)

10                 人BLT(50-89)

11                 人BLT(38-67)

12                 人BLT(38-89)

13                 人BLT(Δ7-23)

14                 人BLT(1-14)

15                 人BLT(8-21)

16                 人BLT(15-28)

17                 人BLT(22-35)

18                 人BLT(29-42)

19                 人BLT(36-49)

20                 人BLT(43-56)

21                 人BLT(50-63)

22                 人BLT(57-70)

23                 人BLT(64-77)

24                 人BLT(71-84)

25                 人BLT(78-89)

26              BLT类似物(1：Glu-Ala)

27              BLT类似物(3：Thr-Ser)

28              BLT类似物(5：Gln-Glu)

29              BLT类似物(7：Leu-Asp)

30              BLT类似物(10：Gly-Ala)

31              BLT类似物(15：Gly-Glu)

32              BLT类似物(17：Ala-Gly)

33              BLT类似物(23：Ala-Phe)

34              BLT类似物(30：Ser-Glu)

35              BLT类似物(42：Pro-Ser)基因分离方法

本领域技术人员可以理解，可以通过多种重组DNA技术获得编码BLT或BLT融合体的核酸，例如，包括聚合酶链式反应(PCR)扩增，或从头DNA合成(例如，参见T.Maniatis等分子克隆；实验室手册，第2版，第14章(1989))。

例如，可将针对序列1的3’和5’末端的寡核苷酸引物用于Met-Arg-BLT的PCR扩增。例如，参见PCR方法：方法和应用指南，M.Innis等著，学术出版社(1990)。PCR扩增包括模板DNA、合适的酶、引物、和缓冲液，并且通常是在DNA热循环仪(Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT)上进行的。通过在琼脂糖凝胶电泳之后检测合适大小的DNA片段(即273个碱基对)确定阳性结果。蛋白生产方法

本发明的一种实施方案涉及用BLT蛋白作为药用化合物。技术人员可以理解的是，本发明的所述蛋白及片段、或其功能性片段可以通过多种不同方法合成，如本领域众所周知的化学方法，包括固相肽合成，或重组方法。以上两种方法披露于被收作本文参考文献的美国专利4617149中。

蛋白固相化学合成的原理在本领域中是众所周知的，并可以参见本领域的普通教科书。例如，参见H.Dugas和C.Penney，生物有机化学(1981)；Spriger-Verlag，纽约54-92。例如，肽可以通过固相方法使用应用生物系统430A肽合成仪(应用生物系统，Foster市，CA)合成，并且使用由应用生物系统提供的合成循环。

对起始对甲基二苯甲基胺树脂进行使用双偶合方法的顺序叔丁氧基羰基化学，以便产生C-末端羰酰胺。为了产生C-末端酸，使用相应的吡啶-2-乙醛肟甲碘化物树脂。用预先形成的羟基苯并噻唑酯将天冬酰胺、谷氨酰胺、和精氨酸连接在一起。在所述合成结束之后，可以对所述肽进行脱保护，并用含有10％间甲酚的无水氟化氢将其从所述树脂上切除。侧链保护基团的切除和所述肽从树脂上的切除是在0℃或更低温度下进行的，优选在-20℃下进行30分钟，然后再在0℃下进行30分钟。

一般，肽的合成包括下面的一系列步骤。首先激活其α-氨基(如果必要的话还有侧链官能团)受到保护的氨基酸，以便形成活性酯。将所述活化的氨基酸通过所述活化的酯基连接到惰性固体支持物上，并对结合的氨基酸进行充分洗涤。在该步骤之后，在一个独立的反应中将第二种受保护的氨基酸激活成酯。将所述第一种氨基酸的α-氨基脱保护，得到一种活性胺，并让第二种激活的氨基酸与它起反应，以便在所述固体支持物上形成一种二-肽。顺序重复上述步骤，得到长度逐渐加长的肽。在所述合成结束之后，将所述肽从固体支持物上切除，并通过用强酸处理所述肽对侧链官能团脱保护。然后通过过滤将所述肽从固体支持物中分离，用有机溶剂沉淀，并通过本领域公知的多种技术纯化。

在本发明中，α-氨基保护基团是9-芴甲氧羰基(Fmoc)基团。侧链保护基团是Boc(用于Lys和Trp残基)、Trt(用于Asn、His、Gln)、tBu(用于Ser、Thr、Tyr)，OtBu(用于Asp、Glu)和Pmc(用于Arg)。活性酯是与2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸(HBTU)形成的。

通过用哌啶处理所述固相除去α-氨基Fmoc保护基团。在上述条件下，Fmoc基团很容易除去，而固相连接和侧链保护基团不受影响。有待于添加到新生肽链上的受保护的氨基酸用HBTU活化。

人BLT的合成出现了若干特殊挑战。首先，所述肽的序列包括ser-pro-pro三肽片段。在所述合成中，标准连接化学会导致一系列缺失错误。通过pro残基的双重连接可以降低所述缺失。在优选实施方案中，所述合成是通过pro和ser残基的双重连接完成的。另外，在所述连接步骤结束之后，用乙酸酐封闭所述剩余的未反应的脱保护肽，以防缺失肽的链伸长。

其次，所述人的肽含有三个asp-gly二肽序列。这些序列即使在asp侧链受保护的情况下也容易形成环亚胺。所述环亚胺然后在脱保护步骤中与哌啶起反应，产生哌啶修饰的肽。通过对asp残基前面的每一个甘氨酸残基进行N-a-Hmb保护可以消除所述环化作用。例如，参见Qubbell等，J.Chem.Soc.Chem.Commun.2343，1994，被收作本文参考文献。在两个asp-gly二肽前面有一个pro。由于所述序列的这一特征，并且由于hmb保护的氨基酸的较弱的活性，对所述二肽中的每一个进行多重连接，然后用乙酸酐封端。在一种优选实施方案中，是双重连接的。

在一种优选方法中，所述肽是用Fmoc化学法用一个轮次合成的。由于在BLT分子的N-末端部分存在若干asp-gly二肽序列，使得BLT的合成复杂化。业已观察到asp-gly二肽序列上的天冬酰胺侧链发生碱催化环化作用，并且随后在FMOC合成中添加哌啶。通过在合成中在每一个asp-gly序列上使用Fmoc-(Fmoc-Hmb)-甘氨酸可以消除上述反应。通过用Hmb基团保护甘氨酰胺，可以抑制天冬酰胺侧链的环化作用。在裂解、脱保护、和反相HPLC纯化后，可以电喷射质谱术分析所述肽。所述BLT合成中出现的主要类型是具有预期质量的完整长度肽。使用该方法可以用一个轮次，以0.1mM的规模生产数量超过100毫克的纯化蛋白。

本发明的蛋白还可以通过重组DNA技术生产。编码BLT、或BLT融合体(例如序列1)的克隆核酸的表达可以在本领域技术人员熟知的多种合适的宿主中进行。为此，通过本领域技术人员熟知的任何合适的方法将BLT编码核酸导入宿主细胞。尽管本发明的范围包括染色体整合，不过优选将所述序列克隆到合适的染色体外存在的表达载体中，以便BLT基因的编码区可操作地连接于组成型或诱导型启动子上。

重组生产BLT蛋白的基本步骤包括：

a)构建编码BLT或其融合蛋白的天然的、合成的或半合成的DNA；

b)以适于表达所述蛋白的方式将所述DNA整合到一种表达载体上；

c)将所述载体转化或导入一种合适的真核或原核宿主细胞中，产生重组宿主细胞；

d)以能表达所述蛋白的方式培养所述重组宿主细胞；和

e)通过任何合适的方法回收并大体上纯化所述蛋白。在原核和真核宿主细胞中表达重组BLT融合蛋白

人β-促脂解素(BLT)是一种有89个氨基酸的激素，它是由脑垂体以前体蛋白的形式产生的，所述前体蛋白进行翻译后加工产生包括BLT在内的若干具有生物活性的激素。由于BLT较小，并且包含蛋白酶解敏感位点，我们最初通过化学合成生产这种蛋白。不过，这种方法不适用于大量制备。在本发明中，我们披露了一种方法，通过该方法可以在细菌或真菌表达宿主中以融合蛋白形式生产BLT。所述融合蛋白受到保护，不会发生蛋白酶解降解，并且可以通过下文所述的方法回收完整的BLT。

在大肠杆菌中，BLT是以融合蛋白形式产生的，这种融合蛋白可以在有高盐的条件下通过常规纯化方法从细胞裂解物中回收。所述融合蛋白含有被用于从BLT上分离融合配偶体的特殊蛋白酶的识别位点。在巴斯德毕赤酵母中，所述融合蛋白是在从细胞中分离时裂解的，以便可以检测到天然BLT，并从培养基中回收到完整的BLT。

该方法提供了BLT的生产工艺。与化学合成不同，本文所披露的方法可以放大，以便生产大量的BLT。

可将原核生物用于生产重组BLT蛋白。例如，大肠杆菌K12菌株294(ATCCNo.31446)特别适用于在原核细胞中表达外源蛋白。还可将大肠杆菌的其他菌株、诸如枯草芽孢杆菌的芽孢杆菌、诸如鼠伤寒杆菌或粘质沙雷氏菌的肠杆菌、各种假单胞菌和其他细菌如链霉菌属用作宿主细胞，克隆并表达本发明的重组蛋白。

适于在原核生物中驱动基因表达的启动子序列包括b-内酰胺酶[例如载体pGX2907，ATCC39344，含有一个复制子和b-内酰胺酶基因]，乳糖系统[Chang等，自然(伦敦)275：615(1978)；Goeddel等，自然(伦敦)281：544(1979)]、碱性磷酸酶、和色氨酸(trp)启动子系统[载体pATH1(ATCC37695)]，它被设计成能在trp启动子的控制下表达诸如trpE融合蛋白的开放读框。诸如tac启动子(从质粒pDR540，ATCC-37282中分离)和T7启动子的杂合启动子也可以使用。还可将其核苷酸序列已知的其他细菌启动子连接到编码本发明的蛋白的DNA上，使用接头提供任何需要的限制位点。用于细菌系统中的启动子还要含有一个可操作地连接在编码所需要的多肽的DNA上的SD序列。上述例子是说明性的而不是限定性的。

本发明的蛋白可以通过直接表达合成或以融合蛋白形式合成，通过酶促或化学裂解从融合蛋白上除去融合配偶体。原则上讲，本发明可应用能够在细菌或真菌宿主中表达的任何融合系统。在合适的融合系统的一种实施方案中，在BLT和融合配偶体间设置一个识别位点，其中，例如，将所述融合配偶体设置在BLT的氨基末端。合适的位点可以是蛋白酶的识别序列，或者是易受化学裂解的位点。

