FR2978161A1 - Preparation et utilisation de cellules meristematiques appartenant aux genres dendrobium, phalaenopsis, anisellia, polyrrhiza, vanilla, cattleya et vanda, a teneur elevee en phenylpropanoides, polysaccharides hydrosolubles et extensines - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne la préparation de cultures de cellules végétales appartenant aux genres Dendrobium, Phalaenopsis, Anisellia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya et Vanda, et leur utilisation dans le domaine cosmétique, nutritionnel et pharmaceutique. En particulier, la présente invention concerne une culture cellulaire obtenue à partir de cellules méristématiques de plantes appartenant aux genres Dendrobium, Phalaenopsis, Anisellia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya et Vanda, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité de phénylpropanoïdes supérieure à 0,1 % par rapport au poids sec des cellules et une quantité de polysaccharides hydrosolubles supérieure à 5 % par rapport au poids sec des cellules. L'invention concerne également des préparations, des compositions pharmaceutiques et cosmétiques et des suppléments diététiques contenant ladite culture cellulaire.

Description

10 15 20 25 30 35 PRÉPARATION ET UTILISATION DE CELLULES MÉRISTÉMATIQUES APPARTENANT AUX GENRES DENDROBIUM, PHALAENOPSIS, ANISELLIA, POLYRRHIZA, VANILLA, CATTLEYA ET VANDA, À TENEUR ÉLEVÉE EN PHÉNYLPROPANOÏDES, POLYSACCHARIDES HYDROSOLUBLES ET EXTENSINES Domaine de l'invention La présente invention concerne la préparation de cultures de cellules végétales appartenant aux genres Dendrobium, Phalaenopsis, Anisellia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya et Vanda, et leur utilisation dans le domaine cosmétique, nutritionnel et pharmaceutique. Contexte de l'invention Les plantes du genre Dendrobium et du genre Phalaenopsis appartiennent à la famille des Orchidacées. La famille des Orchidacées est la deuxième plus grande famille du monde végétal, après celle des composées, et comprend environ 735 genres divisés en 25 000 espèces. Les orchidées du genre Dendrobium, Phalaenopsis, Anisellia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya et Vanda sont des plantes épiphytes, c'est-à-dire qu'elles vivent sur les arbres et qu'elles se développent sur des substrats ligneux. Les orchidées épiphytes, très répandues dans les tropiques, vivent fixées aux arbres des forêts, possèdent une tige avec des feuilles isolées ou en forme d'écailles et ont souvent de longues racines aériennes pendantes, enveloppées dans le velamen formant un manchon à fonction absorbante autour de la racine et ayant un apex vert apte à la photosynthèse. Les genres Dendrobium, Phalaenopsis, Anisellia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya et Vanda comptent de nombreuses espèces rares et en voie d'extinction. Elles sont donc protégées et ne peuvent être cueillies sans distinction. De nombreux composés bioactifs ont été isolés et identifiés dans de nombreuses espèces d'orchidées. Tan Keng Hong et al. (Journal of Chemical Ecology, 2006, 32(11) . 2429-2441) décrivent la présence de nombreux phénylpropanoïdes dans les fleurs de Bulbophyllum vinaceum, tandis que Ali Mohammad Babar et al. (Plant Growth Regulation, 2006, 49(2-3) . 137-146) rapportent une augmentation de la synthèse des phénylpropanoïdes dans des plantules de Phalaenopsis en réponse à un stress induit par des rayonnements. Les activités biologiques des phénylpropanoïdes ont été largement décrites dans la littérature.

En particulier, ces composés protègent les protéines, les lipides et les acides nucléiques contre les dommages causés par les radicaux libres (Gebhardt R. et al., 1997, Toxicol. Appl. Pharm. 144 : 279-286, Perez Garcia F. et al., 2000, Free Radical Res., 33 : 661-665) ; ils inhibent la biosynthèse du cholestérol, contribuent à la prévention de l'athérosclérose et des troubles vasculaires (Brown J.E. et al., 1998, Free Radical Res., 29 : 247-255 ; Kraft K., 1997, 4 : 369-378 ; Pittlern MH et al., Perfusion, 11 : 338-340), présentent une activité hépatoprotectrice, cholérétique et diurétique (Dogan S. et al., 2005, J. Agric. Food Chem., 53 : 776-785), une activité antivirale contre le VIH (Mcdougali B. et a1 , 1998, Antimicrob. Agents Ch., 42 : 140-146 ; Shanina J. et al., 2001, Tetrahedron Lett., 42 : 3383-3385), une activité antibactérienne et antifongique (Martinov et al., 1999, Acta Horticulturae, 501 : 111-114 ; Zhu XF, 2005, Fitoterapia ; 76 : 108-111), une activité anti-inflammatoire et cicatrisante (Korkina et al., 2007, Cellular and Molecular Biology 53(5) . 78-83) et une activité potentielle permettant la prévention des tumeurs (Kurata R. et al., 2007, J. Agric. Food Chem. 55(1) : 185- 190). Quelques travaux décrits dans la littérature montrent que des polysaccharides hydrosolubles extraits de plantes d'orchidée appartenant au genre Dendrobium possèdent une forte activité immunomodulatrice et anti-oxydante (Zha, Xue-Qiang et al., 2007, Pharmaceutical Biology 45(1) : 71-76 ; Luo A. et al., 2009, Int. J. Biol. Macromol. 45(4) . 359-63 ; Fan Y. Et al., 2009, Int. J. Biol. Macromol. 45(2) : 169-73).

Toutefois, la disponibilité de ces composés bioactifs pour un usage commercial est liée à certaines restrictions : 1- disponibilité limitée du matériel végétal car les orchidées sont des plantes à croissance lente et comprennent de nombreuses espèces rares et protégées ; 2- la présence des composés bioactifs, précédemment décrits, dans les tissus végétaux des orchidées est soumise à des fluctuations importantes liées à l'origine géographique, à la variabilité des saisons et aux contaminations des cultures par des parasites ; 3- la teneur de ces composés dans les plantes est 10 toujours très modeste. Résumé de l'invention Les inventeurs de la présente invention ont trouvé qu'une alternative efficace pour obtenir en quantités élevées les composés bioactifs précédemment décrits 15 (polysaccharides hydrosolubles et phénylpropanoïdes) consiste à utiliser des cultures de cellules végétales stabilisées et sélectionnées. La technologie de culture de cellules végétales permet en effet de surmonter les problèmes précédemment mentionnés. 20 Par conséquent, un objet de l'invention est un procédé de préparation, également industrielle, de cellules méristématiques à teneur élevée en polysaccharides hydrosolubles et en phénylpropanoïdes, provenant de cultures cellulaires de plantes appartenant aux genres 25 Dendrobium, Phalaenopsis, Anisellia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya et Vanda et, en particulier, aux espèces Dendrobium polysema, Dendrobium farmeri, Dendrobium nobile, Phalaenopsis aphrodite, Phalaenopsis hybrida, Anisellia africana, Polyrrhiza lindenii, Vanilla planifolia, Cattleya 30 labiata et Vanda coerulea. L'expression « polysaccharides hydrosolubles » fait référence aux glucomannanes, aux xyloglucanes, aux arabinogalactanes, aux hémicelluloses et aux pectines à base de motifs D-galacturonique. 35 En outre, dans les cellules méristématiques préparées à partir de plantes appartenant aux genres Dendrobium, Phalaenopsis, Anisellia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya et Vanda, il a été trouvé de manière inattendue un taux élevé d'extensines (glycoprotéines riches en hydroxyproline, dont la structure est similaire à celle du collagène).

Un autre objet de la présente invention est donc la préparation de cellules méristématiques à teneur élevée en extensines. Il a été observé que les cellules méristématiques obtenues à partir des espèces végétales précédemment mentionnées présentent, en tant que telles, une forte activité anti-oxydante, anti-inflammatoire, d'inhibition de l'enzyme collagénase et d'inhibition de l'enzyme hyaluronidase. Par conséquent, un autre objet de l'invention concerne une préparation de cellules méristématiques obtenue comme décrit ci-dessous, ladite préparation étant de préférence une solution ou une suspension dans le glycérol, un lyophilisat, un produit déshydraté ou une préparation séchée par atomisation.

