KR20010024805A - 베타-리포트로핀 및 그의 용도 - Google Patents

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마크 루이스 하이만
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피터 지. 스트링거
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Abstract

본 발명은 베타-리포트로핀에 관련된, 단리된 핵산, 벡터, 형질전환 숙주 세포, 유사체, 기능성 단편 및 융합 단백질을 제공한다. 또한 베타-리포트로핀 또는 이의 단편 및(또는) 유사체를 포함하는 제약 조성물 및 유효량의 베타-리포트로핀을 투여함으로써 당뇨병 및 이에 따른 합병증을 치료하는 방법도 제공한다.

Description

베타-리포트로핀 및 그의 용도 {Beta-lipotropin and Uses Thereof}
본 출원은 미국 가출원 제60/068,659호 (1997년 12월 23일 출원), 제60/079,857호 (1998년 3월 30일 출원), 제60/086,321호 (1998년 5월 21일 출원), 제60/091,385호 (1998년 7월 1일 출원), 제60/095,405호 (1998년 8월 5일 출원) 및 제60,103,976호 (1998년 10월 13일 출원)의 이점을 청구한다.
본 발명은 제약 및 의학 분야에 관한 것이다. 구체적으로는 베타-리포트로핀 및 이의 단편 및 유사체, 제약 제제, 이들을 사용하여 포유동물의 당뇨병 및 다른 수반되는 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
프로오피오멜라노코르틴 (POMC)은 신경내분비선 세포 내의 분비 경로로 이동되는 신경펩티드 전구체 분자이다. POMC가 특이적 엔도펩티다제의 작용으로 절단되면 부신피질자극성 호르몬 (ACTH), 베타-리포트로핀 (BLT), 베타-엔도르핀 및 멜라린생성세포 자극 호르몬 (MSH) 등의 펩티드가 생성된다. POMC를 하나 이상의 특정 펩티드로 프로세싱하는 것은 조직 및 세포 특이적 방식으로 일어난다 (M. Castro and E. Morrison, Crit. Rev. Neurobiol., 11, 35-57, 1997; Roberts, J. L. and Herbert, E., Proc Nat Acad Sci, 74, 4826 (1977); Roberts, J. L. and Herbert, E., Proc.Nat.Acad.Sci 74, 5300 (1977); Mains, et al., Proc.Nat.Acad.Sci 74, 3014 (1977)). POMC는 주로 뇌하수체선과 시상하부에서 생성된다. 뇌하수체 전엽에서 일어나는 POMC의 번역후 프로세싱에 의해서는 ACTH 및 BLT가 생성된다. 반면 뇌하수체 중엽에서의 주요 프로세싱 생성물은 α-MSH, CLIP, γ-리포트로핀, β-엔도르핀 및 β-MSH이며, 시상하부에서의 POMC는 주로 γ-MSH 및 β-엔도르핀으로 프로세싱된다.
POMC-유래 펩티드는 대사 조절 및 생리 조절에서 여러가지 중요한 역할을 수행한다. 예를 들어, 39개의 아미노산으로 이루어진 ACTH는 부신피질로부터 글루티코코르티코이드의 분비를 촉진한다. MSH는 피부의 멜라닌생성세포에 의한 멜라닌 합성을 촉진하며, 지방 대사에도 관여하는 것으로 보인다. β-엔도르핀은 BLT의 카르복실 말단 (즉, 사람 BLT 서열의 59-89 잔기)로부터 유래된 것이며, 모르핀에 대한 공지된 길항제인 날록손에 의해 길항되는 진통 효과를 갖는다. 따라서 POMC-유래 펩티드 호르몬은 생리 조절 및 대사 조절에 있어서 다양한 기능을 갖는다.
적절한 포도당 및 연료 대사작용은 POMC와 무관한 펩티드인 인슐린에 달려있다. 구체적으로 말하자면 인슐린은 글리코겐, 지방산 및 단백질 합성을 촉진하며, 해당작용도 촉진한다. 인슐린은 근육 및 지방 세포로의 포도당 진입을 촉진하는 데 결정적으로 중요하다.
인슐린 대사에 결함이 있으면 당뇨병이 유발될 수 있다. 1형 당뇨병은 연료 및 포도당 대사의 적절한 조절을 위해 외인성 인슐린의 투여가 필요하다. 반면 2형 당뇨병은 전형적으로 이 질병의 후반기까지 외인성 인슐린을 필요로하지 않는다. 포도당 및 연료 대사의 적절한 조절은 당뇨병의 효과적 관리에 필수적이다. 만약 제대로 조절되지 않는다면, 케토산혈증, 혼수, 망막증, 당뇨병성 미소혈관증, 아테롬성 경화증, 심근경색, 발작, 괴저, 과트리글리세리드혈증, 콜레스테롤과잉혈증, 심근병, 피부병증, 당뇨병성 발 증후군, 신장병증, 요로 감염, 유두 괴저, 백내장, 당뇨병성 위장병, 변비, 말초혈관병 및 심지어 죽음 등 심각하고 어쩌면 치명적이기까지한 결과가 초래될 수 있다. 이런 대부분의 경우에는 분명 지나치게 많은 인슐린과 너무 적은 인슐린 투여 사이의 정교한 균형이 깨어졌음이 분명하다. 따라서 당뇨병의 이상적 치료법은 인슐린에 대한 감수성을 개선시킴으로써 혈당량을 조절하는 것이다.
본 명세서에는 제약상 유효량의 베타-리포트로핀 및(또는) 이의 단편 및(또는) 유사체를 투여하는 것을 포함하는, 1형 및 2형 당뇨병 및 이에 수반되는 합병증을 치료 또는 예방하는 데 유효한 치료 방법 및 제약 조성물이 제시된다.
＜발명의 간략한 요약＞
본 발명은 베타-리포트로핀 (BLT), 이의 유사체, 이의 단편, 이를 코딩하는 핵산, 이의 제조 방법, BLT를 사용하여 당뇨병 및 이것에 수반되는 합병증을 치료하는 방법을 제공한다.
본 명세서에는 제약상 유효량의 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 투여함으로써, 인간을 비롯한 포유동물의 당뇨병 및 이에 수반되는 합병증을 치료하는 방법을 개시한다. 본 발명은 또한 1형 및 2형 당뇨병, 망막증, 당뇨병성 미소혈관증, 아테롬성 경화증, 심근 경색, 발작, 괴저, 과트리글리세리드혈증, 콜레스테롤과잉혈증, 심근병, 피부병증, 당뇨병성 발 증후군, 신장병증, 요로 감염, 유두 괴저, 백내장, 당뇨병성 위장병, 변비 및 말초혈관병의 치료 방법에 관한 것이다.
본 명세서에는 BLT를 대장균 (E. coli) 및 효모 (yeast)로 제조하는 방법을 개시한다. 대장균에서 BLT는 융합 단백질로 생성되어, 고농도의 염이 존재하는 상태에서 세포 용해물로부터 통상적인 정제 방법을 통해 정제될 수 있다. 상기 BLT 융합 단백질은 특이적 프로테아제를 위한 인식 부위를 포함하는데, 이는 융합 파트너를 BLT로부터 분리시키는 데 사용된다. 효모 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서는 융합 단백질이 세포로부터 분비될 때 절단되어 배양 배지로부터는 천연 BLT를 온전한 형태로 회수할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태는, 서열 2, 서열 5 또는 서열 7의 아미노산 서열을 갖는 실질적으로 순수한 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시양태는, 베타-리포트로핀을 포함하는 융합 단백질 또는 재조합 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 본 발명의 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 하나 이상의 단리된 핵산 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 본 발명의 단리된 핵산 화합물을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 본 발명의 단리된 핵산 화합물이 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 상태로 포함된 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 본 발명의 벡터를 임의의 적절한 수단에 의해 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하는, 베타-리포트로핀을 발현할 수 있는 재조합 숙주 세포의 제작 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 유전자 발현에 적절한 조건하에서 본 발명의 재조합 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 재조합 숙주 세포에서 베타-리포트로핀을 발현시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 활성 성분으로서 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 이를 위한 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 제제에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 상기 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편이 사람 베타-리포트로핀인 제약 제제에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 당뇨병 또는 이의 합병증을 치료하는 데 사용하기 위한 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 인슐린영양 활성을 갖는 BLT의 단편에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 서열 9 내지 서열 13으로 구성된 군에서 선택된 인슐린영양 활성을 갖는 펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 서열 14 내지 서열 25로 구성된 군에서 선택된 인슐린영양 활성을 갖는 펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 본원에 공개된 베타-리포트로핀 펩티드의 기능성 유사체에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 치료 유효량의 서열 9 내지 25로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩티드를 투여하는 것을 포함하는 당뇨병 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 치료 유효량의 서열 9 내지 13으로 구성된 군에서 선택된 펩티드를 투여하는 것을 포함하는 당뇨병 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 서열 9 내지 25로 구성된 군에서 선택된 인슐린영양 활성이 있는 하나 이상의 펩티드를 활성 성분으로 포함하는 제약 제제에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 치료 유효량의 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 투여하는 것을 포함하는, 인간을 비롯한 포유동물의 당뇨병 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 치료 유효량의 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 투여함으로써 포유동물의 혈당량을 낮추는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 유효량의 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 투여함으로써 과혈당증 치료가 필요한 포유동물의 과혈당증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 유효량의 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 투여함으로써 포유동물의 과인슐린혈증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 유효량의 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 투여함으로써 포유동물의 인슐린 감수성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는, 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 합성하는 고상 합성 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는,
(a) 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 코딩하는 발현 벡터로 적절한 숙주를 형질전환시키는 단계,
(b) 상기 베타-리포트로핀을 발현할 수 있는 조건하에서 상기 형질전환된 숙주를 배양하는 단계, 및
(c) 상기 베타-리포트로핀을 임의의 적절한 수단을 통해 정제하는 단계를 포함하는 베타-리포트로핀의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시양태는,
(a) (a) 인슐린 불감성 및 상승된 혈당량을 나타내는 포유동물에게 시험 단백질을 투여하는 단계 및
(b) 이 (a) 단계 이후에 혈당량 및 혈중 인슐린 농도를 임의의 적절한 수단으로 시험하는 단계를 포함하는 베타-리포트로핀 활성의 분석 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 제약상 유효량의 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 투여함으로써 포유동물에게서 1형 및 2형 당뇨병 및 이에 수반되는 합병증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
＜개념 정의＞
"유사체" 또는 "기능성 유사체"란 용어는 비변형된 BLT와 생체내 및(또는) 시험관내 생물학적 활성이 실질적으로 동일하도록 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어진 BLT의 병형태를 지칭한다.
"bid" 또는 "b.i.d."란 용어는 BLT 또는 다른 화합물의 투여량을 하루에 2회 투여한다는 것을 의미한다.
"BLT"는 베타-리포트로핀을 지칭한다. 사람 BLT는 89개의 아미노산 잔기를 포함한다 (서열 8). 사람 BLT는 다양한 유기체에서 규명되었으며, 사람, 생쥐, 양, 돼지 (Li ＆ Chung, Nature, 260, 622-24 (1976), 및 코끼리 (Li et al. Int. J. Pept. Prot. Res. 32, 573-78, 1988) 등과 그외 포유동물 등 다양한 유기체의 것의 아미노산 서열이 결정되었다. 상기 문헌은 모두 본 명세서에 언급함으로써 도입된다.
"베타-리포트로핀 융합 단백질" 또는 "BLT 융합 단백질"이란 용어는 BLT를 포함하는 일군의 하이브리드 재조합 단백질 분자로서, 대장균 또는 다른 세포 종류에서 생성되며, 특이적 단백질 가수분해 또는 화학적 절단에 의해 절단되면 BLT 또는 BLT 단편을 생성할 수 있는 분자이다. BLT 융합 단백질의 예로는 서열 2, 서열 5 및 서열 7에 기재된 것들이 있다.
본 명세서에 사용된 "상보적인" 또는 "상보성"이란 용어는 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드가 수소결합을 통해 이중가닥 핵산 분자를 형성하는 능력을 지시한다. 구아닌과 시토신, 아데닌과 티민, 아데닌과 우라실은 서로 상보성이 있는 관계이다. 본원에서 사용된 "상보적인"이란, 두 개의 단일가닥 핵산 분자의 전체 길이에 걸쳐서 이 핵산 분자들을 구성하는 실질적으로 모든 염기쌍에 상보적인 관계가 적용됨을 의미한다. "부분적으로 상보적인"이란 두 단일가닥 핵산 분자 중 하나가 다른 하나 보다 길이가 짧아 두 분자 중 어느 하나의 일부는 단일가닥으로 남아있음을 의미한다.
본원에 사용된 "합병증" 또는 "이의 합병증"이란 용어는 1형 및 2형 당뇨병 등 인슐린 대사 결함 또는 탄수화물 대사 결함, 예를 들면 포도당 대사 결함에 따르는 하나 이상의 질병 또는 증후군 또는 상태에 수반되는 상태, 증후군, 부수적인 질병(들), 가벼운 병 등을 지칭한다. 합병증의 예로는 케토산혈증, 혼수, 망막증, 당뇨병성 미소혈관증, 아테롬성 경화증, 심근경색, 발작, 괴저, 과트리글리세리드혈증, 콜레스테롤과잉혈증, 심근병, 피부병증, 당뇨병성 발 증후군, 신장병증, 요로 감염, 유두 괴저, 백내장, 당뇨병성 위장병, 변비, 말초혈관병 등이 있다.
"보존적 치환" 또는 "보존적 아미노산 치환"이란 표 1에 예시된 바와 같이 단백질 또는 펩티드에서 하나 이상의 아미노산 잔기(들)가 대체됨을 의미한다.
"이의 단편"이란, 펩티드 또는 핵산의 단편, 조각 또는 일부영역을 지칭하므로, 단편은 본래의 펩티드 또는 핵산 분자에서 인접한, 2 개 이상의 인접 아미노산, 또는 약 5 내지 14 개의 아미노산 또는 그이상, 또는 10개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진다. 그의 단편은 생물학적 활성을 보유할 수도 있고 아닐 수도 있다. 예를 들면 본원에 개시된 펩티드의 단편은 이 단편이 유래된 본래의 펩티드에 대해 특정 항원을 유발하는 항원으로서 사용될 수 있다. 핵산 분자와 관련하여 "이의 단편"이란 본래의 핵산으로부터 유래된 10 개 이상의 인접한 뉴클레오티드를 지칭하며, 또한 유전자 코드를 고려하면 상보적 서열까지도 지칭하는 것이다. 예를 들면 단편이 5'-AGCTAG-3'의 서열을 갖는다면, "그의 단편"은 또한 상보적 서열인 3'-TCGATC-5'를 포함할 것이다.
"융합 단백질"이란 용어는 번역단계의 융합 또는 효소에 의한 융합을 비롯해 자연에서는 발견되지 않는 하이브리드 단백질 분자를 말하며, 둘 이상의 상이한 단백질 또는 그의 단편이 단일 폴리펩티드 사슬 상에 공유결합을 통해 결합된다.
"융합 파트너"는 BLT 융합 단백질 중 BLT로부터 유래하지 않은 아미노산 서열로서, 그 예로는 서열 6의 서열이 있다.
본 명세서에 사용된 "기능성 단편" 또는 "기능상 등가의 단편"은 생체내 및(또는) 시험관내의 인슐린 효과를 증진시키고(거나) 생체내의 혈당 저하를 촉진하거나 생체내 세포 또는 조직으로의 포도당 흡수를 향상시키는 전체 길이 BLT의 생물학적 활성을 보유한 영역 또는 단편을 일컫는다. 기능성 단편은 또한 생체내 및(또는) 시험관내에서 전체길이 BLT에 의해 나타나는 생물학적 활성, 즉 포도당 흡수를 촉진하고(거나) 인슐린의 효과를 증진하고(거나) 인슐린 감수성을 증진시키는 능력을 제공할 수 있다. 기능성 단편은 클로닝 기술이나 화학적 합성법 또는 화학적, 효소적 절단에 의해 생성될 수 있다.
"숙주 세포"는 벡터를 형질전환 또는 형질감염 등에 의해 도입하면 벡터에 포함된 클로닝된 유전자를 번식 및(또는) 발현하는 데 적절한 모든 진핵 또는 원핵 세포를 의미한다.
"동족체" 또는 "상동성"은, 상이한 핵산 분자들 또는 상이한 아미노산 서열들이 서로 동일하거나 부분적으로 동일하고(거나) 이 분자들 내의 서열의 한 곳 이상의 블럭 또는 영역에서 유사성이 있는 경우 상기 분자들 사이의 관계를 지칭할 때 사용된다.
본원에 사용된 "혼성화"란 용어는 단일가닥 핵산 분자가 상보적 가닥과 뉴클레오티드 염기쌍 형성을 통해 결합되는 과정을 의미한다. "선택적 혼성화"란 높은 엄격도 조건에서의 혼성화를 의미한다. 혼성화도는 상동성 정도, 혼성화의 엄격도, 혼성화하는 가닥의 길이 등에 따라 달라진다.
"인슐린영양성 (insulinotropic)"이란 용어는 인슐린 불감성의 영향을 반전시키거나 완화하는 등에 의한 인슐린 증진 활성을 의미한다.
"단리된 핵산 화합물"이란 천연 상태의 위치 (예를 들면, 세포)와 위치상 별개로 떨어뜨려 놓은, 제작된 것이든 합성된 것이든 모든 RNA 또는 DNA 서열을 의미한다.
본원에 사용된 "핵산 프로브" 또는 "프로브"는 다른 핵산 화합물을 혼성화시키는 표지된 핵산 화합물이다. "핵산 프로브"는 상보성 또는 부분적으로 상보성인 단일가닥 표적 핵산 서열과 결합하여 이중가닥 분자를 형성하는 단일가닥 핵산 서열을 의미한다. 핵산 프로브는 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 중합체일 수 있다. 프로브는 통상 검출가능한 부분을 포함하게 되며, 이 부분은 프로브의 말단(들) 또는 프로브의 서열 중간에 부착될 수 있다.
"플라스미드"는 염색체외 유전자 요소를 의미한다. 본 명세서에 기재된 플라스미드는 시판되는 것이거나 비제한적인 기관으로부터 공개적으로 입수할 수 있는 것이거나 용이하게 입수할 수 있는 플라스미드로부터 공개된 절차에 따라 제작할 수 있는 것이다.