合适的细菌融合配偶体的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶、麦芽糖结合蛋白、羧肽酶原、钙调蛋白结合蛋白或任何能启动融合蛋白高水平表达的位于氨基末端的序列。

合适的蛋白酶的例子包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。用于化学裂解的制剂包括溴化氰、酸等。

适用于真菌系统的融合配偶体的例子包括α交配因子、前肽、人血清白蛋白和任何能启动所述融合蛋白表达和分泌的其他序列，并且随后裂解(在分泌期间)将天然BLT释放到培养基中。

在一种方法中，BLT融合蛋白包括与二肽(即met-arg)融合的天然BLT序列，所述二肽融合在天然BLT分子的氨基末端(例如序列2)。该融合分子的二肽配偶体可以通过用组织蛋白酶C处理除去，并通过诸如HPLC的本领域公知的方法纯化天然BLT分子。在生产重组BLT融合蛋白的另一种方法中，将谷胱甘肽S-转移酶(GST)用作融合配偶体。生产在本文中被称为序列7的蛋白，大体上如Smith和Johnson(基因67，31，1988)所述，该文献被收作本文参考文献。

在重组系统中生产某些肽时经常观察到，以融合蛋白形式表达能延长其寿命，提高所需要的肽的产量，或提供纯化所述蛋白的方便的方法。在原核宿主中表达哺乳动物蛋白时这一点特别重要。已知有多种肽酶(例如肠激酶和凝血酶)能在特定位点上裂解多肽或者从氨基或羧基末端消化所述肽(例如，二氨基肽酶)。另外，特定的化合物(例如溴化氰)可以在特定位点上裂解多肽。技术人员可以理解的是，必须对氨基酸序列(如果采用重组方法的话还有合成的或半合成的编码序列)进行修饰，以便插入位点专一性内部裂解位点。例如，参见P.Carter，“融合蛋白的位点专一性蛋白酶解”，第13章，见蛋白纯化：从分子机制到大规模加工，美国化学协会，华盛顿特区，(1990)。

除了原核生物之外，可以使用诸如蛙卵母细胞的两栖表达系统，和哺乳动物细胞系统。具体宿主细胞的选择在一定程度上取决于所使用的具体表达载体。适用于本发明的代表性哺乳动物宿主细胞包括，例如，HepG-2(ATCC HB8065),CV-1(ATCC CCL70),LC-MK2(ATCCCCL7.1),3T3(ATCC CCL92),CHO-K1(ATCC CCL61),HeLa(ATCCCCL2),RPMI8226(ATCC CCL155),H4IIEC3(ATCC CCL1600),C127I(ATCC CCL1616),HS-Sultan(ATCC CCL1484),和BHK-21(ATCC CCL10)。

有多种载体适用于转化哺乳动物宿主细胞。例如，包括转录和聚腺苷酸化所需要的猴病毒40(SV40)基因组的片段的pSV2-型载体。业已构建了大量的质粒pSV2-型载体，如pSV2-gpt,pSV2-neo,pSV2-dhfr,pSV2-hyg,pSV2-b-珠蛋白，其中，SV40启动子启动插入基因的转录。所述载体可以从诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC)12301 Parklawn Drive,Rockville，马里兰，20852，或农业研究机构保藏中心(NRRL)1815N.大学大街，Peoria，伊利诺依，61604的来源广泛获得。

适用于在哺乳动物细胞中表达的启动子包括SV40晚期启动子，源于真核基因的启动子，如雌激素诱导鸡卵清蛋白基因，干扰素基因，糖皮质素诱导酪氨酸氨基转移酶基因，胸苷激酶基因启动子，以及主要早期和晚期腺病毒基因的启动子。

用载体转染哺乳动物细胞可以用多种众所周知的方法进行，包括，但不限于原生质体融合、磷酸钙共沉淀、和电穿孔等。例如，参见Maniatis等，同上。

某些病毒也构成合适的载体。其例子包括腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒、疱疹病毒、杆状病毒、和肉瘤病毒，如美国专利4775624中所披露的，该专利被收作本文参考文献。

诸如酵母和其他真菌的真核微生物也适于作为宿主细胞。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母是优选的真核微生物。诸如乳酸克鲁维酵母的其他酵母也可以使用。为了在酵母属中表达，可以使用诸如Yrp7(ATCC-40053)的质粒。例如，参见L.Stiachcom等，自然，282，39(1979)；J.Kingsman等，基因7，141(1979)；S.Tschemper等，基因10，157(1980)。质粒Yrp7含有TRP1基因，它提供了用于trp1营养缺陷突变型的选择标记。

本发明的其他实施方案包括编码BLT或其片段的分离的核酸序列。正如技术人员可以理解的，本发明的氨基酸化合物可以由多种不同的核酸序列编码。由于这些不同的核酸序列可以编码相同的氨基酸序列，本发明还包括这些不同的核酸序列。

本发明的BLT编码核酸还可以通过化学合成法生产。核酸的合成在本领域中是众所周知的。例如，参见E.L.Brown,R.Belagaje,M.J.Ryan，和H.G.Kheorana，酶学方法68，109-151(1979)。相当于BLT的DNA序列的片段可以用常规DNA合成装置制备，如用应用生物系统380A或380B型DNA合成仪(应用生物系统公司，850LincolnCenter Drive,Foster市，CA94404)用亚磷酰胺化学法合成，然后连接所述片段，以便重建完整的基因。另外，可以用磷酸三酯化学法合成本发明的核酸。(例如参见M.J.Gait著，寡核苷酸合成，实践方法，(1984))。载体

本发明的另一方面涉及包含本发明核酸的重组DNA克隆载体和表达载体。优选的核酸载体是包括DNA的载体。最优选的重组DNA载体包括分离的DNA序列序列1。

技术人员可以理解，最合适的克隆载体和表达载体的选择取决于多种因素，包括限制性酶切位点的可利用性，待转染或转化所述载体的宿主细胞的类型，转染或转化的目的(例如，作为染色体外因子稳定转化，或者整合到宿主染色体上)，容易检测的标记或选择标记的有或无(例如，一种类型和另一种类型的抗生素抗性和代谢标记)，以及目标基因在宿主细胞中的拷贝数量。

适于携带本发明核酸的载体包括RNA病毒、DNA病毒、裂解性噬菌体、溶源性噬菌体、稳定性噬菌体、质粒、和类病毒等。最优选的载体是质粒。

本领域技术人员可以理解，在制备表达载体时有多种可变因素需要考虑，例如，是使用组成型还是诱导型启动子。技术人员还可以理解的是，待生产的核酸或蛋白的量在一定程度上决定表达系统的选择。就启动子序列而言，优选诱导型启动子，因为它们能够高水平的、可调节地表达可操作地连接的基因。技术人员可以理解，多种合适的启动子对多种诱导剂有反应，例如，碳源、金属离子和热。与表达载体相关的其他因素包括是否包括指导重组蛋白定位的序列。例如，位于编码区前面编码信号肽的序列可用于指导所产生的多肽的细胞外输出。

本发明还提供了一种构建能表达BLT蛋白重组宿主细胞的方法，该方法包括将含有编码BLT的分离的DNA序列的重组DNA载体转入或导入宿主细胞。优选的宿主细胞是适于外源导入的基因或蛋白高水平表达的任何细胞。可以在本领域技术人员熟知的条件下培养转化的宿主细胞，以便表达重组BLT。

本发明还提供了用于治疗受与胰岛素代谢或糖代谢缺陷相关的疾病或症状困扰的人和其他哺乳动物的方法，所述疾病如包括糖过多病、胰岛素过多病、1型和2型糖尿病、以及与其相关的并发症。所述方法包括给需要治疗的生物服用有效量的BLT蛋白或肽，或含有BLT的融合蛋白或其功能性片段，或其类似物，剂量为大约1-1000微克/公斤体重。在实施该方法时，BLT可以1日1次的剂量，1日多次的剂量服用，或者通过植入身体或用其他方式连接在身体上的机械泵送装置连续或不连续服用。待服用的BLT或相关蛋白或肽的量由医生确定，并取决于诸如被治疗的症状，或疾病的性质和严重程度，以及患者的年龄和一般健康状况的因素。

本发明还提供一种含有BLT蛋白或其功能性片段或其类似物，如以序列8为代表，或其药理学上可以接受的无毒的盐作为活性剂的药用组合物，所述活性剂与药理学上可以接受的固体或液体载体混合。所述蛋白优选为药理学上可以接受的盐的形式，可将其制备成适于肠胃外服用，用于治疗和预防性治疗糖尿病或其并发症。例如，序列8的化合物或其他BLT，或其片段可以与常规药用载体和赋形剂混合。含有BLT蛋白的所述组合物含有重量百分比大约0.1-90％的蛋白，优选为可溶形式，并且一般为大约10-30％。另外，本发明蛋白可以单独服用，或者与其他抗糖尿病制剂或用于治疗糖尿病的制剂组合服用。

为了静脉内(Ⅳ)使用，BLT、片段或类似物以常用的静脉内流体形式服用并且通过输液服用。所述流体如可以使用生理盐水、Ringer’s溶液或5％葡萄糖溶液。

对于肌内制剂来说，可以溶解一种无菌制剂，优选合适的可溶盐形式的BLT蛋白，例如序列8，如氢氯酸盐，并在诸如无热原的水(蒸馏水)、生理盐水或5％葡萄糖溶液的药用稀释剂中服用。可以制备合适的不可溶形式的化合物，并且作为在水基或药理学上可接受的油基，例如长链脂肪酸的酯，如油酸乙酯中的悬浮液形式服用。

下面的实施例更全面地说明了本发明，以及将BLT用于治疗糖尿病的用途。本领域技术人员可以理解，所披露的特定试剂、设备和方法仅仅是说明性的，并不希望以任何形式限定本发明。

例1人BLT蛋白的固相合成和纯化

用Fmoc化学法用一个轮次合成人BLT肽(序列8)。由于在BLT分子的N-末端部分存在若干asp-gly二肽序列，使得BLT的合成复杂化。业已观察到asp-gly二肽序列上的天冬酰胺侧链发生碱催化环化作用，并且随后在FMOC合成中添加哌啶。通过在合成中在每一个asp-gly序列上使用Fmoc-(Fmoc-Hmb)-甘氨酸可以消除上述反应。通过用Hmb基团保护甘氨酰胺，可以抑制天冬酰胺侧链的环化作用。在裂解、脱保护、和反相HPLC纯化后，可以电喷射质谱术分析所述肽。所述BLT合成中出现的主要类型是具有预期质量的完整长度肽。使用该方法可以用一个轮次，以0.1mM的规模生产数量超过100毫克的纯化蛋白。

