FR2837385A1

FR2837385A1 - Procede d'obtention de phytoalexines

Info

Publication number: FR2837385A1
Application number: FR0203423A
Authority: FR
Inventors: Rachid Ennamany; Jean Michel Merillon
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-03-20
Filing date: 2002-03-20
Publication date: 2003-09-26
Anticipated expiration: 2022-03-20
Also published as: WO2003077880A1; AU2002334321A1; US20050265953A1; FR2837385B1; ES2482697T3

Abstract

L'invention a pour objet une composition à usage topique, en particulier cosmétique, riche en métabolites produits par des cellules végétales. En particulier, l'invention a pour objet une composition contenant des cellules végétales dédifférenciées et élicitées puis séchées partiellement ou totalement de préférence lyophilisées, broyées et dispersées dans cette composition. L'invention a également pour objet un procédé de préparation de phytoalexine (s), dans lequel :- on met dans un milieu de culture des cellules végétales dédifférenciées, - après culture, on élicite les cellules dans le milieu de culture, - on sèche, de préférence on lyophilise, les cellules dédifférenciées, - on soumet éventuellement les cellules dédifférenciées élicitées séchées à un ou plusieurs lavages et séchages, - on broie les cellules dédifférenciées, élicitées et séchées, et on extrait une ou plusieurs phytoalexines des cellules broyées, éventuellement après une étape de remise des cellules broyées dans un milieu, en particulier un milieu aqueux et / ou alcoolique.

Description

PROCEDE D'OBTENTION DE PHYTOALEXINES.

L'invention a pour objet une composition à usage topique, en particulier cosmétique, riche en métabolites produits par des cellules végétales. En particulier, l'invention a pour objet une composition contenant des cellules végétales dédifférenciées et élicitées puis séchées partiellement ou totalement de préférence, lyophilisées, broyées et dispersées dans cette composition.

Par cellules végétales dédifférenciées, on entend toute cellule végétale ne présentant aucun des caractères d'une spécialisation particulière et capable de vivre par elle-même et non en dépendance avec d'autres cellules.

Les cellules végétales dédifférenciées peuvent être obtenues à partir de matériel végétal issu de plante entière ou de partie de plante comme les feuilles, les tiges, les fleurs, les pétales, les racines, les fruits, leur peau, l'enveloppe les protégeant, les graines, les anthères, la sève, les épines, les bourgeons, l'écorce, les baies, et des mélanges de ceux-ci.

Préférentiellement, les cellules végétales dédifférenciées sont obtenues à partir d'écorce, de feuilles, de bourgeons et de la peau des fruits.

Les cellules végétales dédifférenciées utilisables selon l'invention peuvent être obtenues à partir de végétaux obtenus par culture in vivo ou issu de culture in vitro.

Par culture in vivo on entend toute culture de type classique c'est à dire en sol à l'air libre ou en serre ou encore hors sol ou en milieu hydroponique.

Par culture in vitro, on entend l'ensemble des techniques connues de l'homme du métier qui permet de manière artificielle l'obtention d'un végétal ou d'une partie d'un végétal. La pression de sélection imposée par

les conditions physico-chimiques lors de la croissance des cellules végétales in vitro permet d'obtenir un matériel végétal standardisé, exempt de contaminations et disponible tout au long de l'année contrairement aux plantes cultivées in vivo.

Préférentiellement selon l'invention on utilise des cellules végétales dédifférenciées issues de culture in vitro.

Les cellules végétales dédifférenciées utilisables selon l'invention peuvent être obtenues par toute méthode connue de l'art antérieur. A cet égard on peut citer les méthodes décrites par E. F. George et P.D. Sherrington dans Plant Propagation by tissue culture, handbook and directory of commercial laboratories (Exegetics Ltd 1984).

Les milieux de culture utilisables selon l'invention sont ceux généralement connus de l'homme du métier. On peut citer à titre d'exemples les milieux de Gamborg, Murashige et Skoog, Heller, White etc.... On trouvera dans "Plant Culture Média : formulationsand uses" de E. F. George, DJM Puttock et H.J George (Exegetics Ltd 1987, tome 1 & 2) des descriptions complètes de ces milieux.

Préférentiellement selon l'invention on prépare les cellules végétales dédifférenciées cultivées sur milieu de Murashige et Skoog.

Etat de la technique On connaît par le document FR 2795637 une composition cosmétique contenant un extrait de cellules végétales dédifférenciées pour éviter les problèmes d'odeur. Cette composition contient un extrait de cellules végétales dédifférenciées mais non élicitées, de sorte que cette composition est pauvre en métabolites secondaires ou en phytoalexines, voire est sensiblement exempte de tels composés. De plus ce document décrit l'utilisation d'extrait aqueux obtenus après broyage des cellules dans leur milieu de culture puis élimination des particules en suspension avec une perte inévitable des métabolites liés aux particules en suspension. Afin

d'éliminer les protéases et notamment les oxydases ce document préconise également l'emploi de filtres capturant les molécules d'un poids moléculaire supérieur à 100. 000 daltons perdant ainsi dans l'extrait final tous les métabolites supérieurs à ce poids et qui peuvent s'avérer d'un grand intérêt pour l'industrie cosmétique. De plus afin d'éliminer les problèmes dus à l'oxydation le document préconise l'ajout de stabilisants, notamment la cystèine et/ ou des dérivés soufrés ce qui entraîne nécessairement une pureté moindre de l'extrait avec des étapes subséquentes de filtration. Les méthodes décrites dans ce document nécessitent la mise en oeuvre de moyens compliqués pour l'obtention d'extraits dont, tant la pureté ( nombreux additifs), que la qualité et la concentration ( en métabolites ) n'est pas optimale. De plus les nombreuses étapes nécessaires à l'obtention des extraits de ce procédé induisent des coûts élevés et le risque de contaminations de part les nombreuses manipulations et additifs.