Les autres objets de l'invention concernent de telles préparations de cellules méristématiques pour un usage dans des applications cosmétiques, nutritionnelles et pharmaceutiques. Les objets supplémentaires et les avantages de la 25 présente invention seront mieux compris à la lecture de la description détaillée suivante de l'invention. Brève description des figures Figure 1 : activité anti-oxydante de cellules méristématiques provenant de Dendrobium farmeri (DfSG) en 30 solution dans le glycérol. Figure 2 : activité d'inhibition de la production de NO de cellules méristématiques séchées par atomisation provenant de Dendrobium polysema (DpSD). Figure 3 : activité d'inhibition de la production de 35 NO de cellules méristématiques lyophilisées provenant de Vanilla planifolia (VpSL).

Figure 4 : activité d'inhibition de la production de NO de cellules méristématiques lyophilisées provenant de Vanda Coerulea (VcSL). Figure 5 : activité d'inhibition de la collagénase de 5 cellules méristématiques lyophilisées provenant de Dendrobium nobile (DnSL). Figure 6 : activité d'inhibition de la collagénase de cellules méristématiques lyophilisées provenant de Cattleya labiata (C1SL). 10 Description détaillée de l'invention La procédure de préparation, également en quantités industrielles, de cellules méristématiques végétales à teneur élevée en phénylpropanoïdes, polysaccharides hydrosolubles et extensines, comprend les étapes 15 successives suivantes . 1) la sélection de clones dérivant de cultures de cellules de plantes appartenant aux genres Dendrobium, Phalaenopsis, Anisellia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya et Vanda, dans lesquels on trouve les quantités les plus 20 élevées de phénylpropanoïdes, de polysaccharides hydrosolubles et d'extensines ; 2) la collecte de la biomasse végétale résultant d'une culture cellulaire desdits clones sélectionnés dans l'étape 1) sur un milieu de culture liquide ; 25 3) la séparation entre les cellules et le milieu de culture liquide ; 4) facultativement, la lyophilisation et/ou le séchage par atomisation desdites cellules ou de solutions ou suspensions desdites cellules dans le glycérol. 30 De préférence, l'étape de récolte de la biomasse est réalisée après culture, dans un fermenteur, des cellules issues des plantes appartenant aux espèces précédemment mentionnées, et comprend une première phase de sélection des cultures cellulaires sur la base de la vitesse de 35 prolifération et de la teneur en phénylpropanoïdes, polysaccharides hydrosolubles et extensines.

Dans une forme de réalisation, cette procédure implique le prélèvement d'un tissu (de préférence, les feuilles, les racines et les pseudobulbes) sur des plantes choisies parmi un ou plusieurs des genres susmentionnés, de préférence entre les espèces suivantes : Dendrobium farmeri, Dendrobium polysema, Dendrobium nobile, Phalaenopsis aphrodite, Phalaenopsis hybrida, Anisellia africana, Polyrrhiza lindenii, Vanilla planifolia, Cattleya labiata et Vanda coerulea, son lavage, par exemple sous l'eau courante, sa fragmentation en petits morceaux de 2 cm à 5 cm et une stérilisation sur plaques, par exemple selon la séquence de traitements suivante : éthanol à 70 % pendant environ 15 minutes, hypochlorite de sodium à 2 % pendant environ 5 minutes puis HgC12 à 0,05 % pendant environ 1 minute. Entre les traitements, les fragments végétaux sont lavés, traditionnellement au moins trois fois, avec de l'eau distillée stérile. Chaque fragment dudit tissu, dont la taille est encore réduite (expiants), est placé dans une boîte de Pétri contenant un milieu nutritif rendu solide par ajout de gélose, le milieu nutritif contenant des hormones de croissance ajoutées mais pas d'antibiotiques. Le nombre d'expiants effectué a une influence sur le succès des étapes ultérieures. En général, 2000 à 5000 expiants non contaminés sont suffisants pour permettre l'étape ultérieure de sélection. Après une période de temps appropriée, un tissu calleux indifférencié se forme, lequel se multiplie ensuite dans un milieu frais après transfert sur une plus grande surface. De préférence, la lignée de cellules végétales dérivant du tissu calleux indifférencié est en outre stabilisée grâce à un certain nombre de transferts (sous-culture) sur un milieu frais de culture. En particulier, il a été observé que pour obtenir une lignée cellulaire stable, il est important d'effectuer au moins dix sous-cultures. Un tel milieu est de type solide et peut être constitué de manière avantageuse de 0,8 % à 1 % de gélose dans un milieu standard pour culture auquel des peptones végétales sont ajoutées, ce qui permet un apport équilibré en acides aminés et garantit le maintien d'une bonne intégrité de la paroi cellulaire. De préférence, les peptones végétales sont ajoutées en une quantité comprise entre 500 mg/1 et 4000 mg/1 de milieu de culture. Une « lignée cellulaire stable » est une culture qui 10 présente les caractéristiques suivantes : - vitesse de prolifération élevée et constante au cours du temps ; - conservation dans les différentes sous-cultures des mêmes caractéristiques phénotypiques (couleur des cellules, 15 friabilité des agrégats, dimensions, etc.) ; - teneur constante, par unité de masse, en phénylpropanoïdes, polysaccharides et extensines dans les différentes sous-cultures (la teneur en phénylpropanoïdes, polysaccharides hydrosolubles et extensines est évaluée par 20 l'analyse chimique d'extraits) ; - teneur constante, par unité de masse, des métabolites primaires (protéines, lipides et polysaccharides). Après l'étape de stabilisation, la lignée cellulaire 25 est soumise à une « sélection clonale ». Une telle sélection consiste à cultiver les cellules stabilisées pendant une durée appropriée (traditionnellement, 10 à 15 jours de culture). Ensuite, des agrégats individuels de cellules sont prélevés sur le milieu solide de culture et 30 ces agrégats de cellules sont chacun inoculés sur un milieu de culture liquide décrit ci-dessous. Après une fermentation pendant une durée permettant d'obtenir une multiplication appropriée de l'agrégat cellulaire (désormais appelé « clone »), durée généralement 35 comprise entre 10 et 15 jours, la teneur en métabolites intéressants dans chaque clone est déterminée.

Ces opérations peuvent être répétées jusqu'à la sélection d'un clone de la lignée de cellules végétales dans lequel la production de phénylpropanoïdes, de polysaccharides et d'extensines est optimale.

Il doit être noté que l'alternance des cultures sur milieu solide et liquide est essentielle pour la procédure de sélection clonale de la présente invention. Il est donc essentiel que le procédé de sélection clonale décrit ci-dessus ne se termine pas avec l'identification du clone le plus actif, et qu'il soit constamment répété afin de conserver phénotypiquement homogène le clone sélectionné. La lignée de cellules végétales sélectionnée est donc multipliée pour obtenir une quantité suffisante de biomasse afin d'effectuer l'étape de production de la fermentation.

Cette quantité dépendra des conditions spécifiques de production, du type de lignée de cellules végétales utilisée et du type de métabolite que l'on souhaite produire. La biomasse ainsi obtenue peut être introduite directement dans le fermenteur final, ou elle peut être soumise à une ou plusieurs étapes supplémentaires de croissance dans un milieu liquide, en utilisant des volumes intermédiaires. De préférence, la procédure illustrée ci-dessus comprend les étapes suivantes : a) la culture sur un milieu solide d'une lignée prédéterminée de cellules végétales stabilisées pendant une durée suffisante pour obtenir la multiplication de ladite lignée de cellules et avoir des amas cellulaires essentiellement distincts ; b) le prélèvement à partir dudit milieu solide desdits amas cellulaires essentiellement distincts et leur placement dans un milieu liquide de culture distinct ; c) la culture de chacun desdits amas cellulaires essentiellement distincts dans ledit milieu liquide de culture pendant une durée suffisamment longue pour permettre la multiplication dudit amas cellulaire et la détermination analytique des métabolites primaires et/ou secondaires qu'il a produits ; d) la mise en oeuvre d'une détermination qualitative et quantitative des métabolites primaires et/ou secondaires produits par chacun desdits amas cellulaires dans ledit milieu de culture liquide ; e) la sélection de l'amas cellulaire apte à produire la plus grande quantité dudit métabolite intéressant ; f) la répétition du cycle d'opérations selon les étapes a), b), c), d) et e) sur ledit amas cellulaire sélectionné selon l'étape e) pendant un nombre suffisant de fois afin que la quantité dudit métabolite intéressant produit par un amas cellulaire sélectionné et par un amas cellulaire résultant d'un cycle successif d'opérations de sélection soit sensiblement constante. En outre, la fermentation ultérieure peut comprendre de préférence les étapes suivantes : A) l'inoculation dudit clone végétal dans un milieu liquide et sa multiplication pendant une durée suffisante pour obtenir une augmentation de la masse cellulaire représentant au moins 300 % de son poids ; B) facultativement, le transfert de la suspension obtenue dans l'étape A) dans un milieu de culture liquide frais et sa multiplication pendant une durée suffisante pour obtenir une augmentation de 1a masse cellulaire représentant au moins 300 % de son poids ; C) facultativement, la répétition de l'étape B) au moins une fois de plus ; D) le transfert de la suspension obtenue dans l'étape A), B) ou C) dans un milieu de culture liquide frais dans un fermenteur, pour donner une biomasse et mener la fermentation dans des conditions telles et pendant une durée suffisante afin d'obtenir dans ladite biomasse une concentration déterminée de phénylpropanoïdes, de polysaccharides hydrosolubles et d'extensives.