"프라이머"는 핵산 분자 등의 효소적 또는 합성적 연장을 위한 초기 기질로서 기능하는 핵산 단편이다.
"프로모터"란 용어는 전사, 예를 들면 DNA에서 RNA로의 전자를 지시하는 핵산 서열을 지칭한다. 유도성 프로모터는 탄소원, 열 또는 금속 이온과 같은 환경 신호에 의해 조절될 수 있는 프로모터이다. 구성적 프로모터 (constitutive promoter)는 대개 일정한 수준으로 작동하며, 조절이 불가능하다.
"단백질" 및 "펩티드"는 둘 이상의 아미노산 잔기가 펩티드 결합에 의해 공유결합된 것을 의미하며, 양자가 두루 상호교환되어 사용된다. 어떤 경우에는 이 용어들은 10 개 이상, 약 500 개 이하의 아미노산 잔기가 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 생체고분자를 설명하는 것이다.
본 명세서에 사용된 "재조합 DNA 클로닝 벡터"는 하나 이상의 추가 DNA 세그먼트가 도입될 수 있거나 도입된 DNA 분자를 포함하는 자가 복제가능한 플라스미드 및 파아지 등을 의미하나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "재조합 DNA 발현 벡터" 또는 "발현 벡터"란 프로모터 및 다른 조절 요소가 있어서, 단백질을 코딩할 수 있는 삽입된 DNA의 전사를 촉진할 수 있는 파아지 또는 벡터 등의 모든 재조합 DNA 클로닝 벡터를 의미한다.
용어 "엄격도"는 혼성화 조건을 의미한다. 고엄격도 조건은 상동성 염기쌍 형성을 어렵게 한다. 저엄격도 조건은 반대의 효과를 갖는다. 엄격도는 예를 들면 온도 및 염 농도에 의해 변화될 수 있다.
"저엄격도" 조건은 예를 들면 약 37 ℃ 이하의 온도와 포름아미드 농도 약 50 % 이하와 중간 내지 낮은 염 (SSC) 농도로 이루어지거나 또는 약 50 ℃ 이하의 온도와 중간 내지 높은 염 (SSPE) 농도, 예를 들면 1 M NaCl로 이루어진다.
"고엄격도" 조건은 예를 들면 약 42 ℃ 이하의 온도와 약 20 % 이하의 포름아미드 농도와 낮은 염 (SSC) 농도로 이루어지거나 또는 약 65 ℃ 이하의 온도와 낮은 염 (SSPE) 농도로 이루어진다. 예를 들면 고엄격도 조건은 0.5 M NaHPO4, 7 % 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 1 mM EDTA, 65 ℃에서의 혼성화를 의미한다 (Ausubel, F.M. et al. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, 1989; Green Inc. New York, at 2.10.3).
"SSC"는 혼성화 용액 및 세척 용액을 이룬다. 스톡 20X SSC 용액은 3 M 염화나트륨 및 0.3 M 시트르산나트륨을 포함하며, pH 7.0이다.
"SSPE"는 혼성화 용액 및 세척 용액을 이룬다. 1X SSPE 용액은 180 mM NaCl, 9 mM Na2HPO4, 0.9 mM NaH2PO4및 1 mM EDTA를 포함하며 pH 7.4이다.
단백질과 관련해서 "실질적으로 순수한"이란, 해당 단백질이 다른 단백질 분자를 비롯한 다른 세포 성분 및 비세포성분으로부터 분리되었음을 의미한다.
실질적으로 순수한 제제는 85 % 이상의 순도, 바람직하게는 약 95 % 이상의 순도를 갖는다. "실질적으로 순수한" 단백질은 본원에 언급함으로써 도입된 IMAC 단백질 정제법 (미국 특허 제4,569,794호) 등을 비롯한 적절한 방법으로 제조할 수 있을 것이다.
본 명세서에 사용된 "치료"란 용어는 증상 또는 합병증의 발병을 예방하거나, 증상 또는 합병증을 완화하거나, 질병, 상태 또는 장애를 제거하기 위해 본 발명의 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 질병, 상태 또는 장애를 물리칠 목적으로 수행되는 환자의 관리 및 보호를 의미한다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌은 모두 언급함으로써 본원에 도입된 것이다.
베타-리포트로핀은 1964년 양의 뇌하수체선으로부터 단리되었으며, 그의 1차 구조는 다음해에 보고되었다 (Li et. al. Nature, 208, 1093, 1965). 면양, 소, 양, 생쥐, 돼지, 기니피그, 쥐, 코끼리 및 사람의 BLT의 1차 구조 서열이 보고되어 있다 (See e.g. Lohmar and Li, Biochim. Biophys. Acta, 147, 381, 1967; Li and Chung, Nature, 260, 622, 1976; Drouin and Goodman, Nature, 288, 619, 1980; Li et al. Int. J. Pept. Prot. Res. 32, 573-78, 1988; Blake and Li, Proc. Nat. Acad. Sci. 80, 1556-1559, 1983; Takahashi et.al. FEBS Lett. 135, 97-102, 1981;이 문헌들은 모두 언급에 의해 본원에 도입된다). 그 서열 정보에 따르면 BLT의 카르복시 말단은 종들 사이에 매우 잘 보존되어 있다. 한편 BLT 분자의 아미노 말단부에서는 종들 간에 상당한 서열 차이가 나타난다.
본 발명은 사람 BLT (서열 8) 또는 다른 종의 BLT, 또는 이들의 기능성 단편을 포함하는 BLT 융합 단백질에 관한 것이다. BLT 융합 단백질의 예는 서열 2, 서열 5, 및 서열 7에 기재되어 있다.
BLT의 기능성 단편은 생물학적 활성, 예를 들면 당뇨병 증상을 완화시킬 필요가 있는 포유동물에 투여되면 당뇨병 증상을 완화시키거나 혈청 인슐린 농도를 감소시키고(거나) 인슐린 감수성을 증가시키고(거나) 혈당량을 낮추고(거나) 지방조직(adipose tissue) 또는 근육조직에서, 생체내 또는 시험관내에서, 시험관내에서의 지방세포 (adiocyte)에서 포도당의 흡수를 자극하는 능력을 보이는 BLT의 단편으로 간단히 판정된다. BLT의 기능성 단편은 생물학적 활성을 보유하고 (어떤 경우에는 BLT 단백질 내에서 인접한 상태로 존재하는) 둘 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 모든 단편이다. 바람직한 단편은 부분적으로 또는 전체적으로, 사람 BLT (서열 8)의 잔기 59 내지 89의 영역 또는 이와 동등한 비사람 BLT의 영역 (즉 β-엔도르핀을 코딩하는 영역) 바깥쪽의 BLT 맵핑의 인접 영역을 포함한다.
사람 BLT의 기능성 단편의 예는 본 명세서에 서열 9 내지 25로 개시되어 있다. 바람직한 단편은 서열 9 내지 12으로 지정되며, 가장 바람직한 단편은 서열 10, 서열 12 및 서열 12으로 지정된다. 어떤 경우에는 기능성 단편이 본래의 BLT에서 내부 결실이 일어난 것, 예를 들면 사람 BLT의 아미노산 잔기 7 내지 23이 결실된 서열 13을 포함할 수 있다. 기능성 단편은 당업자에게 잘 알려진 고상 화학 합성 및(또는) 재조합 DNA 기술을 통해 제조할 수 있다 (K. Struhl, "Reverse biochemistry: Methods and applications for synthesizing yeast proteins in vitro," Meth. Enzymol. 194, 520-535). 예를 들어 한 가지 방법에서는, 결실 돌연변이 세트를 BLT를 코딩하는 핵산에 가함으로써, BLT 분자의 아미노 말단 또는 카르복시 말단 중 어느 하나로부터 다양한 정도로 펩티드 코딩 영역이 결실되도록 한다. 이 방법은 또한 온전한 BLT 단백질의 카르복시 말단 및 아미노 말단 모두가 제거된, BLT 단백질의 내부 단편을 제조하는 데 사용될 수도 있다. 그러한 결실을 일으키기는 데 적절한 뉴클레아제로는 예를 들면 Bal31이나 또는 단일가닥 핵산 분자의 경우에는 멍 빈 (mung bean) 뉴클레아제가 있다. 간단히 하려면, BLT 코딩 핵산을 박테리오파아지 M13 또는 이의 동등물 등의 단일가닥 클로닝 벡터에 클로닝하는 것이 바람직하다. 필요하다면 생성된 결실 단편이 임의의 적절한 숙주 세포에서 번식 및 발현에 적합한 모든 적절한 벡터내로 서브클로닝될 수 있다.
BLT의 기능성 단편은 임의의 적절한 분석법을 통해 생물학적 활성, 예를 들면 펩티드 단편이 생체내 또는 시험관내에서 인슐린 감수성 및(또는) 세포에 의한 포도당 흡수를 촉진 또는 증진시키는 능력을 확인 및 시험할 수 있다.
BLT의 기능성 유사체는 BLT 또는 본 명세서에 개시된 펩티드 중 임의의 하나에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 역위 및(또는) 치환되어 생성될 수 있다. 치환 유사체는 일반적으로 고상 또는 재조합 기술을 통해, 하나 또는 다수의 보존적 아미노산 치환 (그 예를 표 1에 나타냄)을 가함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로 다치환의 경우에는, 어떠한 분자에서고 10개 이하의 잔기가 치환되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 1 내지 5개의 잔기가 치환되어 서열 8의 서열과 약 90 % 내지 99 %의 잔기가 동일하거나 또는 약 95 내지 99 %의 잔기가 서열 8의 서열 또는 다른 종에서 유래한 다른 적절한 BLT와 동일한 것이다.
예를 들면, 아미노산 1 내지 89 사이의 영역 내에서 하나 이상 또는 다수의 아미노산 치환을 포함하는 사람 BLT (서열 8)의 유사체는
1번 위치의 잔기가 Glu, Ala, Asp, Gln 중 하나이고,
2번 위치의 잔기가 Leu, Ile, Val, Met 중 하나이고,
3번 위치의 잔기가 Thr, Ala, Glu, Ser, Pro, Gly 중 하나이고,
4번 위치의 잔기가 Gly, Arg, Ala, Leu, Pro, Ser 중 하나이고,
5번 위치의 잔기가 Glu, Gln, Asp, Asn, Ala 중 하나이고,
6번 위치의 잔기가 Arg, Glu, Leu, Lys, Gln, Ala 중 하나이고,
7번 위치의 잔기가 Leu, Pro, Asp, Val, Ile, Met 중 하나이고,
8번 위치의 잔기가 Arg, Glu, Ala, Tyr, Leu, Lys, Pro, Gln, Trp 중 하나이고,
9번 위치의 잔기가 Glu, Ala, Pro, Asp, Asn, Gln 중 하나이고,
10번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser, Asp 중 하나이고,
11번 위치의 잔기가 Asp, Arg, Pro, Asn, Gln, Ala, Glu 중 하나이고,
12번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser, Met 중 하나이고,
13번 위치의 잔기가 Pro, Glu, Gly, Val 중 하나이고,
14번 위치의 잔기가 Asp, Glu, Asn, Gln, Gly 중 하나이고,
15번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser, Glu 중 하나이고,
16번 위치의 잔기가 Pro, Gln, Leu, Gly, Glu 중 하나이고,
17번 위치의 잔기가 Ala, Asp, Ser, Gly 중 하나이고,
18번 위치의 잔기가 Asp, Glu, Gln, Asn 중 하나이고,
19번 위치의 잔기가 Asp, Glu, Asn, Gln 중 하나이고,
20번 위치의 잔기가 Gly, Ser, Ala 중 하나이고,
21번 위치의 잔기가 Ala, Gly, Ser, Phe 중 하나이고,
22번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser, Lys 중 하나이고,
23번 위치의 잔기가 Ala, Phe, Thr, Gly, Ser, Leu 중 하나이고,
24번 위치의 잔기가 Gln, Arg, Asp, Asn, Leu, Val 중 하나이고,
25번 위치의 잔기가 Ala, Leu, Asp, Ile, Gly, Ser, Thr 중 하나이고,
26번 위치의 잔기가 Asp, Glu, Gly, Asn, Gln, Lys 중 하나이고,
27번 위치의 잔기가 Leu, Ala, Ile, Met, Val 중 하나이고,
28번 위치의 잔기가 Glu, Gln, Asn, Asp 중 하나이고,
29번 위치의 잔기가 His, Asn, Tyr, Ala, Gln, Glu 중 하나이고,
30번 위치의 잔기가 Ser, Gly, Glu, Ala, Leu, Asp 중 하나이고,
31번 위치의 잔기가 Leu, Ala, Val, Met, Ile 중 하나이고,
32번 위치의 잔기가 Leu, Ala, Val, Ile, Met, Pro 중 하나이고,
33번 위치의 잔기가 Val, Ala, Glu, Leu, Ile, Met, Arg 중 하나이고,
34번 위치의 잔기가 Ala, Ser, Pro, Glu, Gly 중 하나이고,
35번 위치의 잔기가 Ala, Asp, Gly, Ser, Leu 중 하나이고,
36번 위치의 잔기가 Glu, Ala, Thr, Leu, Asp, Asn, Gln 중 하나이고,
37번 위치의 잔기가 Lys, Glu, Thr, Arg, Gln, Asp 중 하나이고,
38번 위치의 잔기가 Lys, Arg, Gln, Glu 중 하나이고,
39번 위치의 잔기가 Asp, Ala, Asn, Glu, Gln, Lys 중 하나이고,
40번 위치의 잔기가 Glu, Ser, Asp, Asn, Gln, Gly 중 하나이고,
41번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser 중 하나이고,
42번 위치의 잔기가 Pro, Gly, Ser, Asn 중 하나이고,
43번 위치의 잔기가 Tyr, Phe, Trp 중 하나이고,
44번 위치의 잔기가 Arg, Lys, Gln, Glu 중 하나이고,
45번 위치의 잔기가 Met, Ile, Ser, Val 중 하나이고,
46번 위치의 잔기가 Glu, Gln, Asp, Asn, His, Arg, Gly 중 하나이고,
48번 위치의 잔기가 Tyr, Trp 중 하나이고,
49번 위치의 잔기가 Arg, Lys 중 하나이고,
50번 위치의 잔기가 Trp, Tyr, Phe 중 하나이고,
51번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser, Gln 중 하나이고,
52번 위치의 잔기가 Ser, Thr, Asn, Ala 중 하나이고,
53번 위치의 잔기가 Pro, Gly 중 하나이고,
54번 위치의 잔기가 Pro, Ala, Gly, Arg, Leu, Thr 중 하나이고,
55번 위치의 잔기가 Lys, Arg, Gln, Ala 중 하나이고,
56번 위치의 잔기가 Asp, Asn, Glu, Gln, Ala, Gly, Ile 중 하나이고,
57번 위치의 잔기가 Lys, Gln, Arg 중 하나이고,
58번 위치의 잔기가 Arg, Gln, Lys 중 하나이고,
59번 위치의 잔기가 Tyr, Phe, Trp 중 하나이고,
60번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser 중 하나이고,
61번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser 중 하나이고,
62번 위치의 잔기가 Phe, Tyr, Trp 중 하나이고,
63번 위치의 잔기가 Met, Leu, Ile, Val 중 하나이고,
64번 위치의 잔기가 Thr, Ala, Ser, Lys 중 하나이고,
65번 위치의 잔기가 Ser, Ala, Thr, Pro 중 하나이고,
66번 위치의 잔기가 Glu, Asp, Asn, Lys, Gln 중 하나이고,
67번 위치의 잔기가 Lys, Arg, Gln 중 하나이고,
68번 위치의 잔기가 Ser, Ala, Thr, Gly 중 하나이고,
69번 위치의 잔기가 Gln, Glu, Asp, Asn, Arg, His 중 하나이고,
70번 위치의 잔기가 Thr, Ser, Ala, Lys 중 하나이고,
71번 위치의 잔기가 Pro, Gly 중 하나이고,
72번 위치의 잔기가 Leu, Ile, Met, Val 중 하나이고,
73번 위치의 잔기가 Val, Leu, Ile, Met 중 하나이고,
74번 위치의 잔기가 Thr, Ala, Ser 중 하나이고,
75번 위치의 잔기가 Leu, Ile, Met, Val 중 하나이고,
76번 위치의 잔기가 Phe, Tyr, Trp, Leu 중 하나이고,
77번 위치의 잔기가 Lys, Gln, Arg 중 하나이고,
78번 위치의 잔기가 Asn, Asp, Glu, Gln, His 중 하나이고,
79번 위치의 잔기가 Ala, Gly, Ser, Ile, Val 중 하나이고,
80번 위치의 잔기가 Ile, Leu, Met, Val, Thr 중 하나이고,
81번 위치의 잔기가 Ile, Met, Val, Thr, Leu 중 하나이고,
82번 위치의 잔기가 Lys, Gln, Arg 중 하나이고,
83번 위치의 잔기가 Asn, Asp, Glu, Gln, Ser 중 하나이고,
84번 위치의 잔기가 Ala, Val, Ser, Gly, Glu 중 하나이고,
85번 위치의 잔기가 Tyr, Phe, Trp, His 중 하나이고,
86번 위치의 잔기가 Lys, Gln, Arg 중 하나이고,
87번 위치의 잔기가 Lys, Gln, Arg 중 하나이고,
88번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser 중 하나이고,
89번 위치의 잔기가 Glu, Gln, Asp, Asn, His 중 하나인 것으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 치환을 포함한다.