On connaît les cultures de cellules dédifférenciées, d'autre part on connaît les mécanismes d'élicitation de ces cellules suivi d'étapes d'extractions et de filtrations diverses suivis de lyophilisation afin d'incorporer les extraits obtenus dans une préparation cosmétique ou pharmaceutique.

De nos jours, malgré les compétences et le savoir faire des industries dans le domaine de l'extraction végétale, et malgré les progrès de la chimie organique, plusieurs étapes d'extraction sont indispensables pour obtenir une matière première végétale.

Plusieurs inconvénients sont imputés à ces extractions : - perte de la structure tertiaire des molécules isolées, - présence des différents solvants au niveau du produit fini, - hétérogénéité des substrats nécessitant des extractions fines faisant appel à des solvants de plus en plus toxiques,

- qualité de l'extrait en fonction de l'état physiologique de la plante au moment de la récolte, - production de l'extrait limitée en fonction des saisons,
Face à ces facteurs limitants et au regain d'intérêt des consommateurs pour tout ce qui est d'origine naturelle, plusieurs tentatives d'obtention de cellules ont été réalisées. Ainsi, à ce jour, deux procédés majeurs ont été exploités : - La culture de cellules à partir d'organismes unicellulaires ou de microorganismes, technique peu originale se basant sur la reproduction des conditions de vie normale. Cependant ces organismes sont primitifs et ne développent pas de métabolisme secondaire, source des principes actifs les plus intéressants.

- L'obtention des cellules à partir de fruits (cellules fraîches) après digestion enzymatique. Les limites de ce procédé résident dans le fait que les fruits ne sont pas aseptiques et qu'ils peuvent contenir des résidus de pesticides (fongicides, herbicides, insecticides,...). D'autre part, les enzymes (cellulases, pectinases,... ) utilisées en quantité importante (2%, P/P) pour la digestion des parois végétales et l'obtention des cellules sans paroi (protoplastes) se retrouvent dans le produit fini. Par ailleurs, les enzymes utilisées peuvent altérer la qualité des métabolites. Enfin, l'utilisation de cette technique permet seulement de récupérer des protoplastes (cellules sans paroi cellulaire), structures fragiles ne pouvant pas orienter leur métabolisme.

L'inventeur a développé une technologie innovante et maîtrisée, garantissant la qualité et l'authenticité des produits. Il s'agit de la mise en culture de cellules de plantes supérieures dédifférenciées.

En effet, et pour la première fois, un procédé industriel permet d'obtenir des cellules à partir de plantes supérieures par un processus sans aucune modification de leur patrimoine génétique, permettant à la cellule de garder ses caractéristiques physiologiques.

Le maintien des différentes souches est assuré par repiquages réguliers, avec une maîtrise totale des différentes conditions de culture.

L'intérêt de ce procédé et qu'il permet la culture de cellules végétales dédifférenciées en grands volumes tout en répondant aux besoins de l'industrie, notamment : - Le respect de la structure tertiaire des molécules, - L'absence de solvant et de résidus, - L'homogénéité des substrats, - La production continue indépendamment du cycle des saisons, - La conservation des caractéristiques biologiques et physiologiques sans ajout de conservateur, - L'absence totale de polluants, - La production standardisée et reproductible quant à la qualité et la concentration des métabolites, - L'utilisation de ces suspensions végétales après lyophilisation directe. Cette technique permet l'obtention d'une poudre très fine pouvant être dispersée dans des compositions cosmétiques (crèmes, pommades, lotions...). Ces cellules sont susceptibles de libérer directement les principes actifs qu'elles contiennent, sans

passage par une extraction à l'aide de solvants organiques (élimination des risques de résidus).

- L'utilisation des extraits cellulaires uniquement après sonification et centrifugation.

Cette technologie apporte une alternative utile et innovante aux extractions conventionnelles par solvants. La possibilité d'orienter de manière naturelle (élicitation) la synthèse des métabolites sans porter atteinte à l'intégrité génétique des cellules, représente une garantie de qualité et d'authenticité.

De manière tout à fait surprenante l'inventeur a découvert que l'on pouvait directement incorporer ou disperser les cellules après élicitation, séchage et broyage dans une composition cosmétique et/ ou pharmaceutique. Ce procédé présente notamment l'avantage de désactiver les enzymes oxydants sans ajouts d'additifs ou de produits chimiques. Un autre aspect de l'invention permet de concentrer et de diriger la production de phytoalexines sans pertes quantitatives ou qualitatives dues aux extractions et aux filtrages. Un aspect particulier de l'invention est qu'il évite les étapes d'extraction et de filtrage et permet l'obtention d'un broyat de cellules dénué d'additifs, de solvants et de résidus, ledit broyat pouvant être directement dispersé dans une composition cosmétique.

Le but de la présente invention est de proposer un procédé simple excluant l'emploi d'additifs et de produits chimiques et respectant le caractère naturel des cellules obtenues. De plus l'élicitation par des moyens physiques permet de diriger et de concentrer la production de métabolites recherchés par l'industrie cosmétique. L'aspect particulier de l'invention en respectant l'intégrité des cellules obtenues et en les élicitant permet d'une

part d'optimiser la concentration et la qualité des métabolites obtenus, d'autre part de résoudre les problèmes d'oxydation en inactivant les enzymes par un simple séchage( lyophilisation ) sans ajout d'additifs et sans pertes dues aux filtrations et enfin permet la dispersion du broyat obtenu directement dans une préparation cosmétique.

Par élicitation dans le milieu de culture, on entend la mise en #uvre d'un stress ou d'une agression (biologique, chimique ou physique) sur les cellules dans leur milieu de culture afin de provoquer un ou plusieurs mécanismes de défense.

Tout au long de leur développement, les plantes sont soumises à des agressions continuelles de la part de leur environnement. Cependant, elles se montrent souvent capables de résister naturellement à ces agressions extérieures grâce à la présence ou à l'activation de mécanismes de défense (Hammond-Kosack et Jones, 1996). Ainsi, bien que certains de ces mécanismes soient constitutifs et fournissent une barrière physique et chimique à une agression, d'autres ne sont induits qu'après une attaque par un nuisible.