Selon une forme de réalisation préférée, la fermentation est habituellement réalisée à une température comprise entre 15 °C et 35 °C, traditionnellement d'environ 25 °C, et pendant une durée habituellement comprise entre 7 et 40 jours, de préférence entre 14 et 21 jours. Il est essentiel que la biomasse soit aérée de manière appropriée et qu'elle soit soumise en même temps à une agitation à l'aide de moyens d'agitation externes au fermenteur. En effet, il a été observé que la biomasse végétale est composée de cellules dont les parois se rompent facilement. Un agitateur plongé dans la biomasse a une action mécanique sur les cellules, ce qui provoque facilement leur lyse. Cependant, il est nécessaire que l'agitation, bien que faible, soit efficace, surtout dans les phases finales de la fermentation quand la densité de 1a biomasse augmente énormément. Les moyens d'agitation particulièrement appropriés dans le cadre de la présente invention sont les moyens d'agitation orbitale. Ces moyens d'agitation fonctionnent de préférence entre 40 et 200 tours/minute, et de manière davantage préférée à environ 120 tours/minute. De manière appropriée, le volume du récipient (fermenteur) dans lequel la fermentation est réalisée est beaucoup plus grand que le volume de la biomasse. Traditionnellement, le volume du réacteur est de 50 % à 200 % supérieur au volume de la biomasse. Comme précédemment mentionné, pour que la fermentation soit efficace, une oxygénation appropriée est nécessaire. L'oxygénation est habituellement effectuée avec de l'air stérile et avec un débit de 0,5 1/minute à 4 1/minute, de manière davantage préférée de 2 1/minute à 2,5 1/minute, pour un volume de 10 1 de biomasse. En variante, des mélanges gazeux contenant de 10 % à 100 % en volume/volume d'oxygène peuvent être utilisés. Comme précédemment mentionné en ce qui concerne 35 l'agitation, une oxygénation par barbotage trop violente peut également provoquer la rupture des parois cellulaires.

Il est donc nécessaire de s'assurer que l'oxygénation s'effectue de manière douce, par exemple en utilisant des diffuseurs appropriés avec le dispositif de barbotage. De préférence, les moyens de diffusion d'air ou d'oxygène utilisés présentent une vitesse de flux en sortie de buse comprise entre 10 m/minute et 600 m/minute, et de manière davantage préférée entre 50 m/minute et 350/minute. La forme de la chambre de fermentation est également très importante. En effet, il est préférable que la surface de la chambre soit lisse et uniforme, c'est-à-dire qu'elle ne contienne pas d'arêtes, d'angles ou d'autres parties pouvant provoquer la rupture des parois des cellules de la biomasse. Selon une forme particulière de réalisation de la présente invention, des additifs servant à augmenter la solubilité de l'oxygène dans l'eau sont ajoutés à la biomasse. Ces additifs sont choisis de préférence parmi les substances définies comme « sang artificiel », par exemple les hydrocarbures perfluorés (PFC).

En particulier, dans le cadre de la présente invention, les lignées cellulaires stabilisées dérivant d'un tissu végétal de plantes appartenant aux genres susmentionnés, et de préférence provenant de Dendrobium farmeri, Dendrobium polysema, Dendrobium nobile, Phalaenopsis aphrodite, Phalaenopsis hybrida, Anisellia africana, Polyrrhiza lindenii, Vanilla planifolia, Cattleya labiata et Vanda coerulea ont été sélectionnées pour leur capacité à produire . - des phénylpropanoïdes en une quantité supérieure à 0,1 % (par rapport au poids sec des cellules), de préférence supérieure à 1 %, et de manière davantage préférée supérieure à 10 % par rapport au poids sec des cellules ; - des polysaccharides hydrosolubles en une quantité 35 supérieure à 5 % (par rapport au poids sec des cellules), de préférence supérieure à 10 %, et de manière davantage préférée supérieure à 20 % ; - des extensines en une quantité supérieure à 0,01 % (par rapport au poids sec des cellules), de préférence 5 supérieure à 0,05 %, et de manière davantage préférée supérieure à 0,1 %. Procédé de préparation des « souches » (cellules méristématiques) La procédure de préparation des cellules méristématiques issues des lignées cellulaires précédemment 10 mentionnées comprend les étapes successives suivantes : 1. 1a sélection de clones dérivant de la culture cellulaire de cellules de plantes appartenant aux genres précédemment mentionnés, dans lesquels on trouve les concentrations les plus élevées de phénylpropanoïdes, de 15 polysaccharides hydrosolubles et d'extensines ; 2. la collecte de la biomasse végétale résultant d'une culture cellulaire desdits clones sélectionnés dans l'étape 1) sur un milieu de culture liquide ; 3. la séparation entre les cellules et le milieu de 20 culture liquide ; 4. facultativement, la lyophilisation ou le séchage par atomisation des cellules ou de solutions ou suspensions des cellules dans le glycérol ou dans du glycérol contenant de la gomme xanthane (en une quantité variable allant de 25 0,1 % à 2 % en poids/poids, de préférence en une quantité de 0,3 %) ou dans le butylèneglycol. A. Préparation de « souches » dans le glycérol En particulier, des cultures cellulaires obtenues à partir de lignées cellulaires de Dendrobium farmeri, 30 Dendrobium polysema, Dendrobium nobile, Phalaenopsis aphrodite, Phalaenopsis hybrida, Anisellia africana, Polyrrhiza lindenii, Vanilla planifolia, Cattleya labiata et Vanda coerulea, stabilisées et sélectionnées comme décrit ci-dessus, sont collectées entre le 7ème jour et le 35 21ème jour. Les cellules sont tout d'abord séparées du milieu de culture par filtration par gravité, par filtration sous pression ou par centrifugation sur un crible poreux, par exemple un crible en Nylon, acier, coton, etc., ayant de préférence une porosité comprise entre 50 }gym et 150 pm. Les cellules méristématiques séparées du milieu de culture sont mises en suspension dans du glycérol à un rapport en poids/volume de 20 : 80 (intervalle de concentrations : 5 : 95 à 50 : 50). Les préparations ainsi obtenues représentent les souches dans le glycérol. B. Préparation de « souches » lyophilisées Selon une première variante du mode de réalisation du procédé, des cultures cellulaires en suspension obtenues à partir de lignées de Dendrobium farmeri, Dendrobium polysema, Dendrobium nobile, Phalaenopsis aphrodite, Phalaenopsis hybrida, Anisellia africana, Polyrrhiza lindenii, Vanilla planifolia, Cattleya labiata et Vanda coerulea, stabilisées et sélectionnées, également collectées entre le 7ème jour et le 21ème jour, sont tout d'abord séparées du milieu de culture par filtration par gravité, par filtration sous pression ou par centrifugation sur un crible poreux, par exemple un crible en Nylon, acier, coton, etc., ayant de préférence une porosité comprise entre 50 µm et 150 pm. Les cellules obtenues sont soumises à une lyophilisation selon des techniques classiques. Les lyophilisats obtenus représentent les souches lyophilisées.

C. Préparation de « souches » séchées par atomisation Selon un mode de réalisation supplémentaire de l'invention, des cultures cellulaires en suspension obtenues à partir des lignées cellulaires précédemment décrites, collectées entre le 7ème jour et le 21ème jour et filtrées selon le schéma général décrit en B, sont soumises à un procédé de pulvérisation par atomisation selon des techniques classiques. Les poudres obtenues représentent les souches séchées par atomisation. La technique de « séchage par atomisation » est une 35 technique connue et largement utilisée dans le secteur alimentaire et pharmaceutique. Elle consiste à atomiser le liquide (dans le cas présent, une suspension aqueuse de cellules méristématiques) à travers une buse appropriée dans une chambre, où le liquide atomisé rencontre (à cocourant ou à contre-courant) un gaz chaud (air ou azote).