사람 BLT (서열 8)에서 추가의 특정 치환체로는
3번 위치의 잔기가 Glu,
4번 위치의 잔기가 Arg,
6번 위치의 잔기가 Gln,
7번 위치의 잔기가 Pro,
8번 위치의 잔기가 Glu, Ala, 또는 Pro,
9번 위치의 잔기가 Pro 또는 Ala,
11번 위치의 잔기가 Arg 또는 Pro,
16번 위치의 잔기가 Leu 또는 Gln,
21번 위치의 잔기가 Phe,
23번 위치의 잔기가 Thr, Leu 또는 Pro,
24번 위치의 잔기가 Arg 또는 Val,
27번 위치의 잔기가 Ala,
29번 위치의 잔기가 Asn, Tyr, 또는 Ala,
30번 위치의 잔기가 Glu,
31번 위치의 잔기가 Ala,
32번 위치의 잔기가 Ala,
33번 위치의 잔기가 Ala 또는 Glu,
34번 위치의 잔기가 Pro 또는 Ser,
35번 위치의 잔기가 Asp,
36번 위치의 잔기가 Thr 또는 Ala,
37번 위치의 잔기가 Glu,
40번 위치의 잔기가 Ser,
42번 위치의 잔기가 Ser,
44번 위치의 잔기가 Glu,
45번 위치의 잔기가 Val,
52번 위치의 잔기가 Asn,
54번 위치의 잔기가 Ala 또는 Arg,
56번 위치의 잔기가 Gly,
84번 위치의 잔기가 Val,
85번 위치의 잔기가 His이고,
89번 위치의 잔기가 His인 서열 8의 단일치환 또는 다치환이 있다.
아미노산 치환의 가능한 예
본래 잔기 치환예
ALAARGASNASPCYSGLNGLUGLYHISILELEULYSMETPHESERTHRTRPTYRVALPRO SER, GLYLYSGLN, HIS, ASP, GLUGLU, GLN, ASNSERASN, GLU, ASPASP, GLN, ASNPRO, SER, ALAASN, GLNLEU, VAL, METILE, VAL, METARG, GLN, GLULEU, ILE, VALMET, LEU, TYR, TRPTHR, ALASER, ALATYR, PHETRP, PHEILE, LEU, METGLY
서열표 설명
서열 번호 설명
1 Met-Arg-BLT 코팅하는 핵산
2 Met-Arg-BLT의 아미노산 서열
3 서열 5를 만드는 데 사용되는 융합 파트너의 아미노산 서열
4 BLT 융합체를 제작하는 데 사용되는 올리고뉴클레오티드 링커
5 BLT 융합체의 아미노산 서열
6 글루타치온-S-트랜스퍼라제 (GST) 융합 파트너
7 GST/BLT 융합 단백질
8 사람 BLT의 아미노산 서열
9 사람 BLT (1-49)
10 사람 BLT (50-89)
11 사람 BLT (38-67)
12 사람 BLT (38-89)
13 사람 BLT ( 델타 7-23)
14 사람 BLT (1-14)
15 사람 BLT (8-21)
16 사람 BLT (15-28)
17 사람 BLT (22-35)
18 사람 BLT (29-42)
19 사람 BLT (36-49)
20 사람 BLT (43-56)
21 사람 BLT (50-63)
22 사람 BLT (57-70)
23 사람 BLT (64-77)
24 사람 BLT (71-84)
25 사람 BLT (78-89)
26 BLT 유사체 (1: Glu-Ala)
27 BLT 유사체 (3:Thr-Ser)
28 BLT 유사체 (5:Gln-Glu)
29 BLT 유사체 (7:Leu-Asp)
30 BLT 유사체 (10:Gly-Ala)
31 BLT 유사체 (15:Gly-Glu)
32 BLT 유사체 (17:Ala-Gly)
33 BLT 유사체 (23:Ala-Phe)
34 BLT 유사체 (30:Ser-Glu)
35 35 BLT 유사체 (42:Pro-Ser)
유전자 단리 절차
당업자라면 BLT 또는 BLT 융합체를 코딩하는 핵산이 중합효소 연쇄반응 (PCR) 증폭 또는 신규생성(de novo) DNA 합성 등의 여러 재조합 DNA 기술을 통해 얻을 수 있음을 알 것이다 (T. Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed. Chap. 14 (1989)).
예를 들면, 서열 1의 3' 말단 및 5' 말단을 타겟으로 하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 Met-Arg-BLT의 PCR 증폭에 사용할 수 있다 (PCR Protocols: A Guide to Method and Application, Ed. M. Innis et al., Academic Press (1990)). PCR 증폭은 주형 DNA, 적절한 효소, 프라이머, 및 완충제를 포함하며, DNA 가열 사이클러 (미국 코넥티커트주 노르워크에 위치한 Perkin Elmer Cetus 제품)에서 편리하게 수행된다. 양성 결과는 아가로오스 겔 전기영동 이후에 적절한 크기의 DNA 단편 (즉, 273 bp)을 검출함으로써 결정된다.
단백질 제조 방법
본 발명의 한 실시양태는 의약물로서의 BLT 단백질의 용도에 관한 것이다.
당업자라면, 본 발명의 단백질 및 이의 단편 또는 기능성 단편이 많은 여러가지 방법, 예컨데, 고상 펩티드 합성법 등의 당업계에 공지된 화학적 방법 또는 재조합 방법으로 합성할 수 있음을 잘 알 것이다. 두 방법 모두 본원에 언급함으로써 도입되는 미국 특허 제4,617,149호에 기재되어 있다.
단백질의 고상 화학 합성법의 원리는 당분야에 잘 알려져 있으며, 이 분야의 일반적인 교과서인 문헌 (H. Dugas and C. Penney, Bioorganic Chemistry (1981) Springer-Verlag, New York, 54-92)에서 찾아볼 수 있다. 예를 들면, 어플라이드 바이오시스템즈 430A 펩티드 합성기 (미국 캘리포니아주 포스터시티에 위치한 Applied Biosystems사의 제품) 및 이 회사가 제공하는 합성 사이클을 써서 고상 방법으로 펩티드를 합성할 수 있다.
C-말단 카르복스아미드의 제조를 위해, 이중커플 프로토콜을 사용하는 순차적인 t-부톡시카르보닐 화학법을 출발대인 p-메틸 벤질히드릴 아민 수지에 적용한다. C-말단 산의 생성을 위해, 상응하는 피리딘-2-알독심 메티오디드 수지를 사용한다. 아스파라진, 글루타민 및 아르기닌을 먼저 형성된 히드록시 벤조트리아졸 에스테르를 써서 커플링시킨다. 합성이 완료된 후, 무수 불화수소가 함유된 10 % 메타크레졸을 써서 펩티드를 탈보호화하고 수지로부터 잘라낼 수 있다. 측쇄 보호기(들)의 절단 및 수지로부터의 펩티드 절단은 0 ℃ 이하에서 수행하며, 바람직하게는 -20 ℃에서 30분 수행후 0 ℃에서 30분 수행한다.
일반적으로 펩티드의 합성은 다음과 같은 일련의 단계로 구성된다. 우선 α-아미노기 (및 필요에 따라 측쇄 관능기)가 있는 아미노산을 활성화시켜 반응성 에스테르를 형성한다. 이 활성화된 아미노산을 그 활성화된 에스테르기를 통해 불활성 고체 지지체에 부착시키고, 결합된 아미노산을 철저히 세척한다. 이 단계 후 제2의 보호된 아미노산을 별도의 반응으로 에스테르로 활성화시킨다. 제1 아미노산의 α-아미노기는 탈보호되어 반응성 아민이 되며 이것과 제2 활성화된 아미노산이 반응하여 고상 지지체 상에 디펩티드를 형성한다. 이 단계의 연속적 반복을 통해 길이가 긴 펩티드를 얻는다. 합성을 완료한 후에는 이 펩티드를 고체 지지체로부터 제거하고 측쇄 관능기는 강산으로 펩티드를 처리함으로써 탈보호시킨다. 그 다음 이 펩티드를 여과를 통해 고체 지지체와 분리하며 유기 용매로 침전시키고, 당분야에 잘 알려진 여러 기술을 써서 정제한다.
이 경우에는 α-아미노 보호기가 9-플루오로에닐메틸카르보닐 (Fmoc)기이다. 측쇄 보호기는 Boc (Lys 및 Trp 잔기의 경우), Trt (Asn, His, Gln의 경우), tBu (Ser, Thr, Tyr의 경우), OtBu (Asp, Glu의 경우), 및 Pmc (Arg의 경우)가 있다. 활성 에스테르는 2-(1H-벤조-트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸 우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU)를 써서 형성한다.
α-아미노 Fmoc 보호기는 고상을 피페리딘으로 처리하여 제거한다. 이런 조건에서는 고상 연결 및 측쇄 보호기에는 영향을 주지 않으면서 Fmoc 기를 용이하게 제거할 수 있다. 초기 펩티드 사슬로 추가될 보호된 아미노기는 HBTU를 써서 활성화시킨다.
사람 BLT의 합성은 특별한 여러 가지 어려움이 있었다. 첫째는 이 펩티드의 서열이 ser-pro-pro 트리펩티드 세그먼트를 포함하고 있다는 것이다. 표준적 커플링 화학법에 의해서는 합성시 일련의 결실 오류가 발생한다. 그러한 결실은 pro 잔기를 이중커플링함으로써 최소화된다. 바람직한 실시양태에서는 이 합성을 Pro와 Ser 잔기를 이중커플링함으로써 수행한다. 또한, 커플링 단계의 완료 후에, 모든 잔류 미반응 탈보호된 펩티드는 아세트산 무수물로 차단하여, 결실 펩티드의 사슬 연장을 억제한다.
둘째로, 사람 펩티드는 3개의 asp-gly 디펩티드를 포함한다. 이들 서열은 asp 측쇄가 보호된 상태일 때조차 시클릭 이민을 형성하기 쉽다. 만일 시클릭 이민이 생성되면, 이들은 탈보호 단계에서 피페리딘과 반응하여 피페리딘 변형 펩티드를 생성시킬 수 있다. 이런 고리화는 asp 잔기 앞의 각 gly 잔기를 N-a-Hmb 보호함으로써 제거되었다 (본 명세서에 언급함으로써 도입된 Qubbell et.al. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 2343, 1994를 참조). asp-gly 디펩티드들 중 2개는 pro 다음에 온다. 이 서열의 이런 특징 및 hmb 보호된 아미노산의 더 낮은 반응성 때문에 이들 각각을 다중 커플링한 후, 아세트산 무수물로 캡핑시킨다. 바람직한 실시양태에서는 이들은 이중커플링된다.
바람직한 방법에서 펩티드는 Fmoc 화학을 사용하여 1회 운전으로 합성된다. BLT의 합성은 이 분자의 N 말단 부분에 asp-gly 디펩티드 서열이 여럿 존재하기 때문에 복잡해 진다. asp-gly 디펩티드 서열들 중에서 아스파티딜 측쇄는 염기에 의해 촉매되는 고리화에 이어 FMOC 합성 중에 피페리딘과 합쳐지는 것으로 관찰된 바 있다. 이 반응은 합성시 각 asp-gly 서열마다 Fmoc-(FmocHmb)-글리신을 사용함으로써 제거된다. 글리시딜 아미드를 Hmb 기로 보호하면 아스파티딜 측쇄의 고리화가 억제된다. 절단, 탈보호, 역상 HPLC 정제 이후에, 펩티드는 전기분무 질량 분광법으로 분석한다. BLT의 이런 합성에서 관찰된 주요 종류는 예상 질량을 갖는 전체길이 펩티드였다. 이 방법을 사용하면 0.1 mmol 규모에서 1회 운전으로 100 mg이 넘는 양의 순수한 단백질의 제조가 가능했다.
본 발명의 단백질은 또한 재조합 DNA 방법으로도 합성할 수 있다. BLT 또는 BLT 융합체 (즉, 서열 1)를 코딩하는 클로닝된 핵산을 당업자에게 잘 알려진 여러 적절한 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 이를 위해 당업자에게 잘 알려진 적절한 수단으로 숙주 세포에 BLT 코딩 핵산을 도입한다. 염색체 통합 방법도 본 발명의 범위에 포함되지만, 염색체외로 유지되는 적절한 발현 벡터에 서열을 클로닝함으로써 BLT 유전자의 코딩 영역을 구성적 또는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결시키는 것이 바람직하다.
BLT 단백질의 재조합 제조에서 기본적인 단계는
(a) BLT 또는 이의 융합 단백질을 코딩하는 천연, 합성 또는 반합성 DNA를 제작하는 단계,
(b) 상기 DNA를 상기 단백질을 발현시키는 데 적절한 방식으로 발현 벡터 내로 통합시키는 단계,
(c) 상기 벡터를 적절한 진핵 또는 원핵 숙주 세포 내로 도입하거나 형질전환시켜서 재조합 숙주 세포를 생성하는 단계,
(d) 상기 단백질을 발현시킬 수 있는 방식으로 상기 숙주 세포를 배양하는 단계 및
(e) 상기 단백질을 임의의 적절한 수단을 통해 회수하고 실질적으로 정제하는 단계가 있다.
원핵 및 진핵 숙주 세포에서의 재조합 BLT 융합 단백질의 발현
사람 베타-리포트로핀 (BLT)은 89개의 아미노산으로 이루어진 호르몬으로서, 뇌하수체에서 전구체 단백질 형태로 생성된 후, BLT를 비롯한 여러 생체활성 호르몬을 생성시키는 번역후 프로세싱을 거친 것이다. BLT는 작고 단백질 가수분해 민감성 부위를 갖고 있어서, 본 발명자들은 초기에는 화학적 합성을 통해 이 단백질을 제조했다. 그러나 이 방법은 다량 생산에는 유용하지 못하다. 본 발명에서는 세균 또는 진균 발현 숙주에서 융합 단백질의 형태로 BLT를 제조하는 방법을 설명한다. 이들 융합 단백질은 단백질 가수분해로부터 보호되며, 하기의 방법을 통해 온전한 BLT의 회수가 가능하다.
대장균에서 BLT는, 통상적인 정제 방법에 의해 높은 염 농도 상태에서 세포 용해물로부터 회수될 수 있는 융합 단백질로서 제조된다. 이 융합 단백질은 BLT로부터 융합 파트너를 분리하는 데 사용되는 특이적 프로테아제를 위한 인식 부위를 포함한다. 피치아 파스토리스에서 융합 단백질은 세포로부터 분비될 때 천연 BLT가 배양 배지로부터 검출 및 회수될 수 있는 방식으로 절단된다.
이 방법은 BLT의 제조 방법을 제공한다. 화학적 합성과 달리 여기에 기재된 방법은 규모를 키워 BLT를 대량 생산할 수 있다.
재조합 BLT 단백질을 제조하는 데 원핵생물을 사용할 수 있다. 예를 들면 대장균 (Escherichia coli) K12 균주 294 (ATCC No. 31446)가 원핵 세포에서의 외래 단백질의 발현에 특히 유리하다. 대장균의 다른 균주, 고초균(Bacillus subtilis)과 같은 간균속(bacilli), 쥐티프스균 (Salmonella typhimurium) 또는 영균 (Serratia marcescans) 등의 장내세균과, 여러 슈도모나스 종 및 그외 스트렙토미세스 (Streptomyces) 등의 다른 세균도 본 발명의 재조합 단백질의 클로닝 및 발현에 숙주 세포로서 사용할 수 있다.
원핵세포에서 유전자의 발현을 유도하기에 적합한 프로모터 서열은 β-락타마제 (예를 들면, 벡터 pGX2907, ATCC 39344, 레플리콘 및 β-락타마제 유전자를 포함), 락토오스 시스템 (Chang et al., Nature (London), 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature (London), 281:544 (1979)), 알칼리성 포스파타제, 및 trp 프로모터의 조절하에 trpE 융합 단백질로서 오픈 리딩 플레임의 발현을 촉진하도록 설계된 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (벡터 pATH1 (ATCC 37695)) 등이 있다. tac 프로모터 등의 하이브리드 프로모터 (플라스미드 pDR540, ATCC-37282로부터 단리될 수 있음)도 T7 프로모터와 마찬가지로 적절하다. 뉴클레오티드 서열이 일반적으로 알려진 그외 다른 세균 프로모터도 임의의 필요한 제한 부위를 제공하는 링커 또는 어댑터를 사용하여 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA에 라이게이션될 수 있다. 세균계에서 사용되는 프로모터는 또한 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인 달가르노 서열을 포함할 것이다. 이들 예는 이것으로 국한되는 것이라기 보다는 단지 예에 불과하다.
본 발명의 단백질은 직접 발현에 의해 합성되거나 효소적 또는 화학적 절단에 의해 융합 파트너가 제거될 수 있는 융합 단백질로서 합성될 수 있다. 원칙적으로 본 발명은 세균 숙주 또는 진균 숙주에서 발현될 수 있는 모든 융합계에 적용된다. 적절한 융합계의 한 실시양태에서 인식 부위는 BLT와 융합 파트너 사이에 위치하며, 이때 예를 들면 융합 파트너는 BLT의 아미노 말단에 놓인다. 적절한 위치는 프로테아제의 인식 서열, 또는 화학적 절단에 민감한 부위가 될 수 있다.
적절한 세균성 융합 파트너의 예로는 글루타치온-S-트랜스퍼라제, 말토오스 결합 단백질, 프로카르복시펩티다제, 칼모듈린 결합 단백질 또는 융합 단백질의 고수준 발현을 촉진하는 임의의 아미노 말단 위치 서열을 들 수 있다.
적절한 프로테아제의 예로는 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나아제를 들 수 있다. 화학적 절단을 위한 작용제로는 브롬화시아노겐, 산 등을 들 수 있다.
진균계에서 유용한 융합 파트너의 예로는 알파 접합 인자, 프로펩티드, 사람 혈청 알부민, 및 융합 단백질의 발현 및 분비와 그에 연이은 절단 (분비 동안)를 촉진시켜서 천연 BLT를 배양 배지로 분비되게 하는 임의의 다른 서열을 들 수 있다.
한 방법에서, BLT 융합 단백질은 천연 BLT 분자의 아미노 말단에서 디펩티드 (즉, Met-Arg)와 융합된 천연 BLT 서열을 포함한다 (예: 서열 2). 이 융합 분자의 디펩티드 파트너는 카텝신 C로 처리함으로써 떼어낼 수 있으며, 천연 BLT 분자는 당업계에 공지된 기술, 예컨데 HPLC에 의해 정제할 수 있다. 재조합 BLT 융합 단백질을 제조하는 또다른 방법에서는 글루타치온-S-트랜스퍼라제 (GST)를 본질적으로, 본 명세서에 언급됨으로써 도입된 문헌 (Smith and Johnson, Gene, 67, 31, 1988)에 기재된 바와 같이 융합 파트너로서 사용하여, 본 명세서에 서열 7로 지정된 단백질을 생성할 수 있다.