Dès qu'une plante détecte un pathogène, elle met en place un des systèmes de défense naturelle les plus efficaces : la réponse d'hypersensibilité. Au niveau du site de pénétration du pathogène, cette réaction, rapide et violente, se traduit par la mort des premières cellules infectées et l'apparition d'une petite zone nécrotique, isolant ainsi les cellules attaquées du reste de la plante (Dangl et al., 1996; Lamb et Dixon, 1997). Le déclenchement de cette réponse dépend d'une reconnaissance spécifique de l'agent pathogène par la plante hôte. En effet, la plante attaquée reconnaît par l'intermédiaire d'une protéine (récepteur) une protéine produite par le pathogène, nommée éliciteur. Chez la plante, les gènes codant pour les protéines réceptrices sont appelés gènes de résistance (gènes R), et pour le

pathogène, les gènes codant pour les molécules élicitrices sont nommés gènes d'avirulence (gène Avr) : on parle alors ici d'une relation gène pour gène ou relation R-Avr (Hammond-Kosack, 1996). D'autres molécules, qualifiées d'éliciteurs généraux, sont également capables d'initier (de façon moins spécifique que les éliciteurs cités précédemment) cette réaction de défense de la plante hôte. Celles-ci, sont le plus souvent des oligosaccharides libérés par le pathogène (éliciteurs exogènes) ou la cellule végétale (éliciteurs endogènes), (Scheel et Parker, 1996).

A cette réaction d'hypersensibilité succède l'activation d'une réaction de défense intense dans les cellules voisines de la zone infectée, c'est la réaction locale. Enfin, l'émission de divers signaux d'alerte vers toutes les autres organes de la plante, ce qui lui permet de réagir plus rapidement et plus efficacement lors d'une nouvelle agression, on parle alors de réaction systémique.

Lors de ces réactions, trois catégories de systèmes de défense peuvent être activés : - la formation d'un épiderme de cicatrisation et le renforcement des parois (lignification...) (Dai et al., 1995) ; - la synthèse de protéines de défense ou Pathogenesis Related (PRs) proteins découvertes en 1970 chez le Tabac. Parmi ces PRs on trouve, par exemple, des inhibiteurs de protéase (Ryan, 1992), des enzymes hydrolytiques, comme les chitinases ou les 8-1,3 glucanases (Derckel et al., 1996 ; Robinson et al., 1997, Kraeva et al., 1998 ; Salzman et al., 1998 ; Renault et al., 2000) ; - et la synthèse de métabolites secondaires de type phytoalexines. Parmi, les métabolites secondaires, plus de 300 phytoalexines ont déjà été caractérisés. Elles appartiennent à un large spectre de classes chimiques

différentes parmi lesquelles on pourra citer les coumarines, les benzofuranes, les terpènes, les alcaloïdes, certains polyphénols (Smith, 1996)...

La mise en place des réactions de défense des plantes implique toute une panoplie de signaux de transduction conduisant à l'induction rapide de l'expression de gènes de défense. Ainsi, la reconnaissance du pathogène par la plante hôte va activer toute une cascade de signaux dans les cellules attaquées tels que la phosphorylation de protéines par des protéines kinases, les flux d'espèces ioniques (Ca2+), la formation d'espèces oxygénées réactives (Coté et Hahn, 1994; Shibuya et al., 1996; Benhamou, 1996)...

De plus, les cellules attaquées sont capable de produire des signaux d'alarme transmis au cellules voisines (réaction locale) ainsi qu'à toute la plante engendrant ainsi, comme énoncé dans le paragraphe précédent, le phénomène de réaction systémique.

Le mécanisme de résistance systémique le plus étudié est le phénomène de SAR ou systemic acquired resistance . Le terme de SAR a été défini par Ross en 1961. Il décrit l'apparition de résistance d'une plante consécutive à une attaque par un pathogène, aussi bien dans les parties infectées que dans les parties saines de la plante. Elle se développe, en général, après l'apparition de lésions nécrotiques autour du site d'inoculation. Cette réponse d'hypersensibilité localisée restreint le pathogène dans, et autour du site d'infection, et semble rendre la plante plus résistante aux agressions par divers organismes (Ryals et al., 1996). Comment les parties distantes du site d'infection sont-elles capables d'acquérir cette résistance ? C'esten 1966 que Ross a développé l'idée de l'existence de molécules signal qui, à de faibles concentrations, seraient capables d'activer des mécanismes de défense dans les tissus distants de la zone infectée.

Trois types de molécules peuvent intervenir chez les plantes comme signal d'alarme au niveaux intra et intercellulaire, à courte ou longue distance : l'acide salicylique, l'éthylène et les jasmonates.

Le mécanisme de transduction le plus étudié et le mieux connu dans le développement de la SAR est celui impliquant l'acide salicylique (AS) (Delaney et al., 1994 ; Ryals et al., 1996).

D'une part, l'acquisition de résistance de certaines plantes est directement liée à une augmentation de la synthèse endogène d'AS ou de ses dérivés (Malamy et al., 1990 ; Métraux et al., 1990 ; Rasmussen et al., 1991 ; Smith-Becker et al., 1998). Dans ce type de réponse, lorsque la synthèse d'AS est initiée, la transduction du signal s'effectuerait à longue distance, soit par transport direct de l'AS (Shulaev et al., 1995), soit par conversion de ce dernier en méthyl salicylate (MeSa), molécule-signal volatile pouvant entraîner l'apparition de résistance dans les tissus sains de la plante infectée mais aussi dans les plantes voisines (Shulaev et al., 1997).

De plus, la mise en évidence du rôle joué par l'AS dans le déclenchement de la SAR est liée à l'utilisation de plants de Tabac transgéniques exprimant le gène bactérien NahG. Ce gène, codant pour la salicylate hydroxylase, inactive l'AS en le convertissant en catéchol, rendant ainsi les plantes transformées incapables de développer une SAR (Gaffney et al., 1993).