De cette manière, l'eau de la suspension s'évapore instantanément et les cellules forment une poudre ayant une granulométrie régulée (grâce entre autres au type de buse d'atomisation utilisée). Des équipements permettant de mettre en oeuvre un séchage par atomisation sont disponibles dans le commerce. D. Préparation de « souches » déshydratées Selon un mode de réalisation supplémentaire de l'invention, des cultures cellulaires en suspension obtenues à partir des lignées cellulaires précédemment décrites, collectées entre le 7ème jour et le 21ème jour et filtrées selon le schéma général décrit en B, sont soumises à un procédé de déshydratation selon des techniques classiques. Les poudres obtenues représentent les souches déshydratées.

La déshydratation des cellules filtrées est réalisée dans une étuve ventilée à une température comprise entre 40 °C et 70 °C et pendant une durée de 12 heures à 72 heures. A titre d'exemple, mais sans s'y limiter, il a été décrit les procédés de préparation des souches dans le glycérol, des souches lyophilisées et des souches séchées par atomisation, obtenues à partir de cultures de cellules stabilisées et sélectionnées pour leur teneur élevée en phénylpropanoïdes, polysaccharides hydrosolubles et extensines. Exemple 1 - Préparation des souches dans le glycérol de Dendrobium farmeri Des cellules stabilisées et sélectionnées comme précédemment décrit, dérivant de la lignée de Dendrobium farmeri et cultivées sur un milieu solide (Gamborg B5 contenant 1 % (poids/volume) de gélose, 20 g/1 de saccharose, 0,5 g/1 de peptones végétales, 2 mg/1 de NAA et 1 mg/1 de kinétine, pH final de 6,5), sont inoculées dans 5 flacons ayant une capacité de 3 litres, contenant 1000 m1 de milieu liquide (Gamborg B5 contenant 20 g/1 de saccharose, 0,5 g/1 de peptones végétales, 2 mg/1 de NAA et 1 mg/1 de kinétine, pH final de 6,5). La quantité de cellules végétales inoculées dans le milieu liquide est égale à 5 % en poids/volume. Les suspensions ainsi obtenues sont mises en incubation à 25 °C, à l'obscurité et placées sur un agitateur orbital réglé à 120 tours/minute. Après 14 jours d'incubation, la biomasse végétale (5 litres de suspension cellulaire) est collectée et filtrée sur un crible en Nylon ayant une porosité de 50 pm. A partir de 5 litres de suspension cellulaire, 400 g en poids frais (20,7 g en poids sec) de cellules sont obtenus, présentant une teneur en phénylpropanoïdes de 3,3 g, une teneur en polysaccharides hydrosolubles de 4,6 g et une teneur en extensines de 0,08 g. Les cellules collectées sont mises en suspension dans du glycérol en un rapport en poids/volume de 20 : 80. La préparation obtenue représente la souche dans le glycérol de Dendrobium farmeri (DfSG). Exemple 2 - Préparation des souches lyophilisées de Phalaenopsis aphrodite Des cellules stabilisées et sélectionnées comme précédemment décrit, dérivant de la lignée de Phalaenopsis aphrodite et cultivées sur un milieu solide (Gamborg B5 contenant 1 % (poids/volume) de gélose, 20 g/1 de saccharose, 0,5 g/1 de peptones végétales, 3 mg/1 de NAA et 0,5 mg/1 de kinétine, pH final de 6,5), sont inoculées dans 5 flacons ayant une capacité de 3 litres, contenant 1000 ml de milieu liquide (Gamborg B5 contenant 20 g/1 de saccharose, 0,5 g/1 de peptones végétales, 3 mg/1 de NAA et 0,5 mg/1 de kinétine, pH final de 6,5). La quantité de cellules végétales inoculées dans le milieu liquide est égale à 7 % en poids/volume. Les suspensions ainsi obtenues sont mises en incubation à 25 °C, à l'obscurité et placées sur un agitateur orbital réglé à 120 tours/minute. Après 14 jours d'incubation, la biomasse végétale (5 litres de suspension cellulaire) est collectée et filtrée sur un crible en Nylon ayant une porosité de 50 pm. Les cellules collectées sont soumises à une lyophilisation. A partir de 5 litres de suspension cellulaire, 25 g de lyophilisat cellulaire sont obtenus, présentant une teneur en phénylpropanoïdes de 4,7 g, une teneur en polysaccharides hydrosolubles de 5,75 g et une teneur en extensines de 0,08 g. La préparation obtenue représente la souche lyophilisée de Phalaenopsis aphrodite (PaSL). Exemple 3 - Préparation des souches lyophilisées de Anisellia africana Des cellules stabilisées et sélectionnées comme précédemment décrit, dérivant de la lignée de Anisellia africana et cultivées sur un milieu solide (Gamborg B5 contenant 1 % (poids/volume) de gélose, 20 g/1 de saccharose, 2 g/1 de peptones végétales, 2 mg/1 de NAA et 1 mg/1 de kinétine, pH final de 6,5), sont inoculées dans 5 flacons ayant une capacité de 3 litres, contenant 1000 ml de milieu liquide (Gamborg B5 contenant 20 g/1 de saccharose, 2 g/1 de peptones végétales, 2 mg/1 de NAA et 1 mg/1 de kinétine, pH final de 6,5). La quantité de cellules végétales inoculées dans le milieu liquide est égale à 7,5 % en poids/volume. Les suspensions ainsi obtenues sont mises en incubation à 25 °C, à l'obscurité et placées sur un agitateur orbital réglé à 120 tours/minute. Après 14 jours d'incubation, la biomasse végétale (5 litres de suspension cellulaire) est collectée et filtrée sur un crible en Nylon ayant une porosité de 50 pm. Les cellules collectées sont soumises à une lyophilisation. A partir de 5 litres de suspension cellulaire, 18 g de lyophilisat cellulaire sont obtenus, présentant une teneur en phénylpropanoïdes de 3,25 g, une teneur en polysaccharides hydrosolubles de 4,12 g et une teneur en extensines de 0,05 g. La préparation obtenue représente la souche lyophilisée de Anisellia africana (AaSL). Exemple 4 - Préparation des souches lyophilisées de Polyrrhiza lindenii Des cellules stabilisées et sélectionnées comme précédemment décrit, dérivant de la lignée de Polyrrhiza lindenii et cultivées sur un milieu solide (Gamborg B5 contenant 1 % (poids/volume) de gélose, 10 g/1 de saccharose, 1 g/1 de peptones végétales, 3 mg/1 de NAA et 0,3 mg/1 de kinétine, pH final de 6,5), sont inoculées dans 5 flacons ayant une capacité de 3 litres, contenant 1000 ml de milieu liquide (Gamborg B5 contenant 10 g/1 de saccharose, 1 g/1 de peptones végétales, 3 mg/1 de NAA et 0,3 mg/1 de kinétine, pH final de 6,5). La quantité de cellules végétales inoculées dans le milieu liquide est égale à 8 % en poids/volume. Les suspensions ainsi obtenues sont mises en incubation à 25 °C, à l'obscurité et placées sur un agitateur orbital réglé à 120 tours/minute. Après 14 jours d'incubation, la biomasse végétale (5 litres de suspension cellulaire) est collectée et filtrée sur un crible en Nylon ayant une porosité de 50 Nm. Les cellules collectées sont soumises à une lyophilisation. A partir de 5 litres de suspension cellulaire, 15 g de lyophilisat cellulaire sont obtenus, présentant une teneur en phénylpropanoïdes de 2,81 g, une teneur en polysaccharides hydrosolubles de 3,25 g et une teneur en extensines de 0,03 g. La préparation obtenue représente la souche lyophilisée de Polyrrhiza lindenii (P1SL). Exemple 5 - Préparation des souches lyophilisées de Vanilla 30 planifolia Des cellules stabilisées et sélectionnées comme précédemment décrit, dérivant de la lignée de Vanilla planifolia et cultivées sur un milieu solide (Gamborg B5 contenant 1 % (poids/volume) de gélose, 20 g/1 de 35 saccharose, 2 g/1 de peptones végétales, 1 mg/1 de NAA, 0,5 mg/1 de IAA et 2 mg/1 de kinétine, pH final de 6,5), sont inoculées dans 5 flacons ayant une capacité de 3 litres, contenant 1000 ml de milieu liquide (Gamborg B5 contenant 20 g/1 de saccharose, 2 g/1 de peptones végétales, 1 mg/1 de NAA, 0,5 mg/1 de IAA et 2 mg/1 de kinétine, pH final de 6,5). La quantité de cellules végétales inoculées dans le milieu liquide est égale à 5 % en poids/volume. Les suspensions ainsi obtenues sont mises en incubation à 25 °C, à l'obscurité et placées sur un agitateur orbital réglé à 120 tours/minute. Après 14 jours d'incubation, la biomasse végétale (5 litres de suspension cellulaire) est collectée et filtrée sur un crible en Nylon ayant une porosité de 50 Nm. Les cellules collectées sont soumises à une lyophilisation. A partir de 5 litres de suspension cellulaire, 28 g de lyophilisat cellulaire sont obtenus, présentant une teneur en phénylpropanoïdes de 5,12 g, une teneur en polysaccharides hydrosolubles de 6,35 g et une teneur en extensines de 0,09 g. La préparation obtenue représente la souche lyophilisée de Vanilla planifolia (VpsL).