재조합계에서의 특정 펩티드의 제조에 있어서는 융합 단백질로서 발현되는 것이 수명이 길어지고, 원하는 펩티드의 수율이 증가되며, 단백질 정제가 용이한 경우가 종종 있다. 이는 포유동물 단백질을 원핵 숙주에서 발현시킬 때 특히 잘 들어맞는다. 폴리펩티드의 특정 부위를 절단하는 펩티다제 (예를 들면, 엔테로키나아제 및 트롬빈) 또는 펩티드 사슬의 아미노 또는 카르복시 말단을 절단하는 펩티다제 (예를 들면, 디아미노펩티다제) 등 다양한 펩티다제가 공지되어 있다. 더욱이 특정 화합물 (예를 들면, 브롬화 시아노겐)은 폴리펩티드 사슬을 특정 위치에서 절단할 것이다. 당업자라면 아미노산 서열 (및 재조합 방법이 사용되는 경우에는 합성 또는 반합성 코딩 서열)에 필요한 변형을 통해 부위 특이적 내부 절단 위치를 도입할 수 있음을 이해할 것이다 (P. Carter, "Site Specific Proteolysis of Fusion Proteins", Chapter 13, in Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large Scale Processes, American Chemical Society, Washington, D.C. (1990))
원핵생물 말고도, 개구리 난모세포 등의 다양한 양서류 발현계 및 포유동물 세포계를 사용할 수 있다. 특정 숙주 세포의 선택은 어느 정도까지는 사용되는 특정 발현 벡터에 달려있다. 본 발명에 사용되기에 적절한 포유동물 숙제 세포의 예로는 HepG-2 (ATCC HB 8065), CV-1 (ATCC CCL 70), LC-MK2(ATCC CCL 7.1), 3T3 (ATCC CCL 92), CHO-K1 (ATCC CCL 61), HeLa (ATCC CCL 2), RPMI8226 (ATCC CCL 155), H4IIEC3 (ATCC CCL 1600), C127I (ATCC CCL 1616), HS-술탄 (ATCC CCL 1484), 및 BHK-21 (ATCC CCL 10)를 들 수 있다.
포유동물 숙주 세포를 형질전환시키는 데에는 아주 다양한 벡터들이 적합하다. 예를 들면 pSV2형 벡터는 전사 및 폴리아데닐화에 필요한, 유인원 바이러스 (SV 40)의 세그먼트를 포함한다. pSV2-gpt, pSV2-neo, pSV2-dhfr, pSV2-hyg, 및 pSV2-b-글로빈 등 SV40 프로모터가 삽입된 유전자의 전사를 유도하는 많은 수의 플라스미드 pSV2형 벡터가 제작된 바 있다. 이들 벡터들은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 20852 메릴랜드주 록크빌 파크론 드라이브 12301) 또는 노던 리져널 리서치 라보라토리 (NRRL) (미국 61604 일리노이주 페오리아 노쓰 유니버시티 스트리트 1815) 등의 공급처로부터 널리 입수할 수 있다.
포유동물 세포에서의 발현에 적절한 프로모터로는 SV40 후기 프로모터, 진핵생물 유전자의 프로모터, 예컨데 에스트로겐 유도성 닭 난알부민 유전자, 인터페론 유전자, 글루코코르티코이드-유도성 티로신 아미노트랜스퍼라제 유전자, 티미딘 키나아제 유전자 프로모터, 및 아데노바이러스 주요 전기 및 후기 유전자의 프로모터를 들 수 있다.
벡터로 포유동물 세포를 형질감염시키는 것은 프로토플라스트 융합, 인산칼슘 공침전법, 전기천공법 등을 비롯한 (그러나 이것으로 한정되는 것은 아닌) 많은 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다 (Maniatis et al의 앞의 문헌 참조).
몇몇 바이러스로도 적절한 벡터를 만들 수 있다. 그 예로는, 본 명세서에 언급됨으로써 도입된 미국 특허 제4,775,624호에 기재된 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 우두 바이러스, 허피스 바이러스, 바쿨로바이러스, 및 라우스 육종 바이러스 등을 들 수 있다.
효모 및 그외 진균류 등의 진핵 미생물도 적절한 숙주 세포가 된다. 효모인 맥주효모균 (Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)가 바람직한 진핵 미생물이다. 클루이베로미세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) 등의 다른 효모도 적절하다. 사카로미세스에서의 발현을 위해서는 예를 들면 플라스미드 YRp7 (ATCC-40053)가 사용될 수 있다. 이에 관해서는 문헌(L. Stinchcomb et al., Nature, 282, 39 (1979); J. Kingsman et al., Gene, 7, 141 (1979); S. Tschemper et al., Gene, 10, 157 (1980))를 참조한다. 플라스미드 YRp7은 TRP1 유전자를 포함하는데, 이 유전자는 trp1 영양요구성 돌연변이체에서 사용되는 선택 마커이다.
본 발명의 다른 실시양태는 BLT 또는 이의 단편을 코딩하는 단리된 핵산 서열을 포함한다. 당업자라면 본 발명의 아미노산 서열이 다수의 상이한 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있음을 이해할 것이다. 이런 대체 핵산 서열들은 여전히 동일한 아미노산 서열을 코딩하므로, 본 발명에서는 그러한 대체 핵산 서열로 포함한다.
본 발명의 BLT 코딩 핵산은 또한 화학 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 핵산의 합성은 당분야에 잘 알려져 있다. 이와 관련해서는 문헌 (E.L. Brown, R. Belagaje, M.J. Ryan, and H.G. Khorana, Methods in Enzymology, 68:109-151 (1979))를 참조한다. BLT에 상응하는 DNA 서열의 단편은 통상적인 DNA 합성 기기, 예를 들면 포스포아미다이트 화학법을 사용하는 어플라이드 바이오시스템스 모델 380A 또는 380B DNA 합성기 (미국 94404 캘리포니아주 포스터시티 링컨 센터 드라이브 850에 위치한 Applied Biosystems, Inc. 제품)를 사용하여 제조할 수 있으며, 그 후 이런 단편의 라이게이션을 통해 전체 유전자를 재구성한다. 이와 달리는 포스포트리에스테르 화학법을 활용하여 본 발명의 핵산을 합성할 수 있다 (M.J. Gait, ed., Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, (1984)).
벡터
본 발명의 또다른 면은 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 DNA 클로닝 벡터 및 발현 벡터에 관한 것이다. 바람직한 핵산 벡터는 DNA를 포함하는 것이다. 가장 바람직한 재조합 DNA 벡터는 서열 1의 단리된 DNA 서열을 포함한다.
당업자라면 가장 적절한 클로닝 벡터 또는 발현 벡터의 선정이, 제한 효소 부위의 이용가능성, 이 벡터에 의해 형질감염 또는 형질전환될 숙주 세포의 종류, 형질감염 또는 형질전환의 목적 (예를 들면 염색체외 요소로서의 안정한 형질전환인지 숙주 염색체에 통합시키는 것인지), 용이하게 분석 또는 선택되는 마커의 존재 여부 (예를 들면, 한 종류 및 다른 종류의 항생제 저항성 및 물질대사 마커), 숙주세포에서의 원하는 유전자 복제수 등을 비롯한 많은 요인에 따라 달라짐을 잘 알 것이다.
본 발명의 핵산을 운반하기에 적절한 벡터로는 RNA 바이러스, DNA 바이러스, 용해성 박테리오파아지, 용원성 박테리오파아지, 스테이블 박테리오파아지, 플라스미드, 바이로이드 등이 있다. 가장 바람직한 벡터는 플라스미드이다.
발현 벡터를 제조할 경우, 당업자라면 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터 중 어느 것을 사용할 것인가와 같은 다양한 변수를 고려해야 함을 이해할 것이다. 또한 실험수행자들은 제조되어야 할 핵산 또는 단백질의 양에 따라 발현계의 선택이 어느 정도 좌우된다는 것을 잘 알 것이다. 프로모터 서열과 관련해서는, 유도성 프로모터가 바람직한데, 이것에 작동가능하게 연결된 유전자의 조절가능하고 높은 수준의 발현이 가능하기 때문이다. 당업자라면 탄소원, 금속 이온 및 열 등의 다양한 유도인자에 대해 반응하는 적절한 많은 프로모터를 알고 있을 것이다. 발현 벡터와 관련해서 다른 필요한 고려 사항으로는 재조합 단백질의 위치지정을 위한 서열을 포함시킬 것인가의 문제이다. 예를 들면 유전자의 코딩 영역 앞에 오는 신호 펩티드를 코딩하는 서열이 생성되는 폴리펩티드의 세포외 방출을 유도하는 데 유용하다.
본 발명은 또한 BLT를 코딩하는 단리된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키거나 또는 이와 달리 숙주세포에 도입하는 것을 포함하는, BLT 단백질을 발현할 수 있는 재조합 숙주 세포의 제작 방법도 제공한다. 바람직한 숙주 세포는 외생적으로 도입된 유전자 또는 단백질의 고수준 발현에 적합한 모든 세포이다. 형질전환된 숙주 세포는 재조합 BLT가 발현되도록, 당업자에게 잘 알려진 조건에서 배양시킬 수 있다.
본 발명은 또한 인슐린 대사작용 또는 탄수화물 대사작용의 결함에 따른 질병 또는 상태, 예컨데 과혈당증, 과인슐린혈증, 1형 및 2형 당뇨병 및 이에 수반되는 합병증에 걸린 사람 및 그외 포유동물을 치료하는 방법도 제공한다. 이 방법은 치료가 필요한 유기체에게 유효량의 BLT 단백질 또는 펩티드, 또는 BLT를 포함하는 융합 단백질, 또는 이들의 기능성 단편, 또는 이의 유사체를 체중 1 kg 당 약 1 내지 1000 ug의 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 이 방법을 수행할 때 BLT는 하루에 일회 투여, 또는 수회 투여하거나, 신체에 이식되거나 신체에 부착된 기계적 펌프 디바이스를 통해 연속 또는 불연속 투여할 수 있다. BLT 또는 관련 단백질 또는 펩티드의 투여량은 의사가 결정할 것이며, 치료할 상태, 증상 또는 질병의 성질 및 증세, 환자의 나이 및 전반적 건강 상태 등의 요인에 따라 달라질 것이다.
본 발명은 또한 활성성분으로서 BLT 단백질 또는 이의 기능성 단편 또는 이의 유사체, 예를 들면 서열 8의 단백질, 또는 이의 제약상 허용가능한 무독성염을 제약상 허용가능한 고체 담체 또는 액체 담체와 함께 포함하는 제약 조성물도 제공한다. 바람직하게는 제약상 허용가능한 염 형태의 단백질이 당뇨병 또는 이의 합병증의 치료 또는 예방적 처치를 위해 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 예를 들면 서열 8의 화합물 또는 다른 BLT 또는 이의 단편을 통상적인 제약 담체 및 부형제와 함께 혼합할 수 있다. BLT 단백질을 포함하는 조성물은 약 0.1 내지 90 중량%의 단백질을 바람직하게는 가용성 형태로 포함하며, 더 일반적으로는 약 10 내지 30 중량%를 포함한다. 또한 본 발명의 단백질은 단독으로 투여되거나 또는 항당뇨병제 또는 당뇨병 치료에 유용한 그외 작용제와 함께 투여할 수 있다.
정맥내 (IV) 투여용인 경우 BLT 단백질 또는 이의 단편 또는 유사체는 통상적으로 사용되는 정맥내 유체에 담겨져 주입에 의해 투여된다. 그러한 유체로는 예를 들면 생리식염수, 링거 용액 또는 5 % 덱스트로오스 용액이 사용될 수 있다.
근육내 제제의 경우에는 멸균 제제, 바람직하게는 히드로클로라이드염 등의 BLT 단백질의 적절한 가용 염 형태를 발열원이 없는 물 (증류수) 등의 제약 희석제에 용해시켜 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물의 적절한 불용성 형태는 수성 기재 또는 제약상 허용가능한 오일 기재, 예컨데 에틸 올레에이트와 같은 장쇄 지방산의 에스테르 중의 현탁제로서 제조되어 투여될 수 있다.
다음의 실시예로써 본 발명 및 BLT의 당뇨병 치료 용도를 더욱 상세히 설명한다. 당업자라면 여기에 기재된 구체적인 시약, 장치 및 절차는 단지 예시를 위한 것이지 본 발명의 범위를 어떤 식으로도 제한하지 않음을 이해할 것이다.
＜실시예 1＞
사람 BLT 단백질의 고상 합성 및 정제
사람 BLT 펩티드(서열 8)를 Fmoc 화학을 이용한 1회 운전으로 합성하였다. BLT의 합성은 이 펩티드의 N-말단에 Asp-Gly 디펩티드 서열이 있어서 복잡하다. Asp-Gly 디펩티드 서열의 아스파티딜 측쇄는 FMOC 합성 중에 염기에 의해 촉매되는 고리화에 이어 피페리딘과 합쳐지는 것으로 관찰되었다. 합성시 각각의 Asp-Gly 서열에 Fmoc-(FmocHmb)-글리신을 사용하여 이런 반응을 제거하였다. Hmb기로 글리신의 아미드를 보호하면 아스파티딜 측쇄의 고리화 반응이 억제된다. 절단, 탈보호화 및 역상 HPLC 정제 후에, 전기분무 질량 분광법에 의해 펩티드를 분석할 수 있었다. 합성시 주로 나타나는 종류는 예상 질량을 갖는 전체 길이의 펩티드였다. 상기 방법을 사용함으로써, 0.1 mmol 규모의 1회 운전에서 100 mg가 넘는 정제된 단백질을 얻었다.
재료: 수지 1g당 약 0.6 mmol의 아미노산 용량으로 미리 로딩된 Fmoc-Glu (OtBu) Wang (p-벤즈옥시벤질 알코올로 관능화된 1% 가교 폴리스티렌) 수지. N-메틸피롤리돈(NMP), 피페리딘, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), 2M N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA) 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 디클로로메탄(DCM), 디메틸포름아미드(DMF).
Fmoc로 보호된 C-말단 아미노산 (0.1 또는 0.25 mmol의 아미노산)과 함께 미리 로딩된 수지의 중량을 측정하고 반응기에 넣었다. 상기 수지는 DCM 세척에 의해 미리 부풀려져 있었다. 이어서, 수지를 NMP로 세척하였다. 상기 수지를 NMP 중의 18 내지 22% 피페리딘 용액에서 인큐베이션하여 N-말단의 Fmoc기를 제거하였다. 탈보호화 이후에, 수지를 NMP로 집중 세척하였다.
펩티드에 가할 다음 1 mmol의 Fmoc-보호 아미노산을 DMF 중의 NMP 2.1g 및 2.0 g의 0.45M HBTU/HOBt 시약에 용해시켰다. 용해시킨 후에, NMP 중의 2M DIEA 3 ml을 가하여 아미노산을 활성화시켰다. 이어서, 활성화된 아미노산을 탈보호된 수지에 가하여 커플링시켰다. 커플링이 완료된 후, 수지를 NMP로 집중 세척하였다. 탈보호화 및 커플링의 완전한 주기를 각각의 후속 아미노산에 대해 반복하였다.
합성에서 특이적인 주기 단계는 하기와 같다.
주기 아미노산 단계
1 Glu(OtBu) 완전한 세척
2 Gly 단일 결합
3 Lys(Boc) 단일 결합
4 Lys(Boc) 단일 결합
5 Tyr(tBu) 단일 결합
6 Ala 단일 결합
7 Asn(Trt) 단일 결합
8 Lys(Boc) 단일 결합
9 Ile 단일 결합
10 Ile 단일 결합
11 Ala 단일 결합
12 Asn(Trt) 단일 결합
13 Lys(Boc) 단일 결합
14 Phe 단일 결합
15 Leu 단일 결합
16 Thr(tBu) 단일 결합
17 Val 단일 결합
18 Leu 단일 결합
19 Pro 이중 결합/Ac20 cap
20 Thr(tBu) 단일 결합
21 Gln(Trt) 단일 결합
22 Ser(tBu) 단일 결합
23 Lys(Boc) 단일 결합
24 Glu(OtBu) 단일 결합
25 Ser(tBu) 단일 결합
26 Thr(tBu) 단일 결합
27 Met 단일 결합
28 Phe 단일 결합
29 Gly 단일 결합
30 Gly 단일 결합
31 Tyr(tBu) 단일 결합
32 Arg(Pmc) 단일 결합
33 Lys(Boc) 단일 결합
34 Asp(OtBu) 단일 결합
35 Lys(Boc) 단일 결합
36 Pro 이중 결합/Ac20 cap
37 Pro 이중 결합/Ac20 cap
38 Ser(tBu) 단일 결합
39 Gly 단일 결합
40 Trp(Boc) 단일 결합
41 Arg(Pmc) 단일 결합
42 Phe 단일 결합
43 His(Trt) 단일 결합
44 Glu(OtBu) 단일 결합
45 Met 단일 결합
46 Arg(Pmc) 단일 결합
47 Tyr(tBu) 단일 결합
48 Pro 이중 결합/Ac20 cap
49 Gly 단일 결합
50 Glu(OtBu) 단일 결합
51 Asp(OtBu) 단일 결합
52 Lys(Boc) 단일 결합
53 Lys(Boc) 단일 결합
54 Glu(OtBu) 단일 결합
55 Ala 단일 결합
56 Ala 단일 결합
57 Val 단일 결합
58 Leu 단일 결합
59 Leu 단일 결합
60 Ser(tBu) 단일 결합
61 His(Trt) 단일 결합
62 Glu(OtBu) 단일 결합
63 Leu 단일 결합
64 Asp(OtBu) 단일 결합
65 Ala 단일 결합
66 Gln(Trt) 단일 결합
67 Ala 단일 결합
68 Gly 단일 결합
69 Ala 단일 결합
70 Gly(Fmoc-hmb) 이중 결합/Ac20 cap
71 Asp(OtBu) 단일 결합
72 Asp(OtBu) 단일 결합
73 Ala 단일 결합
74 Pro 이중 결합/Ac20 cap
75 Gly(Fmoc-hmb) 이중 결합/Ac20 cap
76 Asp(OtBu) 단일 결합
77 Pro 이중 결합/Ac20 cap
78 Gly(Fmoc-hmb) 이중 결합/Ac20 cap
79 Asp(OtBu) 단일 결합
80 Gly 단일 결합
81 Glu(OtBu) 단일 결합
82 Arg(Pmc) 단일 결합
83 Leu 단일 결합
84 Arg(Pmc) 단일 결합
85 Gln(Trt) 단일 결합
86 Gly 단일 결합
87 Thr(tBu) 단일 결합
88 Leu 단일 결합
89 Glu(OtBu) 단일 결합
90 최종 탈보호화
느리게 또는 비효율적으로 반응하는 아미노산을 위해, 두 가지 별도의 커플링 반응을 수행하였다. 아세트산 무수물로 처리하여 잔류 미반응 펩티드를 모두 차단했다. 상기 아미노산 중 하나에 대한 반응 단계의 순서는 탈보호화, 커플링 반응 1, 세척, 커플링 반응 2, 세척, Ac20 cap, 세척, 탈보호화이다.