材料：预加样Fmoc-Glu(OtBu)Wang(用对苯氧基苄醇功能化的1％交联的聚苯乙烯)树脂，大约为0.6M氨基酸/克树脂。N-甲基吡咯烷酮(NMP)、哌啶、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-甲基脲六氟磷酸(HBTU)，2M N，N，二异丙基乙基胺(DIEA)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，二氯甲烷(DCM)，二甲基甲酰胺(DMF)。

对用Fmoc-保护的C-末端氨基酸(0.1或0.25mM氨基酸)预加样的树脂进行称重，并放入反应室中。通过用DCM洗涤使所述树脂预膨胀。然后用NMP洗涤所述树脂。通过在溶解在NMP中的12-22％哌啶溶液中温育所述树脂除去N-末端Fmoc基团。在脱保护之后用NMP充分洗涤所述树脂。

将待添加到所述肽上的1mmol的另一个Fmoc保护的氨基酸溶解在2.1克NMP、2.0克DMF中的0.45M HBTU/HOBt制剂中。在溶解之后，通过添加3ml溶解在NMP中的2M DIEA开始氨基酸的活化。然后将活化的氨基酸添加到脱保护的树脂上，并进行连接。在交联结束之后，用NMP彻底洗涤所述树脂，然后对每一个后续的氨基酸重复完整轮次的脱保护和连接。

在所述合成中的特定轮次中的步骤如下：轮次      AA                步骤1  Glu(OtBu)               完全洗涤2  Gly                     单连接3  Lys(Boc)                单连接4  Lys(Boc)                单连接5  Tyr(tBu)                单连接6  Ala                     单连接7  Asn(Trt)                单连接8  Lys(Boc)                单连接9  Ile                     单连接10 Ile                     单连接11 Ala                     单连接12 Asn(Trt)                单连接13 Lys(Boc)                单连接14 Phe                     单连接15 Leu                     单连接16 Thr(tBu)                单连接17 Val                     单连接18 Leu                     单连接19 Pro                     双连接/Ac20封端20 Thr(tBu)                单连接21 Gln(Trt)                单连接22 Set(tBu)                单连接23 Lys(Boc)                单连接24 Glu(OtBu)               单连接25 Bet(tBu)                单连接26 Thr(tBu)                单连接27 Met                     单连接28 Phe                     单连接29 Gly                     单连接30 G1y                     单连接31 Tyr(tBu)                单连接32 Arg(Pmc)                单连接33 Lys(Boc)                单连接34 Asp(OtBu)               单连接35 Lys(Boc)                单连接36 Pro                     双连接/Ac20封端37 Pro                     双连接/Ac20封端38 Ser(tBu)         单连接39 Gly              单连接40 Trp(Boc)         单连接41 Arg(Pmc)         单连接42 Phe              单连接43 His(Trt)         单连接44 Glu(OtBu)        单连接45 Met              单连接46 Arg(Pmc)         单连接47 Tyr(tBu)         单连接48 Pro              双连接/Ac20封端49 Gly              单连接50 Glu(OtBU)        单连接51 Asp(OtBu)        单连接52 Lys(Boc)         单连接53 Lys(Boc)         单连接54 Glu(OtBU)        单连接55 Ala              单连接56 Ala              单连接57 Val              单连接58 Leu              单连接59 Leu              单连接60 Ser(tBu)         单连接61 His(Trt)         单连接62 Glu(OtBu)        单连接63 Leu              单连接64 Asp(OtBu)        单连接65 Ala              单连接66 Gln(Trt)         单连接67 Ala              单连接68 Gly              单连接69 Ala              单连接70 Gly(Fmoc-hmb)    双连接/Ac20封端71 Asp(OtBu)        单连接72 Asp(OtBu)        单连接73 Ala              单连接74 Pro              双连接/Ac20封端75 Gly(Fmoc-hmb)    双连接/Ac20封端76 Asp(OtBu)           单连接77 Pro                 双连接/Ac20封端78 Gly(Fmoc-hmb)       双连接/Ac20封端79 Asp(OtBu)           单连接80 Gly                 单连接81 Glu(OtBu)           单连接82 Arg(Pmc)            单连接83 Leu                 单连接84 Arg(Pmc)            单连接85 Gln(Trt)            单连接86 Gly                 单连接87 Thr(tBu)            单连接88 Leu                 单连接89 Glu(OtBu)           单连接90                     最终脱保护

对于反应缓慢或低效率的氨基酸来说，进行2个独立的连接反应。通过用乙酸酐处理封闭所有剩余的未反应的肽，对于所述氨基酸之一的步骤的顺序是脱保护、连接反应1、洗涤、连接反应2、洗涤、Ac20封端、洗涤、脱保护。

缩略语：OtBu：叔丁基酯，tBu：叔丁基，Boc：叔丁氧基羰基，Pmc：2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基，Hmb：2-羟基-4-甲氧基苄基，Fmoc：9-芴甲氧基羰基。

例2构建编码BLT的合成基因

用标准克隆方法构建质粒，如Maniatis等所披露的，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，纽约(1982)，酶和其他试剂是从Gibco-BRL，Gaithersgurg，MD或新英格兰实验室，Beverly MAO1915获得。用于消化、鉴定、回收和纯化本发明所使用的各种寡核苷酸和DNA片段的方法是本领域技术人员所熟知的，而且用于将所述序列连接到载体上，转化宿主微生物，以及在能够产生质粒DNA和重组蛋白产物的条件下培养所述宿主微生物的方法也是已知的。

编码人BLT的DNA序列(序列8)是用8个化学合成的大小为52-86个碱基的寡核苷酸组装而成的。所述寡核苷酸是用诸如应用生物系统380A或380B型的常规DNA合成装置制备的(可以从应用生物系统公司购买，850，Lincoln Center Drive，Foster市，CA94404)。设计所述寡核苷酸的序列，以便由4个所述寡核苷酸形成合成基因的一条链，而由其余的4个寡核苷酸形成该合成基因的互补链。在组装之前，在有ATP的条件下用多核苷酸激酶处理所述寡核苷酸，以便将每一个寡核苷酸上的游离羟基磷酸化。

将所述8种寡核苷酸以等摩尔浓度(3皮摩尔/微升)混合在100微升体积中，加热到95℃，并用数小时时间逐渐冷却到室温。这样能使得单个的寡核苷酸进行正确的碱基配对。加入T4 DNA连接酶，连接所述寡核苷酸，产生大约285碱基对的双链DNA，在2％琼脂糖凝胶上对该DNA进行分析和纯化。将具有“粘性”末端的该片段连接到用NdeⅠ和BamHⅠ消化过的pUC18载体上。将所述连接混合物转入感受态DH10B细胞中，将所述细胞铺平板到含有100微克/毫升氨苄青霉素的胰胨-酵母琼脂平板上。对生长过夜的菌落进行分析，证实是否存在含有所述化学合成基因的质粒。所述分析是这样进行的：从所述菌落中纯化质粒DNA，用NdeⅠ和BamHⅠ消化所述质粒DNA，并证实大约285碱基对片段的存在。然后通过DNA序列分析证实正确的序列。该质粒被命名为pOJ838。

例3构建表达BLT融合蛋白的质粒

由于BLT是一种小的蛋白，优选通过产生融合蛋白以增加其大小。为此，使用两种不同的融合配偶体。一种是具有因子Xa裂解位点的谷胱甘肽S-转移酶(GST)，其氨基酸序列在本文中被称为序列6，它是由载体pGEX-2T(Pharmacia生物技术，Piscataway,NJ08855)编码的；另一个是短肽序列MIIGLMVGGVSGSGSGSGDDDDP(序列3)。

为了获得天然β-促脂解素，通过化学或酶促消化处理融合蛋白，以便将β-促脂解素从其融合配偶体上解离。这一目的通过在所述融合配偶体和β-促脂解素之间插入酶促或化学裂解位点而实现。对于GST融合体来说，选择肠激酶或因子Xa的识别位点；对于小的合成肽融合体(序列3)来说，插入一个脯氨酸，以便在酸处理之后能够进行化学裂解。

编码具有因子Xa识别序列(IEGR)的GST融合体的质粒是按如下方法构建的。用AdeⅠ和NruⅠ消化质粒pOJ838(含有合成β-促脂解素的pUC18；参见例4)，并对最大的载体片段进行凝胶纯化。以等摩尔量混合序列为5’TATGAGATCTATCGAAGGTCGTGAGCTCACCGGTCAGCGTGTTCG-3’(序列4)的合成接头及其补体，加热到95℃，并通过逐渐将温度降低到大约25℃进行退火。将退火的接头连接到所述载体片段上，并将连接混合物转入感受态DH10B细胞。将转化细胞铺平板到含有100微克/毫升氨苄青霉素的胰胨-琼脂平板上。对生长过夜的菌落进行分析，证实含有所述接头序列的质粒的存在。这一目的是这样实现的：从所述菌落中纯化质粒DNA，证实通过所述接头导入的新的BglⅡ位点的存在。然后通过DNA序列分析证实正确的接头序列。所得到的质粒被命名为pOJ839。

用BglⅡ和EcoRⅠ消化质粒pOJ839，并对含有β-促脂解素基因的小的片段(现在连接在因子Xa识别序列上)进行凝胶纯化，并连接到用BamHⅠ和EcoRⅠ消化过的pGEX2-T上。将连接混合物转入感受态DH10B细胞，将所述细胞铺平板到含有100微克/毫升氨苄青霉素的胰胨-酵母琼脂平板上，对生长过夜的菌落进行分析，在用SacⅠ消化之后证实含有新的大约300bp片段的质粒的存在。这种新的质粒被命名为pOJ840。

例4编码羧肽酶原-BLT融合蛋白的重组载体pHMM260-ProCpB(10)/LVPR/β-促脂解素(R49)

一种含有ProCpB(10)/LVPR/β-促脂解素(R49)表达框的重组DNA表达载体pHMM260编码羧肽酶原-BLT融合蛋白。该载体是用标准克隆技术生产的。对pHMM260表达框的注释如图16所示。该表达框的旁侧在5’末端是NdeⅠ位点，而在3’末端是BamHⅠ位点。猪羧肽酶原B蛋白的前肽部分存在于所述表达框的5’末端，始于Mgt残基，并止于Ser残基。凝血酶蛋白酶识别序列LVPR存在于羧肽酶原的3’末端。该序列始于Glu残基，位于凝血酶裂解位点的3’末端，编码野生型人β-促脂解素。