Exemple 6 - Préparation des souches lyophilisées de Cattleya labiata Des cellules stabilisées et sélectionnées comme précédemment décrit, dérivant de la lignée de Cattleya labiata et cultivées sur un milieu solide (Gamborg B5 contenant 1 % (poids/volume) de gélose, 25 g/1 de saccharose, 2 g/1 de peptones végétales, 3 mg/1 de NAA et 1 mg/1 de kinétine, pH final de 6,5), sont inoculées dans 5 flacons ayant une capacité de 3 litres, contenant 1000 ml de milieu liquide (Gamborg B5 contenant 25 g/1 de saccharose, 2 g/1 de peptones végétales, 3 mg/1 de NAA et 1 mg/1 de kinétine, pH final de 6,5). La quantité de cellules végétales inoculées dans le milieu liquide est égale à 6 % en poids/volume. Les suspensions ainsi obtenues sont mises en incubation à 25 °C, à l'obscurité et placées sur un agitateur orbital réglé à 120 tours/minute. Après 14 jours d'incubation, la biomasse végétale (5 litres de suspension cellulaire) est collectée et filtrée sur un crible en Nylon ayant une porosité de 50 pm. Les cellules collectées sont soumises à une lyophilisation. A partir de 5 litres de suspension cellulaire, 22 g de lyophilisat cellulaire sont obtenus, présentant une teneur en phénylpropanoïdes de 4,18 g, une teneur en polysaccharides hydrosolubles de 5,05 g et une teneur en extensines de 0,06 g. La préparation obtenue représente la souche lyophilisée de Cattleya labiata (C1SL).

Exemple 7 - Préparation des souches séchées par atomisation de Dendrobium polysema Des cellules stabilisées et sélectionnées comme précédemment décrit, dérivant de la lignée de Dendrobium polysema et cultivées sur un milieu solide (Gamborg B5 contenant 1 % (poids/volume) de gélose, 20 g/1 de saccharose, 0,5 g/1 de peptones végétales, 2 mg/1 de NAA, 0,5 mg/1 de IAA et 1 mg/1 de kinétine, pH final de 6,5), sont inoculées dans 5 flacons ayant une capacité de 3 litres, contenant 1000 ml de milieu liquide (Gamborg B5 contenant 30 g/1 de saccharose, 2 g/1 de peptones végétales, 2 mg/1 de NAA, 0,5 mg/1 de IAA et 1 mg/1 de kinétine, pH final de 6,5). La quantité de cellules végétales inoculées dans le milieu liquide est égale à 6 % en poids/volume. Les suspensions ainsi obtenues sont mises en incubation à 25 °C, à l'obscurité et placées sur un agitateur orbital réglé à 120 tours/minute. Après 14 jours d'incubation, la biomasse végétale (5 litres de suspension cellulaire) est collectée et filtrée sur un crible en Nylon ayant une porosité de 50 Nm. Les cellules collectées sont soumises à un séchage par atomisation. A partir de 5 litres de suspension cellulaire, 29 g de cellules séchées par atomisation sont obtenus, présentant une teneur en phénylpropanoïdes de 6,2 g, une teneur en polysaccharides hydrosolubles de 8,1 g et une teneur en extensines de 0,1 g. La préparation obtenue représente la souche séchée par atomisation de Dendrobium polysema (DpSD).

Exemple 8 - Préparation des souches séchées par atomisation de Vanda coerulea Des cellules stabilisées et sélectionnées comme précédemment décrit, dérivant de la lignée de Vanda coerulea et cultivées sur un milieu solide (Gamborg B5 contenant 1 % (poids/volume) de gélose, 10 g/1 de saccharose, 0,5 g/1 de peptones végétales, 3 mg/1 de NAA et 1 mg/1 de kinétine, pH final de 6,5), sont inoculées dans 5 flacons ayant une capacité de 3 litres, contenant 1000 ml de milieu liquide (Gamborg B5 contenant 10 g/1 de saccharose, 0,5 g/1 de peptones végétales, 3 mg/1 de NAA et 1 mg/1 de kinétine, pH final de 6,5). La quantité de cellules végétales inoculées dans le milieu liquide est égale à 7 % en poids/volume. Les suspensions ainsi obtenues sont mises en incubation à 25 °C, à l'obscurité et placées sur un agitateur orbital réglé à 120 tours/minute. Après 14 jours d'incubation, la biomasse végétale (5 litres de suspension cellulaire) est collectée et filtrée sur un crible en Nylon ayant une porosité de 50 }gym. Les cellules collectées sont soumises à un séchage par atomisation. A partir de 5 litres de suspension cellulaire, 19 g de cellules séchées par atomisation sont obtenus, présentant une teneur en phénylpropanoïdes de 3,5 g, une teneur en polysaccharides hydrosolubles de 4,37 g et une teneur en extensines de 0,07 g. La préparation obtenue représente la souche séchée par atomisation de Vanda coerulea (VcSD). Exemple 9 - Détermination de la teneur en phénylpropanoïdes dans les cultures cellulaires de Dendrobium, Phalaenopsis, Anisellia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya et Vanda sélectionnées pour la préparation des souches La détermination de la teneur en phénylpropanoïdes dans les cultures cellulaires de Dendrobium, Phalaenopsis, Anisellia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya et Vanda sélectionnées pour la préparation des souches est réalisée en prélevant 10 ml de la suspension cellulaire à examiner. Un volume équivalent de méthanol et 5 mg/ml d'acide ascorbique sont ajoutés à l'échantillon prélevé. La suspension obtenue est soumise à une homogénéisation au moyen d'un Ultra-turrax. Après le traitement d'homogénéisation, la suspension est filtrée sur un filtre Millipore de 0,45 }gym, ou centrifugée. Une portion aliquote de la solution limpide est injectée, après une dilution appropriée, dans un appareil de CLHP pour effectuer une analyse qualitative/quantitative. De cette manière, on obtient les données de la production de phénylpropanoïdes par unité de volume (pg/ml de culture). Pour obtenir les données de production spécifique (pg/ml de cellules fraîches), une quantité connue de culture est prélevée et filtrée sur un entonnoir de Büchner, puis les cellules séparées sont pesées, mises en suspension dans du méthanol contenant de l'acide ascorbique et soumises à une homogénéisation avec un Ultra-turrax comme décrit ci-dessus. La suspension est filtrée de la même manière ou centrifugée et analysée par CLHP. Pour la détermination quantitative des composants du mélange, une analyse par CLHP en phase inversée est utilisée. La détection des analytes est réalisée par des mesures d'absorbance à 330 nm, au maximum d'absorption de l'acide caféïque. Les analyses par CLHP sont réalisées au moyen d'un chromatographe en phase liquide Agilent modèle 1100 équipé d'un détecteur à photodiodes. La méthode adoptée est la suivante : - Colonne Phenomenex Luna C18 de 4,6 x 150 mm, thermostatée à 30 °C - Solvant A : H2PO4 0,01 N dans H2O - Solvant B : H8PO4 0,01 N dans CH8CN - Débit : 0,8 ml/minute - Détection à 330 nm - Elution selon le gradient suivant : 5 10 15 20 25 30 35 Temps % de B 0 0 10 10 15 20 20 25 25 35 30 45 35 55 40 0 Les pics individuels sont quantifiés en les exprimant en acide caféïque. Exemple 10 - Détermination de la teneur en polysaccharides hydrosolubles dans les cultures cellulaires de Dendrobium, Phalaenopsis, Anisellia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya et Vanda sélectionnées pour la préparation des souches Dans les cellules végétales, les polysaccharides hydrosolubles sont des constituants essentiels de la paroi et de la matrice extracellulaire. Ces composants assurent diverses fonctions, telles que la définition de la forme de la cellule, la fourniture d'une barrière rigide contre les fluctuations de volume dues au changement osmotique, l'accumulation et le stockage de l'eau dans des tissus tels que les racines, les pseudobulbes, les feuilles et les fleurs, ainsi que leur utilisation comme source d'énergie (Wang CY et al., 2008, Planta, 227(5) . 1063-1077). Pour exécuter toutes les diverses fonctions biologiques, il existe diverses formes de polysaccharides, tels que les celluloses insolubles qui confèrent une rigidité à la paroi. Les celluloses sont des polymères linéaires de molécules de glucose liées par liaison covalente avec une liaison 13(1-4). Les autres formes de polysaccharides sont représentées par des polymères contenant plusieurs composants monosaccharidiques dans lesquels on trouve plus de mannose que de glucose, en un rapport molaire de 3 : 1, lesquels sont appelés glucomannoses. La rupture de ces polymères n'est également pas ramifiée (Daloul M, et al., 1963, Bulletin de la Société de Chimie biologique). Ces polysaccharides sont plus solubles dans l'eau (Shcherbukhina NK, et al., 1969, Inst. Biokhim. im. Bakha, Moscou, URSS. Rastitel'nye Resursy) et sont donc les plus faciles à extraire des plantes. La teneur en polysaccharides dans les plantes varie beaucoup parmi les diverses espèces, parmi les divers tissus de chaque plante et, au sein de chaque tissu, varie avec l'âge de la plante (Lu H, et al., 2007, Zhongshan Daxue Xuebao, Ziran Kexueban, 46(3), 79-83. Editeur : Zhongshan Daxue Xuebao Bianjibu). Cette variabilité pose de sérieux problèmes pour la standardisation du matériel extrait, ce qui rend difficile l'application pour la production sur une échelle industrielle. Finalement, dans la paroi cellulaire, il existe des polysaccharides ramifiés et solubles dans l'eau, notamment des xyloglucanes, des arabinogalactanes, des hémicelluloses et des pectines à base de motifs D-galacturonique.