약어: OtBu: t-부틸 에스테르, tBu: t-부틸, Boc: t-부톡시카르보닐, Pmc: 2,2,5,7,8-펜타메틸크로마-6-술포닐, Hmb: 2-히드록시-4-메톡시벤질, Fmoc:9-플루오레닐메톡시카르보닐.
＜실시예 2＞
BLT를 코딩하는 합성 유전자의 제작
문헌(Maniatis et. al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982))에 기재된 바와 같은 표준 클로닝 방법을 사용하여 플라스미드를 제작하였다. 효소 및 다른 시약은 미국 메릴랜드주 게티스버그에 위치한 기브코사(Gibco-BRL) 또는 미국 01915 매사추세츠주 비버리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs)으로부터 수득하였다. 본 발명에 사용된 다양한 올리고뉴클레오티드 및 DNA 단편를 절단하고, 확인하고, 회수하며, 정제하는 방법은 당업계 숙련자에게 공지되어 있고, 상기 서열을 벡터에 라이게이션시키고, 숙주 미생물을 형질전환하며, 플라스미드 DNA 및 재조합 단백질이 생성되도록 상기 숙주 미생물을 배양하는 방법도 공지되어 있다.
52 내지 86개의 염기 크기의 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 8 종을 조합하여 사람의 BLT(서열 8)를 코딩하는 DNA 서열을 만들었다. 상기 올리고뉴클레오티드는 어플라이드 바이오시스템스 모델 380A 또는 380B(미국 94404 캘리포니아주 포스터시티 링컨 센터 드라이브 850에 위치한 Applied Biosystems, Inc.으로부터 구입)와 같은 종래의 DNA 합성 장치를 사용하여 제조하였다. 올리고뉴클레오티드 중 4 종은 합성 유전자의 한 가닥을 생성하고, 나머지 4 종은 상기 유전자에 상보적인 가닥을 생성하도록 올리고뉴클레오티드의 서열을 고안하였다. 서열을 조합하여 만들기 전에, 상기 올리고뉴클레오티드를 ATP의 존재하에 폴리뉴클레오티드 키나아제로 처리하여 개개의 올리고뉴클레오티드에 있는 유리 히드록실기를 인산화시켰다.
8 종의 뉴클레오티드를 100㎕ 중에 동일한 몰수(3 pmol/㎕)로 혼합하고, 95℃로 가열 후, 여러 시간에 걸쳐 서서히 상온으로 냉각시켰다. 상기 단계로 인하여 적합한 개개의 올리고뉴클레오티드 염기쌍이 형성되었다. T4 DNA 리가아제를 가하여 올리고뉴클레오티드를 라이게이션시켜 약 285 bp의 이중가닥 DNA를 제조하였고, 이는 2% 아가로오스 겔에서 분석 및 정제하였다. "점착성" 말단을 갖는 상기 단편을 NdeI 및 BamHI으로 잘린 pUC18 벡터에 라이게이션하였다. 라이게이션 혼합물로 감응성 DH10B 세포를 형질전환하여 100㎍/ml의 암피실린이 함유된 Trp-효모 아가 배지에 도말하였다. 밤새 자란 콜로니를 대상으로 화학적으로 합성된 유전자가 포함된 플라스미드의 존재 여부를 분석하였다. 즉, 콜로니로부터 플라스미드를 정제하여 NdeI 및 BamHI으로 플라스미드 DNA를 절단하여 약 285 bp의 단편이 있는지 확인하였다. 이어서, DNA 서열 분석에 의해 올바른 서열임을 확인하였다. 상기 플라스미드를 pOJ838이라 명명하였다.
＜실시예 3＞
BLT 융합 단백질을 발현하는 플라스미드의 제작
BLT는 작은 단백질이기 때문에, 융합 단백질로 만들어서 크기를 증가시키는 것이 유리하였다. 상기 목적을 위해, 두 가지 상이한 융합 파트너를 사용하였다. 그 중 하나는 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST)로서, 이는 미국 08855 뉴저지주 피스카타웨이에 위치한 파마시아 바이오테크놀로지사 (Pharmacia Biotechnology)의 pGEX-2T 벡터에 의해 코딩되는 바와 같이 인자 Xa 절단 부위를 가지며, 본 명세서 서열 6의 서열을 포함하는 것이고, 다른 융합 파트너는 짧은 펩티드 서열 MIIGLMVGGVSGSGSGSGDDDDP (서열 3)이었다.
천연 베타-리포트로핀을 수득하기 위해, 융합 단백질을 화학적으로 또는 효소 분해적으로 처리하여 융합 파트너로부터 베타-리포트로핀을 분리하였다. 이는 융합 파트너와 베타-리포트로핀 사이에 효소적 또는 화학적 절단 분위를 삽입하여 수행하였다. GST 융합에서는 엔테로키나아제 또는 인자 Xa 인지 부위를 선택하였고, 작은 합성 펩티드 융합(서열 3)에서는 Pro을 삽입하여 산 처리에 의해 화학적으로 절단되게 하였다.
인자 Xa 인지 부위(IEGR)를 포함하는 GST 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드를 하기와 같이 구성하였다. 플라스미드 pOJ838(합성 베타-리포트로핀을 포함하는 pUC18 벡터임, 실시예 4 참조)을 NdeI 및 NruI으로 절단하여 가장 큰 벡터 단편을 겔-정제하였다. 서열 5'-TATGAGATCTATCGAAGGTCGTGAGCTCACCGGTCAGCGTGTTCG-3' (서열 4) 및 그의 상보적 서열의 합성 링커를 동일한 몰수로 혼합하고, 95℃로 가열한 후, 온도를 25℃로 점차 낮추어 어닐링되도록 하였다. 어닐링된 링커를 벡터 단편에 라이게이션시키고, 라이게이션 혼합물을 감응성 DH10B 세포에 형질전환하였다. 형질전환 세포를 100㎍/ml의 앰피실린이 함유된 Trp-효모 아가 배지에 도말하였다. 밤새 자란 콜로니를 대상으로 링커 서열이 포함된 플라스미드의 존재 여부를 분석하였다. 즉, 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 정제하여 링커를 통해 도입된 새로운 BglⅡ 부위가 있는지 확인하였다. 이어서, DNA 서열 분석에 의해 올바른 서열임을 확인하였다. 상기 플라스미드를 pOJ839라 명명하였다.
플라스미드 pOJ839를 BglⅡ 및 EcoRI으로 절단하고, 베타-리포트로핀 유전자(현재는 인자 Xa 인지 부위 서열이 부착됨)를 포함하는 작은 크기의 단편을 겔-정제하여 BamHI 및 EcoRI으로 잘린 pGEX2-T 벡터에 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 감응성 DH10B 세포에 형질전환하고, 이를 100㎍/ml의 앰피실린이 함유된 Trp-효모 아가 배지에 도말하였다. 밤새 자란 콜로니를 대상으로 새로운 약 300bp 단편이 포함된 플라스미드의 존재 여부를 SacI으로 잘라 분석하였다. 상기 새로운 플라스미드를 pOJ840이라 명명하였다.
＜실시예 4＞
프로카복시펩티다아제-BLT 융합 단백질을 코딩하는 재조합 벡터 pHMM260-ProCpB(10)/LVPR/베타 리포트로핀(R49)
재조합 DNA 발현 벡터 pHMM260은 프로카복시펩티다아제-BLT 융합 단백질을 코딩하는 ProCpB(10)/LVPR/베타 리포트로핀(R49) 발현 카세트를 포함한다. 상기 벡터는 표준 클로닝 기술을 사용하여 제조하였다. pHMM260의 발현 카세트에 대한 설명은 도 16에 기재하였다. 발현 카세트의 5' 말단에는 NdeI 부위가 포함되고 3' 말단에는 BamHI 부위가 포함된다. 돼지의 프로카복시펩티다아제 B 단백질의 프로-펩티드 부분은 카세트의 5' 말단에 나타나는데, Met 잔기로 시작하여 Ser 잔기로 끝난다. 트롬빈 단백질 분해효소 인지 서열인 LVPR이 프로카복시펩티아아제 서열의 3'에 존재한다. 트롬빈 절단 부위의 3' 말단에서 Glu 잔기로 시작하는 야생형 사람 베타-리포트로핀을 코딩한다.
BLT 서열의 49번 위치에서 야생형 서열 Arg(R49)이 Ala(A49)으로 변화된 pHMM261, Glu(E49)으로 변화된 pHMM262, 또는 Gln(Q49)으로 변화된 pHMM263과 같은 여러 가지 유도체 카세트를 구성하였다. 상기 유도체는 융합 단백질의 합성 및 정제 단계에서 단백질 가수분해에 대한 감응성을 감소시키기 위해 제조하였다.
＜실시예 5＞
세린 히드록시 메틸트랜스퍼라제(SHMT)-BLT 융합 단백질을 코딩하는 재조합 벡터 pHMM268
세린 히드록시 메틸트랜스퍼라제 (SHMT) 효소의 아미노-말단 서열을 포함하는 융합 단백질은 표준 클로닝 기술을 사용하여 제작하였다. 플라스미드 pHMM268은 대장균(E. coli)에서 높은 수준으로 발현되었다. pHMM268에 의해 제조된 융합 단백질은 비가용성이었고, 미립자 분획으로 회수할 수 있었다. 상기 특징으로 인해 단백질 가수분해에 의한 분해로부터 보호되는 이점이 있었다.
＜실시예 6＞
수컷 Avy/A생쥐에 생쥐 BLT를 7일 동안 투여함
Avy/A생쥐는 비만 및 당뇨병의 모델이다. 이것의 동종번식 계통은 중년에 과혈당증, 과인슐린혈증 및 인슐린 불감증이 발병하기 때문에 비만 및 당뇨병의 유용한 모델이 된다.
태어난 지 약 6개월된 수컷 Avy/A생쥐는 하란사 (Harlan Co., 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재)로부터 구입하였다. 이 동물들을 각 우리당 6마리씩 넣고 5008 사료 및 물을 마음대로 먹도록 해주었다. 혈당량을 규칙적인 간격으로 측정하였다. 아침에 포도당의 수치가 300 mg/dL 이상이 되었을 때, 그 동물로 실험을 수행하였다. 무작위로 선택된 5마리의 생쥐를 대조구로서 함께 사육하였고, 또한 무작위로 선택된 5 마리의 생쥐를 고상 기술로 합성된 생쥐 BLT(생쥐 BLT 서열은 쉽게 입수가능하고, 이에 관해서는 본 명세서에 언급됨으로써 도입되는 문헌(M. Notake et. al. FEBS Lett. 156, 67-71, 1983)을 참조할 수 있음)로 처리하고 사육하였다.
BLT로 처리하는 생쥐에는 60㎍을 하루 2회 (bid) 피하(SC) 투여(각 용량의 전체 부피는 200 ㎕임)하였고, 대조구 동물에는 200㎕의 비히클(식염수 용액)을 하루 2회 투여하였다. 6일 동안은 아침과 오후에 매일 2회씩 동물에게 투여하였고, 7일째 되던 날은 아침에만 주사하였다.
실험을 시작한 날(O일) 아침에 혈당량, 체중 및 사료 소비량을 측정하였다. 1일부터 6일까지 아침에 체중 및 사료 소비량을 측정하였다. 6일째 아침에 혈장내 트리글리세리드를 측정하였다. 6일째 오후부터 7일째 아침까지 밤새 생쥐를 금식시켰다. 7일째에, 경구 내당력 시험 (oral glucose tolerance test)을 수행하였다. 식염수 또는 BLT를 주사한 아침으로부터 2시간 후에 0시간째의 혈액내 포도당 수치를 측정하였다. 상기 시험을 위해, 동물에 25%의 덱스트로오스(체중 10g 당 100㎕)를 경구 투여하고 30분, 60분 및 120분 후에 혈액을 채취하였다. 혈액 시료를 포도당 및 인슐린 수치 측정용으로 사용하였다. 마지막 SC 주사(식염수 또는 BLT) 후 1, 3 및 14일에, 동물에서 혈액을 채취하여 혈당량을 측정하였다.
결과:
BLT를 투여하면 생체내 혈당 및 혈액내 인슐린 농도가 저하된다.
이 실험의 결과를 도 1 내지 도 8에 요약하였다. 7일 간의 처리를 통해, 대조구와 실험구 동물이 소비한 사료량은 대략 4.5 g 내지 6g였다(도 1). 대조구와 실험구의 체중은 약 50g으로 동일하게 유지되었다(도 2).
BLT 처리 결과, 처리된 생쥐에서는 처리 후 6일 째에 혈장내의 트리글리세리드가 감소되었다(도 3). 대조구 동물은 평균치가 3.05 nmol/L(표준편차 0.58)인 반면, 처리된 생쥐의 평균치는 2.05 nmol/L (표준편차 0.43)이었다. 이는 혈청의 트리글리세리드가 약 30% 내지 35% 감소됨을 나타낸다.
또한, BLT는 처리군 동물의 혈당량을 실질적으로 감소시켰다(도 4). BLT 투여 7일 후, 처리군 동물의 혈당량은 135 mg/dL(표준편차 16)인 반면, 대조구 동물에서는 171 mg/dL(표준편차 16)로 확연히 대조되었다.
처리군 동물에서 혈당량의 감소는 7일째의 마지막 BLT 투여 이후에 3일 이상 지속되었다. 대조구 동물의 포도당 수치는 331mg/dL(표준편차 79)이었다. 반면, 처리군 동물은 205mg/dL(표준편차 76)의 실질적으로 저하된 혈당량을 유지하였다. 혈당량을 저하시키는 BLT의 효과는 마지막 BLT 투여 14일 이후에는 관찰되지 않았다(도 6).
인슐린 수치에 대한 BLT 처리의 효과를 조사하기 위해, 7일 동안의 처리 및 밤새 금식시킨 후에 경구 내당력 시험을 수행하였다(도 7 및 도 8). 시험 개시 30분 시점에 대조구 및 실험구 동물의 수치가 약 80mg/dL에서 약 200mg/dL 또는 그 이상으로 초반에는 증가하였으나, 그 이후에는 2시간 시점에서 두 가지 군의 수치가 비교가능한 감소율을 나타냈다(도 7). 엄격히 말하면, 처리군 동물의 혈장내 인슐린 수치는 대조구 동물에 비해 실질적으로 낮았다(도 8). 예를 들면 30분 시점에서, 대조구 동물의 인슐린 수치는 11.5ng/ml(표준편차 1.9)인 반면, 처리군의 인슐린 수치는 6.0ng/ml(표준편차 3.0)이었다.
＜실시예 7＞
수컷 Avy/A생쥐에 생쥐 BLT를 14일 동안 투여함
수컷 Avy/A생쥐를 각 우리당 6마리씩 가두고, 5008 사료 및 물을 마음대로 먹게 했다. 혈당량을 규칙적인 간격으로 측정하였다. 아침에 포도당의 수치가 300mg/dL 이상이 되었을 때, 그 동물로 실험을 수행하였다. 무작위로 선택된 5마리의 동물을 대조구으로서 함께 사육하였고, 무작위로 선택된 5마리의 동물은 고상 기술로 합성된 생쥐 BLT로 처리하고 사육하였다.
BLT로 처리하는 생쥐에는 60㎍을 SC 투여(각 투여량은 200㎕임)하였고, 대조구 동물에는 200㎕의 비히클(식염수 용액)을 투여하였다. 13일 동안은 아침과 오후에 매일 2회씩 동물에게 투여하였고, 14일째 되던 날은 아침에만 주사하였다.
0일째 아침에 혈당량, 체중 및 사료 소비량을 측정하였다. 1일부터 13일까지 아침마다 체중 및 사료 소비량을 측정하였다. 13일째 오후부터 14일째 아침까지 밤새 생쥐를 금식시켰다. 14일째에, 경구 내당력 시험을 수행하였다. 식염수 또는 BLT를 주사한 아침으로부터 2시간 후에 0시간째의 혈당량을 측정하였다. 상기 시험을 위해, 동물에 25%의 덱스트로오스(체중 10g 당 100㎕)를 경구 투여하고 30분, 60분 및 120분 후에 혈액을 채취하였다. 혈액 시료를 포도당 및 인슐린 수치 측정용으로 사용하였다. 경구 혈액내 내당력 시험 후에, 동물을 임의로 사육하였다. 마지막 SC 주사(식염수 또는 BLT) 후 1,3 및 14일에, 동물에서 혈액을 채취하여 혈액내 포도당 수치를 측정하였다.
결과:
14일 동안의 BLT 투여는 혈당 및 혈중 인슐린을 저하시킨다.
상기 실험의 결과를 도 9 내지 도 10에 요약하였다. 14일 간의 처리를 통해, 대조구와 실험구 동물이 소비한 사료량은 약 4.5 g 내지 6 g이었고, 대조구와 실험구의 체중은 약 50g으로 동일하게 유지되었다(결과는 제시하지 않음).