构建若干衍生的表达框，以便BLT序列的49号位置从野生型序列Arg(R49)改变成Ala(A49)pHMM261，或Glu(E49)pHMM262，或Gln(Q49)pHMM263。制备上述衍生物是为了降低在所述融合蛋白的合成和纯化期间受到蛋白酶解作用的影响。上述所有载体编码可溶性融合蛋白。

例5编码丝氨酸羟基甲基转移酶(SHMT)-BLT融合蛋白的重组载体pHMM268

用标准克隆技术构建含有源于丝氨酸羟基甲基化酶转移酶(SHMT)的氨基末端序列的融合蛋白。质粒pHMM268在大肠杆菌中以高水平表达。由pHMM268产生的融合蛋白是不溶性的，并可以以颗粒组分形式回收。这一特征的优点是，可以防止蛋白酶解降解作用。

例6给雄性A^VY/A小鼠服用小鼠BLT 7天

A^VY/A小鼠是研究肥胖和糖尿病的模型。这种近交品系在中年时期会产生血糖过多病、胰岛素过多病和胰岛素不敏感性，因此构成了研究肥胖和糖尿病的有用模型。

雄性A^VY/A小鼠是从Harlan公司(Indianapolis,IN)购买的，大约为6月龄。将所述动物圈养在笼子中，每笼6只，并随意采食5008食物和水。在规定的间隔时间测定血液葡萄糖含量；当清晨葡萄糖含量达到至少300毫克/dL时，让所述动物接受实验方案。将5只随机挑选的动物圈养在一起作为对照；将5只随机挑选的动物圈养在一起接受小鼠BLT(小鼠BLT序列容易获得；例如，参见M.Notake等FEBS通讯156，67-71，1983，收作本文参考文献)处理，所述小鼠BLT是通过固相技术合成的。

接受处理的小鼠每天2次皮下注射(SC)BLT(每一个剂量共200微升体积)；对照动物每天2次注射200微升媒介物(盐水溶液)。所述动物每天注射2次，在上午和下午注射，共注射6天；在第7天只在上午进行注射。

在第0天上述测定血液葡萄糖含量、体重、和食物消耗量。第1-6天早上测定体重和食物消耗量。在第6天上午测定血浆甘油三酯。从第6天下午到第7天上午对小鼠禁食一夜。第7天进行口服葡萄糖耐受性试验。在上午注射盐水或BLT 2小时之后测定0时间血液葡萄糖含量。为了进行该试验，给动物口服25％葡萄糖溶液(100微升/10克体重)，然后在30、60、和120分钟之后放血。将所述血样用于测定葡萄糖和胰岛素含量。在口服葡萄糖耐受性试验之后，让所述动物自由进食。在最后1次SC注射盐水或BLT之后第1、3、和14天，对动物放血，以便测定血液葡萄糖值。

结果：体内服用BLT可降低血液葡萄糖和胰岛素含量

上述实验结果归纳在图1-8中。在为期7天的处理时间内，对照组和实验组的动物大约消耗4.5-6克食物(图1)。在两组中的体重保持相同，大约为50克(图2)。

在处理6天之后，在处理过的小鼠体内BLT处理可降低血浆甘油三酯(参见图3)。对照动物表现出3.05nmol/l(s.d.0.58)的平均值，而处理动物测得的平均值为2.05nmol/l(s.d.0.43)。这表明了血清甘油三酯下降了大约30％-35％。

BLT还能在处理过的动物中导致血液葡萄糖含量的显著降低(图4)。在服用BLT 7天之后，处理组表现出的血液葡萄糖含量为135mg/dL(s.d.16)；形成鲜明对照的是，对照组的测定值为171mg/dL(s.d.16)。处理动物体内血液葡萄糖含量的降低在第7天最后一次服用BLT之后能持续至少3天(图5)。对照动物表现出的葡萄糖含量为331mg/dL(s.d.79)。另一方面，处理动物保持明显较低的血液葡萄糖含量，为205mg/dL(s.d.76)。在最后一次服用BLT之后第14天没有观察到BLT在降低血液葡萄糖含量方面的作用(图6)。

为了证实BLT处理对胰岛素含量的影响，在为期7天的处理和禁食一夜之后进行口服葡萄糖耐受试验(图7和图8)。在开始试验之后30分钟，对照和处理动物表现出最初的血液葡萄糖含量升高，从大约80mg/dL升高到200mg/dL或更高；随后两个组表现出水平相当的葡萄糖值的降低，一直到2小时的时间点(图7)。另人吃惊的是，处理过的动物表现出的血浆胰岛素值明显低于对照动物的(图8)。例如，在30分钟的时间点上，对照动物的胰岛素含量为11.5mg/dL(s.d.1.9)，而处理动物的胰岛素含量为6.0mg/dL(s.d.3.0)。

例7给雄性A^VY/A小鼠服用小鼠BLT 14天

对雄性A^VY/A小鼠进行圈养，每笼6只，自由采食5008食物和水。在规定的间隔时间测定血液葡萄糖含量；当清晨葡萄糖含量达到至少300毫克/dL时，让所述动物接受实验方案。将5只随机挑选的动物圈养在一起作为对照；将5只随机挑选的动物圈养并用小鼠BLT处理，所述小鼠BLT是通过固相技术合成的。

接受处理的小鼠每天2次SC注射600微克BLT(每一个剂量共200微升体积)；对照动物接受200微升媒介物(盐水溶液)。每天2次注射所述动物，在上午和下午注射，共注射13天；在第14天只在上午进行注射。

在第0天上午测定血液葡萄糖含量、体重、和食物消耗量。第1-13天早上测定体重和食物消耗量。从第13天下午到第14天上午对小鼠禁食一夜。在第14天，进行口服葡萄糖耐受性试验。在上午注射盐水或BLT 2小时之后测定0时间血液葡萄糖含量。为了进行该试验，给动物口服25％葡萄糖溶液(100微升/10克体重)，然后在30、60、和120分钟之后放血。将所述血样用于测定葡萄糖和胰岛素含量。在口服葡萄糖耐受性试验之后，让所述动物自由进食。在最后1次SC注射盐水或BLT之后第1、3、和14天，对动物放血，以便测定血液葡萄糖值。结果：服用BLT14天可降低血液葡萄糖和胰岛素含量

有关结果归纳在图9-10中。在为期14天的处理时间内，对照组和实验组的动物大约消耗4.5-6克食物，而两组动物的体重保持相同，大约为50克(数据未显示)。

为了证实用BLT处理2周对胰岛素含量的影响，在14天时间进行口服葡萄糖耐受性试验(图9和图10)。在30分钟的时间点上，

对照和处理动物表现出最初的血液葡萄糖含量升高，从大约80mg/dL升高到300mg/dL或更高；随后两个组表现出水平相当的葡萄糖含量值的降低，一直到2小时该试验的结束点(图9)。例如，处理过的动物在30分钟的时间点上表现出平均血液葡萄糖含量为289mg/dL(s.d.24)，而对照组的含量为348mg/dL(s.d.18)。还在60分钟和120分钟的时间点上观察到较低的含量。例如，在120分钟时，处理动物的平均血液葡萄糖含量为114mg/dL(s.d.4)，而对照组的含量为188mg/dL(s.d.23)。

处理动物还表现出血浆胰岛素值明显低于对照动物的(图10)。例如，在30分钟的时间点上，对照动物的胰岛素含量为7.4ng/ml(s.d.2.1)，而处理动物的胰岛素含量为4.8ng/ml(s.d.0.6)。

例8在3T3脂肪细胞中BLT刺激葡萄糖摄取

将小鼠3T3-L1细胞铺平板在每孔大约100微升生长培养基的96孔平板上，以便每孔分配大约25，000细胞。生长培养基：

DMEM，高葡萄糖，w/out L-谷氨酰胺

10％牛血清

2mM L-谷氨酰胺

1％PenStrep

1.25微克/毫升两性霉素

在铺平板之后3天通过用不同的培养基更换生长培养基诱导细胞分化成脂肪细胞。分化培养基

DMEM，高葡萄糖，w/out L-谷氨酰胺

10％FBS

2mM L-谷氨酰胺

1％PenStrep

1.25微克/毫升两性霉素

10mM Heps

0.25μM地塞米松(1微升/毫升0.25mM母液)

0.5mM IBMX(10微升/毫升50mM母液)

5微克/毫升胰岛素(1微升/毫升5毫克/毫升母液)

用通过一个流量控制器连接在箱式真空源上的8路歧管将培养基从细胞中吸出。用一个8路Matrix电子移液管将新鲜培养基分配到孔中，将其设定为最低速度，以便减少对细胞的破坏。

在第1天，将100微升分化培养基加入每一个孔中，以便开始将3T3细胞分化成脂肪细胞。在开始分化之后第3天，将所述培养基更换成含有胰岛素的分化培养基，但不含IBMX或地塞米松(胰岛素培养基)。在第6天将所述培养基再次更换成不含胰岛素、IBMX、或地塞米松的培养基(FBS)培养基。将细胞维持在FBS培养基中，每隔一天进行饲养，直到在开始分化之后15-21天能够进行葡萄糖转运试验。

例9在存在BLT的条件下在被诱导分化成脂肪细胞的3T3细胞中进行葡萄糖转运试验

按例8所述方法诱导小鼠3T3-L1细胞分化成脂肪细胞。在进行葡萄糖转运试验之前15-24小时，按如下方法处理细胞：

1．在37℃下用100毫升磷酸缓冲的盐溶液(PBS)洗涤孔两次，在两次洗涤之间进行抽吸。

2．然后，向每一个孔中添加100毫升DMEM，高葡萄糖，1％抗生素/抗真菌素溶液，2mM谷氨酰胺，0.1％BSA(加热到37℃)，0-1000nM小鼠BLT(通过固相技术合成)，和0-100nM胰岛素。这一时期是血清饥饿阶段。

3．然后，在37℃下培养细胞过夜。

在试验当天，按如下方法处理细胞：

1．除去培养基，在纸巾上吸印平板，并用100毫升KRBH缓冲液(含有Hepes的Krebs-Ringer缓冲液，pH7.4)洗涤细胞两次。

2．在去掉最终的洗涤液之后，在37℃下在100微升KRBH、含有100M葡萄糖的0.1％BSA、10微升/毫升(0.1μCi/孔)放射性标记过的2-脱氧葡萄糖(C¹⁴)和适当浓度的胰岛素中培养所述细胞1小时。