Les polysaccharides sont également produits à partir de cultures de cellules d'orchidées (Song J, et al., 2008, Yunnan Zhiwu Yanjiu, 30(1), 105-109). Ceci peut représenter une source utile alternative pouvant se substituer à l'extraction des substances contenues dans des plantes rares et permettre une plus grande standardisation de l'extrait. Les polysaccharides solubles dans l'eau et extraits de la plante sont utiles aux cosmétiques. Les polysaccharides hydrosolubles extraits d'orchidées de la famille des Odontoglossum se sont avérés très efficaces dans la réduction de la lipoperoxydation de la peau et dans la détermination de l'augmentation des niveaux d'hydratation et de synthèse du collagène IV dans le derme (Sasaki A, et al., 2009, demande internationale PCT WO 2009 139 231 Al).

La détermination de la teneur en polysaccharides dans les cultures de cellules sélectionnées provenant de

24 Dendrobium, Phalaenopsis, Anisellia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya et Vanda est effectuée par le prélèvement d'une partie de la suspension de cellules préalablement homogénéisée. L'homogénéisation est réalisée au moyen de systèmes appropriés, tels que : un mélangeur à haute vitesse ou un désintégrateur de cellules à haute pression de type presse French. L'extraction des polysaccharides peut être mise en oeuvre directement sur l'homogénat brut ou sur un culot résiduaire obtenu lors d'une extraction précédente avec un mélange de solvants organiques et d'eau (par exemple, éthanol/eau ou acétone/eau), mise en oeuvre pour extraire à l'avance d'autres fractions de composants organiques d'intérêt, tels que des polyphénols, des flavonoïdes, des alcaloïdes, entre autres.

L'homogénat est traité à chaud avec 2 à 5 volumes d'eau à 80-90 °C pendant 30 minutes, en régulant le pH entre 6,0 et 7,5. Le surnageant est séparé du culot par centrifugation et le culot est à nouveau extrait avec 2 volumes d'eau chaude. L'extrait aqueux est ensuite soumis à une ultrafiltration sur une membrane retenant peu les polysaccharides et présentant un seuil de coupure approprié. Une première filtration est réalisée avec un seuil de coupure de 1 000 000 Da pour séparer dans le rétentat les composants mucilagineux peu solubles et une seconde filtration est réalisée à 3000-5000 Da pour concentrer la solution. Le polysaccharide est récupéré sous forme solide par précipitation avec 2 volumes d'acétone, séché par lyophilisation puis finalement pesé de manière quantitative. Exemple 11 - Détermination de la teneur en extensines dans les cultures cellulaires de Dendrobium, Phalaenopsis, Anisellia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya et Vanda sélectionnées pour la préparation des souches L'analyse des protéines qui composent la paroi cellulaire a souligné le rôle joué par la famille de glycoprotéines riches en hydroxyproline (HRGP), en tant que composants principaux. Dans le groupe des HRPG, on distingue en outre les lectines riches en hydroxyproline et les extensines. La séquence d'acides aminés des extensines est très répétitive et contient un motif penta-peptidique caractéristique (Ser-Pro-Pro-Pro-Pro) dans lequel les résidus proline (Pro) sont d'abord hydroxylés, ce qui donne un penta-peptide contenant des hydroprolines (Ser-Hyp-Hyp-Hyp-Hyp), puis glycosylés, et dans certains cas, la glycosylation représente environ 50 % du poids de la molécule. Il existe diverses formes d'extensive qui se différencient par la présence d'une ou de plusieurs tyrosines entre deux motifs Ser-(Hyp)4 adjacents dans leur séquence d'acides aminés. Il est également bien connu que les extensines sont particulièrement difficiles à extraire de la paroi cellulaire. En effet, les extensines sont initialement synthétisées sous la forme de monomères solubles ayant des poids moléculaires compris entre 60 000 dalton et 90 000 dalton, lesquels deviennent ensuite insolubles dans la paroi cellulaire végétale à cause de ponts intra- et inter-moléculaires formés par des liaisons covalentes entre les résidus tyrosines présents sur des monomères adjacents. De telles structures rigides et insolubles, en collaboration avec des polysaccharides tels que la cellulose, garantissent la solidité et la tension mécanique nécessaires pour maintenir la forme de la cellule végétale. Par conséquent, une méthode pour extraire les extensines d'une plante nécessite un traitement hydrolytique avec divers agents chimiques pour produire un hydrolysat d'extensines composé de petits fragments glycosylés d'extensines.

Les extensines présentent de nombreux aspects intéressants pour des applications en cosmétique, pour une teneur en Pro et en Hyp comparable à celle du collagène animal. En effet, dans certaines applications cosmétiques, des hydrolysais d'extensines sont utilisés comme « collagène végétal » (PARK HJ, Ptn. Appl. document KR 2007 0 117 355 A ; Wolf B, document EP 0 533 408 B2).

Cependant, le poids moléculaire des hydrolysats d'extensines se situe entre 100 daltons et 1500 daltons, tandis que le poids d'une protéine extensine monomère est supérieur à 60 000 daltons.