인슐린 수치에 대한 2주 동안의 BLT 처리의 효과를 조사하기 위해, 14일 동안 처리한 후에 경구 내당력 시험을 수행하였다(도 9 및 도 10). 시험 개시 30분 시점에 대조구 및 실험구 동물의 수치가 약 80 mg/dL에서 약 200 mg/dL 또는 그 이상으로 초반에는 증가하였으나, 그 이후에는 2시간 시점에서 두 가지 군의 수치가 비교가능한 감소율을 나타냈다(도 9). 예를 들면, 30분 시점에서 처리군 동물의 혈당량 평균은 289 mg/dL(표준편차 24)인 반면, 대조구의 수치는 348 mg/dL(표준편차 18)이었다. 또한, 60분 및 120분 시점에서도 저하된 수치가 관찰되었다. 예를 들면, 120분 시점에서 처리군 동물의 혈당량은 114 mg/dL(표준편차 4)인 반면, 대조구의 수치는 188 mg/dL(표준편차 23)이었다.
또한, 처리군 동물의 혈장내 인슐린 수치는 대조구 동물에 비해 실질적으로 낮았다(도 10). 예를 들면 30분 시점에서, 대조구 동물의 인슐린 수치는 7.4 ng/ml(표준편차 2.1)인 반면, 처리군의 인슐린 수치는 4.8 ng/ml(표준편차 0.6)이었다.
＜실시예 8＞
BLT는 3T3 지방세포(Adipocyte)의 포도당의 흡수를 자극한다.
각 웰당 약 100㎕의 생장용 배지가 들어있는 96 웰 플레이드에 생쥐 3T3-L1 세포를 각 웰당 약 25,000개가 되도록 접종하였다.
생장용 배지: 포도당 농도가 높고, L-글루타민이 없는 DMEM
10% 송아지 혈청
2mM L-글루타민
1% 펜 스트렙(Pen Strep)
1.25㎍/ml 펀지존(Fungizone)
접종한지 3일 후에, 생장 배지를 분화용 배지로 바꾸어 세포를 지방 세포(adipocyte)로 분화시켰다.
분화용 배지: 포도당 농도가 높고, L-글루타민이 없는 DMEM
10% FBS
2mM L-글루타민
1% 펜 스트렙(Pen Strep)
1.25㎍/ml 펀지존(Fungizone)
10mM Hepes
0.25μM 덱사메타손 (1㎕/ml의 0.25mM 원액)
0.5mM IBMX (10㎕/ml의 50mM 원액)
5㎍/ml 인슐린 (1㎕/ml 및 5mg/ml의 원액)
유속 조절기가 장착된 진공 형성원에 부착된 8개의 채널 분기관을 이용한 흡출법에 의해 세포로부터 배지를 제거하였다. 8 채널 매트릭스 전기 피펫(8 channel Matrix electronic pipettor)을 이용하여, 세포에 피해를 최소화 하기 위해 가능한 느린 속도로 신선한 배지를 웰에 분배하였다.
1일째에, 100㎕의 분화용 배지를 각 웰에 가하여 3T3 세포의 지방 세포로의 분화를 개시하게 하였다. 분화 시작 3일 후, 배지를 인슐린을 포함하면서 IBMX 또는 덱사메타손이 없는 배지(인슐린 배지)로 교환하였다. 6일째에, 배지를 인슐린, IBMX 또는 덱사메타손이 전혀 없는 배지(FBS 배지)로 다시 교환하였다. 분화를 시작한지 15 내지 21일에 수행하는 포도당 수송 분석(glucose transport assay)의 준비가 될 때까지, 세포를 이틀에 한 번씩 배지를 교환하면서 계속 FBS 배지에서 배양하였다.
＜실시예 9＞
BLT의 존재하에 지방 세포로 분화가 유도된 3T3 세포에서의 포도당 수송 분석
실시예 8에서와 같이 생쥐 3T3-L1 세포의 지방 세포로의 분화를 유도하였다. 포도당 수송 분석을 수행하기 15 내지 24시간 전에 세포를 하기와 같이 처리하였다.
1. 37℃의 인산 완충 식염수(PBS) 100ml로 웰을 2회 세척하였고, 세척 중간에는 세척액을 흡출로 제거하였다.
2. 100ml DMEM, 높은 농도의 포도당, 1% 항생제 및 항균제 용액, 2mM 글루타민, 0.1% BSA (37℃로 온난화), 0 내지 1000nM 생쥐 또는 사람 BLT(고상 기술에 의해 합성됨) 및 0 내지 100nM 인슐린을 각 웰에 가하였다. 상기 단계는 혈청 결핍 상태이다.
3. 세포를 37℃에서 밤새 배양하였다.
분석을 수행하는 날에, 세포를 하기와 같이 처리하였다.
1. 배지를 제거하고, 플레이트를 종이 타올로 찍어낸 후, 세포를 100ml의 KRBH 완충액(pH 7.4의 Hepes를 포함하는 Krebs-Ringer 완충액)으로 2회 세척하였다.
2. 최종 세척액을 제거한 후, 세포를 100㎕ KRBH, 100μM의 포도당을 포함한 0.1% BSA, 10㎕/ml(0.1μCi/웰)의 방사능 표지된 2-데옥시포도당(C14) 및 원하는 농도의 인슐린에서 1시간 동안 37℃에서 배양하였다.
3. 방사능 표지된 포도당을 포함한 배지에서 세포를 배양한 후에, 10㎕의 200μM 싸이토클라신 B(cytochlasin B)를 가하여 추가의 포도당 유입을 멈추게 하였다.
4. 방사능 표지된 포도당의 유입을 Micorbeta 플레이트 판독기로 측정하였다.
결과:
상기 실험의 결과를 도 11에 요약하였다. 지방 세포로 분화가 유도된 3T3 세포로의 포도당 유입은 BLT를 미리 처리하였을 경우에 3배 내지 6배로 증가하였다.
＜실시예 10＞
BLT 기능성 단편의 존재하에 지방 세포로 분화가 유도된 3T3 세포에서의 포도당 수송 분석
실시예 8에서와 같이 생쥐 3T3-L1 세포의 지방 세포로의 분화를 유도하였다. 포도당 수송 분석을 수행하기 15 내지 24시간 전에 세포를 하기와 같이 처리하였다.
1. 37℃의 인산 완충 식염수(PBS) 100ml로 웰을 2회 세척하였고, 세척 중간에는 세척액을 흡출로 제거하였다.
2. 100ml DMEM, 높은 농도의 포도당, 1% 항생제 및 항균제 용액, 2mM 글루타민, 0.1% BSA (37℃로 온난화), 0 내지 1000nM 생쥐 또는 사람 BLT(고상 기술에 의해 합성됨) 및 0 내지 100nM 인슐린을 각 웰에 가하였다. 상기 단계는 혈청 결핍 상태이다. 예를 들면, 한쪽 시험에서는 본 명세서에 서열 10으로 지정된 사람 BLT 단편을 사용하였고, 다른 시험에서는 본 명세서에 서열 12로 지정된 사람 BLT 단편을 사용하였다.
3. 세포를 37℃에서 밤새 배양하였다.
분석을 수행하는 날에, 세포를 하기와 같이 처리하였다.
1. 배지를 제거하고, 플레이트를 종이 타올로 찍어낸 후, 세포를 100ml의 KRBH 완충액(pH 7.4의 Hepes를 포함하는 Krebs-Ringer 완충액)으로 2회 세척하였다.
2. 최종 세척액을 제거한 후, 세포를 100㎕ KRBH, 100μM의 포도당을 포함한 0.1% BSA, 10㎕/ml(0.1μCi/웰)의 방사능 표지된 2-데옥시포도당(C14) 및 원하는 농도의 인슐린에서 1시간 동안 37℃에서 배양하였다.
3. 방사능 표지된 포도당을 포함한 배지에서 세포를 배양한 후에, 10㎕의 200μM 싸이토클라신 B(cytochlasin B)를 가하여 추가의 포도당 유입을 멈추게 하였다.
4. 방사능 표지된 포도당의 유입량을 Micorbeta 플레이트 판독기로 측정하였다.
결과:
분석 전에 지방 세포에 BLT의 기능성 단편을 미리 처리하였을 경우, 지방 세포로 분화가 유도된 3T3 세포로의 포도당 유입량은 대조구에 비해 증가하였다.
＜실시예 11＞
BLT의 기능성 유사체
실시예 10에서과 같이 생쥐 3T3-L1 세포를 지방 세포로 분화하도록 유도하였다. 이어서, 지방 세포를 사람 BLT(예를 들면, 서열 26 내지 서열 35)에 노출시켰고, 실시예 8과 같은 방법으로 포도당 수송을 모니터하였다. 기능성 유사체는 천연 BLT와 실질적으로 동일한 결과를 나타내었다.
＜실시예 12＞
수컷 Avy/A생쥐에 사람 BLT를 14일 동안 투여함
고상 합성된 사람 BLT를 실시예 7에 기재된 방식에 따라 수컷 Avy/A생쥐에 투여하였다.
결과:
사람 BLT의 투여는 수컷 Avy/A생쥐의 혈청내 인슐린의 양을 실질적으로 감소시켰다(도 12 및 도 13 참조).
상기 실험의 결과를 도 12 내지 도 13에 요약하였다. 14일 간의 처리를 통해, 대조구와 실험구 동물이 소비한 사료량은 약 4.5 g 내지 6 g이었고, 대조구와 실험구 동물의 체중은 약 50g으로 동일하게 유지되었다(결과는 제시하지 않음).
혈장내 포도당 및 인슐린 수치에 대한 2주 동안의 사람 BLT 처리의 효과를 조사하기 위해, 14일 동안 처리한 후에 경구 내당력 시험을 수행하였다. 시험 개시 30분 시점에 대조구 및 실험구 동물의 수치가 약 80 mg/dL에서 약 200 mg/dL 또는 그 이상으로 초반에는 증가하였으나, 그 이후에는 2시간 시점에서 두 가지 군의 수치가 비교가능한 감소율을 나타냈다(도 12). 예를 들면, 30분 시점에서 처리군 동물의 혈당량은 약 400 mg/dL(표준편차 12)의 평균값을 나타낸 반면, 대조구의 수치는 330 mg/dL(표준편차 19)이었다. 또한, 60분 및 120분 시점에서도 저하된 수치가 관찰되었다. 예를 들면, 120분 시점에서 처리군 동물의 혈당량 수치의 평균은 178 mg/dL(표준편차 16)인 반면, 대조구의 수치는 202 mg/dL(표준편차 13)이었다.
처리군 동물의 혈장내 인슐린 수치는 대조구 동물에 비해 실질적으로 낮았다(도 13). 예를 들면 30분 시점에서, 대조구 동물의 인슐린 수치는 14.0 ng/ml(표준편차 1.5)인 반면, 처리군의 인슐린 수치는 10.2 ng/ml(표준편차 0.4)이었다. 120분 시점에서, 대조구 동물의 인슐린 수치는 9.3 ng/ml(표준편차 2.3)인 반면, 처리군의 인슐린 수치는 5.4 ng/ml(표준편차 0.9)이었다.
＜실시예 13＞
수컷 Lepob/Lepob생쥐에 생쥐의 베타 리포트로핀 투여
잭슨 라보라토리즈(Jackson Laboratories, 미국 메인주 바 하버 소재)로부터 구입한 수컷 Lepob/Lepob생쥐를 한 마리씩 가두고, 5008 사료 및 물을 마음대로 먹게 하였다. 생쥐의 꼬리에서 혈액을 채취해 초기의 포도당, 인슐린 및 트리글리세리드 수치를 측정하였다. 대조구, 60 ㎍ 또는 120 ㎍의 생쥐 베타 리포트로핀 처리를 위해 생쥐를 선택하였다. 처리군의 생쥐에는 60 ㎍ 또는 120 ㎍(각 용량의 전체 부피는 200 ㎕임)을 하루 2회 SC 투여하였고, 대조구 생쥐에는 200 ㎕의 비히클(식염수 용액)을 투여하였다. 16일 동안 매일 아침 7시 및 오후 3시에 주사하였고, 17일째에는 아침 7시에만 주사하였다. 0일 내지 17일에 걸쳐 아침에 체중 및 음식 소비량을 측정하였다. 7일째 아침에 생쥐의 꼬리에서 혈액을 채취하여 혈당, 인슐린 및 트리글리세리드 수치를 측정하였다. 13일째 오후부터 14일째 아침까지 밤새 생쥐를 금식시켰다. 14일째에, 경구 내당력 시험을 수행하였다. 주사를 놓은 아침으로부터 2시간 후에 0시간째의 혈당 및 혈중 인슐린 수치를 측정하였다. 생쥐에 25%의 덱스트로오스(체중 10g 당 100㎕)를 경구 투여하고 30분, 60분 및 120분 후에 혈액을 채취하였다. 혈액 시료를 포도당 및 인슐린 수치 측정용으로 사용하였다. 경구 내당력 시험 후에, 생쥐에게 마음대로 사료를 먹을 수 있게 했다. 16일째에, 꼬리에서 채취한 혈액 시료로부터 혈액내 포도당, 인슐린, 트리글리세리드 및 코르티코스테론 수치를 측정하였다. 17일째에 쥐를 죽였다.
상기 실험의 결과를 도 14에 기재하였다. 16일 동안 처리한 처리군 동물의 혈장내 인슐린 수치는 매우 낮았다. 처리 7일째에 예를 들면, 대조구 동물의 인슐린 수치는 약 300 ng/ml인 반면, 처리군 동물의 수치는 30% 이상 감소된 약 215 ng/ml이었다. 게다가, 처리군 동물의 혈장내 인슐린 수치는 처리 16일째에도 낮은 상태로 유지되었다(도 14).
＜실시예 14＞
수컷 Lepob/Lepob생쥐에 AlzetTM펌프를 통한 사람 BLT의 투여
잭슨 라보라토리즈 (Jackson Laboratories, 미국 메인주 바 하버 소재)로부터 구입한 생후 1개월된 수컷 Lepob/Lepob생쥐를 한마리씩 가두고, 5008 사료 및 물을 마음대로 먹게 함과 동시에 12시간 주기(오후 6시부터 오전 6시까지는 빛을 주지 않음)로 빛을 밝혀주었다. 생쥐의 꼬리에서 혈액을 채취해 초기의(0시) 포도당, 인슐린 및 트리글리세리드 수치를 측정하였다. 처리군의 생쥐에는 하루에 0.24 mg 또는 0.48 mg의 사람 베타 리포트로핀(ER4-VBH-43)을 AlzetTM펌프(Alza, Inc.)의 피하 이식을 통해 연속적으로 투여하여, 세 가지 생쥐군의 포도당 및 트리글리세리드 평균 농도를 동일하게 하였다. 대조구 동물에는 식염수 용액을 투여하였다. 대조구에 사용한 펌프에는 식염수를 채웠고, 투여량이 적은 군의 펌프에는 20 mg/ml의 사람 베타 리포트로핀을 채웠으며, 투여량이 많은 군의 펌프에는 40 mg/ml의 사람 베타 리포트로핀을 채웠다. 펌프를 이식하기 전에 생쥐를 이소플루란으로 마취시켰다. 0일 내지 7일에 걸쳐 아침에 체중 및 음식 소비량을 측정하였다. 4일째 아침에 생쥐의 꼬리에서 혈액을 채취하여 혈액내 포도당, 인슐린 및 트리글리세리드 수치를 측정하였다. 6일째 오후부터 7일째 아침까지 밤새 생쥐를 금식시켰다.
7일째에, 경구 내당력 시험을 수행하였다. 생쥐의 꼬리에서 혈액을 채취하여 0시간째의 혈액내 포도당 및 인슐린 수치를 측정하고 나서, 생쥐에 25%의 덱스트로오스(체중 10g 당 100㎕)를 경구 투여한 후, 30분, 60분 및 120분 후에 혈액을 채취하였다. 혈액 시료를 포도당 및 인슐린 수치 측정용으로 사용하였다. 경구 내당력 시험 후에, 생쥐에게 마음대로 사료를 먹을 수 있게 했다.
내당력 시험에 관한 결과를 도 15에 기재하였다. 매일 0.24mg의 BLT를 처리한 동물의 수치는 대조구보다 약 25% 낮은 반면, 매일 0.48 mg의 BLT를 처리한 동물의 수치는 대조구보다 약 40% 낮았다(도 15의 곡선 아래쪽에 삽입된 영역 참조).
＜실시예 15＞
사람 BLT 단백질 유사체의 고상 합성 및 정제
서열 8에서 Ala이 Glu으로 치환된 사람의 BLT 펩티드의 유사체(즉, 서열 26에 의해 대표되는 유사체)를 Fmoc 화학을 이용한 1회 운전으로 합성하였다. 이 합성은 BLT 펩티드의 N-말단에 Asp-Gly 디펩티드 서열이 몇 개 있어서 복잡하다. Asp-Gly 디펩티드 서열의 Asp 잔기는 FMOC 합성 중에 염기의 존재하에 고리화되며 이어서 피페리딘과 합쳐지는 것으로 관찰되었다. 합성시 각각의 Asp-Gly 서열에 Fmoc-(FmocHmb)-글리신을 사용하여 상기 반응을 제거하였다. Hmb기로 글리신의 아미드를 보호함으로써 Asp 잔기의 고리화 반응을 억제하였다. 절단, 탈보호화 및 역상 HPLC 정제 후에, 전기분무 질량 분광법에 의해 펩티드를 분석하였다. 합성시 주로 나타나는 종류는 예상 질량을 갖는 전체 길이의 펩티드였다. 상기 방법의 사용으로 0.1 mmol 규모의 1회 운전으로 100 mg가 넘는 정제된 단백질을 수득하였다.
재료: 수지 1g당 약 0.6mmole의 아미노산 용량으로 미리 로딩된 Fmoc-Glu (OtBu) Wang (p-벤즈옥시벤질 알코올로 관능화된 1% 가교 폴리스티렌) 수지. N-메틸피롤리돈(NMP), 피페리딘, 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), 2M N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA) 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), 디클로로메탄(DCM), 디메틸포름아미드(DMF).
Fmoc로 보호된 C-말단 아미노산(0.1 또는 0.25mmole의 아미노산)과 함께 미리 로딩된 수지의 중량을 측정하고 반응기에 넣었다. 상기 수지는 DCM 세척에 의해 미리 부풀려져 있었다. 이어서, 수지를 NMP로 세척하였다. 상기 수지를 NMP 중의 18 내지 22% 피페리딘 용액에서 인큐베이션하여 N-말단의 Fmoc기를 제거하였다. 탈보호화 이후에, 수지를 NMP로 과도하게 세척하였다.