3．在用放射性标记过的葡萄糖培养之后，加入10微升10×细胞松弛素B(200μM)，终止细胞对葡萄糖的进一步摄取。

4．通过在Microbeta平板读数器上读平板的数测定放射性标记的葡萄糖摄取。结果：

该实验的结果归纳在图11中。当在摄取实验之前用BLT对脂肪细胞进行预处理时，被摄入诱导分化成脂肪细胞的3T3细胞的葡萄糖从大约3倍增加到大约6倍。

例10在有BLT的功能性片段的条件下在诱导分化成脂肪细胞的3T3细胞中进行葡萄糖转运实验

按例8方法将小鼠3T3-L1细胞诱导分化成脂肪细胞。在进行葡萄糖转运试验之前大约14-24小时，按如下方法处理细胞：

1．在37℃下用100毫升磷酸缓冲的盐溶液(PBS)洗涤孔两次，在两次洗涤之间进行抽吸。

2．然后，向每一个孔中添加100毫升DMEM、高葡萄糖、1％抗生素/抗真菌素溶液、2mM谷氨酰胺、0.1％BSA(加热到37℃)、0-1000nM小鼠或人BLT(通过固相技术合成)和0-100nM胰岛素。这一时期是血清饥饿阶段。例如，在一种实验中使用在本文中被称为序列10的人BLT片段；在另一个实验中，使用在本文中被称为序列12的人BLT片段。

3．然后，在37℃下培养细胞过夜。

在实验的当天，按如下方法处理细胞：

1．除去培养基，在纸巾上吸印平板，并用100毫升KRBH缓冲液(含有Hepes的Krebs-Ringer缓冲液，pH7.4)洗涤细胞两次。

2．在去掉最终的洗涤液之后，在37℃下在100微升KRBH、含有100M葡萄糖的0.1％BSA、10微升/毫升(0.1μCi/孔)放射性标记过的2-脱氧葡萄糖(C¹⁴)和适当浓度的胰岛素中培养所述细胞1小时。

3．在用放射性标记过的葡萄糖培养之后，加入10微升10×细胞松弛素B(200μM)，终止细胞对葡萄糖的进一步摄取。

4．通过在Microbeta平板读数器上读平板的数测定放射性标记的葡萄糖摄取。结果：

当在所述摄取实验之前用BLT的功能性片段对脂肪细胞进行预处理时，被诱导分化成脂肪细胞的3T3细胞对葡萄糖的摄取相对对照而言有所加强。

例11BLT的功能性类似物

按例10所述方法将小鼠3T3-L1细胞诱导分化成脂肪细胞。然后按例8所述方法用人BLT类似物，例如序列26-序列35处理脂肪细胞，并监测葡萄糖转运。功能性类似物表现出与天然BLT大体上相同的结果。

例12给雄性A^VY/A小鼠服用人BLT14天

按例7所述方案的剂量给雄性A^VY/A小鼠服用固相合成的人BLT。结果：

服用人BLT能显著降低雄性A^VY/A小鼠的血清胰岛素含量(参见图12和13)。

有关结果归纳在图12-13中。在为期14天的处理中，对照组和实验组的动物大约消耗4.5-6克食物，而在两组中的体重保持相同，大约为50克(数据未显示)。

为了证实用人BLT进行2周处理对血浆葡萄糖和其胰岛素含量的影响，在14天的时间之后进行口服葡萄糖耐受试验。在30分钟的时间点上，对照动物和处理动物表现出最初的血液葡萄糖含量升高，从大约80mg/dL升高到300mg/dL或更高；随后两个组表现出水平相当的葡萄糖值的降低，一直到2小时的时间点(图12)。例如，处理过的动物在30分钟的时间点上表现出平均血液葡萄糖含量为大约400mg/dL(s.d.12)，而对照的含量330mg/dL(s.d.19)。在60分钟和120分钟的时间点上也观察到较低的含量。例如，在120分钟时，处理动物的平均血液葡萄糖含量为178mg/dL(s.d.16)，而对照组的含量为202mg/dL(s.d.13)。

处理动物表现出血浆胰岛素值明显低于对照动物的(图13)。例如，在30分钟的时间点上，对照动物的胰岛素含量为14.0ng/ml(s.d.1.5)，而处理动物的胰岛素含量为10.2ng/ml(s.d.0.4)。在120分钟时间点上，对照动物的胰岛素含量为9.3ng/ml(s.d.2.3)，而处理动物的胰岛素含量为5.4ng/ml(s.d.0.9)。

例13给雄性Lep^ob/Lep^ob小鼠服用小鼠β-促脂解素

将从Jackson实验室(Bar Harbor,ME)购买的雄性Lep^ob/Lep^ob小鼠单独圈养，并自由采食5008食物和水。从尾部对小鼠放血，测定最初的葡萄糖、胰岛素、和甘油三酯值。选择小鼠用作对照，或每天两次注射小鼠β-促脂解素60微克或120微克处理。处理小鼠每天两次皮下注射60微克或120微克(每个剂量为200微升的总体积)；对照小鼠接受200微升媒介物(盐水)。在每天注射2次，在上午7点和下午3点对小鼠进行注射，共注射16天，而在第17天只在上午7点进行注射。在第0-17天清晨测定体重和食物消耗量。在第7天清晨将小鼠尾部放血，进行葡萄糖、胰岛素和甘油三酯值的测定。从第13天下午到第14天上午将所述动物禁食一夜。第14天进行口服葡萄糖耐受性试验。在上午注射之后2小时测定0时间血液葡萄糖和胰岛素。给小鼠口服25％葡萄糖溶液(100微升/10克体重)，然后在30、60、和120分钟之后放血。将所述血样用于测定葡萄糖和胰岛素。在口服葡萄糖耐受性试验之后，让小鼠自由进食。在第16天，取尾部血样，以便测定血液葡萄糖值、胰岛素、甘油三酯、和皮质酮值。在第17天，宰杀小鼠。

该实验的结果如图14所示。在为期16天的处理期间内，处理动物的血浆胰岛素值显著降低。例如，在处理的第7天，对照动物的胰岛素值大约为300ng/ml，而处理动物的测定值为大约215ng/ml，至少降低了30％。另外，在处理的第16天，处理动物的血浆胰岛素值较低(图14)。

例14给雄性Lep^ob/Lep^ob小鼠通过Alzet^TM泵服用人BLT

将从Jackson实验室(Bar Harbor,ME)购买的1月龄雄性Lep^ob/Lep^ob小鼠单独圈养，并自由采食5008食物和水。给予12小时的光照周期(从下午6点到上午6点关闭光源)。从尾部对小鼠放血，测定最初的葡萄糖、胰岛素、和甘油三酯值。处理动物接受0.24mg/天或0.48mg/天连续服用的人β-促脂解素(ER4-VBH43)，通过皮下植入Alzet^TM泵(Alza公司)服用，使得所有三个组中的平均葡萄糖和甘油三酯值相等。对照动物接受盐水溶液。对对照组来说，用盐水填充所述泵，对低剂量组来说用20毫克/毫升人β-促脂解素填充，而对高剂量组来说用40毫克/毫升人β-促脂解素填充。在植入所述泵之前用异氟烷麻醉小鼠。在第0-7天清晨测定体重和食物消耗量。在第4天上午将小鼠尾部放血，进行葡萄糖、胰岛素和甘油三酯值的测定。从第6天下午到第7天上午将小鼠禁食一夜。

第7天进行口服葡萄糖耐受性试验。将小鼠尾部放血，进行0时间胰岛素和葡萄糖测定，然后口服25％葡萄糖溶液(100微升/10克体重)，然后在30、60、和120分钟之后放血。将血样用于测定葡萄糖和胰岛素。在口服葡萄糖耐受性试验之后，让小鼠自由进食。

相应于血浆胰岛素含量的葡萄糖耐受性实验的结果如图15所示。0.24mg BLT/天的值比对照大约低25％，而0.48mg BLT/天的值比对照大约低40％(参见图15中插入曲线下面的部分)。

例15人BLT蛋白类似物的固相合成和纯化

用Fmoc化学法用一个轮次合成人BLT肽的类似物(即序列26所示的类似物)，其中，用Ala取代序列8中的Glu。由于在BLT分子的N-末端部分存在若干asp-gly二肽序列，使得BLT的合成复杂化。业已观察到asp-gly二肽序列上的天冬酰胺侧链发生碱催化环化作用，并且随后在FMOC合成中添加哌啶。通过在合成中在每一个asp-gly序列上使用Fmoc-(Fmoc-Hmb)-甘氨酸可以消除上述反应。通过用Hmb基团保护甘氨酰胺，可以抑制天冬酰胺侧链的环化作用。在裂解、脱保护、和反相HPLC纯化后，可以电喷射质谱术分析所述肽。所述BLT合成中出现的主要类型是具有预期质量的完整长度肽。使用该方法可以用一个轮次，以0.1mM的规模生产数量超过100毫克的纯化蛋白。

材料：预加样Fmoc-Glu(OtBu)Wang(用对苯氧基苄醇功能化的1％交联的聚苯乙烯)树脂，大约为0.6M氨基酸克树脂。N-甲基吡咯烷酮(NMP)、哌啶、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-甲基脲六氟磷酸(HBTU)，2M N，N，二异丙基乙基胺(DIEA)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，二氯甲烷(DCM)，二甲基甲酰胺(DMF)。

对用Fmoc-保护的C-末端氨基酸(0.1或0.25mM氨基酸)预加样的树脂进行称重，并放入反应室中。通过用DCM洗涤使所述树脂预膨胀，然后用NMP洗涤所述树脂，通过在溶解在NMP中的12-22％哌啶溶液中温育所述树脂除去N-末端Fmoc基团。在脱保护之后用NMP充分洗涤所述树脂。

将待添加到所述肽上的1 mmo1的另一个Fmoc保护的氨基酸溶解在2.1克NMP、2.0克溶解在DMF中的O.45M HBTU／HOBt制剂中。在溶解之后，通过添加3ml溶解在NMP中的2M DIEA开始氨基酸的活化。然后将活化的氨基酸添加到脱保护的树脂上，并进行连接。在交联结束之后，用NMP彻底洗涤所述树脂。然后对每一个后续的氨基酸重复完整轮次的脱保护和连接。