Il est possible d'extraire une quantité élevée d'extensines monomères de cultures de cellules végétales en croissance rapide. La détermination de la teneur en extensines dans les cultures de cellules sélectionnées issues de Dendrobium, Phalaenopsis, Anisellia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya et Vanda concerne la forme soluble biodisponible qui est extraite de la paroi cellulaire avec un tampon de force ionique élevée. L'extraction est effectuée en prélevant 1 litre de cellules en phase de croissance exponentielle, selon le protocole suivant : 1) filtrer sous vide la culture cellulaire sur un entonnoir de Büchner à mailles de 50 pm et éliminer le milieu de culture ; 2) laver rapidement les cellules en les remettant en 20 suspension dans 1 litre d'eau osmosée ; 3) filtrer à nouveau et éliminer le liquide ; 4) remettre en suspension les cellules dans 200 ml de tampon d'extraction (solution A : NaCl 200 mM, acide ascorbique 1 g/1, et amener le pH à 3,0 avec du HC1 6 M) ; 25 5) maintenir la culture sous agitation pendant 5 minutes, puis filtrer et conserver le filtrat ; 6) ajouter au filtrat de l'acide trichloracétique (TCA) à une concentration finale de 10 Mettre en incubation à 4 °C pendant 12 heures. 30 De cette manière, la majeure partie des protéines présentes dans l'extrait précipite. Au contraire, puisque les extensines sont hautement glycosylées et de nature basique, elles restent en solution ; 7) centrifuger la solution à 8000 tours/minute pendant 35 20 minutes à 4 °C ; 8) prélever le surnageant et dialyser la solution dans un excès d'eau pendant 24 heures ; 9) lyophiliser l'échantillon dialysé ; 10) remettre en suspension dans la solution B (tampon au phosphate de sodium 30 mM, pH 7,8) et doser l'hydroxyproline (selon Kivirikko, K.I., 1967, Anal Biochem. 19(2) . 249-55) par une hydrolyse acide suivie d'une oxydation du pyrrole et une coloration avec le réactif d'Ehrlich. L'hydroxy-proline représente 40 % du poids des extensines. Les préparations obtenues selon les procédures décrites dans les exemples 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 et 8 ont été utilisées pour mettre en oeuvre des essais biologiques. Dans ce qui suit sont présentés quelques exemples donnés à titre indicatif, mais non limitatifs, de l'activité anti-oxydante, anti-inflammatoire, inhibitrice de la collagénase et inhibitrice de la hyaluronidase des préparations de cellules méristématiques de la présente invention. Exemple 12 - Détermination de l'activité anti-oxydante des souches dans le glycol de Dendrobium farmeri La détermination de l'activité anti-oxydante des souches dans le glycol de la lignée de Dendrobium farmeri (préparées comme décrit dans l'exemple 1) est effectuée en utilisant des radicaux libres de DPPH. 500 pl d'une solution à 100 pM de DPPH sont mis en incubation pendant 15 minutes à température ambiante avec un volume équivalent de souches dans le glycérol de Dendrobium farmeri. Au cours de l'incubation, le DPPH se réduit en perdant sa couleur pourpre caractéristique pour une couleur jaune pâle. La valeur de l'absorbance est mesurée par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 515 nm. L'activité anti-radicalaire est exprimée sous la forme de la concentration de l'agent antioxydant qui diminue de 50 % la concentration initiale du DPPH (CIH)-35 La valeur de CI50 obtenue en testant la préparation de souches dans le glycérol de Dendrobium farmeri (DfSG) est la suivante (voir le graphique de la figure 1) .

CI50 = dilution des souches dans le glycérol DfSG 1 : 200

Exemple 13 - Détermination de l'activité d'inhibition de l'enzyme hyaluronidase des souches lyophilisées de Phalaenopsis aphrodite, Anisellia africana et Polyrrhiza lindenii La capacité des souches lyophilisées de Phalaenopsis aphrodite, Anisellia africana et Polyrrhiza lindenii (préparées comme décrit respectivement dans les exemples 2, 3 et 4) à inhiber la dégradation de l'acide hyaluronique présent dans la matrice extracellulaire est évaluée par le test d'inhibition de l'activité de l'enzyme hyaluronidase. Le test comprend une première incubation de l'échantillon à analyser en présence de 50 U de l'enzyme hyaluronidase pendant 15 minutes à 37 °C, puis une seconde incubation pendant 45 minutes à 37 °C après l'ajout d'une solution d'acide hyaluronique à 3 mg/ml. Les échantillons sont portés à ébullition pendant 3 minutes, refroidis rapidement dans de la glace et ajoutés à 3 ml d'une solution de DMAB à 10 mg/ml.

La solution est mise en incubation à 37 °C pendant 20 minutes et la valeur de l'absorbance est déterminée par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 544 nm. Les résultats obtenus par le test des échantillons de Phalaenopsis aphrodite, Anisellia africana et Polyrrhiza lindenii sont présentés respectivement dans les tableaux 1, 2 et 3.

5 10 15 20 25 30 29 Tableau 1 : activité d'inhibition de l'enzyme hyaluronidase par des souches lyophilisées de Phalaenopsis aphrodite (PaSL) Echantillon % d'inhibition PaSL 50 pg/ml 0,72 PaSL 100 pg/ml 12,5 PaSL 200 pg/ml 41,8 PaSL 400 pg/ml 66,4 PaSL 800 pg/ml 87,5 Tableau 2 : activité d'inhibition de l'enzyme hyaluronidase par des souches lyophilisées de Anisellia africana (AaSL) Echantillon % d'inhibition AaSL 50 pg/ml 3,84 AaSL 100 pg/ml 25,5 AaSL 200 1_1g/ml 64,3 AaSL 400 1_1g/ml 81,1 AaSL 800 g/ml 90,8 Tableau 3 : activité d'inhibition de l'enzyme hyaluronidase par des souches lyophilisées de Polyrrhiza lindenii (P1SL) Echantillon % d'inhibition P1SL 50 pg/ml 1,93 P1SL 100 pg/ml 18,6 P1SL 200 pg/ml 47,1 P1SL 400 pg/ml 76,6 P1SL 800 pg/ml 92,1 35 Exemple 14 - Détermination de l'activité anti-inflammatoire des souches séchées par atomisation de Dendrobium polysema et de Vanda coerulea et des souches lyophilisées de Vanilla planifolia La détermination de l'activité anti-inflammatoire des souches séchées par atomisation de Dendrobium polysema (préparées comme décrit dans l'exemple 7) et de Vanda coerulea (préparées comme décrit dans l'exemple 8) et des souches lyophilisées de Vanilla planifolia (préparées comme décrit dans l'exemple 5) est effectuée par un test biologique qui utilise la lignée cellulaire de macrophages de type RAW 264,7. Le test est préparé par l'ensemencement des cellules de la lignée RAW 264,7 dans des plaques à 96 puits dans un milieu de culture DMEM + 10 % de FCS. A une confluence cellulaire de 80 %, le milieu de culture est remplacé par un milieu conditionné avec le composé à tester en présence et en l'absence d'une solution de LPS à 20 pg/ml et laissé en incubation pendant 24 heures à 37 °C sous une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. A 1a fin de l'incubation, 90 pl de surnageant de la culture sont laissés pendant 10 minutes à température ambiante avec 10 pl de réactif de Griess. L'absorbance de la solution est mesurée par spectrophotométrie à 540 nm et la concentration de l'oxyde nitrique (NO) présent dans les échantillons est extrapolée au moyen d'une courbe étalon de NaNO2. Les résultats obtenus par le test des souches séchées par atomisation de Dendrobium polysema (DPSD), de Vanda coerulea (VcSD) et de Vanilla planifolia (VpSl) sont présentés respectivement sur la figure 2, la figure 3 et la figure 4. Exemple 10 - Détermination de l'activité d'inhibition de la collagénase des souches lyophilisées de Dendrobium Nobile et de Cattleya labiata La détermination de l'activité des souches lyophilisées de Dendrobium Nobile et de Cattleya labiata pour inhiber la dégradation du collagène de la matrice extracellulaire par l'inhibition de l'enzyme collagénase est effectuée par le dosage spectrophotométrique de l'hydroxyproline. Le test comprend la gélification dans une plaque à 6 puits de 500 pl de collagène, puis l'incubation pendant 15 heures à 37 °C de l'échantillon de souches en la présence et en l'absence de 70 U/ml d'enzyme collagénase. A la fin de la période d'incubation, les échantillons sont lavés avec du PBS 1X, séchés avec de l'azote gazeux et soumis à une hydrolyse acide avec du HC1 6 M pendant 15 à l0 18 heures à 110 °C. Après les avoir séchés à nouveau avec de l'azote gazeux et remis en suspension dans un tampon acétate/citrate, 100 pl d'échantillon sont mis en incubation à la température ambiante et à l'abri de la lumière pendant 25 minutes avec 100 pl d'une solution de 15 chloramine T à 7 Une seconde incubation pendant 15 minutes à 60 °C est réalisée après l'ajout de 100 pl de solution d'Ehrlich, après quoi une lecture spectrophotométrique est effectuée à 540-560 nm et la quantité d'hydroxyproline présente dans les échantillons est 20 extrapolée au moyen d'une courbe étalon. Les résultats obtenus par le test d'un échantillon de souches lyophilisées de Dendrobium Nobile (DnSL) à des concentrations allant de 0,1 mg/ml à 1 mg/ml sont présentés sur la figure 5 et ceux obtenus par le test d'un 25 échantillon de souches lyophilisées de Cattleya labiata (C1SL) à des concentrations allant de 0,1 mg/ml à 1 mg/ml sont présentés sur la figure 6. Les préparations de l'invention peuvent trouver des applications utiles du fait des activités biologiques 30 suivantes dont elles sont dotées : - activité anti-oxydante, pour la prévention et le traitement des troubles liés aux dommages causés par les radicaux libres et les composants inflammatoires : les troubles cutanés tels que les dermatites séborrhéiques, 35 atopique et irritative, la cellulite, les troubles des muqueuses, notamment les muqueuses des cavités oropharyngée, gastro-intestinale et vaginale, les troubles dentaires, les troubles des voies respiratoires, les maladies articulaires, les maladies ophtalmiques et une diminution de la réponse immunitaire ; - activité anti-inflammatoire, pour la prévention et le traitement des troubles liés aux états d'inflammations chroniques et aiguës ; - activité cytoprotectrice, pour la prévention des dommages causés par les stress environnementaux ; - activité d'inhibition de la collagénase et de stimulation de la production du collagène, pour la prévention et le traitement des troubles cutanés et pour le ralentissement des processus de vieillissement cutané ; - activité d'inhibition de la hyaluronidase, pour la conservation de la tonicité de la peau, de l'hydratation et pour prévenir et contrer le relâchement cutané. Pour renforcer, moduler, mettre en synergie ou agrandir le spectre d'activités biologiques rapporté ci-dessus, il est possible de préparer des mélanges contenant au moins deux préparations de l'invention en des rapports variant entre 1 : 10 et 10 : 1 d'une préparation par rapport à l'autre, en fonction des besoins et en particulier des activités biologiques qui seront maximisées. Un objet supplémentaire de l'invention concerne donc des compositions de préparations pouvant être obtenues à partir d'une préparation telle que définie ci-dessus ou d'un mélange contenant au moins deux préparations tel que défini ci-dessus. Les doses, le moment de l'administration et la voie d'administration du traitement sont choisis en fonction du type, du stade, de la gravité et de l'endroit des manifestations du trouble. Pour tous les troubles cités, une administration par voie orale est indiquée, ainsi qu'une administration par voie topique, transdermique et toute administration permettant de maximiser la disponibilité des principes actifs. Pour les formules orales, on préfère les doses sous forme de comprimés, dragées et capsules, ainsi que les poudres et les suspensions ; pour un traitement topique, on préfère un gel, une crème et une pommade et les solutions appropriés pour être utilisés sur la peau et les muqueuses, et les gouttes oculaires pour une administration dans le sac conjonctival. La dose utilisée varie entre 0,1 mg et 2 g de composition par jour et, de préférence, entre 5 mg et 150 mg de composition par jour, en une seule administration ou en 2 à 4 doses ou au moyen de formes à libération lente en fonction des nécessités thérapeutiques du sujet et pendant des périodes variant entre 1 jour et 120 jours. Les mêmes compositions, à des concentrations appropriées, peuvent être formulées sous forme de suppléments à prendre par voie orale dans la prévention ou comme traitement adjuvant des troubles liés aux états apathiques chez l'homme. Les compositions de l'invention, à des concentrations appropriées et dans des formules appropriées, peuvent être utilisées dans les cosmétiques et les traitements capillaires. 30 35