D'autre part, certaines études montrent que l'application d'AS exogène est capable d'induire une résistance à différentes lésions causées par une bactérie, un virus ou un pathogène. Ainsi, chez le Tabac, on observe une réduction des symptômes liés à l'inoculation du virus de la Mosaïque du Tabac après traitement des plants par l'AS (White et al., 1983). De même, l'AS est capable de stimuler la biosynthèse de différentes protéines PRs normalement produites dans le cas d'une SAR (Renault et al., 1996 ; Narusaka et al., 1999).

Différentes études ont montré que certaines réactions de défense pouvaient être activées indépendamment de la présence d'AS. Ainsi, d'autres types de molécules ont été reconnues comme molécules-signal de la SAR (Enyedi et al., 1992; Pieterse et al., 1999). Ces réactions feraient intervenir principalement deux régulateurs de croissance végétale, l'éthylène et l'acide jasmonique (AJ), comme signaux d'induction de défense systémique. En effet, ces deux types de molécules peuvent être rapidement produites, de façon endogène, lorsqu'une plante est soumise à une agression, et entraîner ainsi l'apparition d'une résistance. De, plus elles sont également capables d'induire l'expression de certaines PRs et/ou la production de phytoalexines.

L'éthylène est une phytohormone volatile intervenant dans de nombreux processus physiologiques des plantes. Son rôle dans les phénomènes de défense végétale a été démontré par plusieurs équipes. Des études ont montré que l'attaque d'une plante par un pathogène ou un herbivore pouvait être corrélée à une induction ou une augmentation de la synthèse d'éthylène endogène dans la plante hôte (O'Donnell et al., 1996 ; Popp et al., 1997 ; Lund et al., 1998). De plus, tout comme l'AS, l'application d'éthylène exogène est également capable de stimuler la synthèse de protéines PRs (Ward et al., 1991 ; Penninckx et al., 1996 ; Yang et al., 1997). Enfin, l'activation de protéines de défense chez Arabidopsis en réponse à un pathogène peut être bloquée dans le cas de mutants déficients dans la perception de ce signal (Pennickx et al., 1998).

L'acide jasmonique et son méthyl ester, le méthyl jasmonate (MeJa), sont des composés naturels de type cyclopentanone analogues aux prostaglandines animales par leur biosynthèse et leur fonction (Creelman et al., 1992 ; Mason et al., 1993 ; Sadka et al., 1994). Ils dérivent des acides gras et sont synthétisés à partir de l'oxydation lypoxygénase-dépendante de l'acide a-linolénique. On parle de voie octadécanoïque (Figure 2).

Outre leur rôle dans diverses fonctions physiologiques (Stawick, 1992), ces composés ont récemment été impliqués en tant que molécules de signalisation intracellulaire synthétisées en réponse à un stress, biotique ou abiotique, et menant aux réponses de défense des plantes, comme la biosynthèse de phytoalexines ou de protéines de défense (Gundlach et al., 1992 ; Blechert et al., 1995 ; Creelman et al., 1995 ; Doares et al., 1995 ; Conconi et al., 1996a et 1996b ; Ignatov et al., 1996 ; Baldwin et al., 1997).

D'une part, l'application de MeJa, dérivé volatile de l'acide jasmonique, induit la production de nombreux métabolites secondaires, in vivo ou in vitro (en cultures cellulaires), dont certains jouent le rôle de composés de défense. En effet, cet ester est capable d'éliciter la biosynthèse de furanocoumarines dans les feuilles de Céleri (Miksch et Boland, 1996), de momilactone A dans des cultures cellulaires de Riz (Nojiri et al., 1996), d'alcaloïdes de jeunes plants ou de cultures cellulaires de Catharanthus roseus (Aerts et al., 1996 ; Gantet et al., 1997) et de jeunes plants de Cinchona ledgeriana (Aerts et al., 1994; 1996). D'autres dérivés précurseurs de l'AJ, comme l'acide 12-oxo-phytodiénoïque, sont capables d'agir sur la biosynthèse de nombreux métabolites secondaires.

L'effet inducteur de ces composés est souvent précédé d'une activation de l'expression des gènes ou de la synthèse d'enzymes intervenant dans la biosynthèse de ces divers métabolites. Parmi ces enzymes, on trouve la phénylalanine ammonialyase (PAL), la 4-coumarate-CoA ligase (4CL), la chalcone synthase (CHS), la dihydroflavonol-4-reductase (DFR), la polyphénol oxydase (PPo), la bercaptol methyl transférase (BMT), la tyrosine/dopa décarboxylase (TYDC),... (Dittrich et al., 1992 ; Gundlach et al., 1992 ; et al., 1993 ; et al., 1995 ; et al., 1996 ; Facchini et al., 1996 ; Ignatov et al., 1996 ; Lee et al., 1997 ; Yasaki et al., 1997 ; Constanbel et Ryan, 1998).

D'autre part, l'exposition de plantes à des vapeurs de MeJa, permet d'éliciter des mécanismes de défense similaires à ceux induits par des insectes, des herbivores, une blessure ou les UV (Farmer et Ryan, 1990 ; 1992 ; Conconi et al., 1996b ; et al., 2000). Ainsi, les jasmonates, et en particulier le MeJa, sont capables d'induire la biosynthèse de protéines de défense et de stress, encore appelées JIPs (Jasmonate Induced Proteins), (Reinbothe et al., 1994).

De plus, le traitement de plants de Tomate, de Pomme de terre ou de Luzerne par le MeJa, induit l'expression d'inhibiteurs de protéase (Farmer et Ryan, 1990, 1992 ; Hildmann et al., 1992 ; Pena-Cortes et al., 1992 ; Lee et al., 1996), la biosynthèse de thionine chez l'Orge (Reinbothe et al., 1997), de protéines riche en proline ou de Vsp (Vegetative storage protéins) des graines de Soja (Stawick et al., 1991 ; et al., 1992 ; Mason et al., 1992, 1993 ; Berger et al., 1995).