在所述合成中的特定轮次中的步骤如下：轮次    AA       步骤1  Ala           完全洗涤2  Gly           单连接3  Lys(Boc)      单连接4  Lys(Boc)      单连接5  Tyr(tBu)      单连接6  Ala           单连接7  Asn(Trt)      单连接8  Lys(Boc)      单连接9  Ile           单连接10 Ile           单连接11 Ala           单连接12 Asn(Trt)      单连接13 Lys(Boc)      单连接14 Phe           单连接15 Leu           单连接16 Thr(tBu)      单连接17 Val           单连接18 Leu           单连接19 Pro           双连接/Ac20封端20 Thr(tBu)      单连接21 Gln(Trt)      单连接22 Set(tBu)      单连接23 Lys(Boc)      单连接24 Glu(OtBu)     单连接25 Set(tBu)      单连接26 Thr(tBu)      单连接27 Met           单连接28 Phe           单连接29 Gly           单连接30 Gly          单连接31 Tyr(tBu)     单连接32 Arg(Pmc)     单连接33 Lys(Boc)     单连接34 Asp(OtBu)    单连接35 Lys(Boc)     单连接36 Pro          双连接/Ac20封端37 Pro          双连接/Ac20封端38 Ser(tBu)     单连接39 Gly          单连接40 Trp(Boc)     单连接41 Arg(Pmc)     单连接42 Phe          单连接43 His(Trt)     单连接44 Glu(OtBu)    单连接45 Met          单连接46 Arg(Pmc)     单连接47 Tyr(tBu)     单连接48 Pro          双连接/Ac20封端49 Gly          单连接50 Glu(OtBu)    单连接51 Asp(OtBu)    单连接52 Lys(Boc)     单连接53 Lys(Boc)     单连接54 Glu(OtBu)    单连接55 Ala          单连接56 Ala          单连接57 Val          单连接58 Leu          单连接59 Leu          单连接60 Ser(tBu)     单连接61 His(Trt)     单连接62 Glu(OtBu)    单连接63 Leu          单连接64 Asp(OtBu)    单连接65 Ala          单连接66 Gln(Trt)     单连接67 Ala          单连接68 Gly          单连接69 Ala          单连接70 Gly(Fmoc-hmb)      双连接/Ac20封端71 Asp(otBu)          单连接72 Asp(OtBu)          单连接73 Ala                单连接74 Pro                双连接/Ac20封端75 Gly(Fmoc-nmb)      双连接/Ac20封端76 Asp(OtBu)          单连接77 Pro                双连接/Ac20封端78 G1y(Fmoc-hmb)      双连接/Ac20封端79 Asp(OtBu)          单连接80 Gly                单连接81 Glu(OtBu)          单连接82 Arg(Pmc)           单连接83 Leu                单连接84 Arg(Pmc)           单连接85 Gln(Trt)           单连接86 Gly                单连接87 Thr(tBu)           单连接88 Leu                单连接89 Glu(OtBu)          单连接90                    最终脱保护

对于反应缓慢或低效率的氨基酸来说，进行2个独立的连接反应，通过用乙酸酐处理封闭所有剩余的未反应的肽，对于所述氨基酸之一的步骤的顺序是脱保护、连接反应1、洗涤、连接反应2、洗涤、Ac20封端、洗涤、脱保护。

缩略语：OtBu：叔丁基酯，tBu：叔丁基，Boc：叔丁氧基羰基，Pmc：2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基，Hmb：2-羟基-4-甲氧基苄基，Fmoc：9-芴甲氧基羰基。

例16给雄性ZDF大鼠A1zet泵服用人BLT

将从遗传学模型公司(Indianapolis，IN)购买的雄性Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠单独圈养，并自由采食5008食物和水。在5周龄时将所述大鼠禁食一夜，进行最初的口服葡萄糖耐受性实验。从尾部抽血测定0时间点上的胰岛素和葡萄糖含量，然后给所述动物口服50％的葡萄糖溶液(2．5克／公斤体重)，并在服用之后30、60、和120分钟抽血，在口服葡萄糖耐受性试验之后，让所述大鼠自由进食。在6周龄时，将所述动物分组，每组4只动物，服用人BLT。在实验的第0天，再次从尾部抽血，测定葡萄糖、胰岛素、皮质酮和甘油三酯的值。随机挑选所述大鼠为对照，通过皮下植入Alzet泵连续服用人β-促脂解素(ER4-VTA-2)0.5毫克/天或1.0毫克/天。对对照来说，用盐水填充所述泵，对低剂量组来说用20.835mg/ml人β-促脂解素填充，而对高剂量组来说用41.67mg/ml人β-促脂解素填充。在皮下植入之前37℃下在盐水中温育所述泵过夜。在第0-8天测定体重和食物消耗量。在第3天上午取样，测定葡萄糖、胰岛素、皮质酮和甘油三酯值。从第5天下午到第6天上午将大鼠禁食一夜。在第6天，进行口服葡萄糖耐受性试验，。在口服葡萄糖耐受性试验之后，让大鼠自由进食。

用于该研究的Zucker动物是2型糖尿病的良好模型。在6-7周龄时，血液葡萄糖值和甘油三酯含量升高，而胰岛素分泌降低。这些动物是抗皮质酮过多和胰岛素的。

表3．用人BLT处理的ZDF大鼠

	血液葡萄糖(mg/dl)			甘油三酯(mmol/L)
							处理(mg/dyBLT)	0	第2天	第7天	0	第2天	第7天
对照0.51.0	149151154	153160144	150±8.8150±5.5141±5.7	1.92.02.0	2.42.82.8	4.1±0.54.0±0.43.6±0.1

表3和图16中的结果表明每天服用剂量为1毫克的人BLT可以对ZDF大鼠产生明显影响。在开始OGTT 30分钟之后，对照的血浆葡萄糖含量平均为191±16毫克/dL，而BLT处理动物为172±5毫克/dL(参见图16)。在开始之后60分钟，对照动物表现出的葡萄糖含量为157±6毫克/dL，而BLT处理动物为154±8毫克/dL。

表3表明，在BLT处理动物中血液葡萄糖值保持低于对照动物，特别是在较高剂量下。在开始服用BLT第0、2、和7天，对照动物所具有的葡萄糖值为大约150毫克/dL。另一方面，用1毫克/天人BLT处理的动物在第7天平均为140毫克/dL，低于对照动物大约7％。处理动物还表现出比对照动物低大约11％的血清甘油三酯含量(表3)，这证实了BLT处理的促胰岛素作用。

例17在ZDF大鼠骨骼肌中人BLT能促进葡萄糖转运

 进行一种研究，以便确定β-促脂解素在骨骼肌中对葡萄糖转运的影响。Zucker糖尿病肥胖(ZDF/Gmi^TM-fa/fa)雄性大鼠是从遗传学模型公司获得(Indianapolis,IN)。用Purina Formulab 5008大鼠饲料(Purina Mills公司，圣路易丝，MO)维持所述大鼠，并圈养在光照受控制的空间内，给予12小时的光照和黑暗的交周期。单独圈养大鼠，并自由采食食物和水。

为了测定肌肉组织中葡萄糖的转运，通过腹膜内注射戊巴比妥钠盐(6.5毫克/100毫克体重)麻醉来自例16的动物，分离足底肌并分成两半。将每一半组织样品放在盐水中洗涤2分钟，然后在充气的(95％氧气-5％二氧化碳)含有1％BSA、8mM葡萄糖和32mM甘露糖醇的KHB中洗涤。

按如下方法进行葡萄糖转运实验。预培养

将肌组织样品转移到装有1.8毫升充气的含有1％BSA、8mM葡萄糖和32mM甘露糖醇的KHB的20毫升试管中，含或不含500nM小鼠β-促脂解素。将样品放置在摇动水浴中在室温下保持20小时，进行两次间隔的缓冲液更换。

在预培养之后，在29℃下在恒定的95％氧气-5％二氧化碳气流中洗涤肌组织样品15分钟。在含有1.8毫升添加了40mM甘露糖醇的试管中洗涤所述样品，在有(2000μU/ml)或没有胰岛素，有或没有β-促脂解素(100nM)的条件下进行。

然后在恒定的95％氧气-5％二氧化碳气流中将肌样品转移到新的试管中。所述温育培养基包括8mM 3-O-甲基-葡萄糖(OMG)、2mCi/ml³H-3-OMG、30mM甘露糖醇、0.3mCi/ml¹⁴C甘露糖醇、2mM丙酮酸、胰岛素(2000μU/ml)、和小鼠β-促脂解素。对照缺少胰岛素和/或β-促脂解素。在29℃下保持10分钟之后，冷冻控制样品，并冷冻保存直到可以进行葡萄糖转运实验。

葡萄糖转运

将肌肉削减到大约20-25毫克，在70℃下在0.5毫升1M氢氧化钾中消化30分钟。在消化之后，将样品放在冰上，并取出100微升样品进行糖原分析。向其余的0.4毫升样品中添加0.4毫升1N盐酸，并对试管进行涡旋搅拌。然后将300毫升盐酸处理的样品添加到6.4毫升闪烁液中，并在闪烁计数器上测定样品的放射性。

用¹⁴C甘露糖醇做细胞外标记，根据细胞内³H-3-OMG累积量计算葡萄糖转运。糖原含量：

向100微升上述样品中添加17微升冰醋酸和500微升0.3M乙酸钠缓冲液(Ph4.8+5毫克/毫升淀粉葡糖苷酶)。然后在37℃下温育所述试管过夜。在第2天，将50微升样品放入96孔平板上，并添加200微升Trinder试剂(Sigma 315-100；用水稀释到20微升)。在37℃下温育所述平板10分钟，并在505nm波长下测定吸收读数。

表4．用人BLT处理过的ZDF大鼠肌肉组织中的葡萄糖转运

处理             3OMG转运(μmol/克/10分钟)

对照             .085±.01

胰岛素           .080±

BLT+胰岛素       .113±.018

序列表&#60110&#62 Butler,Jon P.

        Hale,John E.

        Heath JrWilliam F.

        Schoner,Brigitte E.

        Heiman,Mark L.

        Becker,Gerald W.