펩티드에 가할 1mmole의 Fmoc-보호 아미노산을 DMF 중의 NMP 2.1g 및 0.45M HBTU/HOBt 시약에 용해시켰다. 용해시킨 후에, NMP 중의 2M DIEA 3ml을 가하여 아미노산을 활성화시켰다. 이어서, 활성화된 아미노산을 탈보호화된 수지에 가하여 커플링시켰다. 커플링이 완료된 후, 수지를 NMP로 집중 세척하였다. 탈보호화 및 커플링의 완전한 주기를 각각의 후속 아미노산에 대해 반복하였다.
합성에서 특이적인 주기 단계는 하기와 같다.
주기 아미노산 단계
1 Ala 완전한 세척
2 Gly 단일 결합
3 Lys(Boc) 단일 결합
4 Lys(Boc) 단일 결합
5 Tyr(tBu) 단일 결합
6 Ala 단일 결합
7 Asn(Trt) 단일 결합
8 Lys(Boc) 단일 결합
9 Ile 단일 결합
10 Ile 단일 결합
11 Ala 단일 결합
12 Asn(Trt) 단일 결합
13 Lys(Boc) 단일 결합
14 Phe 단일 결합
15 Leu 단일 결합
16 Thr(tBu) 단일 결합
17 Val 단일 결합
18 Leu 단일 결합
19 Pro 이중 결합/Ac20 cap
20 Thr(tBu) 단일 결합
21 Gln(Trt) 단일 결합
22 Ser(tBu) 단일 결합
23 Lys(Boc) 단일 결합
24 Glu(OtBu) 단일 결합
25 Ser(tBu) 단일 결합
26 Thr(tBu) 단일 결합
27 Met 단일 결합
28 Phe 단일 결합
29 Gly 단일 결합
30 Gly 단일 결합
31 Tyr(tBu) 단일 결합
32 Arg(Pmc) 단일 결합
33 Lys(Boc) 단일 결합
34 Asp(OtBu) 단일 결합
35 Lys(Boc) 단일 결합
36 Pro 이중 결합/Ac20 cap
37 Pro 이중 결합/Ac20 cap
38 Ser(tBu) 단일 결합
39 Gly 단일 결합
40 Trp(Boc) 단일 결합
41 Arg(Pmc) 단일 결합
42 Phe 단일 결합
43 His(Trt) 단일 결합
44 Glu(OtBu) 단일 결합
45 Met 단일 결합
46 Arg(Pmc) 단일 결합
47 Tyr(tBu) 단일 결합
48 Pro 이중 결합/Ac20 cap
49 Gly 단일 결합
50 Glu(OtBu) 단일 결합
51 Asp(OtBu) 단일 결합
52 Lys(Boc) 단일 결합
53 Lys(Boc) 단일 결합
54 Glu(OtBu) 단일 결합
55 Ala 단일 결합
56 Ala 단일 결합
57 Val 단일 결합
58 Leu 단일 결합
59 Leu 단일 결합
60 Ser(tBu) 단일 결합
61 His(Trt) 단일 결합
62 Glu(OtBu) 단일 결합
63 Leu 단일 결합
64 Asp(OtBu) 단일 결합
65 Ala 단일 결합
66 Gln(Trt) 단일 결합
67 Ala 단일 결합
68 Gly 단일 결합
69 Ala 단일 결합
70 Gly(Fmoc-hmb) 이중 결합/Ac20 cap
71 Asp(OtBu) 단일 결합
72 Asp(OtBu) 단일 결합
73 Ala 단일 결합
74 Pro 이중 결합/Ac20 cap
75 Gly(Fmoc-hmb) 이중 결합/Ac20 cap
76 Asp(OtBu) 단일 결합
77 Pro 이중 결합/Ac20 cap
78 Gly(Fmoc-hmb) 이중 결합/Ac20 cap
79 Asp(OtBu) 단일 결합
80 Gly 단일 결합
81 Glu(OtBu) 단일 결합
82 Arg(Pmc) 단일 결합
83 Leu 단일 결합
84 Arg(Pmc) 단일 결합
85 Gln(Trt) 단일 결합
86 Gly 단일 결합
87 Thr(tBu) 단일 결합
88 Leu 단일 결합
89 Glu(OtBu) 단일 결합
90 최종 탈보호화
느리게 또는 비효율적으로 반응하는 아미노산을 위해, 두 가지 분리된 결합 반응을 수행하였다. 아세트산 무수물로 처리하여 임의의 잔류 미반응 펩티드의 반응성을 차단하였다. 상기 아미노산 중 하나에 대한 반응 단계의 순서는 탈보호화, 커플링 반응 1, 세척, 커플링 반응 2, 세척, Ac20 cap, 세척, 탈보호화이다.
약어: OtBu: t-부틸 에스테르, tBu: t-부틸, Boc: t-부톡시카르보닐, Pmc: 2,2,5,7,8-펜타메틸크로마-6-술포닐, Hmb: 2-히드록시-4-메톡시멘질, Fmoc:9-플루오르에닐메톡시카르보닐.
＜실시예 16＞
수컷 ZDF 쥐에 Alzet 펌프를 통한 사람의 BLT 투여
제네틱 모델스 인크(Genetic Models Inc., 미국 인디애나주 인디애나폴리스)로부터 구입한 수컷 주커 당뇨병 비만 (Zucker Diabetic Fatty)(ZDF) 쥐를 한마리씩 가두고 5008 사료 및 물을 마음대로 먹게 하였다. 생후 5주의 쥐를 밤새 금식시켜 초기의 경구 내당력 시험을 하였다. 쥐의 꼬리에서 혈액을 채취하여 0시간째의 인슐린 및 포도당 수치를 측정하고 나서, 동물에 50%의 덱스트로오스(체중 1kg 당 2.5g)를 경구 투여하고 30분, 60분 및 120분 후에 혈액을 채취하였다. 경구 내당력 시험 후에, 쥐를 임의로 사육하였다. 시험 6주 전에, 동물을 4마리씩의 군으로 나누고, 각각에 사람 BLT를 투여하였다. 시험 0일째, 다시 꼬리에서 혈액을 채취하여 포도당, 인슐린, 코르티코스테론 및 트리글리세리드 수치를 측정하였다. 투여에 대한 대조구와 하루에 0.5 mg 또는 1.0 mg의 사람 베타 리포트로핀(ER4-VBH-43)을 Alzet 펌프의 피하 이식을 통해 연속적으로 투여하기 위해 쥐를 무작위로 선택하였다. 대조구에 사용한 펌프에 식염수를 채웠고, 투여량이 적은 군의 펌프에는 20.835 mg/ml의 사람 베타 리포트로핀을 채웠으며, 투여량이 많은 군의 펌프에는 41.67 mg/ml의 사람 베타 리포트로핀을 채웠다. 피하 이식 전에 펌프를 37℃에서 밤새 배양하였다. 0일 내지 8일에 걸쳐 체중 및 사료 소비량을 측정하였다. 3일째 아침에 혈액을 채취하여 혈액내 포도당, 인슐린, 코르티코스테론 및 트리글리세리드 수치를 측정하였다. 5일째 오후부터 6일째 아침까지 밤새 쥐를 금식시켰다. 6일째에 경구 내당력 시험을 수행하였다. 경구 내당력 시험 후에, 쥐를 임의로 사육하였다.
본 연구에 사용된 Zucker 동물은 유형 2의 당뇨병에 대한 훌륭한 모델이다. 생후 6 내지 7주에, 포도당 및 트리글리세리드 수치는 올라가는 반면 인슐린 분비는 감소한다. 상기 동물은 혈액내 코르티코스테론 수치가 높고 인슐린 내성이 있다.
사람 BLT를 처리한 ZDF 쥐
혈당 (mg/dl) 혈중 트리글리세리드 (mmol/L)
처리(mg/일 BLT) 0일 2일 7일 0일 2일 7일
대조구0.51.0 149151154 153160144 150±8.8150±5.5141±5.7 1.92.02.0 2.42.82.8 4.1±0.54.0±0.43.6±0.1
표 3 및 도 16은 매일 1mg의 투여량으로 사람 BLT를 투여한 ZDF 쥐에서 밝혀진 사람 BLT의 효과에 관한 것이다. OGTT의 개시 후 30분에, 혈장내 포도당 수치는 대조구에서 평균 191±16mg/dL이었고, BLT 처리군에서 172±5mg/dL이었다(도 16 참조). 개시 후 60분에는, 대조구의 포도당 수치는 157±6mg/dL인 반면 BLT 처리군의 수치는 154±8mg/dL이었다.
표 3은 특히 투여량이 많은 경우에, 대조구 동물에 비해 BLT 처리군 동물의 혈당 수치가 낮은 상태로 유지된다는 사실을 나타낸다. BLT 투여 시작 후 0, 2 및 7일째에, 대조구 동물의 포도당 수치는 약 150mg/dL이었다. 반면 하루에 1mg의 사람 BLT를 투여한 처리군의 수치는 7일째에 140mg/dL로, 대조구에 비해 약 7% 낮았다. 또한, 처리군 동물은 대조구에 비해 혈청 트리글리세리드 수치가 약 11% 낮게 나타났는데(표 3), 이는 BLT 처리에 의한 인슐린 자극 효과를 나타낸다.
＜실시예 17＞
사람 BLT는 ZDF 쥐의 골격근에서 포도당의 수송을 자극한다
골격근에서의 포도당 수송에 대한 베타 리포트로핀의 효과를 측정하기 위한 연구를 수행하였다. 제네틱 모델 인크 (Genetic Models Inc., 미국 인디애나주 인디애나폴리스)로부터 주커 당뇨병 비만 (Zucker Diabetic Fatty)(ZDF/GmiTM-fa/fa) 쥐 수컷을 입수했다. 상기 쥐에 플리나 포뮬랩(Purina Formulab) 5008 쥐 먹이(미국 미저리주 새인트루이스 소재의 Puina Mills, Inc. 제품)를 주면서, 12시간씩 낮과 밤을 바꾸는 광-제어 장소에서 사육하였다. 쥐는 단독으로 사육하였고, 음식과 물을 자유롭게 먹을 수 있었다.
근육 조직에서 포도당 수송을 측정하기 위해, 펜타바르비톨 소듐(체중 100g당 6.5g)을 복막내에 주사하여 실시예 16의 동물을 마취시키고, 가자미근을 단리하여 반으로 나누었다. 절반의 조직 시료 각각를 식염수로 2분 동안 세척하고 나서, 1% BSA, 8mM 포도당 및 32mM 만니톨을 포함하는, 기체 충전(95% 산소 및 5% 이산화탄소)된 KHB로 세척하였다.
포도당 수송 분석은 하기와 같이 수행하였다.
예비-인큐베이션:
500nM의 쥐 베타-리포트로핀이 포함되거나 또는 포함되지 않은 상태에서, 1% BSA, 8mM 포도당 및 32mM 만니톨을 포함하는 기체 충전된 KHB 1.8ml이 들어있는 20ml 바이알에 근육 조직을 옮겼다. 시료를 상온의 진탕 항온수조에 20시간 동안 놓아 두면서 중간에 완충액을 2회 바꾸어 주었다.
예비-인큐베이션 후에, 95%의 산소 및 5%의 이산화탄소로 일정하게 충전시키는 조건하에 근육 조직 시료를 15분 동안 29℃에서 세척하였다. 40mM 만니톨을 포함하고, 인슐린을 2000μU/ml로 포함하거나 포함하지 않고, 베타 리포트로핀을 500nM로 포함하거나 포함하지 않는 1.8ml의 KHB가 들어 있는 바이알에서 상기 시료를 세척하였다.
이어서, 근육 시료를 95%의 산소 및 5%의 이산화탄소로 일정하게 충전되는 새로운 바이알에 옮겼다. 인큐베이션용 배지는 8mM 3-O-메틸-포도당(OMG), 2mCi/ml3H-3-OMG, 30mM 만니톨, 0.3mCi/ml14C 만니톨, 2mM 피루브산, 인슐린(2000μU/ml) 및 생쥐 베타 리포트로핀을 포함하였다. 대조구으로 인슐린 및(또는) 베타 리포트로핀이 결핍된 배지를 사용하였다. 29℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 시료를 냉동시키고 포도당 수송 분석 전까지 냉동 상태로 보관하였다.
포도당 수송:
근육을 약 20 내지 25mg으로 손질하여, 70℃에서 30분 동안 1M KOH 0.5ml 중에 분해시켰다. 분해시킨 후 시료를 얼음 상에 놓고, 시료 100㎕를 글리코겐 분석용으로 분리하였다. 남아있는 0.4ml의 시료에 1N HCl을 0.4ml 가하고, 튜브를 복텍싱하였다. 이이서, 300㎕의 HCl이 처리된 시료에 6.4ml의 섬광 용액을 가하고, 섬광 계수기로 시료의 방사능을 측정하였다.
포도당 수송은14C 만니톨을 세포외 마커로 사용하여 세포내3H-3-OMG 축적을 기초로 계산하였다.
글리코겐 수치:
상기 언급한 100㎕의 시료에 0.3M 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.8 + 5mg/ml 아밀로글루코시다아제) 500㎕와 함께 17㎕의 빙초산을 가하였다. 이어서, 튜브를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 시료 50㎕를 96 웰 플레이트에 넣고, 200㎕의 Trinder 시약(Sigma 315-100, 물을 가하여 20ml로 희석)을 가하였다. 플레이트를 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하고, 505nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
사람 BLT를 처리한 ZDF 쥐의 근육 조직에서의 포도당 수송
처리 3 OMG 수송 (μmol/g/10분)
대조구인슐린BLT+인슐린 0.085±.01.080±.113±.018
＜110＞ Butler, Jon P.
Becker, Gerald W.
Hale, John E.
Heath Jr., William F.
Schoner, Brigitte E.
Varshavsky, Alexander D.
Heiman, Mark L.
＜120＞ Beta-lipotropin and Uses Thereof
＜130＞ X-12139
＜140＞
＜141＞
＜160＞ 35
＜170＞ PatentIn Ver. 2.0
＜210＞ 1
＜211＞ 273
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence:Met-Arg Human BLT
＜400＞ 1
atgcgtgagc tcaccggtca gcgtcttcgc gaaggtgacg gtccggacgg tccggctgac 60
gacggtgctg gtgctcaggc agatctcgag cactccctgc tggttgctgc agaaaaaaaa 120
gacgaaggtc cgtaccgtat ggaacacttc cgttggggtt ccccgccgaa agacaaacgt 180
tacggtggtt tcatgacctc cgaaaaatcc cagaccccgc tggttaccct gttcaaaaac 240
gctatcatca aaaatgcata caaaaaaggt gaa 273
＜210＞ 2
＜211＞ 91
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence:Met-Arg Human
BLT
＜400＞ 2
Met Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp
1 5 10 15
Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser
20 25 30
Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu
35 40 45
His Phe Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe
50 55 60
Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn
65 70 75 80
Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
85 90
＜210＞ 3
＜211＞ 23
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Fusion protein
partner
＜400＞ 3
Met Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Ser Gly Asp Asp Asp Asp Pro
20
＜210＞ 4
＜211＞ 45
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence:
Oligonucleotide linker
＜400＞ 4
tatgagatct atcgaaggtc gtgagctcac cggtcagcgt gttcg 45
＜210＞ 5
＜211＞ 114
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: BLT fusion
protein
＜400＞ 5
Met Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Ser Gly Asp Asp Asp Asp Pro Met Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu
20 25 30
Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala
35 40 45
Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp
50 55 60
Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys
65 70 75 80
Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro
85 90 95
Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys
100 105 110
Gly Glu
＜210＞ 6
＜211＞ 331
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: GST fusion partner
＜400＞ 6
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
210 215 220
Gly Ser Pro Gly Ile His Arg Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Glu
225 230 235 240
Gly Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp
245 250 255
Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser
260 265 270
Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu
275 280 285
His Phe Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe
290 295 300
Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn
305 310 315 320
Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
325 330
＜210＞ 7
＜211＞ 422
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: GST/BLT fusion protein
＜400＞ 7
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
210 215 220
Gly Ser Pro Gly Ile His Arg Asp Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Glu
225 230 235 240
Gly Arg Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp
245 250 255
Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser
260 265 270
Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu
275 280 285
His Phe Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe
290 295 300
Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn
305 310 315 320
Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu Met Arg Glu Leu Thr
325 330 335
Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro Ala Asp Asp
340 345 350
Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu Val Ala Ala
355 360 365
Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg Trp Gly
370 375 380
Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys
385 390 395 400
Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile Ile Lys Asn
405 410 415
Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
420
＜210＞ 8
＜211＞ 89
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 8
Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro
1 5 10 15
Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu
20 25 30
Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe
35 40 45
Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr
50 55 60
Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile
65 70 75 80
Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
85
＜210＞ 9
＜211＞ 49
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 9
Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro
1 5 10 15
Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu
20 25 30
Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe
35 40 45
Arg
＜210＞ 10
＜211＞ 40
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 10
Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser
1 5 10 15
Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile Ile
20 25 30
Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
35 40
＜210＞ 11
＜211＞ 30
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 11
Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg Trp Gly Ser Pro
1 5 10 15
Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys
20 25 30
＜210＞ 12
＜211＞ 52
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 12
Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg Trp Gly Ser Pro
1 5 10 15
Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln
20 25 30
Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr
35 40 45
Lys Lys Gly Glu
50
＜210＞ 13
＜211＞ 72
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 13
Glu Leu Thr Gly Gln Arg Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu Val
1 5 10 15
Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg
20 25 30
Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser
35 40 45
Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile Ile
50 55 60
Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
65 70
＜210＞ 14
＜211＞ 14
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 14
Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp
1 5 10
＜210＞ 15
＜211＞ 14
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 15
Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala
1 5 10
＜210＞ 16
＜211＞ 14
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 16
Gly Pro Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu
1 5 10
＜210＞ 17
＜211＞ 14
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 17
Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu Val Ala Ala
1 5 10
＜210＞ 18
＜211＞ 14
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 18
His Ser Leu Leu Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro
1 5 10
＜210＞ 19
＜211＞ 14
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 19
Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe Arg
1 5 10
＜210＞ 20
＜211＞ 14
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 20
Tyr Arg Met Glu His Phe Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp
1 5 10
＜210＞ 21
＜211＞ 14
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 21
Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met
1 5 10
＜210＞ 22
＜211＞ 14
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 22
Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr
1 5 10
＜210＞ 23
＜211＞ 14
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 23
Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys
1 5 10
＜210＞ 24
＜211＞ 14
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 24
Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile Ile Lys Asn Ala
1 5 10
＜210＞ 25
＜211＞ 12
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 25
Asn Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
1 5 10
＜210＞ 26
＜211＞ 89
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Human analog
＜400＞ 26
Ala Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro
1 5 10 15
Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu
20 25 30
Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe
35 40 45
Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr
50 55 60
Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile
65 70 75 80
Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
85
＜210＞ 27
＜211＞ 89
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Human analog
＜400＞ 27
Glu Leu Ser Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro
1 5 10 15
Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu
20 25 30
Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe
35 40 45
Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr
50 55 60
Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile
65 70 75 80
Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
85
＜210＞ 28
＜211＞ 89
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Human analog
＜400＞ 28
Glu Leu Thr Gly Glu Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro
1 5 10 15
Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu
20 25 30
Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe
35 40 45
Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr
50 55 60
Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile
65 70 75 80
Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
85
＜210＞ 29
＜211＞ 89
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Human analog
＜400＞ 29
Glu Leu Thr Gly Gln Arg Asp Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro
1 5 10 15
Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu
20 25 30
Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe
35 40 45
Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr
50 55 60
Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile
65 70 75 80
Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
85
＜210＞ 30
＜211＞ 89
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Human analog
＜400＞ 30
Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Ala Asp Gly Pro Asp Gly Pro
1 5 10 15
Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu
20 25 30
Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe
35 40 45
Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr
50 55 60
Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile
65 70 75 80
Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
85
＜210＞ 31
＜211＞ 89
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Human analog
＜400＞ 31
Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Glu Pro
1 5 10 15
Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu
20 25 30
Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe
35 40 45
Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr
50 55 60
Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile
65 70 75 80
Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
85
＜210＞ 32
＜211＞ 89
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Human analog
＜400＞ 32
Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro
1 5 10 15
Gly Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu
20 25 30
Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe
35 40 45
Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr
50 55 60
Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile
65 70 75 80
Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
85
＜210＞ 33
＜211＞ 89
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Human analog
＜400＞ 33
Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro
1 5 10 15
Ala Asp Asp Gly Ala Gly Phe Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu
20 25 30
Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe
35 40 45
Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr
50 55 60
Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile
65 70 75 80
Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
85
＜210＞ 34
＜211＞ 89
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Human analog
＜400＞ 34
Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro
1 5 10 15
Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Glu Leu Leu
20 25 30
Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Pro Tyr Arg Met Glu His Phe
35 40 45
Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr
50 55 60
Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile
65 70 75 80
Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
85
＜210＞ 35
＜211＞ 89
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: Human analog
＜400＞ 35
Glu Leu Thr Gly Gln Arg Leu Arg Glu Gly Asp Gly Pro Asp Gly Pro
1 5 10 15
Ala Asp Asp Gly Ala Gly Ala Gln Ala Asp Leu Glu His Ser Leu Leu
20 25 30
Val Ala Ala Glu Lys Lys Asp Glu Gly Ser Tyr Arg Met Glu His Phe
35 40 45
Arg Trp Gly Ser Pro Pro Lys Asp Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Thr
50 55 60
Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr Leu Phe Lys Asn Ala Ile
65 70 75 80
Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
85

Claims (39)

  1. 서열 2, 서열 5 및 서열 7로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 실질적으로 순수한 단백질.