Enfin, il est également impliqué dans la régulation de la biosynthèse de protéines participant à la transduction des signaux en réponse à un stress, comme par exemple les lypoxygenases (Saravitz et Siedow, 1996) ou bien encore la systémine (Reinbothe et al., 1994 ; et al., 1996).

De ce fait, il n'est pas étonnant que différentes équipes aient montré une diminution de l'incidence de certaines maladies suite à un traitement de la plante concernée par les vapeurs de MeJa (Cohen et al., 1993 ; et al., 1998 ; Thomma et al., 1998 ; Vijayan et al., 1998 ; Thomma et al., 2000).

De plus, J.S. Thaler (1999) montre que pour de nombreuses plantes, divers mécanismes de défense contre l'attaque d'herbivores sont induits par l'intermédiaire de la voie octadécanoïque et seraient ainsi impliqués dans l'attraction d'ennemis naturels. Par exemple, elle démontre que le traitement de plants par l'AJ augmente le parasitisme des chenilles de nuisibles.

Chez la Vigne, les mécanismes de signalisation impliqués dans l'expression des réactions de défense ne sont pas encore bien connus. Cependant, on retrouve la synthèse des trois types de molécules de défense (lignine, protéines de défense et phytoalexines). En particulier, le rôle de phytoalexines est notamment tenu par une famille de composés originaux : les polyphénols (Deloire et al., 2000).

Présents en plus ou moins grandes quantités dans tous les organes de la plante, les phytoalexines ils sont inductibles au niveau des feuilles et des baies. Ce type d'induction est désigné sous le terme d'élicitation. Les facteurs d'élicitation (ou éliciteurs) peuvent avoir des origines différentes.

Il peut s'agir : - d'élicitation biotique, par exemple lors d'une agression par un pathogène comme Botrytis cinerea, agent de la Pourriture grise (Jeandet et al., 1995 ; Bavaresco et al., 1997), Plasmopara viticola, agent du Mildiou (Dercks et Creasy, 1989) ou Phomopsis viticola, responsable de l'Excoriose (Hoos et Blaich, 1990).

- d'élicitation abiotique par les facteurs environnementaux tels que U.V., température, lumière, asphyxie, agents naturels extraits d'autres plantes (Jeandet et al., 1997 ; Langcake et Pryce, 1977b ; Douillet-Breuil et al., 1999), le chlorure d'aluminium (Adrian et al., 1996) ou l'ozone (Sarig et al., 1996).

Lors d'une élicitation, des phytoalexines comme le trans-resvératrol, le trans-picéide, l'#-viniférine et le ptérostilbène, peuvent être induits au niveau des feuilles et des baies (Soleas et al., 1997). Cette propriété de biosynthèse de novo des phytoalexines en réponse à un stress, et en particulier après attaque par un pathogène, suggère que ces molécules pourraient jouer le rôle de moyen de défense naturelle des plantes.

Ce rôle de molécules de défense est corroboré par certaines études qui semblent indiquer une corrélation étroite entre le niveau de résistance naturelle de la plante et son aptitude à synthétiser ces molécules. Par exemple, Langcake et Mc Carthy (1979) ont mis en évidence une relation entre la résistance de certaines espèces du genre Vitis à Botrytis cinerea ou Plasmopara viticola et leur capacité de biosynthèse de phytoalexines (resvératrol et viniférine). De plus, Dercks et Creasy (1989) ont montré que les espèces résistantes à Plasmopara viticola produisent cinq fois plus de phytoalexines que les espèces sensibles. De même, à l'intérieur de l'espèce Vinifera, on trouve des cépages plus ou moins tolérants à l'attaque par des champignons selon leur capacité de production de phytoalexines.

L'élicitation des cellules peut être opérée au moyen d'agents ou de stress divers, tels que pression, dépression, vide, variation de pression, présence d'un gaz, atmosphère variable, température, froid, lumière, cycle de luminosité, radiation, toxine, toxine végétale, agitation, bactérie, virus, fungi, microorganisme, ultrason, IR, UV, asphyxie, etc.

Toute méthode d'élicitation connue de l'homme du métier peut être utilisée pour préparer un broyat utilisable dans la composition selon l'invention.

Ainsi, les broyats utilisables selon l'invention peuvent prendre toute forme connue. On peut, en particulier, citer les broyats aqueux, alcooliques, notamment éthanoliques ou encore hydroalcooliques.

Préférentiellement selon l'invention, le broyat est un broyat aqueux ou un broyat sec ou sensiblement sec.

Avantageusement, le broyat peut dans une étape subséquente être lyophilisé.

L'invention a donc pour objet une composition cosmétique contenant au moins un broyat de cellules végétales dédifférenciées, caractérisée en ce que ledit broyat est un broyat de cellules végétales dédifférenciées, cultivées dans un milieu de culture et élicitées dans le milieu de culture, ledit broyat étant dispersé dans ladite composition ou étant sous une forme apte à être dispersé dans ladite composition.

Par exemple, la composition contient de 0,01 à 25% en poids, avantageusement de 0,01 à 5 % en poids de broyat de cellules végétales dédifférenciées, ce poids étant calculé sous forme sèche.

De façon avantageuse, la composition contient un broyat de cellules végétales dédifférenciées et élicitées. De préférence, le broyat est un broyat sec ou sensiblement sec de cellules végétales dédifférenciées et élicitées, ledit broyat sec ou sensiblement sec contenant une teneur en eau inférieure à 25% en poids, avantageusement inférieure à 15% en poids, de préférence inférieure à 10% en poids. En particulier, ledit broyat sec ou sensiblement sec contient une quantité d'eau suffisante pour assurer l'intégrité de la membrane des cellules.

Le broyat a avantageusement une granulométrie moyenne de particules solides inférieure à 100 um, avantageusement inférieure à 10 m, de préférence inférieure à 1 m.