        Varshavsky,Alexander D.&#60120&#62 β-促脂解素及其用途&#60130&#62 X-12139&#60140&#62&#60141&#62&#60160&#62 35&#60170&#62 PatentIn Ver.2.0&#60210&#62 1&#60211&#62 273&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：Met-Arg人BLT&#60400&#62 1atgcgtgagc tcaccggtca gcgtcttcgc gaaggtgacg gtccggacgg tccggctgac 60gacggtgctg gtgctcaggc agatctcgag cactccctgc tggttgctgc agaaaaaaaa 120gacgaaggtc cgtaccgtat ggaacacttc cgttggggtt ccccgccgaa agacaaacgt 180tacggtggtt tcatgacctc cgaaaaatcc cagaccccgc tggttaccct gttcaaaaac 240gctatcatca aaaatgcata caaaaaaggt gaa                              273&#60210&#62 2&#60211&#62 91&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：Met-Arg人BLT&#60400&#62 2Met Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp1               5                  10              15Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser

          20                  25                  30Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu

      35                  40                  45His Phe Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe

  50                  55                  60Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn65                  70                  75                  80Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu

             85                  90&#60210&#62 3&#60211&#62 23&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：融合蛋白配偶体&#60400&#62 3Met Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Ser Gly Ser Gly Ser Gly1               5                  10                  15Ser Gly Asp Asp Asp Asp Pro

         20&#60210&#62 4&#60211&#62 45&#60212&#62 DNA&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：寡核苷酸接头&#60400&#62 4tatgagatct atcgaaggtc gtgagctcac cggtcagcgt gttcg              45&#60210&#62 5&#60211&#62 114&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：BTL融合蛋白&#60400&#62 5Met Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Ser Gly Ser Gly Ser Gly1               5                  10                  15Ser Gly Asp Asp Asp Asp Pro Met Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu

          20                   25                   30Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala

      35                  40                  45Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp

  50                  55                  60Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys65                  70                  75                  80Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro

              85                  90                  95Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys

         100                  105                 110Gly Glu&#60210&#62 6&#60211&#62 331&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：GST融合配偶体&#60400&#62 6Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro1               5                  10                  15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

          20                  25                  30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

      35                  40                  45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

  50                  55                  60Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65                  70                  75                  80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

              85                   90                  95Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

         100                  105                  110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

     115                  120                  125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

 130                 135                 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp145                 150                 155                 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

             165                  170                  175Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

         180                  185                  190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

      195                 200                 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg

  210                  215                220Gly Ser Pro Gly Ile His Arg Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Glu225                 230                 235                 240Gly Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp

              245                 250                 255Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser

          260                 265                 270Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu

      275                 280                 285His Phe Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe

  290                 295                 300Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn305                 310                 315                 320Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu

            325                 330&#60210&#62 7&#60211&#62 422&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：GST/BLT融合蛋白&#60400&#62 7Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro1               5                  10                  15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

          20                   25                  30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

     35                   40                  45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

 50                   55                  60Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65                  70                  75                  80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

             85                  90                  95Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

        100                 105                 110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

     115                 120                 125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130                 135                 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp145                 150                 155                 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

            165                 170                 175Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

         180                 185                 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

      195                 200                 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg

  210                  215                 220Gly Ser Pro Gly Ile His Arg Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Glu225                 230                 235                 240Gly Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp

              245                 250                 255Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser

          260                 265                 270Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu

      275                 280                 285His Phe Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe

  290                 295                 300Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn305                 310                 315                 320Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu Met Arg Glu Leu Thr

              325                 330                 335Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro Ala Asp Asp

         340                  345                 350Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu Val Ala Ala

    355                  360                  365Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg Trp Gly

  370                 375                 380Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys385                 390                 395                 400Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile Ile Lys Asn

             405                 410                 415Ala Tyr Lys Lys Gly Glu

        420&#60210&#62 8&#60211&#62 89&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 8Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro1               5                  10                  15Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu

         20                   25                  30Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe

      35                  40                   45Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr

  50                  55                  60Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile65                  70                  75                  80Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu

             85&#60210&#62 9&#60211&#62 49&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 9Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro1               5                  10                  15Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu

         20                   25                  30Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe

     35                   40                  45Arg&#60210&#62 10&#60211&#62 40&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 10Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser1               5                  10                  15Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile Ile

         20                 25               30Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu

      35                  40&#60210&#62 11&#60211&#62 30&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 11Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg Trp Gly Ser Pro1               5                  10                  15Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys

          20                  25                  30&#60210&#62 12&#60211&#62 52&#60212&#62 PRT&#60213&#62 Homo sapiens&#60400&#62 12Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg Trp Gly Ser Pro1               5                  10                  15Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln

         20                   25                  30Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr

     35                  40                   45Lys Lys Gly Glu

 50&#60210&#62 13&#60211&#62 72&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 13Glu Leu Thr Gly Gln Arg Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu Val1               5                  10                  15Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg

          20                  25                  30Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser

      35                  40                   45Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile Ile

  50                  55                  60Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu65                  70&#60210&#62 14&#60211&#62 14&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 14Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp1               5                  10&#60210&#62 15&#60211&#62 14&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 15Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala1               5                  10&#60210&#62 16&#60211&#62 14&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 16Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu1               5                  10&#60210&#62 17&#60211&#62 14&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 17Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu Val Ala Ala1               5                  10&#60210&#62 18&#60211&#62 14&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 18His Ser Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro1               5                  10&#60210&#62 19&#60211&#62 14&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 19Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg1               5                  10&#60210&#62 20&#60211&#62 14&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 20Tyr Arg Met Glu His Phe Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp1               5                  10&#60210&#62 21&#60211&#62 14&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 21Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met1               5                  10&#60210&#62 22&#60211&#62 14&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 22Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr1               5                  10&#60210&#62 23&#60211&#62 14&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 23Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys1               5                  10&#60210&#62 24&#60211&#62 14&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 24Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile Ile Lys Asn Ala1               5                  10&#60210&#62 25&#60211&#62 12&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人&#60400&#62 25Asn Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu1               5                  10&#60210&#62 26&#60211&#62 89&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：人类似物&#60400&#62 26Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro1               5                  10                  15Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu

          20                  25                  30Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Asp Lys Tyr

      35                  40                  45Arg Tyr Ala Thr Pro Pro His Glu His Arg Tyr Ala Ala Phe Met Thr

  50                  55                  60Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile65                  70                  75                  80Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu

             85&#60210&#62 27&#60211&#62 89&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：人类似物&#60400&#62 27Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro1               5                  10                  15Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu

          20                  25                  30Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu Lys Phe

      35                  40                  45Arg Tyr Gly Ser Pro Pro Arg Glu Lys His Trp Gly Ala Trp Met Thr

  50                  55                  60Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu VaL Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile65                  70                  75                  80Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu

             85&#60210&#62 28&#60211&#62 89&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：人类似物&#60400&#62 28Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro1               5                  10                  15Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu

          20                  25                  30Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Asp His Phe

      35                  40                  45His Phe Ala Ser Pro Pro Arg Glu Lys His Tyr Gly Ala Tyr Met Thr

  50                  55                  60Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile65                  70                  75                  80Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu

             85&#60210&#62 29&#60211&#62 89&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：人类似物&#60400&#62 29Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro1               5                  10                  15Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu

          20                  25                  30Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Asp His Phe

      35                  40                  45Arg Trp Ala Ser Pro Pro Lys Glu Arg His Phe Ala Ala Tyr Met Thr

  50                  55                  60Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile65                  70                  75                  80Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu

             85&#60210&#62 30&#60211&#62 89&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：人类似物Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro1              5                   10                  15Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu

          20                  25                  30Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Asp Lys Tyr

      35                  40                  45Arg Phe Gly Thr Pro Pro Arg Glu Lys Arg Phe Ala Gly Tyr Met Thr

  50                  55                  60Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile65                  70                  75                  80Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu

             85&#60210&#62 31&#60211&#62 89&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：人类似物&#60400&#62 31Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro1               5                  10                  15Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu

          20                  25                  30Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Asp Arg Trp

      35                  40                  45Arg Trp Ala Ser Pro Pro Arg Glu Lys His Tyr Gly Ala Trp Met Thr

  50                  55                  60Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile65                  70                  75                  80Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu

             85&#60210&#62 32&#60211&#62 89&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 序列描述：人类似物&#60400&#62 32Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro1               5                  10                  15Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu

          20                  25                  30Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu Arg Trp

      35                  40                  45Lys Phe Ala Thr Pro Pro His Asp His Lys Trp Gly Gly Phe Met Thr

  50                  55                  60Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile65                  70                  75                  80Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu

             85&#60210&#62 33&#60211&#62 89&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：人类似物&#60400&#62 33Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro1               5                  10                  15Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu

          20                  25                  30Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Asp Lys Trp

      35                  40                  45Arg Trp Ala Ser Pro Pro Lys Glu His Arg Trp Gly Gly Tyr Met Thr

  50                  55                  60Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile65                  70                  75                  80Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu

             85&#60210&#62 34&#60211&#62 89&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：人类似物&#60400&#62 34Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro1               5                  10                  15Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu

          20                  25                  30Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Asp His Phe

      35                  40                  45Lys Tyr Ala Ser Pro Pro His Glu Arg His Phe Gly Ala Trp Met Thr

  50                  55                  60Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile65                  70                  75                  80Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu

             85&#60210&#62 35&#60211&#62 89&#60212&#62 PRT&#60213&#62 人工序列&#60220&#62&#60223&#62 人工序列描述：人类似物&#60400&#62 35Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro1               5                  10                  15Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu

          20                  25                  30Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu Lys Phe

      35                  40                  45Lys Trp Ala Thr Pro Pro His Glu Arg Arg Tyr Gly Ala Tyr Met Thr

  50                  55                  60Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile65                  70                  75                  80Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu

             85

Claims (39)

1．一种大体上纯的蛋白，具有选自下列一组的氨基酸序列：序列2、序列5、和序列7。

2．一种编码权利要求1的蛋白的分离的核酸化合物。

3．一种含有权利要求2的分离的核酸化合物的载体。

4．如权利要求3的载体，其中，所述分离的核酸化合物可操作地连接在一个启动子序列上。

5．一种含有权利要求4的载体的宿主细胞。

6．一种用于构建具有表达β-促脂解素的潜力的重组宿主细胞的方法，该方法包括通过任何合适的方法将权利要求5的载体导入所述宿主细胞。

7．一种在权利要求6的重组宿主细胞中表达β-促脂解素的方法，所述方法包括在适于基因表达的条件下培养所述重组宿主细胞。

8．一种药用制剂，含有β-促脂解素、其类似物或功能性片段作为活性成分，并与一种或几种药理学上可以接受的载体、赋形剂、或稀释剂组合。

9．如权利要求8的药用制剂，其中，所述β-促脂解素是人β-促脂解素。

10．β-促脂解素、其类似物或功能性片段用于治疗糖尿病或其并发症。

11．一种用于治疗哺乳动物糖尿病的方法，包括服用治疗有效量的β-促脂解素或其类似物。

12．一种用于治疗哺乳动物糖尿病的方法，包括服用治疗有效量的β-促脂解素的功能性片段。

13．如权利要求11的方法，其中，所述β-促脂解素是具有本文中序列8所示序列的人β-促脂解素。

14．如权利要求11的方法，其中，所述β-促脂解素是重组人β-促脂解素。

15．如权利要求11的方法，其中，所述糖尿病是1型或2型糖尿病。

16．如权利要求11的方法，其中，所述哺乳动物是人。

17．一种用于治疗需要治疗的患者的糖尿病并发症的方法，包括服用治疗有效量的β-促脂解素、其类似物或功能性片段。

18．一种通过服用有效量的β-促脂解素、其类似物或功能性片段降低哺乳动物血液葡萄糖水平的方法。

19．一种通过服用有效量的β-促脂解素、其类似物或功能性片段治疗需要治疗的哺乳动物的血糖过多病的方法。

20．一种通过服用有效量的β-促脂解素、其类似物或功能性片段治疗哺乳动物胰岛素过多病的方法。

21．一种通过服用有效量的β-促脂解素、其类似物或功能性片段增强哺乳动物胰岛素敏感性的方法。

22．一种用于通过一个轮次合成β-促脂解素、其类似物或片段的固相合成方法，包括以下步骤：

a)活化α-氨基或者侧链官能团被保护的氨基酸以形成活性酯；

b)将所述活化氨基酸连接到惰性固体支持物上；

c)将第二种受保护的氨基酸活化成一种酯，其中，所述第一种氨基酸的α氨基被脱保护，产生活性胺，而所述第二种活化氨基酸与所述第一种氨基酸起反应，在所述固体支持物上形成二肽；