Claims (22)

1. REVENDICATIONS1. Culture cellulaire sélectionnée obtenue à partir de cellules méristématiques de plantes appartenant aux genres Dendrobium, Phalaenopsis, Anisellia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya et Vanda, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité de phénylpropanoïdes supérieure à 0,1 % par rapport au poids sec des cellules et une quantité de polysaccharides hydrosolubles supérieure à 5 % par rapport au poids sec des cellules.
2. 2. Culture cellulaire selon la revendication 1, dans laquelle lesdites plantes appartiennent aux espèces Dendrobium polysema, Dendrobium farmeri, Dendrobium nobile, Phalaenopsis aphrodite, Phalaenopsis hybrida, Anisellia africana, Polyrrhiza lindenii, Vanilla planifolia, Cattleya labiata et Vanda coerulea.
3. 3. Culture cellulaire selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle contient une quantité d'extensines supérieure à 0,01 % par rapport au poids sec des cellules.
4. 4. Culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle la quantité desdits phénylpropanoïdes est supérieure à 1 % ou supérieure à 10 % par rapport au poids sec des cellules.
5. 5. Culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle ladite quantité de polysaccharides hydrosolubles est supérieure à 10 % ou supérieure à 20 % par rapport au poids sec des cellules.
6. 6. Culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle ladite quantité d' extensines est supérieure à 0,05 % ou supérieure à (D,' % par rapport au poids sec des cellules.
7. 7. Culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle lesdits polysaccharides hydrosolubles comprennent les glucomannanes, les xyloglucanes, les arabinogalactanes, les hémicelluloses et les pectines à base de motifs D-galacturonique.
8. 8. Culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle lesdites extensines comprennent des extensines monomères.
9. 9. Culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, obtenue par un procédé comprenant : 1) la sélection de clones dérivant de la culture d'une lignée cellulaire stable de plantes appartenant aux genres DendrobiUm, Phalaenopsis, Anisellia, Polyrrhiza, Vanilla, Cattleya et Vanda, dans lesquels on trouve les quantités les plus élevées de phénylpropanoïdes, de polysaccharides hydrosolubles et facultativement d'extensines ; 2) la collecte de la biomasse végétale résultant d'une culture cellulaire desdits clones sélectionnés dans l'étape 1) sur un milieu de culture liquide ; 3) la séparation entre les cellules et le milieu de culture liquide ; 4) facultativement, la lyophilisation et/ou le séchage par atomisation desdites cellules ou de solutions ou suspensions desdites cellules dans le glycérol ou dans du glycérol contenant de la gomme xanthane en une quantité variable allant de 0,1 % à 2 % en poids/poids, ou en une quantité de 0,3 ou dans le butylèneglycol.
10. 10. Culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle ladite culture cellulaire comprend une lignée cellulaire stabilisée desdites plantes.
11. 11. Préparation de cellules méristématiques comprenant la culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 et du glycérol, ladite culture cellulaire étant exempte de milieu de culture et ladite culture cellulaire étant présente en un rapport en poids/volume compris entre 5 : 95 et 50 : 50, ou d'environ 20 : 80, par rapport au glycérol.
12. 12. Préparation de cellules méristématiques, comprenant 1a culture cellulaire selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, ladite culture cellulaire étantexempte de milieu de culture, et ladite préparation étant un lyophilisat, une préparation séchée par atomisation ou un produit déshydraté.
13. 13. Préparation ou mélange de préparations selon la revendication 11 ou 12, pour un usage comme médicament.
14. 14. Préparation pour un usage selon la revendication 13, dans laquelle ledit médicament possède une activité anti-oxydante, une activité anti-inflammatoire, une activité inhibant la collagénase avec stimulation de la synthèse de collagène et/ou une activité inhibant la hyaluronidase.
15. 15. Préparation pour un usage selon la revendication 14, pour le traitement et la prévention des troubles liés aux dommages causés par les radicaux libres et les composants inflammatoires : les troubles cutanés tels que les dermatites séborrhéiques, atopique et irritative, la cellulite, les troubles des muqueuses, notamment les muqueuses des cavités oropharyngée, gastro-intestinale et vaginale, les troubles dentaires, les troubles des voies respiratoires, les maladies articulaires, les maladies ophtalmiques et une diminution de la réponse immunitaire.
16. 16. Préparation pour un usage selon la revendication 14, pour le traitement et la prévention des troubles liés aux états d'inflammations chroniques et aiguës.
17. 17. Préparation pour un usage selon la revendication 14, pour la prévention des dommages causés par les stress environnementaux.
18. 18. Préparation pour un usage selon la revendication 14, pour le traitement et la prévention des troubles 30 cutanés et pour le ralentissement des processus de vieillissement cutané.
19. 19. Préparation pour un usage selon l'une quelconque des revendications 13 à 18, dans laquelle ledit mélange de préparations comprend lesdites préparations en des rapports 35 variables compris entre 1 : 10 et 10 : 1 d'une préparation par rapport à l'autre.
20. 20. Composition constituée d'une ou de plusieurs préparations selon la revendication 11 ou 12, adaptée à une administration orale, topique ou transdermique, dans laquelle ladite composition pour administration orale est de préférence choisie entre les comprimés, les dragées, les capsules, les poudres et les suspensions ; ladite composition pour administration topique est de préférence choisie entre un gel, une crème, une pommade et les solutions appropriées pour être utilisées sur la peau et les muqueuses, et les gouttes oculaires pour une administration dans le sac conjonctival.
21. 21. Supplément diététique, comprenant une composition selon la revendication 20.
22. 22. Composition cosmétique, comprenant une préparation 15 selon la revendication 11 ou 12. 20 25 30 35