  2. 제1항의 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 화합물.
  3. 제2항의 단리된 핵산 화합물을 포함하는 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 단리된 핵산 화합물이 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 것인 벡터.
  5. 제4항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  6. 제5항의 벡터를 적절한 수단에 의해 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하는, 베타-리포트로핀을 발현할 수 있는 재조합 숙주 세포의 제작 방법.
  7. 제6항의 방법으로 얻은 재조합 숙주 세포를 유전자 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는 상기 숙주 세포 내에서의 베타-리포트로핀의 발현 방법.
  8. 활성 성분으로서 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 이를 위한 1종 이상의 제약상 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 제제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 베타-리포트로핀이 사람 베타-리포트로핀인 제약 제제.
  10. 당뇨병 또는 이의 합병증을 치료하는 데 사용하기 위한 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편.
  11. 치료 유효량의 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체를 투여하는 것을 포함하는 포유동물의 당뇨병 치료 방법.
  12. 치료 유효량의 베타-리포트로핀의 기능성 단편을 투여하는 것을 포함하는 포유동물의 당뇨병 치료 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 베타-리포트로핀이 서열 8의 서열을 갖는 사람 베타-리포트로핀인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 베타-리포트로핀이 재조합 사람 베타-리포트로핀인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 당뇨병이 1형 또는 2형 당뇨병인 방법.
  16. 제11항에 있어서, 상기 포유동물이 사람인 방법.
  17. 치료 유효량의 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 투여하는 것을 포함하는 당뇨병 합병증 치료가 필요한 환자의 당뇨병 합병증 치료 방법.
  18. 유효량의 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 투여함으로써 포유동물의 혈당량을 낮추는 방법.
  19. 유효량의 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 투여함으로써 과혈당증의 치료가 필요한 포유동물의 과혈당증을 치료하는 방법.
  20. 유효량의 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 투여함으로써 포유동물의 과인슐린혈증을 치료하는 방법.
  21. 유효량의 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 투여함으로써 포유동물의 인슐린 감수성을 증진시키는 방법.
  22. (a) 측쇄 관능기를 가질 수 있으며 α-아미노기를 갖는 보호된 아미노산을 활성화시켜 반응성 에스테르를 형성하는 단계,
    (b) 상기 활성화된 아미노산을 불활성 고체 지지체에 부착시키는 단계,
    (c) 제1 아미노산의 α-아미노기가 탈보호되어 반응성 아민이 생성되면, 제2 활성화된 아미노산이 제1 아미노산과 반응하여 고체 지지체 상에서 디펩티드가 형성되도록, 제2의 보호된 아미노산을 에스테르로 활성화시키는 단계,
    (d) 상기 (a) 단계부터 (c) 단계까지를 반복하는 단계
    (e) 상기 고체 지지체로부터 펩티드를 제거하고 측쇄 관능기를 탈보호시키는 단계,
    (f) 상기 펩티드를 고상 지지체와 분리시키는 단계 및
    (g) 상기 펩티드를 임의의 적절한 수단을 통해 정제하는 단계를 포함하며,
    여기서, (h) 상기 베타-리포트로핀(BLT) 서열이 ser-pro-pro 트리펩티드 세그먼트를 포함하는 경우 상기 pro 잔기들의 다중 커플링을 수행하는 단계,
    (i) 상기 커플링의 완료후, 미반응 탈보호 펩티드를 차단하여 결실 펩티드의 사슬 연장을 억제하는 단계 및
    (j) 상기 BLT 서열이 asp-gly 디펩티드 서열을 포함하는 경우, asp 잔기 앞에 오는 각 글리신 잔기에 N-α보호기를 사용하는 것을 포함하는,
    1회 운전에 의해 베타-리포트로핀 또는 이의 유사체 또는 기능성 단편을 합성하는 고상 합성 방법.
  23. (a) 베타-리포트로핀을 코딩하는 발현 벡터로 적절한 숙주를 형질전환시키는 단계,
    (b) 상기 베타-리포트로핀을 발현할 수 있는 조건하에서 상기 형질전환된 숙주를 배양하는 단계, 및
    (c) 상기 베타-리포트로핀을 적절한 수단을 통해 정제하는 단계를 포함하는 제1항의 베타-리포트로핀의 제조 방법.
  24. (a) 인슐린 불감성 및 상승된 혈당량을 나타내는 포유동물에게 시험 단백질을 투여하는 단계 및
    (b) 이 (a) 단계 이후에 혈당량 및 혈중 인슐린 농도를 적절한 수단으로 시험하는 단계를 포함하는 베타-리포트로핀 활성의 분석 방법.
  25. 제11항에 있어서, 상기 베타-리포트로핀이 서열 2, 서열 5, 서열 7, 및 서열 8로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
  26. 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 및 서열 13으로 구성된 군에서 선택된 인슐린영양 활성이 있는 펩티드.
  27. 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24 및 서열 25로 구성된 군에서 선택된 인슐린영양 활성이 있는 펩티드.
  28. 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24 및 서열 25로 구성된 군에서 선택된 인슐린영양 활성이 있는 펩티드.
  29. 치료 유효량의 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24 및 서열 25로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩티드를 투여하는 것을 포함하는 당뇨병 치료 방법.
  30. 치료 유효량의 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 및 서열 13으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩티드를 투여하는 것을 포함하는 당뇨병의 치료 방법.
  31. 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 서열 24 및 서열 25로 구성된 군에서 선택된 인슐린영양 활성이 있는 펩티드를 활성 성분으로서 함유하는 제약 제제.
  32. 베타-리포트로핀의 기능성 유사체.
  33. 시험관내 또는 생체내에서 인슐린영양 활성을 갖는 베타-리포트로핀의 단편.
  34. 1번 위치의 잔기가 Glu, Ala, Asp, Gln 중 하나이고,
    2번 위치의 잔기가 Leu, Ile, Val, Met 중 하나이고,
    3번 위치의 잔기가 Thr, Ala, Glu, Ser, Pro, Gly 중 하나이고,
    4번 위치의 잔기가 Gly, Arg, Ala, Leu, Pro, Ser 중 하나이고,
    5번 위치의 잔기가 Glu, Gln, Asp, Asn, Ala 중 하나이고,
    6번 위치의 잔기가 Arg, Glu, Leu, Lys, Gln, Ala 중 하나이고,
    7번 위치의 잔기가 Leu, Pro, Asp, Val, Ile, Met 중 하나이고,
    8번 위치의 잔기가 Arg, Glu, Ala, Tyr, Leu, Lys, Pro, Gln, Trp 중 하나이고,
    9번 위치의 잔기가 Glu, Ala, Pro, Asp, Asn, Gln 중 하나이고,
    10번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser, Asp 중 하나이고,
    11번 위치의 잔기가 Asp, Arg, Pro, Asn, Gln, Ala, Glu 중 하나이고,
    12번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser, Met 중 하나이고,
    13번 위치의 잔기가 Pro, Glu, Gly, Val 중 하나이고,
    14번 위치의 잔기가 Asp, Glu, Asn, Gln, Gly 중 하나이고,
    15번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser, Glu 중 하나이고,
    16번 위치의 잔기가 Pro, Gln, Leu, Gly, Glu 중 하나이고,
    17번 위치의 잔기가 Ala, Asp, Ser, Gly 중 하나이고,
    18번 위치의 잔기가 Asp, Glu, Gln, Asn 중 하나이고,
    19번 위치의 잔기가 Asp, Glu, Asn, Gln 중 하나이고,
    20번 위치의 잔기가 Gly, Ser, Ala 중 하나이고,
    21번 위치의 잔기가 Ala, Gly, Ser, Phe 중 하나이고,
    22번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser, Lys 중 하나이고,
    23번 위치의 잔기가 Ala, Phe, Thr, Gly, Ser, Leu 중 하나이고,
    24번 위치의 잔기가 Gln, Arg, Asp, Asn, Leu, Val 중 하나이고,
    25번 위치의 잔기가 Ala, Leu, Asp, Ile, Gly, Ser, Thr 중 하나이고,
    26번 위치의 잔기가 Asp, Glu, Gly, Asn, Gln, Lys 중 하나이고,
    27번 위치의 잔기가 Leu, Ala, Ile, Met, Val 중 하나이고,
    28번 위치의 잔기가 Glu, Gln, Asn, Asp 중 하나이고,
    29번 위치의 잔기가 His, Asn, Tyr, Ala, Gln, Glu 중 하나이고,
    30번 위치의 잔기가 Ser, Gly, Glu, Ala, Leu, Asp 중 하나이고,
    31번 위치의 잔기가 Leu, Ala, Val, Met, Ile 중 하나이고,
    32번 위치의 잔기가 Leu, Ala, Val, Ile, Met, Pro 중 하나이고,
    33번 위치의 잔기가 Val, Ala, Glu, Leu, Ile, Met, Arg 중 하나이고,
    34번 위치의 잔기가 Ala, Ser, Pro, Glu, Gly 중 하나이고,
    35번 위치의 잔기가 Ala, Asp, Gly, Ser, Leu 중 하나이고,
    36번 위치의 잔기가 Glu, Ala, Thr, Leu, Asp, Asn, Gln 중 하나이고,
    37번 위치의 잔기가 Lys, Glu, Thr, Arg, Gln, Asp 중 하나이고,
    38번 위치의 잔기가 Lys, Arg, Gln, Glu 중 하나이고,
    39번 위치의 잔기가 Asp, Ala, Asn, Glu, Gln, Lys 중 하나이고,
    40번 위치의 잔기가 Glu, Ser, Asp, Asn, Gln, Gly 중 하나이고,
    41번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser 중 하나이고,
    42번 위치의 잔기가 Pro, Gly, Ser, Asn 중 하나이고,
    43번 위치의 잔기가 Tyr, Phe, Trp 중 하나이고,
    44번 위치의 잔기가 Arg, Lys, Gln, Glu 중 하나이고,
    45번 위치의 잔기가 Met, Ile, Ser, Val 중 하나이고,
    46번 위치의 잔기가 Glu, Gln, Asp, Asn, His, Arg, Gly 중 하나이고,
    48번 위치의 잔기가 Tyr, Trp 중 하나이고,
    49번 위치의 잔기가 Arg, Lys 중 하나이고,
    50번 위치의 잔기가 Trp, Tyr, Phe 중 하나이고,
    51번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser, Gln 중 하나이고,
    52번 위치의 잔기가 Ser, Thr, Asn, Ala 중 하나이고,
    53번 위치의 잔기가 Pro, Gly 중 하나이고,
    54번 위치의 잔기가 Pro, Ala, Gly, Arg, Leu, Thr 중 하나이고,
    55번 위치의 잔기가 Lys, Arg, Gln, Ala 중 하나이고,
    56번 위치의 잔기가 Asp, Asn, Glu, Gln, Ala, Gly, Ile 중 하나이고,
    57번 위치의 잔기가 Lys, Gln, Arg 중 하나이고,
    58번 위치의 잔기가 Arg, Gln, Lys 중 하나이고,
    59번 위치의 잔기가 Tyr, Phe, Trp 중 하나이고,
    60번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser 중 하나이고,
    61번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser 중 하나이고,
    62번 위치의 잔기가 Phe, Tyr, Trp 중 하나이고,
    63번 위치의 잔기가 Met, Leu, Ile, Val 중 하나이고,
    64번 위치의 잔기가 Thr, Ala, Ser, Lys 중 하나이고,
    65번 위치의 잔기가 Ser, Ala, Thr, Pro 중 하나이고,
    66번 위치의 잔기가 Glu, Asp, Asn, Lys, Gln 중 하나이고,
    67번 위치의 잔기가 Lys, Arg, Gln 중 하나이고,
    68번 위치의 잔기가 Ser, Ala, Thr, Gly 중 하나이고,
    69번 위치의 잔기가 Gln, Glu, Asp, Asn, Arg, His 중 하나이고,
    70번 위치의 잔기가 Thr, Ser, Ala, Lys 중 하나이고,
    71번 위치의 잔기가 Pro, Gly 중 하나이고,
    72번 위치의 잔기가 Leu, Ile, Met, Val 중 하나이고,
    73번 위치의 잔기가 Val, Leu, Ile, Met 중 하나이고,
    74번 위치의 잔기가 Thr, Ala, Ser 중 하나이고,
    75번 위치의 잔기가 Leu, Ile, Met, Val 중 하나이고,
    76번 위치의 잔기가 Phe, Tyr, Trp, Leu 중 하나이고,
    77번 위치의 잔기가 Lys, Gln, Arg 중 하나이고,
    78번 위치의 잔기가 Asn, Asp, Glu, Gln, His 중 하나이고,
    79번 위치의 잔기가 Ala, Gly, Ser, Ile, Val 중 하나이고,
    80번 위치의 잔기가 Ile, Leu, Met, Val, Thr 중 하나이고,
    81번 위치의 잔기가 Ile, Met, Val, Thr, Leu 중 하나이고,
    82번 위치의 잔기가 Lys, Gln, Arg 중 하나이고,
    83번 위치의 잔기가 Asn, Asp, Glu, Gln, Ser 중 하나이고,
    84번 위치의 잔기가 Ala, Val, Ser, Gly, Glu 중 하나이고,
    85번 위치의 잔기가 Tyr, Phe, Trp, His 중 하나이고,
    86번 위치의 잔기가 Lys, Gln, Arg 중 하나이고,
    87번 위치의 잔기가 Lys, Gln, Arg 중 하나이고,
    88번 위치의 잔기가 Gly, Ala, Ser 중 하나이고,
    89번 위치의 잔기가 Glu, Gln, Asp, Asn, His 중 하나인 것으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 치환을 포함하는, 서열 8과 약 90 % 내지 95 %가 동일한 베타-리포트로핀의 기능성 유사체.
  35. 제34항에 있어서, 상기 유사체가 서열 8과 약 95 % 내지 99%가 동일한 베타-리포트로핀의 기능성 유사체.
  36. 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 및 서열 22로 구성된 군에서 선택된 인슐린영양 활성이 있는 펩티드.
  37. 제22항에 있어서, 상기 (h) 단계에서 BLT 서열이 ser-pro-pro 트리펩티드 세그먼트를 포함하는 경우 상기 pro 및 ser 잔기의 이중 커플링이 수행되며,
    (i) 단계에서 상기 커플링 단계의 완료 후에, 미반응 탈보호된 펩티드를 무수물로 차단하여 결실 펩티드의 사슬 연장을 억제하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, (j) 단계의 상기 N-α보호가 N-α-Hmb 또는 메틸 벤조에이트를 포함하는 것인 방법.
  39. 서열 8과 90 % 이상 동일한 베타-리포트로핀의 기능성 유사체.
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