d)重复步骤(a)-(c)；

e)从所述固体支持物上分离所述肽，并对侧链官能团脱保护；

f)从所述固体支持物上分离所述肽；和

g)通过任何合适的方法纯化所述肽；其中，

h)当BLT序列含有ser-pro-pro三肽片段时，进行pro残基的多重连接；

i)在所述连接步骤结束之后，封闭所有未反应的、脱保护的肽，以防缺失肽的链延伸；和

j)当BLT序列含有asp-gly二肽序列时，在asp残基前面的每一个甘氨酸残基上用N-α保护基团保护。

23．一种用于制备权利要求1的β-促脂解素的方法，包括：

a．用一种表达载体转化合适的宿主，其中，所述载体编码一种β-促脂解素；

b．在能表达所述β-促脂解素的条件下培养所述转化宿主；

c．通过任何合适的方法纯化所述β-促脂解素。

24．一种测定β-促脂解素活性的方法，包括以下步骤：

a)给表现出胰岛素不敏感性和较高血液葡萄糖水平的哺乳动物服用一种试验蛋白；和

b)在步骤(a)之后通过任何合适的方法测定血液葡萄糖和胰岛素水平。

25．如权利要求11的方法，其中，所述β-促脂解素选自下列一组：序列2、序列5、序列7、和序列8。

26．一种具有促胰岛素活性的肽，选自下列一组：序列9、序列10、序列11、序列12、和序列13。

27．一种具有促胰岛素活性的肽，选自下列一组：序列14、序列15、序列16、序列17、序列18、序列19、序列20、序列21、序列22、序列23、序列24、和序列25。

28．一种具有促胰岛素活性的肽，选自下列一组：序列9、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15、序列16、序列17、序列18、序列19、序列20、序列21、序列22、序列23、序列24、和序列25。

29．一种用于治疗糖尿病的方法，包括服用治疗有效量的选自下列一组的至少一种肽：序列9、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15、序列16、序列17、序列18、序列19、序列20、序列21、序列22、序列23、序列24、和序列25。

30．一种用于治疗糖尿病的方法，包括服用治疗有效量的选自下列一组的至少一种肽：序列9、序列10、序列11、序列12、和序列13。

31．一种药用制剂，含有选自下列一组的具有促胰岛素活性的肽作为活性成分：序列9、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15、序列16、序列17、序列18、序列19、序列20、序列21、序列22、序列23、序列24、和序列25。

32．一种β-促脂解素的功能性类似物。

33．一种在体外或体内具有促胰岛素活性的β-促脂解素的片段。

34．一种与序列8具有大约90-95％相同性的β-促脂解素的功能性类似物，其中，氨基酸取代选自下列一组：

1号位置上的残基可以是Glu、Ala、Asp或Gln；

2号位置上的残基可以是Leu、Ile、Val或Met；

3号位置上的残基可以是Thr、Ala、Glu、Ser、Pro或Gly；

4号位置上的残基可以是Gly、Arg、Ala、Leu、Pro或Ser；

5号位置上的残基可以是Glu、Gln、Asp、Asn或Ala；

6号位置上的残基可以是Arg、Glu、Leu、Lys、Gln或Ala；

7号位置上的残基可以是Leu、Pro、Asp、Val、Ile或Met；

8号位置上的残基可以是Arg、Glu、Ala、Tyr、Leu、Lys、Pro、Gln或Trp；

9号位置上的残基可以是Glu、Ala、Pro、Asp、Asn或Gln；

10号位置上的残基可以是Gly、Ala、Ser或Asp；

11号位置上的残基可以是Asp、Arg、Pro、Asn、Gln、Ala；Glu；

12号位置上的残基可以是Gly、Ala、Ser、或Met；

13号位置上的残基可以是Pro、Glu、Gly或Val；

14号位置上的残基可以是Asp、Glu、Asn、Gln或Gly；

15号位置上的残基可以是Gly、Ala、Ser或Glu；

16号位置上的残基可以是Pro、Gln、Leu、Gly或Glu；

17号位置上的残基可以是Ala、Asp、Ser或Gly；

18号位置上的残基可以是Asp、Glu、Gln或Asn；

19号位置上的残基可以是Asp、Glu、Asn、或Gln；

20号位置上的残基可以是Gly、Ser、或Ala；

21号位置上的残基可以是Ala、Gly、Ser、或Phe；

22号位置上的残基可以是Gly、Ala、Ser、或Lys；

23号位置上的残基可以是Ala、Phe、Thr、Gly、Ser、或Leu；

24号位置上的残基可以是Gln、Arg、Asp、Asn、Leu、或Val；

25号位置上的残基可以是Ala、Leu、Asp、Ile、Gly、Ser、或Thr；

26号位置上的残基可以是Asp、Glu、Gly、Asn、Gln、或Lys；

27号位置上的残基可以是Leu、Ala、Ile、Met、或Val；

28号位置上的残基可以是Glu、Gln、Asn、或Asp；

29号位置上的残基可以是His、Asn、Tyr、Ala、Gln、或Glu；

30号位置上的残基可以是Ser、Gly、Glu、Ala、Leu、或Asp；

31号位置上的残基可以是Leu、Ala、Val、Met、或Ile；

32号位置上的残基可以是Leu、Ala、Val、Ile、Met或Pro；

33号位置上的残基可以是Val、Ala、Glu、Leu、Ile、Met、或Arg；

34号位置上的残基可以是Ala、Ser、Pro、Glu、或Gly；

35号位置上的残基可以是Ala、Asp、Gly、Ser、或Leu；

36号位置上的残基可以是Glu、Ala、Thr、Leu、Asp、Asn、或Gln；

37号位置上的残基可以是Lys、Glu、Thr、Arg、Gln、或Asp；

38号位置上的残基可以是Lys、Arg、Gln、或Glu；

39号位置上的残基可以是Asp、Ala、Asn、Glu、Gln、或Lys；

40号位置上的残基可以是Glu、Ser、Asp、Asn、Gln、或Gly；

41号位置上的残基可以是Gly、Ala、或Ser；

42号位置上的残基可以是Pro、Gly、Ser、或Asn；

43号位置上的残基可以是Tyr、Phe、或Trp；

44号位置上的残基可以是Arg、Lys、Gln、或Glu；

45号位置上的残基可以是Met、Ile、Ser、或Val；

46号位置上的残基可以是Glu、Gln、Asp、Asn、His、Arg、或Gly；

48号位置上的残基可以是Tyr或Trp；

49号位置上的残基可以是Arg或Lys；

50号位置上的残基可以是Trp、Tyr、或Phe；

51号位置上的残基可以是Gly、Ala、Ser、或Gln；

52号位置上的残基可以是Ser、Thr、Asn、或Ala；

53号位置上的残基可以是Pro或Gly；

54号位置上的残基可以是Pro、Ala、Gly、Arg、Leu、或Thr；

55号位置上的残基可以是Lys、Arg、Gln、或Ala；

56号位置上的残基可以是Asp、Asn、Glu、Gln、Ala、Gly、或Ile；

57号位置上的残基可以是Lys、Gln、或Arg；

58号位置上的残基可以是Arg、Gln、或Lys；

59号位置上的残基可以是Tyr、Phe、或Trp；

60号位置上的残基可以是Gly、Ala、或Ser；

61号位置上的残基可以是Gly、Ala、或Ser；

62号位置上的残基可以是Phe、Tyr、或Trp；

63号位置上的残基可以是Met、Leu、Ile、或Val；

64号位置上的残基可以是Thr、Ala、Ser、或Lys；

65号位置上的残基可以是Ser、Ala、Thr、或Pro；

66号位置上的残基可以是Glu、Asp、Asn、Lys、或Gln；

67号位置上的残基可以是Lys、Arg、或Gln；

68号位置上的残基可以是Ser、Ala、Thr、或Gly；

69号位置上的残基可以是Gln、Glu、Asp、Asn、Arg、或His；

70号位置上的残基可以是Thr、Ser、Ala、或Lys；

71号位置上的残基可以是Pro、或Gly；

72号位置上的残基可以是Leu、Ile、Met、或Val；

73号位置上的残基可以是Val、Leu、Ile、或Met；

74号位置上的残基可以是Thr、Ala、或Ser；

75号位置上的残基可以是Leu、Ile、Met、或Val；

76号位置上的残基可以是Phe、Tyr、Trp、或Leu；

77号位置上的残基可以是Lys、Gln、或Arg；

78号位置上的残基可以是Asn、Asp、Glu、Gln、或His；

79号位置上的残基可以是Ala、Gly、Ser、Ile、或Val；

80号位置上的残基可以是Ile、Leu、Met、Val、或Thr；

81号位置上的残基可以是Ile、Met、Val、Thr、或Leu；

82号位置上的残基可以是Lys、Gln、或Arg；

83号位置上的残基可以是Asn、Asp、Glu、Gln、或Ser；

84号位置上的残基可以是Ala、Val、Ser、Gly、或Glu；

85号位置上的残基可以是Tyr、Phe、Trp、或His；

86号位置上的残基可以是Lys、Gln、或Arg；

87号位置上的残基可以是Lys、Gln、或Arg；

88号位置上的残基可以是Gly、Ala、或Ser；

89号位置上的残基可以是Glu、Gln、Asp、Asn、或His。

35．如权利要求34的β-促脂解素的功能性类似物，其中，所述类似物与序列8的相同性大约为95％-99％。

36．一种具有促胰岛素活性的肽，选自下列一组：序列14、序列15、序列16、序列17、序列18、序列19、序列20、序列21、和序列22。

37．如权利要求22的方法，其中，在步骤：

h)当BLT序列含有ser-pro-pro三肽片段时，进行pro和ser残基的双重连接；

i)在完成所述连接步骤之后，用一种酸酐封闭所有未反应的、脱保护的肽，以防缺失肽的链延伸。

38．如权利要求37的方法，其中，在步骤：

j)所述N-α保护包括N-α-Hmb或甲基苯甲酸酯。

39．一种与序列8至少有90％的相同性的β-促脂解素的功能性类似物。

Images