Selon une forme de réalisation particulière, ledit broyat de cellules végétales dédifférenciées et élicitées contient au moins une phytoalexine synthétisée par l'élicitation des cellules végétales dédifférenciées.

Selon une particularité avantageuse d'une forme de réalisation, ledit broyat de cellules végétales dédifférenciées et élicitées est un broyat de cellules végétales dédifférenciées et élicitées par un agent dans le milieu de culture, ledit broyat étant sensiblement exempt dudit agent après élicitation.

Le broyat de cellules végétales dédifférenciées, élicitées puis séchées se présente par exemple sous une forme apte à être dispersé dans une composition cosmétique et/ou pharmaceutique.

Selon une autre particularité avantageuse d'une forme de réalisation, ledit broyat de cellules végétales dédifférenciées et élicitées est un broyat de cellules végétales dédifférenciées et élicitées par un agent dans le milieu de culture, ledit agent étant un agent dont la présence est souhaité dans la composition cosmétique, tel que par exemple, un tensioactif, un agent dispersant, un acide, etc.

Selon une forme de réalisation préférée, les cellules dédifférenciées sont élicitées par un agent volatile, en particulier un gaz, tel que du C02.

Selon une forme de réalisation préférée, les cellules dédifférenciées sont élicitées par un agent physique, en particulier la température, la lumière, les champs électromagnétiques, les UV, la pression, l'asphyxie.

Selon un détail d'une forme de réalisation, ledit broyat de cellules végétales dédifférenciées et élicitées contient au moins un composé terpénique ou tannique ou polyphénolique, ledit composé étant synthétisé par l'élicitation des cellules végétales dédifférenciées dans leur milieu de culture.

Avantageusement, le broyat de cellules végétales dédifférenciées et élicitées se présente sous la forme d'une suspension visqueuse ou d'un gel ou d'une poudre sensiblement sèche, ladite suspension, gel ou poudre étant avantageusement sous une forme apte à être dispersée dans la composition.

Selon une forme de réalisation particulière, le broyat de cellules est un broyat de cellules de vigne dédifférenciées et élicitées.

Selon un détail d'une forme de réalisation préférentielle, la composition contient un broyat de cellules dédifférenciées, cultivées et élicitées dans leur milieu de culture.

L'invention a encore pour objet, un procédé de préparation d'une composition à usage topique selon l'invention. Dans ce procédé, on met des cellules végétales dédifférenciées dans un milieu de culture de manière à permettre une croissance des cellules, on élicite lesdites cellules végétales différenciées dans leur milieu de culture pendant une période de temps suffisante pour la synthèse d'une quantité suffisante de métabolites, et on mélange au moins un broyat des cellules végétales élicitées du milieu de culture avec un ou plusieurs excipients pour préparer une composition cosmétique.

De façon avantageuse, on sépare des cellules élicitées du milieu de culture, et on soumet ledit extrait à un séchage, suivi d'un broyage.

De préférence, on élicite les cellules dans leur milieu de culture au moyen d'un agent, qui après extraction des cellules élicitées ne se retrouve pas dans le broyat de cellules élicitées.

Par exemple, les cellules végétales dédifférenciées sont mises en culture, élicitées dans le milieu de culture, séchées, puis broyées (éventuellement après une ou plusieurs étapes de lavage/séchage) et dispersées dans une composition de traitement du corps humain. Les cellules sont par exemple séchées par lyophilisation. On utilise par exemple un agent ou un moyen d'élicitation ne formant pas une impureté dans le broyat séché.

L'invention a encore pour objet un procédé de préparation de phytoalexine (s), dans lequel :

on met dans un milieu de culture des cellules végétales dédifférenciées, - après culture, on élicite les cellules dans le milieu de culture, - on sèche, de préférence on lyophilise, les cellules dédifférenciées, - on soumet éventuellement les cellules dédifférenciées élicitées séchées à un ou plusieurs lavages et séchages, - on broie les cellules dédifférenciées, élicitées et séchées, et on extrait une ou plusieurs phytoalexines des cellules broyées, éventuellement après une étape de remise des cellules broyées dans un milieu, en particulier un milieu aqueux et/ ou alcoolique.

Un exemple de préparation de broyat utilisable selon l'invention est donné par ailleurs dans les exemples.

La quantité de broyat présent dans la composition selon l'invention est bien entendu fonction de l'effet recherché et peut donc varier dans une large mesure.

Pour donner un ordre de grandeur, on peut utiliser un broyat tel que défini précédemment en une quantité représentant de 0,01% à 20% du poids total de la composition et préférentiellement en une quantité représentant de 0,1% à 5% du poids total de la composition.

Le broyat de cellules végétales dédifférenciées et élicitées est par exemple utilisé en tant qu'agent antioxydant, agent anti-radicalaire, agent apaisant, agent anti-irritant, agent scavenger de radicaux libres.

Dans un aspect particulier le procédé de l'invention permet l'obtention d'un broyât enrichi en flavonoïdes tels les flavanols, les anthocyanes et les flavonols.

Dans un autre aspect particulier le procédé de l'invention permet l'obtention d'un broyat enrichi en non flavonoïdes tels les acides phénols, dérivés de l'acide benzoïque mais également des composés originaux comme les stilbènes, les isomères trans- et cis- du resvératrol et leurs glucosides, les trans- et cis-picéides.

Dans un autre aspect particulier de l'invention le broyat enrichi en polyphénols, phytoalexines et métabolites secondaires retiendrait leurs effets pharmacologiques importants. Ainsi les broyats de l'invention revendiqueraient plusieurs activités telles que antioxydant, anti-radicalaire, antiinflammatoire, anti-proliférative, relaxante vasculaire,...etc.

Contrairement aux métabolites primaires, les métabolites secondaires tels que les polyphénols s'accumulent dans la plante en faible quantité. Dans un aspect de l'invention afin d'obtenir ces métabolites secondaires en quantité importante et de façon continue et stable, nous avons stimulé leur biosynthèse dans des cultures de cellules standardisées.

Les cellules végétales dédifférenciées utilisables dans la composition selon l'invention peuvent provenir de toutes les espèces de végétaux connues.

A cet égard on citera les genres Salvia, Coleus, Rosmarinus, Ginkgo, Cannabis, Colchicum, Gloriosa, Asparagus, Glycine, Medicago, Mungo, Erythrina, Oenothera, Papaver, Atropa, Datura, Solanum, Borago, Reseda, Amsonia, Catharantus, Pilocarpus, Digitalis, Coffea, Theobroma, Jasminum, Capsicum et Iris, vigne, taxus, séquoia, chlorophytum, etc.

Particulièrement selon l'invention on utilise des cellules végétales

dédifférenciées provenant de végétaux des genres séquoia, vigne, arganier et chlorophytum.

Bien entendu les broyats de cellules végétales dédifférenciées utilisables dans la composition selon l'invention peuvent provenir de mélanges de cellules végétales dédifférenciées obtenues à partir de genres végétaux différents et/ ou obtenues à partir de matériel végétal différent.

Par composition à usage topique on entend des crèmes, des onguents, des lotions, suspensions, des bâtons, des shampooings, des gels, des solutions (par exemple applicable par spray). La composition à usage topique est par exemple une composition cosmétique, dermatologique, une composition d'hygiène de la peau, un parfum, etc.

Préférentiellement selon l'invention, la composition est une composition cosmétique, particulièrement d'application topique.

La présente invention a en outre pour objet un procédé de traitement cosmétique de la peau, caractérisé par le fait que l'on applique sur la peau, sur les cheveux, et/ ou sur les muqueuses, une composition selon l'invention comprenant au moins un broyat de cellules végétales dédifférenciées et élicitées dans leur milieu de culture, lyophilisées et incorporées ou dispersées dans un produit cosmétique.

Le procédé de traitement cosmétique de l'invention peut être mis en #uvre notamment en appliquant les compositions cosmétiques telles que définies ci-dessus, selon la technique d'utilisation habituelle de ces compositions.

Par exemple : de crèmes, de gels, de sérums, de lotions, de laits, de shampooings ou de compositions anti-solaires sur la peau.

Les exemples et compositions suivants illustrent l'invention sans la limiter aucunement. Dans les compositions les proportions indiquées sont des pourcentages en poids.

Procédé d'obtention d'un broyat.

Etape 1 : de cellules dédifférenciées et cultivés dans un milieu de culture Etape 2 : Elicitation des cellules dédifférenciées dans le milieu de culture Etape 3 : Extraction des cellules dédifférenciées et élicitées Etape 4 : Séchage ou lyophilisation des cellules Cette étape est avantageusement opérée à une température inférieure à 60 C, par exemple entre -60 C et 50 C.

Etape 5 : broyage Etape 6 : mélange et/ ou incorporation à un ou des excipients et/ ou à d'autres principes actifs ( notamment d'autres cellules/ broyats végétaux ) pour la préparation de la composition à usage topique Exemple 1 Réalisation d'un broyat de cellules dédifférenciées et élicitées de vigne.

La première étape pour le développement de cultures cellulaires végétales consiste à sélectionner la plante produisant les substances recherchées. On admet aujourd'hui qu'au sein d'une même espèce, il

existe une variabilité des capacités de production d'un métabolite donné, en partie d'origine génétique. Lorsque cela est possible, il faudra donc exploiter cette variabilité en sélectionnant le meilleur génotype, c'est-à-dire le plus productif pour le métabolite recherché.

A partir de fragments aseptisés d'un organe de plante choisie (feuille, tige, racine...), placés in vitro sur un milieu solide (gélosé), on parvient à induire des proliférations primaires. Ainsi, après quelques semaines de mise en culture, il se forme, au niveau des explants, des amas cellulaires indifférenciés, appelés cals. La croissance de ces cals sera maintenue par repiquages successifs sur un milieu nutritif neuf. Les conditions de culture vont alors induire l'apparition spontanée d'une variabilité morphologique et métabolique entre cals issus d'une même plante ou d'un même explant. Cependant, le maintien de conditions environnementales constantes tend à diminuer cette variabilité. Ainsi, après une à deux années de repiquages réguliers, on obtient une collection de souches stables présentant des caractéristiques de croissance et de production de métabolites très différentes.

A ce stade, il est alors possible de sélectionner, à l'aide de tests bien définis, la ou les souches produisant les composés d'intérêt en quantité importante. Le passage de ces cals en milieu liquide permet ensuite de s'orienter vers des volumes de production plus importants, tout d'abord en fioles de 250 ml, et plus tard en bioréacteur (20 L et plus). Les suspensions cellulaires ainsi obtenues, formées d'agrégats et de cellules isolées, peuvent encore présenter une hétérogénéité (variabilité somaclonale). Une sélection supplémentaire est alors effectuée pour obtenir des lignées cellulaires hautement productrices. En complément de ce clonage, la production du métabolite d'intérêt peut également être optimisée

par la modification des conditions de culture conduisant à élaboration de milieux, dits milieux de production.

Exemple 2 Activité pharmacologique d'un broyat de vigne : antioxydant Cette activité a été révélée sur des épidermes reconstitués SKINETHIC .

Il ressort de cet essai que le broyat présente un effet anti-radicalaire significatif.

Compte tenu du model retenu (épiderme reconstitué), il peut d'ores et déjà être envisagé d'utiliser broyat dans des préparations à usage topique à la dose minimale active de 0,1%.

Exemple 3 Etude de la tolérance d'un broyat de vigne Une étude de tolérance cutanée et oculaire in vitro à été réalisée à titre préliminaire en vue de l'élaboration de préparations cosmétiques.

Ces essais ont révélé une parfaite tolérance locales (cutanée et oculaire) du broyat à la concentration de 0,3%.

Claims

Revendications 1. Composition pour application topique, en particulier composition cosmétique, contenant des cellules végétales dédifférenciées, caractérisée en ce que la composition contient au moins un broyat de cellules végétales dédifférenciées et élicitées, ledit broyat étant dispersé dans ladite composition ou étant sous une forme apte à être dispersé dans ladite composition.
2. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le broyat est un broyat de cellules dédifférenciées et élicitées, lesdites cellules étant au moins partiellement séchées.
3. Composition suivant la revendication 2, caractérisée en ce que le broyat est un broyat de cellules dédifférenciées et élicitées, lesdites cellules étant sensiblement complètement séchées, de préférence lyophilisées.
4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle contient de 0,01 à 25% en poids, avantageusement de 0,01 à 5 % en poids de cellules végétales dédifférenciées, ce poids étant calculé sous forme sèche.
5. Composition suivant l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle contient un broyat sec ou sensiblement sec de cellules végétales dédifférenciées et élicitées, ledit broyat sec ou sensiblement sec contenant une teneur en eau inférieure à 25% en poids, avantageusement inférieure à 15% en poids, de préférence inférieure à 10% en poids.
6. Composition suivant l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le broyat a une granulométrie moyenne de particules solides inférieure

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à 100 m, avantageusement inférieure à 10 m, de préférence inférieure à 1 m.
7. Composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit broyat de cellules végétales dédifférenciées et élicitées contient au moins une phytoalexine synthétisée par l'élicitation des cellules végétales dédifférenciées.
8. Composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit broyat de cellules végétales dédifférenciées et élicitées est un broyat de cellules végétales dédifférenciées et élicitées par un agent dans le milieu de culture, ledit broyat étant sensiblement exempt dudit agent après élicitation.
9. Composition suivant la revendication précédente, caractérisée en ce que les cellules dédifférenciées sont élicitées par un agent volatile.
10. Composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit broyat de cellules végétales dédifférenciées et élicitées contient au moins un composé terpénique ou tannique ou polyphénolique, ledit composé étant synthétisé par l'élicitation des cellules végétales dédifférenciées dans leur milieu de culture.
11. Composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le broyat de cellules végétales dédifférenciées et élicitées se présente sous la forme d'une suspension visqueuse ou d'un gel ou d'une poudre sensiblement sèche, ladite suspension, gel ou poudre étant avantageusement sous une forme apte à être dispersée dans la composition.
12. Composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le broyat de cellules est un broyat de cellules de vigne dédifférenciées et élicitées.

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13. Composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle contient un broyat de cellules dédifférenciées, cultivées et élicitées dans leur milieu de culture.
14. Procédé de préparation d'une composition à usage topique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on met des cellules végétales dédifférenciées dans un milieu de culture de manière à permettre une croissance des cellules, en ce que l'on élicite lesdites cellules végétales différenciées dans leur milieu de culture pendant une période de temps suffisante pour la synthèse d'une quantité suffisante de métabolites, et en ce qu'on mélange les cellules végétales élicitées du milieu de culture avec un ou plusieurs excipients pour préparer une composition cosmétique.
15. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce qu'on soumet lesdites cellules élicitées à un séchage, suivi d'un broyage.
16. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 14 et 15, caractérisé en ce qu'on élicite les cellules dans leur milieu de culture au moyen d'un agent, qui après extraction des cellules élicitées ne se retrouve pas dans les cellules élicitées.
17. Procédé dans lequel des cellules végétales dédifférenciées sont mises en culture, élicitées dans le milieu de culture, séchées, puis broyées (éventuellement après une ou plusieurs étapes de lavage/ séchage) et dispersées dans une composition de traitement du corps humain.
18. Procédé suivant la revendication précédente, caractérisé en ce que les cellules sont séchées par lyophilisation.

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19. Procédé suivant la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce qu'on utilise un agent ou un moyen d'élicitation ne formant pas une impureté dans le broyat séché.
20. Broyat de cellules végétales dédifférenciées, élicitées puis séchées.
21. Broyat suivant la revendication 20, caractérisé en ce qu'il est exempt d'agent d'élicitation.
22. Broyat de cellules végétales suivant la revendication 20 ou 21, caractérisé en ce qu'il se présente sous une forme apte à être dispersé dans une composition cosmétique et/ ou pharmaceutique.
23. Procédé de préparation de phytoalexine(s), dans lequel : - on met dans un milieu de culture des cellules végétales dédifférenciées, - après culture, on élicite les cellules dans le milieu de culture, - on sèche, de préférence on lyophilise, les cellules dédifférenciées, - on soumet éventuellement les cellules dédifférenciées élicitées séchées à un ou plusieurs lavages et séchages, - on broie les cellules dédifférenciées, élicitées et séchées, et - on extrait une ou plusieurs phytoalexines des cellules broyées, éventuellement après une étape de remise des cellules broyées dans un milieu, en particulier un milieu aqueux et/ ou alcoolique.
24. Composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le broyat est issu de la culture de cellules végétales dédifférenciées, élicitées puis séchées des espèces Salvia, Coleus, Rosmarinus, Ginkgo, Cannabis, Colchicum, Gloriosa, Asparagus, Arganier, Glycine, Medicago, Mungo, Erythrina, Oenothera, Papaver, Atropa, Datura, Solanum, Borago, Reseda, Amsonia, Catharantus,

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Pilocarpus, Digitalis, Coffea, Theobroma, Jasminum, Capsicum et Iris vigne, taxus, séquoia, chlorophytum
25. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le broyat est issu de la culture de cellules végétale; dédifférenciées, élicitées puis séchées des espèces Salvia, Coleus Rosmarinus, Ginkgo, Cannabis, Colchicum, Gloriosa, Asparagus Arganier, Glycine, Medicago, Mungo, Erythrina, Oenothera, Papaver Atropa, Datura, Solanum, Borago, Reseda, Amsonia, Catharantus Pilocarpus, Digitalis, Coffea, Theobroma, Jasminum, Capsicum et Iris vigne, taxus, séquoia, chlorophytum.